JP2002512370A - 還元剤を用いる改良された免疫診断アッセイ - Google Patents

還元剤を用いる改良された免疫診断アッセイ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、還元剤の存在下における固相上の抗原を含む固相イムノアッセイに関する。さらに本発明は、少なくとも２つ、好ましくは３つまたは４つ、さらに好ましくはすべての下記工程：（ａ）組み換え宿主細胞からの溶解物をスルホン化すること、あるいは塩化グアニジウムの存在下で組み換え宿主細胞を溶解させて細胞溶解物をスルホン化すること、（ｂ）好ましくは細胞残渣を除去した後に、両性イオン性界面活性剤で処理すること、（ｃ）スルホン化組み換え蛋白を精製すること、あるいはスルホン化組み換え蛋白を精製し、その後両性イオン性界面活性剤を除去すること、ここに好ましくは、精製はクロマトグラフィー、より好ましくはＮｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーであり、組み換え蛋白はＨｉｓ−タグを付した組み換え蛋白である、（ｄ）好ましくはモル過剰のＤＴＴのごとき還元剤でスルホン化組み換え蛋白を脱スルホン化すること、（ｅ）モル過剰のＤＴＴの存在下で貯蔵することを含む、システイン含有組み換え発現蛋白の精製方法に関する。また本発明は、図１〜８に示される新規ＨＣＶ ＮＳ３配列にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、ＨＣＶ感染の診断および治療の分野に関する。より詳細には、本発
明は、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼおよびその使用に関する。また本発明は、改良
された免疫診断アッセイにも関する。
【０００２】 発明の背景 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はフラビウイルス科中の属を構成しており、Ｇ型
およびＧＢ型肝炎ウイルスならびにペスチウイルスに対して相同性を有する。プ
ラス鎖ＲＮＡゲノムは少なくとも９個の蛋白をコードしている。コア、Ｅ１およ
びＥ２は構造蛋白を構成する。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ
およびＮＳ５Ｂは非構造（ＮＳ）蛋白である。ＨＣＶ単離体は高レベルの配列異
種性を示し、少なくとも１１タイプおよび９０サブタイプに分類される（Maerte
ns and Stuyver, 1997）。ヒト肝臓へのＨＣＶの感染は、しばしば、臨床的に良
性であり、急性フェーズにおいて弱い黄疸を伴う。急激に寛解するＣ型肝炎のい
くつかの場合には、疾病は気づかれない可能性がある。しかしながら、大部分の
ケース（＞７０％）において、ＨＣＶ感染は慢性の持続的なまたは活性のある感
染となり、しばしば、肝硬変および自己免疫性疾患といった合併症を伴う。肝細
胞癌腫が約２０ないし３５年後に生じる可能性があり（Saito et al., 1990）、
肝硬変の中間フェーズを伴わない場合がある。今日、予防策はなく、ＨＣＶ遺伝
子型によっては、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）での治療のみが治療ケー
スの約４ないし３６％において長期の寛解を引き起こす（Maertens and Stuyver
, 1997）。
【０００３】 ＨＣＶの生産的培養方法が現在利用できず、ごくわずかな量のＨＣＶ抗原しか
感染患者体内を循環していないので、ＨＣＶ粒子の直接的検出をルーチンに行う
ことはできず、ＨＣＶ ＲＮＡを検出するために面倒な増幅方法を用いる間接的
診断のみが可能である。他の多くのウイルス感染とは異なり、一般的には、大部
分のＨＣＶ蛋白に対する細胞性および体液性免疫応答の存在にもかかわらずＨＣ
Ｖ粒子は血液、肝臓およびリンパ球中に持続的に存在する。便利には、ＨＣＶ抗
体をＥＬＩＳＡ法により検出することができ、そのことにより血液銀行および臨
床研究室における高処理量スクリーニングが可能となる。補足的な抗体試験が必
要であり、現在、多くの国において必須となっている。このようにして真のＨＣ
Ｖの反応性が偽の反応性から区別されるが、偽の反応性は、被覆剤もしくはブロ
ッキング剤への、またはＨＣＶ抗原調合物中に存在する汚染混入物質への、また
は組み換え抗原自体の融合部分もしくは非特異的領域への血清または血漿の免疫
グロブリンまたは抗イディオタイプ成分の非特異的結合により生じる可能性があ
る（McFarlane et al., 1990）。慢性ＨＣＶ疾病、特に治療中のものをモニター
するために、ＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法によるＨＣＶ ＲＮＡの検
出が最近になって導入された。驚くべきことに、繰り返してＨＣＶ Ａｂ陽性で
ある患者のわずか〜７０ないし９４％がネステッドＰＣＲにより陽性となるとい
う事実にもかかわらず、ＨＣＶ ＲＮＡの検出は、しばしば、ＨＣＶ Ａｂスクリ
ーニング試験を確認するために使用されている（Martin et al., 1994）。通常
には温和な形態の疾病を示し、低いＨＣＶ ＲＮＡレベルであるＨＣＶ Ａｂ陽性
血ドナーのうち、ネステッドＰＣＲにより確認されるのは〜４０％のオーダーで
ある（Waumans et al., 1993; Stuyver et al., 1996）。それゆえ、片をベース
にしたアッセイ（strip-based assay）はＨＣＶ Ａｂの確認のためのわずかに信
頼できる別法を提供するものである。確認アッセイにおける中間的結果の場合、
患者についてＨＣＶ ＲＮＡの検出よりもむしろ血清学的フォローアップが推奨
される（Di Bisceglie et al., 1998）。生の（native）ＨＣＶ抗原は十分な量
の使用ができないので、かかる確認アッセイには合成ペプチドおよび／またはＨ
ＣＶ 蛋白の組み換えフラグメントが用いられる。抗体確認において最も臨床的
に用いられるのはＮＳ３蛋白の反応性である（Zaaijer et al., 1994）。しばし
ばＮＳ３抗体は一連のセロコンバージョンの最初に出現し、ＮＳ３蛋白の反応性
は現在利用可能な個々の市販アッセイにおいて異なると思われる。
【０００４】 イノジェネティックス（Innogenetics）は、通常には合成ペプチドと組み換え
蛋白との組み合わせを序列化され容易に読み取れるようになった個別の線として
適用する、片による方法（strip technology）の概念を導入した。INNO-LIA HIV
Ab試験はルーチンに使用されるウェスタンブロットよりも優れていることが証
明された（Pollet et al., 1990）。Line Immuno Assayは多パラメーター試験を
可能にし、かくしてカットオフおよび他の評価システムならびに試料添加コント
ロールを可能にし、さらにＥＬＩＳＡ試験におけるいくつかの抗原に必要な担体
または融合パートナーとして用いられる非ＨＣＶ蛋白に関する偽の反応性の試験
も可能とした。原理的には、該試験フォーマットは異なる病原体または表現型的
にリンクした条件を単一試験において組み合わせることを可能にする。
【０００５】 INNO-LIA HCV Ab IIIは、コア領域、Ｅ２超可変領域（ＨＶＲ）、ＮＳ３ヘリ
カーゼ領域、ならびにＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａ領域に由来するＨＣＶ
抗原を含む第３世代のLine Immuno Assayである。当該第３世代のアッセイにお
いて、高度に精製された組み換えサブタイプ１ｂ ＮＳ３蛋白およびＥ２ペプチ
ドにより高感度が実現される一方で、ペプチドをベースにした試験の特徴である
信頼できる特異性（Peeters et al., 1993）が担保されている。おそらく、この
アッセイの最も重要な特徴の１つは、今までにないＨＣＶ ＲＮＡ陽性との相関
関係である（Claeys et al., 1992; De Beenhouwer et al., 1992）。
【０００６】 抗原は６本の別個の線としてプラスチックで裏打ちされたナイロン片上に被覆
される。さらに、４種の対照線、すなわち、抗ストレプトアビジン、３＋陽性対
照（抗ヒトＩｇ）、１＋陽性対照（ヒトＩｇＧ）、および±カットオフ線が各片
上に被覆される。希釈された試験試料をLIA III片と一緒にインキュベーション
する。ＨＣＶ抗体が試験試料中に存在する場合には、ＨＣＶ抗体が片上のＨＣＶ
抗原線に結合するであろう。次いで、アフィニティー精製されたアルカリ性ホス
ファターゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抱合体が添加され、特異的な
ＨＣＶ抗原／抗体複合体が生成されている場合にはこれと反応する。酵素基質と
のインキュベーションにより栗色が生じ、その強度は試料から捕獲された特定線
上のＨＣＶ特異的抗体量に比例する。硫酸を用いて発色を停止させる。ＨＣＶ特
異的抗体が存在しない場合、抱合体のみが±、１＋、および３＋対照線に結合す
る。試料を添加しない場合には、±および１＋対照線のみが染色される。
【０００７】 定義 以下の定義は本明細書に用いられる異なる用語および表現を説明するものであ
る。 用語「ＨＣＶ ＮＳ３」は、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼまたはヘリカーゼのい
ずれかの少なくとも１つのエピトープを示すアミノ酸配列（および／またはアミ
ノ酸アナログ）を含むポリペプチドまたはそのアナログ（例えば、ミモトープ（
mimotopes））をいう。 用語「Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白」は、Ｅ１またはＥ２領域のいずれ
かの少なくとも１つのＨＣＶエピトープを示すアミノ酸配列（および／またはア
ミノ酸アナログ）を含むポリペプチドまたはそのアナログ（例えば、ミモトープ
）をいう（WO96/04385参照、参照により本明細書に一体化させる）。 本発明の実施例セクションにおいて使用される単離体（生物学的試料）は本発
明を限定するものでなく、タイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２または他の新たなＨＣＶ遺伝子型に属するＨＣＶ単離体は本発明の実
施に適したＨＣＶ配列源であることも理解されるはずである。
【０００８】 本発明に使用するＨＣＶ抗原は全長ウイルス蛋白、その実質的に全長のバージ
ョン、あるいはそれらの機能的フラグメント（例えば、エピトープの形成または
保持に必須の配列を失っていないフラグメント）であってもよい。さらにそのう
え、本発明のＨＣＶ抗原は、目的のコンホーメーション的エピトープの形成をブ
ロックまたは妨害しない他の配列を包含しうる。抗体（ポリクローナル血清また
はモノクローナル抗体）を用いて目的抗原をスクリーニングし、その反応性を、
直鎖状エピトープ（存在する場合に）を保持している変性バージョンの抗原の反
応性と比較することにより、コンホーメーション的エピトープの存在または不存
在を容易に調べることができる。かかるスクリーニングにおいてポリクローナル
抗体を用いる場合、最初にポリクローナル血清を変性抗原に吸着させ、それが目
的抗原に対する抗体を保持しているかどうかを調べることが有利であるかもしれ
ない。
【０００９】 用語「融合ポリペプチド」は、ポリペプチド中において、抗原が、詳細にはＨ
ＣＶ抗原が天然には存在しない１本の連続したアミノ酸鎖の一部となっているポ
リペプチドを意味する。ペプチド結合によりＨＣＶ抗原を互いに直接連結するこ
とができ、スペーサーアミノ酸配列により分離することができる。融合ポリペプ
チドはＨＣＶに関して外来性のアミノ酸配列を含んでいてもよい。 用語「固相」または「固体支持体」は、個々のＨＣＶ抗原またはＨＣＶ抗原含
有融合ポリペプチドが共有結合され、あるいは疎水的吸着のごとき手段により非
共有結合される固体を意味する。固相の例はマイクロタイタープレート、ナイロ
ンまたはニトロセルロース片のごとき膜片、およびシリコンチップを包含する。 用語「生物学的試料」は、通常には個体により生成された抗体、詳細にはＨＣ
Ｖに対する抗体を含有する、哺乳動物個体（例えば、類人猿、ヒト）の体液また
は組織を意味する。体液または組織はＨＣＶ抗原を含んでいてもよい。かかる成
分は当該分野において知られており、血液、血漿、血清、尿、脊髄液、リンパ液
、呼吸器、腸管もしくは性器分泌物、涙、唾液、乳、白血球細胞および骨髄腫を
包含するが、これらに限らない。体成分は生物学的液体を含む。用語「生物学的
液体」は器官から得られる液体をいう。いくつかの生物学的液体は、凝固因子（
例えば、因子ＶＩＩＩ）、血清アルブミン、成長ホルモン等のごとき他の生成物
の源として使用される。かかる場合において、生物学的液体の源がＨＣＶのごと
きウイルスによるコンタミネーションがないことが重要である。
【００１０】 用語「免疫学的に反応性のある」は、問題となる抗原がＨＣＶ感染個体または
免疫個体由来の体成分中の存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応することを意味
する。 用語「免疫複合体」は、抗体がエピトープまたは抗原に結合した場合に形成さ
れる複合体を意味する。 本明細書の用語Ｅ１およびＥ２は、WO96/04385中に十分に記載されており、該
文献を参照により本明細書に一体化させる。
【００１１】 蛋白に用いられる用語「精製」は、所望蛋白が組成物中の全蛋白成分の少なく
とも３５％を占めている組成物をいう。好ましくは、所望蛋白は全蛋白成分の少
なくとも４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくと
も約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少な
くとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％、さらにより好ま
しくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を占める。純度
のパーセンテージ決定に影響しない場合には、組成物は炭水化物、塩類、脂質、
溶媒等のごとき他の成分を含んでいてもよい。「単離」ＨＣＶ蛋白は、純度が少
なくとも３５％であるＨＣＶ蛋白成分を意味する。 用語「本質的に精製された蛋白」は、インビトロ診断法に使用され、治療化合
物として使用されるように精製されている蛋白をいう。これらの蛋白は細胞の蛋
白またはＤＮＡ、ベクター由来の蛋白またはＤＮＡ、あるいは他のＨＣＶウイル
ス性成分を実質的に含まない。通常には、これらの蛋白は均質に精製されている
（少なくとも純度８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ま
しくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは
９９％、さらにより好ましくは９９．５％、最も好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よび銀染色のような慣用的方法によっては混入蛋白が検出されない）。
【００１２】 本明細書の用語「組み換え発現」は、本発明蛋白が、以下に詳述する原核細胞
、下等もしくは高等真核細胞において組み換え発現法により製造されるという事
実をいう。 用語「下等真核細胞」は、酵母、真菌等のごとき宿主細胞をいう。一般的には
、下等真核細胞は単細胞である（必ずしもそうでなくもよい）。好ましい下等真
核細胞はSaccharomyces、Schizosaccaromyces、Klyveromyces、Pichia（例えば
、Pichia pastoris）、Hansenula（例えば、Hansenula polymorpha）、Yarowia
、Schwanniomyces、Zygosaccaromyces等である。Saccharomyces cerevisiae、S.
carlsbergensisおよびK. lactisは最も普通に使用される酵母宿主である。
【００１３】 用語「原核細胞」は、E. coli、Lactobacillus、Lactococcus、Salmonalla、S
treptococcus、Bacillus subtilisまたはStreptomyecsのごとき宿主をいう。こ
れらの宿主も本発明の範囲内であると考える。 用語「高等真核細胞」は、哺乳動物、爬虫類、昆虫等のごとき高等動物由来の
宿主細胞をいう。現在好ましい高等真核宿主細胞はチャイニーズハムスター由来
（例えば、ＣＨＯ）、サル由来（例えば、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞）、幼若ハ
ムスター腎臓由来（ＢＨＫ）、ブタ腎臓由来（ＰＫ１５）のもの、ウサギ腎臓１
３細胞（ＲＫ１３）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト細胞系ＨｅＬａおよびＨ
ｅｐ Ｇ２のようなヒト肝癌細胞系、ならびに昆虫細胞系（例えば、Spodoptera
frugiperda）由来のものである。宿主細胞は懸濁液またはフラスコ培養物、組織
培養物、器官培養物等として提供されううる。あるいはまた、宿主細胞はトラン
スジェニック動物であってもよい。
【００１４】 用語「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーをいい、特定の長さの生成物をい
うのではない。よって、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白はポリペプチドの
定義に含まれる。またこの用語はポリペプチドの発現後修飾物、例えば、糖鎖付
加物、アセチル化物、リン酸化物等を排除するものではない。例えば、１または
それ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸、ＰＮＡ等を包含）を含
有するポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、ならびに当該分野におい
て知られた他の天然および非天然修飾物がこの定義に含まれる。
【００１５】 用語「組み換えポリヌクレオチド」は、その起源または取り扱いに応じて、ポ
リヌクレオチドまたはゲノムの核酸、ｃＤＮＡ、半合成または合成のものを意味
し、以下のものがある：（１）天然において結合しているポリヌクレオチドの全
体または一部分に結合していないもの、（２）天然において結合しているポリヌ
クレオチド以外のポリヌクレオチドに結合しているもの、あるいは（３）天然に
おいて存在しないもの。
【００１６】 用語「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培
養物」、ならびに単細胞として培養された微生物または高等真核細胞系を示す他
のかかる用語は、組み換えベクターまたは他の導入ポリヌクレオチドのレシピエ
ントとして用いることのできる、あるいは用いられている細胞をいい、トランス
フェクションされた元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、自然、
偶発的または人工的な変異のため、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補性に
おいて必ずしも親と同じでなくてもよい。
【００１７】 用語「レプリコン」は遺伝学的エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウ
イルス、コスミド等であり、細胞中でポリヌクレオチド複製の自律的単位として
挙動するもの、すなわち、自分自身の制御下で複製しうるものである。 用語「ベクター」は、所望オープンリーディングフレームの複製および／また
は発現を提供する配列をさらに含むレプリコンである。
【００１８】 用語「制御配列」は、連結されているコーディング配列の発現を起こさせるの
に必要なポリヌクレオチド配列をいう。かかる制御配列の性質は宿主生物により
異なる。原核細胞においては、一般的にかかる制御配列はプロモーター、リボソ
ーム結合部位、およびターミネーターを含む。真核細胞においては、一般的にか
かる制御配列はプロモーターを含み、エンハンサーを含んでいてもよい。用語「
制御配列」は、最少でも、存在が有利であるさらなる成分、例えば、分泌をつか
さどるリーダー配列を含んでいてもよい。
【００１９】 用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鋳型に結合させて、隣
接する構造遺伝子に対する正常転写開始部位におけるｍＲＮＡ生成を開始させる
コンセンサス配列を含むヌクレオチド配列である。 「作動可能に連結」なる表現は、そのように説明される成分が意図される様式
で機能するような関係にある並置をいう。制御配列に適合した条件下でコーディ
ング配列の発現が達成されるように制御配列がコーディング配列に「作動可能に
連結」される。 「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、選択されたリーディングフ
レーム中のポリペプチドをコードしているが停止コドンを含まないポリヌクレオ
チド配列の領域をいう。この領域はコーディング配列の一部またはコーディング
配列全体であってもよい。 「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡ
および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。５’末
端のスタートコドンおよび３’末端の翻訳停止コドンの翻訳によってコーディン
グ配列の境界が決定される。コーディング配列はｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ（ｃＤＮＡを包含）、および組み換えポリヌクレオチド配列を包含しうるが
、これらに限らない。
【００２０】 用語「エピトープ」または「抗原決定基」は免疫反応性のあるアミノ酸配列を
意味する。一般的には、エピトープは少なくとも３個または４個のアミノ酸から
なり、より通常には少なくとも５個または６個のアミノ酸、時々、約７個ないし
８個、あるいは約１０個のアミノ酸からなる。本明細書において用いるように、
ポリペプチドのエピトープとは、該ポリペプチド中のエピトープと同じアミノ酸
配列ならびにその免疫学的同等物をいう。また、かかる同等物は、例えば、遺伝
子型1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b,
3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 5a,
5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 11a, 12aに属する現在知
られている配列または株あるいは新たに決定されたＨＣＶ（サブ）タイプの株、
サブタイプ（＝遺伝子型）またはタイプ（グループ）特異的変種を包含する。エ
ピトープを構成するアミノ酸は直鎖状配列の部分である必要はないが、いずれか
の数のアミノ酸からなる１個またはそれ以上の列をなして散在し、かくしてコン
ホーメーション的エピトープを形成していてもよいことが理解されるべきである
。 用語「免疫原性」は、体液性および／または細胞性の応答を引き起こす物質の
能力をいい、該物質はアジュバント存在下または不存在下において、単独であっ
ても、担体に結合していてもよい。「中和」は、感染性物質の感染性を不完全ま
たは完全にブロックする免疫応答をいう。「ワクチン」はＨＣＶに対する不完全
または完全な防御を誘導しうる免疫学的組成物である。治療ワクチンと呼ばれる
場合には、ワクチンは個体の治療にも有用でありうる。 用語「治療的」は、ＨＣＶ感染を治療しうる組成物をいう。 「有効量」は、投与された個体において免疫学的応答を誘導するに十分、ある
いは意図された系（例えば、イムノアッセイ）において検出可能に免疫反応する
に十分なエピトープを有するポリペプチドの量をいう。好ましくは、有効量は、
上で定義した治療を行うに十分な量である。正確な必要量は適用例により異なる
であろう。
【００２１】 「抗体」はポリクローナルまたはモノクローナル抗体をいう。用語「モノクロ
ーナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。当該用語は抗体の
種または源に限定されず、さらにまた作成方法にも限定されない。ヒト化抗体、
１本鎖抗体あるいは該抗体の特異性をほぼ保持しているそれらの他のフラグメン
トが本発明によりカバーされることにも留意すべきである。 本明細書の用語「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少
なくとも一部分がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。 本明細書の用語「１本鎖抗体」は、結合抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖
の両方）を決定し、結合機能の保存を可能にする連結部分を提供することにより
調製される抗体をいう。 本明細書の用語「（抗体の）フラグメント」は、元の抗体の抗原結合機能およ
び特異性を保持しているＦab、Ｆ(ab)2、Ｆvおよび他のフラグメントをいう。
【００２２】 発明の目的 改良されたＨＣＶ診断アッセイ成分および治療蛋白を提供することが本発明の
目的である。 より詳細には、ＨＣＶ抗体の診断および／またはＨＣＶの治療に使用する改良
されたＨＣＶ ＮＳ３蛋白調合物を提供することが本発明の目的である。 固相上に存在する組み換えまたは合成ＮＳ３ヘリカーゼ蛋白またはその一部分
とＨＣＶ抗体との反応性を増大させる方法を提供することが本発明のさらなる目
的である。 システイン含有組み換え蛋白、より詳細には、組み換えＨＣＶ蛋白の新規精製
方法を提供することも本発明の目的である。 新たなＨＣＶ ＮＳ３蛋白コーディング配列を提供することも本発明の目的で
ある。 産物が疑陽性ＨＣＶ試料とは反応しない新たなＨＣＶ ＮＳ３蛋白コーディン
グ配列を提供することも本発明の目的である。 本発明の核酸を検出する方法を提供することも本発明の目的である。 本発明の核酸を検出するためのプローブおよびプライマーを提供することも本
発明の目的である。 本発明の核酸を検出するための診断キットを提供することも本発明の目的であ
る。 新たなＨＣＶ ＮＳ３ポリペプチドを提供することが本発明のもう１つの目的
である。 疑陽性ＨＣＶ試料とは反応しない新たなＨＣＶ ＮＳ３ポリペプチドを提供す
ることが本発明のもう１つの目的である。 ＨＣＶ感染を予防または治療するための医薬組成物を提供することが本発明の
もう１つの目的である。 本発明のポリペプチドを検出する方法を提供することが本発明のもう１つの目
的である。 受動免疫および／または治療に使用する本発明のポリペプチドに対する抗体を
提供することが本発明のもう１つの目的である。 本発明のポリペプチドの製造方法を提供することが本発明のもう１つの目的で
ある。 本発明のすべての目的は、後で示す具体例に合致すると考える。
【００２３】 発明の詳細な説明 より詳細には、本発明は、還元剤の存在下における固相上の抗体を含む固相イ
ムノアッセイに関する。実施例セクションで示すように、本発明者らは、固相に
対して被覆された抗原とともにＤＴＴのごとき還元剤が存在することは、固相イ
ムノアッセイと組み合わせた抗原を、該抗原に指向された抗体に対してずっと反
応性にすることを見出した。溶液中においても、還元により抗原はより反応性と
なる。 本発明の還元剤はＳ−Ｓジスルフィド架橋を還元するいずれかの作用剤である
。「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋の還元は化学反応であり、それによりジスルフィ
ドが還元されてチオール（−ＳＨ）になる。ＷＯ９６／０４３８５に開示された
ジスルフィド架橋破壊剤および方法を、参照により本明細書に一体化させる。「
Ｓ−Ｓ」還元を、（１）酵素カスケード経路、または（２）還元性化合物により
行うことができる。チオレドキシン、グルタレドキシンのような酵素はインビボ
におけるジスルフィドの還元に関与することが知られており、インビトロにおけ
る「Ｓ−Ｓ」架橋の還元に有効であることが示されている。ｐＨ７．０において
還元されたチオレドキシンによりジスルフィド結合が迅速に開裂され、ＤＴＴと
の反応に関する速度定数よりも約１０4倍大きな見かけの２次反応速度を有する
。蛋白溶液を１ｍＭのＤＴＴまたはジヒドロリポアミドとともにプレインキュベ
ーションすることにより還元のキネティクが劇的に増大しうる（Holmgren,1979
）。
【００２４】 蛋白のジスルフィド架橋を還元することのできるチオール化合物は、例えば、
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリチオール（ＤＴＥ）、β−メル
カプトエタノール、チオカルバメート類、ビス（２−メルカプトエチル）スルホ
ンおよびＮ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン、ならびにナトリウ
ム−チオナイトである。 アスコルビン酸または塩化すず（ＳｎＣｌ2）のようなチオール基を有しない
還元剤は、モノクローナル抗体中のジスルフィド架橋の還元に非常に有用である
ことが示されており（Thakur et al., 1991）、それらをＮＳ３の還元に使用し
てもよい。水素化ホウ素ナトリウムでの処理はペプチド中のジスルフィド架橋の
還元に効果的であることが示されている（Gailit,1993）。トリス（２−カルボ
キシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は低いｐＨにおいてジスルフィドを還元す
ることができる（Burns et al., 1991）。ＤＴＴまたは水素化ホウ素ナトリウム
を還元剤として用いる場合、セレノールはジスルフィドからチオールへの還元を
触媒する。市販ジセレニドであるセレノシステアミンが触媒前駆体として使用さ
れた（Singh and Kats, 1995）。
【００２５】 より詳細には、本発明は、抗原を固相に被覆、ブロッキングおよび／または固
定する工程の間に還元剤が固相に添加される上記イムノアッセイの製造方法に関
する。 また本発明は、固相の前処理工程の間に還元剤が添加される上記イムノアッセ
イを実行する方法に関する。
【００２６】 被覆条件は当業者に知られているように広範であり、固相に蛋白を適用し、反
応を起こさせて蛋白を固相に結合させることを包含する。結合は、共有結合、疎
水結合またはイオン結合、ファンデルワールス力または水素結合であってよいが
、これらに限らない。当業者に知られた別のバッファーをこの工程に使用しても
よく、カルバメートおよびホスフェートバッファーがあるが、これらに限らない
。 当該分野知られている方法によりブロッキングを行うことができ、例えば、ア
ルブミン、血清蛋白、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、界面活性剤、ゼラチン
、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはカゼインを用いて行ってもよい。 当該分野において知られた方法により固定を行う。 ブロッキング、固定および被覆条件のさらなる例を実施例セクションに示す。
【００２７】 さらに詳細には、本発明は、抗原を固相に被覆する工程の間に還元剤が固相に
添加される上記方法に関する。被覆バッファーの例を実施例セクションに示す。
知られている他のすべての被覆バッファーも本開示の一部を形成する。
【００２８】 また本発明は、固相をブロックする工程の間に還元剤が固相に添加される上記
方法にも関し、固相は還元剤の存在下または不存在下でそれに適用された抗原を
含む。ブロッキングバッファーの例を実施例セクションに示す。知られている他
のすべてのブロッキングバッファーも本開示の一部を形成する。
【００２９】 また本発明は、被覆抗原を固相に固定する工程の間に還元剤が固相に添加され
る上記方法にも関し、固相は還元剤の存在下または不存在下でそれに適用された
抗原を含む。固定工程の前に、還元剤の存在下または不存在下でのブロッキング
工程を行ってもよい。固定バッファーの例を実施例セクションに示す。知られて
いる他のすべての固定バッファーも本開示の一部を形成する。
【００３０】 また本発明は、試料添加前における固相の前処理工程の間に還元剤が添加され
る上記方法に関する。被覆、ブロッキングおよび／または固定工程において還元
剤で処理されたプレートに関して、あるいは前以て還元剤で処理されていないプ
レートに関してプレートの前処理を行うことができる。
【００３１】 結局、酵素イムノアッセイにおいて行われるさらなる工程の間に還元剤を添加
してもよいが、可能には、被覆、ブロッキング、固定および／または前処理から
なる上記４工程の１つまたはそれ以上において還元剤を適用した後に還元剤を添
加する。かかるさらなる工程は抗体のインキュベーション、結合抗体の検出およ
び発色を包含するが、これらに限らない。
【００３２】 好ましくは、本発明は、還元剤がＤＴＴ、ＤＴＥまたはＴＣＥＰである上記方
法に関する。
【００３３】 また本発明は、還元剤が０．１ｍＭないし１Ｍ、より詳細には０．５ｍＭない
し５００ｍＭ、さらにより詳細には１ｍＭないし２５０ｍＭ、最も詳細には１な
いし５０ｍＭの濃度範囲で使用される上記方法に関する。いくつかの適用例にお
いては０．５ないし５０ｍＭ、１ないし３０ｍＭ、２ないし２０ｍＭ、５ないし
１５ｍＭの範囲、あるいは約１０ｍＭの還元剤が必要となりうる。他の適用例に
おいては５０〜５００ｍＭ、１００〜３００ｍＭまたは２００ｍＭの濃度のＤＴ
Ｔが必要となりうる。ＤＴＴは還元剤として特に好ましい。
【００３４】 また本発明は、抗原がＨＣＶ ＮＳ３蛋白である上記方法に関する。より詳細
には、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼである。Ｅ１および／またはＥ２蛋白のごとき
ＨＣＶエンベロープ蛋白も好ましい。当該分野で知られた他の蛋白も、ＤＴＴ存
在下で固相に添加された場合、あるいは添加後ＤＴＴで処理された場合に、該蛋
白に対する抗体とうまく反応する可能性がある。
【００３５】 また本発明は、該固相イムノアッセイが異なる病原体の抗原または表現型的に
関連した条件の組み合わせを含むものである上記方法に関する。
【００３６】 また本発明は、上記方法により製造される固相イムノアッセイに関する、より
詳細には、還元剤の存在下で抗原を含有するマイクロタイタープレート、膜片ま
たはシリコンチップのごとき固相を少なくとも１個含むキットに関する。 より詳細には、本発明は、上記方法により製造されるＥＬＩＳＡに関する。
【００３７】 好ましい具体例において、本発明は、好ましくは被覆および／または固定工程
において還元剤が添加される上記方法により製造されるＥＬＩＳＡに関する。１
の好ましい具体例において、被覆工程において還元剤を適用することができる。
もう１つの好ましい具体例において、固定工程において還元剤を適用することが
できる。特に好ましい具体例において、被覆工程および固定工程の両方において
還元剤が添加される。 もう１つの好ましい具体例において、本発明は、試料添加前におけるプレート
の前処理の間に還元剤が添加される上記方法により製造されるＥＬＩＳＡに関す
る。被覆および／または固定工程において還元剤で処理されたプレートに関して
、あるいは前以て還元剤で処理されていないプレートに関してプレートの前処理
を行うことができる。プレートの前処理を行うことができる。酵素イムノアッセ
イにおけるさらなる工程の間に還元剤を添加してもよい。かかるさらなる工程は
抗体のインキュベーション、結合抗体の検出および発色を包含するが、これらに
限らない。
【００３８】 また本発明は、上記方法により製造されるラインイムノアッセイ（ＬＩＡ）に
も関する。 好ましい具体例において、本発明は、好ましくはブロッキング工程および／ま
たは洗浄工程において還元剤が添加される上記方法により製造されるラインイム
ノアッセイ（ＬＩＡ）に関する。酵素イムノアッセイを製造または実行するさら
なる工程の間に還元剤を添加してもよい。かかるさらなる工程は、固定、前処理
、抗体のインキュベーション、結合抗体の検出および発色を包含するが、これら
に限らない。
【００３９】 また本発明は、上記方法により製造されるクイック（ＱＵＩＣＫ）アッセイに
も関する。 好ましい具体例において、本発明は、好ましくは抗原を片に被覆する工程の間
に還元剤が添加される上記方法により製造されるＱＵＩＣＫアッセイに関する。
ＱＵＩＣＫアッセイは、スプレイにより抗原が片上に被覆される水平流れアッセ
イ（lateral flow assay）である。このアッセイにおいて、好ましくは還元剤を
スプレイ溶液に添加する。酵素イムノアッセイの製造または実行におけるさらな
る工程の間に還元剤を添加してもよい。かかるさらなる工程は、ブロッキング、
固定、前処理、抗体のインキュベーション、結合抗体の検出および発色を包含す
るが、これらに限らない。 また本発明は、上記抗原に対して生成した抗体のインビトロでの診断のための
上記アッセイの使用に関する。
【００４０】 また本発明は、スルホン化およびその後の脱スルホン化の工程を含む方法によ
りオリゴヌクレオチドされたＨＣＶ ＮＳ３蛋白にも関する。 スルホン化および脱スルホン化はそれぞれ蛋白に−ＳＯ3基を導入または蛋白
から除去する反応である。 スルホン化は、下記反応に従って蛋白（Ｒ）上のチオール基（ＳＨ）およびジ
スルフィド基をＳ−スルホネートに変換するプロセスであると定義される。 RSH ---> RS-SO3 - (1) RS-SR + 2 -SO3 - + H2O --> 2 RS-SO3 -+ 2 OH- (2) 反応生成物はＳ−スルホ蛋白であり、通常には中性ｐＨにおいて安定である。
ｐＨ＞７において蛋白溶液をテトラチオネートとともにインキュベーションする
ことにより反応（１）を行うことができる（Inglis and Liu, 1970）。銅イオン
存在下で反応（２）を完了させる（Cole, 1967）。Chan(1968)は、酸素の存在下
における亜硫酸ナトリウムおよび触媒量のシステインでの蛋白の処理によりスル
ホ蛋白が得られることを示した。 （１）過剰の競合−ＳＨ（チオール）基により、（２）還元剤により、あるい
は（３）非中性ｐＨ条件におけるインキュベーションにより、脱スルホン化を行
うことができる。 RS-SO3 - + R'SH ---> RSH + R'S-SO3 - RS-SO3 - + 還元剤 ---> RSH 低分子量化合物または蛋白性−ＳＨ基から競合チオール基を得てもよい。 モノ−またはジチオール含有化合物の例は： システイン、システアミン、還元されたグルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン
、ホモシステイン、β−メルカプトエタノール、チオカルバメート類、ビス（２
−メルカプトエチル）スルホン（ＢＭＳ）およびＮ，Ｎ’−ビス（メルカプトア
セチル）ヒドラジン（ＢＭＨ）、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸
）（ＤＴＮＢまたはElman試薬）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびジチオ
エリスリトール（ＤＴＥ）である。
【００４１】 さらに本発明は、両性イオン性界面活性剤でさらに処理された上記ＨＣＶ Ｎ
Ｓ３蛋白に関する。エムピゲン（Empigen）はベタインとして知られ、両性イオ
ン性界面活性剤の特に好ましい例である。他の適当な界面活性剤は当業者に知ら
れており、ＷＯ９６／０４３８５にも説明されている。
【００４２】 さらに本発明は、少なくとも２つ、好ましくは３つまたは４つ、さらに好まし
くはすべての下記工程： （ａ）組み換え宿主細胞からの溶解物をスルホン化すること、あるいは塩化グア
ニジウム（好ましくは、６Ｍ Ｇｕ．ＨＣｌ）の存在下で組み換え宿主細胞を溶
解させて細胞溶解物をスルホン化すること、 （ｂ）好ましくは細胞残渣を除去した後に、両性イオン性界面活性剤で処理する
こと、 （ｃ）スルホン化組み換え蛋白を精製すること、あるいはスルホン化組み換え蛋
白を精製し、その後両性イオン性界面活性剤を除去すること、ここに好ましくは
、精製はクロマトグラフィー、より好ましくはＮｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィ
ーであり、組み換え蛋白はＨｉｓ−タグを付した組み換え蛋白である、 （ｄ）好ましくはモル過剰のＤＴＴのごとき還元剤でスルホン化組み換え蛋白を
脱スルホン化すること、 （ｅ）モル過剰のＤＴＴの存在下で貯蔵すること を含む、システイン含有組み換え発現蛋白の精製方法に関する。 エムピゲンは両性イオン性界面活性剤の特に好ましい例である。かかる両性イ
オン性界面活性剤およびＤＴＴを用いることは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼおよ
びＨＣＶエンベロープ蛋白の精製プロトコールを改良するものである。
【００４３】 また本発明は、図１（配列番号：３〜１８）に示すＨＣＶ ＮＳ３ポリ蛋白（p
olyprotein）をコードするＨＣＶポリ核酸（polynucleic acid）、または図２−
１、３−１、４−１、５−１、６−１、７−１および８−１（配列番号：１９、
２１、２３、２５、２７、２９および３１）に示す配列を有するＨＣＶポリ核酸
に関する。 また本発明は、図２−１、３−１、４−１、５−１、６−１、７−１および８
−１において特徴づけられ、さらにその産物が疑陽性ＨＣＶ試料と反応しない事
実により特徴づけられる上記ＨＣＶポリ核酸、あるいは疑陽性ＨＣＶ試料と反応
しないＮＳ３エピトープをコードする該ポリ核酸の部分にも関する。配列番号：
１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１により示されるクローンによっ
てコードされる蛋白は疑陽性ＨＣＶ試料と反応しないという特性を有するが、Ｄ
ＴＴ処理後、それらは大部分の既知ＮＳ３抗体陽性試料と反応し得た。
【００４４】 さらに本発明は、説明したポリ核酸を含む組み換えベクターに関する。 さらに本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４５】 さらに本発明は、本発明の核酸の検出方法に関する。この検出方法は、Maerte
nsおよびStuyverに付与されたＷＯ９６／１３５９０に記載のごとき当該分野で
知られたいずれの方法であってもよい。 より詳細には、本発明は、 本発明の核酸をプローブと接触させ； 該核酸と該プローブとの間に形成された複合体を調べること を含む、本発明の核酸の検出方法に関する。 したがって、本発明は、プローブもしくはプライマーとして使用される上記単
離核酸またはそのフラグメントに関する。
【００４６】 さらに本発明は、本発明の少なくとも１つのプライマーおよび／または少なく
とも１つのプローブを含む、上記核酸配列を検出するための診断キットに関する
。これらの適用を見渡すための詳細な説明についてはＷＯ９６／１３５９０を参
照のこと。
【００４７】 還元により得られる反応性のほかに、ＮＳ３の反応性はＮＳ３抗原の配列によ
っても重大に決定される。 それゆえ、本発明は、図１、２−２、３−２、４−２、５−２、６−２、７−
２および８−２（配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２）に示
すアミノ酸配列の部分または全体を有するＨＣＶポリペプチドにも関する。また
本発明は、図１（配列番号：１〜１８）に示すＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ蛋白ま
たはそのユニークな部分にも関する。 また本発明は、Ｓ１２００、Ａ１２１８、Ａ１３８４、Ｐ１４０７、Ｖ１４１
２、Ｐ１４２４もしくはＦ１４４４のいずれか、またはこれらのアミノ酸とＬ１
２０１、Ｓ１２２２、Ｉ１２７４、Ｓ１２８９、Ｔ１３２１、Ａ１３２３、Ｔ１
３６９、Ｌ１３８２、Ｖ１４０８、Ａ１４０９もしくはＦ１４１０のいずれかと
の組み合わせを含むＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ蛋白またはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカー
ゼ蛋白の部分にも関する。上記番号付けは広く受け入れられているＨＣＶアミノ
酸の番号付けシステムによるものである。
【００４８】 さらに本発明は、本発明のポリペプチドまたはその機能的同等物もしくはフラ
グメントを含む医薬組成物に関する。用語「医薬組成物」は、本発明のポリペプ
チドおよび医薬上許容される担体もしくは賦形剤（両方の用語を混用することが
できる）を含む組成物または医薬（両方の用語を混用することができる）に関す
る。この医薬組成物を医薬として使用することができる。この医薬組成物をＨＣ
Ｖ感染の治療または予防のための医薬として使用することができる。当業者に知
られた適当な担体または賦形剤はセイライン、リンゲル液、ブドウ糖液、Hankの
溶液、固定油脂（fixed oils）、オレイン酸エチル、セイライン中５％ブドウ糖
、等張性および化学的安定性を高める物質、バッファーならびに保存料である。
他の適当な担体は、それ自体組成物を与えられる個体に有害な抗体の産生を誘導
しない担体を包含し、例えば、蛋白、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ
マー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーのごときものである。当業者の知識内
の適当な方法により「医薬組成物」または「医薬」を投与することができる。好
ましい投与経路は非経口経路またはワクチンである。非経口投与またはワクチン
投与において、本発明の医薬を、上記の医薬上許容される賦形剤と混合された溶
液、懸濁液またはエマルジョンのごとき１回分の注射可能形態として処方する。
例えば、ワクチンとして適用するため、あるいはポリクローナル抗血清／抗体を
生じさせるためには、有効量は種、年齢、および個体の一般的状態、治療すべき
症状の重さ、選択される個々のポリペプチドならびに投与方法等により様々であ
る。比較的広範囲かつクリティカルでない範囲にわたって有効量が見出されると
考えられる。ルーチンな実験のみにより適切な有効量を容易に決定することがで
きる。ＨＣＶ疾患の予防のためのＮＳ３および／またはＥ１および／またはＥ２
および／またはＥ１／Ｅ２単量体またはオリゴマーエンベロープ蛋白の好ましい
範囲は０．０１ないし１０００μｇ／回、好ましくは０．１ないし１００μｇ／
回、より好ましくは１ないし５０μｇ／回である。十分な免疫応答およびその後
のＨＣＶに対する防御を得るためには１個体につき数回の投与が必要になるかも
しれない。治療的ワクチンの場合、必要な投与回数は１０回以上であるかもしれ
ない。連続的輸液を用いてもよい。その場合、５ないし２０μｇ／ｋｇ／分、よ
り好ましくは７ないし１５μｇ／ｋｇ／分の量で医薬を輸液してもよい。本発明
の医薬組成物は、配列番号：３〜１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、
３２に示される配列の機能的に同等な変種またはフラグメントを含んでいてもよ
い。変種またはフラグメントは、本発明のポリペプチドの蛋白配列全体あるいは
本発明のポリペプチドの蛋白配列の一部を含む分子であって、ある種の修飾が付
されており、本発明のポリペプチドの生物学的特性のすべてまたは一部を保持し
ている分子をいう。かかる修飾は、多糖鎖の付加、ある種の化学基の付加、脂質
部分の付加、他のペプチドまたは蛋白配列との融合ならびに分子内架橋の形成を
包含するが、これらに限らない。
【００４９】 また本発明は上記ＨＣＶポリペプチドを含むイムノアッセイにも関する。該イ
ムノアッセイは当該分野で知られたいずれのフォーマットのタイプであってもよ
い（例えば、ＷＯ９６／１３５９０およびColigan et al. 1992参照）。詳細に
は、本発明は、本発明のポリペプチドを検出する方法に関し、該方法は、 該ポリペプチドを該ポリペプチドに結合するリガンドと接触させ； 該ポリペプチドと該リガントとの間に形成された複合体を調べること を含む。 また本発明は、本発明のポリペプチドに結合するリガンドにも関する。用語「
リガンド」は、本発明のポリペプチドに結合しうる分子をいう。リガンドは、特
に、本発明のポリペプチドに対して特異的に生成した（当該分野において知られ
た方法により）ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体をいい、さら
に抗体様構築物およびLorre et alに付与されたＥＰ９７８００６２．０に詳述
された他の構築物も包含する。かかる抗体は生物学的液体中の抗原の検出に非常
に有用である可能性がある。ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン
を用いるアッセイ、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降、免疫組織化学的手法および凝集
アッセイのごとき当該分野で知られたイムノアッセイにより抗原の検出を行うこ
とができる。これらのアッセイに関する詳細な説明はＷＯ９６／１３５９０にあ
り、参照により本明細書に一体化させる。
【００５０】 さらにそのうえ、該抗体はＨＣＶまたは他の疾病の治療に非常に有用である可
能性があり、それゆえ、非ヒト宿主において生成される場合にはヒト化されてい
てもよい。したがって、本発明は、医薬上許容される賦形剤中のこれらの抗体を
含む、医薬として使用される組成物に関する。 また本発明は、本発明の該抗体を製造し使用する方法にも関する。ＨＣＶポリ
ペプチドの製造および使用方法はＷＯ９６／１３５９０に開示されている。該使
用は診断における使用のみならず治療的および予防的使用も包含する。本発明の
ＮＳ３蛋白はワクチン組成物中に含有させるのにも適する。かかるワクチン組成
物は、有効成分のほかに、当該 分野で知られたいずれかのタイプのアジュバン
トを含んでいてもよい。ＷＯ９６／１３５９０の内容を参照により本明細書の説
明に取り入れる。本発明のＮＳ３蛋白は、薬剤スクリーニング目的のようにＮＳ
３ヘリカーゼが適用可能ないずれの適用例にも使用することできる。
【００５１】 実施例 実施例１ ＨＣＶ ＮＳ３タイプ１ｂクローン１９ｂのイー・コリ（E. coli）に
おける発現 １．１ ＨＣＶ ＮＳ３タイプ１ｂクローン１９ａおよび１９ｂ遺伝子のクロー
ニング 合成オリゴヌクレオチドプライマーＨＣＰｒ５９（5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGC
GAAGGCGGTGGACTT-3'）（配列番号：１）およびＨＣＰｒ６０（5'-CTATTAGCTGAAA
GTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3'）（配列番号：２）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼド
メイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ
１ｂ血清ＩＧ８３０９（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これに
よりＰＣＲフラグメント１９を得て、イー・コリ中にクローン化した。センスプ
ライマーＨＣＰｒ５９は、人工的なメチオニンを含むＡｐａＩ制限部位を導入す
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドＨＣＰｒ６０はａａ（アミノ酸）１４６５
の後ろに停止コドンを導入する。次いで、ＰＣＲフラグメントをＡｐａＩで切断
し、得られた８３３ｂｐのＡｐａＩフラグメントをＡｐａＩで切断した発現ベク
ターｐｍＴＮＦＨＲＰ（Innogenetics, Ghent, Belgium）中に組み込んだ。４つ
のＣ型肝炎クローン（ＨＣＣ１）を配列決定した：ＨＣＣ１１９ａおよびＨＣＣ
１１９ｂ（図１および図２−２に示す推定アミノ酸配列参照）。クローンＨＣＣ
１１９ｂ（ｐｍＴＮＦＨＲＰＨＣＣ１１９ｂ）をさらなるサブクローニングのた
めに保存した。
【００５２】 １．２ 発現プラスミドｐＥｍＴＮＦＭＰＨＨＣＣ１１９ｂの構築 ベクターｐｍＴＮＦＨＲＰＨＣＣ１１９ｂから出発して、ＮＳ３クローン１９
ｂコーディング配列を９００ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、Ｎｃｏ
Ｉで切断した発現ベクターｐＥｍＴＮＦＭＰＨ（Innogenetics, Ghent, Belgium
）に挿入し、ベクターｐＥｍＴＮＦＭＰＨＨＣＣ１１９ｂを得た。このプラスミ
ドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦの
Ｎ末端の２５ａａとの融合蛋白としてＨＣＶ ＮＳ３クローン１９ｂを発現する
（配列番号：１９および２０；図２）。
【００５３】 １．３ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３クローン１９ｂの発現 イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラ
スミドｐＥｍＴＮＦＭＰＨＨＣＣ１１９ｂで形質転換した。ｐＥｍＴＮＦＭＰＨ
ＨＣＣ１１９ｂを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖さ
せた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ60 0 を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後
に細胞を集めた。ＨＣＶ ＮＳ３クローン１９ｂ融合蛋白の発現を、特異的モノ
クローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングに
より分析した。
【００５４】 実施例２ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３クローンＢ９の発現 ２．１ ＨＣＶ タイプ１ａクローンＢ９遺伝子のクローニング 合成オリゴヌクレオチドプライマーＨＣＰｒ５９（5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGC
GAAGGCGGTGGACTT-3'）（配列番号：１）およびＨＣＰｒ６０（5'-CTATTAGCTGAAA
GTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3'）（配列番号：２）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼド
メイン（アミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ
１ａ血清ＩＧ２１０５４（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これ
によりＰＣＲフラグメントＢを得て、イー・コリ中にクローン化した。センスプ
ライマーＨＣＰｒ５９は、人工的なメチオニンを含むＡｐａＩ制限部位を導入す
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドＨＣＰｒ６０はａａ１４６５の後ろに停止
コドンを導入する。次いで、ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Prom
ega, Madison, WI, US）中に組み込んだ。４つのＣ型肝炎クローンを配列決定し
た：Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２およびＢ１４（図１および図３−２に示す推定アミノ酸
配列参照）。クローンＢ９（ｐＧＥＭＴＮＳ３Ｂ９）をさらなるサブクローニン
グのために保存した。
【００５５】 ２．２ 発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ９の構築 ベクターｐＧＥＭＴＮＳ３Ｂ９から出発して、Ｂ９コーディング配列を８５０
ｂｐのＮｃｏＩ／ＳｔｕＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩ／ＳｔｕＩで切
断した発現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入
し、ベクターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ９を得た。このプラスミドは、ヘキサヒ
スチジン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａ
ａとの融合蛋白としてＨＣＶ ＮＳ３クローンＢ９を発現する（配列番号：２１
および２２；図３）。
【００５６】 ２．３ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３クローンＢ９の発現 イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラ
スミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ９で形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｂ
９を有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培養物
を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ600を０．２と
し、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を集め
た。ＨＣＶ ＮＳ３クローンＢ９融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体
およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。
【００５７】 実施例３ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ１ａクローンＡ２６、Ｃ１
６およびＤ１８の発現 プライマーＨＣＰｒ５９およびＨＣＰｒ６０を用いるクローンＢ９の単離に関
して説明したのと同様にして、クローンＡ２６、Ｃ１６およびＤ１８を、それぞ
れ、ＨＣＶサブタイプ１ａ感染血清ＩＧ２１０５１、ＩＧ１７７９０およびＩＧ
２１０６８から単離した。最初に、クローンＡ５、Ａ２６、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、
Ｃ１２、Ｃ１６、Ｄ１７、Ｄ１８およびＤ１９をクローン化し、次いで、配列決
定した（図１に示す推定アミノ酸配列参照）。クローンＡ２６、Ｃ１６およびＤ
１８をさらなるサブクローンのために保存した。
【００５８】 実施例４ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３
２の発現 ４．１ ＨＣＶ ＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２遺伝子のクローニン
グ 合成オリゴヌクレオチドプライマー４０３（5'GGGCCCCACCATAGGTGTAGCAAAAGCC
CTACAGTT-3'）（配列番号：３３）および４０４（5'-CTATTAGCTGAAGTCAACGTACTG
TTCAACAGC-3'）（配列番号：３４）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（アミ
ノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ３ａ血清ＩＧ
２１３４９（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、いず
れの場合にも約８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、次いで、ｐＧＥＭ−
Ｔベクター（Promega, Madison, WI, US）中にサブクローンした。クローン化さ
れた各ＰＣＲフラグメントから、数個のクローンを配列決定したが、配列決定に
より、各血清由来のただ１個のクローン化フラグメントだけが完全に正しいもの
であることがわかった。これらは血清ＩＧ２１３４９に関してはクローン３１（
ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．２１）であり、血清ＩＧ２００１４に関してはクロ
ーン３２（ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．３２）であった（図４および５）。
【００５９】 ４．２ 発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＩＧＦＨ
１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．３２の構築 ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ３ａ．
３２から出発して、クローン２１および３２コーディング配列を８５０ｂｐのＮ
ｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩで切断した発
現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、それ
ぞれベクターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ
３Ｔ３ａ．３２を得た。これらのプラスミドは、ヘキサヒスチジン精製タグおよ
びギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融合蛋白として
ＨＣＶ ＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２を発現する（配列番号：２３
〜２６；図４および５）。
【００６０】 ４．３ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ３ａクローン２１および３２
の発現 イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラ
スミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１およびｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３
ａ．３２でそれぞれ形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．２１または
ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ３ａ．３２を有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を
、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８
℃において一晩増殖させた。培養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８
℃で増殖させてＯＤ600を０．２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。
誘導から２〜３時間後に細胞を集めた。ＨＣＶ ＮＳ３タイプ３ａクローン２１
および３２融合蛋白の発現を、特異的モノクローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト
血清を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。
【００６１】 実施例５ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ａクローン３の発現 ５．１ ＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ａクローン３遺伝子のクローニング 合成オリゴヌクレオチドプライマー４１２（5'-GGGCCCCACCATGGGCGTGGCCAAGTC
CATAGACTT-3'）（配列番号：３５）および４１３（5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAACTT
GAGTGACCGC-3'）（配列番号：３６）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（ア
ミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ２ａ血清Ｉ
Ｇ２１３４２（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、約
８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、次いで、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Pr
omega, Madison, WI, US）中にサブクローンした。数個のクローンを配列決定し
、クローン３（ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ａ）をさらなるサブクローニングのため
に保存した（図６）。
【００６２】 ５．２ 発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ａの構築 ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ａから出発して、クローン３コーディング配
列を８５０ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩで切断した発現
ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベクタ
ーｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ａを得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジン
精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融
合蛋白としてＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ａクローン３を発現する（配列番号：２７
および２８；図６）。
【００６３】 ５．３ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ａクローン３の発現 イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラ
スミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ａで形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３
Ｔ２ａを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培
養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ600を０．
２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を
集めた。ＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ａクローン３融合蛋白の発現を、特異的モノク
ローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングによ
り分析した。
【００６４】 実施例６ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｂクローン９の発現 ６．１ ＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｂクローン９遺伝子のクローニング 合成オリゴヌクレオチドプライマー４０１（5'-GGGCCCCACCATGGGCGTAGCCAAATC
CATTGACTT-3'）（配列番号：３７）および４０２（5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAATTT
GAGAGACCGC-3'）（配列番号：３８）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（ア
ミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ２ｂ血清Ｉ
Ｇ２０１９２（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、約
８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega, M
adison, WI, US）中にサブクローンした。数個のクローンを配列決定し、クロー
ン９をさらなるサブクローニングのために保存した（図７）。
【００６５】 ６．２ 発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｂの構築 ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ｂから出発して、クローン９コーディング配
列を８５０ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩで切断した発現
ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベクタ
ーｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｂを得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジン
精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの融
合蛋白としてＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｂクローン９を発現する（配列番号：２９
〜３０；図７）。
【００６６】 ６．３ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｂクローン９の発現 イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラ
スミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｂで形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３
Ｔ２ｂを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培
養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ600を０．
２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を
集めた。ＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｂクローン９融合蛋白の発現を、特異的モノク
ローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングによ
り分析した。
【００６７】 実施例７ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｃクローン１４の発現 ７．１ ＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｃクローン１４遺伝子のクローニング 合成オリゴヌクレオチドプライマー４０１（5'-GGGCCCCACCATGGGCGTAGCCAAATC
CATTGACTT-3'）（配列番号：３７）および４０２（5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAATTT
GAGAGACCGC-3'）（配列番号：３８）を用いて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（ア
ミノ酸１１８８〜１４６５）をＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶサブタイプ２ｃ血清Ｉ
Ｇ２００３１（Innogenetics, Ghent, Belgium）から増幅した。これにより、約
８５０ｂｐのＰＣＲフラグメントが得られ、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega, M
adison, WI, US）中にサブクローンした。数個のクローンを配列決定し、クロー
ン１４（ｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ｃ）をさらなるサブクローニングのために保存
した（図８）。
【００６８】 ７．２ 発現プラスミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｃの構築 ベクターｐＧＥＭ−ＴＮＳ３Ｔ２ｃから出発して、クローン１４コーディング
配列を８５０ｂｐのＮｃｏＩフラグメントとして単離し、ＮｃｏＩで切断した発
現ベクターｐＩＧＦＨ１１１（Innogenetics, Ghent, Belgium）に挿入し、ベク
ターｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｃを得た。このプラスミドは、ヘキサヒスチジ
ン精製タグおよびギ酸開裂部位が後に続くネズミＴＮＦのＮ末端の２５ａａとの
融合蛋白としてＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｃクローン１４を発現する（配列番号：
３１および３２；図８）。
【００６９】 ７．３ イー・コリにおけるＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｃクローン１４の発現 イー・コリ株ＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞（Wertman et al., 1986）をプラ
スミドｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３Ｔ２ｃで形質転換した。ｐＩＧＦＨ１１１ＮＳ３
Ｔ２ｃを有するＭＣ１０６１（ｐＡｃＩ）細胞を、１０μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを補足したLuria Broth（ＬＢ）中、２８℃において一晩増殖させた。培
養物を新鮮ＬＢで２０倍に希釈し、次いで、２８℃で増殖させてＯＤ600を０．
２とし、その後、温度を４２℃まで上昇させた。誘導から２〜３時間後に細胞を
集めた。ＨＣＶ ＮＳ３タイプ２ｃクローン１４融合蛋白の発現を、特異的モノ
クローナル抗体およびＨＣＶ陽性ヒト血清を用いるウェスタンブロッティングに
より分析した。
【００７０】 実施例８ ９体積の８Ｍ塩酸グアニジニウム（Ｇｕ．ＨＣｌ）および１体積の０
．２Ｍ ＮａＨＰＯ4を各グラム当量の湿イー・コリ細胞ペーストに添加し、連続
的にボルテックスすることにより溶液を均質化させた。固体Ｎａ2Ｓ4Ｏ6および
Ｎａ2ＳＯ3を溶液に添加して、それぞれの最終濃度を６５ｍＭおよび３６０ｍＭ
とした。ＣｕＳＯ4（ストック溶液：２５％ ＮＨ3中０．１Ｍ）を添加して最終
濃度１００μＭとした。暗所かつ室温において溶液を一晩撹拌し、−７０℃でイ
ンキュベーションした後、４℃で遠心分離（２００００ｒｐｍで３０分、ＪＡ２
０ローター）することにより清澄化させた。 エムピゲンＢＢTM（Albright & Wilson Ltd., Okibury, UK）およびイミダゾ
ールを上清に添加して最終濃度をそれぞれ１％（ｗ／ｖ）および２０ｍＭとした
。１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを７．２に合わせた。３Ｌの細胞培養物に相当する
試料を、２０ｍＭイミダゾールを含有するバッファーＡで平衡化しておいた２５
ｍＬのＮｉ−ＩＤＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（XK 16/20 カラム, Pharmacia,
Upsala, Sweden）に２ｍＬ／分で負荷した（バッファーＡ：５０ｍＭホスフェー
ト、６Ｍ Ｇｕ．ＨＣｌ、１％エムピゲン、ｐＨ７．２）。Ｎｉ−ＩＤＡ Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅカラムを下記バッファーで順次洗浄した： ２０ｍＭイミダゾール含有バッファーＡ ３５ｍＭイミダゾール含有バッファーＡ ５０ｍＭイミダゾール含有バッファーＡ ５０ｍＭイミダゾール含有バッファーＢ（バッファーＢ：５０ｍＭホスフェー
ト、６Ｍ Ｇｕ．ＨＣｌ、ｐＨ７．２） ２００ｍＭイミダゾール含有バッファーＢ。 ２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに達するまでクロマトグラフィーに
おいて各洗浄を行った。５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０
でカラムを再生した。 非還元的条件および銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによりフラクションを分
析した。ｍＴＮＦ−ＮＳ３ Ｂ９融合蛋白を２００ｍＭイミダゾールでの溶出物
中に回収した。ウサギ抗ヒトＴＮＦ（１μｇ ＮＳ３／レーン）およびウサギ抗
イー・コリ（１０μｇ ＮＳ３／レーン）を用いるウェスタンブロッティングに
より、この単一クロマトグラフィー工程後におＮＳ３純度が９９％以上であるこ
とが示された。 ２００ｍＭイミダゾール溶出フラクションをプールし、脱塩した。 ４０ｍＬのＮｉ−ＩＤＡ溶出試料を、５０ｍＭホスフェート、６Ｍ尿素、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２で平衡化しておいた３００ｍＬのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５カラム（XK 50, Pharmacia, Upsala, Sweden）に１０ｍＬ／分で負荷した。
１０ｍＬのフラクションを集め、ミクロＢＣＡ法（Pierce, Rockford, IL, US）
により蛋白濃度を調べた。脱塩バッファーを用いて蛋白濃度を５００μｇ／ｍＬ
に合わせ、次いで、脱スルホン化および還元を行った。全工程にわたる収量は、
１Ｌの培養物あたり５０〜５５ｍｇの精製ＮＳ３融合蛋白であった。 最後に、ＤＴＴ（ストック溶液：蒸留水中１００ｍＭ）を、ＮＳ３抗原中のシ
ステイン含量（例えば、ＮＳ３ １９ｂは７個のシステインを含む）に対して１
００倍モル過剰添加した。溶液に窒素を吹き込み、２８℃で１時間インキュベー
ションした。次いで、ＥＬＩＳＡおよびＬＩＡ被覆用にＮＳ３試料を適当なバッ
ファーで希釈した。
【００７１】 実施例９ ＬＩＡにおいて試験したＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性 ＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性を調べるために、ホスフェート緩衝化セイライ
ン中の５０μｇ／ｍｌ ＮＳ３抗原溶液をナイロン膜片上に適用した。１８〜２
４℃において少なくとも１時間片を乾燥させ、次いで、還元剤ＤＴＴの存在下（
１０ｍＭ）または不存在下でＰＢＳ／カゼインでブロックした。次いで、ＤＴＴ
不含または１０ｍＭ ＤＴＴ含有するＴｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳで、次いで、
ＤＴＴ不含または１０ｍＭ ＤＴＴ含有する１ｍＭ ＥＤＴＡ含有水で片を洗浄し
た。膜を３０分乾燥させ、異なる患者の試料を調べるために片状に切断した。 抗ＨＣＶセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０３（Boston Biomedica Inc., B
oston, US）とともに片をインキュベーションした実験結果を表１に示す。
【００７２】 実施例１０ ＥＬＩＳＡにおいて試験したＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性 ＮＳ３ヘリカーゼ抗体の反応性を調べるために、実施例４のごとく精製したＮ
Ｓ３抗原でＥＬＩＳＡプレートを次のように被覆した。 マイクロタイタープレートのウェルを、２００ｍＭ ＤＴＴ含有またはＤＴＴ
不含の１ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ炭酸バッファーを含有する被覆バッファー
中、濃度０．３μｇ／ｍｌのＮＳ３蛋白で被覆した。マイクロタイタープレート
を２０℃で１８時間インキュベーションし、１ウェルあたり３００μｌのＰＢＳ
／カゼインバッファーでブロックした。プレートを２０℃で２時間インキュベー
ションし、次いで、２００ｍＭ ＤＴＴ含有またはＤＴＴ不含の１ｍＭ ＥＤＴＡ
含有固定バッファー３００μｌで、２０℃で２時間固定した。 結果を表２および３に示す。表２は、ＮＳ３で被覆し、ＤＴＴありまたはなし
で固定したアッセイをＢＢＩセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０１およびＰＨ
Ｖ９０２に適用した場合のノイズ対シグナル値を示す。表３は、ＤＴＴを用いる
アッセイによりＨＣＶ抗体をより早く検出できる日数をまとめたものである。明
らかに、アッセイにＤＴＴを用いることによって、１２のＨＣＶセロコンバージ
ョンにおけるより早い検出の全日数３４を得ることができる。
【００７３】
【表１】 1-: 反応せず; +反応陽性; 同じ片上にスプレイされた異なるカットオフ線との
比較において強度等級を示す。
【表２】 表２ 実施例１０において説明したＨＣＶ ＮＳ３で被覆したＥＬＩＳＡにいて
試験したＢＢＩパネル
【表３】 表２のつづき
【表４】
【表５】 表３ ＢＢＩパネルの概観−より早く検出できる日数
【００７４】 文献 Burns, J., Butler, J., Moran, J., and Whitesides, G. (1991) Selective re
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【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＣＶサブタイプ１ａおよび１ｂ感染血清から単離されたＨＣＶ
ＮＳ３クローンのアミノ酸配列を示す。
【図２−１】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローン１９ｂ融合蛋白のＤＮＡコーデ
ィング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮ
Ｆ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図２−２】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローン１９ｂ融合蛋白のアミノ酸配列
を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パー
トナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図３−１】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローンＢ９融合蛋白のＤＮＡコーディ
ング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ
融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図３−２】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３クローンＢ９融合蛋白のアミノ酸配列を
示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パート
ナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図４−１】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン２１融合蛋白のＤＮ
Ａコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列
はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分
を含む。
【図４−２】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン２１融合蛋白のアミ
ノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ
融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図５−１】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン３２融合蛋白のＤＮ
Ａコーディング配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列
はｍＴＮＦ融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分
を含む。
【図５−２】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ３ａクローン３２融合蛋白のアミ
ノ酸配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ
融合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図６−１】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ａ融合蛋白のＤＮＡコーディン
グ配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融
合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図６−２】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ａ融合蛋白のアミノ酸配列を示
す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナ
ー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図７−１】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｂ融合蛋白のＤＮＡコーディン
グ配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融
合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図７−２】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｂ融合蛋白のアミノ酸配列を示
す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナ
ー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図８−１】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｃ融合蛋白のＤＮＡコーディン
グ配列を示す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融
合パートナー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
【図８−２】 ｍＴＮＦＨ６ＮＳ３タイプ２ｃ融合蛋白のアミノ酸配列を示
す。太字で示した配列は非ＮＳ３配列である。この配列はｍＴＮＦ融合パートナ
ー、ヘキサヒスチジンタグおよびマルチリンカーの部分を含む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｑ 1/25 15/09 ＺＮＡ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 1/68 33/576 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 33/576 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 アルフォンス・ボスマン ベルギー、ベー1745オプウェイク、フルス ト165番 (72)発明者 エルウィン・サブロン ベルギー、ベー−1785メルヒテム、ロブレ ークラーン１アー番 (72)発明者 マーン・ズレイン フランス、エフ−59910ボンデュ、ドメー ヌ・ドゥ・ラ・ヴィーヌ201番

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 還元剤の存在下における固相上の抗原を含む固相イムノアッ
    セイ。
  2. 【請求項２】 抗原を固相に被覆、ブロッキングおよび／または固定する工
    程の間に、あるいは固相の前処理の間に還元剤が添加される、請求項１記載のイ
    ムノアッセイを製造または実行する方法。
  3. 【請求項３】 抗原を固相に被覆する工程の間に還元剤が固相に添加される
    請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 還元剤の存在下または不存在下において適用された抗原を含
    む固相をブロックする工程の間に還元剤が固相に添加される請求項２記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 還元剤の存在下または不存在下において適用された抗原を含
    む固相を固定する工程の間に還元剤が固相に添加される請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】 還元剤の存在下または不存在下において適用された抗原を含
    む固相を前処理する間に還元剤が添加される請求項２記載の方法。
  7. 【請求項７】 還元剤がＤＴＴ、ＤＴＥまたはＴＣＥＰである請求項１ない
    し６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 還元剤が０．１ｍＭないし１Ｍ、より詳細には０．５ｍＭな
    いし５００ｍＭ、さらに詳細には１ｍＭないし２５０ｍＭの範囲の濃度で使用さ
    れ、いくつかの適用例においては０．５ないし５０ｍＭ、１ないし３０ｍＭ、２
    ないし２０ｍＭ、または５ないし１５ｍＭの範囲、または約１０ｍＭが必要とな
    りうるである、請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 抗原がＨＣＶ ＮＳ３蛋白である請求項２ないし８のいずれ
    かに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項２ないし９のいずれかに記載の方法により製造され
    る固相イムノアッセイ。
  11. 【請求項１１】 請求項２ないし９のいずれかの方法により製造されるＥＬ
    ＩＳＡ。
  12. 【請求項１２】 被覆および／または固定工程において還元剤が添加される
    請求項１１記載のＥＬＩＳＡ。
  13. 【請求項１３】 請求項２ないし９のいずれかに記載の方法により製造され
    るＱＵＩＣＫ試験。
  14. 【請求項１４】 ブロッキング工程において還元剤が添加される請求項１３
    記載のＱＵＩＣＫ試験。
  15. 【請求項１５】 請求項２ないし９のいすれかに記載の方法により製造され
    るラインイムノアッセイ。
  16. 【請求項１６】 ブロッキング工程において還元剤が添加される請求項１５
    記載のラインイムノアッセイ。
  17. 【請求項１７】 請求項１記載の抗原に対して生成した抗体のインビトロで
    の診断のための請求項１０ないし１６のいずれかに記載のアッセイの使用。
  18. 【請求項１８】 スルホン化およびその後の脱スルホン化の工程を含む方法
    により処理されるＨＣＶ ＮＳ３蛋白。
  19. 【請求項１９】 さらに両性イオン性界面活性剤、好ましくはエムピゲンで
    処理されるＨＣＶ ＮＳ３蛋白。
  20. 【請求項２０】 少なくとも２つ、好ましくは３つまたは４つ、さらに好ま
    しくはすべての下記工程： （ａ）組み換え宿主細胞からの溶解物をスルホン化すること、あるいは塩化グア
    ニジウムの存在下で組み換え宿主細胞を溶解させて細胞溶解物をスルホン化する
    こと、 （ｂ）好ましくは細胞残渣を除去した後に、両性イオン性界面活性剤で処理する
    こと、 （ｃ）スルホン化組み換え蛋白を精製すること、あるいはスルホン化組み換え蛋
    白を精製し、その後両性イオン性界面活性剤を除去すること、ここに好ましくは
    、精製はクロマトグラフィー、より好ましくはＮｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィ
    ーであり、組み換え蛋白はＨｉｓ−タグを付した組み換え蛋白である、 （ｄ）好ましくはモル過剰のＤＴＴのごとき還元剤でスルホン化組み換え蛋白を
    脱スルホン化すること、 （ｅ）モル過剰のＤＴＴの存在下で貯蔵すること、あるいは即座にアッセイに使
    用すること を含む、システイン含有組み換え発現蛋白の精製方法。
  21. 【請求項２１】 図１に示されるポリペプチド（配列番号：３〜１８）をコ
    ードするＨＣＶポリ核酸あるいはＨＣＶポリ核酸のユニークな部分、より詳細に
    は図２−１、３−１、４−１、５−１、６−１、７−１または８−１（配列番号
    ：１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１）に示された配列を有するポ
    リ核酸。
  22. 【請求項２２】 図２−１、３−１、４−１、５−１、６−１、７−１また
    は８−１に示され、その産物が疑陽性ＨＣＶ試料と反応しないという事実により
    特徴づけられる請求項２１記載のポリ核酸、あるいは疑陽性ＨＣＶ試料と反応し
    ないＮＳ３エピトープをコードしている該ポリ核酸の部分。
  23. 【請求項２３】 請求項２１または２２記載のポリ核酸を含む組み換えベク
    ター。
  24. 【請求項２４】 請求項２３記載のベクターを含む宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 請求項２１または２２記載の核酸配列を検出する方法であ
    って、 該核酸をプローブと接触させ； 該核酸と該プローブとの間に形成された複合体を調べること を含む方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２１または２２記載の核酸の検出のためのプローブ
    またはプライマーとして使用される、請求項２１または２２記載の単離核酸また
    はそのフラグメント。
  27. 【請求項２７】 請求項２６記載の少なくとも１つのプライマーおよび／ま
    たは少なくとも１つのプローブを含む、請求項２１または２２記載の核酸配列の
    検出のためのキット。
  28. 【請求項２８】 請求項２１または２２記載のポリ核酸によりコードされる
    ポリペプチドのアミノ酸配列の一部または全体を有するＨＣＶポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 Ｓ１２００、Ａ１２１８、Ａ１３８４、Ｐ１４０７、Ｖ１
    ４１２、Ｐ１４２４もしくはＦ１４４４のいずれか、またはこれらのアミノ酸と
    Ｌ１２０１、Ｓ１２２２、Ｉ１２７４、Ｓ１２８９、Ｔ１３２１、Ａ１３２３、
    Ｔ１３６９、Ｌ１３８２、Ｖ１４０８、Ａ１４０９もしくはＦ１４１０のいずれ
    かとの組み合わせを含むＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ蛋白またはＨＣＶ ＮＳ３ヘリ
    カーゼ蛋白の部分。
  30. 【請求項３０】 請求項２８または２９記載のポリペプチド、またはその機
    能的に同等な変種またはフラグメントを含む医薬組成物。
  31. 【請求項３１】 ＨＣＶ感染を予防または治療するための医薬として使用さ
    れる、請求項２８または２９記載のポリペプチド、またはその機能的に同等な変
    種またはフラグメントを含む医薬組成物。
  32. 【請求項３２】 請求項２８または２９記載のポリペプチドを検出する方法
    であって、 該ポリペプチドを該ポリペプチドに結合するリガンドと接触させ、 該ポリペプチドと該リガンドとの間に形成された複合体を調べること を含む方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２８または２９記載のポリペプチドに結合するリガ
    ンド。
  34. 【請求項３４】 医薬上許容される賦形剤と混合された請求項３３記載の少
    なくとも１つのリガンドを含む、医薬として使用される組成物。
  35. 【請求項３５】 診断または治療目的の請求項２８または２９記載のポリペ
    プチドの製造方法。
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