JPH04305156A - Ｃ型肝炎ウイルス関連抗体および抗原の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検査測定用試薬、精製
用試薬として有用なＣ型肝炎ウイルス（以下ＨＣＶと記
載することがある）関連抗原に対する抗体、Ｃ型肝炎ウ
イルス関連抗原、およびそれらの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）型慢性肝炎のチン
パンジーのプラズマより調製されたＲＮＡからｃＤＮＡ
ライブラリーが作製された。このライブラリーからＮＡ
ＮＢ型肝炎患者の回復期血清と反応する陽性クローン（
５−１−１）が分離され、ジーン・ウオーキングによっ
て最終的に約１０ｋｂから成るＨＣＶ遺伝子の大部分（
７３１０　ｂｐ）が解明された（ＷＯ　８９／０４６６
９；特開平２−５００８８０）。続いて、このＨＣＶの
抗原Ｃ１００−３（３６３アミノ酸残基）とヒト・スー
パーオキシド・ディスムターゼ（１５４アミノ酸残基）
とから成る融合蛋白が酵母で生産され、この抗原を用い
る抗ＨＣＶ抗体の測定系が開発された［Ｑ．　Ｌ．　Ｃ
ｈｏｏら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２４４，　
３５９　（１９８９）；　Ｇ．　Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，　２４４，　３６２（１９８９）］。この方法で
測定されるＨＣＶ抗体は、従来の基準でＮＡＮＢ型肝炎
と考えられていた症例のなかに多数見出され、米国では
輸血後ＮＡＮＢ型肝炎の７１％、散発性ＮＡＮＢ型肝炎
の５８％に検出された。また、輸血後ＮＡＮＢ型の慢性
肝炎では、イタリアで８４％、日本で７８％に抗ＨＣＶ
抗体が検出された〔Ｇ．　Ｋｕｏ　ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２４４，　３６２（１９８９）］。スペインでは輸血
後ＮＡＮＢ型肝炎の８５％に抗ＨＣＶ抗体が検出された
。また、薬物常用者では７０％に抗ＨＣＶ抗体が検出さ
れ、ＨＣＶが注射器や針を介して感染する危険性の高い
ことが示唆された［Ｊ．　Ｉ．　Ｅｓｔｅｂａｎら、ラ
ンセット　（Ｌａｎｃｅｔ）　ｉｉ，　２９４　（１９
８９）］。 Ｙ．　Ｋｕｂｏら［ニュークレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．），　１７，　
１０３６７　（１９８９）］は、輸血後ＮＡＮＢ型肝炎
を発症した日本人供血者プラズマからＲＮＡを分離し、
ＨＣＶｃＤＮＡを作製し、ＨＣＶの非構造蛋白質領域３
（ＮＳ３）に特異的なオリゴヌクレオチド・プライマー
を用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣ
Ｒ）によりｃＤＮＡを増幅させた。このｃＤＮＡ（Ｊ１
と命名、５８３ヌクレオチド）は、上述のチンパンジー
由来のプロトタイプのＨＣＶ　ｃＤＮＡと比較して、ヌ
クレオチド・レベルで７９．８％、アミノ酸レベルで９
２．２％の相同性を示した。この結果は、ＨＣＶにサブ
タイプの存在することを示唆した。

【０００３】Ｈ．　Ｏｋａｍｏｔｏら［ジャパニーズ・
ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（
Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．），６０，　１６
７　（１９９０）］は、抗ＨＣＶ抗体陽性のヒト・プラ
ズマおよび抗ＨＣＶ抗体陰性でＮＡＮＢ型肝炎感染性の
証明されたチンパンジー・プラズマからそれぞれＲＮＡ
を抽出し、これをもとにして作製したｃＤＮＡライブラ
リーからＨＣＶゲノムをクローニングし、２種類のサブ
タイプ（それぞれＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４と命名）の５
’末端側配列を報告した。この配列の上流域には、高度
に保存されたアミノ酸配列が存在し、またアルギニンの
ような塩基性アミノ酸の含量が多いことが見出された。 これらの結果から、この配列には、ウイルスのカプシド
蛋白がコードされていると推定された。また、Ｏｋａｍ
ｏｔｏらの報告した配列の１６７４ヌクレオチドの下流
にＷＯ８９／０４６６９で公開された塩基配列の続くこ
とが明らかにされた。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】上述のようにＨＣＶのゲノム
の全域が解明されたが、ＨＣＶにはサブタイプの存在す
ることも証明された。特に、ＮＡＮＢ型肝炎の感染性を
示すが、従来のＣ１００−３抗原を用いる抗ＨＣＶ抗体
測定系では陰性であった検体からＨＣＶのサブタイプが
検出されたことは、従来のＨＣＶ診断法に新たな問題を
提起した。従って、Ｃ１００−３抗原以外の抗原を用い
る別種の抗ＨＣＶ抗体測定系の作製が望まれている。特
に、サブタイプ間でアミノ酸配列の保存された５’末端
側のコード領域を利用する抗体測定系は、サブタイプの
異なるＨＣＶ感染者の抗体の検出・定量に役立つことが
期待される。又、この領域の抗原に対する抗体を作製す
ることができれば、サブタイプの異なるＨＣＶ関連抗原
の検出・定量への応用も期待される。

【０００５】しかしながら、この領域（例えばＭｅｔ１
〜Ｇｌｙ１２０）では塩基性アミノ酸含量が２３％と異
常に高いため、遺伝子工学的に生産する場合には産物が
宿主のプロテアーゼによって分解を受けやすい傾向が予
想されたが、Ｔ７ファージの遺伝子１０産物との融合蛋
白として生産することによって大量かつ安定に生産する
ことが可能となった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の事
情に鑑み、鋭意研究し、ＨＣＶ５’末端領域によってコ
ードされたカプシド蛋白とＴ７ファージ遺伝子１０産物
とから成る融合蛋白を利用する抗体測定法を設定したと
ころ、本測定法は高頻度にＮＡＮＢ型肝炎患者血清を検
出し、またＨＣＶ５’末端領域によってコードされたカ
プシド蛋白に対する抗体を作製したところ、ＨＣＶ関連
抗原に結合能の高い抗体が得られ、免疫組織化学的、免
疫化学的測定法に付すと感度よくＨＣＶ関連抗原を検出
・定量でき、しかも該抗体を用いるとＨＣＶ関連抗原を
効率よく精製できることを見いだし、これらに基づいて
さらに研究した結果、本発明を完成した。

【０００７】本発明は、（１）Ｃ型肝炎ウイルス構造蛋
白であるカプシド蛋白のアミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号：１、ポリペプチド（Ｉ）
）またはＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号：
２、ポリペプチド（ＩＩ））を含む抗原に結合性を示す
抗体；（２）該抗体を用いてＨＣＶ関連抗原を検出・定
量することを特徴とする免疫組織化学的および免疫化学
的測定法；（３）Ｃ型肝炎ウイルス関連抗原を上記抗体
を用いて精製することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス関
連抗原の精製法；（４）（３）の精製法により得られる
Ｃ型肝炎ウイルス関連抗原；（５）（４）の抗原を含む
蛋白質を用いてＣ型肝炎ウイルス関連抗原に対する抗体
を検出・定量することを特徴とする免疫化学的測定方法
に関するものである。抗体を検出・定量する方法に関す
るカプシド蛋白は塩基性アミノ酸含量が高く、宿主のプ
ロテアーゼに分解され易いため、このカプシド蛋白とＴ
７ファージの遺伝子１０産物とからなる融合蛋白質とし
て製造すると比較的安定なものとして得られる。従って
上記５においてＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ
ｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列
番号：１、ポリペプチド（Ｉ））またはＳｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号：２、ポリペプチド（ＩＩ
））のアミノ酸配列を含むＣ型肝炎ウイルス構造蛋白の
カプシド領域とＴ７ファージ遺伝子１０産物とからなる
融合蛋白質を抗原として用いることにより、Ｃ型肝炎ウ
イルス関連抗原に対する抗体を検出・定量する免疫学的
測定法をも包含する。

【０００８】哺乳動物に免疫するＣ型肝炎ウイルス関連
抗原は、得られる抗体が上記したＨＣＶ構造蛋白のカプ
シド蛋白であるポリペプチド（Ｉ）またはポリペプチド
（ＩＩ）に結合するものであるならばＨＣＶ由来の天然
のもの、遺伝子工学的な手法によるもの、あるいは化学
的な合成手法によるもの等いずれでもよいが、ポリペプ
チド（Ｉ）またはポリペプチド（ＩＩ）とＴ７ファージ
遺伝子１０産物とからなる融合蛋白が効率よく得られる
遺伝子工学的手法が好都合に用いられる。

【０００９】上記ポリペプチド（Ｉ）をコードする塩基
配列を含有する組換えＤＮＡとしては、たとえば塩基配
列：５’−ＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡ
ＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣ
ＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＣ
ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＴＧＧ
ＡＧＴＴＴＡＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣ
ＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣＡＣＧＡＣＴＡ
ＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣ
ＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＣＣＴＡＴＣＣＣＣ
ＡＡＧＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧ
ＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧ−３’（配列番号
：３）などが挙げられる。上記ポリペプチド（ＩＩ）を
コードする塩基配列を含有する組換えＤＮＡとしては、
たとえば塩基配列：５’−ＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣＣＣＡ
ＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＡＡ
ＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴＣ
ＡＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＧ
ＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＣＧ
ＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣ
ＧＣＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴ
ＣＧＣＡＡＣＣＴＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＣＣ
ＴＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣＧＡＧ
ＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧ−
３’（配列番号：４）などが挙げられる。上記Ｔ７ファ
ージ遺伝子１０の塩基配列は、ファージ本来の配列でも
よく、またインクルージョン・ボディーを形成するＴ７
ファージ遺伝子１０産物の性質を変えないように変化し
たものであれば何でも良い。

【００１０】上記のＨＣＶポリペプチドをコードするＲ
ＮＡは、ＮＡＮＢ型肝炎患者のプラズマあるいは肝臓か
ら得ることができる。これらの材料からＲＮＡを調製す
る方法としては、グアニジン・チオシアネート法［Ｊ．
　Ｍ．　Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、バイオケミストリー（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　１８，　５２９４　（１
９７９）］などが挙げられる。このようにして得られた
ＲＮＡに既報［ＷＯ　８９／０４６６９］のＨＣＶゲノ
ムの５’末端領域に基づいて合成されたアンチセンス・
プライマー（Ａ）を添加した後、リバース・トランスク
リプターゼを加えてｃＤＮＡを合成することができる。 このｃＤＮＡ標品に既報［Ｈ．　Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ
ｐｎ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．，　６０，　１６７
　（１９９０）］のＨＣ−Ｊ１の５’側末端コード領域
に相当するセンス・プライマー（Ｂ）とアンチセンス・
プライマー（Ｃ）を添加し、製造業者（たとえば、Ｃｅ
ｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）　のキットの指示
書に従ってＰＣＲを行うことができる。増幅されたｃＤ
ＮＡを自体公知の方法、たとえばアガロース電気泳動で
分離した後、ゲルから回収することができる。このｃＤ
ＮＡの塩基配列はジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法
［Ｔ．　Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　
Ｒｅｓ．，　９，　３０９　（１９８１）］によって決
定することができる。

【００１１】クローン化されたｃＤＮＡを有するプラス
ミドはそのまま、あるいは所望により適当な制限酵素で
切り出して別のベクターに挿入して用いることができる
。ベクターとしては、宿主に対応して複製できるもので
あれば何でもよい。宿主がエシェリキア属菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　大腸菌）　の場合には、
大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２［Ｆ．Ｂ
ｏｌｉｖａｒら，　Ｇｅｎｅ，　２，　９５　（１９７
９）］，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣｌ２、ｐＵＣｌ３などが
挙げられる。宿主がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌
の場合には、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ）由来プラスミド、例えばｐＵＢｌ１０　（
Ｔ．　Ｊ．　Ｇｒｙｃｚａｎ　ａｎｄ　Ｄ．　Ｄｕｂｎ
ａｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　
ＵＳＡ，　７５，　１２８　（１９７８）］，ｐＴＰ５
［Ｎ．　Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｇｅｎｅ，　２，９５　（１
９７９）］，　ｐＣｌ９４［Ｄ．　Ｄｕｂｎａｕ，　エ
キスペリメンタル・マニピュレーション・オブ・ジーン
・エクスプレッション（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍ
ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ；　ｅｄ．　Ｍ．　Ｉｎｏｕｙｅ），　８３
頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ），　（１９８３）］などが挙げられる。宿主が酵
母である場合には、酵母由来プラスミド、例えばｐＳＨ
ｌ９［Ｓ．　Ｈａｒａｓｈｉｍａら、モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．
　Ｂｉｏｌ．），４，　７７１（１９８４）］，　ｐＳ
Ｈｌ９−１（ヨーロッパ特許出願公開　ＥＰ−Ａ−０２
３５４３０）などが挙げられる。宿主が動物細胞の場合
には、例えばｐＢＲ３２２にＳＶ４０のｏｒｉの挿入さ
れたｐＳＶ２−Ｘ［Ｒ．　Ｃ．　Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａ
ｎｄ　Ｐ．　Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａ
ｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７８，２０７２（１９８１
）］，ｐｃＤ−Ｘ［Ｈ．　Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｐ
．　Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　
３，　２８０　（１９８３）］などが挙げられる。

【００１２】クローン化されたｃＤＮＡは５’末端に翻
訳開始コドン（ＡＴＧ）を有し、また３’末端に翻訳終
止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡあるいはＴＡＡ）を有してい
てもよい。さらに該ｃＤＮＡを発現させるためにその上
流にプロモーター配列、プロモーター−プレ−プロ配列
あるいはプロモーター−シグナル配列を接続する。本発
明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に
用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいか
なるものでもよい。宿主が大腸菌である場合には、ｔｒ
ｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬ（Ｌは下
付きのＬである）プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔ
ａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｒｅｃＡプロ
モーターなどが挙げられ、とりわけＴ７プロモーターが
好ましい。宿主がバチルス属菌である場合には、ＳＰＯ
１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロ
モーター、ＭＷＰプロモーターなどが挙げられ、とりわ
けＭＷＰプロモーターが好ましい。宿主が酵母である場
合には、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＧＫプロモーター
、ＰＨＯ５プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ
８１プロモーターなどが挙げられ、とりわけＧＡＰＤＨ
プロモーターが好ましい。宿主が動物細胞である場合に
は、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプ
ロモーターなどが挙げられる。プロモーターは対応する
遺伝子より調製することができる。また、化学合成する
こともできる。

【００１３】シグナル配列およびプレ−プロ配列は、宿
主で機能するものであれば何でもよい。大腸菌の場合に
は、β−ラクタマーゼ遺伝子のシグナル配列、エンテロ
トキシン遺伝子のシグナル配列、アルカリ性ホスファタ
ーゼ遺伝子のシグナル配列、ＯｍｐＡ遺伝子のシグナル
配列などが挙げられる。バチルス属菌の場合には、α−
アミラーゼ遺伝子のシグナル配列、中性プロテアーゼ遺
伝子のシグナル配列、ＭＷＰ遺伝子のシグナル配列など
が挙げられる。酵母の場合には、卵白リゾチーム遺伝子
のシグナル配列、ヒト・リゾチーム遺伝子のシグナル配
列、インベルターゼ遺伝子のシグナル配列、α−ファク
ター遺伝子のプレ−プロ配列などが挙げられる。動物細
胞の場合には、インターロイキン２遺伝子のシグナル配
列などが挙げられる。このようにして構築されたポリペ
プチドＩまたはＩＩをコードする塩基配列を含有する組
換えＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を
製造する。宿主としては、例えばエシェリキア属菌、バ
チルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。エシェ
リキア属菌としては、エシェリキア・コリＫ１２ＤＨ１
［Ｂ．　Ｌｏｗ，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，　１６０　（１９６８）］、
Ｃ６００［Ｒ．　Ｋ．　Ａｐｐｌｅｙａｒｄ，ジェネテ
ィックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），　３９，　４４０　（
１９５４）］、ＭＭ２９４［Ｋ．　Ｂａｃｋｍａｎら、
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳ
Ａ，７３，　４１７４　（１９７６）　］などが挙げら
れる。バチルス属菌としては、例えばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４
［Ｋ．　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ．　２４，　
２５５　（１９８３）］、２０７−２１［Ｋ．　Ｏｈｍ
ｕｒａら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．），　９５，　８７　（１９８４
）］、バチルス・ブレビス４７［Ｓ．　Ｕｄａｋａ．　
アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（
Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　４０，　
５２３　（１９７６）］などが挙げられる。酵母として
は、例えばサッカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｓｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ
￣［Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ
ｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８０，１　（１
９８３）］，ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、ＮＡ７
４−３Ａ、ＮＡ７４−３Ａρ￣［Ｙ．Ｋａｉｓｈｏ　ら
、イースト（Ｙｅａｓｔ）　，　５，　９１　（１９８
９）］やシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）　ＡＴＣＣ
３８３９９（ｈ￣　ｌｅｕｌ−３２），　ＴＨ１６８（
ｈ９０　ａｄｅ６−Ｍ２１０　ｕｒａｌ　ｌｅｕｌ）［
Ｍ．　Ｋｉｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｃ．　Ｓｈｉｍａｄａ
，　カレント・ジェネティクス（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ），　１０，　４４３　（１９８６）］な
どが挙げられる。動物細胞としては、例えば付着細胞で
あるサルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＬ細胞、
ヒトＦＬ細胞、および浮遊細胞であるマウスミエローマ
細胞（ＳＰ２／０など）、マウスＹＡＣ−１細胞、マウ
スＭｅｔｈＡ細胞、マウスＰ３８８細胞、マウスＥＬ−
４細胞などが挙げられる。

【００１４】エシェリキア属菌を形質転換するには、例
えばＴ．　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　２４９頁　（１９８２）
などに記載の方法に従って行われる。バチルス属菌を形
質転換する方法としては、Ｓ．　Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　
Ｓ．　Ｎ．　Ｃｏｈｅｎ，モレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎ
ｅｔ．），　１６８，　１１１　（１９７９）　などに
記載の方法に従って行われる。酵母を形質転換するには
、例えば　Ａ．　Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ
ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７５，　１９
２９　（１９７８）に記載の方法に従って行われる。動
物細胞を形質転換するには、例えば　Ｍ．　Ｗｉｇｌｅ
ｒら、セル（Ｃｅｌｌ），　１４，　７２５　（１９７
８）に記載の方法に従って行われる。このようにして得
られた形質転換体をそれ自体公知の方法で培養する。宿
主がエシェリキア属菌である形質転換体を培養する際、
培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ
９培地［Ｊ．　Ｈ．　Ｍｉｌｌｅｒ，　エクスペリメン
ツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ），４３１頁，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　（１９７２）］が
好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働
かせるために、例えばイソプロピルチオガラクトシド（
ＩＰＴＧ）やインドリル−３−アクリル酸のような薬剤
を加えることができる。培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えるこ
ともできる。宿主がバチルス属菌である形質転換体を培
養する際、培地としては、例えばＬ−ブロス培地、Ｔ２
培地［Ｓ．　Ｕｄａｋａ，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．
　Ｃｈｅｍ．，４０，　５２３（１９７６）］などが挙
げられる。培養は通常約１５〜３７℃で約６〜９６時間
行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿
主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては
、例えばバークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最
小培地［Ｋ．　Ｌ．　Ｂｏｓｔａｉｎら、Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７７，　４
５０４　（１９８０）］などが挙げられる。培地のｐＨ
は約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０
〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、例えば約５〜２０％の牛胎児血
清を含むＭＥＭ培地［Ｈ．Ｅａｇｌｅ，　サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ），　１３０，　４３２　（１９５９）
］、ＤＭＥＭ培地［Ｒ．　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ａｎｄ　
Ｇ．　Ｆｒｅｅｍａｎ，　ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ），　８，　３９６　（１９５９）］、ＲＰＭＩ−
１６４０培地［Ｇ．　Ｅ．　Ｍｏｒｅら、ジャーナル・
オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（Ｊ．Ａｍ．　Ｍｅｄ．　Ａｓｓｏｃ．），　１９９，
　５１９　（１９６７）］、１９９培地［Ｊ．　Ｆ．　
Ｍｏｒｇａｎら、プロシージング・オブ・ザ・ソサイエ
ティ・フォー・エクスペリメンタル・バイオロジー・ア
ンド・メディスン（Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　
Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．），　７３，１　（１９５０）］
などが挙げられる。培養は通常約３０〜４０℃で約１５
〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。上
記培養物から、ＨＣＶ由来の新規なポリペプチドを単離
するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせ
て行うことができる。これらの公知の分離・精製法とし
ては、塩折や溶媒沈澱などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など
が挙げられる。

【００１５】このようにして得られたＨＣＶ由来ポリペ
プチドを免疫するに際しては、該ポリペプチドをキャリ
ア蛋白との複合体としてから、これを免疫に用いてもよ
い。該キャリア蛋白としては、例えば、牛血清アルブミ
ン、牛サイログロブリン、ヘモシアニンなどが挙げられ
る。該ポリペプチドとキャリア用蛋白との結合には、公
知の常套手段を用いて実施し得る。結合に用いる試薬と
しては、例えば、グルタールアルデヒド、水溶性カルボ
ジイミドなどが挙げられる。ペプチドとキャリア用蛋白
との使用比は、約１対１ないし約１対４が適当であり、
反応のｐＨは、中性付近、特に７．３前後が良好な結果
を与える場合が多い。また、反応に要する時間は、約２
〜６時間が良い場合が多いが、特に、約３時間が適当で
ある。このようにして作製された複合物は、常套手段で
約４℃前後で水に対して透析し、凍結して保存しても良
いし、凍結乾燥して保存しても良い。

【００１６】ポリクローナル抗体を製造するためには、
以上のようにして製造した免疫原が、温血動物に接種さ
れる。上記抗体の製造に用いられる温血動物としては、
例えば、哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ラ
ット、マウス、モルモット、ウマ、ブタ）、鳥類（例、
ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙
げられる。免疫原を、温血動物に接種する方法としては
、動物に接種する免疫原は、抗体産生をするに有効な量
で良く、例えば、ウサギに１回１ｍｇを１ｍｌの生理食
塩水およびフロイントの完全アジュバントで乳化して、
背部ならびに後肢掌皮下に４週間おきに５回接種すると
抗体を産生させる場合が多い。このようにして、温血動
物中に形成された抗体を採取する方法としては、例えば
ウサギでは、通常最終接種後７日から１２日の間に耳静
脈から採取し、遠心分離して血清として得られる。得ら
れた抗血清は、通常、ＨＣＶ由来ポリペプチドを保持さ
せた担体を用いるアフィニティクロマトグラフィーで吸
着した画分を回収することによりポリクローナル抗体を
精製することが出来る。また、ミルスタイン（　Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ　）らの方法〔ネイチャー（　Ｎａｔｕｒｅ
　）、２５６、４９５（１９７５）〕に記載の方法と同
様の方法により得られるモノクローナル抗体も利用でき
る。即ち、該モノクローナル抗体は、免疫原のポリペプ
チドまたは蛋白複合体で哺乳動物を免疫し、取りだした
脾臓細胞と同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融
合によりハイブリドーマとし、これをクローン化し、こ
こで得られたハイブリドーマを哺乳動物に接種し、モノ
クローナル抗体を生成蓄積せしめ、これを採取して製造
される。抗体分子は、ＩｇＧ　でもよく、または、その
フラクション｛例、Ｆ（ａｂ´）２，Ｆａｂ´もしくは
Ｆａｂ｝であってもよい。なかでも、標識剤を直接結合
させる抗体分子はＦａｂ´であることが好ましい。この
ようにして得られた抗体は、ＨＣＶ関連抗原の免疫組織
化学的・免疫化学的測定法における試薬として用いるこ
とができる。該ＨＣＶ関連抗原の免疫組織化学的・免疫
化学的測定法によって、生体組織や体液中のＨＣＶ関連
抗原の検出・定量が可能となる。これにより、例えば肝
組織や体液中のＨＣＶ関連抗原を検出・定量することに
より、ＨＣＶに関連する肝炎の診断に役立つと考えられ
る。本発明の免疫化学的測定法において用いられるＨＣ
Ｖ関連抗原に対する抗体としては、ＨＣＶ構造蛋白のカ
プシド蛋白に対して結合能を有すものであればいずれで
もよい。特に、該カプシド蛋白とＴ７ファージ遺伝子１
０産物とから成る融合蛋白を免疫原として得られた抗体
が好ましい。

【００１７】ＨＣＶ関連抗原の測定方法において用いら
れる担体上に保持された抗体における担体としては、例
えば、ゲル粒子（例、アガロースゲル〔例、セファロー
ス４Ｂ、セファロース６Ｂ、（ファルマシア・ファイン
ケミカル社（スウェーデン）製）〕、デキストランゲル
〔例、セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１
００、セファデックスＧ−２００（ファルマシア・ファ
インケミカル社（スウェーデン）製）〕、ポリアクリル
アミドゲル〔例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−
６０、バイオゲルＰ−１００（バイオラッド・ラボラト
リーズ社（米国）製）〕、セルロース粒子〔例、アビセ
ル（旭化成製）、イオン交換セルロース（例、ジエチル
アミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
）〕、物質的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラ
スロッド、アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガ
ラスロッド）、シリコン片、ステンレス系樹脂（例、ポ
リスチレン球、ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用
プレート（例、ヌンク社（デンマーク）製）〕、イオン
交換樹脂｛例、弱酸性イオン交換樹脂〔例、アンバーラ
イト　ＩＲＣ−５０（ローム・アンドハース社（米国）
製）、ゼオカーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）
製）、弱塩基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバーライト
　ＩＲ−４Ｂ、ダウエックス３（ダウケミカル社（米国
）製）〕｝などが挙げられる。担体に抗体を保持させる
には、公知の常套手段を応用し得るが、例えば、“代謝
”、第８巻（１９７１年）、第６９６頁に記載されてい
るブロムシアン法、グルタールアルデヒド法などが挙げ
られる。また、より簡便な方法として物理的に抗体表面
に吸着させてもよい。

【００１８】標識剤を結合させた抗体における標識剤と
しては、放射性同位元素、酵素、螢光物質、発光物質な
どが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。酵素と
しては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることが
できるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダ
ーゼとしては、種々の起源のものを用いることができる
が、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナップル
、イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなどから得
られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびか
ら抽出されたホースラディッシュ　ペルオキシダーゼ（
　ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　）
（　ＨＲＰ　）が好ましい。ペルオキシダーゼと抗体を
結合するにあたり、抗体分子としてのＦａｂ´のチオー
ル基を利用するために、あらかじめペルオキシダーゼに
マレイミド基を導入したものを用いると好都合である。 マレイミド基をペルオキシダーゼに導入する方法として
は、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してマレイミド基
を導入することができる。そのためには、Ｎ−サクシニ
ミジル−マレイミド−カルボキシレート誘導体を用いる
ことができ、好ましくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチル
オキシ）サクシイミド（　ＧＭＢＳ　と略称することも
ある）などが良い。従って、マレイミド基とペルオキシ
ダーゼとの間に一定の基が入っていてもよい。 ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させるには、両者を
、ｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０℃の
温度で約１０分ないし２４時間反応させることによって
行われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＨ７．０の
０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにし
て得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、たとえば
ゲルろ過クロマトグラフィーなどにより精製することが
できる。該ゲルろ過クロマトグラフィーを行う際に用い
られる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５
〔ファルマシア・ファインケミカル社（スウェーデン）
製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラトリー
ズ社（米国）製〕などが挙げられる。マレイミド化ペル
オキシダーゼと抗体分子との反応は、両者を緩衝液中で
約０℃ないし４０℃の温度で、約１ないし４８時間反応
させることにより行うことができる。該緩衝液としては
、例えば、ｐＨ６．０の５ｍＭ　エチレンジアミン四酢
酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液などが挙げ
られる。このようにして得られたペルオキシダーゼ標識
抗体は、たとえばゲルろ過クロマトグラフィーなどによ
り精製することができる。該ゲルろ過クロマトグラフィ
ーを行う際に用いられる担体としては、例えば、セファ
デックスＧ−２５〔ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーデン）製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド
・ラボラトリーズ社（米国）製〕などが挙げられる。さ
らに、ペルオキシダーゼにチオール基を導入し、マレイ
ミド化された抗体分子と反応させてもよい。ペルオキシ
ダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるには、ペルオ
キシダーゼの場合に準じて行うことができ、また、自体
公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法，水溶性カ
ルボジイミド法などが用いられる。本発明の免疫化学的
測定系における被検試料としては、尿、血清、血漿、髄
液等の体液、あるいは、動物組織、動物細胞や菌体の抽
出液またはその培養上清が挙げられる。

【００１９】免疫組織化学的検索を行う場合は、ＨＣＶ
構造蛋白のカプシド蛋白に対する抗体を上記のように直
接ペルオキシダーゼで標識しても可能であるが、ビオチ
ン化した該抗体を用いる直接的あるいはビオチン化二次
抗体を用いる間接的アビジン−ビオチン複合体染色法〔
ＡＢＣ法，ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・ア
ンド・サイトケミストリー（　Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅ
ｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．　）　２９，　５７７　（　
１９８１　）は、感度が高く、また非特異的染色が少な
いので有利に用いられる。本発明の免疫組織化学的検索
における被検材料としては、ヒト、チンパンジー等の肝
臓およびそれらに由来する細胞・組織片などが挙げられ
る。ＨＣＶ関連抗原を、ＨＣＶ構造蛋白のカプシド蛋白
に対する抗体を用いて精製するには、該抗体を用いてア
フィニティーカラムクロマトグラフィーを実施すること
により行うことができる。該アフィニティーカラムクロ
マトグラフィーは、たとえば、該抗体を適切な担体にカ
ップリングさせ、これをカラムに充填し、ＨＣＶ関連抗
原を含む溶液をカラムに通して吸着させ、次いで溶出さ
せることにより行うことができる。該担体としては、た
とえば、先に記載された担体と同様のものが挙げられる
。とりわけゲル粒子や各種合成樹脂が好都合に用いられ
る。たとえば、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル
社製），アフィゲル−１０，アフィゲル１５（バイオラ
ッド・ラボラトリーズ社製）などが挙げられる。抗体を
担体にカップリングさせるには、公知の常套手段を応用
し得るが、たとえば「代謝」，第８巻（１９７１年），
第６９６頁に記載されているブロムシアン法、グルター
ルアルデヒド法が挙げられる。また、水溶性カルボジイ
ミドを用いる方法、活性エステル法なども用いることが
できるが、より簡単な方法として物理的に担体表面に吸
着させてもよい。

【００２０】このようにして得られた抗体カラムを用い
て精製を行なうには、抗体を結合させた担体を充てんし
た抗体カラムに中性付近の緩衝液中のＨＣＶ関連抗原を
吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、
特異的に吸着させたＨＣＶ関連抗原を溶出させる。特異
的に吸収された抗原を溶出するには、たとえば、低ｐＨ
もしくは高ｐＨの緩衝液、高濃度の塩を含有する緩衝液
を用いて行われる。該低ｐＨの緩衝液としては、たとえ
ばｐＨ２．３の０．１７Ｍ　グリシン−塩酸緩衝液，ｐ
Ｈ１．８の０．１Ｍ　第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩
衝液などが挙げられる。該高ｐＨの緩衝液としては、た
とえばｐＨ１１のアンモニア水、ｐＨ１１．７の０．２
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。該高濃度
の塩を含有する緩衝液としては、たとえば６Ｍグアニジ
ン塩酸溶液、７Ｍ尿素溶液などが挙げられる。上記の溶
出は、バッチ法でもよく、またカラムを用いる方法でも
よい。抗原の溶出液はたとえば透析するなどして精製す
る。低ｐＨの緩衝液で溶出した時は、０．１Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１０．５）、高ｐＨの緩衝液で溶出
した時は、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０
）で中性化したのち、０．１％ＮａＮ３を含む０．０２
Ｍリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析すると
いった方法が挙げられる。また高濃度の塩を含有する緩
衝液で溶出した抗原液は直接に上記のリン酸食塩緩衝液
に透析して保存することもできる。また、上記溶出液ま
たは透析液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥標品として
保存することもできる。

【００２１】このようにして精製されたＨＣＶ関連抗原
は、サブタイプの存在するＨＣＶ蛋白の中ではよくアミ
ノ酸配列の保存された領域で、かつ高度に精製されたも
のであり、ＨＣＶ抗体の検出のための抗原として用いる
ことができる。抗ＨＣＶ抗体の測定方法において用いら
れる担体上に保持されたＨＣＶ関連抗原における担体と
しては、前述の抗体を保持するために用いられる担体で
あればいずれでもよいが、とりわけポリスチレン系で直
径が約２〜９ｍｍ好ましくは約３〜８ｍｍである球状形
態好ましくは球形の合成樹脂が挙げられ、ビーズの表面
が研磨により作製することによってざらざらとした形態
であるものが好ましい。本発明の抗原感作ビーズは、上
記した合成樹脂ビーズをＨＣＶ関連の抗原で公知の方法
［石川栄治著，酵素免疫測定法（医学書院）、イムノエ
ンザイマティック・アッセイ・テクニクス（Ｉｍｍｕｎ
ｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ），１６５頁，１９８０年（Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ
ｉｊｈｏｆｆ　社）］などに従って感作することによっ
て作製することもできるが、抗原感作の前処理として合
成樹脂ビーズの洗浄を行うことによって不純蛋白質等を
除去することができ、ＨＣＶ抗体測定における検出感度
を向上させることができるので好都合である。洗浄処理
としては約０．１〜５％（ｖ／ｖ）好ましくは約１〜２
％（ｖ／ｖ）に非イオン性界面活性剤（例、ポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル（例、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレートなど）、ポリオキシエチレンソルビト
ール脂肪酸エステル（例、ポリオキシエチレンソルビト
ールモノラウレートなど）、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル（例、ポリオキシエチレンステアレートなど）
、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル（例、ポ
リオキシエチレンラウリルアルコール、ポリオキシエチ
レンオレイルアルコールなど）、ポリオキシエチレンア
ルキルアリールエーテル（例、ポリオキシエチレンノニ
ルフェノールなど）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導
体（例、ＨＣＯ−５０，ＨＣＯ−６０などのポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油誘導体など）、ポリオキシエチレ
ンラノリン誘導体、ポリオキシエチレンラノリンアルコ
ール誘導体、ブロックポリマー型非イオン性界面活性剤
（例、プルロニック、Ｌ−６２，Ｌ−６４，Ｆ−６８な
ど）など好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪
酸エステルさらに好ましくはポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ　２０）を溶解した溶
液を用いて、約１０〜５０℃好ましくは約２０〜３０℃
で約１〜１０時間好ましくは約２〜３時間、約１〜１０
回好ましくは約３〜５回洗浄する方法が挙げられる。又
、抗原感作の前処理として合成樹脂ビーズをアルデヒド
類（例、ホルムアルデヒド、ピルビンアルデヒド、グル
タールアルデヒド）好ましくはグルタールアルデヒドで
処理することによってＨＣＶ抗体測定法における検出感
度を向上させることができ、またＨＣＶ抗体測定用試薬
（ＨＣＶ関連抗原で感作した合成樹脂ビーズ）の安定性
を向上させることができるので好都合である。アルデヒ
ド類での処理としては、約０．１〜１２．５％（ｖ／ｖ
）好ましくは約０．８〜２．５％（ｖ／ｖ）のアルデヒ
ド類好ましくはグルタールアルデヒドの水溶液を用いて
、約１０〜５０℃好ましくは約２０〜３０℃で約１０分
〜５時間好ましくは約１〜２時間合成樹脂ビーズを処理
する方法が挙げられる。抗原感作の前処理としては上記
洗浄処理とアルデヒド類での処理とを組み合わせて行う
ことが好ましく、合成樹脂ビーズを洗浄処理後、必要に
応じて乾燥し、アルデヒド類での処理を行うことが好ま
しい。又、合成樹脂ビーズ（好ましくは上記前処理後の
合成樹脂ビーズ）は、抗原感作前に後述する抗原調製に
用いる緩衝液と同一の緩衝液で洗浄しておくのが好まし
い。抗原感作に用いるＨＣＶ関連抗原は、通常約０．５
〜５μｇ／ｍｌ好ましくは約０．８〜１．５μｇ／ｍｌ
となるように弱アルカリ性好ましくはｐＨ約９〜１０の
緩衝液に溶解した後、抗原感作処理に用いられる。緩衝
液としては、ｐＨ９．６程度の炭酸緩衝液が好ましく、
炭酸緩衝液の濃度としては、約０．００５〜０．０５Ｍ
、なかでも約０．０１２４〜０．０２５Ｍが好ましい。 上記のごとく緩衝液にＨＣＶ関連抗原を溶解した抗原溶
液は、そのまま抗原感作処理に用いてもよいが、抗原感
作処理前に約１０〜４０℃好ましくは約２０〜３０℃で
約１〜１０時間好ましくは約４〜６時間さらに好ましく
は約２〜３時間静置して安定化処理を行うことによって
、ＨＣＶ抗体の測定法におけるバラツキが減少し、測定
制度を向上させることができる。合成樹脂ビーズおよび
ＨＣＶ関連抗原は、それぞれ所望により上記した前処理
を行った後、抗原感作処理に用いられるが、例えば抗原
溶液に合成樹脂ビーズを加え、約４℃で一晩放置するこ
とによりＨＣＶ関連抗原で感作した合成樹脂ビーズ（抗
原感作ビーズ）を作製することができる。得られた抗原
感作ビーズは、必要に応じ洗浄（例えば、０．１％（ｖ
／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０　を含有するリン酸緩衝液によ
る洗浄）を行った後、ＨＣＶ抗体の測定に用いることが
できるが、測定時の非特異反応を減少させる目的でブロ
ッキング操作を行い、さらに必要に応じ洗浄（例えば、
０．１％　ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０　を含有するリン
酸緩衝液による洗浄）を行うことが好ましい。ブロッキ
ング操作においては、動物の血清（例えば、ヤギ、ヒツ
ジ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、マウス、ヒトな
どの血清）好ましくはヤギ又はヒツジの血清が用いられ
、又用いられる緩衝液としては例えば０．１％（ｖ／ｖ
）Ｔｗｅｅｎ　２０を含有するリン酸緩衝液などが挙げ
られる。添加する血清濃度としては約１〜２０％（ｖ／
ｖ）なかでも約５〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、ブロ
ッキング処理温度としては約２〜６０℃なかでも約４５
℃が、ブロッキング時間としては約１〜３０時間なかで
も約２〜２０時間が好ましい。又後述の液体試料には、
ブロッキング操作において該動物とは種の異なる動物の
血清が用いられる。本発明の抗原感作ビーズは、液体試
料（例えば、ヒト、チンパンジーの血清又は血漿）中の
ＨＣＶ抗体を測定する酵素免疫測定法において、固相（
感作固相）として用いられるが、例えば液体試料（約５
０μｌのヒト血清など）中のＨＣＶ抗体と通常約１〜２
個の抗原感作ビーズとを反応させ、さらにＨＣＶ抗体（
イムノグロブリン）と反応する酵素標識化抗体を添加し
て得られる固相化酵素標識の酵素活性を測定することに
より、ＨＣＶ抗体の抗体価を測定することができる。抗
原感作ビーズは、ＨＣＶに由来する一種の抗原で感作し
た合成樹脂ビーズをＨＣＶ抗体の測定法に用いてもよく
、又ＨＣＶに由来する二種以上の抗原でそれぞれ個別に
感作した合成樹脂ビーズを同一容器内に入れて、同一液
体試料中のＨＣＶ抗体を測定することもできる。本発明
におけるＨＣＶ関連抗原で感作した合成樹脂ビーズは安
定で、ＨＣＶに対する抗体の測定法に用いる試薬として
優れており、該測定法に該ビーズを用いることによって
該測定法の測定精度、検出感度、再現性が向上すると共
に、非特異反応が減少するので、Ｃ型肝炎の診断・予後
管理の目的で、ＨＣＶ抗体を測定する際に有利に用いら
れる。又、該ビーズは抗原感作処理前にアルデヒド類で
処理することによってさらに安定性が向上するが、抗原
感作処理前のアルデヒド類処理による安定化効果は、Ｈ
ＣＶ関連抗原以外の抗原（例、百日せき、破傷風、ジフ
テリア、ましん、風しん、おたふくカゼ、日本脳炎など
の病原菌又はウィルスに由来する抗原など）で合成樹脂
を感作する場合にも奏されるので、例えば合成樹脂をア
ルデヒド類で処理後に任意の抗原で感作することによっ
て、安定な抗原感作合成樹脂を得ることができる。

【００２２】

【発明の効果】本発明で得られるＣ型肝炎ウイルス構造
蛋白のカプシド蛋白に反応する抗体は、Ｃ型肝炎ウイル
ス関連抗原を免疫組織化学的または免疫化学的測定法で
検定、定量する方法における試薬として、Ｃ型肝炎ウイ
ルス関連抗原の精製の試薬として有効であり、またＣ型
肝炎ウイルス構造蛋白のカプシド蛋白を抗原として用い
ることによるＣ型肝炎ウイルス関連抗原に対する抗体の
検出・定量法は、Ｃ型肝炎ウイルスの感染の有無を知る
ための有効な手段となり得ることが期待される。

【００２３】なお、本願明細書や図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ　Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次
に挙げる。またアミノ酸に関して光学異性体があり得る
場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ　　　　：デオキシリボ核酸 Ａ　　　　　　：アデニン Ｔ　　　　　　：チミン Ｇ　　　　　　：グアニン Ｃ　　　　　　：シトシン ＳＤＳ　　　　：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙ　　　
　：グリシン（Ｇ） Ａｌａ　　　　：アラニン（Ａ） Ｖａｌ　　　　：バリン（Ｖ） Ｌｅｕ　　　　：ロイシン（Ｌ） Ｉｌｅ　　　　：イソロイシン（Ｉ） Ｓｅｒ　　　　：セリン（Ｓ） Ｔｈｒ　　　　：スレオニン（Ｔ） Ｃｙｓ　　　　：システイン（Ｃ） １／２　Ｃｙｓ：ハーフシスチン Ｍｅｔ　　　　：メチオニン（Ｍ） Ｇｌｕ　　　　：グルタミン酸（Ｅ） Ａｓｐ　　　　：アスパラギン酸（Ｄ）Ｌｙｓ　　　　
：リジン（Ｋ） Ａｒｇ　　　　：アルギニン（Ｒ） Ｈｉｓ　　　　：ヒスチジン（Ｈ） Ｐｈｅ　　　　：フェニールアラニン（Ｆ）Ｔｙｒ　　
　　：チロシン（Ｙ） Ｔｒｐ　　　　：トリプトファン（Ｗ）Ｐｒｏ　　　　
：プロリン（Ｐ） Ａｓｎ　　　　：アスパラギン（Ｎ） Ｇｌｎ　　　　：グルタミン（Ｑ） Ａｐｒ　　　　　：アンピシリン耐性遺伝子（注：ｒは
上付きのｒを表す） Ｔｃｒ　　　　　：テトラサイクリン耐性遺伝子（注：
ｒは上付きのｒを表す） なお、本発明のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配
列の一部が修飾（付加、除去、その他のアミノ酸への置
換など）されてもよい。

【００２４】

【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。後述の参考例５で得られた形質転換体エシ
ェリキア　　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦおよびＥ
．ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１Ｃ
Ｆ、は平成２年１１月９日から財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１５１０７およびＩＦＯ　１
５１０８としてそれぞれ寄託されており、又これらの形
質転換体は平成２年１１月２２日から通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−３１７１及びＦＥＲＭ　ＢＰ−３１７２とし
てそれぞれ寄託されている。

【００２５】参考例１　　Ｃ１００−３抗体陽性血漿由
来ｃＤＮＡからのＨＣＶ遺伝子の増幅 ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）製の超遠心ローターＳＷ
２８用チューブに１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．０）を含む１２ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）庶糖を注入し
た後、Ｃ１００−３抗体陽性の血漿２３ｍｌを重層して
室温、２８，０００回転／分（ｒｐｍ）で４時間、超遠
心分離を行った。７０ｍｌ分の該血漿から得られた沈澱
を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２００
ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（メル
ク社製）を含む溶液３ｍｌで溶解し、６５℃、１時間静
置した。この溶液に等容量のフェノールとクロロホルム
を加えて水層を抽出した後、該水相に５μｇのグリコー
ゲン、１０分の１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ４．８）、２倍容量のエタノールを加えて−２０℃で
一昼夜静置した。 この液をエッペンドルフ微量遠心機で室温、１０，００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、得られた沈澱（核
酸画分）を３０μｌの蒸留水で溶解した。一方、既報の
ＨＣＶ塩基配列［Ｈ．　Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．　
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．，　６０，　１６７　（１９
９０）；　ＷＯ　８９／０４６６９；　特開平２−５０
０８８０］の５’末端を塩基番号１とした時、２０２３
〜２０４２に相当するアンチセンス・プライマーＮｏ．
２：５’　　　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　
Ａ　Ｃ　Ａ　Ｃ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　　３’
（配列番号：５）、塩基番号３２５〜３４７［Ｈ．　Ｏ
ｋａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．
，　６０，　１６７　（１９９０）］に対応するセンス
・プライマーＮｏ．２１７：５’　　　Ｃ　Ａ　Ａ　Ｇ
　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｇ　
Ｃ　Ａ　Ｃ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ａ　Ａ
　Ｃ　Ｃ　Ｔ　ＣＡ　　３’（配列番号：６）、塩基番
号６７９〜７０１［Ｈ．　Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．
　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．，　６０，　１６７　（１
９９０）］に対応するアンチセンス・プライマーＮｏ．
２１９：５’　　　Ｃ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　
Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｇ
　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｃ　Ｃ　ＣＡ
　Ａ　　３’（配列番号：７）、をそれぞれ合成し、ｃ
ＤＮＡ作製用プライマーとして用いた。上記核酸画分の
１０分の１量（３μｌ）にプライマーＮｏ．２を６０ｐ
ｍｏｌ加えて７５℃、１０分間保温した後、氷中で急冷
した。 次に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５
ｍＭ　ＫＣｌ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ　各ｄ
ＮＴＰ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、２００ｕｎｉｔｓリバース
・トランスクリプターゼ［ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（Ｔ
ｒａｄｅ　Ｍａｒｋ）　ＲＴ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）］を含有する溶液中で４２
℃、１時間のｃＤＮＡ合成反応を行い、７０℃、１０分
間加熱して反応を停止させた。得られたｃＤＮＡ画分の
５分の１量に２種類のプライマー（Ｎｏ．２１７と２１
９；各１００ｐｍｏｌ）を加え、シータス／パーキン−
エルマー（Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）　
により供給されたキット指示書に従って、９４℃、１分
間、５５℃、２分間、７２℃、３分間の反応を４０回繰
り返すＰＣＲを行った。

【００２６】参考例２　　ＨＣＶｃＤＮＡのクローニン
グとその塩基配列の決定 上記ＰＣＲ産物を１．２％アガロース電気泳動で分離し
た後、ＨＣＶ塩基配列から予想される大きさ（約４００
ｂｐ；塩基番号３２５〜７０１に相当）に相当する位置
のアガロースゲルからＤＮＡ断片を回収した。得られた
ＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ［宝酒造
（株）製］と［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰにより５’末端を
リン酸化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ［宝酒造（株）製
］とＡＴＰによりプラスミドｐＵＣ１１８［宝酒造（株
）製］のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ｃＤＮＡ部分の塩
基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法［Ｊ．　
Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，
　９，　３０９，　（１９８１）］によって決定した。 その結果、該ＤＮＡ断片は既報の配列とは明らかに異な
る１種類のＨＣＶ　ｃＤＮＡ（ａ型）を含んでいること
が分かった。ａ型のｃＤＮＡ断片を含むプラスミドをｐ
ＨＣａ１０１と命名し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列および
塩基配列より予測されるアミノ酸配列を各々図１と図２
に示した。同様に他のＣ１００−３抗体陽性血漿由来ｃ
ＤＮＡについてもＰＣＲを行った結果、ａ型と同じ大き
さの産物が回収された。塩基配列を解析したところ　Ｈ
．　Ｏｋａｍｏｔｏら［Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍ
ｅｄ．，　６０，　１６７　（１９９０）］の報告した
ＨＣ−Ｊ４株と全く同じＨＣＶ　ｃＤＮＡ以外に、新規
なＨＣＶ　ｃＤＮＡ（ｂ型）がクローニングされている
ことが判明した。そこで、上記ｂ型ｃＤＮＡを有するプ
ラスミドをｐＨＣｂ１０１と命名した。 その塩基配列および塩基配列より予測されるアミノ酸配
列を各々図１と図２に示した。これらのａ型とｂ型のｃ
ＤＮＡより予測されるアミノ酸配列は、従来知られてい
たＨＣＶのアミノ酸配列と高い相同性を示したが、既知
のＨＣＶポリペプチドと一致するものはなく、新規なＨ
ＣＶポリペプチドであることが分かった。

【００２７】参考例３　　発現ベクターの構築−１参考
例２で得られたプラスミドｐＨＣａ１０１とｐＨＣｂ１
０１を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した後、それぞれから
０．３８ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。これらの断片を
プラスミドｐＥＴ−３ｘａ［メソッズ・イン・エンザイ
モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ．　ｅｄ．　Ｄ．　Ｖ．　Ｇｏｅｄｄｅｌ），　１８
５巻、６８頁、アカデミック・プレス　（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），（１９９０）］のＢａｍＨＩ部位
に挿入し、プラスミドｐＨＣａ１０１ＣＦとｐＨＣｂ１
０１ＣＦを作製した。

【００２８】参考例４　　発現ベクターの構築−２参考
例２で得られたプラスミドｐＨＣａ１０１とｐＨＣｂ１
０１を制限酵素ＫｐｎＩで消化してそれぞれ開環した後
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により末端を平滑にした
。これらにＢａｍＨＩリンカー（ｐＣＧＧＧＡＴＣＣＣ
Ｇ）（ＮＥＢ製）をＴ４　ＤＮＡリガーゼ［宝酒造（株
）製］を用いて付加した。該リンカーの付加したｐＨＣ
ａ１０１ＣＦを更に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨ
Ｉで処理した後、プラスミドｐＵＣ８のＨｉｎｄＩＩＩ
部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入してプラスミドｐＵ
Ｃａ−ＫＦを作製した。また、該リンカーの付加したｐ
ＨＣｂ１０１を制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化し
た後、プラスミドｐＵＣ１８のＸｂａＩ部位とＢａｍＨ
Ｉ部位との間に挿入してプラスミドｐＵＣｂ−ＫＦを作
製した。これらのプラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＢ
ａｍＨＩで消化し、それぞれから０．２６ｋｂのＢｇｌ
ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。これらの断片をプラスミ
ドｐＥＴ−３ｘａのＢａｍＨＩ部位に挿入し、発現プラ
スミドｐＨＣａ１０１ＫＦとｐＨＣｂ１０１ＫＦを作製
した。

【００２９】参考例５　　形質転換体の作製および発現
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＭＭ２９４に、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３［Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕ
ｄｉｅｒら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．），　１８９，　
１１３　（１９８６）］を溶原化させて作製したエシェ
リキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｍ
Ｍ２９４（ＤＥ３）を、参考例３および４で得られた発
現ベクターｐＨＣａ１０１ＣＦ、ｐＨＣｂ１０１ＣＦ、
ｐＨＣａ１０１ＫＦおよびｐＨＣｂ１０１ＫＦを用いて
形質転換し、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦ（ＩＦＯ　１５１０７）、
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１
ＣＦ（ＩＦＯ　１５１０８）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＭ２９
４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＫＦおよびＥ．ｃｏｌｉ
　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＫＦをそれぞ
れ得た。各形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む１．５ｍｌのＬＢ培地で３７℃、１６時間培養
した。得られた培養液の０．５ｍｌを１０ｍｌの同じ培
地を含む２００ｍｌ容フラスコに移し、３７℃で培養し
、Ｋｌｅｔｔ値が１７０〜２００になった時ＩＰＴＧを
終濃度０．１ｍＭになるように加え、さらに３７℃、２
時間培養した。得られた培養液の１ｍｌから集めた菌体
に５０μｌの蒸留水と５０μｌの２倍濃度のサンプル緩
衝液［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）−２
ｍＭ　ＥＤＴＡ−１％ＳＤＳ−１％メルカプトエタノー
ル−８％グリセロール−０．０２５％ブロムフェノール
ブルー］を加えて懸濁し、１００℃、１０分間加熱した
後、０．１％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルでの
電気泳動にかけた。 泳動後、ゲルをクマジー・ブリリアント・ブルーあるい
は銀染色液で染めたところ、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ　
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦとＥ．ｃｏ
ｌｉ　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＣＦは約
４６キロダルトンの位置に、またＥ．ｃｏｌｉ　ＭＭ２
９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＫＦとＥ．ｃｏｌｉ　
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＫＦは約４４キ
ロダルトンの位置にそれぞれ泳動する特異的な産物を発
現していることが分かった。

【００３０】参考例６　　Ｔ７ファージ遺伝子産物とＨ
ＣＶポリペプチドとから成る融合蛋白遺伝子の大腸菌に
おける発現 参考例５において得られた形質転換体　　Ｅ．ｃｏｌｉ
　　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦ　　及
び　　Ｅ．ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣ
ｂ１０１ＣＦを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２
０ｍｌの培養液（１リットルあたり、バクトトリプトン
１０ｇ，イーストエキストラクト５ｇ，塩化ナトリウム
５ｇを含む）中で３７℃，一晩振とう培養した後、その
１５ｍｌを上記同培地３００ｍｌ（１リットル容フラス
コ中）に移し、更に３７℃で振とう培養を行なった。Ｋ
ｌｅｔｔ値が１７０〜２００になった時点で最終濃度が
０．１ｍＭになるように４０ｍＭのイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を７５０μｌ
加えて、更に３７℃で２時間振とう培養し、菌体を遠心
分離によって集めた。

【００３１】参考例７　　Ｔ７ファージ遺伝子１０産物
とＨＣＶポリペプチドから成る融合蛋白の精製参考例６
において集めた菌体を１０ｍｌの懸濁バッファー〔５０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−１００ｍＭ
　　ＮａＣｌ−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０．１ｍＭ　　Ａ
ＰＭＳＦ−０．５％　　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００〕
に懸濁し、超音波処理を行なった後、８℃，２５０×ｇ
，２０分間遠心分離にかけて、上澄液を得た。更にこの
上澄液を８℃，５０００×ｇ，２０分間遠心分離にかけ
沈殿物を得、これを４ｍｌの１Ｍ尿素バッファー〔１Ｍ
尿素−５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−
１００ｍＭ　　ＮａＣｌ−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０．１
ｍＭ　　ＡＰＭＳＦ−０．５％　　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ
−１００〕によく懸濁し室温で１時間放置した。これを
８℃，５０００×ｇ，２０分間遠心分離にかけ沈殿物を
得、この沈殿物を４ｍｌの４Ｍ尿素バッファー〔４Ｍ尿
素−５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−１
００ｍＭ　　ＮａＣｌ−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０．１ｍ
Ｍ　　ＡＰＭＳＦ−０．５％　　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−
１００〕によく懸濁し室温で１時間放置した。これを８
℃，５０００×ｇ，２０分間遠心分離にかけ沈殿物を得
、この沈殿物を４ｍｌの８Ｍ尿素バッファー〔８Ｍ尿素
−５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−１０
０ｍＭ　　ＮａＣｌ−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０．１ｍＭ
　　ＡＰＭＳＦ−０．５％　　Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１
００〕によく懸濁し、４℃で一晩放置した。 これを８℃，５０００×ｇ，２０分間遠心分離にかけ上
澄液を得た。これに半量の２倍の濃度の　Ｌａｅｍｍｌ
ｉ　ｂｕｆｆｅｒ　を加え、１００℃，１０分間加熱し
た。冷却後１３０００ｒｐｍ，５分間遠心分離にかけ、
上澄液を得た。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
での電気泳動にかけた後、銀染色を行ったところ、Ｅ．
ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１Ｃ
Ｆ及びＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＣＦから
得られた各融合蛋白（それぞれＨＣ−Ｔ１抗原とＨＣ−
Ｔ２抗原と命名）は、ともに約４６キロダルトンの位置
に単一バンドとして検出された。

【００３２】実施例１　　抗原感作量の検討直径６．３
５ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル社）５０
０個にＴｗｅｅｎ　２０（フナコシ薬品株式会社）の１
％（ｖ／ｖ）水溶液１００ｍｌを加えて室温で２時間処
理を行った後、蒸留水で５回洗浄、乾燥した。このポリ
スチレンビーズ５００個に対し最終濃度が２．５％（ｖ
／ｖ）となるようにグルタールアルデヒド溶液（和光純
薬工業株式会社）１００ｍｌを加え、室温で２時間処理
を行い、蒸留水で５回洗浄した後、０．１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム溶液（ｐＨ９．６）で洗浄を行った。このよう
に前処理したポリスチレンビーズ５０個に対し、参考例
７で得られた融合抗原ＨＣ−Ｔ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）で０．３、１、３、１０、３０μｇ／ｍ
ｌの濃度に調製したものをそれぞれ１０ｍｌ添加し、撹
拌後に真空条件下で２時間脱気し、４℃で一夜放置する
ことにより抗原感作を行った。感作後、余剰の結合部位
をふさぐため、それぞれの抗原感作ビーズ５０個に対し
、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０、１０％ヒツジ血清を含有
するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を１
０ｍｌ添加し、ゆっくり振とうしながら３７℃の温湯で
４時間処理、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで洗
浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０、１０％ヒツジ血清、
０．０１％マーチオレート（東京化成株式会社）含有Ｐ
ＢＳ（アッセイ溶液）中で冷蔵保存した。

【００３３】以上のように作製した抗原結合ポリスチレ
ンビーズを１個ずつ丸底型セラムチューブ（住友ベーク
ライト）に入れ、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ
で洗浄後、アッセイ溶液で１０倍希釈した非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血清サンプル４００μｌを添加し、室温で２．５
時間振とうしながら反応させた。反応後、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで３回洗浄し、１５０００倍希
釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（タゴ社）を４
００μｌ加え、室温で４５分間振とうして反応させた。 反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで４
回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質（０．０２％Ｈ２Ｏ２
と０．１５％　　ｏ−フェニレンジアミンを含むｐＨ５
．５のクエン酸ナトリウム緩衝液）を５００μｌ加え、
室温で３０分間反応させ、１Ｎ硫酸１５００μｌを加え
ることにより反応を停止し、その２００μｌをマイクロ
タイタープレートに移し、マイクロプレート用自動比色
計（ＭＴＰ−３２、コロナ社製）を用いて４９２ｎｍに
おける吸光度を測定した。その結果、ＨＣ−Ｔ１抗原を
１μｇ／ｍｌの濃度で感作した場合が最も感度がよく、
８例中５例のサンプルが正常人の平均値＋６Ｓ．Ｄ．以
上の吸光度を示した（表１）。

【００３４】実施例２　　非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿中の
抗ＨＣＶ関連抗体の測定 参考例７記載のＨＣ−Ｔ１，ＨＣ−Ｔ２の２種の抗原を
１μｇ／ｍｌの濃度に調製し、実施例１記載の方法で感
作させたポリスチレンビーズを用いて、２１例の非Ａ非
Ｂ型肝炎患者血清中の抗ＨＣＶ関連抗体の測定を行なっ
た。その結果、抗原としてＨＣ−Ｔ１を用いた場合２１
例中１６例が、ＨＣ−Ｔ２を用いた場合１３例が正常人
の平均値＋３Ｓ．Ｄ．以上の吸光度を示すことが判明し
た（表２）。

【００３５】

【表１】抗原感作量の検討

【００３６】

【表２】非Ａ非Ｂ型肝炎患者血漿中の抗ＨＣＶ関連抗体
の測定

【００３７】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓ
ｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５Ａｒｇ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　
Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ
　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　
Ｔｈｒ　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４５Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａ
ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒ
ｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　　　　　５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６０Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ６５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　７５。

【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：７９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓ
ｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５Ａｒｇ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　
Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ
　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　
Ｔｈｒ　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４５Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａ
ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｒ
ｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　　　　　５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６０Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ６５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　７５。

【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：２３７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ
配列 ＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣ　ＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡ　ＡＡＧ
ＡＡＡＡＡＣＣ　ＡＡＡＣＧＴＡＡＣＡ　ＣＣＡＡＣＣ
ＧＣＣＧ　ＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣ　　６０ＧＴＣＡＡＧ
ＴＴＣＣ　ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧ　ＴＣＡＧＡＴＣＧＴ
Ｔ　ＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴ　ＡＣＣＴＧＴＴＧＣＣ　Ｇ
ＴＧＣＡＧＧＧＧＣ　　１２０ＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧ　
ＧＴＧＴＧＣＧＣＡＣ　ＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧ　ＡＣＴ
ＴＣＣＧＡＧＣ　ＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣ　ＴＴＧＴＧＧ
ＡＡＧＧ　　１８０ＣＧＡＣＡＡＣＣＴＡ　ＴＣＣＣＣ
ＡＡＧＧＣ　ＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣ　ＧＡＧＧＧＣＡＧ
ＧＧ　ＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡ　ＧＣＣＣＧＧＧ　　　　
　２３７。

【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：２３７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ
配列 ＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣ　ＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡ　ＡＡＧ
ＡＡＡＡＡＣＣ　ＡＡＡＣＧＴＡＡＣＡ　ＣＣＡＡＣＣ
ＧＣＣＧ　ＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣ　　６０ＧＴＣＡＡＧ
ＴＴＣＣ　ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧ　ＴＣＡＧＡＴＣＧＴ
Ｔ　ＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴ　ＡＣＣＴＧＴＴＧＣＣ　Ｇ
ＣＧＣＡＧＧＧＧＣ　　１２０ＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧ　
ＧＴＧＴＧＣＧＣＧＣ　ＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧ　ＡＣＴ
ＴＣＣＧＡＧＣ　ＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣ　ＴＣＧＴＧＧ
ＡＴＧＧ　　１８０ＣＧＡＣＡＡＣＣＴＡ　ＴＣＣＣＣ
ＡＡＧＧＣ　ＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣ　ＧＡＧＧＧＣＡＧ
ＧＧ　ＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡ　ＧＣＣＣＧＧＧ　　　　
　２３７。

【００４１】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ
配列 ＣＣＴＣＣＧＡＴＧＡ　ＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧ　　　　
　　　　　　　　　　２０。

【００４２】配列番号：６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ
配列 ＣＡＡＧＡＴＣＴＣＧ　ＧＡＴＧＡＧＣＡＣＧ　ＡＴＴ
ＣＣＣＡＡＡＣ　ＣＴＣＡ　　　　　　　　　　　３４
。

【００４３】配列番号：７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ
配列 ＣＴＡＧＡＴＣＴＴＣ　ＡＧＡＧＧＧＴＡＴＣ　ＧＡＴ
ＧＡＣＣＴＴＡ　ＣＣＣＡＡ　　　　　　　　　　　３
５。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で得られたＨＣＶ　ｃＤＮＡのａ型の塩
基配列およびｂ型の塩基配列をａ型と比較して示した図
である。ｂ型における「−」はａ型のものと同じ塩基で
あることを示す。

【図２】図１の塩基配列から予測されるアミノ酸配列を
示した図であり、ｂ型における「−」はａ型のものと同
じアミノ酸であることを示す

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｃ型肝炎ウイルス構造蛋白のカプシド蛋白
   を認識する抗体。
2. 【請求項２】カプシド蛋白のアミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｔ
   ｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒ
   ｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ
   −Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
   Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａ
   ｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
   −Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
   Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓ
   ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙ
   ｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
   −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
   Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇ
   ｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙまたはＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−
   Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔ
   ｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒ
   ｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
   −Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
   Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌ
   ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
   ｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ
   −Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−
   Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
   ｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
   −Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−
   Ｇｌｙを含む抗原を認識する請求項１記載の抗体。
3. 【請求項３】請求項１記載の抗体の１種または複数種を
   用いることにより、生物学的検体におけるＣ型肝炎ウイ
   ルス関連抗原を検出または定量することを特徴とする免
   疫組織化学的または免疫化学的測定法。
4. 【請求項４】請求項１記載の抗体を用いて精製すること
   を特徴とするＣ型肝炎ウイルス関連抗原の精製法。
5. 【請求項５】請求項４記載の精製法を用いて精製された
   Ｃ型肝炎ウイルス関連抗原。
6. 【請求項６】カプシド蛋白のアミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｔ
   ｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒ
   ｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ
   −Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
   Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａ
   ｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
   −Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
   Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓ
   ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙ
   ｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
   −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
   Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇ
   ｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙまたはＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−
   Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔ
   ｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒ
   ｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
   −Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
   Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌ
   ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
   ｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ
   −Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−
   Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔ
   ｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
   −Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−
   Ｇｌｙを含む抗原を含む蛋白質を用いることによりＣ型
   肝炎ウイルス関連抗原に対する抗体を検出又は定量する
   ことを特徴とする免疫化学的測定法。