FI101966B - Antigeeninen, synteettinen polypeptidi sekä sen käyttö diagnostiikassa - Google Patents

Antigeeninen, synteettinen polypeptidi sekä sen käyttö diagnostiikassa Download PDF

Info

Publication number
FI101966B
FI101966B FI890373A FI890373A FI101966B FI 101966 B FI101966 B FI 101966B FI 890373 A FI890373 A FI 890373A FI 890373 A FI890373 A FI 890373A FI 101966 B FI101966 B FI 101966B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
leu
val
pro
ala
thr
Prior art date
Application number
FI890373A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI101966B1 (fi
FI890373A (fi
FI890373A0 (fi
Inventor
Ann M Moriarty
Original Assignee
Scripps Clinic Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Clinic Res filed Critical Scripps Clinic Res
Publication of FI890373A publication Critical patent/FI890373A/fi
Publication of FI890373A0 publication Critical patent/FI890373A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI101966B1 publication Critical patent/FI101966B1/fi
Publication of FI101966B publication Critical patent/FI101966B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

101966
Antigeeninen, synteettinen polypeptidi sekä sen käyttö diagnostiikassa
Keksintö koskee yhdistelmä-DNA-teknologiaa, ilmentämisvekto-reita ja polypeptidi-ilmentämismarkkereita, ja tarkemmin sanoen geenien kloonausta hepatitis B HBxAgrtä varten, HBxAg:tä sisältävää ilmentämisvektoria sekä koejärjestelmiä ja menetelmiä HBxAg:n ja anti-HBxAg:n esiintymisen määräämiseksi kehon näytteissä.
A. Kloonaus ja vektorit
Eksogeenisen DNA:n liittäminen eukaryoottisiin soluihin on tullut erääksi voimakkaimmista keinoista molekyylibiologiassa. Tämä menetelmä vaatii DNA:n tehokkaan lisäämisen vastaanottavan solun tumaan ja sellaisten solujen identifioimisen tämän jälkeen, jotka ilmentävät vierasta DNA:ta.
Käsiteltyjä vektoreita, kuten plasmideja tai bakteriofageja (faageja) tai muita DNA-sekvenssejä, jotka kykenevät kopioi- : V tiimaan isäntäsolussa, voidaan käyttää sellaisten solujen muo- • · • *·· dostamiseksi, jotka toimivat "tehtaina" muodostaen suuria • · « : * : määriä spesifisiä virusproteiineja. Yhdistelmäplasmideja käy- tetään tällöin eräinä vektoreina, joita nimitetään myös kloo- • · · ;*j*. nausvälineiksi. Ks. US-patentti 4 338 397, johon tässä yhtey- .V. dessä viitataan.
• · · • ·
Plasmidit ovat kromosomiin kuulumattomia geneettisiä osia, • · ·.·.· joita esiintyy erilaisissa bakteerilajeissa. Ne ovat tyypil- • · · V · lisesti kaksisäikeisiä, suljettuja, rengasmaisia DNA-mole- : kyylejä. Eniten käytetty plasmidi on pBR322, vektori, jonka t · · nukleotidisekvenssi ja endonukleaasilohkaisukohdat ovat hyvin • · *; tunnettuja.
• · « · * · .···. Nukleiinihapon valmistus käyttäen plasmidia tai faagivekto-
reita on tullut erittäin suosituksi. Plasmidi tai faagi-DNA
2 101966 lohkaistaan rajoitusendonukleaasilla ja yhdistetään in vitro valittuun vieraaseen DNA:hän. Saatu rekombinanttiplasmidi tai faagi lisätään sitten soluun, kuten E. coliin, ja täten valmistettu solu on indusoitu muodostamaan useita käsitellyn vektorin kopioita. Kun riittävä määrä DNA:ta on valmistettu kloonausvektorin avulla, poistetaan valmistettu vieras DNA ja sovitetaan toiseen vektoriin sen proteiinin tai polypepti-din valmistamiseksi tai kopioimiseksi, jonka vieras geeni koodaa.
Riippuen DNA:sta (kokonainen geeni, cDNA tai bakteerigeeni) voi olla välttämätöntä muodostaa eukaryoottisia kopio- ja siirtosignaaleja ilmentämisen ohjaamiseksi vastaanottosoluis-sa. Nämä signaalit voidaan aikaansaada yhdistämällä vieras DNA in vitro ilmentämisvektorin kanssa.
Ilmentämisvektorit sisältävät DNA-sekvenssejä, joita tarvitaan kloonattujen geenien kopioimiseksi ja niiden lähetti-RNA:n (mRNA) siirtämiseksi proteiineihin. Tällaiset tarvittavat sekvenssit tai valvontaelementit ovat tavallisesti: (1) promoottori, joka ilmoittaa kopioitumisen alkukohdan, (2) ·' päättäjä, joka ilmoittaa kopion loppukohdan, (3) operaattori, • · : *·· joka säätää promoottoria, (4) ribosomin sitoutumiskohta solu- j jen proteiinin synteesilaitteiston alustavaksi kiinnittämi- seksi, ja (5) alku- ja loppukodonit, jotka ilmoittavat prote- :*·*: iinisynteesin alkamisen ja päättymisen.
• · • m · ***** Ollakseen käyttökelpoinen tulee ilmentämisvektorilla olla myös useita lisäominaisuuksia. Sen tulee olla suhteellisen • · *.·.* pieni ja sisältää voimakas promoottori. Ilmentämisvektorissa • · · V : tulee olla yksi tai useampi valinnainen markkeri transfor- : .·. mänttien identifioimisen mahdollistamiseksi. Sen tulee myös • · · • · « · ,·«·. sisältää yhden tai useamman muun rajoitusentsyymin tunnistus- • · 'V kohta vektorin niillä alueilla, jotka eivät ole tärkeitä il- mentämisen kannalta.
• · « • · » · « · « 3 101966
Ilmentämisvektoreiden muodostaminen on tämän johdosta monimutkainen ja jossain määrin vaikeasti ennustettavissa oleva toimenpide. Ainoa varma ilmentämisvektorin tehokkuuden koe on mitata se frekvenssi, jolla ko. mRNArn synteesi alkaa. mRNA:n kvantitatiivinen määräys on vaikeaa ja usein on vaikeaa aikaansaada tarkkoja mittauksia. Muita käytännöllisempiä tapoja on tämän johdosta kehitetty transformaation toteuttamiseksi.
Eräs tällainen tapa on ohjata vieraiden proteiinien synteesiä transformoiduissa soluissa entsymaattisten kokeiden avulla. Useita markkerigeenejä on kehitetty sen seikan toteuttamiseksi, että transformaatio on tapahtunut.
Eräs toinen tapa, jota on käytetty transformaation valvomiseksi, käsittää immunologisten reagenssien käytön. Jos valmistetun proteiinin määrä on riittävän suuri, niin tällöin voidaan käyttää sytoplasmista tai pinta-immunofluorisoimista ja vasta-aineella konjugoitua fluorisoivaa väriä, kuten fluo-reseiinia tai rodamiinia vektorispesifisten proteiinituotteiden toteamiseksi.
: Tavallisemmin viljellään transformoituja soluja radioaktiivi- suuden läsnäollessa immunosaostuksen jälkeen. Tätä menetelmää • V. on käytetty Staphylococcus aureus -proteiinin A immuunikomp- • · leksivalikoimassa [Kessler (1975) J. Immunol. 115.:1617-1624] • «
Da Western-täplämenetelmässä [Renard ym. (1979) Proc. Natl.
• ♦ ·
Acad. Sei. USA 25:3116-3120] transformaatiospesifisten mark- • · · * 1 kereiden toteamiseksi.
:V: Geenien ilmentämisanalyysi käyttäen Simian Virus 40 (SV40)- vektoreita on selvästi yleisin eukaryoottinen transformaatio- . 1. tekniikka biologisella ja immunokemiallisella tasolla. Ge- • · · :1j/ neettinen ja biokemiallinen informaatio, joka koskee SV40-ge- *···1 nomin organisaatiota, on aikaansaatu tai todettu virusgenomin · · • · 4 101966 nukleotiäisen sekvenssin avulla. Ks. Tooze (1980), Molecular Biology of Tumor Viruses, 2. painos, osa 2, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor, New York. Erilaisten SV40-vek-torimolekyylien rakenne perustuu geneettisten signaalien tarkkaan merkitsemiseen ja rajoitueendonukleaasien käyttöön määrättyjen fragmenttien erottamiseksi SV40-genomista.
SV40 on kehitetty aluksi eukaryoottisena siirtovektorina käyttäen hajottavaa järjestelmää. Mulligan ym. (1929), Nature (London), 277:108-114. Tämän jälkeen rakennettiin transformoivia (ei-hajottavia) vektoreita käyttäen SV40-genomin erotettuja segmenttejä. Ks. Elder ym. (1981), Annu. Rev. Genet.
15.: 295-340 .
Hamer ym. olivat ensimmäisiä, jotka ehdottivat, että SV40:tä voidaan käyttää sellaisten geenien kloonaamiseksi, joista ei ollut käytettävissä näytettä. He ehdottivat, että heterogeenisten mRNA-populaatioiden kaksisäikeisiä cDNA-kopioita voitiin "ampua” SV40-vektoriin ja virus, jossa oli haluttu sekvenssi, voitiin identifioida käyttäen radioaktiivista tai • · ·’ ' fluorisoivaa vasta-ainetta.
• t i ·
Hamer ym. esittivät ensimmäisinä SV40-yhdistelmä-ilmentämis-. \ vektorin rakenteen, joka sisälsi ilmentämismarkkerin, vuonna 1979. Hamer ym. (1979), Cell, .17:725-735. Heidän SV40-vek- • · · I . torinsa sisälsi BamHI-endonukleaasi-rajoituskohdan virus-DNA- * * · • · · sekvenssin kohdassa 0,14 karttayksikköä myötäpäivään Haell-rajoituskohdasta kohdassa 0,82 karttayksikköä. Koko aikaisemman geenin A ja virue-DNA:n kopion lisäksi sisälsi tämä vektori virus-promoottorin, johtajan, välisekvenssin, rungon • ·« ·.· · 5'-osan ja viruksen viimeisten 195 mRNA:n 3' -päätesekvenssit .
; Se ei sisältänyt alueen viimeisten sekvenssien 1660 emäsparia ♦ <ep), jota koodaavat virusproteiinit UPI 2 ja 3. Priere ym.
(1978) Nature 273:113-120. ja Reddy ym. (1978), Science, 200:494-502.
5 101966
Kaniinin beeta-globiini-geenikoodaussekvenssit kiinnitettiin edellä esitettyyn vektoriin ilmentämisen markkereina. Sen seikan määräämiseksi, oliko kaniinin beeta-globiinia valmistettu synteettisesti apinan soluissa, jotka oli infektoitu niiden yhdistelmävektorilla, käyttivät Hamer ym. supra ra-dioimmunokoetta, joka kykeni toteamaan niinkin vähän kuin 1,0 nanogrammaa globiinia.
Vaikkakin Hamer ym. kykenivät osoittamaan positiivisesti bee-ta-globiinin muodostumisen, esittivät he useita varauksia SV40/beeta-globiini-yhdistelmäjärjestelmän käytön suhteen. Ensinnäkin, koska globiini liukenee vain huonosti, voi huomattavia häviöitä esiintyä valmistettaessa näytteitä mittausta varten. Täten voi globiinin määrän määrääminen infektoiduissa soluissa olla aina 10-kertaisesti virheellinen. Toiseksi tämä koe ei pysty erottamaan toisistaan autenttista globiinia ja muita immunologisesti samankaltaisia tuotteita kuten läpäissyttä proteiinia tai polypeptidifragmentteja.
Eräs tekijä, jota Hamer ym. eivät esittäneet, on suuri homo-logisuusaste kaikkien eukaryoottisten globiinien välillä. Tämä homologia tekee vaikeaksi erottaa vektorin avulla aikaan-saatua globiinin muodostusta siitä globiinista, joka on endo-;·. geeninen isäntäsolu järjestelmässä .
• · · • · B. Hepatitis B virus-peptidit ia anti-polypeptidi-vasta- **· aineet • · · " ' ' .....
• · · ’·’ * Hepatitis-virukset ovat huomattava erilaisia aineita. Ne • * on ryhmitelty yhteen erikoisesti sen "kohde-elimen" perusteella, johon ne vaikuttavat, nimittäin makean. Vaikkakin joukko viruksia vaikuttaa makeaan systeemisten infektioiden osana, tarkoittaa termi "hepatitis-virukset" tavallisesti tyyppiä A <HAV>, tyyppiä B <HBV> ja ei-A- ja ei-B-aineita.
Näistä kolmesta virustyypistä on HBV kaikkein eniten tutkittu • · biologisella* immunokemiallisella ja kliinisellä tasolla.
» · • « · 6 101966 HBV on luokiteltu DNA-viruksekei ja se poikkeaa useissa suhteissa kaikista muista DNA-virueperheen jäsenistä. HBV-viruk-sen muodostaa ulompi päällyste <paremminkin kalvo tai kuori), jonka muodostavat proteiinit, lipidit ja hiilihydraatit ja jossa on ainutlaatuinen antigeenikompleksi, so. hepatitis-B-pinta-antigeeni (HBsAg). Se sisältää myös sisemmän nukleokap-sidin, jolla on antigeeninen spesifisyys, joka eroaa selvästi pinta-antigeenin spesifisyydestä, so. hepat itis-B-ydinanti-geenin C HBcAg).
Liukoinen antigeeni HBeAg on myös tunnettu tältä alalta. Tämän antigeenin on katsottu muodostuvan HBcAg—polypeptideistä, jotka eivät ole liittyneet HBV-ytimiin ja joilla näin ollen on ainutlaatuinen antigeeni-spesifisyys liittymättömässä tilassa.
Tyypillisissä itsensä rajoittavissa akuuttisissa HBV-infek-tioissa esiintyvät seuraavat serologiset markkerit peräkkäisesti infektoidun isännän seerumissa: HBsAg, HBeAg, anti-HBE anti-HBC ja anti—HBS. Anti-HBE osoittaa todettavissa olevan HBeAg:n mahdollisen häviämisen. Näin on itsensä rajoittavan akuutin HBV-infektion kaikissa tapauksissa. HBS:n häviämisen :jälkeen tapahtuu muutamasta viikosta useisiin kuukausiin pi-;·. tuinen viive ennen anti-HBS:n esiintymistä.
*..* Kroonisen HBV-infektion aikana on läsnä HBsAg ja anti-HBC.
*··’ Isännän seerumissa voi esiintyä joko HBeAG- tai anti-HBE-sero- • · · ’·’ logisia markkereita, so. potilas voi olla joko HBeAg- tai an- • · · ·.*.* ti-HBE-positiivinen.
Herkkiä ja spesifisiä radioimmunokokeita ja entsyymi-immuno-kokeita käytetään yleisesti useiden HBV-markkereiden osoitta-miseksi. Nämä erittäin herkät serologiset kokeet ovat aikaan-saaneet perustan viruksen ilmenemisen ja immuunivasteen mark- ·· kereiden toteamiseksi HBV-infektion kuluessa.
• · * · · 7 101966
Muutamana viime vuotena ovat useat tutkimukset osoittaneet, että jokainen serologinen markkeri osoittaa spesifisen viruksen käyttäytymisen isännän vasteen suhteen HBV:n monistumisen kuluessa. Serologisten markkereiden profiili eri vaiheissa sairauden kliinisen kulun aikana voi täten antaa käyttökelpoista diagnostista ja prognoottista informaatiota.
Hepatitis B-viruksen ja ihmisen hepatosolu-karsinooman <HCC>, maksasyövän, välistä suhdetta on tutkittu laajasti ja seroepi-demiologiset ja histopatologiset löydöt viittaavat voimakkaasti siihen, että HBV on suoraan tai välillisesti osallisena maksasyövän etologiassa. Joukko hepatooma-solulinjoja on johdettu ihmisen HCC:sta ja HBV-spesifisen DNA:n toteaminen, joka on yhdistynyt kahden tällaisen solulinjan genomiin, PLC/ PRF/5 ja EPH3B, on todettu. Kuitenkin näissä solulinjoissa on todettu ainoastaan hepatitis B-pinta-antigeeni kudosviljel— mässä virus-spesifisenä geenituotteenä. Muita HBV:n markke-reita, kuten hepatitis B-ydinantigeenia, hepatitis BE-antigee-nia ja DNA-polymeraasia, ei ole todettu.
Muutamat eläinten DNA—tuumorivirukset voivat aikaansaada transformaation virusgeenien vaikutuksesta, jotka säätävät • ·'. virusgenomin monistumista ja integraatiota, ja näiden virus ten vaikutuksesta transformoiduissa soluissa voi olla T (tuu-l·'*' mori)— tai neo < uus i ) —ant igeeni , jota muodostavat transfor — moivat geenit. Hiljakkoin on todettu antigeeni, joka on ana — *** loginen T-antigeeniin nähden, ihmisen hepatoomasoluissa, jotka • · · •*t* sisältävät integroituja HBV-geenejä, käyttäen anti-komplement- • · · *··.* tista immunofluorisoivaa värjäystekniikkaa. Tälle antigeenil le on annettu merkintä HBV-liittynyt ydin-antigeeni <HBNA).
Wen ym. (1983), Infect. Immun. 3ji: 1361-1367.
HBNA todettiin useiden HBsAg-positiivisten HCC-potilaiden see-rumissa, ja antigeenien muodostuminen todettiin sekä soluvil — ·· jelmäesä että tuumorikudoksessa. Lisäksi anti-HBNA-vasta- aineita todettiin muutamien HBsAg—positiivisten potilaiden 8 101966 seerumissa, joilla oli HCC. HBNA voi edustaa aikaisemmin toteamatonta HBV-gesnin muodostumista.
Vuonna 1979 Galibert ym. Nature 281:646-650. esittelivät HBV-genomin nukleotidisekvenssin, joka on rengasmainen DNA, jossa on noin 3200 emästä ja joka on osittain kaksoissäikei-nen ja osittain yksisäikeinen mikä on ainutlaatuinen ilmiö virusten joukossa. Genomin pitkän eli L-säikeen (täydellisesti rengasmainen) todettiin sisältävän 4 lukukehystä, jotka olivat riittävän suuria aiheuttamaan virusproteiineja. Näitä alueita nimitettiin kirjaimilla S, C, P, ja X ja ne on esitetty kaaviollisesti kuviossa 1.
Alueiden S ja C on todettu sisältävän vastaavasti HBsAg- ja HBcAg-geenit. Alueen P on katsottu koodaavan proteiinin, joka on samankaltainen kooltaan ja aminohappojäännöspitoisuudel-taan kuin DNA-polymeraasi. Alueen X olettivat Wen ym. supra, olevan eräs mahdollinen sellaisen geenin lähde, joka koodaa HBNA:n.
Lähinnä alustava geenien toiminnan esittely alueella P ja X osoittaa aukon, joka on vielä olemassa HBV:n geneettisen or- • ·'; ganisaation ja molekyylibiologian ymmärtämiseksi. Eräs syy ;·. tähän aukkoon on ollut in vitro-järjestelmän puuttuminen tä- män viruksen valmistamiseksi.
• s • · · • « • ·
Viime aikoihin asti on ainoa HBV-lähde ollut ihmispotilaiden « · · * , seerumi. Syy niiden yritysten epäonnistumiseen, jotka on teh- • · · ***** ty viruksen kasvattamiseksi soluviljelmässä, on ollut erit täin kapea isäntäsolualue.
Eräs pyrkimys ratkaista ongelma HBV:n DNA:n ja sen geenituot-: : : teiden valmistamiseksi on ollut käyttää yhdistelmä-DNA-tekno- logiaa. Tämä teknologia mahdollistaa sellaisten nukleiinihap-! posekvenssien suurimittakaavaisen valmistuksen, jotka koodaa- vat määrätyn virusproteiinin.
• i « g 101966
Tiollais ym. (1981), Science 213:406-41 1 , ovat esittäneet E. colin transformaation sellaisen pBR-322:n avulla, joka sisältää HBsAg:n koodaavan geenin, ja ovat ilmoittaneet valmistaneensa huomattavia määriä tätä erotettua geeniä. Nämä tutkijat ovat myös tutkineet HBeAg-geenin sijaintia HBV-genomissa ja niitä tekijöitä, jotka vaikuttavat sen liittymiseen proteiiniin. Näin menetellessään he muodostivat ilmentä-misvektoreita, jotka sisälsivät HBeAg-geenin, jota voitiin käyttää sekä bakteerisoluissa että nisäkkäiden soluissa.
Eräs Tiollaisin ym. supra, muodostamista ilmentämisvektoreista aikaansai proteiinin biosynteesin E. colissa, joka sisälsi HBsAg-antigeeni-pääteasemia. Se muodostettiin sovittamalla osa HBsAg:ta koodaavaa geeniä bakteriofagiin plac5-lUV5 niin, että luonnollisen HBV:n lukukehys säilyi.
Tarkoituksella tutkia HBV-geenin ilmentämistä nisäkkäiden soluissa, muodostivat Tiollais ym. supra, sarjan HBsAg-ilmentä-mieplasmideja sovittamalla transfektio-osia koko HBV-genomin eri kohtiin. Nämä transfektio-osat mahdollistivat sen, että koko HBV-genomi liittyi useissa eri kohdissa hiiren solujen genomiin, jotka oli transformoitu tällä vektorilla. Aikaan-j .'. saadessaan nämä vektorit tällä tavoin pyrkivät nämä tutkijat ;·. käyttämään HBV:n luonnossa esiintyviä geneettisiä säätöele- . menttejä.
• « « · • · · • · • « *** Ainoastaan kolme niistä kuudesta ilmentämisvektorista jotka • s · *·1 1 Tiollais ym. ovat esittäneet supra, muodostivat haluttua • · · *.1·’ HBsAg-proteiinia. Sen tuotanto todettiin tutkimalla sen esiin tyminen kudosviljelmänesteissä käyttäen lampaan anti-HBsAg-antieeerumia. Muita virusmarkkereita, jotka tunnettiin tutkimushetkellä (so. HBcAg, HBeAg ja DNA-polymeraasi>, ei todettu transformoiduissa soluissa.
• 1 Edellä esitetyn Tiollaisin ym. tutkimusajankohtana tunnettiin alueen X mahdollinen esiintyminen ja myös mahdollisuus, että • · • · » · » 1 • · > 10 101966 se voi koodata HBV-proteiinin. Toisin sanoen oli tunnettua, että HBV-genomilla oli kyky koodata useampia proteiineja kuin mitä aikaisemmin oli esiintynyt viruksissa.
Tätä ongelmaa on nimitetty genotyypiksi fenotyyppi-tutkimuksissa. Muun muassa tähän ongelmaan Wen ym. supra, viittasivat, kun he olettivat, että alue X sisältää HBNA:n koodaavan geenin .
Ennen edellä esitettyjä Tiollaisin ym. ja Wenin ym. tutkimuksia Sutcliffe ym. <1980), Nature 267:801-805. osoittivat mm. yleismenetelmän tämän ongelman ratkaisemiseksi. He valmistivat kemiallisesti synteettisesti polypeptidin, jonka proteiinista he pystyivät ennakoimaan sellaisen virusgeenin nukleo-tidisekvenssin, jonka proteiinituote oli tuntematon. He muodostivat tämän polypeptidin vasta-aineita ja ne saatettiin reagoimaan kaikkien niiden soluista valmistettujen proteiinien kanssa, jotka oli infektoitu viruksella. Käyttäen vasta-aineita löydetyn proteiinin osissa Sutcliffe ym. löysivät aikaisemmin tuntemattoman ja toteamattoman virus-proteiinituotteen .
• Tähän asti ei tämän tai minkään muunkaan tekniikan käyttöä ;·. HBV-genomin alueen X proteiinituotteen yksikäsitteiseksi identifioimiseksi ole esitetty. Tämä voi johtua siitä, että • · *..! vaikka yleisiä menetelmiä synteettisten vasta-aineiden valmis- ♦ e • · *** tamiseksi ja niiden käyttämiseksi määrätyn spesifisyyden 4 · · * * omaavien vasta-aineiden aikaansaamiseksi on aikaisemmin ku- • · • · ♦ ***** vattu, jää jäljelle tämän teknologian sellainen huomattava alue, jonka käyttäytymistä ei voida ennustaa.
Tähän on olemassa useita syitä. Ensinnäkin proteiinin amino-:*·*: happo jäännöksen sekvenssit, jotka on johdettu geneettisestä ;’;’j sekvenssistä, ovat luonteeltaan hypoteettisia ellei nukleoti- • i * ; disekvenssin lukukehystä ole varmasti todettu geneettisen koodin moninaisuudesta johtuen.
4*4 • s • · « 11 101966
Toiseksi synteettinen antigeeni ei välttämättä aikaansaa sellaisia vasta—aineita, jotka immunoreagoivat koskemattoman proteiinin kanssa sen alkuperäisessä ympäristössä. Kolmanneksi isännän immunogeenisyyden luonnolliset vasta-aineet tuskin immunoreagoivat polypeptidin kanssa, joka vastaa immunogeenin aminohapposekvenssin lyhyttä lineaarista osaa.
Esillä olevaan keksintöön liittyy useita eri piirteitä. Eräs piirre on yhdistelmä-DNA, joka käsittää ilmentämisvektorin, joka liittyy geeniin, joka koodaa HBxAg:n. Eräässä erittäin edullisessa yhdistelmä-DNA:ssa sisältää DNA:n ilmentämisvekto-ri ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka käsittää Simian Virus 40:n viraalisen DNA-sekvenssin BamHItn endonukleaasi—rajoitus-kohdasta emäksen asemasta 246Θ myötäpäivään Hae 11-endonuk-leaasin rajoituskohtaan emäksen asemassa 767, kuten kuviossa 2 on esitetty, ja se geeni, joka koodaa HBxAg:n, aikaansaadaan toisen geenin DNA-sekvenssin avulla, joka käsittää hepatitis B—viruksen DNA-sekvenssin HaelI-endonukleaasin rajoitus-kohdasta emäsasemaesa 1437 myötäpäivään BamHI—endonukleaaein rajoituskohtaan emäsasemaesa 28 kuvion 1 mukaisesti. Ensimmäinen ja toinen DNA-sekvenssi ovat operatiivisesti liittyneet edistäen HBxAg:n tuotantoa.
: . Keksinnön erään toisen piirteen muodostaa yhdistelmä DNA, jo- : ka käsittää geenin, joka koodaa HBxAg:n tai polypeptidin, jo- • · ka muodostaa oleellisen osan HBxAg: ta. Eräs erittäin edulli- • · nen yhdistelmä-DNA sisältää geenin, joka koodaa HBxAg:n, joi- • ♦ · *;*/ la on kuviossa 1 esitetty emässekvenssi ja joka käsittää emäs- • · · *·*·* asemat 1437 myötäpäivään kohtaan 28 tai sen oleellisen osan.
Plaemidi, joka koodaa ainakin yhden yhdietelmä-DNA:n, joka käsittää geenin, joka koodaa HBxAg:n tai polypeptidin, joka muo-dostaa sen oleellisen osan, muodostaa keksinnön erään toisen toteuttamismuodon. Tämä plaemidi voi käsittää kuviossa 1 esi- I · • · tetyn emässekvenssin, joka peittää emäsasemat 1437 myötäpäi vään asemaan 28, tai sen oleellisen osan. Eräässä erittäin • · • · ♦ « > · · 12 101966 edullisessa toteuttamismuodossa käsittää plasmidi ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka sisältää Simian Virus 40:n <SV40> viraa-lisen DNA-sekvenssin BamHI-endonukleaasi-rajoituskohdasta emäsasemassa 2468 myötäpäivään EcoRI-endonukleaasi-rajoitus-kohtaan emäasemassa 1717 kuvion 2 mukaisesti; toisen DNA-sek-vessin, joka käsittää plasmidin pBR322 DNA-sekvenssin BamHI-endonukleaasiasemasta emäsasemassa 375 myötäpäivään EcoRI-endonukleaasin rajoituskohtaan emäsasemassa 0 kuvion 3 mukaisesti, ja kolmannen DNA-sekvenssin, joka käsittää hepatitis B-viruksen DNA-sekvenssin BamHI-endonukleaasi-rajoituskohdasta emäsasemassa 1400 myötäpäivään BamHI-endonukleaasin rajoi-tuskohtaan emäsasemassa 28 kuvion 1 mukaisesti. Tässä plasmi-dissa ensimmäinen ja toinen DNA-sekvenssi ovat toiminnallisesti kiinnitetyt toisiinsa niiden vastaavissa EcoRI-endonuk-leaasi-rajoituskohdissa, toinen ja kolmas DNA-eekvenssi ovat toiminnallisesti kiinnittyneet toisiinsa niiden vastaavissa BamHI-endonukleaasi-rajoituskohdissa, ja ensimmäinen ja kolmas DNA-sekvenssi ovat toiminnallisesti kiinnittyneet toisiinsa niiden vastaavissa BamHI-endonukleaasi-rajoituskohdissa kuvion 4 mukaisesti.
Menetelmä HBxAg:n tai sen oleellisen polypeptidiosan muodosta- • miseksi käsittää keksinnön erään toteuttamismuodon. Tämän to- a < ;·. teuttamismuodon mukaisesti isäntää, joka sisältää keksinnön • 1 « mukaisen ilmentämisjärjestelmän, kasvatetaan vi 1 jelyväliai- Φ 9 neesea siksi, kunnes HBxAg tai sen oleellinen polypeptidioea • · on muodostunut ja kerääntynyt isäntään tai vi1jelyväliainee- • Φ · seen. Kerääntynyt HBxAg tai sen oleellinen polypeptidiosa fis *·*·* otetaan sitten talteen.
Keksinnön vielä eräs toinen toteuttamismuoto käsittää synteettisen antigeeni-polypeptidin. Tämä synteettinen polypep-; }’: tidi sisältää noin 6-40 aminohappo jäännöstä ja vastaa sekvene- eiltään HBxAg:n antigeenideterminantin sekvenssiä. Eräs erit- • · täin edullinen polypeptidi sisältää aminohappojäännös-sekvens sin, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat polypeptidi- • φ • » • · • « i · · » · « • k « » · s « 13 101966 sekvenssit, joita esittävät eeuraavat kaavat luettuina vasemmalta oikealle ja suunnassa amino-pääteasemasta karboksi-pääteaeemaan.
< i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; < ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-
Lys-Val; < iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala; (iv) Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-Gly; < v) Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-Hie-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys; ja < vi > Met-Glu-Thr-THr-Val-Asn-Ala-His-Gln-1le-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly.
Vesiliukoista tai veteen diepergoituvaa antigeenipolymeeria, • joka sisältää useita yhtyneitä, synteettisiä, toistuvia poly- : peptidiyksiköitä, jotka ovat sitoutuneet toisiinsa hapetettu- jen kysteiinijäännösten avulla, tarkastellaan myös tässä yh- • i .·**. täydessä. Nämä toistuvat yksiköt käsittävät edellä kuvattuja « 4 · polypeptide jä, jotka sisältävät kysteiini jäännöksiä sekä • · · l'·' amino- että karboksi-pääteasemissa, tai jotka sisältävät yh den kysteiinijäännöksen yhdessä pääteasemassa ja yhden kys-teiinijäännöksen polypeptidiketjussa. Erittäin edullisia toistuvia polypeptidiyksiköitä, jotka sisältävät amino-ja karboksi-päätteiset kysteiinijäännökset, on esitetty seu- • · · ’.· · rasvassa kaavassa, joka luetaan vasemmalta oikealle ja suun- nassa amino-pääteasemasta karboksi-pääteasemaan ja jotka sek-venssit on valittu ryhmästä jonka muodostavat: * · 14 101966
Cye-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Αβρ-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lye-Αβρ-Cys;
Cy8-Leu-Phe-Lye-Asp-Trp-61u-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys; 1 2 R -Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Aen-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R ; R -Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Aep-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-
Gly-R ;
Cys-Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-
Gly-Leu-Pro-Val-Cye; ja
Cys-Met-Glu-Thr-Thr-Val-Aen-Ala-Hie-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Cys, 1 2 joissa kaavoissa kukin ryhmistä R ja R on kysteiinijäännös I 2 sillä edellytyksellä, että ainoastaan yksi ryhmistä R ja R on läsnä.
Reseptorimolekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineen yhdyskoh-: dan, kuten sellaisten vasta-aineiden, jotka kykenevät iiranuno- • '·· reagoimaan jonkin edellä mainitun antigeeni-polypeptidin : ' kanssa, tarkastellaan myös tässä yhteydessä. Niitä erittäin :***; edullisia polypeptide jä, joiden kanssa nämä reseptor imolekyy- • e · lit immunoreagoivat, kuvataan edellä esitettyjen polypepti-dien avulla. Nämä reeeptorimolekyylit immunoreagoivat myös HBxAg:n tai sen oleellisen polypeptidiosan kanssa.
Diagnostista koejärjestelmää HBxAg:n todettavan määrän esiintymisen toteamiseksi tutkittavassa kehonäytteessä tarkastel- • · · · laan myös tässä yhteydessä. Tämä järjestelmä käsittää ainakin yhden astian, joka sisältää reagenssin, jossa on edellä ku-....: vattuja reseptorimolekyyle jä. Tämä järjestelmä voi käsittää ·· myös toisen reagenssin toisessa astiassa, joka toinen rea- 15 101966 genssi on synteettinen antigeenipolypeptidi, jonka kanssa re-septorimolekyylit immunoreagoivat. Välineet immunoreaktion ilmoittamiseksi reseptorimolekyylien ja HBxAg:n välillä voivat muodostaa tämän diagnostisen koejärjestelmän lisäosan.
Menetelmä HBxAg:n todettavan määrän ilmaisemiseksi kehon näytteissä käsittää keksinnön erään toisen toteuttamismuodon. Tällöin kehon näytteen proteiinit, joista tutkitaan HBxAg:n todettavissa olevan määrän esiintyminen, sekoitetaan edellä mainittujen reseptorimolekyylien kanssa sellaisten aineiden läsnäollessa, jotka osoittavat immunoreaktion reseptorien ja HBxAgm välillä. Seosta ylläpidetään riittävän pitkä aika, jotta osoituslaitteet voivat antaa signaalin immunoreaktion tapahtumisesta. Tämän signaalin esiintyminen todetaan sitten.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit esitetään oheisissa patenttivaatimuksissa .
Piirustuksissa, jotka muodostavat tämän keksinnön selityksen osan:
Kuvio 1 on kaaviollinen diagrammi, joka esittää HBV/adw-genomin fysikaalisen rakenteen ja geneettisen organisaation, jonka ovat esittäneet Tiollais ym. (1981), Science 213:406-411, siten kuin sen ovat modifioineet Ono ym. (1983), N.A.R. 11:1747-1757. Pit-\.*4 kän (L) säikeen 5'-pään on esitetty kiinnittyneen emäsparin avulla lyhyen (S) säikeen 5'-päähän. Määrätyt rajoituskohdat, • · · l. joita on esitetty nuolilla, jotka on yhdistetty kaariin ja ra- • · · *·*·’ joitusendonukleaasin lyhennyksillä, vastaavat HBV/adw-genomin fysikaalista karttaa, jonka ovat analysoineet Ono ym. supra.
• · ·.·.· Leveät nuolet, jotka ympäröivät genomia, vastaavat neljää suur- • · · •m‘ : ta avointa L-säikeen aluetta. Näitä neljää potentiaalista koo- : |·. dausaluetta on merkitty kirjaimilla S, P, X ja C. Aminohappo- • ♦ · jäännösten numero sulkeissa (aa), kunkin neljän mainitun alueen • · Ί* jälkeen, vastaa sen hypoteettisen polypeptidin pituutta, joka on koodattu kullakin alueella. Ne kaksi aluetta, jotka vastaa- »*· vat määriteltyjä geenejä S ja C, on esitetty pilkutetuilla alueilla leveissä nuolissa. Yhtä EcoRI-endonukleaasilohkaisukohtaa käytetään kartan alkukohtana.
16 101966
Kuviossa 2 on esitetty kaaviollieesti SV40:n DNA-rajoitus-kartta, joka on valmistettu siitä primäärisestä sekvenssistä, jonka ovat julkaisseet Reddy ym. <1978), Science 200:494-501, siten kuin sen ovat modifioineet Van Heuverewyn ja Fiers <1979), Eur. J. Biochem. 100:51-60.
Kuvio 3 esittää kaaviollieesti plasmidin pBR322-rajoituskart-taa, joka on valmistettu niistä primäärisistä sekveseiarvois-ta, jotka on esittänyt Sutcliffe <1979), Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77.
Kuvio 4 esittää kaaviollieesti sitä menetelmää, joka on kuvattu jäljempänä olevassa kohdassa Materiaalit ja menetelmät ja jota käytettiin DNA-fragmenttien sovittamiseksi keksinnön mukaisiin vektoreihin, jotka oli valmistettu AM6:sta Aaltoviivat), pBR322:sta <ehjät viivat) ja SV40:sta <pilkkuviivat) kloonausvektorin SVAM191 ja sitten ilmentämisvektorin SVHBV-3 valmistamiseksi, joka ilmentää huomattavan määrän HBxAg:ta. BamHItn, EcoRI:n ja HaeII:n rajoitus-endonukleaasikohtien suhteelliset asemat on esitetty suljetuilla ympyröillä, avoimilla ympyröillä ja vastaavasti suljetuilla kolmioilla. SV40-genomin alkuperäiset <alkup.) ja aikaiset ja myöhäiset pro- • moottorit on myös esitetty.
Kuvio 5 esittää SVHBV-3 yhdistelmä-i lmentämisvektor in lineaa- « · rista osaa, joka sisältää myöhäisen SV40-promoottorin geenit, • · · amino-pääteasemassa 99 amiohappojäännökset <99aa) ja sen • · · HBxAg-geenisekvenssin oleellisen polypeptidiosan <132aa; 132 • · · aminohapon 154 jäännöksestä), joka koodaa 132 karboksi-pääte-asemassa olevaa aminohappojäännöstä. Esitetty on myös mRNA, joka ilmentää VP2:n HBxAg-fuusioproteiinia tämän vektorin avulla.
* · *
Kuviossa 6 on esitetty siirretty aminohappo jäännössekvenssi , . : joka on esitetty vasemmalta oikealle suunnassa sen geenin 17 101966 amino-pääteasemaeta karboksi-pääteaeemaan, joka koodaa HBxAg:n. Oleellinen osa eitä HBxAg:ta, joka on valmistettu SVBHV-3:n avulla, on esitetty nuolella aminohappojäännöksen asemassa 23 (Ala), joka on valmistetun HBxAg-polypeptidin pääteasemassa oleva aminojäännös. Keksinnön mukaisten synteettisten polypeptidien, jotka on esitetty numeroilla 8, 42, 79, 99, 100 ja 142, suhteelliset asemat HBxAg-sekvenssissä on kuvattu kolmella merkityllä, alleviivatulla aminohappojäännös-sekvenssillä . Synteettisen polypeptidin 99 aminohappojäännös-sekvenssi vastaa täten asemia 100-115 amino-pääteasemasa olevasta, kuviossa esitetystä Met-jäännöksestä, synteettisen po-lypeptidin 100 sekvenssi vastaa asemia 115-131 kuvion Met-jäännöksen amino-pääteasemaeta, ja synteettisen polypeptidin 142 sekvenssi vastaa asemia 144-154 kuvion Met-jäännöksen amino-pääteasemaeta, so. 11 karboksi-päätteistä jäännöstä.
Kuvio 7 on valokuva autoradiogrammista, joka esittää anti-X-antieeerumin reaktiivisuutta kahden ihmisen hepatoomasolu-ly-saatin kanssa. Kaksi ihmisen hepatooma-solulinjaa PLC/PRF/5 ja HepG2 kasvatettiin Eaglen väliaineen Dulbecco-muunnoksessa (DMEM), käyttäen 10 % vasikan sikiön seerumia, niiden yhtymiseen saakka (6. vrk 1:5 lohkeamisesta yhtyneestä viljelmästä).
• Sakan yläpuolella olevat liuokset poistettiin, monokerrokset j ‘.. sisältävät pullot sovitettiin jäähän 5 minuutiksi ennen kuin i solut otettiin talteen kaapimalla, ja talteenotetut solut muo- • ψ j***. dostettiin pallosiksi sentrifugoimalla. Solupalloset pestiin • e e fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), jäähdytet- ·.· · o ,·#·# tiin nopeasti lämpötilassa -70 C ja lyofilisoitiin yli yön.
• · ·
Saadut solujauheet liuotettiin PBS:aan ja saatettiin lopulliseen väkevyyteen 2 milligrammaa per millilitra <mg/ml) pusku-rinäytteeseen. Näytteitä keitettiin 5 min ja solujätteet poistettiin sentrifugoimalla Beckman-mikrofugissa 30 min. 50 mik- • · · ·.' 1 rogrammaa solulysaattia haudottiin 15 min RlPA-puskurissa · /jPBS sisälsi 1 X Nonidet P-40 < polyoks ie ty leeni < 9 ) oktyy 1 i f e- • · • · a • · « · 18 101966 nyylieetteri), 0,05 % natriumdeoksikolaattia ja 0,1 % SDSj ja x 2 5 merkittiin radioaktiiviaesti 3 mikrocuriella I:ta käyttämällä kloramiini t -reaktiota, jonka ovat esittäneet McConahey ym. <1966), Int. Arch. Allergy, 2^.:185-189, Kukin radioak- 6 tiivieeeti merkitty hepatooma-lyaaatti, 1,5 x 10 sykettä mi nuutissa <cpm>, saatettiin reagoimaan 10 mikrolitran kanssa anti-X-polypeptidiä 60 min RIPA:esa. Antigeeni-vasta-aine-kompleksit <immunoreaktiotuotteet) eaostettiin formaliiniin kiinnitetyllä Staphylococcus aureuksella. Palloset pestiin kerran RIPArlla ja kahdesti 500 millimoolilla (mM) LiCl, 100 mM:lla Tris (pH 8,5) ja niiden radioaktiivisuus analysoitiin. Kaikki palloset liuotettiin 40 mikrolitran näytteeseen puskuria /*0,0625 H Tris-HCl (pH 6,8), 2 * SDS, 10 % glyserolia, 5 % 2-merkaptoetanolia ja 0,001 % bromifenolis inistä*/, keitettiin 3 min, sentrifugoitiin solujätteiden poistamiseksi ja käsiteltiin SDS-PAGE:n avulla seuraavasti.
Radioaktiivinen solulysaatti lisättiin denaturoituihin nat-riumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeleihin (12,5 %) (SDS—PAGE) ja käsiteltiin elektroforeesin avulla seuraten menetelmää, jonka on esittänyt Laemmli (1970), Nature 297: 680-685. Proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitrosel- « · • ’.· luloosa-arkeille siten kuin Towbin ym. ovat esittäneet (1979), • '·· Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:4350-4354. Nitroselluloosa— ; * ! täplät värjättiin amidomustaila ennen inkuboimista lämpötilaa— • · o aa 4 C yli yön tuotteessa BLOTTO /Johnson ym. (1983), J. Exp.
* · »
Med . 159 : 1751-1756J ei-spesif iaen sitoutumisen poistamisek- • « · ei. Nitrosellulooealiuskoja inkuboitiin 3 h huoneen lämpöti- • · * lassa käyttäen anti-polypeptidi-vasta-aineiden 1:350-laimen-nusta, lopullisen tilavuuden ollessa 10 ml, tuotteessa BLOTTO. Liuskoja pestiin tuotteessa BLOTTO ennen kuin niitä inkuboitiin 1 h I merkityllä S. aureus-proteiinilla A <10 cpm • · · ’ per 10 ml). Mikäli vertailua polypeptidiin on esitetty jäl- jempänä, niin anti-polypeptidi-antiseerumi inkuboitiin 100 . . *. mikrogramman kanssa polypeptidiä 60 min ennen radioaktiivi- .··, eesti merkityn antigeenin lisäämistä. Liuskat pestiin edellä rt# • · 9 • · I t
.. I
• 9 19 101966 esitetyllä tavalla, huuhdottiin vedellä, kuivattiin ja tutkittiin autoradiografiän avulla. Juovat 1 ja 5 saatettiin reagoimaan anti-polyPePtidi 99-vaeta-aineiden kanssa <anti-99), juova 2 saatettiin reagoimaan anti-99:n kanssa, jota oli esi-inkuboitu polypeptidin 99 kanssa, juova 3 saatettiin reagoimaan anti-99:n kanssa, jota oli esi-inkuboitu vieraan poly-peptidin kanssa, ja juova 4 saatettiin reagoimaan esi-immuuni-seerumivertailun kanssa. HepG2-lysaatit (solulinjat 1-4) eivät reagoineet anti-polypeptidi-99:n kanssa. Numerot vasemmanpuoleisessa reunassa osoittavat suhteellisia proteiinin vaellus-kohtia. Nuolet oikeanpuoleisessa reunassa osoittavat sellaisten proteiinien vaellusasemia, joiden molekyylipainot ovat 28 000 ja 45 000 daltonia.
Kuvio 8 on valokuva, joka esittää anti-X-antiseerumin reaktio-kykyä simpanssin <C juovat 3 ja 4) ja ihmisen (H juovat 1 ja 2) makean kudosten kanssa. Simpanssien ja ihmisten maksaleik-keet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja jauhettiin hienoksi jauheeksi huhmareessa. Solujauheet liuotettiin puskurinäytteeseen ja niitä käsiteltiin geeli-elektroforeesin avulla ja täplitettiin kuviossa 7 kuvatulla tavalla. Nitrosel-luloosaliuskat kehitettiin käyttäen antiseerumin 1:50-laimen- 4 « ; '.· nusta kuviossa 7 kuvatulla tavalla kahta seikkaa lukuunotta- • '·. matta: 1) 1 %:sta naudan seerumin albumiiniliuosta <BSA) käy- : **: tettiin tuotteen BLOTTO sijasta kaikissa inkuboinneissa ja pe- • e ;***; suissa, ja 2) antigeeniin sitoutuneet vasta-aineet todettiin • · · .*!*·. piparjuuriperoksidaasilla konjugoidussa vuohen anti-kaniini- • · ·
IgG:ssa. Antigeeni-vasta-aine-immunoreaktiotuotteet tutkit- » i * tiin silmämääräisesti kastamalla liuskat seuraavaan kehitys- liuokseen. Kehitysliuos valmistettiin 50 ml:sta TBS-puskuria o lämpötilassa 37 C, johon oli lisätty 250 mikrolitraa absoluuttista etanolia, joka sisälsi 8 mg 4-kloori-l-naftolia ja 330 • · · ’.* * mikrolitraa 30-% vetyperoksidia. Polypeptidin 99 antiseerumia • f ·.·.· <anti-99) käytettiin kahdessa vasemmanpuoleisessa paneelissa, · suojatussa ja ei-suojatussa, kun taas polypeptidin 142 anti-t·· , seerumia <anti-i42> käytettiin kahdessa oikeanpuoleisessa • * t · * 20 101966 paneelissa, suojatussa ja ei-euojatuesa. Kuvion vasemmalla puolella olevat numerot esittävät niiden proteiinien geelin vaellusasemia, joiden molekyylipainot olivat vastaavasti 66, 45, 31, 21 ja 14 kilodaltonia.
Kuvio 9 on valokuva ihmisen ja simpanssin rajoitusentsyymillä lohkaistun makean DNA:n Southern-täpläanalyyseistä, sellaisista maksakudoksista, jotka sisälsivät X-proteiinia käyttäen hepatitis B-virukeen <HBV> DNA:ta sitovana näytteenä. Koko DNA uutettiin solujauheista, jotka valmistettiin kuviossa 8 kuvatuista näytteistä. 10 mikrogrammaa DNA:ta lisättiin l-% agaroosigeelin kuhunkin syvennykseen. Rajoitusentsyymin uutta-mispuskureita käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (miten ja missä). Kaikki uuttamiset suoritettiin yön kuluessa o lämpötilassa 37 C käyttäen 50 yksikköä entsyymiä <5 x DNA-väkevyys mikrogrammoina). Juovat 1-3 esittävät simpanssin A-243 maksan DNA:ta, jota on uutettu vastaavasti BamHI:lla, EcoRI:lla, tai jota ei ole lohkaistu, juovat 4-6 esittävät simpanssin 344 maksan DNA:ta, joka on lohkaistu vastaavasti BamHIclla, EcoRI:lla tai on lohkaisematon, juovat 7-10 esittävät ihmisen HBcAg-positiivista makean DNA:ta, joka on katkaistu vastaavasti HindiII:n, BamHItn tai EdoRItn avulla, tai « « | jota ei ole uutettu, ja juovat 11-14 esittävät ihmisen HBsAg- negatiivista maksan DNA:ta, jota on uutettu vastaavasti Hind-III :11a, BamHItlla tai EcoRItlla, tai joka on uuttamaton.
« I
··· % « e « ···
Kuvio 10 on autoradiogrammin valokuva, joka esittää anti-X- • e · polypeptidi-antiseerumin reaktiivisuutta X-suunnatun geeni- • · · tuotteen kanssa. BSC-l-solujen yhteneviä monokerroksia (2 x 7 10 solua) infektoitiin yhdistelmä-SVHBV-3-perusviruksella <tsA23g~ ja SVHBV-3-virionien seos) tai villiä tyyppiä olevalla viruksella 5V40 £Moriarty ym. <1981), Proc. Natl. Acad.
• · · ·.· 1 Sei. USA, 78:2606-2610L7 . Viljelmiä inkuboitiin eeerumiva- . . o päässä DMEM:ssa lämpötilassa 40 C 48-72 tuntia, jona ajankoh- • · .,. » tana oli tapahtunut noin 50 % sytofaattisesta vaikutuksesta.
• «
Sakan yläpuolella olevat liuokset poistettiin ja pullot, jotka
» I I
4 · · ♦ · · · • · 4 · · 21 101966 sisälsivät monokerrokeet, sovitettiin jäähän 5 minuutiksi ennen kuin solut otettiin talteen kaapimalla. Talteenotetut solut sentrifugoitiin ja saadut solupalloset pestiin PBS:lla, o jäädytettiin nopeasti lämpötilassa -70 C ja lyofilisoitiin yli yön. Saadut solujauheet liuotettiin PBS:aan ja saatettiin lopulliseen väkevyyteen 2 mg/ml näytepuskurissa. Näytteitä keitettiin 5 min ja solujätteet poistettiin sentrifugoimalla Beckman-mikrofugissa 30 min. 50-100 mikrogrammaa solulysaattia lisättiin denaturoiviin polyakryyliamidigeeleihin (12,5 %> ja niitä käsiteltiin elektroforeesin avulla edellä kuvatulla tavalla. Proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitrosel-luloosa-arkkeihin edellä kuvatulla tavalla. Nitrosellulooea- täplät värjättiin amidomustalla ennen kuin niitä inkuboitiin o lämpötilassa 4 C yli yön tuotteessa BLOTTO ei-spesifisen sitoutumisen poistamiseksi. Nitroselluloosaliuskoja inkuboitiin 3 h huoneen lämpötilassa anti-peptidi-vasta-aineiden 1:350 laimennusta käyttäen BLOTTOtn lopullisen tilavuuden ollessa 10 ml, Liuskat pestiin BLOTTO:sea ennen kuin niitä inkuboitiin 125 6 1 h I-merkityllä S. aureus-proteiinilla A <10 cpm/10 ml).
Liuskat pestiin edellä esitetyllä tavalla, huuhdottiin vedel-.., lä, kuivattiin ja tutkittiin autoradiografiän avulla. Niissä ·* · tapauksissa, joissa oli tapahtunut sulkeminen polypeptidillä, • " esi-inkuboitiin antiseerumeja 100 mikrogrammalla polypeptidi- o o
: liuosta yli yön lämpötilassa 4 C tai 2 h lämpötilassa 37 C
ennen inkubointia nitroselluloosaliuskojen kanssa. Molekyyli-::: painot perustuvat alhaisiin molekyylipainostandardeihin (Bio-
Rad) ja ne on esitetty kuvion vasemmanpuoleisessa reunassa.
Juovat 1 ja 3 saatettiin reagoimaan vastaavasti anti-polypep-tidi 99- ja anti-polypaptidi 142-vasta-aineiden kanssa. Juovat 2 ja 4 saatettiin reagoimaan näiden samojen vasta-aineiden ... kanssa, joita oli esi-inkuboitu vastaavasti polypeptidi 99 :n • · · * , tai polypeptidi 142:n kanssa. Juovat 5 ja 6 esittävät vastaa- '/* vaati anti-polypeptidi 99- ja -142-vasta-aineiden reaktiota ·; : vertailusolulysaattien kanssa.
• · 22 101966
Esillä olevalla keksinnöllä on useita etuja. Eräs näistä eduista on se, että ensimmäistä kertaa HBxAg:n esiintyminen on todettu missään solussa.
Toinen etu on se, että keksinnön avulla aikaansaadaan koemenetelmä ja järjestelmä HBxAg:n esiintymisen toteamiseksi krooniseen hepatitis B:hen infektoituneessa isäntäeläimessä.
Vielä eräs etu on se, että keksintöä käytettäessä mahdollistetaan HBxAg:n toteaminen soluissa, jotka on johdettu ihmisen hepatoomasta ja voidaan täten vahvistaa oletettua yhteyttä hepatitis B-virukeen ja syövän tämän muodon välillä.
Keksinnön eräs etu on myös se, että sen avulla voidaan kloonata HBxAg:ta koodaava geeni.
Keksinnön vielä eräs etu on se, että se aikaansaa mahdollisuuden tuottaa HBxAg:n oleellisen polypeptidiosan, jota voidaan käyttää antigeeninä tutkittaessa diagnostisesti, esiintyykö HBxAg:n vasta—aineita (anti—X—vasta—aineita) ihmisen seeru— , , missä.
* · ’ ^ Keksinnön vielä eräs etu on se, että voidaan valmistaa syn— • ·* teettinen polypeptidi, jonka aminohappojäännöksen sekvenssi ’...· vastaa HBxAg : n ant igeenideterminant in sekvenssiä, jota voi- • · · : daan käyttää sellaisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka :V: immunoreagoivat HBxAg:n sekä sellaisten polypeptidien kanssa, jotka jakavat antigeeni-determinantin HBxAg:n kanssa.
Esillä olevan keksinnön muita etuja ilmenee alan asiantunti-jalle seuraavasta yksityiskohtaisesta selityksestä ja patent-tivaatimukeista.
• · ·
Seuraavassa esitetään selityksessä käytetyt määritelmät· 23 101966
Transfektio: on uusien geneettisten m&rkkerien aikaansaaminen lisäämällä DNA eukaryoottisiin soluihin.
Transformaatio: on uusien geneettisten markkerien aikaansaaminen lisäämällä DNA prokaryoottisiin soluihin.
Kloonausvektori: on mikä hyvänsä plasmidi tai virus, johon vieras kloonattava DNA voidaan sovittaa.
Plasmidi: on autonominen, itsestään kopioituva, ekstrakromo-somaalinen, rengasmainen DNA.
Avoin lukukehys: on DNA-sekvenssi, joka on (potentiaalisesti) muutettavissa proteiiniksi.
Apuvirus: on virus, joka aikaansaa toimintoja, jotka ovat erillisiä virheellisestä viruksesta ja joka mahdollistaa, että viimemainittu täydentää infektiojakson sekainfektion aikana .
. . Geeni (cistron): on DNA-segmentti, joka liittyy polypeptidi- ; ·’ ketjun valmistukseen; se sisältää alueita, jotka edeltävät ja : " eeuraavat koodausaluetta (johtaja ja seuraaja), samoin kuin : .· välisekvenssejä (introneja) yksittäisten koodaussegmenttien ·...· (eksoneiden) välissä.
* · · • · · • · · : Ilmentäminen: menetelmä, jonka toteuttaa rakennegeeni poly- • · peptidin valmistamiseksi. Se on jäljentämisen ja siirron yhdistelmä .
... Klooni: kuvaa suurta lukumäärää identtisiä soluja tai mole- « · · *, kyylejä, joissa on yksi peritty solu tai molekyyli.
• · · • · * • · *:··; Emäspari (ep): on adeniinin (A) ja tymiinin (T) yhdistelmä tai sytosiinin (C) ja guaniinin (G) yhdistelmä DNA-kaksois-. kierteessä.
24 101966
Ilmentämisvektori: on mikä hyvänsä plasmidi tax virus, johon vieras DNA voidaan sovittaa tai muodostaa.
Myötävirta: tarkoittaa sekvenssejä, jotka jatkuvat edelleen ilmentämissuunnassa, esim. polypeptidin geenin koodausalue on myötävirrassa alkukodonin suhteen.
A. Yleistä
Hepatitis B-viruksen HBV genomin alue X on mielenkiintoinen mm. koska nykyiset todisteet osoittavat, että sitä voidaan ilmentää, ja perinteellinen HBV-serologia ei ole löytänyt sen proteiinituotetta tai tämän tuotteen vasta-aineita. Hiljakkoin kehitettyä yhdistelmä-DNA- ja synteettistä polypeptidi-teknologiaa on käytetty tässä yhteydessä muutamien niiden virheiden välttämiseksi, joita esiintyy tavanomaisessa metodologiassa HBxAgtn valmistukeen suhteen, ja HBxAg:n valmistukeen kuvaamiseksi soluissa, jotka ovat peräisin ihmisen hepa-toomasta johdetuista solui injoista ja sellaisten simpanssien ja ihmisten maksasoluista, joilla on krooninen HBV-infektio.
Tämän päämäärän saavuttamiseksi käsittää esillä oleva keksin- • ·’ tö HBxAg:n kloonauksen ja sen ilmentämisvektorit, synteettiset : " polypeptidit, jotka vastaavat HBxAgtn antigeenisiä determi- ." '.· nantteja ja vasta-aineita, jotka on muodostettu tällaisten • synteettisten polypeptidien suhteen, jotka sitoutuvat polypep-tideihin, samoin kuin HBxAg:hen tai niiden oleellisiin osiin, ;Vj samoin kuin kokeet HBxAg:n toteamiseksi.
• ·
Esitettyjä kloonausvektoreita käytetään mm. valmistettaessa käyttökelpoisia määriä HBxAg-pitoisia geenejä. Tällaista gee-... niä voidaan vuorostaan käyttää mm. valmistettaessa HBxAg: ta *. ja sen polypeptidifragmentteja, joita voidaan käyttää tutkit- '·*·* taessa hepatitis B-sairautta.
• · i * · 25 101966
Keksinnön mukaiset uudet synteettiset polypeptidit ovat käyttökelpoisia mm. antigeeneinä valmistettaessa vasta-aineita, jotka immunoreagoivat HBxAgrn ja sen huomattavien polypeptidi— osien kanssa, sekä immunoreagoivat itse synteettisten polypep-tidien kanssa. Täten valmistettuja vasta-aineita voidaan tämän jälkeen käyttää tutkittaessa, esiintyykö HBxAg:ta tai sen oleellista polypeptidiosaa infektoidun isäntäeläimen soluissa tai kudosviljelmässä.
Ilmentämisvektoria voidaan käyttää solujen transfektoimiseen ja polypeptidin ilmentämiseen, joka sisältää huomattavan määrän HBxAg:ta. Ilmennettyä polypeptidia voidaan sitten käyttää antigeeninä tutkittaessa, esiintyykö HBxAgtn vasta-aineita kehon näytteissä.
Keksinnön mukaista ilmentämisvektoria ja vasta-aineita voidaan myös käyttää sellaisten transfektoitujen solujen markkerina, jotka sisältävät ilmentämisvektorin ja sisältävät myös kiinnitetyn geenin, jonka esiintymistä voi olla suhteellisen vaikeaa todeta. Täten jäljempänä kuvattu ilmentämisvektorin sisältämä ; f.< SVHBV-3 voidaan avata ja kiinnittää johonkin toiseen vieraa- * · !. ' seen geeniin, joka koodaa proteiinin, jota voi olla suhteelli- * · « ), t een vaikea todeta. Uudelleenkierrättämisen jälkeen voidaan • ·’ sopivien solujen infektiotodeta täten muodostetulla uudella *··.1 vektorilla, ja levittämisen jälkeen yksittäisiksi soluviljel- *.1 1 miksi identifioida nämä solut, jotka sisältävät tämän uuden • · vektorin, koska ne tuottavat HBxAg:n vektorin koodaamaa osaa, joka on kiinnittynyt proteiiniin, joka voidaan koodata vieraalla geenillä keksinnön mukaisia vasta-aineita käyttäen. Tällainen markkeri voi olla erittäin käyttökelpoinen halut-taessa ilmentää vektorit eukaryoottisissa soluissa, so. kun < · « ,»f«j lääkkeen resistenssi-markkereita, joita esiintyy bakteerisolu-
< « I
V. vektoreissa kuten pBR322, ei ole läsnä.
* 1 • · • 1 • · • · 1 · « * ·· » 26 101966 1. Kloonausvektorit
Keksinnön mukainen yhdistelmä-DNA, joka sisältää HBxAg-geenin, voidaan valmistaa esim. kloonaamalla osa HBV-DNA:ta. HBV:n genomisen materiaalin saamiseksi muutetaan Danen osa DNA:sta, joka sisältää yksisäikeisen osan, täydellisesti kaksisäikei-sekei DNA:kei käyttäen viruksen endogeenista DNA-polymeraasia.
Täten saatu rengasmainen, kaksieäikeinen HBV sisältää kaksi BamHI-endonukleaasi-rajoituekohtaa. Suoritettaessa lohkaisu BamHI:n avulla, saadaan tavallisesti kolme lineaarista tuotetta, jotka luokitetaan koon perusteella. Suurin on 3200 (ep) fragmentti, joka edustaa kokonaista HBV-genomia, joka on lohkaistu ainoastaan yhdessä BamHI-kohdassa. Fragmentit, jotka sisältävät 1850 ep ja 1350 ep, muodostuvat kun HBV lohkaistaan molemmista BamHI-kohdista.
HBV:n nukleotidisen sekvenssin analyysi, jonka ovat esittäneet Galibert ym. <1979), Nature 281:646-650. osoittaa, että 1850 ep HBV:n BamHI-fragmentti käsittää geenin, joka koo-daa HBxAg:n. Kuitenkin kaikissa näissä kolmessa fragmentissa , , on täydellinen BamHI-päätekohta ja ne voidaan tämän johdosta sovittaa kloonausplasmidin BamHI-kohtaan.
• i • « «
« < I
: Plasmidissa pBR322 on yksi BamHI-rajoituskohta, joka sijait- • i 1 see sen tet rasykl i inires i s tense in aiheuttavassa geenissä, ku- • · e
'.'il ten kuviosta 3 voidaan todeta. Lohkaistaessa pBR322-DNA
BamHI:n avulla, saadaan yksi lineaarinen fragmentti, jonka • · pääteasema täydentää kutakin kolmea BamHI HBV DNA-fragmenttia.
Kiinnitettäessä kukin kolmesta BamHI HBV DNA-fragmentista ... pBR322:een sen BamHI-kohdassa käyttäen T4 DNA-ligaasia plasmi- • · · *. dien reformoimiseksi ja tekemiseksi rengasmaiseksi saadaan • · · l i i */. kolme ainutlaatuista yhdistelmäplasmidi-DNA:itä. Nämä yhdis- Τ': telmä-kloonausplasmidit ovat rengasmaisia DNA:ta ja niille on annettu merkinnät: AM7, joka sisältää pBR322 DNA:n, 1350 ep • · · « · · % · 27 101966
BamHI HBV DNA-fragmentin ollessa sovitettu pBR322:n BamHI-kohtaan; AM6, joka sisältää pBR322 DNA:n, jolloin koko HBV-genomi on sovitettu pBR322:n BamHI-kohtaan, ja AMI, joka sisältää pBR322 DNA:n, jossa on 1850 ep BamHI HBV DNA-fragment-ti, jossa on HBxAg-geeni sovitettuna pBR322:n BamHI-kohtaan.
Kun BamHI HBV DNA-fragmentit on kiinnitetty pBR322 BamHI-koh-taan T4 DNA-1igaasi11a, ei täten muodostetulla yhdistelmäplas-midilla ole enää kykyä muuttua tetrasykliiniresistentiksi. Ampisilliiniresistentit ja tetrasykliiniherkät transformoi-misaineet valittiin tämän johdosta Escherichia coli <E. co-li)-kannan HB101 kolonioista, jotka oli transformoitu edellä esitetyillä 1igatoimistuottei1la.
Kolme lääkeaineen perusteella valittua E. coli HB101:n kantaa transformoitiin yhdistelmä-plasmidei1la AMI, AM6 ja AM7, ja niitä on merkitty vastaavasti merkinnöillä ECAM1, ECAM6 ja ECAM7. Edellä mainittuja plasmideja valmistettiin suhteellisen suurissa määrissä kasvattamalla edellä mainittuja trans-formoimisaineita sopivassa väliaineessa, kuten LB-lihaliemes-j ·’; eä, kuten jäljempänä kuvataan.
·’· \ Edellä mainituista plasmideista AMI ja AM6 voidaan valmistaa « · geenifragmentti, joka sisältää kokonaan tai osittain HBxAg:n • · * * .·;· 9eeni-emässekvenssin, käyttäen sopivia ra joitusentsyyme jä .
.·.· Esim. uutettaessa plasmideja AMI ja AM6 rajoitusentsyymillä *.* ;
BamHI, erotettiin 1850 ep DNA-fragmentti, joka sisälsi HBxAg:n koodaavan geenin reaktiotuotteissa. Kasvattamalla yh- dietelmä-plasmidilla transformoitu E. coli HB101:n kannat ECAM6 tai ECAMI voidaan saada suhteellisen suuria määriä DNA- '·* » sekvenssiä, joka koodaa HBxAgtn.
• : ; * $ ..... HBxAg-geenistä, josta DNA-emässekvenssi ja HBV-genomin si- jainti on määrätty, ilmenee että siinä ei esiinny introneita.
• . Tämä tarkoittaa sitä, että tämä geeni voidaan siirtää sellai — • * » ’ · « * · 28 101966 eenaan fenotyyppisen ilmentämisen aikaansaamiseksi lähetti-RNA:na eläinsoluihin, samoin kuin bakteerisoluihin.
2 . I lmentämisvektor i t.
Lisättäessä HBxAg-geeni sopivaan ilmentämisjärjestelmään eläineolussa, esimerkiksi afrikkalaisen vihreän apinan mu-nuaissoluihin, menetelmällä, jonka ovat esittäneet Ganem ym. (1976) J. Mol. Biol. 101:57-83. voidaan aikaansaada HBxAg-synteesi tällaisen solun kanssa. Lisäksi tällaisten apinan munuaissolujen viljeleminen, jotka sisältävät HBxAg-geenin, sopivan ilmentämisvektorin kanssa, mahdollistaa HBxAg:n halvan massatuotannon.
Edullisesti muodostettiin yhdistelmä-DNA, joka kykenee ilmentämään HBxAg-geeniä, sovittamalla, muuttamatta sen lukukehystä, koko HBxAg-geeni tai sen fragmentti Simian Virus 40:een (SV40) myötävirtaan SV40:n myöhäisestä aluepromootto-riata. Ilmentämisvektori valmistettiin käyttäen myöhäistä SV40:n alueen promoottoria suurissa määrissä seuraavalla tavalla.
SV40 DNA:ta ja pBR322 DNAtta käsiteltiin uuttamalla BamHI- ja EcoRI-kaksoisra joitusentsyymillä . Suuremmat SV40- ja pBR322-fragmentit kiinnitettiin T4 DNA-ligaaaia käyttäen. Kiinnitet-tyä tuotetta uutettiin BamHI :n avulla, jolloin muodostui line-aarinen DNA kohes i ivisessa BamHI: n pääteasemassa. Kiinnitettäisi essä tämä SV40/pBR322 DNA 1850 ep BamHI HBV DNA:n kanssa, saa- • · · I, tiin rengasmainen yhdistelmäplaemidi, jolle annettiin merkin- • · · tä SVAM191.
Yhdistelmä-DNA SVAM191 sisältää muuttumattoman E. coli-ampisilliini-resistenseigeenin. E. coli HB101, joka on trans-: formoitu SVAM191 avulla, on ampisilliiniresistentti ja tetra- ; : ; sykliiniherkkä, ja se voidaan täten valita lääkeherkkyyden | I perusteella. E. coli HBlOltlle, joka on transformoitu SVAM191 avulla, on annettu merkintä EC-SVAM191, ja sitä voidaan kas-vattaa sopivassa väliaineessa, kuten LB-lihaliemessä, joka ♦ · 29 101966 sisältää ampisilliinia, ja tällöin saadaan suhteellisen suuri määrä tätä plasmidia.
3. Soluvilielmät
Isäntäsolun transformointi täten saaduilla yhdistelmä-DNA-plasmideilla AMI, AM6 ja SVAM191 voidaan toteuttaa tunnetuilla menetelmillä £Cohen ym. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69: 2110-2114 (1972).7 tai niiden muunnoksen avulla. Ieäntäsolut käsittävät esim. sellaiset mikro-organismit, kuten Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis ja hiivat, ja se on edullisesti Escherichia coli-kanta, esimerkiksi sellainen, jossa on pääasiallisesti kantaa 294 (ATCC-31446), W3110 (ATCC-27325) tai RR1 <ATCC-31447). E. coli-kanta HB101 (ATCC-33694) on erittäin edullinen isäntäsolulinja.
Sellaisen solusäikeen erottaminen, jossa on HBxAg-geenin sisältävä uusi yhdistelmäplasmidi DNA, voidaan aikaansaada tunnetuilla menetelmillä, esim. seuraavaa tekniikkaa käyttäen.
DNA:n Dane-osa, joka on ainoastaan osittain kaksoissäikeinen, voidaan merkitä radioaktiivisesti täyttämällä yksisäikeiseen «3 osaan H-pitoista dNTP:ta käyttäen endogeenista DNA:n polyme- raasireaktiota. Robinson (1975) Am. J. Med. Sei. 270: 151- I'. 159. Tämän jälkeen voidaan käyttäen tätä merkittyä tuotetta ·.·.·. näytteenä positiivinen klooni poistaa saadusta lääkevalin- naisesta transformoimisaineesta tunnetulla Southern-täplähyb- ”1 ridoimismenetelmällä ^Southern (1975) J. Mol. Biol. 98:5037 I , tai käyttäen tunnettua kolonian hybridoimiemenetelmää £Uruns- • « · ··*·* tein ym. (1975), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72:3961-39667
Ieäntäsolut, jotka transformoidaan ja erotetaan täten, kasvatetaan tunnetussa väliaineessa. Tämä väliaine voi olla esim.
: LB-lihaliemi , Penaesay-1 ihaliemi tai M9-väliaine, joka sisäl- :V; tää glukoosia ja kasaminohappoja filler; Experiments in Mole cular Genetics, 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New [ * York, 1972)7.
30 101966 o
Viljely suoritetaan tavallisesti lämpötilassa 15-43 C, edul-o lisesti 28-40 C, 2-24 tunnin, edullisesti 4-16 tunnin, kuluessa mikäli tarpeellista samalla ilmastoiden ja/tai sekoittaen .
Viljelemisen jälkeen otetaan bakteerisolut talteen, solut sus-pendoidaan puskuriin ja hajotetaan esim. lysotsyymi-, jäädytys-sulatus- tai äänikäsittelyn avulla. Se geeni, joka koodaa HBxAg:n, voidaan erottaa menetelmillä, jotka ovat yleisesti tunnettuja puhdistettaessa DNA sentrifugoinnissa saadusta liuoksesta solujen hajottamisen jälkeen.
Vektorin valmistamiseksi HBxAg:n ilmentämiseksi eukaryootti-sissa soluissa poistettiin osa SVAM191 DNA:ta, mukaan lukien kaikki pBR322:sta peräisin oleva DNA. Tämä toteutettiin uuttamalla SVAM191 HaelI-rajoitusentsyymillä. Kun suurempi Haell SVAM191-uuttamistuotteista oli muodostettu rengasmaiseksi, muodostettiin vektori, joka kykeni ilmentämään HBxAg:ta eläinsoluissa, ja sille annettiin merkintä SVHBV-3.
Nisäkkään isäntäsolu voidaan transfektoida SVHBV-3:11a tunne- : tuilla menetelmillä ilmentämisjärjestelmän aikaansaamiseksi.
;·. Niinpä SVHBV-3 voidaan, kun se on lohkaistu rajoitusentsyy- !. . millä Hindlll, sovittaa COS-7-soluihin (ATCC CRL 1651). £Cat- • · · so Gluzman (1981), Cell 22.:175-182, ja Siddiqui (1983), • » **· Mol. and Cell Biology, 2.:143-146.7. SVHBV-3 voidaan myös » · · ’·1 ’ sovittaa naudan papi 1 looma-virukseen ja käyttää täten solulin- • · ·.1.· jojen transf ektoimiseen .
Vielä edullisemmin SVHBV-3:a käytetään yhdessä SV40tsA23g~ apuviruksen kanssa afrikkalaisen vihreän apinan munuaissolu-;'j': linjan BSC-1 (ATCC CCL 26) transf ektoimiseen. Täten transfek- .·.·. toituina muodostivat PSC-l-solut polypeptidiä, joka sisälsi •· HBxAg:n antigeeni-pääteasemia.
· · • · · 31 101966
On ymmärrettävää, että se nukleotidisekvensei tai geenifrag-mentti, joka sovitetaan kloonaus- tai ilmentämisaineen valittuun rajoituskohtaan, voi sisältää nukleotideja, jotka eivät muodosta halutun proteiinin varsinaisen geenin osaa, tai ne voivat sisältää ainoastaan tämän geenin fragmentin. Täten, johtuen geneettisen koodin tunnetusta monimutkaisuudesta, ei lisätyn geenin tarvitse olla identtinen kuvatun HBxAg-geenin kanssa, vaan sen tulee ainoastaan koodata HBxAg. Lisäksi voi se DNA-sekvenssi, joka koodaa HBxAg:n, sisältää lisäemäksiä toisessa tai molemmissa sen sekvenssin 3'- tai 5'-päätease-massa, joka koodaa HBxAg:n, mikäli lukukehys pysyy muuttumattomana. Toisin sanoen lisättäessä DNA-sekvenssi, esillä oleva keksintö vaatii ainoastaan sen, että transformoitu tai trans-fektoitu ilmentää tuottaa joko HBxAg:n koodaavaa DNA:ta tai proteiinia HBxAg tai vastaavaa polypeptidia, jotka sisältävät vastaavasti huomattavan osan HBxAg-proteiinia.
4. Polvoeptidit. antigeenit ia vasta-aineet
Kuten jäljempänä kuvataan, voidaan HBxAg:n ilmentäminen todeta käyttäen vasta-aineita, jotka on aikaansaatu synteettisillä polypeptideillä, joiden aminohappojäännöksen sekvenssi vastaa HBxAgtn pääteasemassa olevan antigeenin aminohappojäännöksen : .·. sekvenssiä. Keksinnön mukaiset polypeptidit sisältävät taval- ; . lisesti noin 6-40 aminohappojäännöstä. Vielä edullisemmin nämä . ^ polypeptidit sisältävät noin 10-20 aminohappojäännöstä.
• e 0 0 0 00 0 0 7.1 Synteettisten polypeptidien, joita on merkitty numeroilla 8, • · · *· ^ 42, 79, 99, 100 ja 142 ja jotka on esitetty jäljempänä ja ku- *.1·1 viossa 6, aminohappo jäännösten sekvenssit määrättiin HBV: n nukleotidi-sekvenssistä siten kuin Galibert ym. ovat esittäneet, supra.
Polypeptidi 8: Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu- «
Arg-Pro-Val-Gly; • · « • 0 • « • ♦ • · » > · • » « t · • · · • · 32 101966
Polypeptidi 42. Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Aep-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cye;
Polypeptidi 79: Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lye-Arg-Thr-Leu-Gly;
Polypeptidi 99: Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lye-Asp-Cys;
Polypeptidi 100: Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lye-Val, ja
Polypeptidi 142: Ala-Pro-Ala-Pro-Cye-Aen-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala,
Joissa kukin amiohappoJäännöksen sekvenssi on esitetty suunnassa vasemmalta oikealle ja suunnassa amino-pääteasemasta karboks i-pääteasemaan.
On huomattava, että polypeptidit, jotka vastaavat aminohappo- jäännöksen sekvenssiltään polypeptidien 99 ja 100 sekvenssejä, lukuunottamatta polypeptidien 99 ja 100 karboksi- ja amino- pääteasemien kysteiinijäännösten puuttumista, ovat myös käyt- : .·. tökelpoisia tässä yhteydessä ja muodostavat keksinnön osan.
.· Nämä polypeptidit, jotka on merkitty polypeptideikei 99b ja !. . 100b, ovat käyttökelpoisia immunogeeneja, kun ne on yhdistät- • ♦ · • · ty kantajaan niiden amino- tai karboksi-pääteryhmien avulla, • · *···1 ja niitä voidaan myös käyttää immunoreaktion estokokeissa, • · · *.1 1 samoin kuin niitä, jotka on esitetty kuvioissa 7, 8 ja 10 ja • ♦ ·.·.· joita käsitellään jäljempänä.
Polypeptidien 99b ja 100b aminohappojäännösten sekvenssit on esitetty alla olevissa kaavoissa vasemmalta oikealle ja suun-nasea amino-pääteasemasta karboksi-pääteasemaan: • » > 1 · « « * · · • « 33 101966
Polypeptidi 99b: Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lye-Asp;
Polypeptidi 100b: Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lye-Val.
a. X-proteiini tranefektoiduieea eoluiesa
Kaniinit, jotka oli immunoitu polypeptideillä 99, 100 tai 142, kiinnitettynä kotilon hemosyaniini<KLH)-kantajaan konjugaat-tia muodostavina vasta-aineina (anti-99, anti-100 ja vast. anti-142), jotka immunoreagoivat HBxAg-polypeptidin kanssa, muodostivat sitä BSC-1-soluissa, jotka oli tranefektoitu SVHBV-3:n avulla, jolloin ensimmäistä kertaa voitiin todeta HBxAg-polypeptidin muodostuminen näissä tai yleensä missään soluissa. Nämä anti-polypeptidi-vasta-aineet eivät immunorea-goineet minkään ei-transfektoiduissa BSC-l-soluissa olevan polypeptidin kanssa, so. sellaisissa soluissa, jotka oli in-fektoitu villiä tyyppiä <wt> olevalla SV40:llä.
Lisäksi niiden anti-polypeptidi—vasta—aineiden immunoreaktii— visuus, jotka ilmensivät HBxAg-polypeptidia estyi eei-inku- boitaessa vasta—aineita niiden komplementaarisen (vastaavan) ;·': polypeptidin kanssa, so. sen polypeptidi-immunogeenin kanssa, • · ' joka oli niihin kohdistettu. Tämä estyminen osoittaa, että • vasta-aineet tunnistavat spesifisesti polypeptidin antigeeni-pääteaseman, jonka oletetaan olevan HBxAg: n, ja että eynteet-*** tiset polypeptidit vastaavat aminohappojäännöksen sekvenssil- • · e V; tään oletetun HBxAg-proteiinin antigeenideterminantteja. Nämä • · · *·1·’ es to tulokset saatiin käytettäessä Western-täplätekniikkaa (Materiaalit ja menetelmät), jota seurasi sitoutuneiden vasta- 125 aineiden paikallistaminen käyttäen I-merkittyä Staphylococcus aureus-proteiinia A, jota seurasi kokeen autoradiogra-finen kehittäminen.
• · · · • · • · * · · 34 101966 Nämä tulokset on esitetty kuviossa 10 käytettäessä polypepti-dien 99 ja 142 antiseerumeja. Kuvion 10 juova 1 esittää anti-99-immunoreaktiota SVHBV-3:n avulla infektoidun eolulyaaatin kanssa, kun taas juova 2 esittää tämän immunoreaktion estymistä esi-inkuboitaessa antiseerumia polypeptidillä 99. Samalla tavoin saatettiin anti-142 immunoreagoimaan solulysaat-ti-proteiinin kanssa juovassa 3, ja tämä immunoreaktio estyi esi-inkuboitaessa tätä antiseerumia polypeptidillä 142. Juovat 5 ja 6 osoittavat, että immunoreaktiota ei tapahtunut käytettäessä vertailusolujen lysaatteja.
SVHBV-3 transfektoiduista soluista valmistettujen polypeptidi-tuotteiden, jotka solut oli spesifisesti identifioitu polypep-tidien 99 ja 142 antiseerumeilla, kuten kuviossa 10 on esitetty, molekyylipaino oli noin 24 000 daltonia. Kuten jäljempänä esitetään, niin polypeptidi, jonka molekyylipaino on noin 28 000 daltonia, on identifioitu lysaateissa, jotka on saatu ihmisen hepatoomasta johdetusta solulinjasta PLC/PRF/5. Oletetaan, että molekyylipainoero polypeptideiesä (proteiineissa), jotka on ilmennetty näiden kahden solulinjan avulla, johtuu siitä, että muodostetut polypeptidit ovat seurauksena X-proteiinin yhtymisestä muiden proteiinien tai polypeptidien : kanssa .
^ Täten, kuten jo edellä mainittiin, puuttuu SVHBV-3:sta täydel- *,,1 lisen X-koodausgenomin osa. Kuviosta 6 ilmenee, että siinä • · ’1··1 X-geenin osassa, joka sisältyy SVHBV-3:een, ei ole otaksutun • · · *·’ 1 X-proteiinin ensimmäisten 22 aminohappojäännöksen kodoneita, • · • · · *.1.· joihin sisältyy metioniinin aikaansaava kodoni ATG.
Tämän johdosta oletetaan, että solujen ilmentämä polypeptidi, joka on transfektoitu SVH©V-3:n avulla, olisi fuusiotuote, SV40:n rakenteellisen proteiinin VP2-sekvenssien esiintyessä tässä vektorissa. Tämän fuusioproteiinin (polypeptidin) ole- • · tettu koko on 24 500 daltonia. Sellaisen ilmennetyn polypepti- * 1 din toteaminen, jonka molekyylipaino on noin 24 000 daltonia, * · • · • i 1 » · 1 · · 35 101966 vastaa täten tätä oletusta. 28 000 daltonin suuruista fuusio-proteiinia <polypeptidiä) käsitellään tarkemmin jäljempänä.
b. X-proteiini. joka on ilmennetty hepatoomasoluissa HBxAg:n muodostumisen oletetaan myös olevan jonkin HBV-sairau-den tilan seuraus. Esimerkiksi polypeptidin 99 <anti-99> vasta-aineet tunnistivat spesifisesti 28 000 daltonin proteiinin, joka muodostui ihmisen hepatoomasta johdetussa solulinjassa PLC/PRF/5 (ATCC CRL 8024). Normaali kaniinin seerumi ei tunnistanut tätä proteiinia ja anti-99:n tunnistaminen estyi esi-inkuboitaesea polypeptidillä 99. Tämän solulinjan tiedetään sisältävän integroitua HBV:n DNA:ta. Chakraborty ym. <1980) Nature, 286:531-533: Edman ym. (1980) Nature, 286:535-538. ja Marion ym. <1980) Virol. .33.:795-806. HBsAg on todettu tässä hepatoomasolulinjassa ^McNab ym. <1976) Cancer 34:509-515, ja Aden ym. <1979) Nature 282:615-6167. kun taas kaikki tavanomaiset HBcAg- ja HBeAg-kokeet ovat olleet negatiivisia. Solulinjassa mainittu HepG2 <ATCC CCL 23) on myös ihmisen hepatooma-solulinja, mutta se ei sisällä integroituja HBV:n DNA-sekvenssejä. Aden ym. supra.
Nämä tulokset saatiin merkitsemällä radioaktiivisesti PLC/PRF/ • **; 5 soluproteiinit, jota seurasi toistuva immunoeaostus käyt- • · taen anti-99- ja Staphylococcus aureus-proteiinia A, ja suo-rittamalla sitten talteenotetun sakan elektroforeesi. 28 000 * s daltonin proteiini identifioitiin sitten autoradiografiän * m *** avulla. Tätä menetelmää on myös käsitelty osassa Materiaalit * · · *'* * ja menetelmät.
« · • · «
• ♦ · t I
Samankaltaisen tutkimuksen tulokset käytettäessä sekä PLC/-PRF/5- että HepG2-soluista saatuja lysaatteja on esitetty kuviossa 7. Kuviosta 7 ilmenee, että X-spesifinen proteiini ar-vossa 28 000 daltonia todettiin PLC/PRF/5-soluisea < juova 5).
e
Immunoreaktiivisuus menetettiin, kun vasta-ainetta esi-inku-*· boitiin polypeptidillä 99 <juova 6), mutta ei käytettäessä vierasta polypeptidiä <juova 7). Esi-immunoitu vertailuseerumi • · « · w 0 e f « · • * i i · 36 101966 ei-immunoreagoinut (juova 8). Mitään X-epeeifistä reaktiivisuutta ei todettu vertailu-HepG2-lyeaateissa (juovat 1-4).
Nämä tulokset osoittavat, että X-geenituote on muodostunut ihmisen hepatooma-solulinjassa, joka sisältää integroituja HBVtn DNA-sekvenseejä.
c. X-proteiinin ilmentäminen maksasoluissa
Lisäksi tutkittiin neljä maksanäytettä ihmisistä ja simpansseista, joissa oli tapahtunut tai ei ollut tapahtunut HBV-in-fektio, käyttäen Western-täpläkoetta, sen suhteen, esiintyikö niissä X:n kaltaista proteiinia, käyttäen anti-X-polypeptidi-vasta-aineita. Tämän tutkimuksen tulokset on esitetty kuviossa 8. Yksi ihmisestä otettu näyte (H) oli kroonisesti HBV:n infektoimasta hepatooma-maksasta ja toinen akuutissa faasissa olevasta HBV-infektiosta (H). Infektoimatonta simpanssia (C> ja yhtä sellaista, joka oli kroonisesti infektoitu HBVilla (C), käytettiin molempien maksasolulysaattien saamiseksi, jotka saatettiin reagoimaan anti-X-polypeptidi-vasta-aineiden kanssa.
Anti-99-vasta-aineet saatettiin reagoimaan sekä 45 000 että 28 000 daltonin proteiinien kanssa (vasemmassa reunassa oleva : nuoli, oikeassa reunassa oleva merkintä p28). Molemmat reak- • '·· tiot estyivät, jos nämä vasta-aineet oli esi-inkuboitu poly- : · : peptidin 99 kanssa. Kun anti-142-vasta-aineet saatettiin rea- goimaan näiden samojen solujen lysaattien kanssa, todettiin • · « .'i1. spesifiset juovat 40 000 (p40>, 28 000 (p28) ja 17 000 (pl7) .
Reaktiot näiden proteiinien kanssa katsotaan spesifisiksi, • · koska ne eivät tapahdu, jos anti-142-vasta-aineet on esi-inkuboitu polypeptidin 142 kanssa.
Vertailunäytteessä, infektoimattoman simpanssin maksassa ‘ (kaikkien paneelien linja 3), esiintyi noin 45 000 daltonin ·.·.· proteiini (p45> yhdessä anti-99-vasta-aineiden kanssa, sekä p40 että pl7 yhdessä anti-142-vasta-aineiden kanssa. Proteii- .···. ni p28 ilmeni ainoastaan HBV:llä infektoiduissa kudoksissa • · • · · • · • · · · 37 101966 (solulinjat, linja 5>. Immunoreaktiivisuus menetettiin, kun vasta-ainetta esi-inkuboitiin polypeptidillä 99 (linja 6), mutta ei inkuboitaeeea vieraalla polypeptidillä (linja 7). Esi-immuuni-eeeruminäyte ei immunoreagoinut (linja Θ). Mitään X-epeeifistä reaktiivisuutta ei todettu vertailu-HepG2-lyeaa-teissa (linjat 1-4). Tulokset osoittavat, että X-geenituote on muodostunut sellaisessa ihmisen hepatooma-solulinjasea, joka sisältää integroituja HBV:n DNA-sekvenssejä.
45 000 daltonin proteiinin esiintyminen todettiin myös suhteellisen pienessä määrässä kuviossa 7 esitetyissä PLC/PRF/- 5-solujen lysaateissa. Immunoreaktio anti-99-vasta-aineiden ja 45 000 daltonin proteiinin välillä estyi myös esi-inkuboi-taessa vasta-aineita immunoivalla polypeptidillä 99. Tämä ilmenee kuvion 7 linjasta 6.
Ihmisten normaalien maksasolu-uutteiden (HBV-seronegatiivisia) todettiin muodostavan ainoastaan 45 000 daltonin proteiinia Western-täpläkokeessa anti-99:ää käytettäessä. Lisäksi vertailukokeissa, jotka suoritettiin käyttäen kaupan olevia HBs-, HBc- ja HBe-vasta-aineita (Abbott Laboratories, North Chicago, III.) ei voitu identifioida proteeinia, joka olisi sijainnut ·' keksinnön mukaisissa vasta-aineissa. Tämä todistaa jälleen, että 45 000 daltonin proteiinissa on antigeeni-determinantte- 4 · 4 ; V ja, jotka ovat homologisia HBxAg:n kanssa, mutta että 28 000 * · · daltonin proteiini, joka on todettu anti-99:n avulla, on spe-sifinen HBV-sairaustilassa ja on erilainen kuin HBsAg, HBeAg s ja HBeAg.
• 1 d. X-geeni maksasoluissa
Polypeptidin p28 muodostuminen PLC/PRF/5-soluissa tapahtui ... HBV:n DNA:n yhdistyessä isännän DNA:han. Oli mielenkiintoista \ ^ määrätä, oliko tämä ainoa tapa, jolla X-proteiinia voitiin • · · '·1·1 valmistaa.
• · · · « 1 38 101966 Tämän johdosta sellaiset simpanssin ja ihmisen makean DNA:t, joissa esiintyi X-proteiinia, tutkittiin käyttäen HBV-DNA:ta (kuvio 9). Koko DNA erotettiin maksakudoksista, jotka on esitetty kuviossa 8, ja analysoitiin sen suhteen, esiintyikö niissä HBV:n DNA-sekvenssejä. Siinä DNA:ssa, joka saatiin 28 000 daltonia sisältävästä simpanssin proteiinista, ilmeni homologisia juovia, kun se katkaistiin BamHI:n ja EcoRI:n avulla tai kun sitä ei uutettu (kuvio 9, vastaavasti linjat 1, 2 ja 3). BamHI lohkaisee rengasmaista HBV:n DNA:ta kahdeksi fragmentiksi £1850 ja 1350 emäsparia (ep>^, ja juova arvossa 5,8 kiloemästä (ke) (linja 1) esittää suurempaa kuin genomin kokoista integroitua sekvenssiä. Koska minkäänlaisia juovia ei esiintynyt suuren molekyylipainon omaavan DNA-juovan (linja 3) alapuolella, voidaan olettaa, että tässä DNA:esa on ainoastaan HBV:n integroituja sekvenssejä.
Lisäksi valmistettiin DNA:ta HBcAg-positiivisesta ihmisen maksasta ja tutkittiin HBV:n DNA:n suhteen. Rajoitusentsyymi, joka oli lohkaistu HindIII:lla, BamHI:11a, EcoRI:lla tai uut-tama11oma11a DNA:11a (kuvio 9, vastaavasti linjat 7-10), osoittivat homologisia sekvenssejä, jotka olivat joko yhtä suuria tai pienempiä kuin genomi, poistaen täten mahdollisuu- • · den, että nämä ihmisen DNA—näytteet sisältäisivät integroitu— : " ja sekvenssejä. Simpanssin ja ihmisen makean kudokset, joissa ; ,· ollut 28 000 daltonin proteiinia, olivat myös negatiivisia • · · HBV: n DNA—sekvenssin suhteen (kuvio 9, vastaavasti linjat 4 — 6 : : : Öa Kuviossa 9 esitetyt arvot vahvistavat sen, että X- proteiinia muodostuu HBV: 11a infektoiduissa kudoksissa katso- • · matta HBV-geomin tilaan ja poistavat tämän johdosta mahdollisuuden, että HBV:n DNA vaikuttaa X-proteiinin tuotantoon.
e. Tulosten yhteenveto . Edellä kuvatut tulokset osoittavat, että aikaisemmin identi- · fioimaton viruksen koodaama proteiini esiintyy HBV:n infektoi- missä ihmisen ja simpanssin makean kudoksissa. Tämä 28 000 ;***: daltonin proteiini (p28) koodaantuu HBV-genomilla, esiintyipä • · ♦ • · · • · · · 1 « 39 101966 se vapaana ekstrakromosomaalisessa muodossa tai integroituna solujen DNA:han.
28 000 daltonin proteiini (p28) ei ole pelkästään X-alueen tuote, vaan sisältää lisäksi HBV-sekvenssejä. X-proteiinin ennakoitu koko, joka perustuu sekvenssiin, jonka ovat esittäneet Galibert ym. supra, on noin 17 000 daltonia (kuvio 6). Kuitenkin sen X-proteiinin molekyylipaino, joka on todettu anti-X-peptidi-vaeta-aineiden avulla PLC/PRF/5-soluisea sekä simpanssin että ihmisen HBV-infektoiduissa kudoksissa, on 28 000 daltonia. Eroavuus koossa ei aiheudu X-geenin yhtymisestä solusekvenssien kanssa, koska integroidun HBV:n DNA:n puuttuminen ihmisen kudoksista, joissa esiintyy p28 (kuvio 9, linjat 7-10), osoittaa, että X-proteiini <p28> on siirtynyt pelkästään HBV-genomieta.
X-proteiinin kasvanut koko voidaan selittää, jos tämä proteiini on joko HBsAg-X- tai X-HBcAg-yhdistelmä. Tällaisen fuusioitumisen mahdollisuuteen viittaa näiden HBV-geenien samankaltaisuus toisiinsa nähden genomissa.
, , Yritys määrätä tämän fuusion esiintyminen RNA-tasolla epäon- | · nistui johtuen siitä, että jäljennöksissä, jotka saatiin : " PLC/PRF/5-soluissa, joiden todettiin sisältävän X-sekvenssejä, • · · : .1 esiintyi myös joko pinta- tai ydinsekvenssejä, samoin kuin «·» ·...· X-proteiinia (arvoja ei esitetty). Samankaltaisia tuloksia on :T: esittänyt Gough (1983), J. Mol. Biol. 165:683-699. Todiste : X-ytimen fuusiosta saadaan Hepadna-virus-suvun erään toisen • · jäsenen DNA-sekvenssistä, nimittäin ankan hepatitis B-viruk- sesta (DHBV), jossa molemmat geenit ovat muuttuneet yhdeksi proteiiniksi £Mandart ym. (1984) J. Virol. 19:782-79?7, ja ... Feitelson ym. (1982) J. Virol. 43:687-696.
• · 1 • · 0n todettu, että HBV:n X-alue on muodostunut. Tämän geenituot-·:1: teen toiminta on kuitenkin tuntematon. Proteiinimolekyyli, : : jonka on oletettu olevan X-alueen muuttumistuote, on todettu • · · i « « 40 101966 HBV-genomin yhteydessä, tai tarkemmin sanoen se on kovalentti-sesti sitoutunut L-säikeen 5'-kohtaan, Gerlich ym. (1980)
Cell 21.:801-809, Ajatus siitä, että X-proteiini edustaa DNA:hän sitoutunutta proteiinia, hylättiin kun PLC/PRF/5-so-luissa tai HBV:lla infektoiduissa kudoksissa oleva DNA ei poistanut tai muuttanut p28-aktiivisuutta (arvoja ei esitetty) .
Nykyisin tiedetään vain vähän HBV-infaktion biologiasta tai siitä vastaavuudesta, joka on HBV-infektion ja sitä seuraa-van hepatoomasolukarsinooman alkamisen välillä. Tässä tarkoituksessa on mikä hyvänsä HBV-infektion lisämarkkeri tai HBV-sekvenssien esiintyminen erittäin tärkeä. Ihmisen seerumia on tähän asti tutkittu anti-X-vasta-aineiden ja X-proteiinin löytämiseksi.
Termiä "vastata", sen eri kieliopillisissa muodoissa, on käytetty tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa polypeptidi-sekvenssien yhteydessä tarkoittamaan kuvattua polypeptidieek-venssiä plus tai miinus aina kolme aminohappojäännöstä toisessa tai molemmissa amino- ja karbokei-pääteaeemissa, ja se . . käsittää ainoastaan pysyvät substituutiot määrätyissä amino- ' happojäännöksissä polypeptidisekvensseissä.
« ♦ f i « ; Termi "pysyvä substituutio" tarkoittaa, että aminohappojään- t·» *...· nös on korvattu toisella biologisesti samankaltaisella jäänti J nöksellä. Esimerkkejä pysyvistä substituutioista ovat esim.
:Y; hydrofobisten jäännösten, kuten Ile, Vai, Leu tai Met, substi- ψ * tuutio jollain toisella jäännöksellä, tai jonkin polaarisen jäännöksen substituutio jollain toisella, esim. välillä Arg ja Lys, välillä Glu ja Asp tai välillä Gin ja Aan jne.
··· » · « ' « · I . Muutamissa tapauksissa ioni jäännösten korvaaminen vastakkai- • v · V, sesti varatuilla ionisoiduilla jäännöksillä, kuten Asp Lys:- llä, on katsottu pysyväksi siinä mielessä, että näiden ionis- • ♦ » • * • · • · • · · « · » ♦ • ♦ • * 41 101966 ten ryhmien on ajateltu lähinnä parantavan liukoisuutta. Kuitenkin yleensä, koska esitetyt korvaavat lisäykset ovat suhteellisen lyhyitä synteettisiä polypeptidiantigeeneja koko proteiiniin verrattuna, katsotaan ionisoidun jäännöksen korvaaminen toisella, vastakkaisen varauksen omaavalla ionisoidulla jäännöksellä tässä yhteydessä "radikaaliseksi korvaamiseksi", samoin kuin korvaamiset ei-ionisten ja ionisten jäännösten ja suurten jäännösten välillä, joita ovat esim.
Phe, Tyr ja Trp, ja vähemmän suurten jäännösten, kuten Gly,
Ile ja Vai välillä.
Termejä "ei-ioninen" ja "ioninen" jäännös käytetään tässä yhteydessä niiden tavanomaisessa merkityksessä tarkoittamaan sellaisia aminohappojäännöksiä, jotka normaalisti eivät omaa varausta tai joissa normaalisti on vastaavasti varaus fysiologisissa pH-arvoissa. Esimerkkejä ei-ionisista jäännöksistä ovat Thr ja Gin ja ionisista jäännöksistä Arg ja Asp.
Sanaa "antigeeni" käytetään sen tavanomaisessa merkityksessä tarkoittamaan kokonaisuutta, joka on sidottu vasta-aineen avulla, ja myös tarkoittamaan sellaista kokonaisuutta, joka ,, , käsittää vasta-aineen muodostuksen. Viimeaikaisempi käyttö rajoittaa antigeenin merkityksen siihen kokonaisuuteen, joka on sidottu vasta-aineen avulla, kun taas sanaa "immunogeeni“ : käytetään sellaisesta kokonaisuudesta, joka aikaansaa vasta- • · · aineen muodostumisen.
• « · • · » :V: Muutamissa tapauksissa antigeeni ja immunogeeni ovat sama ko- • · konaisuus, esimerkiksi kun synteettistä polypeptidiä käytetään sellaisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka sitoutuvat polypeptidiin. Nämä samat polypeptidit (99, 100 ja 142) ... muodostavat kuitenkin myös vasta-aineita, jotka sitovat koko . proteiinin, kuten HBxAg, jossa tapauksessa polypeptidi on se- *.1, kä immunogeeni että antigeeni, kun taas HBxAg on antigeeni.
Mikäli kyseessä oleva kokonaisuus on sekä immunogeeni että ; ; antigeeni, sitä nimitetään yleensä antigeeniksi.
· · • · · « « 42 101966 5 . Koejärjestelmät ia menetelmät
Edellä olevat tulokset osoittavat, että SVHBV-3:a voidaan käyttää ilmentämisvektorina. Se aikaansaa niiden vieraiden DNA-sekvenseien ilmentämisen säätömahdollisuuden, jotka on sovitettu lukukehykseen myötävirtaan HBxAg-geenistä.
Tulokset osoittavat myös, että synteettisiä polypeptidejä 99, 100 ja 142 ja niiden antipeptidi-vasta-aineita voidaan käyttää osana koejärjestelmässä ja menetelmässä, jolla todetaan HBxAgtn esiintyminen kokeiltavassa kehon näytteessä, kuten hepatoomaeoluissa tai maksasoluissa, jotka on saatu isäntä-eläimestä, jolla oletetaan esiintyvän HBxAg:n, menestyksellisen transfektion toteamiseksi SVHBV-3:n kanssa ja ilmentämisen säätämiseksi käytettäessä SVHBV-3:a ilmentämisvektorina.
Tällainen järjestelmä käsittää ainakin ensimmäisen reagenssin, joka sisältää reseptorimolekyylejä, jotka sisältävät vasta-aineen yhdyskohdan, kuten vasta-aineita, pääasiallisesti kokonaisia vasta-aineita tai tunnettuja Pab- ja F(ab')2~vasta-aineosia, jotka kykenevät immunoreagoimaan keksinnön mukaisen synteettisen polypeptidin kanssa, so. jotka on lisätty keksinnön mukaisiin synteettisiin polypeptideihin. Indikoivat osat, kuten fluorisoiva väri, esim. fluoreseiini tai rodamii-i ni, radioaktiivinen osa, kuten jodi-125 tai hiili-14, tai entsyymiin sidottu vasta-aine, jotka on lisätty ensimmäisen • · · reagenssin reseptoreihin (esim. peroksidaasiin kiinnitettyyn ; ; ; vuohen ant i—kani ini — I gG : hei^, osoittavat ensimmäisen reagenssin reseptoreiden immunoreaktion ilmentämis-spesifisen HBxAg:n kanssa. Osoitus laitteet voivat olla alustavasti sidotut ensimmäiseen reagenssiin tai eivät ole siihen sidotut. Tyypillisiä tällaisia käyttökelpoisia HBxAg:n toteamis-reagenssi- ... järjestelmiä ovat esim. entsyymiin sidotut immunosorboivat • · * • ^ kokeet (ELISA), radioimmunokokeet ja immunofluorisoivat kokeet (IF).
.···. Diagnostiset kokeet HBxAg:n esiintymisen toteamiseksi kehon • · näytteessä käyttäen keksinnön mukaisia polypeptidejä ja nii- 43 101966 den anti-polypeptidi-vasta-aineita on jo kuvattu laajasti. Tällaisen diagnostisen kokeen kaupallinen toteuttamismuoto, diagnostinen koemenetelmä, on kehitetty.
Eräs tällainen järjestelmä käsittää ainakin yhden sellaisen astian käytön, jossa on anti-polypeptidi-reeeptoria, kuten anti-8, -42, -79, -99 tai -142, ensimmäisenä reagenssina.
Toista astiaa, jossa on määrätty määrä polypeptidia, jonka kanssa anti-polypeptidi-vasta-aineen annetaan reagoida, esim. polypeptidia 8, 42, 79, 99 tai 142, voidaan myös käyttää toisen reagenssin aikaansaamiseksi. Lisäastioita, joissa on edellä kuvattuja osoitusaineita, yhtä tai useampaa puskuria yms., jotka ovat hyvin tunnettuja, voidaan myös käyttää tässä diagnostisessa koejärjestelmässä.
Menetelmä HBxAg:n todettavissa olevan määrän tutkimiseksi on myös kuvattu laajasti edellä. Lyhyesti sanoen tämä menetelmä käsittää kokeiltavasta kehon näytteestä saatujen proteiinien, kuten hepatooma- tai maksasolujen, sekoittamisen sellaisten reseptorien kanssa, jotka sisältävät vasta-aineen yhdistävän kohdan, joka kykenee immunoreagoimaan keksinnön mukaisen syn-; teettisen polypeptidin ja HBxAg:n kanssa, joita ovat esimer- !. * kiksi anti-8, -42, -79, -99 tai -142^^tai Fab- tai F(ab'>- *. . osan kanssa, merkkiaineiden, kuten I-merkityn Staphylococ- • ·* cue aureus (S. aureus) proteiinin A tai merkkientsyymin kans- sa, esim. piparjuuriperoksidaasin kanssa, jotka aineet on ·«» * kiinnitetty johonkin edellä olevaan reseptoriin ja ilmoittani/ vat immunoreaktion HBxAg:n ja reseptorin välillä. Seosta yllä pidetään riittävän pitkän ajan, jotta indikoivat aineet ilmoittavat immunoreaktion tapahtumisen, ja signaalin toteaminen voidaan suorittaa esimerkiksi autoradiogrammin avulla.
Kehon näyte tai sen proteiinit adsorboidaan tai kiinnitetään • · · edullisesti (sidotaan) muulla tavoin kiinteään matriisiin, V. kuten nitroselluloosa-arkkiin tai lasilevylle ennen sekoitta- "·”· mistä reseptorien kanssa.
44 101966
Mikäli ilmaisevat aineet muodostaa erillinen molekyyli, kuten radioaktiivisesta merkitty S. aureus-proteiini A, sekoitetaan kiinnitetty kehon näyte ja reseptorimolekyylit ensin keskenään ilman ilmaisuaineita, ja tätä seosta ylläpidetään riittävän pitkän ajan kiinnittyneen immunoreaktiotuotteen muodostamiseksi. Tämä kiinnittynyt immunoreaktiotuote huuhdotaan sitten. Erillinen molekyylin osoittava aine sekoitetaan sitten sidotun immunoreaktiotuotteen kanssa ja tätä seosta ylläpidetään riittävän pitkän ajan, jotta toinen kiinnitetty reaktiotuote muodostuu. Tämä toinen kiinnitetty reaktiotuote huuhdotaan sitten ja signaalin esiintyminen todetaan toteamis-laitteiden avulla.
Mikäli indikoiva aine on osa keksinnön mukaista reseptoria, sekoitetaan nämä merkityt reseptorit kehon kiinnitetyn näytteen kanssa ja seosta ylläpidetään riittävän pitkän ajan, jotta immunoreaktiotuote muodostuu. Kiinnitetty immunoreaktio-tuote huuhdotaan sitten ja signaalin esiintyminen todetaan osoituslaitteiden avulla.
Edellä mainittua toista reagenssia, esim. polpeptideja Θ, 42, . . 79, 99 tai 142, voidaan käyttää kontrollireagenssina immuno- ‘(i ' reaktion esitutkimuksissa sen seikan vahvistamiseksi, että ·' " on tapahtunut spesifinen eikä ei-spesifinen immunositoutumi- : nen. Näitä esitutkimuksia on esitetty kuvioissa 7, 8 ja 10.
··· • · « · • · · ··· ί Käytettäessä SVHBV-3:a ilmentämisvektorina, sovitetaan vieras DNA myötävirtaan HBxAg-geenistä, erikoisesti sen ainutlaatui- • · seen BamHI-rajoituskohtaan, ja muodostettua uutta vektoria käytetään solujen trans fektoimiseen. HBxAg:n muodostuminen transfektoiduissa soluissa on pääasiallinen osoitus sen vie- ... raan DNA:n muodostumisesta, joka on lisätty SVHBV-3:een.
• · · • · · ; . HBxAg:n muodostuminen, joka voidaan todeta edellä kuvatulla HBxAg:n muodostumisen tutkimusmenetelmällä, osoittaa SVHBV-3:een lisätyn vieraan DNA:n muodostumista.
♦ · »f * • · * ♦ » · 45 101966 Täten voidaan niiden eolukolonioiden tutkimusta, jotka ovat muodostuneet transfektioyrityksen jälkeen edellä esitettyä koejärjestelmää käyttäen, käyttää niiden kolonioiden valitsemiseen, joissa transfektio onnistui. Esim. ne solut, jotka saadaan kolonioista, jotka ovat peräisin yrityksestä lisätä vektori eukaryoottisiin soluihin, otetaan talteen, hajotetaan ja soluproteiini uutetaan. Uutetut soluproteiinit erotetaan tämän jälkeen SDS-polyakryyliamidigeeliin elektroforeesin avulla ja erotetut proteiinit täplitetään nitroselluloo-salle. Täplitettyjen proteiinien kosketusta reeeptoriylimää- rän ja edellä kuvatun koejärjestelmän merkkiaineen, kuten syn- 125 teettieen polypeptidin 99 tai polypeptidin 142 I-merkitty-jen vasta-aineiden kanssa, jota seuraa huuhtominen immunorea-goimattomien vasta-aineiden (reseptorien) poistamiseksi, voidaan sitten käyttää auto-radiogrammin valmistamiseksi, joka osoittaa muodostuneen HBxAg-osan esiintymisen, joka on kiinnittynyt vieraan geenin koodaamaan polypeptidiin.
Edellä kuvatut koemenetelmät ja järjestelmät ovat erittäin käyttökelpoisia identifioitaessa X-proteiini tai sen oleellinen osa, joka voi esiintyä kehon näytteissä, erikoisesti ku-. dosnäytteessä, kuten maksanäy t teen soluissa. Jäljempänä ku- ' vattu diagnostinen koe ja menetelmä on erittäin käyttökelpoi- t nen määrättäessä sen X-proteiinin vasta-aineiden esiintyminen, : ' jotka voivat esiintyä kehon näytteessä, kuten kokoveressä, ··· *.·.1 seerumissa tai plasmassa. Western-täpläanalyysi on käyttökel — «·· *.· ♦ poinen eräänä tällaisten diagnostisten menetelmien esimerkki- • · nä. Kuitenkin on eräs kaupallinen toteutusmuoto, jossa käytetään tätä menetelmää, diagnostinen järjestelmä ELISA (entsyymiin sidottu immunosorboiva koe).
Tällöin SVHBV-3-vektorin avulla transfektoiduista soluista i » · ! . erittynyttä tuotetta, kuten noin 24 000 daltonin proteiinia V. (polypeptidi), joka on muodostunut BSC-l-soluissa ja jota on *·’· käsitelty kuvion 10 yhteydessä, käytetään edullisesti antigee- • « « « # » 46 101966 nina, vaikkakin keksinnön mukaista polypeptidiä, kuten poly-peptidiä 99 tai polypeptidiä. 142, voidaan myös käyttää antigeeninä. Täten itse HBxAg-molekyylia, jota on käytetty oleellisesti puhdistetussa muodossa sellaisenaan jäljempänä kuvatussa af finiteetti-kromatografiässä HBxAg-molekyy1 in oleellisena osana, sellaisena kuin se on muodostunut SVHBV-3:n avulla transfektoiduissa BSC-l-soluissa <24 000 daltonin polypep-tidi), tai sellaista polypeptidiä, jonka aminohappojäännös-sekvenssi vastaa HBsAg:n antigeeni-determinanttia, voidaan käyttää antigeeninä.
Antigeeni on edullisesti sidottu (adsorboitu) tai muulla tavoin kiinnitetty kiinteään matriisiin kuten ristikytkettyyn dekstraaniin, jota Pharmacia Fine Chemicals CPiscataway, New Jersey) myy tavaramerkillä SEPHADEX, agaroosiin, lasipallo-eiin, polyvinyylikloridiin, polystyreeniin, ristikytkettyyn akryy1iamidiin, nitroselluloosaan tai mikrotiitterilevyn syvennyksiin, kiinteän kantajan muodostamiseksi.
Antigeeni sekoitetaan edullisesti, kiinnitettynä kiinteään matriisiin, kiinteän kantajan osana nestemäisen, tutkittavan . . kehon näytteen kanssa kiinteä-neste-faasi-seoksen muodostami- • · ’ seksi. Tätä seosta ylläpidetään riittävän pitkän ajan, jotta ; / kehon näytteessä olevat anti-X-proteiinin <anti~HBxAg) vasta- • ·' aineet (HBxAg) immunoreagoivat antigeenin kanssa. Immunoreak- • · * *...· tion esiintyminen todetaan sitten indikoimislaitteilla, jotka • · · ·,· * ilmoittavat anti-X-proteiini-vasta-aineiden esiintymisen tut- e » ::: kitussa kehon näytteessä.
Esim. eräässä tutkimuksessa valmistettiin SVHBV-3 vektorilla transfektoituja BSC-1-eolulysaatteja, erottaminen suoritet-„···# tiin elektroforeettisesti ja ne siirrettiin ja sidottiin nit- t · e !. rosellulooea-arkkeihin, jotka toimivat kiinteänä matriisina, » * i siten että tämä tapahtui oleellisesti samalla lailla kuin ku-viossa 10 on esitetty kiinteää faasia muodostettaessa. Seeru- « · • 4 » • > I · < · · • · > • · 47 101966 mit, jotka oli laimennettu suhteessa 1:50 kuudesta potilaasta, joilla oli erilaisia hepatiittisairauksia, sekoitettiin sitten erikseen nitroselluloosaan sidottujen transfektoitujen BSC-l-soluproteiinien kanssa kiinteä-neste-faasi-seosten muodostamiseksi. Näitä seoksia ylläpidettiin riittävän pitkän ajan <2 h), jotta seerumissa olevat anti-X-vasta-aineet saattoivat immunoreagoida sidotun antigeenin kanssa.
Huuhtomisen jälkeen kiinteän ja nestemäisen faasin erottamiseksi sekoitettiin kiinteät faasit, jotka saatiin edellä esitetyistä vaiheista, erikseen sellaisten nestemäisten liuosten kanssa, jotka sisälsivät 1:200-laimennuksia vuohen anti-ihmis-tai anti-kaniini-vasta-aineita, jotka oli konjugoitu pipar-juuriperoksidaaeiin, joka toimi indikoivana aineena niin, että muodosui toisia kiinteä-neste-faasi-seoksia. Nämä erilliset toiset kiinteä-neste-faasi-seokset ylläpidettiin riittävän pitkän ajan <1 h), jotta merkityt vasta-aineet saattoivat reagoida ihmisen anti-X-vasta-aineiden kanssa, jotka olivat immunoreagoineet matriisiin sitoutuneen antigeenin kanssa. Kaniinin anti-polypeptidi-vasta-aineita käytettiin vuohen an-ti-kaniini-vasta-aineiden valvontaan. Saatu kiinteä-neste-faasi-seos erotettiin jälleen ja huuhdottiin. Saaduissa kiin-teissä faaseissa käytettiin sitten liuoksia, jotka sisälsivät .. 4-kloori-l-naftolia, siten kuin kuviossa 8 on kuvattu.
i « · • · ♦ ·..1 Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että tutkitun potilaan t i '···’ seerumissa, jossa oli heptasellulaarisen karsinooman aiheutta- • · · • ♦ ♦ * mia vasta-aineita, jotka olivat sitoutuneet polypeptidiin, • · nämä muodostuivat SVHBV-3-vektorin johdosta transfektoiduissa BSC-l-soluissa. Nämä vasta-aineet ovat täten anti-X-vasta-ai-neita ja niiden esiintyminen muodostaa X-geenituotteen autenttisena antigeeninä HBV-infektion jossain vaiheessa.
• · · Käytettäessä noin 24 000 daltonin suuruista polypeptidituo- "·’· tetta, jota käytettiin edellä kuvatussa Western-täpläkokeesea, • · • · · · • · 48 101966 antigeeninä ELISA-kokeessa jäljempänä kuvatulla tavalla, tai jossain muussa samankaltaisessa kokeessa, puhdistetaan ja erotetaan tämä polypeptidi edullisesti ennen tällaista käyttöä. Tällainen puhdistaminen ja erottaminen voidaan toteuttaa tunnetuilla menetelmillä.
Esim. anti-8, -42, -79, -99 tai -142 vasta-aineita, tai niiden vasta-aineen yhdistäviä kohtia, voidaan valmistaa kuvatulla tavalla ja kiinnittää kiinteään matriisiin, kuten aga-roosi- tai ristikytkettyihin agaroosijohdannaisiin, joita Pharmacia Fine Chemicals myy tavaramerkillä SEPHAROSE 6B, CL6B, 4B ja CL4B, tai sellaisiin, joita Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, myy tavaramerkeillä Bio-Gel A-0,5M, A-1,5M ja A-50M. Edellä kuvatut ristikytketyt dekstraanit, joita myydään tavaramerkillä SEPHADEX, ja polyakryyliamidipalloset, joita Bio-Rad Laboratories myy tavaramerkeillä Bio-Gel P-2, P-30, P-100 ja P-300, ovat myös käyttökelpoisia kiinteitä matriiseja. Sellaisen matriisin käyttöä, joka sisältää agaroosi-johdannaisen, kuvataan jäljempänä.
Agaroosimatriisi aktivoidaan tavallisesti kiinnittämistä varten syaanibromidia käyttäen. Aktivoitu matriisi pestään ·. · : sitten ja yhdistetään haluttuihin vasta-aineireseptori)-mole- kyyleihin aktivoitua matriisia kuivaamatta. Matriisiin yhdis-tetty vasta-aine pestään sitten ja se on käyttövalmis. Matrii- • ♦ .···. sin reagoimattomat reaktiokykyiset ryhmät voidaan saattaa ha- • · ^"1 luttaessa reagoimaan amiinin, kuten etanoliamiinin, tai tuot- • · · !. teen Trie kanssa, vaikkakin tällaiset reaktiiviset ryhmät tur- • · · "·*·* meltuvat nopeasti.
Affiniteetin sorboivaa ainetta voidaan käyttää irtonaisessa tilassa, kuten pikarissa tai pullossa tai patsaassa. Ennen • ' · käyttöä on edullista, että affiniteetin sorboiva aine pestään : : : puskurissa tai jossain muussa vesipitoisessa väliaineessa, ' jota käytetään sellaisten solulysaattien puhdistamiseen, jot- • « ♦ • · • · • * * « · 49 101966 ka sisältävät noin 24 000 daltonin polypeptidin, ei-spesifi — eesti sitoutuneiden proteiinien eli sellaisten vasta-aineiden poistamiseksi, jotka ovat pysymättömästi sitoutuneet kantajaan .
On aikaansaatu sellainen vesipitoinen seos, joka sisältää SVHBV-3-vektorilla trans fektoitua solulysaattia ja tämä sekoitetaan sitten affiniteetin sorboivan aineen kanssa. Tämä seos muodostaa palautuvan kiinnitetyn vasta-aine-antigeeni-(reseptori-ligandi)-kompleksin kiinnitetyn vasta-aineen (reseptorin) ja noin 24 000 daltonin polypeptidin (antigeenin) välillä.
Kiinnitetty reseptori-ligandi-komplekei erotetaan sitten ei-kompleksisen vesipitoisen seoksen jäljellä olevasta osasta, jolloin polypeptidi-antigeeni saadaan puhdistetussa muodossa kiinnitettynä affiniteetin sorboivaan aineeseen. Kun sekoittaminen tapahtuu pikarissa tai pullossa, voidaan tämä erottaminen suorittaa suodattamalla ja pesemällä. Kun sorboiva aine on patsaassa, voi erottaminen tapahtua eluoimalla ei-komplek-sinen vesipitoinen väliaine, jota seuraa myös edullisesti pe-suvaihe.
:Joe puhdistettu polypeptidi-antigeeni halutaan vapaana affini- teetin sorboivasta aineesta, voidaan se saada erilaisia mene- .·**. telmiä käyttäen. Joissain näissä menetelmissä palautuvasta ··· kiinnitetty reseptori-ligandi-komplekei hajotetaan aineosiin- • · e sa, jotka muodostaa matriisiin kiinnitetty reseptori ja poly- • · · peptidi-antigeeni-ligandi, mitä seuraa polypeptidi-antigeeni-ligandin erottaminen kiinnitetyssä reseptorista sellaisen puhdistetun polypeptidi-antigeeni-ligandin liuoksen saamiseksi, jossa ei ole affiniteettia sorboivaa ainetta. Tätä liuos- • · · \1 1 ta voidaan käyttää sellaisenaan tai se voidaan väkevöidä tai • · ·/·'· kuivata haluttaessa ennen käyttöä. Muutamissa tapauksissa voi • · olla toivottavaa poistaa suola tunnetulla tavalla liuoksesta • · ennen käyttöä.
• « • · • · · · • 1 · 1 1 » · 50 101966
Palautuvan kompleksin diesoeioiminen voidaan suorittaa eri tavoin. Tavallisesti käytetään 0,2 molaarista glysiini-hydro-kloridi-liuosta pH-arvossa noin 2,5. Vaihtoehtoisesti voidaan kiinnitetty polypeptidi-antigeeni-ligandi poistaa kiinnitetystä reseptorista sekoittamalla palautuva kompleksi immuno-geenisen polypeptidin ylimäärän kanssa, jota käytetään vasta-aineiden muodostamiseksi, esim. polypeptidin 99 kanssa, jossa anti-99-vasta-aineet on sidottu matriisiin. Tällaisen poistamisen avulla vältetään polypeptidi-antigeenin mahdollinen denaturoituminen. Dissosioituneen polypeptidi-antigeenin erottaminen affiniteetin sorboivasta aineesta voidaan aikaansaada edellä kuvatulla tavalla.
Affiniteettia sorboivien aineiden valmistaminen ja niiden käyttö on suhteellisen vanhaa. Kuitenkaan ei sellaisia materiaaleja ja käyttötarkoituksia, joissa yhdistyy keksinnön mukainen vasta-aine ja antigeenimolekyyli, tätä ennen ole esitetty. Affiniteetin sorboivien aineiden, niiden valmistusmenetelmien ja käytön, jossa antigeeni on kiinnitetty matriisiin, yksityiskohtainen kuvaus on esitetty julkaisussa Antibody as a Tool, Marchalonis ja Warr, John Wiley and Sons, New York, sivut 64-67 ja 76-96 <1962).
Eräs ELISA-koe, jossa käytettiin edellä esitettyä menetelmää, käsitti kiinteän kantajan, jonka muodosti keksinnön mukainen t«··, edellä kuvattu antigeeni adsorboituna tai muulla tavoin kiin- • · .‘1!^ nitettynä kiinteään matriisiin, jonka muodosti 12 tai 96 sy- * , vennystä sisältävä mikrotiitterilevy, joka oli valmistettu • · · ’·*·* polystyreenistä tai polyvinyylikloridieta, ja joka muodosti kiinteän kantajan. Ei-spesifiset sidoskohdat mikrotiitterisy-vennyksen seinissä peitetään tämän jälkeen tavallisesti proteiinilla, kuten naudan seerumin albumiinilla <BSA>. Sitoutu- ‘. *. mattomat antigeenit ja BSA poistetaan mikrotiitterisyvennyk- ·/;*; sestä esim. huuhtomalla.
» · · I » · ♦ 4 · 51 101966
Esim. ihmisen seerumin veren tai plasman näyte sekoitetaan edellä kuvatun antigeenin sitovan kiinteän kantajan kanssa niin, että muodostuu seos, joka sisältää kiinteän ja nestemäisen faasin. Tätä kiinteä-neste-faasiseosta ylläpidetään riittävän pitkä aika, jotta kehon näytteessä olevat anti-X-proteiini-vasta-aineet immunoreagoivat polypeptidiantigeenin kanssa muodostaen palypeptidipitoisen immunoreaktiotuotteen, esim. noin 30 minuutista aina noin 2 tuntiin. Kiinteä ja nestemäinen faasi erotetaan yleensä tämän jälkeen toisistaan.
Nestemäinen liuos, joka sisältää toisen merkityn indikaattoreita sisältävän vasta-aineen, vasta-aineen yhdyskohdan tai S. aureus -proteiinin A, joka reagoi ensin mainitun vasta-aineen kanssa, sekoitetaan sitten kiinteän faasin kanssa niin, että muodostuu toinen kiinteä-neste-faasiseos, so. merkki-reaktioseos. Eräs esimerkki toisesta vasta-aineesta on perok-sidaasilla merkitty vuohen anti-ihmis-Ig-vasta-aine, jossa ensin mainitut vasta-aineet ovat peräisin ihmisen kehon näytteistä. Muita käyttökelpoisia entsyymimerkkiaineita ovat al-kalifosfaasi, beeta-D-galaktosidaasi ja glukoosioksidaasi.
• · • · · • ·' Seos, joka on muodostettu kiinteästä faasista (kiinteään mat- · • ” riisiin sidottu antigeeni-vasta-aine-immunoreaktiotuote) ja t I · : toisesta merkitystä vasta-aineliuoksesta, ylläpidetään (inku- • · · :,,.ί boidaan) riittävän pitkä aika (esim. noin 1 tunti) niin, että muodostuu ensin mainitun vasta-aineen ja ilmaisuyhdisteiden välinen reaktiotuote, esim. toinen immunoreaktio näiden kah- • · den vasta-aineen välillä. Kiinteä ja nestemäinen faasi erote-taan tämän jälkeen toisistaan.
• * · • · V * Toinen edellä kuvattu vasta-aine voi olla myös spesifinen ai- | noastaan yhdelle immunoglobuliiniluokalle (esim. IgG, IgM, • ·· · .**·. igE, IgA tai igD) ja immunoreagoida sen kanssa. Tällaiset • * * vasta-aineet mahdollistavat sen anti-X-proteiini-vasta-aineen ♦ immunoglobuliiniluokan identifioimisen, joka esiintyy kehon ·»» ·...· näytteessä. Lisäksi voi tämä toinen vasta-aine tai vasta- 52 101966 aineen yhdyskohta olla spesifinen ainoastaan yhdelle kahdesta immunoglobuliinin kevyiden ketjujen lajista (esim. kappa tai lambda) ja immunoreagoida sen kanssa. Nämä vasta-aineet aikaansaavat mahdollisuuden identifioida sen immunoglobuliini-molekyylin isotyypin, joka esiintyy kehon näytteessä, ja ne ovat hyvin tunnettuja.
Liuos, joka sisältää entsyymimerkkiaineen substraatin, kuten vetyperoksidin peroksidaasia varten, ja värin muodostavan väriaineen esituotteen, kuten o-fenyleenidiamiinin tai 4-kloori- 1-naftolin tai p-nitrofenyylifosfaatin, alkalista fosfa-taasia varten, sekoitetaan tämän jälkeen kiinteän faasin kanssa. Optinen tiheys valitulla aaltopituudella (esim. 490 tai 405 nanometria) voidaan sitten määrätä riittävän pitkän ajan kuluttua (esim. 60 min) ja verrata vertailutuotteen optiseen tiheyteen sen seikan määräämiseksi, esiintyykö anti-X-proteiinivasta-aineita kehon näytteessä.
Keksinnön eräs toinen toteuttamismuoto käsittää diagnostisen järjestelmän sellaisen välineen muodossa, joka sisältää kiin-. . teän kantajan, jonka muodostaa kiinteä matriisi, kuten 12 sy- * vennyksellä varustettu polystyreenimikrotitrausliuska, ja • · : ” edellä kuvattu keksinnön mukainen antigeeni absorboituna : (kiinnitettynä) tai muulla tavoin sidottuna tähän kiinteään matriisiin kiinteän kantajan muodostamiseksi. Tämä järjestel- ··· ·,· · mä sisältää myös edullisesti erillisesti pakatut anti-ihmis- :V: Ig-vasta-aineet, joissa on kiinnitetyt indikoimisosat, kuten peroksidaasimerkityt vuohen anti-ihmis-Ig-vasta-aineet, ja se voi myös sisältää kiinnitettyjen indikaattoreiden substraa-tin, kuten vetyperoksidin ja värin muodostavan väriaineen • · · esituotteen, kuten o-fenyleenidiamiinin, toisissa erillisissä • · : pakkauksissa. Vetyperoksidia ei tavallisesti sisällytetä • · · tähän pakkaukseen johtuen sen suhteellisesta epästabiiliu-desta, vaan sen lisää tavallisesti käyttäjä, vaikkakin ve- • · · · • · · • · • · · 53 101966 typeroksidisäi1iö voi myös olla tämän diagnostisen järjestelmän eräänä aineosana. Puekurisuoloja, joita käytetään tätä järjestelmää soveltavissa kokeissa, voidaan myös sisällyttää yhteen tai useampaan pakkaukseen kuivassa tai nestemäisessä muodossa. Keksinnön mukainen edullinen polypeptidi, kuten po-lypeptidi 99, voidaan myös sisällyttää erilliseen pakkaukseen käyttöä varten vertailevissa kiinnittymistutkimuksissa. Koe, josta tutkitaan anti-X-proteiini-vaeta-aineiden esiintyminen kehon näytteissä, kuten seerumissa, voidaan toteuttaa käyttäen tätä diagnostista järjestelmää ja edellä kuvattua menetelmää .
6. Polymeerien valmistus
Keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan yhdistää toisiinsa vesiliukoisen tai veteen dispergoituvan antigeeni-polymeerin muodostamiseksi, joka sisältää useita toistuvia polypeptidi-yksiköitä. Tällaisella polymeerillä on etuna kasvanut immunologinen reaktiokyky. Käytettäessä erilaisia polypeptidejä tämän polymeerin valmistamiseksi on näillä polymeereillä lisäksi kyky aikaansaada vasta-aineita, jotka immunoreagoivat useiden HBxAg:n antigeeni-pääteasemien kanssa.
polymeeri voidaan valmistaa valmistamalla synteettisesti sel- ; laisia polypeptidejä jäljempänä kuvatulla tavalla, jotka si- : ·' sältävät kaksi kysteiinijäännöstä. Nämä kaksi kysteiini- '...· jäännöstä voivat esiintyä yhdessä pääteasemassa ja polypepti- • · · V ! diketjuesa tai sekä amino- että karboksi-pääteasemassa. Poly- : peptidiä, joka sisältää kaksi kysteiiniä, nimitetään tässä yh teydessä yleensä "diCys"-polypeptidiksi, kun taas sellaista polypsptidiä, joka sisältää kaksi pääteasemassa olevaa kyste-iinijäännöstä, nimitetään "diCys-päätteiseksi”-polypeptidiksi. SI·' Tällaiset kysteiinijäännökset polypeptidiketjussa tai polypep- . tidiketjun pääteasemassa voivat esiintyä HBxAg-sekvenssissä, jota tämä polypeptidi vastaa, ja esim. polypeptidin 142 kes-'·'· keistä kysteiiniä ^seitsemäs jäännös karboksi-pääteasemassa 54 101966 olevasta alaniinista (Ala) laskettuni, polypeptidin 99 kar-boksi-pääteasemassa olevaa kysteiiniä (Cys) tai pääteasemassa olevia kysteiinijäännöksiä voidaan lisätä polymeerin valmistamiseksi .
Esimerkkejä käyttökelpoisista diCys-polypeptideistä ovat sellaiset, joita voidaan esittää alla olevilla kaavoilla, jotka on kirjoitettu vasemmalta oikealle ja suunnassa amino-pääte-asemasta karboksi-pääteasemaan:
Polypeptidi 8a: R -Gln-Leu-Aap-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-Gly-R ;
Polypeptidi 42a: Cys-Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cye;
Polypeptidi 79a: Cys-Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-GLy-Cys;
Polypeptidi 99a: Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cye; ; Polypeptidi 100a: Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-
Glu-I le-Arg-Leu-Lye-Val-Cys ; ja *···. Polypeptidi 142a: R -Ala-Pro-Ala-Pro-Cye-Aen-Phe-Phe-Thr-Ser- 2 ··· Ala-R ) • · » • · m 1 2 ** joissa kaavoissa R ja R ovat kumpikin kyeteiinijäännös, ^ sillä edellytyksellä, että läsnä on ainoastaan yksi R ja R .
Kuten kuviosta 6 ilmenee, sisältää kukin polypeptidi 8, 42, ·.· ! 99, 100 ja 142 kysteiini jäännöksen, joka on läsnä siirretyn X- : : : genomin aminohappojäännöksessä. On toistettava, että polypep- ' \ tidit, joissa on polypeptidien 99 ja 100 aminohappojäännös- 1 » • · · · • · » 55 101966 sekvenssit, lukuunottamatta pääteasemassa olevia kysteiini-jäännöksiä, ovat myös käyttökelpoisia tässä yhteydessä immu-noreaktion estotutkimuksieea ja käytettäessä kytkentää kantajaan muulla tavoin kuin MBS-reaktion avulla, jota käsitellään jäljempänä.
Lisättäessä yksi tai kaksi pääteasemassa olevaa kysteiini-jäännöstä polymeerin valmistamiseksi, ja kun jäljelle jäävä aminohappojäännöksen sekvenssi vastaa HBxAg:n antigeeni-pääteasemaa, on polypeptidin toistuvan yksikön silti katsottava vastaavan HBxAg:n antigeeni-determinanttia.
Tyypillisessä laboratoriossa suoritetussa valmistuksessa liuotetaan 10 mg diCys-polypeptidiä (sisältää kysteiinijäännökset hapettamattomassa muodossa) 250 mitään 0,1 molaarista ammoniumbikarbonaattipuskuria, jonka pH-arvo on noin 8. Liuotettu diCys-päätteinen polypeptidi hapetetaan sitten ilman avulla sekoittamalla saatua liuosta varovaisesti noin 18 h eli siksi, kunnes ei esiinny todettavissa olevaa vapaata mer-kaptaania Ellman-kokeessa. <CKs . Ellman <1959), Arch. Biochem. Biophys. 82:70-777.
Täten valmistettu polymeeri sisältää useita keksinnön mukaisia polypeptidejä toistuvina yksikköinä. Nämä toistuvat poly- t « « ·' peptidiyksiköt ovat sitoutuneet toisiinsa hapetettujen kye- • · *...1 teiinijäännösten avulla.
e e · • · e • ♦ · • e V.» Tällaista polymeeriä, joka sisältää useita keksinnön mukaisia polypeptideja, voidaan esittää seuraavalla kaavalla luettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa amino-pääteasemasta karboksi-pääteasemaan, ··· • Φ · .1'!·! <A>a» <B>b « · « • · • · *’1· jossa kaavassa A ja B ovat erilaisia toistuvia polypeptidiyk- : siköitä, kuten polypeptide jä 8, 42, 79, 99, 100 ja 142. Kir- • · · • · a a 56 101966 jaimet a ja b ovat kokonaislukuja, joiden arvo on 0 - noin 2000, sillä edellytyksellä, että a:n ja b:n keskimääräisten arvojen summa on vähintään kaksi niin, että polymeerissä on vähintään kaksi toistuvaa polypeptidiyksikköä.
Kirjainten a ja b keskiarvojen summa ei ole tavallisesti suurempi kuin noin 2000 niin, että saadun polymeerin keskimääräinen molekyylipaino on noin 5 000 000 daltonia. Edullisesti tämän polymeerin keskimääräinen molekyylipaino on noin 50 000 - 1 000 000 daltonia.
Edellä esitetty kaava esittää yleisesti polymeerin toistuvia yksiköitä ja kunkin läsnäolevan toistuvan yksikön keskimääräistä suuruutta. Keksinnön mukaiset polymeerit, jotka sisältävät kaksi erilaista toistuvaa yksikköä, ovat tavallisesti järjestymättömiä kopolymeereja. Täten edellä esitetyn kaavan tarkoituksena ei ole esittää sitä järjestystä, jossa toistuvat polymeeriyksiköt esiintyvät polymeerissä, esim. segmentti-kopolymeerissa.
Keksinnön mukaiset, edellä kuvatut vesiliukoiset tai veteen dispergoituvat polymeerit ovat sekä immunogeenisia että anti- • ' geenisiä ja ovat tämän johdosta esitetyt tässä yhteydessä ; · antigeenisinä, kuten edellä on mainittu. Nämä antigeeniset * · · ; polymeerit kykenevät aikaansaamaan dispergoituina fysiologi- • · · : : eesti sopivaan laimennusaineeseen ja lisättyinä esim. immu- * 1 · :1·1; noivan injektion avulla määrässä 400 mikrogrammaa polymeeriä t kaniinia kohden, vasta-aineiden muodostumisen kaniineissa * · · 1 ♦ t (New Zealand Red), jotka immunoreagoivat HBxAgtn kanssa. Fysiologisesti siedettävät laimennusaineet ovat immunologiasta hyvin tunnettuja ja niitä käsitellään yksityiskohtaisemmin jäljempänä.
• · · • « • · '·’·1 7. Polypept idien kytkeminen protei inikanta i i in Tässä yhteydessä käytetyt synteettiset polypeptidit kytket-tiin kotilon hemosyaniiniin (KLH) käyttäen seuraavaa hyvin I I | • 0 • # 4 « » ·
I I
• · 1 * · 57 101966 tunnettua menetelmää. KLH:n kantaja aktivoitiin ensin m-male-imidobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidi-esterillä ja kytkettiin tämän jälkeen polypeptidiin kyeteiinijäännöksellä, joka esiintyi polypeptidi-amino-pääteasemassa <polypeptidi 100), karboksi-pääteasemassa (polypeptidi 99) tai käyttäen polypep-tidin 142 keskeistä kysteiiniä, Michael-additioreaktion avulla siten kuin Liu ym. ovat esittäneet (1979), Biochem. 80, 690.
Keksinnön mukainen polypeptidi voidaan myös kytkeä kantajaan eri tavoin ja se voidaan myös kytkeä muihin kantajiin kuin KLH:hon. Esim. polypeptidi, kuten polypeptidi 99b, voidaan kytkeä tetanus-toksoidi-kantajaan vapaiden aminoryhmien avulla käyttäen tunnetulla tavalla 0,04 % glutaraldehydi-liuosta. Ke. esim. Klipetein ym. (1983), J. Infect. Disc. 147:318.
Kyeteiinijäännösten, jotka esiintyvät amino- tai karboksi-pää-teasemisea tai synteettisen polypeptidin keskiosassa, on todettu olevan erittäin käyttökelpoisia muodostettaessa konju-gaatteja disulfidisidosten ja Michael-additioreaktiotuottei-den avulla, mutta myös muita menetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja konjugaattien valmistuksesta, voidaan käyttää. Esimerkkejä muista sitomis(kiinnityeMenetelmistä ovat esim. di-j· ·^ aldehydien, kuten glutaraldehydin (käsitelty edellä) yms ., tai karbodi-imidi-teknologian käyttö, esimerkiksi käytettäes- *···* eä vesiliukoista karbodi-imidiä, kuten l-etyyli-3-(3-dimetyy- • · · ’·’ * liaminopropyyli)-karbodi-imidiä, amidisidosten muodostamisek- • · · *.*.* ei kantajan ja polypeptidin välille.
Käyttökelpoiset kantajat ovat hyvin tunnettuja ja ovat yleensä itse proteiineja. Esimerkkejä tällaisista kantajista ovat kotilon hemosyaniini (KLH), edestiini, tyroglobuliini, albu-miinit, kuten naudan seerumin albumiini tai ihmisen seerumin * · albumiini (vastaavasti BSA ja HDA), punaiset verisolut, kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), tetanus-toksoidi, kolera-toksoi- • · • ♦ · · 58 101966 di, samoin kuin polyaminohapot, kuten poly(D-lysiini:D-gluta-miinihappo) yms.
Kuten tällä alalla on hyvin tunnettua, on usein edullista kiinnittää synteettinen polypeptidi kantajaansa välillä sijaitsevan liitosryhmän avulla. Kuten edellä mainittiin, on glutaraldehydi eräs tällainen sitova ryhmä.
Kuitenkin kysteiiniä käytettäessä on välillä sijaitseva lii-tosryhmä edullisesti m-maleimidobentsoyyli-N-hydroksisukkin-imidiesteri (MBS), jota myös on käsitelty edellä. MBS lisätään tavallisesti ensin kantajaan esteri-amidi-vaihtoreaktion avulla. Tämän jälkeen voidaan käyttää edellä mainittua Michael -reaktiota tai MBS:n lisäystä voi seurata suojatun merkap-to-ryhmän Michael-additio, esim. tiolietikkahappo(CH3COSH) -ryhmän, maleimidokaksoissidokseen. Asyylisuojaryhmän lohkai-semisen jälkeen on disulfidisidos muodostettu suojauksesta vapautetun kytkevän merkaptaaniryhmän ja synteettisen poly-peptidin lisätyn kysteiinijäännöksen merkaptaanin välille.
Kantajan valinta riippuu lähinnä antigeenin lopullisesta käyttötarkoituksesta eikä antigeenin determinanttiosasta ja !.' perustuu kriteereihin, jotka eivät liity välittömästi esillä • · « I.. olevaan keksintöön. Jos siirrostetta käytetään esim. eläimis- • · « sä anti-polypeptidi-vasta-aineiden muodostamiseksi, joita • * '·.* käytetään HBxAg:n esiintymisen toteamiseksi, valitaan kanta- ··· ·.· · ja, joka ei aikaansaa haitallista reaktiota tässä eläimessä.
• · V.· Käytettäessä siirrostetta, kuten HBxAg-siirrostetta, ihmisis sä, niin tällöin yliherkkyyden huomioiminen käsittää kantajan ja/tai muodostuneen antigeenin immunokemiallisen tai muiden • · sivureaktioiden välttämisen sekä varmuuden ja tehokkuuden . ·, huomioimisen samalla tavoin kuin mitä hyvänsä ihmiselle tar- • · · koitettua siirrostetta käytettäessä.
• · • · « · · • I · • · I « · · • ·
I · I
59 101966 8 . Immunoimi smanfrtslmät
Siirrosteet, joita käytetään immunoimiseen, sisältävät tehokkaan määrän polypeptidiä sellaisten erillisten polypeptidien polymeerinä, jotka ovat yhdistetyt toisiinsa hapetettujen kysteiinijäännösten avulla, tai kantajaan kiinnitettyjen po-lypeptidien konjugaattina. Tehokas määrä polypeptidiä siir-rosteannosta kohti riippuu mm. siirrostettavan eläimen laadusta, eläimen ruumiinpainosta ja valitusta siirrostesarjas-ta, kuten on hyvin tunnettua. Siirrosteet valmistetaan tavallisesti kuivatusta kiinteästä polypeptidikonjugaatista tai polypeptidipolymeerista, suspendoimalla polypeptidikonjugaat-ti tai polypeptidipolymeeri veteen, suolaliuokseen tai lisäaineeseen.
Näiden siirrosteiden tavanomaiset polypeptidiväkevyydet ovat noin 20 mikrogrammaa - noin 500 milligrammaa siirrosteannosta kohti. Mainitut polypeptidimäärät tarkoittavat polypeptidin painoa ilman kantajan painoa, jos sitä käytetään.
Siirrosteet sisältävät myös fysiologisesti siedettävää (sopivaa) laimennusainetta, kuten vettä, fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta tai suolaliuosta, ja sisältävät tavallisesti myös lisäaineen laimennusaineen osana. Lisäaineet, kuten täy-dellinen Freundin lisäaine (CFA) , epätäydellinen Freundin li-,···, säaine (IFA) ja alunamateriaalit, ovat tällä alalla hyvin a < tunnettuja ja niitä on saatavissa kaupallisesti useista läh- • · · l . teistä.
• · · • · · • ♦
Siirrosteen perusliuokset valmistetaan käyttäen CFA:ta, IFA:ta tai alunaa seuraavasti: synteettisen polypeptidikonju- • · gaatin tai polymeerisen polypeptidin sellainen määrä, joka on . *. riittävä aikaansaamaan halutun polypeptidimäärän siirrostean- • · · "j/ nosta kohti, liuotetaan fosfaatilla puskuroituun suolaliuok- *·.·* seen (PBS) pH-arvossa 7,2. Yhtä suuret tilavuusmäärät CFA: ta, ·· IFA:ta tai alunaa sekoitetaan sitten polypeptidiliuoksen * # · · .·*·. kanssa niin, että saadaan siirroste, joka sisältää polypepti- • · · dia, vettä ja lisäainetta ja jossa veden ja öljyn suhde on 60 101966 noin 1:1. Seos homogenoidaan tämän jälkeen siirrosteen perus-liuoksen saamiseksi.
Kaniinit, joita käytettiin anti-polypeptidi-vasta-aineiden aikaansaamiseksi, injektoitiin subkutaanisesti siirrosteella, joka sisälsi 200 mikrogrammaa polypeptidikonjugaattia (polypeptidi plus kantaja) emulgoituna täydelliseen Freundin lisäaineeseen (CFA), 200 mikrogrammaa polypeptidikonjugaattia epätäydellisessä Freundin lisäaineessa (IFA) ja 200 mikro-grammaa polypeptidikonjugaattia yhdessä 4 milligramman kanssa alunaa, injektoituna intraperitoneaalisesti käyttäen vastaavasti immunoimiskaaviota 0, 14 ja 21 d.
Jokainen siirroste (immunointi) käsitti 4 siirrosteen injektiota. Hiiriä voidaan immunoida samalla tavoin käyttäen noin 1/10 edellä esitetystä injektiomäärästä.
Eläimistä poistettiin tavallisesti verta 4 ja 15 viikkoa ensimmäisen injektion jälkeen. Vertaileva esi-immuuniseerumi saatiin kustakin eläimestä poistamalla verta juuri ennen ensimmäistä immunointia.
< <
< i I
- ·' Vertailevia siirrosteen perusliuoksia voidaan myös valmistaa : käyttäen kotilon hemosyaniinia (KLH), KLH:ta IFA:ssa (epätäy- i dellinen Freundin lisäaine), alunaan absorboitua KLH:ta, KLH- : alunaan absorboituja hinkuyskäbakteereja, edestiinia, tyro- :*·*: globuliinia, tetanustoksoidia, tetanustoksoidia IFA:ssa, ko- • leratoksoidia ja koleratoksoidia IFArssa.
t «
Antigeenin tai siirrosteen injektion tai muunlaisen lisäämisen *.V jälkeen isäntäeläimeen reagoi tämän eläimen immuunijärjestelmä • · · V * muodostaen suuria määriä antigeenin vasta-ainetta. Koska vai- : .·. mistetun antigeenin spesifinen antigeeni-determinantti, so.
··· · ,···, antigeeni, joka on muodostettu synteettisestä polypeptidistä, *·’ joka on kiinnitetty kantajaan tai polymeeriin, vastaa kyseessä olevan luonnollisen antigeenin determinanttia, muodostaa • · · isäntäeläin vasta-aineita ei ainoastaan synteettiseen polypep-tidiantigeeniin nähden, vaan myös siihen proteiiniin tai po- 61 101966 lypeptidiin nähden, jota synteettinen polypeptidi-antigeeni vastaa, so. HBxAg:hen nähden.
9. Tallentaminen Jäljempänä luetellut materiaalit talletettiin laitokseen American Type Culture Collection 8. päivänä maaliskuuta 1984 ja niillä on jäljempänä esitetyt tailetusnumerot. Kaikki eolulin-jojen vektoreiden yms. merkinnät, jotka sisältävät kirjaimet "ATCC", joita seuraa numerot ja/tai kirjaimet ja numerot, tarkoittavat materiaaleja, jotka on talletettu edellä mainittuun laitokseen American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, MD 20852.
ATCC-
Materiaali talletusumero
Seos, joka sisältää virusta VR 2084 SVHBV-3 ja apuvirusta SV40 tsA239
Vektori-DNA
SVHBV-3 40102 AM6 40101 ! .·' SVAM191 40103 : E. coli EC-AM6 39630 ·«· EC - AM 1 39629 * · · .V. EC-SVAM191 39631 • · · • ·
Niiden materiaalien lisäksi, jotka keksijät ovat tallentaneet laitokseen ATCC, on myös sellaisia materiaaleja, joita muut ovat valmistaneet ja joita on käytetty tässä yhteydessä, tal-: letettu laitokseen ATCC. Luettelo näistä materiaaleista esi- *.·.* tetään seuraavassa: • i i 62 101966 ATCC-
Materiaali talletusnumero E . col i W3110 27325 294 31446 RR1 31447 HB101 33694
Nisäkkäiden solut
HepG2 CCL 23 BSC-1 CCL 26 COS-7 CRL 1651 PLC/PRF/5 CRL 8024
Vektori pBR322 37017 B. Materiaalit ia menetelmät 1. HBV: n DNA:n erottaminen ia valmistus DNA:n alue XHBV erotettiin Dane-osasista, alalaji adw, HBsAg-: positiivisen ihmisen plasmasta /National Institutes of Health no 737 139 käyttäen Robinsonin menetelmää, Am. J. Med. Sei.
<1975), 270:151-159.7. Lyhyesti sanoen 1,0 ml plasmaa laimen-nettiin 3,0 ml:ksi TN-puskur i 1 la, joka sisälsi 0,001 molaa- • · ’”·1 rista <M> Tris-HCl <pH 7,4) ja 0,5 M HC1. Laimennettua plas- • 9 · V 1 maa sentrifugoitiin voimakkuudella 10 000 x g 10 minuuttia • · ·.·.· suurten jätteiden poistamiseksi ja kerrostettiin sitten 2,5 millilitraan <ml> 30-prosenttista <paino/tilavuus) sakkaroosia, joka sisälsi TN-puskuria, 0,001 M EDTA:a /0,1 X 2-merkap-toetanolia ja 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia (BSA), jota oli aikaisemmin sentrifugoitu voimakkuudella 10 000 x g 10 min saostuneen BSAtn poistamiseksi^ . Kun oli sentrif ugoitu 4 tun-.... o • · tia nopeudella 50 000 kierr./min lämpötilassa 4 C Spinco SW- ’ ' 65-roottorilla (Beckman Instruments Inc.), poistettiin sakan ♦ · ♦ • 1 «
• > I I
» 63 101966 yläpuolella oleva neste varovasti ja pallo suspendoitiin uudelleen 50 mikrolitraan TN-puskuria, joka sisälsi 1 X tuotetta Nonidet P-40 <polyoksietyleeni(9)-oktyylifenyy1ieetteri,
Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) ja 0,1 % 2-merkaptoetano-1 ia .
Yksisäikeinen osa edellä erotettua HBV:n DNA:ta tehtiin kaksi- säikeiseksi lisäämällä 25 mikrolitraa seosta E £0,2 M Tris- HC1 <pH 7,4), 0,08 M MgCl2, 0,24 g NH4C1, 1,0 millimoolia <mM> kutakin seuraavista: daTP, dTTP, dGTP ja dCTR7 50 mikrolitraan uudelleen suspendoitua HBV:n DNA:ta, jota seurasi inkuboiminen o lämpötilassa 37 C 3 h. Robinson (1975), Am. J. Med. Sei.
270:151-159.
Radioaktiivisesti merkitty HBV:n DNA, jota käytetään genomi-sena näytteenä, valmistettiin käyttäen edellä esitettyä täyt-tömenetelmää käyttäen 0,25 mikrolitraa 3HdCTP ja 3HdGTP (molemmat 21 curieta per mM) vastaavasti dCTP:n ja dGTP:n sijasta .
2. ΗΒχΑσ:η kloonaus : .·. Osa HBV-genomia, joka sisälsi HBxAg:n koodaavan DNA-sekvens- • i ;·. sin, kloonattiin käyttäen plaemidia pBR322, joka oli lisätty 1, , E. coliin. Edellä erotettua kaksisäikeistä merkitsemätöntä « «
HBV: n DNA: ta uutettiin ra joitus-endonukleaasilla BamHI Λ0 mM
*···* NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl, 1 mM ditiotreito- *·· • · · *.* * li%7. Reaktioseosta käsiteltiin elektroforeesin avulla 0,6 %:n • · ♦.·.* horisontaalisessa agaroosigeelilevyssä käyttäen 100 ampeerin virtaa 2 h (0,04 Tris-asetaattia, 0,002 M EDTA:a).
Värjättäessä 1-51:11a etidiumbromidilla paljastui kolme HBV:n DNA-fragmenttia, jotka osoittivat kahden BamHI-rajoituskohdan • · · esiintymisen genomissa. 3200 emäsparin (ep) fragmentti, jonka V. muodosti koko HBV-genomi lineaarisessa muodossa, saatiin sen • * johdosta, että katkaisu oli tapahtunut ainoastaan BamHI- kohdista. 1850 ep ja 1350 ep fragmentit vastasivat sitä geno- • · • · · • * • · · • · 64 101966 mia, joka oli katkennut kahteen fragmenttiin BamHI:n täydellisen uuttamisen johdosta.
Kolmen BamHI HBV:n DNA-rajoitusfragmentin, jotka oli erotettu edellä, kopiot saatiin kloonaamalla plasmidissa pBR322 (ATCC-37017) /Sutcliffe <1978), P. Natl. Acad. Sei. USA, 75:3737-3791,7 . HBV:n DNA: n BamHI-fragmenttien sovittamiseksi pBR322:een tehtiin plasmidi lineaariseksi uuttamalla BamHI:11a /50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl <pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM ditio-treitolia^ sellaisten pääteasemien muodostamiseksi, jotka vastasivat HBV-fragmenttien pääteasemia. Nämä kolme HBV:n DNA-fragmenttia ja pBR322-fragmentti sekoitettiin keskenään ja liitettiin DNA:han T4 DNA-ligaasin avulla /66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 66 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolia ja 0,4 mm ATR7. Edellä olevasta reaktiosta saatu reaktiotuote on rengasmainen DNA, joka on johdettu lineaariseksi tehdyistä pBR322- ja HBV-frag-menteiata, jotka yhtyvät komplementaarisissa pääteasemissaan.
Saadut rengasmaiset yhdistelmäplasmidit lisättiin E. coli-kan- taan HB101 (ATCC 33694, valmistanut tri Dean Hunter; National
Cancer Institute, NIH, Betheeda, MD), jota seurasi Cohen ym.
; .·. käsittely ( 1972), Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 69:2110-2114.
.. Lyhyesti sanoen inkuboitiin E. coli HB101:n viljelmää liuok- : o . sesea,^jossa oli 0,03 M CaCl2, lämpötilassa 0 C 20 min. Noin 'it| 5 x 10 bakteerisolua lisättiin 0,3 ml:aan samaa liuosta, jo- • · '···* h°n lisätty 100 nanogrammaa (ng) yhdistelmäplamisde ja.
··· O
*·** Tata tranaformoimie-reaktioeeoeta inkuboitiin lämpötilaeea 0 C
60 min.
• e
Plasmidi pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliiniresis-tentit geenit. Lääkeaineelle herkistetyissä bakteerisoluissa, • "·*♦ jotka oli transformoitu tällä plasmidilla, esiintyi ampisil- liini- ja tetrasykliiniresistenssi. Koska pBR322 DNA:ssa on ·· ainoastaan yksi BamHI-lohkaisukohta, so. tetrasykliiniresis- tentissä geenissä, hajottaa HBV-fragmenttien lisääminen sen • » · • · * > · « · « · • · · • · « ♦ i i · • · » · > • * « • · 65 101966
BamHI-kohtaan tämän geenin. Lääkeaineelle herkällä E. coli HB101:11a, joka on transformoitu plasmidilla, joka on johdettu pBR322:eta, jossa HBV:n DNA-fragmentti on sovitettu BamHI-kohtaan <kloonausvektori), on tämän johdosta ampisilliinire-sistensei ja tetraeykliiniherkkyys.
Transformoitu E. coli, so. sellainen, joka sisälsi plasmidin ampisilliiniresistenssiä vastaava geenin, valittiin levittämällä transformointireaktioseos LB-lihaliemi-agar-väliainee-seen /kasvuväliaine, joka sisältää litrassa 10 g Bactoagaria, 10 g Bactotryptonia, 5 g Bacto-hiivauutetta (näitä kutakin valmistaa Difco Labs, Detroit, MI) ja 5 g NaCL7, joka sisältää 50 mikrogrammaa/ml ampisilliinia. Tätä levitettyä E. colia o inkuboitiin lämpötilassa 37 C 2 vrk.
Niistä kolonioista, jotka olivat ampisilliiniresistenttejä transformoinnin jälkeen edellä esitetyllä menetelmällä, valittiin tetrasykliiniherkät koloniat levittämällä nämä koloniat edellä mainitulle LB-lihaliemelle, joka sisälsi 50 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä ampisilliinin sijasta. Näitä levitetty-
O
jä kolonioita inkuboitiin myös lämpötilassa 37 C 2 vrk. Tällöin saatiin E. coli HBlOl-kantoja, jotka sisälsivät pBR322:a i t * 1 >' yhdessä HBV:n DNA-fragmenttien kanssa, jotka oli sovitettu ! " tetrasykliiniresistenttiin geeniin BamHI-lohkaisukohtaan.
i i
I I I I I
I « 1 ! 3. Pla8midi-DNA:n uuttaminen ;*·*; E. coli HB101-eolu ja, jotka sisälsivät edellä erotetun yhdis- .·.*· telmä-DNA:n, kasvatettiin LB-väliaineessa, joka sisälsi 20 * · mikrogrammaa/ml ampisilliinia, ja lisättiin kloramfenikolia väkevyyteen 170 mikrogrammaa/ml logaritmisessa kasvuvaiheessa. Viljelyä jatkettiin useita tunteja plasmidi-DNA:n lisäämiseksi .
• •O
4 1* • · * · 0 *·.* Solut hajotettiin sitten sekoittamalla 5 ml 25-X:eta sakka- ··,·-; roosia ja 50 mM Trie-HCl(pH 8,0)-liuosta 500 mitään soluja.
O
Kun oli haudottu 10 min lämpötilassa 0 C, lisättiin 1 ml 1-*: ♦ · i 4 » • * • * · 4 4 · • · * 0 0 « • ♦ 4 « t * * 0 66 101966 eta lysoteyymia 0,25 M Tris-HCKpH 7,5 )-1iuoksessa. Kun oli o inkuboitu 10 min lämpötilassa 0 C, lisättiin varovasti 2 ml 0,25 M EDTAia (pH 8,0>. 10 min pituisen inkuboinnin jälkeen o lämpötilassa 0 C, sekoitettiin 8 ml l-%:sta Triton X-100:aa /polyoksietyleeni(9)oktyyli-fenyy1ieetter^7 0,15 M Tris- HCl:ssa (pH 8,0) ja 0,2 M EDTA (pH 8,0), ja inkuboitiin jäl- o leen 10 min lämpötilassa 0 C.
Saatu lysaatti sentrifugoitiin nopeudella 30 000 kierr./min Spinco SW-65-roottorissa (Beckman Instruments) denaturoituneen proteiinin ja solujätteiden poistamiseksi. DNA saostet-tiin kirkastetusta lysaatista sekoittamalla 1/10 tilavuusosan kanssa 2,5 natriumasetaattia ja 2,5 tilavuusosan kanssa 99 % o etanolia ja inkuboimalla lämpötilassa -20 C 30 min. DNA-sakka muodostettiin pallosiksi sentrifugoimalla voimakkuudella 10 000 x g 30 min.
Proteiinin poisto suoritettiin kahdesti 1 milliä fenolia, joka 011 kyllästetty 0,01 M Tris-HCl:lla (pH 7,6), 0,1 M NaCl:lla ja 0,0012 M EDTA:lla. Landers ym. (1977), J. Virol. 23:368- 376. Edellä suoritetusta käsittelystä otettiin vesikerros ja siitä saostettiin DNA lisäämällä 1/10 tilavuusosaa 2 M natri- umasetaattia ja 2,5 tilavuusosaa 99-% etanolia ja inkuboimalla o lämpötilassa -20 C 20 min. Sentrifugoitaessa 10 min voimakkuudella 10 000 x g saatiin pallonen, jonka muodosti kaksisäikei-nen DNA, jossa oli HBxAg:n koodaava geeni.
• · · • · · • · • · 4. Plasmidi-DNA:n analyysi • · · HBV:n DNA:n esiintyminen klooneissa todettiin käyttäen Sout- hern-eiirto- ja hybridoimietekiikkaa. Southern (1975), Mol.
Biol. Sfi:503. 10 mg plasmidi-DNA:ta, joka oli saatu kustakin edellä erotetusta kloonista, uutettiin BamHI:lla £.50 mM
• · · 1 NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2# 1 mM ditiotreito- ·.·.· li^7. Reaktioseosta käsiteltiin elektroforeesin avulla 0,6-
Kissa horisontaalisessa 1 iuskamaisessa agaroosigeeliseä vir- i « · • · » · · 67 101966 ran voimakkuudella 100 ampeeria 2 h (0,04 H Trie-asetaattia; 0,002 M EDTA).
Geelissä oleva DNA denaturoitiin liottamalla geeliä useissa tilavuueosiesa 1,5 NaCl ja 0,05 M NaOH 1 h huoneen lämpötilassa, samalla jatkuvasti sekoittaen tai ravistaen. Muutamissa tapauksissa hydrolysoitiin geelissä oleva DNA hapon avulla ennen denaturoimista alkalilla, liottamalla geeliä kahdesti 15 min 0,25 M HCl:ssa huoneen lämpötilassa. Denaturoinnin jälkeen geeli neutraloitiin liottamalla useissa tilavuueosiesa liuosta, jossa oli 1 M Tris-HCl (pH Θ.0) ja 1,5 M NaCl, 1 h huoneen lämpötilassa samalla jatkuvasti ravistaen.
Geelissä oleva DNA siirrettiin nitroselluloosaan siten kuin ovat kuvanneet Maniatis ym. (1982), J. Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor. Lyhyesti sanoen nitroselluloosa (luettelo- numero BA85, Schleicher & Schuel, Ohio) sovitettii geelin päälle ja useita kerroksia Whatman 3MM-paperia sovitettiin nitroselluloosan päälle. Tämä kerrostuma sovitettiin sitten geelipuoli alaspäin Whatman 3MM-paperitukolle, jonka päät oli upotettu puskuriin, joka sisälsi 0,9 M NaCl ja 0,09 M nat- riumsitraattia. Puskurin kapillaariliike siirsi tällöin DNA: geelistä nitroselluloosaan. DNA kiinnitettiin nitroselluloo-: o ;·. saan kuumentamalla lämpötilassa 80 C 2 h tyhjössä.
Edellä valmistettu nitroselluloosalla oleva (Southern Filters) « · **’ plasmidi-DNA tutkittiin sen suhteen, esiintyikö siinä HBV:n • · · '·1 DNA-fragmentteja käyttäen menetelmää, jonka ovat esittäneet • · · *·1·1 Maniatis ym. supra.
Lyhyesti sanoen esihybridoitiin Southern-suodattimet liottamalla eeihybridoidueea nesteessä, joka sisälsi 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumsitraattia, 0,5 X SDS (natriumdodekyylisulfaat-ti), 100 mg/ml denaturoitua lohen sperman DNArta ja 5 x Den- • · « · • · • · 68 101966 hardtin liuosta (sisälsi litrassa 1 g tuotetta Ficoll, 1 g polyvinyylipyrrolidonia ja 1 g BSA-fraktiota V), 4 h lämpöti-o lassa 68 C.
Hybridoiminen suoritettiin käyttäen lämmöllä suljettavaa muovipussia, jossa oli riittävästi hybridoimisliuosta pitämään 2
Southern-suodatin kosteana <50 mikrolitraa/cm suodatinta).
Hybridoimisliuos sisälsi 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumsitraattia, 0,01 M EDTA:a, 5 x Denhardtin liuosta, 0,5 % STS, 100 mikro- 7 grammaa/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta ja 5 x 10 cmp radioaktiivisesti merkittyä edellä valmistettua HBV:n DNA:ta.
Southern-suodatintä inkuboitiin hybridoimisliuoksessa 12 h o lämpötilassa 68 C.
Kun suodatinta oli pesty 2 h <0,3 M NaCl, 0,03 M natriumsit-raattia) valotettiin röntgensädefilmi <XRP-1 Kodak) suodatti-meen autoradiografisen kuvan saamiseksi.
Kolme yhdistelmäplasmidia erotettiin käyttäen edellä mainittua menetelmää, ja niille annettiin merkinnät AM6, AM7 ja AMI. AM6 sisälsi pBR322:n DNA:ta ja koko HBV-genomin. AM7 sisälsi pBR322:n DNA:ta ja 1350 ep HBV:n DNA-fragmenttia. AMI sisälsi : ' : pBR322:n DNA:ta ja 1850 ep HBV:n DNA-fragmenttia ja myös HBxAg:n koodaavan geenin.
• · « i .···. 5. Sen kopioplaemidin rakenne, joka sisältää SV40/HBxAg- • · • · · ...# i lmentämisvektorin DNA:n • · · . Virheellistä SV40-virusta, joka saatiin Dean Hamerin mukai- « · · • · ♦ ** eesti, supra, käsiteltiin BamHI:n ja EcoRI:n lohkaisun avulla puskurissa, joka sisälsi 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 ja 1 mM ditiotreitolia. Plasmidin pBR322:n DNA:ta käsiteltiin edellä kuvatun kaksoisuuttamisen avulla niin, et- «i» ’/· ' tä täten lohkaistun SV40:n DNA:han muodostui täydellinen pää- : : : teasema. Kunkin tällaisen uuttamisen lohkaisutuotteet erotet- tiin ja puhdistettiin käyttäen tiheyden gradientti-sentrifu-... gointia kesiumkloridin avulla. Tanaka ym. (1975), 3. Bact.
» · « · » « 1 • · · > · · 69 101966 121:354-362. Täten erotetut 4492 ep SV40-fragmentti ja 39Θ7 ep pBR322-fragmentti kiinnitettiin DNA:han T4 DNA-ligaaein avulla puskurissa, joka sisälsi 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl2; 10 mM ditiotreitolia ja 0,4 mM ATP:a, pBRSV:n muodostamiseksi (kuvio 4).
Edellä olevasta reaktiosta saatu kiinnitetty reaktiotuote on rengasmainen DNA, joka on johdettu lineaariseksi tehdyistä pBR322:n 3987 ep- ja SV40:n 4492 ep-fragmenteista, jotka yhtyvät täydellisissä EcoRI- ja BamHI-pääteasemissaan. Tämä re-gasmainen plasmidi tehtiin sitten lineaariseksi lohkaisemalla BamHI-rajoituskohdassa, joka oli muodostunut sen kiinnittymisen aikana, joka aikaansai BamHI:n koheesio-pääteasemat kumpaankin päähän.
1850 ep HBV:n DNA-fragmentti, joka sisälsi HBxAg:n koodaavan geenin, erotettiin uuttamalla edellä erotettu plasmidi AM6
BamHI:11a puskurissa, joka sisälsi 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 ja 1 mM ditiotreitolia. Reaktioeeosta käsiteltiin elektroforeesin avulla virran voimakkuudessa 100 ampeeria 2 h käyttäen 0,8 1 agaroosia, ja 1850 ep säie irro- o tettiin ja sulatettiin lämpötilassa 68 C 15 min. Sitten li- « i sättiin 1/10 tilavuusosaa 3 M natriumasetaattia ja saatua < i liuosta käsiteltiin proteiinipoistomenetelmällä edellä kuva- 5‘·'; tulla tavalla.
« · s s e s • e • s s Täten erotetussa HBxAg-geenin sisältävässä HBV :n DNA-f ragmen- • · · • ^ tissa on täydellinen BamHI-pääteasema. Tämä DNA-fragmentti • s · ‘ 1 kiinnitettiin sitten edellä valmistettuun pBR-SV:hen T4 DNA- ligaasia käyttäen puskurissa, joka sisälsi 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2» 10 mM ditiotreitolia ja 0,4 mM ATP.
• · · * Edellä esitetystä kiinnitysreaktiosta saatu tuote oli rengas- • · mainen plasmidi-DNA, jolle annettiin merkintä SVAM191. Se si-sälsi myötäpäivään katsottuna 4492 ep SV40:n DNA-fragmentin * 1 · * · • t · • · · • · · • 1 · • · 70 101966 sen BamHI-kohdasta emäsasemasta 246Θ sen EcoRI-kohtaan emäs-asemaan 1717, 3987 ep pBR322 DNA-fragmentin sen EcoRI-kohdasta emäsasemasta 0 BamHI-kohtaan emäsasemaan 375, ja 1Θ50 ep HBV:n DNA-fragmentin sen BamHI-kohdasta emäsasemasta 1400 BamHI-kohtaan emäsasemaan 28, ja plasmidi SVAM191 on esitetty kaaviol-lisesti kuviossa 4.
SVAM191 lisättiin E. coliin HB101 käyttäen edellä kuvattua transformointimenetelmää. Koska nämä trasformoidut E. colit olivat myös ampisilliiniresistenttejä ja tetrasykliiniherkkiä, käsiteltiin niitä samalla erotuskäsittelyllä, joka on kuvattu edellä E. colin kloonausvektoria käsiteltäessä. Edellä kuvattuja valmistus-, erotus-, puhdistus- ja analyysimenetelmiä käytettiin oleellisesti puhtaan SVAM191-DNA:n muutamien milligrammojen saamiseksi.
6. SV40/ΗΒχΑσ-iImentämievektorin rakenne
Vektori, joka kykeni aikaansaamaan HBxAg:n tuoton eukaryootti-sissa soluissa, valmistettiin poistamalla osa SVAM191:n DNA:sta. Tämä toteutettiin uuttamalla SVAM191:n DNA:ta Haelll-endonukleaasilla puskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 ja 1 mM ditiotreitolia SVAM191:n lohkaise-miseksi Hae 11-kohdissa emäsasemaasa 767 SV40:n DNA-alueella « 4 · ja emäsaaemaeea 1437 HBV:n DNA-alueella.
4 · ..I Molemmat edellä esitetystä reaktiosta saadut DNA-fragmentit « e **’ erotettiin toisistaan edellä kuvatun elektroforeettisen aga- 4 · · *·* * roosigeelimenetelmän avulla. Täten erotettu suurempi frag- • · « '·’·* mentti, joka sisälsi ainoastaan SV40:n ja HBV:n DNA:n, teh tiin rengasmaiseksi käsittelemällä sen Hae 11-täydel1istä pääteasemaa edellä kuvatulla T4 DNA:n kiinnitysmenetelmällä.
Edellä valmistettua rengasmaista DNA-ilmentämisvektoria mer-kittiin merkinnällä SVHBV-3 (kuviot 4 ja 5) . Se sisältää • ; SV40:n ilmentämisen säätöelementit ja geenin, joka koodaa HBV:n HBxAg:n.
• · « * I » · • · 4 t · 71 101966 7. Eukarvoottisten isäntäsoluien transfektio SVHBV-3:n avulla BSC-1 afrikkalaisen vihreän apinan munuaissolulinjoja ja (ATCC CCL 26, saatu tri G.B. Thorntonilta, Johnson & Johnson Biotechnology Center Inc. La Jolla, Kalifornia), mahdollisia SV40:n isäntiä, valittiin tranefektiota varten SVHBV-3:a käyttäen. Yhtyneitä monokerroksia, joissa oli noin 10 solua, saa- o tiin viljeltäeeeä lämpötilassa 37 C Eaglen minimivällaineessa (EMEM), johon oli lisätty 10 % vasikan alkion seerumia, 100 yksikköä penisilliiniä/ml, 100 mikrogrammaa/ml streptomysiiniä ja 3 mM L-glutamiinia. Monokerrokset infektoitiin vektorin SVHBV-3 DNA:11a DEAE-dekstraanin läsnäollessa, siten kuin ovat esittäneet Ganem ym. <1976), J. Mol. Biol. 101:57-83.
Yksi pullo infektoitiin 1,6 mikrogrammalla yhdistelmä-SVHBV-3:a yhdessä 0,05 mikrogramman kanssa SV40 tsA23g DNA:ta apuaineena. Vertailunäytteisiin lisättiin ekvivalenttiset määrät pelkästään vektorin apu-DNA:ta, Viljelmiä inkuboitiin lämpö-o tilassa 40 C 12 vrk ja ne hajotettiin sitten jäädyttämällä o ja sulattamalla, ja niitä varastoitiin lämpötilassa -70 C.
Soluproteiineja uutettiin edellä saaduista jäädytetyistä ja . sulatetuista solujauheista lisäämällä ensin 2 mg solujauhetta ' 1 millilitraan proteiinin uutepuskuria C2 % SDS, 10 % glyse- : * rolia, 0,08 M Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM fenyy1i-metyy1i-sulfo- • * : ·* nyy1ifluoridia, 0,1 M ditiotreitolia, 0,001 X bromi fenoliei- • · * ·...* nistä^/. Liuosta keitettiin sitten 5 min, sitä eentrifugoitiin « · · · nopeudella 15 000 kierr./min 10 min ja sakan yläpuolella : oleva liuos otettiin talteen.
Tämän liuoksen sellainen määrä, joka oli riittävä aikaansaamaan proteiinin 100 mikrogramman näytteen, saatettiin sitten SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesikäsittelyyn käyttäen \·' jäljempänä kuvattua Western-täplämenetelmää.
72 101966 8. Polypeptiriisynteesi
Keksinnön mukaiset polypeptidit valmistettiin synteettisesti kemiallisesti käyttäen kiinteäfaasimenetelmiä, joita ovat kuvanneet Merrifield ym. (1963), J. Am. Chem. Soc. £5.:2149, Merrifield ym. (1970), A. Rev. Biochem. 35:841-866, ja Houghten ym. (1980), Int. J. Peptide Prot. Res. 15:311-320.
Tässä yhteydessä käytetyt suhteellisen lyhyet polypeptidit vastaavat HBxAg:n antigeeni-determinantteja.
Kuviossa 6 on esitetty HBxAg:n 154 aminohappojäännössekvenssiä. Edellä kuvattujen edullisten synteettisten polypeptidien (99, 100 ja 142) aminohappojäännössekvenssit on myös esitetty kuviossa 6. Molempien synteettisten polypeptidien koostumus vahvistettiin aminohappoanalyysin avulla.
Yleensä valmistetaan immunogeeni tai synteettinen polypeptidi sellaisten vaiheiden avulla, jotka aikaansaavat useita sopivasti suojattuja aminohappoja, jotka vastaavat HBxAg:n anti-geenideterminantin aminohappojäännöksiä, ja syntetisoimalla nämä aminohapot polypeptidiksi, jolla on sellainen aminohappo jäännössekvenssi, joka vastaa antigeenideterminantin poly-peptidin aminohappojäännössekvenssiä. Valmistettua synteet-tistä polypeptidiä voidaan käyttää siirrosteen valmistamisek-si, tavallisesti yhdistämällä se kantajaan konjugaatin muo- • i ,··. dostamiseksi ja dispergoimalla sitten tehokas määrä tätä kon- « | jugaattia fysiologisesti sopivaan laimennusaineeseen.
• · · • « :.V Polypeptidit valmistetaan edullisesti synteettisesti edellä mainittujen kiinteäfaasimenetelmien avulla kysteiinihartsia käyttäen. Ks. Merrifield ym., J. Am. Chem. Soc. supra. Tätä menetelmää käytettäessä suojataan kunkin lisätyn aminohapon . *. alfa-aminoryhmä tavallisesti tertiäärisellä butoksikarbonyy- • · · :*jt: li (t-BOC)-ryhmällä ennen aminohapon lisäämistä kasvavaan po- • · *·;·* lypeptidiketjuun. Tämä t-BOC-ryhmä poistetaan sitten ennen ··· seuraavan aminohapon lisäämistä kasvavaan polypeptidiketjuun.
• · · • · • · 73 101966
Sivuketjut erillisissä aminohapoissa suojataan seuraavasti: Arg-tosyyli, Ser-, Thr-, Glu- ja Aep-O-bentsyyli, Tyr-O-bromi-bentsyylioksi-karbamyyli, Trp-N-formyyli, S-metoksibentsyyli kysteiinia varten, 2-klooribentsoksikarbonyyli lysiinia varten ja dinitrofenyyli histidiinia varten. Asparagiinia käytettäessä lisätään yhtä suuri moolimäärä N-hydroksi-bentstriatso-lia suojatun aminohapon kanssa ja dimetyyliformamidia <DMF> käytetään kytkentäliuottimena. Trp-jäännösten H-formyyliryhmä poistetaan polypeptidin lohkaisun jälkeen kannatushartsista käsittelemällä 1,0-molaarisella ammoniumbikarbonaatilla, poly-peptidiväkevyydessä 1,0 mg/ml, 16 tuntia huoneen lämpötilassa. Yamashiro ym. ( 1973), 3. Org. Chem. 38.:2594-2597. Kytkennän tehokkuutta voidaan säätää kussakin vaiheessa ninhyd-riinilla tai pikriinihapolla, ja se on edullisesti suurempi kuin 99 % kaikissa tapauksissa. Ke. Gisin <1972), Anal. Chem.
Acta 5j3:248-249, ja Kaiser < 1980), Anal. Biochem. 34:595-598.
Halutun polypeptidin saostamisen jälkeen käsitellään osaa saadusta suojatusta polypeptidistä (noin 1 gramma) 2 millilit-ralla anisolia ja noin 20 millilitralla vedetöntä fluorivetyä, ja kondeneoidaan reaktioastiässä kuivajään lämpötilassa. Saa- o : .·. tua seosta sekoitetaan lämpötilassa noin 4 C noin 1 h suoja- ryhmien lohkaisemiseksi ja polypeptidin erottamiseksi hart- • ' · · o 1. . sista. Kun fluorivety on haihdutettu lämpötilassa 4 C N*>-kaa- • · · 6 • · sukehässä, uutetaan jäännöstä kolmesti vedettömällä dietyyli- • · ··· eetterillä anisolin poistamiseksi ja jäännös kuivataan tyh— ··· ' *.* * jössä.
• · • · ♦ • ♦ · • ·
Tyhjössä kuivattu materiaali uutetaan 5 prosenttisella etikka-hapon vesiliuoksella <3 x 50 ml) vapaan polypeptidin erottamiseksi hartsista. Uutepitoinen liuos lyofilisoidaan monomee-risen hapettamattoman polypeptidin saamiseksi.
. . Lyhyesti sanoen yleisenä menetelmänä kutakin polypeptidiä kä- ; : siteltäessä saatetaan 4 mg KLH:ta reagoimaan 0,25 millilit- • · « · • · • · • · * 74 101966 rasea 10-millimolaarieta natriumfosfaattipuekuria (pH 7,2) 0,7 mg kanssa MBS, joka on liuotettu DMF:aan, ja saatua seosta sekoitetaan 30 min huoneen lämpötilassa. MBS-liuos lisätään tipoittain sen seikan varmistamiseksi, että DMFtn paikallinen väkevyys ei ole liian korkea, koska KLH ei liukene DMF-väkevyyden ollessa noin 30 X tai suuremman. Reaktiotuote KLH-MB johdetaan kromatografisen patsaan läpi, joka sisältää hartsia Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piecataway, NJ), joka on tasapainotettu 50 millimoolilla natriumfosfaattipuekuria (pH 6,0) vapaan MBS:n poistamiseksi. KLH:n talteen-ottaminen patsaan eluaatin huippufraktioieta, noin 280 nano-metriä, on tavallisesti noin 80-proeenttinen.
Täten valmistettu KLH-MB saatetaan sitten reagoimaan 5 milligramman kanssa polypeptidia liuotettuna 1 ml:aan puskuria.
Saadun reaktioseoksen pH säädetään sitten arvoon 7-7,5 ja reaktioseosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 h polypepti-dikantajakonjugaatin saamiseksi.
9. Western-täplitvs
Anti-polypeptidi-vasta-aineita (anti-99, anti-100 ja anti-142) tutkittiin käyttäen Western-täplätekniikkaa niiden oletetun . ^ HBxAg-spesif isyyden varmistamiseksi ja HBxAg:n oleellisen po- , 1 lypeptidiosan muuttumisen toteamiseksi transfektoiduissa so- • t luissa. Soluproteiinit, jotka sisälsivät HBxAg:a, erotettiin « · ♦ ♦* 12,5-prosenttisessa SDS-polyakryy1iamidigeeli-elektroforeesi- i·» käsittelyssä. Ke. Laemmli (1970), Nature 277:680-685. ja Towbin ym. (1979), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:4350-4354.
• · < · · i · · • ·
Proteiinit siirrettiin elektroforeettiseeti nitroselluloosaan (Schleicher & Schuel, luettelo no BA85) siten kuin Towbin ym. ovat esittäneet supra, käyttäen elektrotäplityslaitetta (E.C.
··>' Apparatus Corp. Jacksonville, Florida) ja puskuria, joka si- 4 · · '. . sälsi 25 mM Trie-emästä, 192 mM glysiiniä, 20 X metanolia ja 0,1 X SDS (pH 8,3). Siirtämisen jälkeen kiinnitettiin nitro- • ♦ « » 4 4 4» · « · 4 4 · • ♦ ♦ 75 101966 selluloosa tuotteeseen BLOTTO ^naudan laktosiirtotekniikan op-timoimisaine, Johnson ym. (1983), j. Exp. Hed. 159:1751-1756, 5 X (paino/paino) rasvatonta kuivamaitoa, 0,01 1 vaah-donestoainetta A (Sigma, luettelo no A5758) ja 0,0001 X metio-laattia (Sigma, luettelo no 5125) PBStssa pH-arvossa 7,2/ ei-spesifisen sitoutumisen poistamiseksi. Täplät saatettiin reagoimaan 100 mikrolitran kanssa antipeptidi-vasta—ainetta 10 millilitrassa tuotetta BLOTTO 3 h ja ne pestiin sitten kolmesti 1 h kuluessa 50 millilitralla tuotetta BLOTTO.
Anti-polypeptidi-vasta-aineet, jotka olivat sitoutuneet vek-torispesifiseen proteiiniin, todettiin täplät reagoimaan 20
12 D
mikrolitran kanssa I-merkittyä Staphylococcus aureus-prote-iinia A 10 millilitrassa tuotetta BLOTTO 1 h. Täpliä pestiin sitten 50 ml :11a tuotetta BLOTTO 15 min aikana neljästi ja sitten jatkuvasti virtaavaesa vedessä 20 min ajan.
125 10. Hepatoomasolu-uutteiden I-merkintä
Ihmisen hepatoomasta johdetun solulinjan PLC/PRF/5 monokerrok-sia, jonka tiedettiin sisältävän HBV:n integroituja sekvenssejä Alexander ym. (1976), African Med. J. 50:21-24, ATCC CRL 8024/ lyofilisoitiin. Solujauhe liuotettiin fosfaatilla ;,·, puskuroituun suolaliuokseen (PBS) 1 mg/ml proteiiniväkevyyden ' aikaansaamiseksi. Kun oli sentrifugoitu voimakkuudella 10 000 i « , x 9 solu jätteiden poistamiseksi, lisättiin 50 mikrolitraa i · · : .1 edellä mainittua liuosta 75 mikrolitraan RIPA CO,15 M NaCl, 10 mM natriumfosfaattia (pH 7,5) 1 X Nonidet P-40, 0,5 X nat- • · · : riumdeoksikolaattia, 0,1 X SDS/ ja 20 mikrolitraan 0,2 N nat- : V riumfosfaattia (pH 7,5). Eräässä tutkimuksessa merkittiin tä- 125 ten liukoiseksi tehty soluproteiini 5 millicuriella I käyttäen kloramiini-T-reaktiota. Kuviossa 7 esitetyssä tutkimuk-, 125 sessa merkittiin eolulysaatit 3 mikrocuriella I samaa reak- ...# tiota käyttäen.
• · · V. Edellä mainittu reaktioseos valutettiin Sephadex G-25 (Pharma- '·”1 °la Pine Chemicals, Piacataway, NJ)-patsaan läpi ja pestiin • » · · • · ♦ * · 76 101966 PBS:n avulla. Saatu radioaktiivisesti merkitty huippufraktio 6 (9 x 10 cpm/ml) esi-inkuboitiin tavallisen kaniinin seerumin kanssa ei-spesifisen sitoutumisen poistamiseksi. Lyhyesti sanoen 20 mikrolitraa huippufraktiota sekoitettiin 1,0 ml:n kanssa RIPA, 20 mikrolitran kanssa Trasylol (protiniinin tavaramerkki, Sigma, helmikuu 1984, luettelon sivu 163) ja 100 mikrolitran kanssa NRS. Sen jälkeen, kun formaliiniin kiinnitettyjä Staphylococcus aureus<Staph. A; Calbiochem, La Jolla o
Ca) -soluja oli haudottu 1 h lämpötilassa 0 C, ne lisättiin ja o seosta inkuboitiin lämpötilassa 0 C 30 min. Staph. A-sakka poistettiin sentrifugoimalla voimakkuudella 10 000 x g 10 min kuluessa ja liuos otettiin talteen.
11. Immunosaostukset (IP)
Polypeptidin 99 kaniinin anti-polypeptidi-antiseerumi (anti-99) saatettiin reagoimaan edellä mainittujen radioaktiivisella jodilla merkittyjen soluproteiinien kanssa. Lyhyesti sa- 6 noen sekoitettiin 10 mikrolitraa anti-99 2 x 10 cpm kanssa o merkittyä uutetta ja inkuboitiin 1 h lämpötilassa 0 C, sitten lisättiin 40 mikrolitraa Staph. A:ta ja seosta inkuboitiin 30 o
min lämpötilassa 0 C. Staph. A-sakka erotettiin sentrifugoi-malla voimakkuudella 10 000 x g 10 min ja pallonen otettiin ; talteen. Tämä pallonen suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan RIPA
ja eentrifugoitiin edellä esitetyllä tavalla. Saatu pallonen
i · I
,, . suspendoitiin uudelleen 1,0 millilitraan LiCl-liuosta (100 mM
• · ' Trie HC1, 500 mM LiCl) ja eentrifugoitiin jälleen. LiCl-liuos- '···1 käsittely toistettiin ja pallonen otettiin talteen.
t·· i · · t · · • » » '.·.· Edellä saatu pallonen suspendoitiin uudelleen 50 mikrolitraan samaa puskuria ja sitä keitettiin 3 min. Seosta eentrifugoitiin voimakkuudella 10 000 x g 1 min ja liuos otettiin talteen ja sitä käsiteltiin 12,5-proeenttieesea SDS-polyakryyli-amidigeelissä elektroforeesin avulla. Edellä mainitut geelit valotettiin röntgensädef iImi 1 lä XRP-1 autoradiogrammin saarni- • « · V. seksi.
• a « « t i • r • · ·
4 I
♦ · · • « « 1 · » · » * 1 · • · 77 101966 12. Simpanssin ia ihmisen maksasolu-uutteiden valmistaminen ia kokeileminen
Maksanäytteitä, jotka oli saatu kahdesta HBV:lla kroonisesti infektoidusta simpanssista ja ihmisestä ja normaaleista simpanssin ja ihmisen <HBV-seronegatiivisista> maksoista, jäähdytettiin nopeasti nestemäisessä typeesä ja jauhettiin jauheeksi. Nämä jauheet sekoitettiin puskurinäytteen kanssa £0,0625 M Tris-HCl (pH 6,8), 2 % SDS, 10 % glyserolia, 5 % 2-merkapto-etanolia ja 0,001 % bromifenolisinist%7 ja keitettiin 5 min. Seosta sentrifugoitiin voimakkuudella 10 000 x g 30 min solu-jätteiden poistamiseksi. Näytteitä käsiteltiin sitten Western-täpläanalyysi1la edellä kuvatulla tavalla käyttäen 75 mikro-grammaa proteiinia geelijuovaa kohden.
13. Anti-HBxAct-vasta-aineiden identifiointi ihmisen seerumissa 20 mikrogrammaa juovaa kohden SVHBV-3:lla transfektoituja BSC-1-solu-uutteita käsiteltiin SDS-PAGE:lla 12-prosenttisieea akryyliamidigeeleissä ja erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosaliuskoille edellä kuvatulla tavalla. Saadut nitroselluloosaliuskat sekoitettiin käyttäen 1:50 laimennuksia seerumin kanssa, joka oli saatu •: kuudelta henkilöltä, joilla todettiin olevan HBV:hen liitty- : .. viä infektioita, joihin sisältyi symptomaattinen kantaja ja : * : eellainen potilas, jolla oli maksaeolusyöpä. Vertailuliuskat ;***; 8®koitettiin keksinnön mukaisten kaniini-anti-polypeptidi- ♦ · · vasta-aineiden kanssa.
• · · • » • · · • · ·
Nxtroaelluloosa-proteiiniseerumi-seoksia pidettiin 2 h huoneen lämpötilassa. Liuskat huuhdottiin sitten ja sekoitettiin 1.200-iaimennuksen kanssa vuohen anti-ihmis- tai anti-kaniini-vasta-aineita, jotka oli sidottu piparjuuriperoksidaasiin eo-"·* * Pivalia tavalla. Tätä seosta ylläpidettiin 1 h, jotta sitou- tuneet anti-X-vasta-aineet voivat reagoida vastaavien vasta-·;··· eineiden kanssa. Liuskat pestiin ja kehitettiin sitten 4-kloo- • · ♦ · • · · • t » « ♦ · • · 78 101966 ri-l-naftolilla edellä kuvatulla tavalla. Siinä seerumissa, joka oli saatu maksasolukarsinooman omaavasta potilaasta, esiintyi voimakas immunoreaktiivisuue noin 24 000 daltonin polypeptidin suhteen, joka oli muodostettu SVHBV-3:lla trans-fektoiduissa soluissa.
14. Soluliniat ia kudosnäytteet PLC/PRF/5- ja HepG2-solut saatiin tri D. Milichiltä, Department of Basic and Clinical Research, Scripps Clinic and Research Foundation (Scrippe), La Jolla, CA. Simpanssin maksaku-dosnäytteet toimittivat tri. R. Purcell ja tri. P. Kaplan, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bet-hesda, MD, ja Ortho Diagnostics Inc., Raritan, NJ. Ihmisen makean kudosnäytteet toimittavat tri. F. Chisari, tri. J.
Dienstag ja tri. A. Yu, Scripps Department of Medicine, Harvard University, Boston, MA ja vastaavasti Department of Pediatrics, University of California - SanDiego, La Jolla, CA.
Esimerkit 1 · Diagnostisten järjestelmien valmistus ia käyttö anti-HBxAa-vasta-aineiden (HBxAb) toteamiseksi ' : Polypeptidejä 8, 42, 79, 99, 100 ja 142 (nimitetään myöe täs sä yhteydessä vastaavasti p8, p42, p79, p99, plOO ja pl42> valmistettiin synteettisesti käyttäen symmetristä anhydridi- • · kemiaa ja mallia 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) olevaa pept idi-f aas i-synt et i saa 11 or ia, ja käyttäen menetelmää, > · · jonka ovat esittäneet Hagenmeyer ym. Hoppe-Seyler's Z. Phy-’**·* siol. Chem. 353:1973-1976 (1972).
Kukin polypeptidi liuotettiin deionisoituun veteen (pH 6) väkevyydessä 1 milligramma per millilitra (mg/ml). 100 mikro-• · · m ·.· * litraa </Ul> 10 millimolaarista (mM) natriumboraattipuskuria ; : P** joka sisälsi l mikrogramman (^ug) polypept ide jä p8, p42, p79, p99, plOO tai pl42, sekoitettiin 96 syvennystä ei- • · « · · 79 101966 eältävien EIA-mikrotiitterilevyjen syvennyksiin (Coetar, Van
Nyes, CA). Levyjä pidettiin sitten noin 16 h lämpötilassa o 37 C, jotta puskuri saattoi haihtua ja polypeptidit saattoivat adsorboitua (kiinnittyä) syvennysten seiniin. 300 ^ul tuotetta T-wash (Tris-puskuroitu suolaliuos: 50 mM Tris-emästä, 150 mM NaCl, pH 7,6), joka sisälsi 10 X tavallista hevosen seerumia, 5 X tavallista vuohen seerumia, 5 X vasikan alkion seerumia ja 0,05 X Tween-20, sekoitettiin sitten kuhunkin syvennykseen ylimääräisten proteiinin sidoskohtien salpaamisekei.
o
Syvennyksiä pidetään 2 h lämpötilassa 37 C, salpausliuos poistettiin ravistamalla ja syvennykset kuivattiin pitämällä nii- o tä 1 h lämpötilassa 37 C, jolloin muodostui keksinnön mukainen diagnostinen järjestelmä, so. HBxAg-liittyvä polypeptidi-pitoinen kantaja (polypeptidillä päällystetty syvennys).
Näitä polypeptidin sisältäviä kiinteitä kantajia käytettiin ELISA-kokeen suorittamiseksi tutkittaessa HBxAb:n esiintyminen ja määrä erilaisissa ihmisen seerumeissa. 100 /Ui kutakin seerumia, laimennettuna suhteessa 1:50 tuotteessa T-wash, sekoitettiin polypeptidillä päällystettyyn syvennykseen. Saatua kiinteä-neste-faasi-immunoreaktioseosta pidettiin lämpötilas-o sa 37 C 2 h polypeptidipitoisten immunoreaktiotuotteiden muo- dostumisen mahdollistamiseksi. Syvennykset huuhdottiin sitten '.***; neljästi PBS:lla, joka sisälsi 0,05 X Tween-20, jota seurasi • · · :1·1; lopullinen huuhtominen deionisoidussa vedessä (pH 6), jolloin ·.·. mahdolliset polypeptidipitoiset (kiinteä faasi) immunoreaktio- t · · • · tuotteet erotettiin reagoimattomista ihmisen vasta-aineista.
Tämän jälkeen syvennykseen lisättiin 300 ^ul piparjuuriperok-sidaasilla merkittyä vuohen anti-ihmis-IgG: a (Ortho Diagnos- « · 1 *·1 1 tic Systems Inc., Raritan, NH) laimennettuna suhteessa 1:5000 ·.·.· tuotteessa T-wash. Saatua merkintäreaktioseosta (toiset • · * · « • · • · « · ΘΟ 101966 kiinteäaine-nestefaasi-seokset> pidettiin sitten 1 h lämpöti-o lassa 37 C polypeptidipitoisen (kiinteään faasiin sidotun) merkityn immunoreaktiotuotteen muodostamiseksi. Syvennykset huuhdottiin sitten edellä kuvatulla tavalla reagoimattoman merkityn vasta-aineen poistamiseksi.
100 yul o-fenyleenidiamiinia (OPD) sekoitettiin sitten kuhunkin syvennykseen reaktioseoksen kehittämiseksi. Kun kehitys- o reaktioseosta oli pidetty 30 min lämpötilassa noin 20 C, sekoitettiin kuhunkin syvennykseen 50 /ui 4 N H2SO4 kehitysre-aktion pysäyttämiseksi, ja saaduista liuoksista tutkittiin absorbointi aaltopituudella 490 nanometria (nm) mikrotitraus-levylaekijaa käyttäen.
2. ELISA-kokeet HBxAb:n esiintymisen toteamiseksi Kaikkiaan 130:sta seeruminäytteestä tutkittiin, esiintyikö niissä HBxAb:ta käyttäen ELISA-koetta ja esimerkissä 1 kuvattuja menetelmiä. Näytteet ryhmitettiin potilaan diagnoosin mukaisesti keräyshetkellä. Kaikki ne seeruminäytteet, jotka olivat kroonisesti HBV:lla infektoiduista potilaista (HBsAg-poeitiivieia), olivat peräisin Tokiosta Japanista. Normaali seerumipaneeli saatiin laitoksesta General Clinical Research Center (GCRC) Scripps Clinic, La Jolla, CA. Akuutin faasin omaavat hepatitis B:n seeruminäytteet olivat sekä Tokiosta että La Jollasta. Seeruminäytteet luokitettiin seuraavasti: 4 · ,···, akuutti hepatitis B (B)2 asymptomaattinen kantaja (ASC), « · '•y. krooninen hepatis (CH), maksasolukarsinooma (HCC) tai normaa- t · · :. ii.
• · · » « · « ·
Taulukossa 1 on esitetty tulokset, jotka saatiin seeruminäytteistä, joita tutkittiin käyttäen kutakin X-polypeptidia. Positiivinen merkintä tehtiin, jos näyte reagoi yhden tai * »« : useamman polypeptidin kanssa.
• · « · « · 1 · • 1 • · • « · » 1 · · • · · • 1 » » · 81 101966
Taulukko 1
Kokeiltujen Yhden tai useamman pep- näytteiden tidin kanssa reagoineen 1 2 Diagnoosi määrä aineen määrä Kaikkiaan AH< B> 210 0 ASC 26 7 26,9 CH 26 8 30,7 HCC 21 18 85,7
Normaali 36 Q Q
130 33 25,3
Potilaan diagnoosi näytteenottohetkellä: AH(B> = akuutti he-hepatitie B, ASC = asymptomaattinen kantaja, CH = krooninen hepatitis, HCC = maksasolukarsinooma, Normaali - ei todettavissa olevaa alttiutta HBV:lle (HBsAb-negatiivinen).
2
Seerumin kunkin kategorian prosenttimäärä, joka todettiin positiiviseksi ainakin yhden polypeptidin suhteen.
Kuten taulukosta 1 ilmenee, ei HBxAb:ta todettu kokeilluissa 21:ssa akuutin faasin seeruminäytteessä. Näytteet, jotka oli • · *·* * otettu asymptomaattisesta ja kroonisesta kantajaryhmästä, ei- • » * sälsivät suunnilleen saman prosenttimäärän positiivisia näytteitä (vastaavasti 26,9 ja 30,7 X) . Huomattavan näytemäärän (85,7 X) maksasolukareinoomaryhmäetä (HCC) todettiin sisältävän HBxAb:ta. Positiivisten näytteiden suuri lukumäärä HCC-;*·*; ryhmässä vastasi aikaisempia tutkimuksia, joissa kahdeksan yhdestätoista seeruminäytteestä HCC-potilaita reagoi pepti- • · • · dien 100-115 ja 144-154 kanssa Ztaoriarty ym. Science, 227: 429-433 (1985)J7. Kaikki HBxAb-positiiviset näytteet olivat '...· myös HBsAg-positiivisia. HBeAg/HBeAb-asemalla ei ollut vaiku- : tueta HBxAb:n mahdolliseen toteamiseen. Noin 2/3 positiivi- .·. : sista näytteistä oli HBeAb-positiivisia.
« ♦ 82 101966
Positiivisten näytteiden absorboitumisarvot <A4qq) on esitetty taulukossa 2 kuvaamaan niitä polypeptidejä, joihin kunkin seeruminäytteen vasta-ainevaste oli suunnattu.
Taulukko 2 HBx-vasta-aineen toteaminen ihmisen seerumissa 1 2 3
Dx No. P8 P42 P79 P99 P100 P142 ASC 210 0,478 ASC 216 0,258 0,306 0,327 ASC 220 0,567 ASC 230 1,167 0,484 0,843 ASC 231 0,490 ASC 239 0,303 ASC 245 0,627 CH 204 0,478 4) CH 212 0,203 0,402 0,356 0,507 0,333 0,424 CH 213 0,294 0,269 . . CH 219 0,348 0,549 0,483 0,235 0,206 0,325 ;. ‘ CH 223 0,277 0,349 " CH 234 0,300 : CH 253 0,521 0,328 CH 25 0B 0,393 0,964 1,006 0,457 0,614 0,311 • · · : HCC 257B 0,286 0,402 0,445 0,476 0,650 :Y: HCC 258B 0,369 0,517 0,304 0,318 0,407 HCC 2595 0,312 0,528 0,628 HCC 26 0B 0,292 0,477 0,290 HCC 26 IB 0,365 0,344 0,465 0,347 0,325 HCC 263B 1,176 0,309 0,494 . HCC 265B 0,314 0,278 0,357 0,271 *\\ HCC 266B 0,355 0,400 0,610 0,520 0,749 HCC 267B 0,586 0,607 0,749 0,516 0,643 0,348 HCC 268B 0,472 0,255 0,512 0,328 0,883 0,248 83 101966
Taulukko 2 (jatkoa) HCC 269B 1,126 0,346 0,600 0,411 0,845 0,247 HCC 270B 2,047 0,324 0,292 HCC 271B 0,363 0,409
Potilaan diagnoosi näytteenottohetksllä: ASC = asymptomaat-tinen kantaja, CH = krooninen hepatitis B, HCC = maksasolu-kars inooma.
2
Seerumin tailetusnumero.
3
Polypeptidi, jota käytettiin kiinteässä faasissa antigeeninä ELISA-kokeessa.
4
Absorboimisarvo, joka saatiin ELISA-kokeessa mitattuna aallon pituudella 490 nm.
Taulukosta 2 ilmenee, että HBxAb:n spesifisyys ASC-ryhmässä j oli HBX-proteiinin aminohappojäännösten 79-131 välissä, "kuu- « · man kohdan" sijaitessa alueella noin 79-99, so. polypeptidissä 79. Oli mielenkiintoista, että sellaisten yksilöiden seerumi- i ... näytteet, joissa esiintyi viitteitä maksavauriosta (CH- ja \\\ HCC-ryhmät), sisälsivät HBxAb:ta, jolla oli spesifisyys, joka • · • 4 kattoi koko proteiinin, so. suurin osa näistä näytteistä rea- < · i '·*·* goi kaikkien kuuden peptidin kanssa. Tämän toteamuksen merki tys on epäselvä, mutta viittaa siihen, että HBxAg esiintyy mahdollisesti useammassa kuin yhdessä muodossa sairauden erilaisissa vaiheissa.
• · · • · · i · » 3. HBxAb:n akuutin heoatitis-B-seerumin ear ianävtteiden •; tutkiminen
Todettavan HBxAbrn puuttuminen seeruminäytteiden eräästä mää-rätystä ryhmästä potilailta, joilla on akuutti HBV-infektio • · • < * · 84 101966 ^XH(B) taulukossa 17, kaipaisi tutkimusta sen seikan määräämiseksi, otettiinko 26 tästä ryhmästä analysoitua näytettä liian aikaisessa infektiovaiheesea HBxAb:n toteamiseksi, tai joka tapauksessa vasta-aineen esiintyminen heijastaa kroonista infektiota HBV:lla. Seeruminäyteearjoja otettiin neljästä yksilöstä, jotka oli akuutisti infektoitu HBV:lla. Näytteiden ottamisen alkukohta oli oireiden alkamisajankohta ja jatkui aina HBsAb:n ilmenemiseen saakka. Näitä earjanäytteitä tutkittiin HBxAb:n esiintymisen suhteen ELISA-kokeiden avulla käyttäen esimerkissä 1 kuvattuja polypeptidejä 79, 99 ja 100.
Kaikki neljä paneelia olivat negatiivisia HBxAb:n suhteen akuutin infektion kaikissa vaiheissa. Kuitenkin, vaikka minkäänlaisia oleellisia HBxAb-tasoja ei todettu, todettiin akuutin HBV-infektion klassisia markkereita, so. aikainen HBsAg:n toteaminen, serologinen muuttuminen HBsAb:ksi 6 kuukauden kuluessa ja mahdollinen virusten vapautuminen, minkä osoitti HBeAb:n toteaminen. Täten, vaikka tänä ajankohtana ei ole tunnettua, muodostuuko X-proteiinia viruksen monis-tumisvaiheessa, niin edellä esitetyt arvot viittaavat siihen, : .·. että HBxAb:n ilmeneminen liittyy lähemmin krooniseen HBV-in- _· fektioon.
Näissä tutkimuksissa määrättiin HBsAg- ja HBsAb-tasot passii-'···1 visen hemagglutinoimiskokeen avulla menetelmällä, jonka ovat • s · .2 esittäneet Vyaa ym. Science, 170:332-333 <1970). HBeAg- ja • · .1.· HBeAb-tasot määrättiin käyttäen kaupan olevaa tuotetta (Ab bott Laboratories Inc. Chicago, II). PreSAg-taeot määrättiin ELISA-kokeella, jossa PreS2-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine kiinnitettiin mikrotitrauslevyn syvennyksiin (100 nano-grammaa per syvennys). Kiinteään faasiin sidottu monoklonaa- • · · • linen vasta-aine sekoitettiin ja saatettiin reagoimaan seeru- *· · minäytteiden kanssa sellaisen immunoreaktiotuotteen muodosta- • · misekei, joka todettiin käyttäen piparjuuriperokeidaasilla · • ♦ · 2 ♦ · 1 • I « 85 101966 merkittyä anti-HBs-monoklonaalieta vasta-ainetta ja käyttäen esimerkissä 1 kuvattuja olosuhteita.
Edellä esitetty on tarkoitettu kuvaamaan esillä olevaa keksintöä, mutta ei rajoittamaan sitä. Keksintöön voidaan tehdä erilaisia muunnoksia ja muutoksia joutumatta silti pois keksinnön piiristä.
* * · • · • · • · • · • · • · • · · • · · • · · • · * · i « · · • · « · • · · • ·

Claims (10)

101966
1. Antigen, syntetisk polypeptid, kännetecknad av att den innehäller ca 6-40 aminosyror, vilkas aminosekvens motsvarar en antigendeterminant i HBxAg, och innehäller en aminosyra-restsekvens vald i en grupp av polypeptider med en formel som • '.· frän vänster tili höger och i riktning frän aminoterminalen mot karboxiterminalen lyder: « « « ;; Gin-Leu-Asp- Pro-Ala-Arg-Asp-Vai-Leu-Cys-Leu-Arg- Pro-Vai-Gly; « « I « * ( ' Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly- ·.*.· Leu-Pro-Vai-Cys; och Met-Glu-Thr-Thr-Val -Asn-Ala-Hi s-Gin- Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu- • « · ** His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly. • · « • · : 2. Polypeptid enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den • · · även innehäller en kysteinrest i amino- eller karboxitermi- : .·. nalen i nämnda aminosyrarestsekvens. • · · • * * · • ·
1. Antigeeninen, synteettinen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää noin 6-40 aminohappoa, jotka aminohapposekvenssiltään vastaavat HBxAg:n antigeenideterminanttia, ja sisältää aminohappojäännössekvenssin, joka on valittu sellaisten polypeptidien ryhmästä, joilla on kaava, luettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopääteasemasta karboksipääte-asemään: Gin-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Vai-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Vai-Gly; Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys; ja Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu- Pro-Lys-Vai-Leu-Hi s-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää myös kysteiinijäännöksen mainitun aminohappojäännössekvenssin amino- tai karboksipääteasemassa. • · : 3. Vesiliukoinen tai veteen dispergoituva antigeenipolymee- • ♦ : ’·· ri, tunnettu siitä, että se sisältää useita yhtyneitä syn- • · · : \i teettisen polypeptidin toistuvia yksiköitä, jotka ovat sitou- tuneet yhteen hapetetuilla kysteiinijäännöksillä, joilla • « · toistuvilla yksiköillä on sellainen kaava, luettuna vasemmal-ta oikealle ja suunnassa aminopääteasemasta karboksipäätease- • · maan, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: ·"·*· 1 ·.·.· R - Gin-Leu - Asp - Pro - Ala - Arg - Asp-Vai-Leu-Cys-Leu-Arg - Pro-Vai- • M Λ V : Gly-R ; • · • · · :·| · Cys-Ser-Ala-Vai-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg- Gly-Leu-Pro-Vai-Cys; ja • · • · · ··· ; Cys-Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val- Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Cys, 101966 1 2 , . m m i. , ,. joissa kaavoissa kukin R ]a R on kystennijaannos, silla , 1 . 2 edellytyksellä, että läsnä on ainoastaan yksi R ja R .
3. Vattenlöslig eller i vatten dispergerbar antigenpolymer, kännetecknad av att den innehäller flera sammanbundna repete-rande enheter av syntetisk polypeptid, som sammanbundits med 101966 oxiderade kysteinrester, varvid de repeterande enheterna valts i gruppen som representeras av en formel, som frän vänster till höger och i riktning frän aminorestterminalen mot karboxirestterminalen lyder: R1 -Gin-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-Gly-R2; Cys-Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys; och Cys-Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Cys, i vilka R1 och R2 vardera är en kysteinrest under förutsätt-ning att endast en R1 och R2 är närvarande.
4. Antigenpolymer enligt patentkrav 3, kannetecknad av att nämnda repeterande enheter av syntetisk polypeptid även in-nehäller en polypeptid vald i gruppen som representeras av en . . formel som frän vänster till höger och i riktning frän amino- • I I jt ·' terminalen mot karboxiterminalen lyder: « « « I I : . · Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys- Asp-Cys; • I ( » I I Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys; och R1-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr- Ser-Ala-R2. • · · • · · • · · . 5. Receptormolekyl innehällande ett bindställe for en an- • · · *11.* tikropp som förmär immunoreagera med en syntetisk polypeptid • · *·;·* av en antigen, kannetecknad av att denna polypeptid, som in- : : : nehäller ca 6-40 aminosyrarester, vilka motsvarar aminosyra- ·;··· restsekvensen för en antigendeterminant i HBxAg, innehäller en aminosyrarestsekvens vald i gruppen av polypeptidsekvenser som representeras av följande formler, lasta frän vänster 101966 till höger och i riktning frän aminoterminalen mot karboxi-terminalen: Gin-Leu-Asp- Pro-Ala-Arg-Asp-Val- Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-Gly; Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys; och Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen antigeenipolymeeri, tunnettu siitä, että mainitut synteettiset polypeptidin toistuvat yksiköt sisältävät myös polypeptidin, jolla on sellainen kaava, luettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopääte-asemasta karboksipääteasemaan, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat: Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys- Asp-Cys; Cys -Leu-Phe- Lys -Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-1le-Arg-Leu-Lys-Val-Cys; ja R1-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2.
5. Reseptorimolekyyli, joka sisältää vasta-aineen sidoskoh-dan, joka kykenee immunoreagoimaan antigeenin synteettisen polypeptidin kanssa, tunnettu siitä, että tämä polypeptidi, joka sisältää noin 6-40 aminohappo jäännöstä, jotka vastaavat « · ;·. HBxAg:n antigeenideterminantin aminohappojäännössekvenssiä, • · · j. . sisältää aminohappojäännössekvenssin, joka on valittu sellai- * · sesta polypeptidisekvenssien ryhmästä, joita esittävät seu- « · raavat kaavat, luettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa ami- I I I '·' ‘ nopääteasemasta karboksipääteasemaan: • · • · · • · · • · Gin-Leu-Asp- Pro-AIa-Arg-Asp-Vai-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Vai-Gly; • · • · « *·’·" Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly- V * Leu-Pro-Vai-Cys; ja • · • · · Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu- • · *·;·* His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly. • · • · * t i t mj 6. Diagnostinen koejärjestelmä HBxAg:n esiintymisen toteami- « « seksi kehon näytteessä, tunnettu siitä, että se käsittää ainakin yhden ensimmäisen reagenssin astian, tämän ensimmäisen reagenssin sisältäessä reseptorimolekyylejä, jotka sisältävät 101966 vasta-aineen sidoskohdan, joka kykenee immunoreagoimaan HBxAg:n ja antigeenisen synteettisen polypeptidin kanssa, joka sisältää noin 6-40-aminohappojäännöstä, jotka vastaavat aminohappojäännössekvenssiltään HBxAg:n antigeenideterminant-tia, tämän synteettisen polypeptidin sisältäessä sellaisen aminohappojäännössekvenssin, joka on valittu polypeptidisek-venssien ryhmästä, joita esittävät seuraavat kaavat, luettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopääteasemasta karboksi-pääteasemaan: Gin-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Vai-Leu-Cys-Leu-Arg- Pro-Vai-Gly; Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Vai-Cys; ja Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly.
6. Diagnostiskt testsystem för att fastställa närvaro av HBxAg i ett kroppsprov, kännetecknat av att det innefattar atminstone en första reagensbehällare, varvid denna första reagens innehäller receptormolekyler, vilka innehäller ett bindställe för en antikropp, som förmär immunoreagera med HBxAg och med en antigen syntetisk polypeptid, som innehäller ca 6-40 aminosyrarester, vilkas aminosyrarestsekvens motsva-rar en antigendeterminant i HBxAg, varvid denna syntetiska polypeptid innehäller en aminosyrarestsekvens vald i gruppen av polypeptidsekvenser som representeras av följande formler, « * ' lasta frän vänster tili höger och i riktning frän aminotermi nalen mot karboxiterminalen: Gin-Leu-Asp- Pro-Ala-Arg-Asp-Vai-Leu-Cys-Leu-Arg- Pro-Vai-Gly; Ser-Ala-Val -Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly- • · Leu-Pro-Val-Cys; och • · *.·.* Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln- Ile-Leu - Pro-Lys-Vai-Leu- ·#· * Hi s - Lys - Arg-Thr-Leu-Gly. • · • · · • · · .···. 7. Förfarande för att fastställa en fastställbar mangd av « * *·* HBxAg eller en väsentlig polypeptiddel i denna, kännetecknat • · : av att det som steg innefattar blandning av fasta matrisbund- ’·*" na proteiner av kroppsprovet som skall testas med receptormo lekyler som innehäller stället som sammanbinder antikroppen och förmär immunoreagera med HBxAg och med en antigen synte- 101966 tisk polypeptid innehällande ca 6-40 aminosyrarester, vilkas aminosyrarestsekvens motsvarar en antigendeterminant i HBxAg, i närvaro av indikatorer som exponerar en immunoreaktion mel-lan nämnda receptorer och HBxAg, varvid denna polypeptid in-nehdller en aminosyrarestsekvens vald i gruppen bestdende av polypeptidsekvenser med en formel som frdn vdnster till hoger och i riktning frdn aminoterminalen mot karboxiterminalen ly-der: (A) Gin-Leu-Asp- Pro-Ala-Arg-Asp-Val- Leu-Cys-Leu-Arg- Pro-Val-Gly; (B) Ser-Ala-Val- Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys; och (C) Met -Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gin-lie-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly, upprätthallande av denna blandning tilltrdckligt lange för att indikatorerna skall ange att immunoreaktion intrdffat och fastställande av förekomsten av en signal. • · « 4 , 8. Förfarande enligt patentkrav 7, kännetecknat av att kroppsprovet och receptorn blandas utan nämnda indikatorer, att blandningen upprätthalls tillräckligt länge för att bilda V ‘ en bunden immunoreaktionsprodukt, och att indikatorerna blan- • · \v das med immunoreaktionsprodukten efter det denna produkt skölj ts. • · • « f • · * • «
7. Menetelmä HBxAg:n todettavissa olevan määrän tai sen oleellisen polypeptidiosan toteamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheina kokeiltavan kehon näytteen kiinteiden, j matriisiin sidottujen proteiinien sekoittamisen reseptorimo- lekyylien kanssa, jotka sisältävät vasta-aineen yhdistävän t ·'·*; kohdan ja kykenevät immunoreagoimaan HBxAg:n ja antigeenisen, synteettisen polypeptidin kanssa, joka sisältää noin 6-40 I « aminohappo jäännöstä, joiden aminohappo jäännössekvenssi vastaa • · · HBxAg:n antigeenideterminanttia, sellaisten indikaattoreiden • · · * * läsnäollessa, jotka ilmaisevat immunoreaktion mainittujen re septorien ja HBxAg:n välillä, tämän polypeptidin sisältäessä • · · ‘•V aminohappojäännössekvenssin, joka on valittu sellaisten poly- • · · *.* * peptidisekvenssien ryhmästä, joilla on kaava, luettuna vasem- j malta oikealle ja suunnassa aminopääteasemasta karboksipääte- • · · · .···. asemaan: • · • · · : (A) Gin-Leu-Asp - Pro-Ala-Arg-Asp-Vai-Leu-Cys-Leu-Arg - Pro-Vai - Gly; (B) Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Vai-Cys; ja 101966 (C) Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly, tämän seoksen ylläpitämisen riittävän pitkän ajan, jotta indikaattorit ilmaisevat immunoreaktion tapahtumisen ja tämän signaalin esiintymisen toteamisen.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kehon näyte ja reseptori sekoitetaan ilman mainittuja indikaattoreita, että seosta ylläpidetään riittävän pitkä aika sitoutuneen immunoreaktiotuotteen muodostamiseksi ja että indikaattorit sekoitetaan immunoreaktiotuotteen kanssa tämän tuotteen huuhtomisen jälkeen.
9. Menetelmä kehon näytteessä olevien anti-HBxAg-vasta-ai-neiden esiintymisen toteamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheina: (a) kiinteään matriisiin sidotun antigeenin aikaansaamisen kiinteän kantajan muodostamiseksi, jolloin tämä antigeeni on valittu ryhmästä, jonka muodostavat HBxAg pääasiallisesti • puhdistetussa muodossa, HBxAg:n oleellinen polypeptidiosa ja polypeptidi, joka sisältää noin 6-40 aminohappo jäännöstä ja •"·*j joka vastaa aminohappojäännössekvenssiltään HBxAg:n antigee- • · .*··. nideterminanttia, tämän polypeptidin sisältäessä sellaisen * · · aminohappojäännössekvenssin, joka on valittu sellaisen poly- * « « l'.' peptidisekvenssien ryhmästä, joilla on seuraava kaava luettu- • · · * * na vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopääteasemasta karb- oksipääteasemaan: • · · • · * • · :*·** Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-Gly; • · ; Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly- Leu-Pro-Val-Cys; ja ·· : Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu- ’·"· His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly, 101966 (b) tämän kiinteän kantajan sekoittamisen tutkittavan kehon nestemäisen näytteen kanssa kiinteän ja nestemäisen faasin muodostamiseksi, (c) tämän seoksen ylläpitämisen riittävän pitkän ajan, jotta kehon näytteessä olevat anti-HBxAg-vasta-aineet immunoreagoi-vat tässä kiinteässä kantajassa olevien antigeenien kanssa, ja (d) tämän immunoreaktion esiintymisen toteamisen indikaattoreilla.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kehon näyte on seerumi.
9· Förfarande för fastställande av närvaro av anti-HBxAg- . *. antikroppar i ett kroppsprov, kännetecknat av att det som • · · **j/ steg innefattar: • · • · • · · » : (a) produktion av en antigen bunden vid en fast matris för • ·« * ·;··· att bilda en fast bärare, som bestär av HBxAg huvudsakligen i renad form, en väsentlig polypeptiddel av HBxAg, och en polypeptid innehällande ca 6-40 aminosyrarester, och vars amino- 101966 syrarestsekvens motsvarar en antigendeterminant i HBxAg, var-vid denna polypeptid innehäller en aminosyrarestsekvens vald i gruppen bestäende av polypeptidsekvenser med följande for-mel, läst frän vänster till höger och i riktning fran amino-terminalen mot karboxiterminalen: Gin-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-Gly; Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys; och Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly, (b) blandning av denna fasta bärare med det flytande kroppsprov som skall undersökas för att bilda en fast och en flytande fas, (c) upprätthällande av denna blandning tillräckligt länge för att anti-HBxAg-motkropparna i kroppsprovet skall immunoreage-ra med antigenerna i denna fasta bärare, och (d) fastställande av att denna immunoreaktion inträffar med hjälp av indikatorerna.
• 10. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att • · *.V kroppsprovet är serum. • · • · 1 • · ς • · • · C • « · • · · • · • · · • · · • · « · • 1 · • · • · • · · • · « · • « « • · · · ·
FI890373A 1987-05-26 1989-01-25 Antigeeninen, synteettinen polypeptidi sekä sen käyttö diagnostiikassa FI101966B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/054,424 US4942125A (en) 1984-09-07 1987-05-26 SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US5442487 1987-05-26
US8801719 1988-05-24
PCT/US1988/001719 WO1988009340A1 (en) 1987-05-26 1988-05-24 A SV40 EXPRESSION VECTOR CONTAINING HBxAg AS AN EXPRESSION MARKER

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI890373A FI890373A (fi) 1989-01-25
FI890373A0 FI890373A0 (fi) 1989-01-25
FI101966B1 FI101966B1 (fi) 1998-09-30
FI101966B true FI101966B (fi) 1998-09-30

Family

ID=21990971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI890373A FI101966B (fi) 1987-05-26 1989-01-25 Antigeeninen, synteettinen polypeptidi sekä sen käyttö diagnostiikassa

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4942125A (fi)
EP (1) EP0316425A4 (fi)
JP (1) JPH02500245A (fi)
KR (1) KR0127148B1 (fi)
AU (1) AU614972B2 (fi)
CA (1) CA1326109C (fi)
DK (1) DK174060B1 (fi)
FI (1) FI101966B (fi)
WO (1) WO1988009340A1 (fi)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4777240A (en) * 1984-03-08 1988-10-11 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
EP0299242A3 (en) * 1987-06-22 1989-01-25 Medico Labs Ag Heterologous viral peptide particle immunogens
DE3841755A1 (de) * 1988-12-12 1990-06-13 Basf Ag Neue tnf-peptide
AU662304B2 (en) * 1990-10-22 1995-08-31 Fox Chase Cancer Center DNA construct for providing RNA therapy
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
US20030100520A1 (en) * 1997-01-21 2003-05-29 Philip Needleman Immunological process and constructs for increasing the hdl cholesterol concentration by dna vaccination

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4777240A (en) * 1984-03-08 1988-10-11 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker

Also Published As

Publication number Publication date
FI101966B1 (fi) 1998-09-30
EP0316425A1 (en) 1989-05-24
WO1988009340A1 (en) 1988-12-01
US4942125A (en) 1990-07-17
AU1805088A (en) 1988-12-21
CA1326109C (en) 1994-01-11
JPH02500245A (ja) 1990-02-01
DK32089A (da) 1989-03-21
KR890701623A (ko) 1989-12-21
FI890373A (fi) 1989-01-25
DK174060B1 (da) 2002-05-13
EP0316425A4 (en) 1991-03-20
AU614972B2 (en) 1991-09-19
DK32089D0 (da) 1989-01-25
KR0127148B1 (ko) 1997-12-29
FI890373A0 (fi) 1989-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Neurath et al. Hepatitis B virus contains pre-S gene-encoded domains
US5534405A (en) Antibodies, diagnostic systems and methods for assaying HBxAg
KR900006574B1 (ko) 프리(pre)-S 유전자 코우드된 펩티드, B형 간염면역원, 왁찐, 진단법 및 합성지질소낭 담체
WO2008003236A1 (fr) Procédé de détection conjointe de l&#39;antigène pres1 et de l&#39;antigène de noyau de vhb, coffret d&#39;expérimentation, substrat solide et solution de lyse de virus
Schlicht et al. Biochemical and immunological characterization of the duck hepatitis B virus envelope proteins
AU628156B2 (en) Monoclonal antibodies to pres2 and pres1 polypeptides of the hepatitis b viral envelope
EP0904378A1 (en) Hepatitis b monoclonal antibodies
FI101966B (fi) Antigeeninen, synteettinen polypeptidi sekä sen käyttö diagnostiikassa
JP4293788B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体
AU646039B2 (en) Monoclonal antibodies to Pres2 and Pres1 polypeptides of the hepatitis B viral envelope
EP0082789B1 (en) Immunological composition and method for hepatitis b virus
EP0272483A1 (en) Methods and materials for HBeAg production
US4778784A (en) Cyclic peptide and method of use for inducing an immunological response to hepatitis B virus
Yang et al. Expression and immunoactivity of chimeric particulate antigens of receptor binding site-core antigen of hepatitis B virus
Wei et al. Detection of anti-preS1 antibodies for recovery of hepatitis B patients by immunoassay
KR20000064637A (ko) 비(b)형 간염의 감염 결과를 예측하는 방법
JP2001503750A (ja) Ｂ型肝炎インヒビター
Howard The nature of the hepatitis B virus and its mode of replication
EP1256804A1 (en) HBcAg expression and diagnostic and therapeutic uses
NO177310B (no) Antigent polypeptid fra HBxAg, antistoff som reagerer med polypeptidet, diagnostisk analysesystem for bestemmelse av tilstedeværelsen av HBxAg i en kroppspröve, samt anvendelse av polypeptidet til in vitro diagnose

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

MA Patent expired