JPH02500245A - 発現マーカーとしてＨＢｘＡｇを含有するＳＶ４０発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発現マーカーとじてＨＢｘＡｇを含有するＳＶ４０発現ベクター 説明 （関連出願のクロスレファレンス） これは、１９８４年３月４日登録の出願番号第５８７，５７０号の一部継続出願 である、１９８４年９月７日登録の、出願番号第６４８．１４２号の一部継続出 願である。

説明 （技術分野） 本発明は、組換えＤＮＡ技術、発現ベクター及びポリペプチド発現マーカー、特 に、ヘパチチスＢ　ＨＢｘＡｇ遺伝子のクローニング、ＨＢｘＡｇを含む発現ベ クター及び身体試料におけるＨＢｘＡｇ及び抗ＨＢｘＡｇの検出システム及び方 法に関するものＡ、クローニング及びベクター 外来ＤＮＡの真核細胞への導入は分子生物学者にとって最も有力な道具の１つと なってきている。この方法は、受容細胞の核へ効率よ＜　ＤＮＡを配給し、かつ その外来ＤＮＡを発現する細胞を同定することを必要とする。

プラスミド又はバクテリオファージ（ファージ）のような作られたベクターまた は、宿主細胞中で複製可能なその他のＤＮＡ配列が大量の特別なウィルスタンパ ク質を生産する工場として働く細胞を構築するのに用いられる。ここでは、クロ ーニング・ビヒクルとも呼ばれる代表的ベクターとして、＆ｌｌ換えプラスミド を用いる。ここに参考文献として引用する米国特許第４，３３８．３９７号を参 照せよ。

プラスミドとは、種々のバクテリア内に見られる染色体外遺伝要素である。一般 的にこれらは二本鎖で閉じた環状のＤＮＡ分子である。最も広く使われているプ ラスミドには、そのヌクレオチド配列及びエンドヌクレアーゼ切断部位がよく分 っているｐＢＲ３２２というベクターがある。

プラスミド又はファージを用いた核酸の生産は非常に簡便になってきている。プ ラスミド又はファージのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断し、ついで、イ ン・ビトロで選ばれた外来ＤＮＡと結合させる。それから、生じた組換えプラス ミド又はファージを、大腸菌のような細胞に導入し、そのようにして作った細胞 が、作製したベクターを多数生産するように誘導する。１度、十分な量のＤＮＡ がそのクローニングベクターによって作られてしまえば、その産生外来ＤＮＡを 切り出し、第２のベクターに入れることにより、その外来遺伝子にコードされる タンパク質又はポリペプチドを生産又は転写することができる。

ＤＮＡに依存して（本来の遺伝子か、ｃＤＮＡかバクテリアの遺伝子か）、受容 細胞での発現を制御する真核性の転写及び翻訳シグナルを供給する必要がある。

これらのシグナルは、インビトロで外来ＤＮＡと発現ベクターを合せることによ り与えられることもある。

発現ベクターは、クローン化した遺伝子を転写し、かつそれらのメンセンジャＲ ＮＡ　（ｍＲＮＡ）をタンパク質に翻訳するのに必要な配列を含んでいる。一般 的に、この必要とされる配列又はコントロール要素には、ｆ１１転写の開始点を 知らせるプロモーター、（２）転写の終点を知らせるターミネター、（３）プロ モーターを制御するオペレーター、（４）細胞のタンパク質合成機械の最初の結 合のためのりボゾーム結合部位、及びタンパク質合成の開始及び終了を知らせる 開始及び終止コドンがある。

簡便性のため、発現ベクターはその他にいくつかの性質を有していなければなら ない。発現ベクターは、比較的小さくならなければならないし、かつ強いプロモ ーターを含んでいなければならない。発現ベクターは、トランスホーマントの同 定を可能にする１つ以上の選択マーカーを持っていなければならない、また発現 に重要ではない領域に１つ以上の制限酵素の認識部位を含まなければならない。

従って、発現ベクターの構築は、複雑で、かつ、いくぶん予想しがたい仕事であ る。発現ベクターの有効性の唯一の正しいテスト法は、適当なｍＲＮＡの合成が 開始する頻度を測定することである。しかし、ｍＲＮＡの定量は繁雑で、かつ、 正確な測定は困難な場合が多い。従って、その他のより現実性のあるトランスホ ーメーションの検定法が開発されてきている。

トランスホーメーションをモニターするのに用いられる別の方法には、免疫試薬 の使用がある。もし、発現するクンバク質のレベルが十分高いなら、フルオレセ インやローダミンのような螢光性色素を結合した抗体を用いた細胞質又は表面免 疫螢光法が、ベクター−特定タンパク質発現産物の検定に使うことができる。

より一般的には、トランスホームした細胞を放射活性の存在下で培養し、後に免 疫沈降法が用いられる。この方法はトランスホーメーションー特異的マーカーを 検出するのに、免疫複合体のスタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｃｏｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡ（ケスシー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）　 、（１９７５）　、ジャーナル・オブ　□イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、）　１１５．１６１７−１６２４）及びウェスタンブロッティング操作（レナ ート（Ｒｅｎａｒｔ）等、（１９７９）、プロシーディング・イン・ナショナル ・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ　７６．３１１６−３１２０〕を用いている。

シミアン・ウィルス４０（ＳＶ４０）を用いた遺伝子発現の分析は、生物学的及 び免疫化学的レベルで群を抜いて、最もよく調べられている真核性トランスホー メーション技術である。ＳＶ４０ゲノムの機構に関する遺伝的及び生化学的情報 は、このウィルスゲノムのヌクレオチド配列により明確なものとなっている。

トーゼ（丁ｏｏｚｅ）のレヴユー（（１９８０）　“腫瘍ウィルスの分子１１７ １学”第２編、パート２、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コ ールドスプリング、ニューヨーク）参照。別のＳＶ４０ベクター分子の設計は、 遺伝的シグナルの正確な地図とＳＶ４０ゲノムに由来する決った断片を単離する ための制限エンドヌクレアーゼの使用に依存する。

最初、ＳＶ４０は、溶菌システムを用いた真核性導入ベクターとして開発された 。ムリガン（Ｍｕｌｌ　ｉｇａｎ）等、（１９２９）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）　（ロンドン）２７７．１０Ｂ−１１４，つづいて、トランスホーミング・ベ クター（非１ｆｆｔｆｉ性）がＳＶ４０ゲノムの単離断片を用いて構築された。

エルグ−（Ｅｌｄｅｒ）等のレヴユー（１９８１）、アニュアル・レヴユー・オ ブ・ジェネテイクス（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１５．２９５−３ ４０）参照。

ＳＶ４０がプローブを使用できない遺伝子のクローニングに使うことができるこ とを示したのは、ヘイマー（Ｈａｍｅｒ）等が最初である。彼等は、異種のｍＲ ＮＡ群由来の二本鎖ｃＤＮＡコピーがＳＶ４０ベクターに“ショットガン”され ること、及び目的配列を有するウィルスが放射性又は螢光性抗体を用いて同定で きることを示した。

ヘイマー（Ｂａｓｅｒ）等は、１９７９年、発現マーカーを含むＳ、Ｖ４０ｍ換 え発現ベクターの構築を初めて報告した。ヘイマー（Ｈａｍｅｒ）等、（１９７ ９）、セル（Ｃｅ１１）、１ユ、７２５−７３５゜彼等のＳＶ４０ベクターは、 ０．１４地図単位にあるＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から右回りに、 ０．８２地図単位にあるＨａｅｎ制限部位までのウィルスＤＮＡ配列を含んでい る。全初期遺伝子Ａ及びウィルスＤＮＡ複製オリジンに加えて、このベクターに は、ウィルスプロモーター、リーダー、介在配列、本体の５′側部分及びウィル スの後期１９５ｍＲＮＡに対する３′末末端列が含まれている。ウィルスタンパ ク質ＵＰＩ、２及び３をコードする後期領域配列１６６０塩基対（ｂｐ）は含ん でいなかった。プリアース（Ｐｒｉｅｒｓ）等（１９７Ｂ）ネイチ＋　−（Ｎａ ｔｕｒｅ）、２７３．１１３−１２０及びレディー　（Ｒｅｄｄｙ）等（１９７ ８）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２００．４９４−５０２参照。

ウサギのベータ・グロビン遺伝子コード配列を、発現マーカーとして上記ベクタ ーに連結した。ウサギのベータ・グロビンが、これらの組換えベクターが感染し たサルの細胞内で合成されるかどうかを確かめるため、ヘイマー（ｌａｍｅｒ） 等（上述）は、僅か１．０ナノグラムのグロブリンを検出できるラジオイムノア ンセイを用いた。

へ４　？　−（Ｈａ＋＊ｅｒ）　等は、ベータ・グロビン発現に対し正の結果を 示すことができたけれども、５ｖ４０／ベータ・グロビン組換えシステムの使用 に関し、いくつかの制限を表明した。第１に、グロビンはわずかじか溶けないの で、測定用のサンプル調製の際に有意なロスを生ずる。従って、感染細胞中のグ ロビン量の測定に１０倍程の誤差が生ずる。第２にこの検定法は、本来のグロビ ンとその他の、通読タンパク質もしくはポリペプチド断片のような免疫的に関連 のある産物とを区別できない。

ヘイマー（Ｒａｗｅｒ）等が、示損しなかった因子の１つには、全ての真核性グ ロビンの相同性が非常に高いことがあげられる。この相同性によって、ベクター 誘導のグロビン発現を宿主細胞システム内のグロビンと区別するのが困難となる 。

Ｂ、ヘパチチスＢウィルスペプチド及び抗ポリペプチド抗体へパチチスウィルス 類は、非常異質なものとされている。それらは“標的器官°を肝臓とすることに より厳格にグループ分けされている。多くのウィルスが全身感染の一部として肝 臓を冒すけれども°ヘパチチスウイルス”という言葉はタイプＡ　（ＨＡＶ）、 タイプＢ　（ＨＢＶ）　、及びノンＡ、ノンＢ物質を意味するのが普通である。

ウィルスの３タイプのうち、ＨＢＶは群を抜いて、生物学的、免疫化学的及び臨 床学的によく調べられている。

ＨＢＶはＤＮＡウィルスに分類され、かつ、多くの点でその他の全てのＤＮＡウ ィルスとは異なっている。ＨＢＶはタンパク質、脂質及び炭水化物を含む外皮（ 膜又はエンベロープよりもより堅固なもの）を含み、独特の抗原複合体、すなわ ちヘパチチスＢ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を有している。また、これは表面抗原と 区別される抗原特異性、すなわちヘパチチスＢコア抗原（ＨＢｃＡｇ）をもつ内 部ヌクレオキャプシドを含んでいる。

可溶性抗原、ＨＢｅＡｇもこの分野で確認されている。この抗原は、ＨＢＶコア には会合しないＨＢｃＡｇポリペプチドがらなり、結果的に、非会合状態で独特 の抗原特異性をもっと考えられている。

典型的な自己制限的急性ＨＢＶ感染において、次にあげる血清学的マーカーは、 感染宿主の血清中に順次出現する：ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢＣ，抗ＨＢ Ｅ及び抗ＨＢＳ、抗ＨＢＥの出現は、検出可能なＨＢｓＡｇの最終的な損失を知 らせる。このことは、自己制限性急性ＨＢＶ怒染の全ての場合について言えるこ とである。ＨＢＳの消失につづいて、抗ＨＢＳの出現前に数週間から数ケ月の猶 予がある。

慢性ＨＢＶｉ染の際には、ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢＣが存在する。

宿主の血清はＨＢｓＡｇ又は抗ＨＢＥ血清学的マーカーを示す。

すなわち、この患者はＨＢｅＡｇ又は抗ＨＢＥ陽性となりうる。

高怒度で特異的な、数種の）ＩＢＶマーカーに対するラジオイムノアッセイ及び エンザイムノアンセイは広く使用されている。これらの非常に怒度の高い血清学 的テストは、ＨＢＶ怒染進行時のウィルスの出現及び免疫応答マーカーのモニタ ーの基盤を提供する。

ここ数年の多くの研究により、各血清学的マーカーが、ＨＢＶ複製の際の宿主応 答に対する特異的ウィルス事象を表していることを示した。従って、病気のしｎ 法的経過における各段階での血清学的マーカーのプロフィールは有用な診断及び 予後の情報を与えてくれる。

ヘパチチスＢウィルスと、ヒトの肝細胞がん腫（ＨＣＣ）、肝臓がん、との関係 が広く研究されてきており、また組織病理学的知見ばかりでなく血清疫学的な知 見は、ＨＢＶが直接的又は間接的に肝臓がんの病因に関係することを強く示して いる。多くの肝臓がん腫細胞系列がヒトのＨＣＣから得られており、がっ、その ２つの細胞系列、Ｐ　Ｌ　Ｃ／Ｐ　ＲＦ／、５及びＥＰＨ３Ｂのゲノムへ組込ま れたＨＢＶ特異的ＤＮＡの検出が報告されている。しかし１、：れらの細胞系列 では、組織培養中、ウィルス特異的遺伝子産物として、ヘパチチスＢ表面抗原の みが発現される。ヘパチチスＢコア抗原、ヘパチチスＢＥ抗原及びＤＮＡポリメ ラーゼなどの、その他の）（ＢＶママ−−は検出されなかった。

いくつかの動物ＤＮＡ腫瘍ウィルスはウィルスゲノムの複製及び組込みを制御す るウィルス遺伝子の作用を通してトランスホーメーションを起こすことがあり、 そして、そのようなウィルスによってトランスホームした細胞は、トランスホー ムした遺伝子によって発現するＴ（腫瘍）又はｎｅｏ　（新しい）抗原を所有す る。

Ｔ抗原に類似する抗原の存在証拠が抗補０体免疫螢光染色法により、組込まれた ＨＢＶ遺伝子を含むヒト肝臓がん腫細胞中で最近得られた。この抗原はＨＢＶ関 連核抗原（ＨＢＮＡ）と命名された。

ウエン（Ｗｅｎ）等、（１９８３）、インフェクション・アンド・イムノロジー （Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｔｍｍｕｎ、）　３９．１３６１−１３６７゜ＨＢＮＡは、 何人かのＨＢｓＡｇｌ性Ｈｃｔ４者由来の血清中に検出され、かつ、この抗原の 発現が、細胞培養物及び腫瘍組織の両方で示された。加えて、抗ＨＢ　Ｎ　Ａ抗 体は、ＨＣＣをもつ何人かのＨＢｓＡｇ陽性患者の血清中で発見されている。Ｈ ＢＮＡは、以前確認されなかったＩ（ＢＶ遺伝子の発現を示しているのかもしれ ない。

１９７９年、ガリバート（Ｇａｌ　１ｂｅｒｔ）等（ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒ ｅ）２８１．６４６−６５０）は、ウィルス独特の特性である一部二本鎖で一部 一本鎖の約３２００塩基の環状ＤＮＡである）（ＢＶゲノムのヌクレオチド配列 を報告した。このゲノムの長（Ｌ）鎖（完全に環状）は、ウィルスタンパク質を 説明するのに十分大きい、４種の読み枠を含んでいることが分った。これらの領 域をｓ、ｃ、ｐ及びＸと呼び、第１図に図で示した。

領域Ｓ及びＣは各々ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇの遺伝子を含むことが分った。領 域ＰはＤＮＡポリメラーゼと大きさ及びアミノ酸残基含量が同じタンパク質をコ ードしていると考えられるｍ　％Ｍ域Ｘは、ウェン（Ｈｅｎ）等により、ＨＢＮ Ａをコードする遺伝子の起源の１つであると推定された。

領域Ｐ及びＸ中の遺伝子の機能に対する草なる試験的割当は、ＨＢＶの遺伝的機 構と分子生物学を理解する上で依然として存在するギヤツブを示している。この ギヤツブの理由はこのウィルス増殖のためのインビトロシステムが無いというこ とである。

最近までＨＢＶの唯一の起源はヒトの患者の血清であった。細胞培養物中でのウ ィルス増殖の試みの失敗は非常に狭い宿主細胞範囲によるものであった。

ＨＢＶ　ＤＮＡ及びその遺伝子産物を生産する問題への１つのアプローチは、組 換えＤＮＡ技術を用いることである。この技術により特別なウィルスタンパク質 をコードする核酸配列を大規模に生産することが可能である。

チオレイス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）等（１９８１）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２１３．４０６−４１１）は、ＨＢｓＡｇをコードする遺伝子を含むｐＢＲ３２ ２による大腸菌のトランスホーメーションについて報告し、また、有意な量の単 離遺伝子の生産についても報告している。また、これらの研究者達は、ＨＢ　Ｖ ゲノム内のＨＢｓＡｇ遺伝子の位置及びタンパク質への発現に影響する因子の研 究を望んでいた。これを行うため、彼等は、バクテリアとホ乳細胞の両方で使用 できる、ＨＢｓＡｇ遺伝子を含む発現ベクターを構築した。

チオレイス（Ｔｉｏｌ　１ａｉｓ）等（上述）によって構築された発現ベクター の１つは、ＨＢｓＡｇ抗原決定基を含むタンパク質の生合成を大腸菌中で達成し た。それは、ＨＢｓＡｇのコード遺伝子を一バクテリオファージｐｌａｃ　５− １ｕｖ　５中に、天然のＨＢＶの読み枠を保存するように挿入することにより作 られた。

ホ乳細胞中でのＨＢＶ遺伝子発現を研究するため、チオレイス（Ｔｉｏｌ　Ｉａ ｉｓ）等（上述）は、全ＨＢＶゲノム内の種々の位置に、トランスフエフシラン 要素を挿入することにより一連のＨＢｓＡｇ発現プラスミドを構築した。このト ランスフェクション要素は、全ＨＢＶゲノムがそのベクターでトランスホームし たマウス細胞のゲノム中に、種々の配向で組込まれることを可能にする。この方 法でベクターを作るに当り、これらの研究者は、ＨＢＶの天然の遺伝子コントロ ール要素を用いるよう計画した。

チオレイス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）等によって報告された６個の発現ベクターのう ち、たった３個が目的とするＨＢｓＡｇタンパク質を発現した。その生産は、ヒ ツジの抗ＨＢｓＡｇ抗血清を用いた、組織培養液のテストにより、検出した。こ の研究の時に知られていた、その他のウィルスマーカー（すなわち、ＨＢｃＡｇ 　、ＨＢｅＡｇ及びＤＮＡポリメラーゼ）は、トランスホームした細胞中には検 出されなかった。

上述のチオレイス（Ｔｉｏｌ　１ａｉｓ）等の研究の時には、領域Ｘの存在は、 それがＨＢＶタンパク譬をコードする可能性と考えられた。

すなわち、ＨＢＶゲノムは、従来ウィルスと関連づけられていたものよりも多い タンパク質をコードする容量を含んでいることが知られていた。

この問題は、発現型の探索における遺伝子型と呼ばれている。

なかんずく、ウェン（Ｍｅｎ）等（上述）が領域ＸがＨＢＮＡをコードする遺伝 子を含むものと推定したのがこの問題なのである。

上述のチオレイス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）等及びウェン（Ｈｅｎ）等の研究以前に 、スフリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）等（（１９８０）ネイチ＋　−（Ｎａ　ｔｕ ｒｅ）　。

２８７．８０１−８０５）は、なかんずく、この問題を解く一般技術について示 していた。彼等は、そのタンパク質産物が未知であるウィルス遺伝子のヌクレオ チド配列から予想されるタンパク質の一部のポリペプチドを化学合成した。その ポリペプチドに対する抗体を作り、ウィルスに感染した細胞によって作られる全 てのタンパク質と反応させた。予想されたタンパク質の一部に抗体を用いること により、スフリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）等は、以前は未知でかつ未確認のウィ ルスタンパク質産物を検出した。

今日まで、ＨＢＶゲノムの領域Ｘのタンパク質産物を明白に同定するための、こ の技術又はその他の技術の使用は報告されていない。これは、合成抗原を調製し 、それらを、予め分っている特異性をもつ抗体を誘導するのに用いるという一般 概念が説明されている一方、予測可能性を拒みつづける広範囲なこの技術が存在 することによるものかもしれない。

このことの理由にはいくつかある。第１に、遺伝子配列から引き出されるタンパ ク質のアミノ酸残基配列は、そのヌクレオチド配列の読み枠が明白になっていな いと遺伝コードの縮退により仮定性を含むものである。

第２に、合成抗原はその本来の環境下でその本来のタンパク質と免疫反応を起こ す抗体を必ずしも誘導しない。第３に、ある抗原に対する宿主本来の抗体は、免 疫原のアミノ酸配列の短い線状領域に対応するポリペプチドとほとんど免疫反応 を起こさない。

（本発明の概要） 本発明はいくつかの点について考案している。１つは、ＨＢｘＡｇをコードする 遺伝子に結合した発現ベクターを含む組換えＤＮＡである。特に好ましい組換え ＤＮＡにおいては、そのＤ　Ｎ　Ａ発現ベクターは、第２図に従がい、塩基位置 ２４６８番のＨａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位から右回りに、塩基位置７ ６７番のＨａｅｍエンドヌクレアーゼ制限部位までのシミアンウィルス４０のウ ィルスＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡ配列を含み、またＨＢｘＡｇをコードする 遺伝子は、第１図に従がい、塩基位置１４３７番のＨａｅｍエンドヌクレアーゼ 制限部位から右回りに、塩基位置２８番のＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部 位までのへバチチスＢウィルスＤＮＡ配列を含む第２の遺伝子ＤＮＡ配列から提 供される。

第１及び第２のＤＮＡ配列は機能的に結合されて、ＨＢｘＡｇの発現を可能にす る。

本発明のもう一点は、ＨＢｘＡｇ又は、ＨＢｘＡｇの実質的領域を構成するポリ ペプチドをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡによって構成されている。特に 好ましい組換えＤＮＡは、）ＩＢｘＡｇをコードする遺伝子を含んでおり、かつ 、第１図中に示されている、塩基位置１４３７番から右回りに２８番までをカバ ーする塩基配列又はその実質的領域を育している。

ＨＢｘＡｇ又は、その実質的領域をコードする遺伝子を含む、少なくとも１つの ＆１１換えＤＮＡをコードするプラスミドが本発明のもう１点を構成している。

このプラスミドは、第１図中の、塩基位置１４３７番から右回りに、２８番まで をカバーする塩基配列又はその実質的領域を含んでいる。特に好ましい態様にお いては、このプラスミドは第２閾に従かい塩基位置２４６８番ＯＢａｍ）ＩＩエ ンドヌクレアーゼ制限部位から右回りに塩基位置１７１７番のＥｃｏＲＩエンド ヌクレアーゼ制限部位までのシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）ウィルスＤＮ Ａ配列を含む第１の配列、第３図に従がい、塩基位置３７５番のＢａｍＨＩエン ドヌクレアーゼ部位から右回りに、塩基位置ゼロ番のＥｃｏＲＴエンドヌクレア ーゼ制限部位までの、プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列を含む第２の配列及び 第３図に従がい、塩基位置１４００番のＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位 から右回りに、塩基位置２８番のＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位までの へバチチスＢウィルスＤＮＡ配列を含む第３の配列を含んでいる。このプラスミ ドにおいて、第１及び第２のＤＮＡ配列はそれらの各々のＥｃｏＲＩエンドヌク レアーゼ制限部位で機能的に結合しており、第２及び第３のＤＮＡ配列は、それ らの各々のＢａ＋ｎＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位で、機能的に結合している （第４図参照）。

ＨＢｘＡｇ又は、ＨＢｘＡｇの実質的なポリペプチド部分の生成法が本発明の１ 面を構成している。この発明では、本発明の発現システムを含む宿主を、ＨＢｘ Ａｇ又は、その実質的ポリペプチド部分が生産され、宿主又は培地中に蓄積され るまで培養培地中で生育させる。それから蓄積したＨＢｘＡｇ又はその実質的ポ リペプチド部分を回収する。

本発明のもう１つの点に、抗原性合成ポリペプチドの考案がある。この合成ポリ ペプチドは、約６個から約４０個のアミノ酸残基を含み、かつその配列は、ＨＢ ｘＡｇの抗原決定基の配列に従っている。特に好ましいポリペプチドは、左から 右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向を示して書かれた式で示されるポリ ペプチド配列の群から選ばれたアミノ酸残基配列を含んでいる。

（ｉ　）　Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ −Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ； （ｉｉ　）　Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−τｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ； （ｉｉｉ）　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ；（ｉｖ）　Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａ ｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖ ａｌ−Ｇ］ｙＨ （ｖ）　５ｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−旧５−Ｇｌｙ−Ａ ｌａ−旧ｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−シａ ｌ−Ｃｙｓ；及び（ｖｉ）　Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ −Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ −Ｉｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　ｅ酸化されたシスティン 残基により共に結合した合成ポリペプチド反復ユニットを多く含む水溶性又は水 分散性の抗原性ポリマーもここで考案されている。この反復ユニットは、アミノ 及びカルボキシ末端の両方にシスティン残基を含みもしくは、１つの末端に１つ のシスティン残基かつ、ポリペプチド鎖内に１つのシスティン残基を含む、先に 議論したポリペプチドを含んでも）る、特Ｇこ好ましい、アミノ及びカルボキシ 末端システィン残基を含むボ１ノペプチド反復ユニットは左から右に、アミノ末 端からカルボキシ末端の方向で書かれた式で示される。

Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ −Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ’Ａｓｐ−ＣｙｓＨ Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ −Ｇ　１　ｙ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ −Ｃｙｓ； Ｒ’　−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｒ”　；Ｒ’　−Ｇ　１ｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− Ｐｒｏ−Ａ　１　ａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａ ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｒ”； Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｖａ　］　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈ１ｓ−Ｇ ｌ　ｙ−Ａ　１ａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−シａｌ−Ｃｙｓ；及びＣｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−丁ｈｒ−Ｔｈｒ−ν ａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−）Ｉｉｓ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ− Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ。

（式中、Ｒ１及びＲ″のうちの１つが存在するという条件付きで、Ｒ１及びＲ２ の各々はシスティン残基である）からなる群から選ばれるものである。

先に記述した抗原性ポリペプチドの１つと免疫反応することができる抗体のよう な抗体結合部位を含む受容体分子もここで考案されている。これら受容体分子が 免疫反応を起こす特に好ましいポリペプチドは先に記述したポリペプチドで示し たものである。

またこれらの受容体分子もＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分と免疫反 応を起こす。

検定する身体試料巾検出可能な量のＨＢｘＡｇの存在を測定するための診断検定 システムも考案した。このシステムは上述の受容体分子を含む試薬を含有する少 なくとも１つの容器を含んでいる。さらにこのシステムは、レセプター分子免疫 反応する抗原性合成ポリペプチドである第２の試薬を第２の容器中に含んでいる 。

受容体分子及びＨＢｘＡｇの間の免疫反応を知らせる手段がこの診断検定システ ムの一部を構成している。

身体試料中の検定量のＨＢｘＡｇの存在を検定する方法が本発明のもう１つの面 を構成している。ここでは、検出量のＨＢｘＡｇの存在を検定する身体試料に由 来するタンパク質を受容体及びＨＢｘＡｇ間の免疫反応を知らせる指示手段存在 下、上述の受容体分子と混合する。この混合物をその指示手段が発生した免疫反 応を知らせるのに十分な時間維持する。それからこのシグナルの存在を確認する 。

（図面の簡単な説明） 本発明の公開の一部をなす図には、次のようなものがある。

第１図は、オノ（Ｏｎｏ）等（（１９８３）ヌクレイツク・アシフズ・リサーチ （Ｎ、Ａ、Ｒ）１上、１７４７−１７５７）が修正した、チオレイス（Ｔｉｏｌ ｌａｉｓ）等（（１９８１）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１上盈、４０６ −４１１）に由来するＨＢＶ／ａｄ−ゲノムの物理的構造及び遺伝的機構を示す 図である。長（Ｌ）鎖の５′端は、短（Ｓ）鎖の５゛端と塩基対を作っているこ とが報告されている。

円弧に結合している矢印で示される制限部位及び制限エンドヌクレアーゼに対す る略号は、オノ（Ｏｎｅ）等（上述）によって解析された）ｉ１３Ｖ／ａｄ−ゲ ノムの物理地図に対応している。ゲノムの回りにある広い矢印は、Ｌ鎖の４つの 大きいオープン領域に対応している。これら４つの潜在的コード領域をｓ、　ｐ 、　ｘ及びＣと命名した。４つの各領域の後にあるカッコの中のアミノ酸残基の 数（ａａ）は、各領域によってコードされる仮想のポリペプチドの長さに対応し ている。定義した遺伝子Ｓ及びＣに対応する２つの領域は広い矢印中の点領域で 示されている。単一のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ切断部位を地図の開始点と して使用した。

第２図は、パン・ヒユーバースウィン（Ｖａｎ　’Ａｅｕｖｅｒｓトｙｎ）及び フィアス（Ｆｉｅｒｓ）　（（１９７９）ヨーロピアン・ジャーナル・オン・エ ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２００．４９４−５０１）によって発表された一次配 列から作った５Ｖ４０ＤＮＡ制限地図を図式的に示している。

第３図は、スフリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）　（（１９７９）　、コールド・ス プリング・ハーバ−・シンポジウム・オン・クオンテタチプ・バイオロジー、且 、７７）の−次配列データから作ったプラスミドｐＢＲ３２２制限地図を図式的 に示したものである。

第４図は以後示す材料と方法で説明される、ＡＭ６　（波線）、ｐＢＲ３２２（ 黒線）及びＳＶ４０　（点線）から作った本発明のベクター中にＤＮＡ断片を挿 入し、クローニングベクターＳＶＡＭ１９１、さらにＨＢｘＡｇの実質的部分を 発現する発現ベクター５ＶＨＢ−３を作るのに用いる方法を図式的に示している 。

Ｂａ■Ｈ１，ＥｃｏＲｌ及びＨａｅＩｌの制限エンドヌクレアーゼ部位の相対的 位置を各々黒丸、白丸及び黒三角で示しである。ＳＶ４０ゲノムのオリジン（ｏ ｒｉ）及び初期及び後期プロモーターも示した。

第５図は、ＳＶ４０後期プロモーター、アミノ末端の９９個のアミノ酸残基（９ ９ａａ）、及び１３２個のカルボキシ末端アミノ酸残基をコードするＨＢｘＡｇ 遺伝子配列の実質的ポリペプチド部分（１３２ａａ；１５４個のアミノ酸残基中 の１３２個）を含むＳ　Ｖ　ＨＢ　Ｖ　−３組換え発現ベクターの線状領域を示 している。また、ベクターによって発現されるＶ　Ｐ　２　ＨＢｘＡｇ融合タン パク質のｍＲＮＡも示しである。

第６図は、ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子の、左から右ヘアミノ末端からカルボ キシル末端の方向で示されている翻訳されたアミノ酸残基配列を示している。５ ＶＢＨＶ−３により発現すれるＨＢｘＡｇの実質的部分を、発現したＨＢｘＡｇ ポリペプチドのアミノ末端残基である、アミノ酸残基部位２３番（Ａｌａ）のと ころの矢印で示しである。ＨＢｘＡｇ配列中の本発明の合成ポリペプチドの８． ４２．７９．９９．１００及び１４２番の相対的部位は、３つの標識をつけた下 線のアミノ酸残基配列で示しである。それゆえ、合成ポリペプチド９９のアミノ 酸残基配列は図で示されているアミノ末端の？ｌｅｔ残基から数えて、１００か ら１１５番に対応し、合成ポリペプチド１００の配列は図のアミノ末端Ｍｅｔ残 基から数えて、１１５〜１３１番に対応し、合成ポリペプチド１４２の配列は、 閏のアミノ末端Ｍｅｔ残基がら数えて、１４４〜１５４番すなわち１１個のカル ボキシル末端残基の配列に対応している。

第７図は、抗Ｘ抗血清と２つの肝臓がん腫細胞溶解物との反応を示すオートラジ オグラムの写真である。２つのヒトの肝臓がん腫細胞細胞系列、ＰＬＣ／ＰＲＦ １５及びＨｅｐＧ２を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベコ修正イーグル培地（ ＤＭＥＭ）中で生゛育させ半集密的とする（集密培養物の１：５分離の６日目） 、上滑を除き、単層を含むフラスコを、スクレイビングによる細胞収穫前５分間 、氷上に置き、収穫細胞を遠心によりペレット化した。

この細胞ペレットをリン酸緩衝液ＣＰ　Ｂ　Ｓ）で洗浄し、−７０℃４で急速冷 凍してから一晩かけて凍結乾燥した。出来た細胞粉末をＰＢＳにン容かし、サン プルパンファーで最ｎｔＲ度ミリリフドル当り２ミリグラム（２ｍｇ／ｍ１）と した。このサンプルを５分間煮沸し、細胞片を３０分のベックマン・ミクロフユ ージ中での遠心で除いた。細胞溶解物の５０マイクログラムをＲＩＰＡバッファ 〔１％にプツトＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル ）、０．０５％デオキシコリン酸ナトリウム及び０．１％５ＤＳ）中１５分間イ ンキュベートし、ついで、マコナヒ−（ＭｃＣｏｎａｈｅｙ）等１１９６６）イ ンターナショナル・アーチブス・オブ・アレルギー（Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａ Ｉｌｅｒｇｙ）　２９．１８５−１８９）のクロラミンＴ反応により、３マイク ロキユーリーの＋ｚｓｌを用いて放射性ラベルした。各々の放射性ラベルした肝 臓がん腫細胞溶解物、分当り！、５Ｘ１０’カウント量をＲＩＰＡ中、抗Ｘポリ ペプチドと６０分間反応させた。抗原−抗体複合体（免疫反応産物）を、ホルマ リン固定スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａ ｕｒｅｕｓ）で沈殿化した。このペレットをＩ’１ｌＰＡで１度洗浄し、５００ ミリモル濃度（ｍ　Ｍ　）のＬｉＣＪ、１００＋ｎＭトリス（ｐＨ８，５＞で２ 度洗浄し、その放射活性を測定した。全てのペレットを４０マイクロリツトルの サンプルバッファ（０，０６２５Ｍトリス・塩酸（ｐＨ６，８）　、２％ＳＤＳ 、１０％グリセリン、５％２−メルカプトエタノール及び０．００１％ブロモフ ェノールブルー）に溶かして、３分間煮沸し、遠心して細胞片を除いてから、つ づいて、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。

放射性ラベルした細胞溶解物を、変性ラウリル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア ミドゲル（１２，５％）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に乗せ、レムリ（Ｌａｅｍｍｉ） 　（（１９７０）ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２９７．６８０−６８５）に 従って電気泳動した。このタンパク質をトービン（丁ｏｗｂｉｎ）等１１９７９ ）、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７エ、４３５０−４３ ５４）に報告されているように、電気泳動的にニトロセルロースシートに移した 。このニトロセルロースプロットをアミド・ブランクで染色した後、ＢＬＯＴＴ Ｏ中４℃、−晩インキユベートし〔ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）　）等、（１ ９８３）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅｘｐ 、　Ｍｅｄ、上５９．１７５１−１７５６）非特異的結合を減少させた。このニ トロセルロース片を最終容積１０ｍ１のＢＬＯＴＴＯ中、抗ポリペプチド抗体の ３５０分の１希釈物とともに、室温で３時間インキュベートした。さらにこの紙 片をＢＬＯＴＴＯ中で洗浄した後、ＩｆＳｌラベルしたＳ、オーレウス（ａｕｒ ｅｕｓ）プロティンＡ　（１０’　ｃｐｓ／］　０ｍ１）と１時間インキュベー ションした。ポリペプチドとの競合が下に示されているところで、抗ポリペプチ ド抗血清を１００マイクログラムのポリペプチドと６０分間インキュベートし、 その後、放射性ラベルした抗原を添加した。この紙片を上述のように洗浄し、水 で洗い、乾燥後オートラジオグラフをとった。レーン１及び５は、抗ポリペプチ ド９９抗体（抗９９）と反応させ、レーン２はポリペプチド９９とブレインキュ ベーションした抗９９と反応させ、レーン３は、無関係のポリペプチドでブレイ ンキュベーションした抗９９と反応させ、及びレーン４は免疫前の血清コントロ ールと反応させた。）（ｅｐＧ２細胞系列（レーン１−４）由来の溶解物は、抗 ポリペプチド９９とは反応しなかった。左側の数字は、相対的タンパク質移動位 置を示している。右欄の矢印は、２８０００及び４５０００ダルトンの分子量を 有するタンパク質の移動位置を示している。

第８図は、チンパンジー（Ｃ：レーン３及び４）及びヒ）（Ｈ：レーン１及び２ ）の肝臓組織と抗Ｘ抗血清との反応性を示す写真である。チノパンツー及びヒト の肝臓片を液体窒素中で急速冷凍し、乳鉢と乳棒を使って細かい粉になるまです りつぶした。この細胞粉をサンプルバッファに溶かし、第７図で説明したように 電気泳動後プロッティングを行った。＋１１全てのインキュベーション及び洗浄 でＢＬＯＴＴＯの代りに１％ウシ血清アルブミンを用いること、及び（２）抗原 結合抗体をホースラディツシュパーオキシデースを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ で検出すること以外は、第７図で説明したものと同様にニトロセルロース片を、 抗血清の５０分１希釈物で展開した。抗原−抗体免疫反応産物はこの紙片を次に 示す展開溶液中に浸すことによって可視化した。展開溶液は３７℃で５０−１の ＴＢＳバッファに、８蒙ｇの４−クロロ−１＝ナフトール及び３０％過酸化水素 水３３０μｌを含むエタノール５０−１を加えて調製する。ポリペプチド９９に 対する抗血清（抗９９）を、２つの左側パネルムこ示す、ブロック又は非ブロツ ク条件で用い、一方、ポリペプチド１４２に対する抗血清（抗１４２）を２つの 右側パネルで示すブロック又は非ブロツク条件で用いた０図の左側の数字は、各 々６６．４５．３１．２１及び１４キロダルトンの分子量を有するタンパク質に 対するゲル移動位置を示している。　゛ 第９図は、結合プローブとしてヘパチチスＢウィルス（ＨＢ　Ｖ）ＤＮＡを用い た、Ｘタンパク質を示す肝臓組織に由来するヒト及びチンパンジーの制限酵素切 断肝［ＤＮＡのサウザンブロンド分析の写真である。全ＤＮＡを、第８図で説明 したサンプルから作った細胞粉末から抽出した。このＤＮＡｌ０マイクログラム を１％アガロースゲルの各ウェルに乗せた。制限酵素消化バッファは、業者の指 示に従った（Ｂ　ＲＬ）。消化は全て、５ｏユニ７）の酵素（マイクログラムで ５倍のＤＮＡｆｉ度）を用い３７℃、−晩で行った。レーン１〜３は、各々Ｂａ ｍＨＩ　、　ＥｃｏＲｌ消化又は未消化のｃｈｉｍｐ　Ａ　２４３肝１ｉｔｉＤ ＮＡを示し、レーン４〜６は各々ＢａｍＨＩ　、　ＥｃｏＲｌ消化又は未消化の ｃｈｉｍｐ　３４４肝臓ＤＮＡを示し、レーン７〜１０は、各々、ＨｉｎｄＩ［ ｌ、ＢａｍＨＩ　、、ＥｃｏＲ１消化又は未消化のヒ）ＨＢｃＡｇＰ％性肝臓Ｄ ＮＡを示し、レーン１１〜１４は各々、Ｈ４ｎ６ｍ、、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲｌ 消化又は未消化のヒ）ＨＢｓＡｇ陰性肝ＨＤＮＡを示している。

第１０図は抗Ｘポリペプチド抗血清とＸ依命遺伝子産物との反応を示すオートラ ジオグラムの写真である。Ｂ５Ｃ−１細胞（２×１０？個）の集密化単層を、組 換え５ＶＨＢＶ−３ストツクウイルス（ｔｓＡ２ｓ＊及び５ＶＨＢＶ−３ピリオ ンの混合物）又は、野生型ＳＶ４０　（モリアティ−（Ｍｏｒｉａｒｔｙ）等、 （１９８１）、プロシーディング・イン・ナショナルアカデミ−・オブ・サイエ ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ　、ユ盈 、２６０６−２６１０）で怒染させた。この培養物をおよそ５０％が細胞変性す る４８〜７２時間、無血清培地中４０℃でインキュベーションした。上清を除き 、その単層を含むフラスコを氷上に５分間放置した後、スクレイビングで細胞を 集めた。収穫した細胞を遠心し、生成したペレットをＰＢＳで洗浄した後−７０ ’ｃで急速冷凍してから一晩かけて凍結乾燥した。生成した細胞粉末をＰＢＳに 熔がし、す、ンブルバンファで最終濃度２ｍｇ／ｍ１とした。このサンプルを５ 分間煮沸し、その細胞片は、ベンクマンミクロフユージを用いた３０分間の遠心 で除いた。５０から１００マイクログラムの細胞溶解物を変性ポリアクリルアミ ドゲル（１２，５％）に乗せ、先に述べたように電気泳動した。タンパク質を先 に示したように、電気泳動的にニトロセルロースシートに移した。ニトロセルロ ースプロットをアミドブラック中で染色してから、非特異的結合を減らすために 、ＢＬＯＴＴＯ中、４℃で一晩インキユベーションしり、最終容積１０ｍＡのＢ ＬＯＴＴＯ中、このニトロセルロース片を室温で３時間、抗ペプチド抗体の３５ ０分の１希釈物とインキュベーションした。この紙片をＢＬＯＴＴＯで洗浄した 後、＋０７ラベルしたＳ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡ（１０ｍＡ 当り１０　’　ｃｐｍ）と１時間インキュベーションした。この紙片を上述、の ように洗浄し、水での洗浄、乾燥の後、オートラジオグラフをとった。ポリペプ チドでのブロッキングを行った場合、この抗血清を４℃で一晩、又は３７℃で２ 時間、１００マイクログラムのポリペプチド溶液とブレインキュベーションした 後、ニトロセルロース片とインキュベーションした。分子量は、低分子量標準物 質（バイオラド）に基づくものであり、図の左欄に示した。レーン１及び３を各 々、抗ポリペプチド９９及び抗ポリペプチド１４２と反応させた。レーン２及び ４は、各々ポリペプチド９９又はポリペプチド１４２とブレインキュベーション した同抗体と反応させた。レーン５及び６は、各々抗ポリペプチド９９及び１４ ２抗体とコントロール細胞溶解物との反応を示している。

本発明はいくつかの利点を有している。これらの利点の１つには、まず第１に、 いかなる細胞中のＨＢｘＡｇの存在も検出できるということである。

別の利点は、本発明が慢性のへパチチスＢ感染宿主動物中の）ＩＢｘＡｇの存在 を検出する検定法及びシステムを提供することである。

また別の利点は、本発明を使用すると、ヒトの肝臓がん腫細胞から誘導される細 胞中のＨＢｘＡｇを検出することができ、これによりヘパチチスＢウィルスとこ の種のがんの間の推定されている関係を強調できるということである。

本発明の長所の１つには、これがＨＢｘＡｇをコードする遺伝子をクローニング する手段を提供することがある。

本発明の別の長所には、それがヒトの血清中に存在するＨＢｘＡｇに対する抗体 （抗Ｘ抗体）存在の診断的検定法において、抗原として用いることができるＨＢ ｘＡｇの実質的ポリペプチド部分を発現する手段を提供することがある。

また本発明の別の長所には、ＨＢｘＡｇの抗原決定基をもつポリペプチドと同様 にＨＢｘＡｇと免疫反応する抗体を作るのに用いることができるＨＢｘＡｇの抗 原決定基の配列に対応するアミノ酸残基配列の合成ポリペプチドの調製がある。

なお、その他の本発明の利点及び長所は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から 、当業者には明白なものであろう。

（発明の詳細な説明） （定義） トランスフェクションとは、真核細胞における、付加したＤＮＡの組込みによる 新しい遺伝子マーカーの取得である。

トランスホーメーションとは原核細胞における、付加したＤＮＡの組込みによる 新しい遺伝子マーカーの取得である。

クローニングベクターとは、クローニングすべき外来ＤＮＡを挿入するプラスミ ド又はウィルスである。

プラスミドとは、自己複製する染色体外環状ＤＮＡである。

読み枠とは、タンパク質に（潜在的に）翻訳可能なりＮＡ配列である。

ヘルパーウィルスとは、混合感染の際、感染サイクルを欠損ウィルスに完了させ ることを可能すべく、欠損ウィルスにない機能を提供するウィルスである。

遺伝子（シストロン）とは、ポリペプチド鎖の生産に関係するＤＮＡ断片である 。それは、個々のコード断片（エクソン）の間の介在配列（イントロン）と同様 、コード領域の前後の領域〔リーダー及びトレーラ−（ｔｒａｉｌｅｒ）　）を 含んでいる。

発現とは、構造遺伝子によって行なわれるポリペプチドの生産過程である。それ は転写と翻訳の組合せである。

クローンとは、単一の大兄の細胞又は分子から発した多数の同一の細胞又は分子 を示している。

塩基対（ｂｐ）とは、ＤＮＡ二本鎖へリノクス中の、アデニン（Ａ）とチミン（ Ｔ）、もしくはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の組合せのことである。

発現ベクターとは、外来ＤＮＡを挿入し、もしくは発現するプラスミド又はウィ ルスのことである。

下流とは発現の方向にさらに進んだ配列を示している。例えばある遺伝子のポリ ペプチドコード領域は開始コドンの下流にある。

Ａ、一般的討論 ヘパチチスＢウィルスＨＢＶゲノムの領ｙｉＸは、最近、その発現可能性が示さ れたこと及び伝統的ＨＢＶ血清学はそのタンパク質産物又はそのような産物に対 する抗体を見いだせなかったことからとりわけ興味深い、ここでは、最近開発さ れた組換えＤＮＡ及び合成ポリペプチド技術を用いて、ＨＢｘＡｇの発現に関し て従来の方法が出くわしたいくつかの失敗に打ち勝ち、かつヒトの肝臓がん腫細 胞系列由来の細胞及び慢性ＨＢＶ感染症のチノパンツー及びヒト由来の肝細胞に おけるＨＢｘＡｇの発現を示した。

最後に、本発明は、ＨＢｘＡｇの存在を示す検定法のみならず、ＨＢｘＡｇの抗 原決定基及びＨＢｘＡｇと同様にポリペプチドに結合する、合成ポリペプチドに よって生ずる抗体又はその実質的部分に相当する合成ポリペプチドに対するクロ ーニング及び発現ベクターを考案している。

ここで議ｉＡされるクローニングベクターはとりわけ、ＨＢｘＡｇ含有遺伝子を 有用な量合成するのに用いられる。一方その遺伝子は、とりわけへパチチスＢ病 それ自身を研究するのに使える大量のＨＢｘＡｇ及びそのポリペプチド断片を合 成するのに用いられる。

本発明の新しい合成ポリペプチドは、合成ポリペプチド自身と免疫反応するばか りでなく、ＨＢｘＡｇ及びその実質的ポリペプチド部分と免疫反応する抗体を合 成する上での抗原にとりわけを効である。そのようにして作られた抗体は、感染 した動物宿主の細胞又は組織培養物中のＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド 部分の存在を検定するのに利用される。

この発現ベクターは細胞をトランスフェクトし、かっＨＢｘＡｇの実質的部分を 含むポリペプチドの発現を誘導するのに用いることができる。さらにこの発現し たポリペプチドは、身体サンプル中のＨＢｘＡｇに対する抗体の存在を検出する 検定法における抗原として利用することができる。

本発明の発現ベクター及び抗体も、発現ベクターを含み、がっ、さらに比較的そ の存在を確認するのが難しい付加的に連結されている遺伝子を含むトランスフェ クトされた細胞のマ　カーとしても使用される。つまり、後に述べるように５Ｖ ＨＢＶ−３と命名した発現ベクターを開いて、比較的検定が困難なタンパク質を コードするその他の外来遺伝子に連結する。再環状化の後、このようにして作っ た新しいベクターで適当な細胞を怒染し、華−細胞からのコロニーとなるように ブレーティングし、新しいベクターを組込んだ細胞を、本発明の抗体を用い、外 来遺伝子によってコードされるタンパク質に融合した）］ＢｘＡｇのベクターコ ード部分の発現により同定する。このようなマーカーはそのベクターが真核細胞 中で発現することが望ましい場合、すなわち、ｐＢＲ３２２のように、バクテリ ア細胞ベクター中に存在する薬剤耐性マーカーが存在しない場合には特に有用で ある。

１、クローニングベクター ＨＢｘＡｇ遺伝子を含む、本発明の組換えＤＮＡを例えばＨＢＶＤＮＡの一部を クローニングすることにより作ることができる。

ＨＢＶゲノム物質を入手するため、一本鎖部分を含むディン粒子ＤＮＡをそのウ ィルス内因性ＤＮＡポリメラーゼを用いて完全な二本鎖に変換する。

このようにして得た環状二本鎖ＨＢＶは２個のＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制 限部位を含んでいる。一般的に、ＢａｍＨＩでの切断は、大きさで分類できる３ 個線状産物ができる。もっとも大きいものは、１つのＢａｍ８１部位の切断でで きる全ＨＢＶゲノムを示す３２００塩基対（ｂ　ｐ）断片である。ＨＢＶが両方 のＢａｍＨｉ部位で切断したときは、１８５０ｂｐ及び１３５０ｂｐを含む断片 が生ずる。

ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）等１１９７９）、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）、２ ８１．６４６−６５０）（７）ＨＢＶｔりｌｚオチド配列の分析で、１８５０ｂ ｐのＨＢＶＢａｍＨＩ断片は、ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子を含むことが明ら かになった。しかし、三つの全ての断片はＢａｍＨＩの相補的末端を有しており 、それゆえ、クローニングプラスミドのＢａｍＨ１部位に挿入することができる 。

プラスミドｐＢＲ３２２は、第３ドに示されているようにテトラサイクリン耐性 遺伝子内に存在する単一のＢａｍＨ］制限部位を有している。ＢａｍＨＩによる ｐＢＲ３２２の切断で各３個のＢａ１ＨＩ　ＨＢＶＤＮＡ断片と相補的末端をも つ単一の線状断片が生ずる。

プラスミドを再生し環状化する、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたｐＢＲ３２２のＢ ａｍＨ１部位での各３個のＢａｍＨＩ　ＨＢ　ＶＤＮＡ断片のライゲーションで ３個の独特の組換えプラスミドＤＮＡができる。この組換えクローニング・プラ スミドは環状ＤＮＡであり、次のように命名した。ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部 位に挿入された１３５０ｂｐのＢａｍＨＩ　ＨＢＶＤＮＡ断片をもつｐＢＲ３２ ２を含むものをＡＭ７、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位に挿入した全ＨＢＶ遺伝 子をもつｐＢＲ３２２を含むものをＡＭ６、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位に挿 入した１８５０ｂｐのＢａ＋ｅＨＩＨＢＶＤＮＡをもつｐＢＲ３２２を含むもの をＡＭＩとした。

ＢａｍＨＩ　ＨＢＶＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてｐＢＲ３２２に ライゲーションしたとき、このようにして出来た組換えプラスミドはもはやテト ラサイクリン耐性をもたない。したがってアンピシリン耐性及びテトラサイクリ ン感受性のトランスホーマントが上述のライゲーション産物でトランスホームじ だ大腸菌株のコロニーから選択する。組換えプラスミドＡＭＩ、ＡＭ６及びＡ↑ −４７でトランスホームした大腸菌）ｉ８１０１の３つの薬剤選択株を各々ＥＣ ＡＭＩ、ＥＣＡＭ６及びＥＣＡＭ７と命名した。上述のプラスミドを、後に述べ るように、ＬＢ培地のような適当な培地中で、上述のトランスホーマントを生育 させることにより、比較的大量に調製した。

上述のプラスミドＡＭＩ及びＡＭ６から、全部又は一部のＨＢｘＡｇ遺伝子塩基 配列を含む遺伝子断片を適当な制＠酵素を用いて切断できる。例えば、プラスミ ドＡＭＩ及びＡＭ６を制限酵素ＢａｍＨＩで消化すると、ＨＢｘＡｇをコードす る遺伝子を含む１８５０ｂｐのＤＮＡ断片が反応産物から単離される。この組換 えプラスミドでトランスホームした大腸菌ＨＢＩＯＩ株ＥＣＡ？１６又はＥＣＡ ＭＩを生育させることにより、ＨＢｘＡｇをコードする、比較的大量のＤＮＡ配 列を得ることができる。

ＨＢｘＡｇのＤＮＡ塩基配列及びＨＢＶゲノム上の部位が分っていることから、 その中にイントロンが存在しないことは明白である。このことはバクテリア細胞 においてだけでなく動物細胞においてもメツセンジャーＲＮＡとして、発現型発 現へと進行していく様に転写されうろことを意味している。

２、発現ベクター 適当な発現システムをもつＨＢｘＡｇ遺伝子の動物細胞、例えば、アフリカミド リザル腎細胞へのガネム（Ｇａｎｅｓ）等の方法１１９７６）、ジャーナル・オ ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）上皇上、５７ −８３）による導入は上記細胞内でのＨＢｘＡｇの合成を可能にする。さらに、 このＨＢｘＡｇ遺伝子を含む適当な発現ベクターをもつサル腎細胞の培養は）Ｉ ＢｘＡｇの安価な生産を可能にする。

都合がよいことに、ＨＢｘＡｇ遺伝子を発現できる組換えＤＮＡはその読み枠を シフトせずに、完全なＨＢｘＡｇ遺伝子又はその断片を、ＳＶ４０の後期プロモ ーター領域の下流の位置でシミアン・ウィルス４０　（ＳＶ４０）に挿入するこ とにより構築される。

ＳＶ４０後期プロモーターを用いた発現のためのベクターは次のような方法によ って大量に作られた。

５Ｖ４０ＤＮＡ及びｐＢＲ３２２ＤＮＡをＢａｍＨｌ及びＥｃｏＲＩの二重制限 酵素消化にかけた。大きい方のＳＶ４０及びｐＢＲ３２２１！Ｉｒ片をＴ４ＤＮ Ａリガーゼを用いてライゲーションした。

このライゲーション産物をＢａ＋ｎＨ］消化して、ＢａｍＨｌの粘着末端をもつ 線状ＤＮＡとした。　コノＳＶ　４０／ｐ　ＢＲ３２２ＤＮＡと、１８５０ｂｐ のＢａｍＨｌ　ＨＢＶＤＮＡとのライゲーションでＳＶＡＭ１９１と命名する環 状組換えプラスミドができる。

この組換えＤＮＡ　ＳＶＡＭ１９１は、本来の大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子 を含んでいる。ＳＶＡＭＩ　９１でトランスホームした大腸菌１０１は、アンピ シリン耐性で、かつテトラサイクリン感受性であり、従がって、薬剤窓受性に基 づいて選択が可能である。ＳＶＡＭＩ　９１でトランスホームした大腸菌ＨＢＩ Ｏ１をＥＣＥＣ−３ＶＡ　９１と命名し、アンピシリンを含むＬＢ培地のような 適当な培地を用いて生育して、上記プラスミドを比較的大量に得ることができる 。

３、細胞の培養 このようにして得た組換えＤＮＡプラスミドＡＭＩ、ＡＭ６及びＳＶＡＭ１９１ による、宿主細胞のトランスホーメーションは従来法（コーエン（Ｃｏｈｅｎ） 等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、エエ、２１１０−２１ １４　（１９７２））又は、その修正法を用いて行った。宿主細胞には、とりわ け、大腸菌、枯草菌及びイーストのような微生物が含まれ、中でも２９４　（Ａ ＴＣＣ３１４４６）、Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７３２５）又はＲＲＩ（ＡＴＣ Ｃ３１４４７）と命名されている大腸菌株が好ましい。

大腸菌の）ＩＢＩＯＩ株は特に好ましい宿主細胞系列の１つである。

ＨＢｘＡｇ遺伝子を含む新しい組換えプラスミドをもつ細胞の単離は、例えば次 に示す技術を含む従来の方法によって行うことができる。

ポリメラーゼ反応を用い、その一本鎖部分を充填することにより放射性ラベルす る。ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　（１９７５）アメリカン・ジャーナル・ オプ・メディカル・サイエンス（Ａ棚、　Ｊ、　Ｍｅｄ。

Ｓｃｉ、）　２７０．１５１−’１５９．その後、プローブとしテラヘルした産 物を用い、陽性クローンを、従来のサウザンプロントハイブリダイゼーション法 （サウザン（１９７５）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ ８Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　９８．５０３）又は、従来のコロニーハイブリダイ ゼーション法（グルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）等（１９７５）プロシー ディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、ユ、３９６１−３９６５）を用い、 すでに得られている薬剤選択したトランスホーマントからピンクアンプした。こ のようにしてトランスホームし、かつ単離された宿主細胞を従来の培地で生育さ せた。この培地には、例えば、ＬＢ培地、ペンアセソイ培地、又は、グルコース 及びカザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）　、エクスペリメンツ ・イン・モレキュラー・ジェネテイクス（Ｅｘｐｅｒｉａｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、４３１−４３３（コールドスプリング ハーバ−ラボラトリ−、ニューヨーク、１９７２　）などがある。

培養は一般的に１５〜４３℃、好ましくは２８〜４０℃で、２〜２４時間、好ま しくは４〜１６時間、必要な場合は、通気そして、または攪拌を伴って行う。

培養後、バクテリア細胞を集菌し、バッファに懸濁してから、リゾチーム、凍結 −融解、又は超音波処理により溶菌した。ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子は、溶 菌後の遠心上清からＤＮＡを精製するのに一般的によく知られている方法を使っ て単離できる。

真核細胞中でＨＢｘＡｇを発現するためのベクターを作るため、全７のｐＢＲ３ ２２由来のＤＮＡを含む、ＳＶＡＭＩ　９１　ＤＮＡの一部を取り除いた。この ことは、ＳＶＡＭ１９１をＨａｅｌｌ制限酵素消化することにより行った。Ｈａ ｅｎ　Ｓ　ＶＡＭ　１９１消化産物の大きい方の断片を環状化すると、動物細胞 中でＨＢｘＡｇを発現できる、５ＶＨＢＶ−３と命名したベクターができる。

ホ乳類の宿主細胞を従来法により５ＶＨＢＶ−３でトランスフェクトすることに より、１つの発現システムができる。例えば、制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍ切断した場 合、Ｓ　Ｖ　ＨＢ　Ｖ　−３をＣＯ３−７細１８２；及びシジキ（Ｓｉｄｄｉｑ ｕｉ）　（１９８３）　、モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー（Ｍｏ１ ．　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、３．１４３〜１４６参照。また、 ５ＶＨＢＶ−３は、ポヒン・パピローマ・ウィルス中にも挿入可能で、これによ り、ネズミの細胞系列をトランスフェクトするのにも用いることができる。

さらに好ましイコとに、Ｓ　Ｖ　ＨＢ　ｖ−３は、３　Ｖ　４０　ｔｓＡ２ｆｆ ９ヘルパーウィルスとともに用いて、アフリカミドリザルＶ細胞系列Ｂ５Ｃ−１ （ＡＴＣＣＣＣＬ２６）をトランスフェクトすることができる。そうしてトラン スフェクトしたとき、Ｂ５Ｃ−１細胞は、ＨＢｘＡｇ抗原決定基を含むポリペプ チドを生産した。

そのクローニング又は発現ビヒクルの選択された制限部位のところで挿入した遺 伝子断片又はヌクレオチド配列は、目的とするタンパク質の実際の遺伝子の一部 ではないヌクレオチドを含むこともあるし、又は、その遺伝子の一断片しか含ま ないこともありうる。従って、遺伝子コードの縮退により、挿入遺伝子は、ここ で述べられているＨＢｘＡｇ遺伝子と必ずしも同一である必要はなく、ＨＢｘＡ ｇをコードしてさえいればよい。さらに、ＨＢｘＡｇをコードするＤＮＡ配列は 、その読み枠が変らないかぎり、ＨＢｘＡｇをコードする配列の３′端及び５′ 端の片方又は両方に、付加的塩基を含む場合もある。ＤＮＡ配列が挿入されてい るかどうかは別にして、本発明は、トランスホーム又はトランスフェクトした宿 主が、ＨＢｘＡｇをコードするＤＮＡタンパク質ＨＢｘＡｇ又は、ＨＢｘＡｇタ ンパク質の実質的部分を含むポリペプチドをそれぞれ生産することだけを要求し ている。

４、ポリペプチド、抗原及び抗体 後に述べるように、ＨＢｘＡｇの発現はそのアミノ酸残基配列が、）ｌＢｘＡｇ の抗原決定基のアミノ酸残基配列に対応している合成ポリペプチドによって誘導 される抗体を用いることにより検出できる。典型的に、本発明のポリペプチドは 約６個乃至約４０個のアミノ酸残基を含む、さらに、これらのポリペプチドが約 １０個乃至約２０個のアミノ酸残基を含むことが、より望ましい。

８．４２．７９．９９．１００及び１４２と命名された以下及び第６図に示しす 合成ポリペプチドのアミノ酸残基配列はガリバー　）　（Ｇａｌｉｂｏｒｔ）等 （上述）によって報告された］（Ｂ　Ｖのヌクレオチド配列から決定した。

ポリペプチド８　：　Ｇｌｎ−Ｌｅｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓ ｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇ１ｙ＋ポリ ペプチド４２　：　５ｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ＋ポリペプチド７９　：　Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ− Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−）１ｉｓ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ｌｙｓ−Ｖａ　１−　Ｌｅｕ−Ｆｌ　１ｓ−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅ ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ　。

ポリペプチド９９　：　Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔ ｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃ ｙｓ＋ポリペプチド１００　：　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔ ｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌ ｅｕ−Ｌｙｓ−νａｌ、ａｎｄポリペプチド１４２　：　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌ ａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａｌａ （ここで、各アミノ酸残基配列は左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端の 方向で示しである）。

アミノ酸配列において、ポリペプチド９９及び１００のカルボキシ末端及びアミ ノ末端のシスティン残基が無いこと以外、それぞれ、ポリペプチド９９及び１０ ０の配列に対応しているポリペプチドも有効なものであり、本発明の一部と考え られることに注意を要する。このようなポリペプチドは、それらのアミノ又はカ ルボキシ末端残基を介してキャリヤーに結合したとき免疫原として有用なもので あり、また、第７、第８、第１０図の一部で示し、かつ、後にも議論されるもの と同様に、免疫反応ブロンキング実験でも使用される。

ポリペプチド９９ｂ及び１００ｂのアミノ酸残基配列は、左から右に、アミノ末 端からカルボキシ末端の方向で示しである以下の式で示されている。

ポリペプチド９９　ｂ　：　Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｔｈｒ −Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ 。

ポリペプチド１００　ｂ　：　Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉ　ｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌ ｙｓ−Ｖａｌ。

ａ、）ランスフェクトした細胞におけるＸタンパク質結合体としてキーホール・ リンペット・ヘモシアニア　（ＫＬＨ）キャリヤーに結合させたポリペプチド９ ９．１００又は１４２で免疫化したウサギは、５ＶＨＢＶ−３でトランスフェク トしたＢＳＣ−１細胞中に発現するＨＢｘＡｇポリペプチドと免疫反応を起こす 抗体（抗９９、抗１００及び抗１４２）を生産し、これにより、まず、それら細 胞中におけるＨＢｘＡｇポリペプチドの発現を示すことができる。これらの抗ポ リペプチド抗体は、非トランスフェク）ＢＳＣ−１細胞、かなわち、野生型（ｗ ｔ）ＳＶ４０で惑染した細胞中に見られるポリペプチドとは免疫反応を起こさな かった。

さらに、ＨＢｘＡｇポリペプチドを発現する抗ポリペプチド抗体の免疫反応性は 、それらの相補的（対応する）ポリペプチド、すなわち、それらが生じるポリペ プチド免疫原と、その抗体とのブレインキュベーションにより、阻害又はブロッ クされる。このブロッキングは、この抗体がＨＢｘＡｇであると予想されるポリ ペプチドの抗原決定基を特異的に認識し、かつ、この合成ポリペプチドがアミノ 酸残基配列において、予想されるＨＢｘＡｇタンパク質の抗原決定基に対応して いることを示している。これらのブロッキングに関する結果は、ウェスタンプロ ット技術（技術と方法）とつづく、１２５７ラベル化スタフイロコツカス・オー レウム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡと結合し た抗体の位置決め及びその後の検定のオートラジオグラフ化により得られた。

ポリペプチド９９及び１４２に対する抗血清の結果を第１０図に示した。第１０ 図のレーン１は、抗９９と、Ｓ　Ｖ　ＨＢ　ｖ−３怒染細胞溶解物との免疫反応 を示し、一方、レーン２は、抗血清とポリペプチド９９とのブレインキュベーシ ョンによる、この免疫反応のブロッキングを示している。同様に、レーン３では 、細胞熔解タンパク質と免疫反応させた抗１４２、及びレーン４は、その抗血清 のポリペプチド１４２とのプレインキュベージ；ンによる免疫反応のブロッキン グを示してシ）る、レーン５及び６は、免疫反応がコントロール細胞溶解物では ブロックされなかったことを示している。

第１０図で示されているように、ポリペプチド９９及び１４２に対する抗血清で 特異的に同定される、５ＶＨＢＶ−３でトランスフェクトした細胞からのポリペ プチド発現産物は、約２４０００ダルトン分子量を有している。以下で議論され ているように、約２８０００ダルトンの分子量を有するポリペプチドは、ヒトの 肝臓がん腫由来の細胞系列ＰＬＣ／ＰＲＦ１５に由来する溶解物中に同定されて いる。この２つの細胞系列によって発現されるポリペプチド（タンパク質）の分 子量の差は、発現されるポリペプチドがＸタンパク質と、その他のポリペプチド 又はタンパク質との融合物に由来するという事実に基づくものである。

従って、すでに述べたように、５ＶＨＢＶ−３は、完全なＸコードゲノムの一部 を欠いている。第６図は、５ＶＢＨＶ−３に含まれるＸ遺伝子領域はメチオニン 開始コドンＡＴＧを含む推定上のＸタンパク質の最初の２２個のアミノ酸残基を 欠いている。

それゆえ、５ＶＨＢＶ−３でトランスフェクトした細胞によって発現されるポリ ペプチドは、ベクター中に存在するＳＶ４０の構造タンパク質ｖｐ２の配列との 融合産物であろうと予想される。この融合タンパク質（ポリペプチド）の予想サ イズは、２４，５００ダルトンである。これにより、約２４０００ダルトンの分 子量を有する発現ポリペプチドの知見は、この予想を支持するものである。この ２８０００ダルトンの融合タンパク質（ポリペプチド）は以後議論される。

ｂ、肝１がん腫細胞において発現されるＸタンパク質また、ＢＨｘＡｇの発現は 、あるＨＢＶ症の一機能であることが信しられている。例えば、ポリペプチド９ ９に対する抗体（抗９９）は、ヒトの肝臓がん腫細胞系列ＰＬＯ／ＰＲＦ１５（ ＡＴＣＣｃＲＬ８０２４）中で発現される２８０００ダルトンのタンパク質を特 異的に認識する。正常なウサギの血清は、このタンパク質を認識せず、また、抗 ９９の認識は、ポリペプチド９９とのブレインキュベーションでブロックされる 。この細胞系列は、組込まれたＨ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａを含むことが知られてい る。キャクラボルティ（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ）等、（１９８０）ネイチ及び マリオン（Ｍａｒｉｏｎ）等、（１９８０）ピロロジー（ν１ｒｏ１．）、３３ ．７９５〜８０６．ＨＢｓＡｇはこの肝臓がん腫細胞系列中で検出されており（ マクナブ（ＭａＮａｂ）等、（１９７６）キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）　、３４ ．５０９−５１５及びアゾン（Ａｄｅｎ）等（１９７９）、ネイチ＋　−（Ｎａ ｔｕｒｅ）、２８２．６１５〜６１６）、一方、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｅＡｇに対 する全ての標準検定値は陰性であった。ＨｅｐＧ２　（ＡＴＣＣＣＣＬ２３）と 命名された細胞系列もヒトの肝臓がん腫細胞系列であるが、組込まれた）（ＢＶ 遺伝子を含んでいなかった。アゾン（Ａｄｅｎ）等、上述。

これらの結果は、ＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞タンパク質の細胞タンパ脂質と、つづ く、抗９９及びスタフィロコッカス・オールウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプロティンＡを用いた反復免疫沈殿及び回収沈殿の電気泳 動によって得た。さらに、２８０００ダルトンのタンパク質は、オートラジオグ ラフィーにより同定した。この操作は、材料と方法のセクションでも議論されて いる。

ＰＬＣ／ＰＲＦ１５及びＨｅｐＧ３細胞由来の溶解物を用いた同様の実験結果を 第７図に示した。第７図は、２８０００ダルトンのところのＸ特異的タンパク質 がＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞中に検出されることを示している（レーン５）、抗体 をポリペブチ）’９９とブレインキュベーションしたときには免疫反応性はみら れなかった（レーン６）が、無関係なポリペプチドとブレインキュベーションし たときには見られた（レーン７）、予備免疫した血清コントロールは免疫反応を 起こさなかった（レーン８）。コントロールのＨｅｐＧ２溶解物には、Ｘ特異的 反応性は検出されなかった（レーン１〜４）、これらの結果は、Ｘ遺伝子産物が 組込まれたＨＢＶＤＮＡ配列を含む、ヒトの肝臓がん腫細胞系列中で発現されて いることを明確にしている。

Ｃ１肝細胞におけるＸタンパク質の発現さらに、ＨＢＶｇ染経歴をもつか、ある いはもたない、チノパンツー及びヒトに由来する４つの肝臓サンプルについて、 抗Ｘポリペプチド抗体を用いた、ウェスタンプロット法で、Ｘ関連タンパク質の 存在を検定した。この試験の結果を第８図に示す。１つのヒトのサンプル（Ｈ） は、慢性ＨＢＶ惑染感染肝臓がん腫の肝臓由来のもので、もう１つは急性ＨＢＶ 怒染（Ｈ）のものである、未感染チンパンジー（Ｃ）及びＨＢＶで慢性的に感染 したチンパンジー（Ｃ）のものは、抗Ｘポリペプチド抗体に対して反応を起こす 肝細胞溶解物を得るのに用いた。

抗９９抗体は、４５０００及び２８０００　（左欄矢印、右欄ｐ２８）ダルトン のタンパク質の両方と反応した。これらの抗体をポリペプチド９９とブレインキ ュベーションすると、両反応ともブロックされた。抗１４２抗体をこれらと同様 の細胞熔解物と反応させたとき、４００００　（ｐ４０）　、２８０００（ｐ２ ８）及び１７０００（ｐ１７）の場所６二特異的バンドが検出された。これらの タンパク質に対する反応性は、抗１４２抗体がポリペプチド１４２とブレインキ ュベートしたとき、それらがなくなることから特異的なものであると考えられる 。

コントロールサンプルである未怒染のチンパンジーの肝臓（すべてのパネルのレ ーン３）は、抗９９抗体により約４５０００ダルトンのタンパク質（ｐ４５）を 示し、またＩ）４０及びｐ１７の両方とも抗１４２抗体で示された。タンパク質 ｐ２８は、ＨＢＶｉ染したＭｍでのみ発現した（レーン５）。その抗体をポリペ プチド９９とブレインキュベートすると、その免疫反応性は失なわれたが（レー ン６）、無関係のポリペプチドでは失なわれなかった（レーン７）。予備免疫の 血清コントロールは免疫反応を起こさなかった（レーン８）、コントロールのＨ ｅｐＧ２溶解物中には、Ｘ特異的反応性が検出されなかった（レーン１−４）、 これらの結果は、Ｘ遺伝子産物が、組込まれたＨＢＶＤＮＡ配列を含むヒトの肝 臓がん腫細胞系列中に発現されていることを明確にしている。

比較的少量であるが、４５０００ダルトンのタンパク質の存在が、第７図で示さ れているＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞の溶解物中にも観察された。抗９９抗体及び４ ５０００ダルトンのタンパク質の間の免疫反応も、その抗体と免疫化したポリペ プチド９９とのブレインキュベーションでブロックされる。このことは第７図の レーン６に示されている。

正常なヒトの肝臓細胞抽出物（ＨＢＶ血清陰性）が抗９９を用いたウェスタンプ ロット検定により、４５０００ダルトンタンパク質のみ発現していることが分っ た。さらに、ＨＢｓ、ＨＢｃ及びＨＢｅに対して作った市販の抗体（ＩＬ州、北 シカゴアポットラボラトリー社）を用いて行ったコントロール検定では、本発明 の抗体により検出されるタンパク質を同定できなかった。この証拠も４５０００ ダルトンのタンパク質がＨＢｘＡｇと相同的な抗原決定基をもっているが、抗９ ９によって認識される２８０００ダルトンのタンパク質はＨＢＶ症に特異的であ るがＨＢｓＡｇ　、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｃＡｇとは異なることを示している。

ｄ、肝細胞におけるＸ遺伝子 Ｐ　Ｌ　Ｃ／　Ｐ　ＲＦ　／　５細胞におけるｐ２８の発現は、宿主ＤＮＡに組 込まれたＨ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａに由来するものである。これがＸタンパク質が 発現巳うる唯一の経由かどうかを調べることは興味深い。

それゆえ、Ｘタンパク質を示す、チノパンツー及びヒトの肝臓のＤＮＡをＨＢＶ ＤＮＡで探った（第９図）。全Ｄ　Ｎ　Ａを第８図に示した肝臓組織から単離し 、ＨＢＶ−ＤＮＡ配列の存否を分析した。２８０００ダルトンのタンパク質を含 存するチンパンジーのＤＮＡが、ＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲｌで消化したときも、 未消化のときも、同一のハンドを示した（第９圀、各々レーン１．２及び３　） 　ａ　Ｂ　ａｍ　ＨＩは、環状ＨＢＶＤＮＡを切断して２つの断片Ｅｌ　８５０ 及び１３５０塩基対〕とし、５．８キロベース（ｋｂ）のところのハンド（レー ンｌ）は、ゲノムサイズのものを組込んだ配列よりも大きなものを表わしている 。高分子量ＤＮＡバンドよりも下に、ハンドが見られないことから（レーン３） 　、ＨＢＶの組込まれた配列のみが、このＤＮＡ中に存在すると結論される。

さらに、）（ＢｃＡｇ陽性のヒトの肝臓由来のＤＮＡを調製し、ＨＢ　Ｖ　Ｄ　 Ｎ　Ａで探った。ＨｉｎｄｌＩｌ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲｌでの制限酵素切断し たＤＮＡ又は未消化のＤＮＡ　（第９図、各々レーン７〜１０）は、ゲノムサイ ズと同じか又は小さい相同的配列を示し、これにより、これらヒトのＤＮＡサン プルは組込まれた配列を含むという証拠は取り除かれた。２８０００ダルトンの タンパク質を欠く、チノパンツー及びヒトの肝臓組織もＨＢνＤＮＡ配列は含ま なかった（第９図、各々レーン４〜６及びレーン１１〜１４）。第９図に示した データは、Ｘタンパク質がＨＢＶゲノムの状態とは無関係に、ＨＢＶ怒染した組 織中で発現されることを確証し、また、それゆえ、Ｘ発現に対するＨＢＶＤＮＡ の組込みの必要条件を否定する。

ｅ、結果のまとめ これまでに説明してきた結果は、ＨＢｖ感染したヒト及びチンパンジーの肝臓組 織中に、かつては未同定のウィルスによりコードされているタンパク質の存在を 示している。この２８０００ダルトンのタンパク質（ｐ　２　Ｂ）は、染色体外 に遊離しているか、もしくは、細胞性ＤＮＡ中に組込まれているＨＢＶゲノムに よってコードされている。

この２８０００ダルトンのタンパクｔ（ｐ２８）は、Ｘ領域のみの産物ではなく 、付加的ＨＢＶ配列を含んでいる。ガリバー　）　（Ｇａｌｉｂｅｒｔ）等（上 述）により報告された配列に基づき、Ｘタンパク質の予想サイズは、約１７００ ０ダルトンである（第６図）、シかし、チノパンツー及びヒトのＨＢＶ感染組織 ばかりでなく、ＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞中の、抗Ｘペプチド抗体によって検出さ れるＸタンパク質の分子量は２８０００ダルトンである。ｐ２８を発現するヒト の組織中に組込まれたＨＢＶＤＮＡがないことは（第９図、レーン７〜１０）、 Ｘタンパク質（ｐ　２８）がＨＢＶゲノムからのみ翻訳されることから、仁のサ イズの差は、Ｘ遺伝子と、細胞性の配列の融合物によるものではない。

増加したＸタンパク質の大きさは、もし、このタンパク質がＨＢｓＡｇ−Ｘ、又 はＸ−ＨＢｃＡｇ融合体であるなら説明がつく。このような融合体の可能性は、 これらＨＢＶ遺伝子がゲノム上で互いに隣接していることを示唆している。

ＲＮＡレベルで、このような融合体が存在するかどうかを調べる企ては、Ｘ配列 を含むことが知られているＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞中で得られる転写物が、Ｘば かりでなく、表面又はコア配列も示すことから、不成功に終っている（データ示 さず）。

同様な結果がゴー（Ｇｏｕｇｈ）　（（１９８３）　、ジャーナル・オプ・モレ キュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）上６５．６８３−６９ ９）によっても報告された。Ｘ−コア融合体の証拠は、ヘパドナウィルスのその 他のメンバー、アヒルのへパチチスＢウィルス（ＤＨＢＶ）のＤＮＡ配列に由来 しており、その両遺伝子は、単一のタンパク質として翻訳される（マンダート（ Ｍａｒ＋＋］ａｒｔ）等（１９８４）、ジャーナル・オブ・ピロロジー（Ｊ、Ｖ ｉｒｏｌ、）土工、７８２−７９２）もので、フェイテルソン（Ｆｅｉ　ｔｅｌ ｓｏｎ）等の研究１１９８２）、ジャーナル・オブ・ピロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、）、王立、６８７−６９６）によるものである。

ＨＢＶのＸｔｉｉ域が発現するという事実は明白となっている。

しかし、この遺伝子産物の機能はまた不明である。ＸｉＪ域の翻訳産物であると 思われている１つのタンパク質分子は、ＨＢＶゲノムと関連しているか、又は、 より特別な場合に、そのＬ鎖の５′側のニックに共有結合している（ガーリンヒ （Ｇｅｒｌｉｃｈ）等（１９８０）、セル（Ｃｅｌｌ）　２１．８０１−８０９ ）、ＤＮＡ結合タンパク質を示すＸタンパク質というアイデアは、ＰＬＣ／ＰＲ Ｆ１５ｆ＋Ｂ胞又はＨＢｖｐ染組織のＤＮＡａｓｅ処理が］）２８活性を除去又 は修正できなかったときに除外された（データ示さず）。

現在、ＨＢＶ惑染感染、ＨＢＶ怒染と、肝細胞がん腫の酋来との相関関係に関す る生物学はほとんど分っていない。このため、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ配列の存在 に対する別のマーカーが重要である。目下、抗Ｘ抗体及びＸタンパク質の存否に ついてヒトの血清を調べている。

ポリペプチド配列に関して、このセクション及び請求の範囲で用いられている、 種々の文法型の“対応゛という言葉は、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方あ るいは片方での三個のアミノ酸残基までの増減を示すポリペプチド及びポリペプ チド配列の特別のアミノ酸残基での保存的置換のみを含むポリペプチド配列を意 味している。

°保存的置換”という上で用いた言葉は１つのアミノ酸残基が他の、生物学的に は同じ残基へ置換していることを差して用いる。保存的置換の例には、Ｉｌｅ％ Ｖａｌ　、Ｌｅｕ　、又はＭｅｔのような１つの疏水的残基の別のものへの置換 、又は、Ａｒｇ及びＬｙｓ間、Ｇｌｕ及びＡｓｐ間又はＧｉｎ及びＡｓｎ間のよ うな１つの極性残基のもう１つへの置換及びそれに類するものが含まれる。

ある例では、ＡｓｐのＬｙｓによる置換のような、逆の電荷のイオン性残基によ るイオン性残基の置換も、これらのイオン基が単に溶解性を助長すると考えられ る場合には“保存的”と呼ばれている。しかし、−ＪＧ的に、ここで議論されて いる置換はタンパク質全体と比べ、比較的に短かい合成ポリペプチド抗原に関す るものなので、１つのイオン性残基の、反対の電荷の別のイオン性残基による置 換は、ここでは、非イオン性残基とイオン性残基の間、及び、Ｐｈｅ　、　Ｔｙ ｒ又はＴｒｐのような大きい残基及びＧａｙ　、１ｉｅｕ及び〜゛ａ】などのよ り小さい残基との間の置換のように“過激な置換”と考えられている。

′非イオン性”及び“イオン性°残基という語句は通常の意味で、生理的ｐｔＩ 値において、各々、電荷をもっていないアミノ酸残基及び電荷をもつアミノ酸残 基を指して用いられている。

代表的な非イオン性残基には、Ｔｈｒ及びＧｌｎがあり、一方、イオン性残基に はＡｒｃ及びＡｓｐがある。

“抗原”という言葉は、歴史的に、抗体による結合を受ける実体を指して用いら れてきており、また抗体の産生を誘導する実体を指しても用いられてきた。最近 では、抗原の意味を抗体により結合をうける実体に限って使用し、一方°免疫原 ゛という言葉が抗体産生を誘導する実体に対して用いられている。

ある例では、ポリペプチドに結合する抗体を誘導するのに合成ポリペプチドが用 いられる場合のように、抗原と免疫原は同じ実体を示す。しかし、同しようなポ リペプチドは、ＨＢｘＡｇのような、まるごとのタンパク質と結合する抗体を誘 導するが、その様な場合では、このポリペプチドは免疫原でもあり抗原でもある が、ＨＢｘＡｇは抗原である。ここで議論される実体が免疫原性もありかつ抗原 性もある場合には、−ｍ的に抗原と呼ぶことにしよう。

５、検定システム及び方法 上述の結果は、５ＶＨＢＶ−３が発現ベクターとして使用できることを示してい る。それは、ＨＢｘＡｇ遺伝子の下流に同じ読み枠で挿入されている外来ＤＮＡ 配列に対する発現コントロール要素を提供する。

また、この結果は、合成ポリペプチド９９．１００及び１４２及び、それらに対 する抗体は、ＨＢｘＡｇを持つ疑がいがある動物宿主由来の肝臓がん腫細胞又は 肝細胞のような被検身体サンプル中のＨＢｘＡｇの存否を検出し、５ＶＨＢＶ− ３がうまくトランスフェクションしたか否かを検出し、また５ＶＨＢＶ−３を発 現ベクターとして用いた場合に発現をモニターする検定システム及び方法の一部 として用いられる。

このようなシステムは抗体、実質的な抗体、又はよく知られているところのＦａ ｂ及びＦ（ａｂ’）ｚ抗体部分のような抗体結合部位を含み、かつ、本発明の合 成ポリペプチドと免疫反応を起こすことができる受容体分子、すなわち本発明の 合成ポリペプチド生じる分子を含有する第１の試薬を含んでいる。フルオレセイ ンやローダミンなどの螢光色素、ヨウ素１２５や炭素１４のような放射性元素、 又は第１の試薬の受容体に対して生じた酵素結合抗体（例えばパーオキシダーゼ 結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ）等の第１の試薬の受容体と発現特異的ＨＢｘＡｇとの 免疫反応を知らせる指示手段も提供されている。支持手段は初めから第１の試薬 と結合している場合と、遊離している場合がある。このようなＨＢｘＡｇ検定試 薬システムの典型的用途には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）　、ラジ オイムノアッセイ及び免疫螢光検定法（ＩＰ）がある。

本発明のポリペプチド及びそれらの抗ペプチド抗体を用いた身体サンプル中のＨ ＢｘＡｇの存否を検定する診断法はすでに広範に説明してきた。このような診断 検定法の市販の態様における診断検定システムも考案した。

そのようなシステムの１つには、第１の試薬として、抗８．４２．７９．９９及 び１４２のような抗ポリペプチド受容体を含む少なくとも１つの容器が含まれて いる。抗ポリペプチド抗体を生じさせたポリペプチド、例えば８．４２．７９． ９９又は１４２を一定量含む第２の容器も第２の試薬を提供している。よく知ら れているところの、先に述べた指示手段、１つ以上のバンファ及びそれに類する ものを含む別の容器も、この診断検定システムに提供されている。

検出量のＨＢｘＡｇの存否を検定する方法もこれまでに広範に説明してきた。簡 単に言うと、この方法には、ＨＢｘＡｇと、本発明の合成ポリペプチド及びＨＢ ｘＡｇと免疫反応することができる抗体結合部位を含む、抗８．４２．７９．９ ９又は１４２又はそれらのＦａｂ又はＦ（ａｂ’）部分などのレセプターとの免 疫反応を知らせる、上述受容体の１に結合したホースラディツシュパーオキシダ ーゼのような酵素ラベル、又はｌ！Ｊ−ラベル化スタフィロコンカス・オーレウ ス（Ｓ、オーレウス）　（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）のプロ ティンへのような指示手段の存在下、肝はがん腫細胞又は肝細胞のような検定す べき身体サンプルに由来するタンパク質を、上述の受容体と混合することが含ま れる。この混合物を指示手段が免疫反応が起きたことを知らせるのに十分な時間 維持し、ついで、そのシグナルの存在は、オートラジオグラフで確認する。身体 サンプル、又はそこからのタンパク質は、受容体と混合する前に、ニトロセルロ ースシート又はガラス板のような固体マトリクスに吸着又は固定しておくことが 望ましい。

指示手段が放射性ラベルしたＳ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡのよ うな分離した分子の場合、結合させた身体サンプル及び受容体分子をまず指示手 段のないところで混合し、これを結合した免疫反応産物が形成するのに十分な時 間維持する。それから、結合した免疫反応産物を洗浄する０分離分子の指示手段 をこの結合した免疫反応産物と混合し、結合した第２の免疫反応産物が生成する まで維持する。それからこの結合した第２の免疫反応産物を洗浄し、指示手段に 由来する信号の存否を測定する。

指示手段が本発明の受容体の一部である場合、これらのラベル化した受容体を検 定すべき結合させた身体サンプルと混合し、この混合物を免疫反応物が生成する のに十分な時間、維持する。それから結合した免疫反応産物を洗浄し、その指示 手段に由来するシグナルの存否を測定する。

先に述べた、ポリペプチド８．４２．７９．９９又は１４２などの第２の試薬は 、非特異的というよりむしろ特異的な免疫結合生成を検証する免疫反応ブロッキ ング実験におけるコントロール試薬として用いることができる。このようなブロ ッキング実験を第７．８及び１０図に示す。

発現ベクターとして５ＶＨＢＶ−３を用いるため、外来ＤＮＡを、ＨＢｘＡｇ遺 伝子の下流、好ましくは唯一のＢａｍＨＩ制限部位に挿入し、このようにして作 った新しいベクターを細胞のトランスフェクトに用いた。トランスフェクトした 細胞におけるＨＢｘＡｇの発現は５ＶＨＢＶ−３中に挿入された外来ＤＮＡの発 現の推定証拠である。上述のＨＢｘＡｇ発現検定システムによって検出されるＨ ＢｘＡｇの発現は、Ｓ　Ｖ　ＨＢ　Ｖ　−３に挿入した外来ＤＮＡの発現を示し ている。

従って、上述の検定システムを用いて行ったトランスフェクション後に生成した 細胞コロニーの試験でトランスフェクションがうまく行ったコロニーを選択する 。例えば真核細胞へのベクターの導入によって生じたコロニー由来の細胞を収穫 し、溶解してから、その細胞性タンパク質を抽出する。抽出した細胞性タンパク 質を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分離し、分画したタ ンパク質をニトロセルロースにブロッティングした。このプロットしたタンパク 質を過剰の受容体及びポリペプチド９９又はポリペプチド１４２に対する１２５ Ｉラベルした抗体のような、先に述べた検定システムのラベルと接触させ、つい で、免疫反応していない抗体（受容体）を除くための洗浄により、外来遺伝子に よってコードされているポリペプチドに融合した、発現されたＨＢｘＡｇ部分の 存在を示すオートラジオグラフを得た。

先に説明した検定法及び検定システムは、特に、身体サンプル、特に肝臓生検出 来の細胞のような組織サンプル中に存在するＸタンパク質又はその実質的部分を 同定するのに有用である。以下に説明する診断検定法及び診断法は特に血液自体 、血清又は血柴などの身体サンプル中に存在するＸタンパク質に対する抗体の存 在を測定するのに有用である。ウェスタンプロット分析は、そのような診断法の 代表として用いられるであろう、しかし、この方法を用いた市販されている態様 はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）診断法である。

一方、第１０図に関連して議論したＥＳＣ−１＠胞中で発現する約２４０００ダ ルトンのタンパク質（ポリペプチド）のような、５ＶＨＢＶ−３ベクターでトラ ンスフェクトした細胞由来の発現産物は、ポリペプチド９９又はポリペプチド１ ４２のような本発現の好ましいポリペプチドも抗原として使われるにもがかわら ず、これもうまいことに抗原として使用することができる。従って、以後述べる ようにアフィニティ・クロマトグラフィーによって得られるような実質的に純粋 な形で用いられる、ＨＢｘＡｇ自身、Ｓ　ｖＨＢ　Ｖ　−３でトランスフェクト し１こＥＳＣ−１細胞で発現されるようなＨＢｘＡｇ分子の実質的部分（２４０ ００ダルトンのポリペプチド）、又はＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応するアミノ 酸残基配列をもつポリペプチドは抗原として用いることができる。

この抗原は、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社にュージャージー・ビス力 タウェイ）から登録商１ｓＥＰＨＡＤＥχで市販されている架橋デキストラン、 アガロース、ガラスピーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋アクリルアミ ド、ニトロセルロース又はマイクロプレートのウェルのような固体サポートを作 る固体マトリクスに結合（吸着）又は固定することが好ましい。

好ましくは、固体サポートの一部として、固体マトリクスに結合した抗原を、検 定する液体身体サンプルと混合し、固液相部合物を作る。身体サンプル中の抗Ｘ タンパク質（抗ＨＢｘＡｇ）抗体（ＨＢｘＡｂ）が抗原と免疫反応を起すのに十 分な時間、この混合物を維持する。それからこの免疫反応の有無を検定する身体 サンプル中の抗Ｘタンパク質抗体の存在を知らせる指示手段を使うなどして、測 定する。

例えば、ある実験においては、５ＶＨＢＶ−３ベクターでトランスフェクトした ＥＳＣ−１細胞溶解物を調製し、電気泳動で分画してから、第１０図に関連して 議論したのと実質的に同様の方法で固体マトリクスとしてのニトロセルロースシ ートに転移及び結合させて固体サポートを作った０種々の肝臓がんにかかった６ 名の患者に由来する５０分の１に希釈した血清をニトロセルロースに結合した、 トランスフェクトＢ５Ｃ−１細胞のタンパク質と別々に混合し、固液相部合物を 作る。この混合物を、血清中に存在する抗Ｘ抗体が結合した抗原と免疫反応する のに十分な時間維持した。

洗浄しなから固液相を分離した後、上述のステップでできた固相を、指示手段と してのホースラディツシュパーオキシダーゼに結合したヤギの抗ヒト又は抗ウサ ギ抗体の２００分の１希釈吻を含む溶液と別々に混合し、第２の固液相部合物を 作った。各々の第２の固液相部合物をラベルした抗体が、マトリクスに結合した 抗原と免疫反応を起こすヒトの抗Ｘ抗体と反応するのに十分な時間（１時間）維 持する。ウサギの抗ポリペプチド抗体は、ヤギの抗ウサギ抗体とともにコントロ ールとして用いた。生成した固液相部合物を再び分離し、洗浄した。それからこ の固相を第８図で説明したように４−クロロ−１−ナフトールを含む溶液に使用 した。

この実験結果は、肝細胞がんをもっと診断された患者に由来する血清は、トラン スフェクトしたＥＳＣ−１細胞中の５ＶＨＢＶ−３ベクターによって発現される ポリペプチドに結合する抗体を含んでいることを示した。したがって、これらの 抗体は、抗Ｘ抗体であり、またそれらの存在は、ＨＢＶ感染のある段階での基準 抗原としてＸ遺伝子産物を確認するものである。

上述のウェスタンプロット検定において使用される、約２４０００ダルトンのポ リペプチド発現産物を以下に述べるＥＬ　Ｉ　ＳＡにおける、又は、その他の同 様な検定法で抗原として用いる場合、このポリペプチドは、使用前に精製、単離 した方が好ましい。この精製及び単離は、従来技術で行うことができる。例えば 、抗８．４２．７９．９９、又は１４２抗体、もしくはそれらの抗体結合部位を 、ここで説明しているように調製しアガロースや、ファルマシア・ファイン・ケ ミカルズ社がら登録商標、６Ｂ、ＣＬ６Ｂ、４Ｂ及びＣＬ４Ｂ、で販売されてい る架橋アガロース誘導体又は、ＣＡ州リすチモンドのバイオラボ・ラボラトリー ズがら登録商標Ｂ　１０−ＧＥＬ　Ａ−０，５Ｍ、Ａ−１，５Ｍ及びＡ−５０Ｍ Ｔ：販売されているもの等の固体マトリクスに結合した。

先に示したバイオラドラボラトリーズから市販されている登録商標ＢＩＯ−Ｇｅ ｌ　Ｐ−２、Ｐ−３０、Ｐ−１００及びＰ−３００のポリアクリルアミドビーズ 及び登録商標５ＥＰＨＡＤＥＸで市販されている架橋デキストランも有用な固体 マトリクスである。アガロース誘導体を含むマトリクスの使用について以下に説 明する。

典型的に、アガロースマトリクスは、臭化シアンを用いて結合のための活性化を 行う。活性化したマトリクスを洗浄し、これを乾燥することなしに抗体（受容体 ）分子と結合する。マトリクス結合抗体を洗浄すると使用＄備ができる。マトリ クス上の未反応基は、急速に不活性化していくが、必要な場合は、エタノールア ミン又はトリス等のアミンと反応させる。

アフィニティ吸着体は、ビーカーやフラスコ中などのように浮遊状態で使いうる し、またカラムの中に納めても使用される。使用前に、そのアフィニティー吸着 体を、不安定にサポートに結合している抗体や、非特異的に結合しているタンパ ク質を除くため、約２４０００ダルトンのポリペプチドを含む細胞溶解物の精製 に用いたバッファ又はその他の水性媒体中で洗うことが望ましい。

Ｓ　Ｖ　ＨＢ　Ｖ　−３ベクターでトランスフェクトした細胞溶解物を含む水性 組成物を作り、このアフィニティー吸着体と混合する・この混合物は、結合した 抗体（受容体）と、約２４０００ダルトンのポリペプチド（抗原）との間の可逆 的結合状態の抗体−抗原（受容体−リガント）複合体を生成する。

それから、この結合した受容体−リガント複合体を残りの未反応水性組成物から 分離し、そうすることにより、アフィニティー吸着体に結合した純粋な形のポリ ペプチド抗原が得られる。この混合物をビーカー又はフラスコ中で作ったときは 、この分離を濾過及び洗浄で行うことができる。この吸着体がガラム中にあると き、この分離は、未反応水性媒体の溶出と、好ましくは洗浄ステップで行うこと ができる。

この精製ポリペプチド抗原がアフィニティー吸着体を含まないことが望ましい場 合は、−ｉ的に多くの操作でこれを得ることができる。そのどの操作においても 、可逆的結合の受容体−リガント複合体を、マトリクス結合受容体とポリペプチ ド抗原リガンドの各成分へと解離し、そのポリペプチド抗原リガンドを、結合し た受容体から分離することによって、アフィニティー吸着体を含まない精製され たポリペプチド抗原リガンドの溶液を得ている。

この溶液はこのままで用いることもできるし、必要なら、使用前に濃縮又は乾燥 する。ある場合には、よく知られているように、使用前に脱塩することが望まし い。

可逆性複合体の解離は、いくつかの方法で行うことができる。

一般的には、ｐＨ約２．５の０．２モル濃度の塩酸グリシンが用いられる。別に 、可逆性複合体を、抗体生産に用いた免疫原性ポリペプチド、例えばマトリクス に抗９９抗体が結合している場合にはポリペプチド９９の過剰量と混合すること により、結合しているポリペプチド抗原リガンドを結合した受容体から競争で引 き離すことができる。このような競争は、ポリペプチド抗原の変性の可能性を回 避させるものである。解離したポリペプチド抗原をアフィニティー吸着体から分 離するのは上述と同様である。

アフィニティ吸着体の調製及びその使用法は古くから広く行なわれている。しか しながら本発明の抗体及び抗原を組入れた物質及びその使用は、これまでにない ものである。アフィニティー吸着体、その調製法及び抗原がマトリクスに結合し ている場合の使用法の詳細な説明はマーシャロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ） 及びワー（Ｗａｒｒ）縄の“道具としての抗体”　１１９Ｂ２）、ニューヨーク 、ジョンウィリー・アンド・サンズ社、６４〜６７頁及び７６〜９６頁）に示さ れている。

上述の方法を用いた代表的ＥＬＩＳＡは、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルから なる１２又は９６大のマイクロプレートを含む固体マトリクス上に吸着又は固定 した、前述の本発明の抗原を含む固体サポートを使用している。マイクロプレー トのウェルの壁にある非特異的結合部位は一般的にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）のようなタンパク質であとからブロックする。未結合の抗原及びＢＳＡは洗浄 によりマイクロプレートから除く。

ヒトの血清、血液又は血漿のような身体サンプルの部分標本を上述の抗原結合固 体サポートと混合し、固液相からなる混合物を作る。身体サンプル中の抗Ｘタン パク質抗体がポリペプチド抗原と反応し、ポリペプチド含有免疫反応産物が生成 するのに十分な時間、例えば、約３０分から約２時間、その固液相部合物を維持 する。その後、−ｉ的には、この同相及び液相は分離される。

第１の抗体と反応する、第２のラベル化した指示手段を含む抗体、抗体結合部位 、Ｓ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）のプロティンＡの溶液を、その固相と混合し 、もう１つの固液相部合物、すなわちラベル化反応混合物を生成させる０代表的 な第２の抗体には、第１の抗体がヒトの身体サンプル由来である場合の、パーオ キシダーゼラベルしたヤギの抗ヒトＩｇ抗体がある。さらに、有用な酵素ラベル には、アルカリホスファターゼ、ベーターＤ−ガラクトシダーゼ及びグルコース オキシダーゼがある。

固相（固体マトリクス結合の抗原−抗体免疫反応産物）及び第２のラベル化抗体 溶液の混合物を２つの抗体間の第２の免疫反応のように、結合した第１の抗体と 、指示手段の間の反応産物が生成するのに十分な時間（例えば約１時間）、維持 する。それからこの固相と液相を分離する。

上述の第２の抗体と、一群のイムノグロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉｇ Ｅ、ＩｇＡ又はＩｇＤ）の中の１つだけに特異的であり、免疫反応を起こす。こ のような抗体は身体サンプル中に存在する抗Ｘタンパク質抗体のイムノグロブリ ンクラスの同定を可能にする。さらに、第２の抗体又は抗体結合部位は、イムノ グロブリンＬ鎖の２つのタイプの１つ（例えばカッパ又はラムダ）だけに特異的 に免疫反応を起こす。これらの抗体は身体サンプル中に存在するイムノグロブリ ン分子のアイソタイプの同定を可能にするもので、よく知られているものである 。

その後に、パーオキシダーゼに対する、過酸化水素のような酵素ラベルのための 基質及び０−フェニレンジアミン又は４−クロロ−１−ナフトール又はアルカリ ホスファターゼに対するｐ−ニトロフェニルホスフェートのような発色色素前駆 体を含む溶液をその固相と混合する。予め選択された波長（例えば、それぞれ４ ９０又は４０５ナノメータ）における光学密度を、十分な時間経過後（例えば６ ０分）測定し、そして、コントロールの光学密度と比較して、抗Ｘタンパク質抗 体が身体サンプル中に存在するかどうかを判断する。

本発明の別の態様には、ポリスチレン１２六マイクロタイターストリツプのよう な固体マトリクスを含む固体サポートと、そのマトリクスに吸着（結合）又は固 定化された、上述の本発明の抗原を含む、キットの形をした診断システムが含ま れている。また、このシステムは、別にパンケージされたパーオキシダーゼラベ ルしたヤギの抗ヒｚｇ抗体のような結合した指示手段を有する抗ヒトＩｇ抗体を 含むことが望ましく、また、別のパフケージとし゛て、過酸化水素及び０−フェ ニレンジアミンのような発色色素前駆体等の結合した指示手段に対する基質も含 めることもある。−般的に過酸化水素は不安定なためキットの中に含めないし、 また、過酸化水素の容器は診断システムの１つの要素となりうるが、それ自体は 、使用者が入手するのが一般的である。本システムに用いる検定で使用するバッ ファ塩も乾燥又は液状の１つ以上の別個のパンケージ内に含めることも可能であ る。ポリペプチド９９等の本発明の好ましいポリペプチドもコントロールとして 競争結合実験に使用するために、別のパンケージ内に含めることもある。

血清等の身体サンプル中の抗Ｘタンパク質抗体の存否の検定は先に述べた方法を 用いた、この診断システムで行うことができる。

６、ポリマーの調製 本発明のポリペプチドを継げて、多くのポリペプチド反復ユニットを含む水溶性 又は水分散性の抗原性ポリマーを作ることができる。このようなポリマーは免疫 反応が増加するという利点をもっている。種々のポリペプチドでポリマーを作る と、このようなポリマーは、多くのＨＢｘＡｇの抗原決定基と免疫反応する抗体 を付加的に誘導することが可能である。

以下に示すように、２つのシスティン残基を含むよう、ポリペプチドを合成する ことにより、ポリマーを作ることができる。この２つのシスティン残基はポリペ プチドの末端と内部に存在することもあるし、また、アミノ末端とカルボキシ末 端の両方にあることもある。２つのシスティンを含むポリペプチドはここでは一 般的に’ｄｉＣｙｓ　”ポリペプチドと呼び、一方、両末端のシスティン残基を 含むポリペプチドは、“末ｉ’４ｄｉｃｙｓ　”ポリペプチドと呼ぶ。ポリペプ チド内部及びポリペプチド鎖末端の、このようなシスティン残基はそのポリペプ チドが対応するＨＢｘＡ４配列中、例えばポリペプチド１４２の中央のシスティ ン（カルボキシ末端のアラニン（Ａｌａ）から数えて、７番目の残基、や、ポリ ペプチド９９のカルボキシ末端のシスティン（Ｃｙｓ）に存在する場合もあるし 、あるいは、末端システィン残基がそのポリマーを調製する目的で付加される場 合がある。

有用なｄｉＣｙｓポリペプチドの例には、左から右にアミノ末端からカルボキシ 末端の方向で示されている、下記の式で表わされるものがある。

ポリペプチド８　ａ　：　Ｒ’−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ ｒｇ−Ａｓｐ−％’ａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− Ｇｌｙ−Ｒ”；ポリペプチド４２　ａ　：　Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ− Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ＋ポリペプチド ７９　ａ　：　Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａ ｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−シａｌ−Ｌｅｕ−Ｈ ｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ。

ポリペプチド９９　ａ　：　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−５ｅｒ −Ｔｈｒ−τｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−τｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ −Ａｓｐ−Ｃｙｓ。

ポリペプチド１００　ａ　：　Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒ ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｉｅ−Ａｒｇ−Ｌｅ ｕ−Ｌｙｓ−Ｖａ　Ｉ　−Ｃｙ　ｓ　＋及びポリペプチド１４２　ａ　：　Ｒ’ −Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ −Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ”＋ （式中、Ｒ１及びＲ２の１つだけが存在するという条件付きでｉｌｌ及びＲ２は 各々システィン残基を示す）第６図に示したように、各々のポリペプチド８．４ ２．９９．１００及び１４２は、翻訳されたＸ−ゲノムのアミノ酸残基配列中に 存在する１個のシスティン残基を含んでいる。末端システィン残基以外は、ポリ ペプチド９９及び１００のアミノ酸残基配列をもつポリペプチドも免疫反応プロ ンキング実験及び後に議論するように、ＭＢＳ反応以外の手段でキャリヤーへの 結合が使用される場合に有用である。

１つ又は２つの末端システィン残基が、ポリマー調製の目的で付加したとき、及 びその他のアミノ酸残基配列がＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応する場合には、こ のポリペプチド反復ユニットは、なお、ＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応している と考えられる。

一般的な実験室レベルの調製においては、１０ミリグラムのｄｉＣｙｓポリペプ チド（非酸化型のシスティン残基を含む）をｐｏ価約８の０．１モル濃度重炭酸 アンモニウムパンフ７２５０ミリリットルに溶解する。それから、この溶解した 末＠ｄｉＣｙｓポリペプチドを、約１８時間、またはエルマンテストで遊離した メルカプタンが検出されなくなるまで、緩やかに、この）８液を撹拌することに より空気酸化させる。（エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）　（１９５９）　、アーク・ バイオケム・バイオフィズ（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ）　８２．７０−７７、参照） このようにして得たポリマーは、反復ユニットとして、多くの本発明のポリペプ チドを含んでいる。このようなポリペプチド反復ユニットを酸化されたシスティ ン残基により共に結合させる。

本発明のポリペプチドを多く含む、このようなポリマーは、左から右に、アミノ 末端からカルボキシ末端の方向で示された次の式て表わされる。

（Ａ）　ａ　’　（Ｂ）　ｂ （式中、Ａ及びＢは、ポリペプチド８．４２．７９．９９．１００及び１４２の ような種々のポリペプチド反復ユニットである。また下付の文字ａ及びｂは、ａ 及びｂの平均値の合計が少なくとも２であり、その結果、ポリマー中に少なくと も２つのポリペプチド反復ユニットがあるという条件付きで、各々、ゼロから約 ２０００までの平均値をもつ整数である。） 下付文字ａ及びｂの平均価の合計は一般的に約２０００よりも小さく、その結果 、生成シだポリマーは、約５００００００ダルトンの平均分子量を存する。好ま しいｇ４ｇにおいては、このポリマーの平均分子量は約５００００〜約１０００ ０００ダルトンである。

上記の式；よ、ポリマーの反復ユニット及び存在する各反復ユニットの平均数の 一般化表現を意図したものである。２つの異なる反復ユニットを含む、本発明の ポリマーは典型的にはランダムコポリマーである。従って、これまで示してきた 式は、例えば、ブロックコポリマーにおけるような、ポリマー中に存在するポリ ペプチド反復ユニットの順序を表わす意図はない。

上記本発明の水溶性または水分散性ポリマーは免疫原でもあり抗原でもあるので 、先に議論したように、ここでは抗原と記述する。生理学的に許容される希釈剤 に分散し、ウサギ当り４００マイクログラムのポリマーの免疫化注射したとき、 これらの抗原ポリマーは、ニューシーラント赤ウサギ中に、ｌ（ＢｘＡｇと免疫 反応する抗体の産生を誘導することができる。代表的な生理学的に許容しうる希 釈剤は、免疫学ではよく知られており、以後、詳細に議論される。

７、　ポリペプチドのタンパク質キャリヤーへの結合ここで用いる合成ポリペプ チドを、次に示す従来法に用いてキーホール・リンベット・ヘモシアニン（Ｋ　 Ｌ　Ｈ）に結合させた。

まず、ＫＬＨキャリヤーをｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドエステルで活性化し、つづいて、リュウ（ｌｊｕ）等１１９７９）、バイ オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　８０．６９０）により報告されているミ カエル付加反応により、ポリペプチドのアミノ末端（ポリペプチド１００）又は カルボキシ末端（ポリペプチド９９）に存在するシスティン残基を介して、又は 、ポリペプチド１４２の中央のシスティンを用いることにより、ポリペプチドに 結合させた。

また本発明のポリペプチドを、別の手段を用いてキャ”リヤーに結合させること もできるし、ＫＬＨ以外のキャリヤーへも結合させることもできる。例えば、ポ リペプチド９９等のポリペプチドをよく知られでいるように、０．０４パーセン トのグルタルアルデヒド溶液を用いて、遊離したアミノ基を介して、チクナス・ トクソイドキャリャーに結合させることができる。例えば、クリプスタイン（Ｋ ｌｉｐｓｔｅｉｎ）等、（１９８３）、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ デシーズＵ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓｃ、）１土１．３１８）参照。

ポリペプチドのアミン又はカルボキシ末端又はその中央部分にあるシスティン残 基は、ジスルフィド結合を介した結合体及びミカエル付加反応産物を作るのに特 に有用であることが分ったが、結合体を作るための、当分野でよく知られている 他の方法も用いることができる。代表的な付加的結合操作には、グルタルアルデ ヒド（上述）及びそれに頻するもの等のようなジアルデヒドの使用、又は、キャ リヤーとポリペプチドの間にアミド結合を形成させる、例えば、１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのような水溶性カルボジイミ ドの使用のようなカルボジイミド技術の使用が含まれる。

有用なキャリヤーは、この分野でよく知られており、一般的にはタンパク質それ 自身である。このようなキャリヤーの例にはポリ　（Ｄ−リジン；Ｄグルタミン 酸）のようなポリアミノ酸以外にキーホール・リンペント・ヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）、エデスチン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミ ン（各々ＢＳＡ又はＨ３Ａ）のようなアルブミン、ヒツジの赤血球（ＳＲＢＣ） 　のような赤血球細胞、チクナス、トキソイド、コレラトキソイド及びそれに類 するものがある。

また当分野でよく知られているように、しばしば、中間的結合基を介して、その 合成ポリペプチドをキャリヤーに結合させる方が有利である。

しかし、システィンを用いるとき、中間的結合基としては、先にも議論したよう に、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ ）であることが望ましい。一般的には、まず、エステル−アミド交換反応により 、ＭＢＳをキャリヤーに付加させる。その後、上述のミカエル反応を行うか、ま たはマレイミド・二重結合への、チオール酢酸（ＣＨ３ＣＯ５Ｈ）のような・ブ ロックされたメルカプト基のミカエル付加を行なう。アシルブロッキング基切断 後、脱保護した結合基メルカプタン及び合成ポリペプチドの付加したシスティン 残基のメルカプタンの間にジスルフィド結合が形成される。

キャリヤーの選択は、抗原の決定基部分よりもむしろ、抗原の最終的用途に依存 し、本発明に特に関係しない基準に基づいている。例えば、もし、ＨＢｘＡｇの 存否を検定するのに使用する抗ポリペプチド抗体の生産の場合のように接種物を 動物に使用するなら、特別な動物において都合の悪い反応が起こらないキャリヤ ーを用いるべきである。もし、ＨＢｘＡｇに対するワクチンのような接種物がヒ トに使われるなら、重要な事にはキャリヤー、そして、または生成した抗原の免 疫化学的又はその他の副反応のないこと、安全性及び効率等−−ヒトに使用する 際のワクチンに適用するのと同じ考慮が含まれる。

８、　免疫操作 免疫に用いる接種物は酸化したシスティン残基を介して結合した個々のポリペプ チドのポリマーとして、または、キャリヤーに結合したポリペプチド結合体とし て、効果的量のポリペプチドを含んでいる。接種当りの効果的なポリペプチド量 はなかでも、接種する動物の種類、その動物の体重及び選択された接種摂生に依 存することはよく知られている。一般的に接種物は、乾燥した固体のポリペプチ ド結合体又はポリペプチドポリマーから、それらを水、生理食塩水又はアジュバ ントに懸濁することで調製される。

これら接種物は、一般的に、接種当り約２０マイクログラムから約５００ミリグ ラムのポリペプチド濃度のものである。記述されるポリペプチド量は、キャリヤ ーを用いる場合、キャリヤーの重さ以外のポリペプチドの重さのことである。

接種物は生理学的に許容しうる（受容しうる）水、リン酸緩衝液、又は生理食塩 水などの希釈剤を含み、また、さらに典型的には、希釈剤の一部としてアジュバ ントを含んでいる。完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイン ドアジュバント（ＩＦＡ）及びミョウバンなどのアジュバントは、当分野ではよ く知られた物質であり、また、いくつかの業者から市販されている。

接種物ストック溶液は次のようにして、ＣＦＡ、ＩＦＡ又はミョウバンを用いて 調製する。接種当りの、望まれる量のポリペプチドを提供するのに十分な量のポ リマー性ポリペプチドを、ｐ）ｌ値７．２のリン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に溶解 する。それから、等容量のＣＦＡ、ＩＦＡ又はミョウバンをこのポリペプチド溶 液と混合し、水／油比約１＝１のポリペプチド、水及びアジュバントを含む接触 物を作る。その後、この混合物を均一化して、接種物ス）７り溶液とした。

抗ポリペプチド抗体を生成するのにここで用いるウサギに、虎疫スケジュールの 、各々、０．１４．２１日回目腹腔的注射される、完全フロインドアジュバント （ＣＦＡ）中にエマルジョン化した２００マイクログラムのポリペプチド結合体 、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中の２００マイクログラムのポリペ プチド結合体及び４ｍｇのミョウバンを伴う２００ｍｇのポリペプチド結合体を 含む接種物を注射する。各々の接種（免疫化）は、この接種物の４回の注射から なる。マウスは、同様の方法で、注射当り１０分の１の投与量で免疫化する。

−Ｓ的に、動物は、第１回目の注射後４及び１５週間飼育する。

コントロールの免疫前血清は、最初の免疫化直前の各動物から入手する。

コントロールの接種物ストック溶液も、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ ＬＨ）　、ＴＦＡ　（不完全フロインドアジュバント）中のＫＬＨ，ＫＬＨ−ミ ョバン吸収、ＫＬＨ−ミョウバン吸収百日咳菌、エデスチン、チログロブリン、 チクナス・トキソイド、ＩＦＡ中のチクナストキソイド、コレラトキソイド及び ＩＦＡ中のコレラトキソイドを用いて調製することができる。

宿主動物の抗原又は接種物の注射又はその他の導入に当たり、この動物の免疫シ ステムは、この抗原に対する大量の抗体のを産生ずることにより応答する０作り 出した抗原、すなわち、キャリヤー又はポリマーに結合させた合成ポリペプチド から生成した抗原の特異的抗原決定基は、問題にしている天然の抗原の決定基に 対応しているので、合成ポリペプチド抗原ばかりでなく、合成ポリペプチド抗原 が対応するタンパク質又はポリペプチド、すなわちＨＢｘＡｇに対する抗体をも 、その宿主動物は製造する。

９、保管 以下に列挙した物質を１９８４年３月８日、アメリカン・タイプ・カルチャーコ レクシ；ンに保管し、各々、示された受理番号を得た。

“ＡＴＣＣ”と文字につづく数字そして、または、文字と数字を含む、細胞系列 、ベクター及びそれに類するものに対する全ての名称は、２０８５２、ＭＤ州、 ロックビル、バークローンドライブ１２３０１アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクションに保管した物質を示している。

５ＶＨＢＶ−３４０１０２ ＡＭ６　４０１０１ ＳＶＡＭ１９１　４０１０３ 太−■−皿 ＥＣ−ＡＭ６　３９６３０ ＥＣ−ＡＭＩ　３９６２９ ＥＣ−３ＶＡＭ１９１　３９６３１ 本発明者によりＡＴＣＣに保管された上記物質に加えて、他の人により調製され 、ここで用いられている物質もＡＴＣＣに保管しである。それらの物質のリスト を以下に示す。

Ｗ３１１０　２７３２５ ＲＲＩ　３１４４７ ＨＢＩＯＩ　３３６９４ 主１Ｊ１」聡 ＨｅｐＧ２　ＣＣＬ　２３ ＢＳＣ−Ｉ　ＣＣＬ　２６ ＣＯ３−７ＣＲＬ　１６５１ ＰＬＣ／ＰＲＦ１５　ＣＲＬ　８０２４Ｂ、材料と方法 １、ＨＢＶ　ＤＮＡの単離及び調製 ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　（アメリカン・ジャーナル・オブ・メディカ ル・サイエンス　（Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、）　（１９７５）　２７ ０゜１５１−１５９）の操作に従がい、ＨＢｓＡｇ陽性の提供者（ナショナル・ インスチチュート・オブ・ヘルス１７３７１３９）の血漿由来のサブタイプａｄ −のディン粒子からχＨＢＶ領域ＤＮＡを単離した。簡単に言うと、］、Ｏ＋ｎ ｆの血漿を、０．００１モル濃度（Ｍ）のトリス−ＨＣｆ　（ｐＨ７，４）及び ０．５ＭＨＣｆを含むＴＮＮバッファ３．０ｍｌに希釈した。この希釈した血漿 を１００００×ｇで１０分間遠心し、大きい細胞片を除き、ＴＮ、０．０１ＭＥ ＤＴＡ（０，１パーセント２−メルカプトエタノール及び予め１１００００Ｘ、 １０分間の遠心を行って、沈殿したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を除いた。１ ミリグラム／ミリリツトル（Ｉｎｇ／ｍＡ）のＢＳＡ〕を含む３０パーセント（ Ｗ／Ｖ）スクロース、２．５ミリリツトル（ｍ＃）上に重層した。スピンコ５Ｗ −６５０−ター（ベックマン・インスッルメント社）　中、５００００ｒｐｖｅ 　％　４時間、４°Ｃの遠心後、この上清を注意深く取り出し、ペレットを１パ ーセントノニデントＰ−１０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエー テル；シグマ・ケミカル社、ＭＯ州、セントルイス）及び０．１パーセント２− メルカプトエタノールを含むＴＮＮバッファ０マイクロリットルに懸濁した。

上述の単離したＨＢＶ　ＤＮＡの一木鎖領域は、懸濁したＨＢＶ　ＤＮＡ５０マ イクロリツトルに２５マイクロリツトルのミン’）スＥ　（０，２Ｍ　）リス　 ＨＣｌ（ｐＨ７，４）　、０．０８Ｍ　ｈｇｃｌ、、０、２４　Ｍ　ＮＨ，ＣＪ 　、各１．０ミリモル濃度（ｍ　Ｍ　）のｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）を加えた後、３７℃、１時間インキュベーシ ョンすることにより二本鎖にした。ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　（１９７ ５）アメリカン・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンス（Ａｍ、　Ｊ、　 Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、）　２７０．１５１−１５９　。

ゲノムプローブとして用いる放射性ラベルしたＨＢＶ　ＤＮＡを、ｄＣＴＰ及び ｄＧＴＰの代りに各々０．２５ミリモル瀞度の３ＨｄＣＴＰ及び３ＨｔｌＧＴＰ を用いた、上述の充填操作を用いて作った（両方とも、ａＭ当り２１キユーリー ）。

２、ＨＢｘＡｇのクローニング ＨＢｘＡｇをコードするＤＮＡ配列を含むＨＢＶゲノムの一部を、大腸菌に導入 したプラスミドＰＢＲ３２２を用いてクローン化した。上述の単離した二本鎖、 未ラベル化ＨＢＶ　ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩで消化した［５０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，１０＋ｎＭ）リス・ＨＣｊ！　（ｐ）Ｉ　７．５　）　、１０＋ｅＭ　Ｍ ｇＣｊ！　ｚ、１ｍＭジチオスレイトール〕。

この反応混合物を０．６％アガロース・ホリゾンクル・スラブゲルを用い、１０ ０アンペア、２時間の電気泳動を行った（０．０４Ｍトリス・アセテート、０． ００２Ｍ　ＥＤＴＡ）。

１パーセントのエチジウム・ブロマイドによる染色により、３個のＨＢＶ　ＤＮ Ａ断片が確認され、このことは、このゲノム中に２個のＢａｓ＋ＨＩ制限部位が あることを示している。３２００塩基対（ｂ　ｐ）の断片は、ＢａｍＨ１部位の １つのみでの切断の結果として得られる、線状の全ＨＢＶゲノムを示している。

１８５０ｂｐ及び１３５０ｂｐの断片は、完全ＢａｍＨＩ消化の結果として２つ の断片に切断されたゲノムを示している。

このようにして単離された３個のＢａｍＨＩ　ＨＢＶ　ＤＮＡ＠限断片のコピー は、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）におけるクローニングによ って得られる（スフリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）（１９７８）プロシーディング ・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　（Ｐ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、１立、３７３７−３７９１）、ＨＢＶ　ＤＮＡの ＢａｍＨＩ断片をｐＢＲ３２２に挿入するため、このプラスミドをＢａｍＨＴで 消化して線状化しく５０ｍＭ　ＮａＣｆ、１０ｍＭ　）リス・）ＩＣｊ！　（ｐ Ｈ７，５）　、１０＋１１ＭＭｇＣ１ｚ　、１　ｍＭジチオスレイトール）、Ｈ ＢＶ断片の末端と相補的末端を作った。３種のＨＢＶ　ＤＮＡ断片及びｐＢＲ３ ２２断片を混合し、ついでＴ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡライゲーションを行 った（６６ｍＭ）’Ｊス・ＥＣ４（ｐＨ７，６）、６’６ｍＭ　ＰＩｇＣｌｔ。

１０＋ｎＭジチオスレイトール及び０．４ｍＭ　ＡＴＰ）、上記反応で得られた ライゲーション反応産物は、線状化したｐＢＲ３２２及びＨＢＶ断片の相補的末 端の結合によって誘導された環状ＤＮＡである。

この環状組換えプラスミドを大腸菌ＨＢＩＯＩ株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６９４、Ｍ Ｄ州、ベセスダ、ＮＩＨ，国立がん研究所、ディーン・ハンター博士（Ｄｒ、　 Ｄｅａｎ　）Ｉｕｎｔｅｒ）により提供された）に、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）等 の方法に従って（（１９７２）、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデ ミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　 Ｕ　Ｓ　Ａ、　６９．２１１０−２１１４））導入した。簡単にいうと、大腸菌 ＨＢＩＯＩの培養物を、０．０３ＭＣａＣ１□の溶液中、０℃で２０分間インキ ュベートした。約５×１０９個のバクテリア細胞に０．３　和１の同溶液を加え 、さらに、１０ナノグラム（ｎｇ）の組換えプラスミドを加えた。このトランス ホーメーション反応混合物を０℃で６０分間インキユベーシッンした。

このプラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子 を含んでいる。このプラスミドでトランスホームした薬剤感受性バクテリア細胞 は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性を示す。ＰＢＲ３２２ＤＮＡは、テ トラサイクリン耐性遺伝子上にある唯一のＢａｍＨ］切断部位を有しているので 、Ｂａｍ８１部位へのＨＢＶ断片の挿入は、この遺伝子を破壊する。

それ故、Ｂａｍ８１部位に挿入したＨＢＶ切断を伴うｐＢＲ３２２由来のプラス ミド（クローニングヘクター）でトランスホームした薬剤怒受性大腸菌ＨＢＩＯ Ｉは、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン怒受性を示す。

トランスホームした大腸菌、すなわちプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子を含 むものは、そのトランスホーメーション反応混合物を、ｍ１当り５０マイクログ ラムのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（リフドル当り、１０ｇバタトアガー、 １０ｇバクトドリブトン、５ｇバクトイ−スト抽出物、（各々、Ｍｌ州、ブトロ イド、ディフコ・ラブ社）及び５ｇＮａＣＡを含有する）にブレーティングする ことにより選択した。このブレーティングした大腸菌を３７℃で２日間インキュ ベートした。

上記操作によるトランスホーメーション後、アンピシリン耐性を示すコロニーの 中から、そのコロニーを、アンピシリンの代りに、ミリリットル当り５０マイク ログラムのテトラサイクリンを含む上述のＬＢ培地にブレーティングすることに より、テトラサイクリン怒受性コロニーを選択した。このブレーティングしたコ ロニーも、３７℃で２日間インキュベーションした。テトラサイクリン耐性遺伝 子中のＢａｍＨＴ切断部位に挿入したＨＢＶ　Ｄ’ＮＡ断片を有するｐＢＲ３２ ２を含む大腸菌ＨＢＩＯＩをこのようにして得た。

３、　プラスミドＤＮＡの抽出 上述のように単離した組換えＤＮＡを含む大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞を２０マイクロ グラム／　ｍ　Ｒのアンピシリンを含むＬＢ培地中で生育させ、その対数増殖期 に１７０マイクログラム／　ｍ　Ｊの濃度となるようクロラムフェニコールを添 加する。この培養を数時間続行し、プラスミドＤＮＡを増巾する。

それから、細胞溶液５００ｍρに対し、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８，０） 中の２５パーセントスクロース溶液５顛ｌを添加し、この細胞を溶菌する。０℃ 、１ｏ分間のインキュベーションの後、０．２５Ｍ）リス・Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７， ５）中、１パーセントのりゾチーム溶液１１を加えた。０℃、１ｏ分間のインキ ュベーションの後、２ｍＡ（７）０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）を緩ヤ カニ加える。

０°Ｃ１１０分間のインキュベーションの後、０．１５Ｍ　）リス・Ｈｆ１（ｐ Ｈ８，０）　、０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）溶液中、１パーセントのト リトンＸ−１００［ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル〕溶液 ８１を加え、０℃で１ｏ分間インキュベーションする。

このン容解物を、スビンコ５Ｗ−６５０−ター（ベックマン・インスッルメント 社）中３００００ｒｐ＋ｍで遠心し、変性したタンパク質及び細胞片を除去した 。１ｏ分の１容の２．５Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５倍容の９９パーセントエタ ノールを加え、−２０”Ｃで３０分間インキュベートすることにより、透明な溶 解物からＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡの沈殿を、１１００００Ｘ、３０分間 の遠心でペレットとした。

除タンパクは、０．０１　Ｍ　）リス−ＨＣ１，（ｐＨ７，６）　、０．１ＭＮ ａＣ１及び０．００１２Ｍ　ＥＤＴＡを飽和したフェノール１ｍ４を用い２度行 なった。ランダースＣＬａｎｄｅｒｓ）等（１９７７）ジャーナル・オブ・ピロ ロジー（Ｊ、ν１ｒｏ１．）　２３．３６８−３７６゜上述の操作からできた水 層を取り出し、それ６２１０分の１容の２Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容の９９ パーセントエタノールを加え、−２０℃で３０分間インキュベートすることによ り、ＤＮＡを沈殿させた。１１００００Ｘ、１０分間の遠心により、ＨＢｘＡｇ をコードする遺伝子を含む完全に二本鎖のＤＮＡのペレットが得られた。

４、　プラスミドＤＮＡの分析 このクローン中にＨＢＶ　ＤＮＡが存在することを、サウザーントランスファー 及びハイブリダイゼーション法を用いて確かめた。サウザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒ ｎ）　（１９７５）　、モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｂ３ｏ１．） 　、９８．５０３゜上述の単離した各クローンに由来するＤＮＡ１０＋ｎｇをＢ ａ＋ｏＨＩで消化した（５０ｍＭＮａＣＩｌ、１０＋Ｍ　）リス・ｌ１ＣＩＩＣ ｐＨ７，５）　、］　ＯｍＭ　ＭｇＣＡｚ　、］＋ｗＭジチオスレイトール）。

この反応混合物を、０．６パーセントアガロースのホリゾンタルスラグゲルを用 い、１００アンペア、２時間の電気泳動を行った（０．０４Ｍトリス・酢酸塩、 ０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ＞。

ゲルを、数倍容の１．５ＭＮａＣｊ！及び０．５　Ｍ　ＮａＯＨ溶液中に室温で 浸し、一定に攪拌又は振盪することにより、ゲル中のＤＮＡを変性した。ある場 合には、このゲルを室温で０．２５ＭＨ（Ｊに１５分間、２度浸すことにより、 アルカリ変性前に酸による脱プリン化で、ゲル中のＤ　Ｎ　Ａを加水分解した６ 変性後、このゲルを数倍容のＩＭＩ−リス１ｌＣ１ｐＨ８，Ｏ）及び１．５　Ｍ 　ＮａＣ！２の溶液に室温で１時間、一定に振盪しながら浸すことにより中和し た。

基本的にはマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法（（１９８２）、ジャーナ ル・オブ・モレキュラー・クローニング（Ｊ、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ ｎｇ）コールドスプリングハーバ−）に従がい、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロ ースに移した。簡単に言うと、ニトロセルロース（オハイオ、シュレイチャー・ アンド・シュニル社、カタログ番号ＢＡ８５）をゲルの上に置き、数枚のワンド マン３ＭＭペーパーをそのニトロセルロースの上に置く。このサンドインチをゲ ル側を下にして、端を０．９　ＭλａｃＲ及び０．０９　Ｍクエン酸ナトリウム を含むバッファ中に浸したワンドマン３ＭＭウィンク上に乗せた。そうすること ムニより、バッフ７の毛細管的移動でＤＮＡがゲルからニトロセルロースに移動 する。減圧下、８０℃、２時間、焼くことにより、このＤＮＡをニトロセルロー スに固定する。

このようにして作ったニトロセルロース（サウザンフィルター）上のプラスミド ＤＮＡを、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）の方法に従がい、ＨＢＶ 　ＤＮＡ断片の存在を探った。

簡単に言うと、このサウザンフィルターを、プレハイブリダイゼーション液、０ ．９　Ｍ　ＮａＣ１，０，０９Ｍクエン酸ナトリウム、０．５パーセフ）ＳＤＳ 　Ｃラウリ）Ｌｔ硫Ｈす）　！Ｊ　ラム）　、］　ＯＯｍｇ／ｌの変性サケ精子 ＤＮＡ及び、５×デンハルド溶液（１リットル当り、１ｇのフィコール、１ｇポ リビニルプロリドン及び１ｇＢＳＡフラクシシンＶを含む）中に６８℃で４時間 浸すことにより、プレハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは 、そのサウザンフィルターを湿らすのに十分なハイブリダイゼーション溶液を含 む（フィルター〇ｃｍ”当り５０マイクロリフトル）熱シール可能な袋の中で行 った。ハイブリダイゼーション溶液は、０．９Ｍ　ＮａＣｊ！、　０．０９Ｍり ｘンｈナトリウム、０．０１ＭＥＤ丁Ａ、　５　Ｘ　テ７ハ）Ｌｔ　Ｆ？容液、 ０．５パー’ｙ７）ＳＤＳ、１ｏｏマイクログラム／　ｍ　１の変性したサケ精 子Ｄ　Ｎ　Ａ及び上述のように調製した、５Ｘ１０’ｃｐｓの放射活性ラベル化 ＨＢＶ　ＤＮＡを含んでいる。サウザンフィルターを、このハイブリダイゼーシ ョン溶液中、６８℃で１２時間インキュベーションする。

このフィルターを２時間、洗浄Ｌ　タａ　（０，３Ｍ　ＮａＣ１，０，０３Ｍク エン酸ナトリウム）、このフィルムでＸ線フィルムを怒光させ、オートラジオグ ラムを得た。

上述の方法により、３個の組換えプラスミドを単離し、ＡＭ６゜ＡＭ７及びＡＭ Ｉと命名した。ＡＭ６は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ及び全ＨＢＶゲ／、１．を含む、 ＡＭ７はｐＢＲ３２２ＤＮＡ及び１３５゜ｂｐ　（７）ＨＢＶ　ＤＮＡ断片を含 む、ＡＭｌはｐＢＲ３２２ＤＮＡ及びＨＢｘＡｇをコードする遺伝子を含む１８ ５０　ｂｐのＨＢＶＤＮＡ断片を含んでいる。

５、ＳＶ４０／ＨＢｘＡｇ発現ベクターＤＮＡを含む複製プラスミドの構築 ゾーン・ヘイマー（Ｄｅａｎ　）ｌａｍｅｒ）　（上述）から入手した欠損５ｖ ４０ウイルスを５０＋ｅＭ　ＮａＣ１，１０ｉＭ　ト’）ス・ＨＣｆ　（ｐＨ７ 、５）　、１０ｉＭ　ＭｇＣＡ　２及び１ｍＭジチオスレイトールを含むバッフ ァ中、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより切断した。プラスミドｐＢＲ３２２を、 先に議論したように二重切断し、同様に切断した５Ｖ４０ＤＮＡと相補的な末端 を作った。これら各々の消化切断産物を塩化セシウム密度勾配遠心により分離及 び精製した。タナ力（Ｔａｎａｋａ）等、（１９７５）、ジャーナル・オプ・バ クテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１２上、３５４−３６２゜コ ノようにしてｊｆＬ離した４　４９２　ｂｐのＳ　Ｖ　４０断片及び３９８７　 ｂｐのｐＢＲ３２２断片を、６６＋ｎＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）　、６ ．６ｍＭ　ＭｇＣｊｚ　、１０＋ｎＭジチオスレイトール、及び０．４ｍＭＡＴ Ｐを含むハ′ソファ中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼでＤＮＡライゲーションを行ない 、ｐＢ　ＲＳ　Ｖを作った（第４図）。

上述反応でできたライゲーション反応産物は、各々の相補的ＥｃｏＲ１及びＢａ ｍＨＩ末端で結合した、線状ｐＢＲ３２２の３９８７ｂｐ及びＳＶ４０の４４９ ２　ｂｐの断片から誘導された環状ＤＮＡである。それから、この環状プラスミ ドを、各末端にＢａｍＨＩ粘着末端を作るライゲーションの際に生成したＢａｍ ＨＩ制限部位で切断することにより線状にした。

ＨＢｘＡｇをコードする遺伝子は含む１８５０　ｂｐのＨＢＶＤＮＡ断片は、上 述のようにして単離したプラスミドＡＭ６を、５０ｍＭ　ＮａＣ７！、１０＋ｅ Ｍ）リス・ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＦ′ＩｇＣ６，及び１ｍＭジ チオスレイトールを含むバッファ中のＢａｇＨｌで切断することにより単離した 。この反応混合物を０．８パーセントのアガロースを用いた、１００アンペア、 ２時間の電気泳動にかけ、１８５０ｂｐのバンドを切り出して、１５分間６８℃ で融解した。１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、ついで、その溶液を先 に説明した除タンパク操作をほどこした。

このようにして単離した、ＨＢｘＡｇ遺伝子を含む）ＩＢＶ　ＤＮＡ断片はＢａ ａＨＩの相補的末端を有している。さらに、このＤＮＡ断片を、６６＋ｎＭ）リ ス・ＨＣｌ２　（ｐＨ７，６）、ｍＭＭｇｃＡｚ　、１０ｍＭジチオスレイトー ル及び０．４ｍＭＡＴＰを含むバッファ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、先に 調製したｐＢＲ−３Ｖにライゲーションした。

上記ライゲーション反応産物は、ＳＶＡＭＩ　９１と命名した、環状プラスミド ＤＮＡである。それは、右回りの順に、塩基位置２４６８番のＢａ＋ｎＨ１部位 から、塩基位２１７１７のＥｃｏＲ１部位までの、４４９２ｂｐ　（ＺＩＳＶ４ ０ＤＮＡ断片、塩基位置０番のＥｃｏＲＩ部位から、塩基位置３７５番のＢａｍ Ｈ１部位までの、３９８７　ｂｐのｐＢＲ３２２ＤＮＡ断片、及び塩基位置１４ ００番のＢａｍＨ１部位から、塩基位Ｗ２８番のＢａｍＨ１部位までの、１８５ ０ｂｐのＨＢＶ　ＤＮＡ断片を含んでいる。プラスミドＳＶＡＭ１９１の図を第 ４図に示した。

上述のトランスホーメーション操作を用い、ＳＶＡＭ１９１を大腸菌ＨＢＩＯＩ に導入した。また、これらのトランスホームした大腸菌はアンピシリン耐性でテ トラサイクリン感受性なので、それらを、大腸菌クローニングベクターに対して 説明したものと同じ単離操作にかけた。先に述べた産生、単離、精製及び分析操 作は、実質的に純粋なＳＶＡＭＩ　９１　ＤＮＡをミリグラム量得るのに使用さ れた。

６、ＳＶ４０／ＨＢｘＡｇ発現ベクターの構築真核細胞中でのＨＢｘＡｇの産生 を誘導することができるベクターを、ＳＶＡＭ１９１　ＤＮＡの一部を切り出す ことにより作つた。これは１０閣Ｍトリス・ＲＣＩ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍ Ｍ　ＭｇＣ４ｚ及び１＋ａＭジチオスレイトールを含むバッファ中、Ｈａｅｎエ ンドヌクレアーゼでＳＶＡＭ１９１を消化し、５Ｖ４０ＤＮＡ中の塩基位置７６ ７番及びＨＢＶＤＮＡＳｉ域中の塩基位１１１１！１４３７１のＨａｅｎ部位で ＳＶＡＭＩ　９１を切断して作った。

上記反応から得た、２つのＤＮＡ断片を、先に説明したアガロースゲルでの電気 泳動操作で分離した。このようにして得られた、ＳＶ４０及び）（ＢＶ　ＤＮＡ のみを含む大きい方の断片を、そのＨａｅｎ相補末端に対する、先に述べたＴ４ ＤＮＡライゲーショ、ン操作によ２り環状化した。

このようにして生成した環状ＤＮＡ発現ベクターを、５ＶＨＢシー３と命名した （第４図及び第５図）。これはＳＶ４０由来の発現コントロール要素及びＨＢＶ 由来のＨＢχＡ、をコードする遺伝子を含んでいる。

７、　３ＶＨＢＶ−３による真核宿主細胞のトランスフェクションＢ５Ｃ−１ア フリカミドリザル腎細胞系列（ＡＴＣＣＣＣＬ２６；カリホルニア州うジョラ、 ジョンソン・アンド・ジョンソン・バイオテクノロジー・センター〇〇、　Ｂ、 ソーントン（Ｔｈｏｒｎ　ｔｏｎ）　博士から入手した）、（ＳＶ４０に対する 許容宿主）を５ＶＨＢＶ−３によるトランスフェクション用に選択した。約１０ ’個の細胞からなる集密性単層を、１０％ウシ胎児血清、＋＋ｉ当り１００ユニ ツトのペニシリン、１００マイクログラム／ｌａｎのストレプトマイシン及び３ ｍＭ２−グルタミンを補った、イーグル最小基礎培地（ＥＭＥＭ）中、３７℃で 培養することにより作った。この単層を、ガネム（Ｇａｎｅｓ）等（１９７６） 、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、）、１１上、５７−８３）により報告されたように、ＤＥＡＭ−デキストラン 存在下で、ベクター５ＶＨＢＶ−３ＤＮＡで感染した。

１つのフラスコは、ヘルパーとしての、０．０５マイクログラムのＳ　Ｖ　４０ 　ｔｓＡ　ｔ３ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａと一緒に、１．６マイクログラムの組換え５ＶＨ ＢＶ−３で感染させた。コントロールは、同量のベクターヘルバＤＮＡのみを使 用した。この培養物を４０’Ｃで１２日間、インキユベーションし、それから、 凍結−融解によって溶菌し、−７０℃で保存した。

２Ｆｇの細胞粉体に、まず１ｗ１のタンパク質抽出バッファ〔２パーセント・Ｓ ＤＳ、１０パーセント・グリセリン、０．０８Ｍトリス・ＨＣｆｆ　（ｐＨ６， ８）　、２＋ｏＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、０．１Ｍジチオスレ イトール、０．００１パーセントブロモフエノールブルー〕を加えることにより 、上述のようにして得た凍結融解細胞粉末から、細胞性タンパク質を抽出した。

それから、この溶液を５分間煮沸し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、 それから上清を回収した。

１００マイクログラムのサンプルタンパク質を提供するのに十分な量の上滑を、 以下に説明するウェスタンプロット操作の５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動にかけた。

８、ポリペプチド合成 本発明のポリペプチドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）等（（１９ ６３）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ−（Ｊ、　Ａｓ ｈ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、）　８５．２１４９）、メリフィールド（Ｍｅｒｒ ｉｆ　１ｅｌｄ）等（（１９７０）、アニュアル・レヴユー・オブ・バイオケミ ストリー（Ａ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　３９．８４１−８６６＞及び ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）等（（１９８０）、インターナショナル−ジャー ナル・オプ・ペプチド・アンド・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔ、　Ｒｅｓ、）１６，３１１−３２０）により報告されて いる、固相法によって化学合成した。ここで用いられる比較的短いポリペプチド は、ＨＢｘＡｇの抗原決定基に対応している。第６図は、ＨＢｘＡｇの１５４個 のアミノ酸残基配列を示している。ここで示されている好ましい合成ポリペプチ ド（９９，１００及び１４２）のアミノ酸残基配列も、第６図に示した。

再合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析により確認した。

−穀に、免疫原又は合成ポリペプチドは、ＨＢｘＡｇの抗原決定基ドメインのア ミノ酸残基に対応する、適当に保護した多くのアミノ酸の提供及び、その抗原決 定基のポリペプチドのアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を有するポ リペプチドに、それらのアミノ酸から合成するステップによって作られる。生成 した合成ポリペプチドは、通常それをキャリヤーに結合することにより結合体を 作り、さらに、その効果量を、生理学的に許容しうる希釈剤に分散させることに より接種物を作るのに用いられる。

このポリペプチドは、システィン樹脂を用いる、先に引用した固相法で合成する のが好ましい、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ）等、ジャーナル・オ ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ−（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ＋ｅ、　Ｓ ｏｃ、）　（上述）参照、この方法を用いるときは、一般的にアミノ酸を成長す るポリペプチド鎖に付加する前に、各アミノ酸のアルファ・アミノ基を三級ブト キシカルボニル（１−ＢＯＣ）基で保護しておく。それから、次のアミノ酸を、 成長するポリペプチド鎖に付加する前に、このｔ−ＢＯＣ基をはずしておく。個 々のアミノ酸の側鎖は、次のように保護しておく。Ａｒｇ−トシル基、５ｅｒ− 、７ｈｒ　、　Ｇｌｕ−及びＡｓｐ−○−ベンジル基；ｔｙｒ−０−ブロモベン ジロキシ・カルバミル；　Ｔｒｐ　−Ｎ−ホルミル基ニジスティンはＳ−メトキ シベンジル基；リジンは２−クロロベンゾキシカルボニル基；及びヒスチジンは 、ジニトロフェニル基、アスパラギンを用いたときには、保護したアミノ基とと もに、等モルのＮ−ヒドロキシ−ベンズトリアゾールを加え、結合溶媒にジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いる。　Ｔｒｐ残基のＮ−ホルミル基は、樹脂サ ポートからポリペプチドを切り出した後に、１ミリグラム／ミリリツトルのポリ ペプチド濃度に対し、１モル濃度の重炭酸アンモニウムで室温、１，６時間の処 理を行うことにより除去する。ヤマシロ（Ｙａｍａｓｈ　１ｒｏ）等、（１９７ ３）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈ ｅｗ、）　３８．２５９４−２５９７゜各ステップでの結合効率は、ニンヒドリ ン又はピクリン酸によってモニターすることができ、全ての場合において９９パ 一セント以上であることが望ましい、ギジン（Ｇｉｓｉｎ）（１９７２）アナリ ティカル・ケミストリー・アクタ（Ａｎａｌ。

Ｃｈｅｓ、　Ａｃｔａ、）、５８，２４８−２４９及びカイザー（Ｋａｉｓｅｒ ）（１９８０）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　３４．５９５−５９８参照。

望ましいポリペプチド合成後、生成した保護されたポリペプチドの一部（約１グ ラム）を、２ミリリツトルのアニソールで処理し、ついで約２０ミリリツトルの 無水フン化水素を、ドライアイス温度の反応容器中に凝縮させた。この混合物を 、約４℃で約１時間攪拌し、保護基を切り離し、かつ樹脂からポリペプチドを切 り出す、窒素気流を用い、４℃でフン化水素をエバボレートした後、残金を無水 ジエチルエーテルで３回抽出して、アニソールを除き、ついで、この残金を減圧 下で乾燥した。

この真空乾燥した物質を、５％酢酸水溶液で抽出しく５０ミリリツトル３回）、 樹脂から遊離したポリペプチドを分離する。この抽出物含有溶液を凍結乾燥する と、非重合未酸化ポリペプチドが得られる。

簡単に言うと、各ポリペプチドに対する、一般化した操作としては、１０ミリリ ツトルの１０ミリモル濃度リン酸ナトリウムバッファ　（ｐＨ７，２）中、４ミ リグラムのＫＬＨを、ＤＭＦに？容かした０６７ミリグラムのＭＢＳと反応させ 、生成した混合物を室温で３０分間攪拌する。ＤＭＦＩ度が約３０％以上になる と、ＫＬＨが不溶性になるので、ＭＢＳ溶液を滴下して加えることにより、局所 的なりＭＦ濃度が高くなりすぎないようにする。５０ミリモル濃度のリン酸バフ ファ（ｐＨ６，０）で平衡化したセファデツクスＧ−２５（ＮＪ州ピスカタウェ イ、ファルマシア・ファイン・・ケミカルズ社）で製作したクロマトグラフィー カラムに反応産物であるＫ　Ｌ　Ｈ−ｘｑ　Ｂを通し、遊離のＭＢＳを除去した 。２８０ナノメーターでモニターした、カラム溶出物のピークフラクションから のＫＬＨの回収は、典型的には約８０％である。

このようにして調製したＫＬＨ−ＭＢを、１ミリリツトルのバッファに溶かした ５ミリグラムのポリペプチドと反応させる。この反応組成物ＯｐＨ値を７〜７． ５に調整し、ついで、この反応組成物を室温で３時間攪拌して、ポリペブチトー キ中リヤー結合体を作った。

９、　ウェスタン・プロッティング 抗ポリペプチド抗体（抗９９、抗１００及び抗１４２）をウェスタン・プロット 技術を用い、それらの予期されるＨＢｘＡｇに対する特異性の有無及び、トラン スフェクトした細胞におけるＨＢｘＡｇの実質的ポリペプチド部分の発現の有無 を確かめた。

ＨＢｘＡｇを含む細胞性タンパク質を、１２．５パーセント５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により分離した。レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　（１９７０ ）ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２７７．６８０−６８５ｉ及びトウービン（ Ｔｏｗｂｉｎ）等（１９７９）、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　 ＵＳＡ＋工立、４３５０−４３５４参照。

トウービン（Ｔｏｗｂｉｎ）等（上述）により報告されているように、２５ｍＭ ）リス−ベース、１９２＋Ｍグリシン、２０パーセントメタノール及び０．１パ ーセントＳＤＳ　（ｐＨ８，３）を含むバッファを使ったエレクトロプロット装 置（フロリダ州、ジャクフンビル、Ｅ、Ｃ，アパレイタス社）を用い、タンパク 質を電気泳動的に、ニトロセルロース（シュレイチャー・アンド・シュニル社、 カタログ番号ＢＡ８５）に移した。この転移につづいて、ニトロセルロースをＢ ＬＯＴＴＯＣボビン・ラクト・トランスファー・テクニックオプチタイザー、ジ ョンソン（Ｊｏｈｏｎｓｏｎ）等、（１９８３）、ジャーナル・オプ・エクスペ リメンタル・メディシンＵ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、）　１５９．１７５１−１７５６；５％（Ｗ／Ｖ）脱脂粉乳；０．０１ ％消泡剤Ａ（シグマ、カタログ番号Ａ３７５Ｂ）及び０．０００１％メルチオレ ート（シグマ、カタログ番号５１２５）のＰＢＳ（ｐＨ７，２＞溶液）中でブロ ックし、非特異的結合を減少させた。このブｔ）７トを、１０＋ｎｊ！（７）Ｂ ＬＯＴＴＯ中、１００マイクロリツトルの抗ペプチド抗体と３時間反応させてか ら、新鮮なりＬＯＴＴＯ５０ｓＪ！を用いて、１時間の洗浄を３回行った。

ベクター特異的タンパク質に結合した抗ポリペプチド抗体は、そのプロットを、 １０ミリリツトルのＢＬＯＴＴＯ中、２０マイクロリツトルの１２５１ラベルし たスタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅ ｕｓ）のプロティンＡと１時間反応させることにより検出した。それから、この プロットに対し、新鮮なりＬＯＴＴＯ５０ミリリットル中、１５分間の洗浄を４ 回行った後、さらに流水中で２０分間洗浄した。

１０、肝臓ガン腫細胞抽出物の１２％　ｌによるラベル化ＨＢＶの配列が組込ま れていることが分っているヒトの肝臓がん腫由来の細胞系列ＰＬＣ／ＰＲＦ１５ 　（アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）等、（１９７６）アフリカン・メデ ィカル・ジャーナル（Ａｆｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊ、）　５０．２１− ２４；ＡＴＣＣＣＲＬ８０２４）の単層を凍結乾燥した。この細胞粉末を、リン 酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶かし、ｌ　ｍｇ／ｍＪのタンパク質濃度とした。

１１００００Ｘの遠心を行ない、細胞片を除いた後、上記溶液５０ミリリツトル を、７５ミリリツトルのＲＩＰＡ（０，１５ＭＮａＣ！１１０ｓＭリン酸ナトリ ウム（ｐＨ７，５）、１％ノ二デッドＰ−４０，０，５％デオキシコール酸ナト リウム、０．１％５ＤＳ）及び２０マイクロリツトルの０．２Ｍリン酸ナトリウ ム（ｐＨ７，５）と混合した。ある実験においては、このようにして可溶化した 細胞タンパク質を、クロラミンＴ反応を用い、５ミリキニーリーの＋ｚｓ１でラ ベルした。第７図に示した実験では、この細胞溶解物を、同反応を用い、３マイ クロキユーリーの１２′Ｉでラベルした。

上記反応混合物を、ＰＢＳで洗浄したセファデックスＧ−２５（ＮＪ州ビスカタ ウェイ・ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社）カラムに通した。得られた放 射性ラベルされたピークフラクション（９Ｘ　１０　ｃｐｍ／＋ｎＪ　）を、正 常なウサギの血清とブレインキュベートし、非特異的結合を除いた。簡単に言う と、２０マイクロリツトルのピークフラクションを１．ＯｍＡのＲＩＰＡ、２０ マイクロリツトルのトラシロール（１９８４年２月のカタログ頁１６３、シグマ の、プロチニンの登録商標）及び１００マイクロリ、トルのＮＲ３と混合した。

０℃、１時間のインキュベーションの後、ホルマリン固定したスタフィロコッカ ス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　（スタフ（ Ｓｔａｐｈ）　Ａ　；　ＣＡ州、ラジョラ、カルバイオケム社）細胞、５００マ イクロリンドルを混合し、この混合物を、０℃、３０分間インキュベーションし た。スタフＡの沈殿を、１００００．Ｘｇ、１０分間の遠心で除いてから、上滑 を回収した。

１１、免疫沈殿化（Ｉ　Ｐ） ポリペプチド９９に対する、ウサギの抗ポリペプチド抗血清（抗９９）を、先に 得られた放射性ヨウ素ラベルした細胞タンパク質と反応させた。簡単に言うと、 抗９９１０マイクロリツトルを２Ｘ１０’ｃｐＩｌｌのラベル化した抽出物と混 合してから、０℃で１時間インキュベーションし、さらにスタフＡ４０マイクロ リツトルを混合して、０℃３０分間、インキュベーションした。スタフＡの沈殿 を１００１００００Ｘ分間の遠心により、除いて、そのペレットを回収した。こ のペレットを１ｍ＃のＰＩＰＡ！：Ｑ。

濁し、再度同様の遠心を行った。生成したベレットを１．０＋ｏｆのＬｉＣｊに 溶液（１００ｍＭ）リス・ＨＣｊ！、　５００ｍＭ　ＬｉＣＪ）に＠濁し、再び 遠心した。このＬｉＣｌ溶液処理を繰り返し、そのペレットを回収した。

上述のベレットを、５０マイクロリツトルのサンプルバッファに懸濁し、３分間 煮沸した。この混合物を１ｏｏ６ｏｘｇで１分間遠心し、その上清を回収し、１ ２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。このゲルでＸＲＰ− ＬＸ線フィルムを感光し、オートラジオグラフを得た。

１２、チノパンツー及びヒトの肝細胞抽出物の調製及び検定２匹のＨＢＶ慢性悪 染チノパンツー及び１名のヒト及び正常なチノパンツー及びヒ）　（ＨＢＶ血清 陰性）の肝臓のサンプルを液体窒素中で急速冷凍し、粉末になるまですりつぶし た。この粉末をサンプルバッファ　（０，０６２５Ｍ）リス−ＨＣ１（ｐＨ６， ８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、５％メルカプトエタノール及び０．００ １％ブロモフェノールブルー）と混合し、５分間煮沸した。

この混合物を１１００００Ｘで３０分間遠心し、細胞片を除いた。

それから、このサンプルをレーン当り７５マイクログラムのタンパク質を用いて 、先に述べたウェスタンプロット分析した。

１３、ヒト血清中の抗ＨＢｘＡｇ抗体の同定レーン当り２０マイクログラムの５ ＶＨＢＶ−３惑染Ｂ５Ｃ−１細胞抽出物を１２％アクリルアミドゲル電気泳動に かけ、分画したタンパク質を先に説明したように電気泳動的にニトロセルロース シートに移した。このニトロセルロースシートを症状保有者、及び肝臓がん腫を もつ患者を含む、ＨＢＶ関連の感染を受けていると診断されている６名のヒト由 来の血清の５０分の１希釈物と混合した。コントロールシートは、本発明のウサ ギ抗ポリペプチド抗体と混合した。

このニトロセルロース−タンパク質血清混合物を室温に２時間維持した。さらに 、このシートを洗浄し、適当なホースラディツシュパーオキシダーゼに結合した ヤギ抗ヒト又は抗ウサギ抗体の２００分の１希釈物と混合した。この混合物を、 結合した抗Ｘ抗体が適当な抗抗体と反応するのに要する１時間、維持した。この シートを洗浄してから先に述べたように４−クロロ−１−ナフトールを用いて展 開した。肝臓がん腫をもつ患者からの血清は、５ＶＨＢＶ−３怒染細胞により発 現する約２４０００ダルトンのポリペプチドとの強い免疫反応性を示した。

１４、細胞系列及び組織サンプル ＰＬＣ／ＰＲＦ１５及びＨｅｐＧ２細胞は、ＣＡ州、ラジョラ・スクリブス・ク リニック・アンド・リサーチ・ファンデーション（スクリブス）基礎及び臨床研 究科のり、ミリク（Ｍｉｌｉｃｈ）博士から入手した。チンパンジーの肝臓組織 は、各々、ＭＤ州ベセスダ、国立アレルギー及び伝染病研究所及び、ＮＪ州シラ リタンオルト・ダイアグノスティクス社のＲ，バーセル博士及びＰ、カブラン（ Ｍａｐｌａｎ）博士から入手した。ヒトの肝ｎｕ織は、各々、ＭＡ州ボストン、 バーバード大学、医学部及びＣＡ州ラうョラ、カルホルニア　サンディエゴ大学 の小児科のＦ、チサリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）博士、Ｊ、ジーンスタブ（Ｄｉｅｎｓ ｔａｇ）博士及びスクリプスのＡ、ユ（Ｙｕ）氏から入手した。

例。

１、抗ＨＢｘＡｇ抗体（ＨＢｘＡｂ）を検出するための診断システムの製造及び 使用 ポリペプチド８．４２．７９．９９．１００及び１４２（ここではｐ８、ｐ４２ ．ｐ７９、ｐ９９、ｐｌｏｏ及びｐ１４２とも呼ばれる）をハーゲンマイヤー（ Ｈａｇｅｎｍｅｉｅｒ）等（ホブーセイシーズ、Ｚフィジオロジカル・ケミスト リー（Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’　ｓＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋１１ ．）、３５３．１９７３−１９７６　（１９７２））の方法に従がい、アブライ ドバイオシステムズ社（Ｃｌ州、フォスクーシティ−）モデル４３０Ａ、固相ペ プチド合成機を用いた、対称無水物化学によって合成した。

各ポリペプチドを、１ミリグラム／ミリリツトル（ｍｇ／ａ＋　ｐ　）の濃度と なるように脱イオン水（ｐＨ６）に溶かした。１マイクもしくはｐ１４２を含む ｐＨ９の１０ミリモル濃度（＋ｅＭ）ホウ酸ナトリウム１００マイクロリットル （μｌ）を９６穴のＥＴＡマイクロプレート（Ｃｌ州、ヴアンナイス、コスタ− 社）に入れた。それからこのプレートを、３７℃に１時間維持し、そのバッファ をエバボレートさせ、かつポリペプチドをウェルの壁に吸着（固定）させた、そ の後１０％の正常なウマ血清、５％正常なりギ血清、５％ウシ胎児血清及び０． ０５）ウィーン２゜を含むＴ−ウォッシュ（トリス緩衝液、：５０ｍＭ）リス塩 基、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，６）　３００　、Ｉｆ　Ａを各ウェルに加 え、過剰のタンパク質結合部位をブロックした。

ソノウェルを、３７℃に２時間維持し、このブロッキング溶液を振ることによっ て取り除き、ついで、それらを、３７℃に１時間維持することにより、ウェルを 乾燥して、本発明の診断システム、すなわち、ＨＢｘＡｇ関連ポリペプチド含有 固体サポート（ポリペプチドコートウェル）を作った。

このポリペプチド含有固体サポートは、種々のヒト血清中のＨＢｘＡｂの存否及 び存在量を調べるＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法を行うときに用いられた。Ｔ−ウォッシ ュで５０倍に希釈した各血清１００μｌをポリペプチドコートウェルに入れた。

この固液相免疫反応混合物を３７℃に２時間維持し、ポリペプチド含を免）　疫 反応産物を形成させた。それからこのウェルを０．０５％トゥイーン２０を含む ＰＢＳで４回すすぎ、脱イオン水（ｐＨ６）で最後に１度すすぎ、こうすること によって、ポリペプチド含有（固相）免疫反応産物を未反応ヒト抗体から分離し た。

Ｔ−ウォフシュで５０００倍に希釈したホースラデソシュ・パーオキシダーゼラ ベルしたヤギ抗ヒトＩｇＧ　（ＮＨ州、ラリタン、オルト・ダイアグノスチンク ・システムズ社）３００μｌを各ウェルに入れた。このラベル化反応混合物（第 ２固液相混合物）を１時間３７℃に維持し、ポリペプチド含有（固相結合した） ラベル化免疫反応産物を形成させた。これからこのウェルを先に述べたように洗 浄し、未反応のラベル化抗体を除いた。

さらに、１００μｌの０−フェニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ）を各ウェルに添加し 、発色反応混合物を作った。この発色反応混合物を３０分間約２０℃に維持した 後、５０μｌの４ＮＨ，ＳＯ。

を各ウェルに加えて、この発色反応を停止し、ついで、この溶液を、マイクロプ レートリーダーを用いて４９０ナノメーター（ｎｍ）の吸収を測定した。

２、ＨＢｘＡｂの存在を検出するためのＥＬ　Ｉ　ＳＡ法全部で１３０個の血清 サンプルについてＥＬ　Ｉ　ＳＡシステム及び例１で説明した方法を用い、ＨＢ ｘＡｂの存在を検定した。

このサンプルを収集時の患者の診断によりグループ別けした。

ＨＢＶによって慢性的感染を受けている患者に由来する全ての血清サンプル（Ｈ ＢｓＡｇ陽性）は、日本の東京から入手したものである。正常な血清は、Ｃｌ州 、ラジョラ、ゼネラル・クリニカル・リサーチ・センター（ＧＣＲＣ）スクリブ スクリニックから入手した。急性のへパチチスＢ血清サンプルは東京及びラジョ ラの両方に由来する。この血清サンプルを急性へバチチスＢ　［ＡＨ（Ｂ）　） 　、アシントマチンクキャリャ−（Ａ　Ｓ　Ｃ）；慢性へパチチス（ＣＨ）；肝 細胞がん腫（ＨＣＣ”）又は正常に分類した。

第１表は、各Ｘポリペプチドを用いて検定した血清サンプルを用いて得られた結 果のまとめである。もし、サンプルが１つ以上のポリペプチドと反応したなら、 正の値が記録される。

第１表 診断曹　検定サンプル　１つ以上のポリペプチド　割合２との反応性 ＡＨ（Ｂ）　２１　０　０ ＡＳＣ２６７２６，９ Ｃａｌ　２６　８　３０．７ ＨＣＣ２１１８８５，７ １、スクリーンサンプル収集時の患者の診断；ＡＨ（Ｂ）＝急性へパチチスＢ； ＡＳＣ＝アシンプトマチンクキャリャ−、ＣＨ−慢性へバチチス；　ＨＣＣ＝肝 臓がん腫；正常＝過去にＨＢＶ怒染が検出されない（ＨＢｓＡｂ陰性）。

２、少なくとも１つのポリペプチドに陽性の結果をもつ血清の各カテゴリーの割 合 第１表にみられるように、検定した２１個の急性血清サンプル中にはＨＢｘＡｂ は検出されなかった。はぼ同様の陽性サンプルをアシンブトマチック及び慢性キ ャリヤーグループ（各々２６．９％及び３０．７％）が含んでいた。肝臓がん腫 グループ（ＨＣＣ）由来のサンプルのうち有意な数のものがＨＢｘＡｂを含んで いることが分った。ＨＣＣグループ内の陽性サンプル数の高さは、ＨＣＣをもつ 患者に由来する１７個の血清のうち８個がペプチド１００−１１５及び１４４− １５４と反応するという過去の研究と一致した〔モリアティー（Ｍｏｒｉａｒｔ ｙ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２２７．４２９−４３３　（１９８ ５））ＨＢｘＡｂ陽性の全てのサンプルは同様にＨＢｓＡｇ陽性でもあった。Ｈ ＢｅＡｇ　／ＨＢｅＡｂの値は、ＨＢｘＡｂの予測に何の役にも立たなかった。

つまり、その陽性サンプルの約３分の２が、ＨＢｅＡｂ陽性であった。

陽性サンプルの吸光度（Ａ４．。）を第２表に示し、各血清サンプルの抗体応答 が依存するポリペプチドを表示している。

第２表 ヒト血清におけるＨＢｘ抗体の検出 ＤＸ’　ｍ”　皿Ｌ　皿　Ｐ７９　崖　盟　皿ＡＳＣ２１００，４７８ ＡＳＣ２１６０，２５Ｂ　０．３０６　０．３２７ＡＳＣ２２００，５６７ ＡＳＣ２３０１，１６７０，４８４０，８４３ＡＳＣ２３１０，４９０ ＡＳＣ２３９０，３０３ ＡＳＣ２４５０，６２７ ＣＨ２０４０，４７８ Ｃ）ｌ　２１２　０．２０３’　０．４０２　０．３５６　０．５０？　０．３ ３３　０．４２４ＣＢ　２１３　０．２９４　０．２６９ＣＨ２１９０，３４８ ０，５４９０，４８３０，２３５０，２０６０，３２５ＣＨ２２３０，２７７０ ，３４９ ＣＨ２３４０，３００ ＣＢ　２５３　０．５２１　０．３２８ＣＢ　２５０Ｂ　Ｏ，３９３０，９６４ １，００６０，４５７０，６１４０，３１１ＨＣＣ２５７Ｂ　Ｏ，２８６０，４ ０２０，４４５０，４７６０，６５０ＨＣＣ２５８Ｂ　Ｏ，３６９０，５１？　 ０．３０４　０．３１８　０．４０７ＨＣＣ２５９Ｂ　Ｏ，３１２０，５２８０ ，６２８ＨＣＣ２６０Ｂ　Ｏ，２９２０，４７７０，２９０ＨＣＣ２６１Ｂ　Ｏ ，３６５０，３４４０，４６５０，３４７０，３２５ＨＣＣ２６３Ｂ　１．１？ ６　０．３０９　０．４９４）１ｃｃ　２６５ＢＯ，３１４０，２７Ｂ　０．３ ５７　０．２７１ＨＣＣ２６６Ｂ　０．３５５　０．４００　０．６１０　０． ５２０　０．７４９ＨＣＣ２６７Ｂ　Ｏ，５８６０，６０７０，７４９０，５１ ６０，６４３０，３４８ＨＣＣ２６ＢＢ　Ｏ，４７２０，２５５０，５１２０， ３２８０，８８３０，２４８ＨＣＣ２６９Ｂ　１．１２６　０．３４６　０．６ ００　０．４１１　０．８４５　０．２４７ＨＣＣ２７ＯＢ　２．０４７　０． ３２４　０．２９２ＨＣＣ２７１Ｂ　Ｏ，３６３０，４０９１、サンプル収集時 の患者の診断； ＡＳＣ＝ＳＣニアシンブトマチックキャリヤー＝慢性へバチチスＢ、ＨＣＣ−肝 臓がん腫 ２、血清受理番号 ３、ＥＬＩＳＡ法で固相抗原として用いたポリペプチド４．４９０ｎｍで測定し たＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で得られた吸光度の値第２表はＡＳＣグループにおける）（ ＢｘＡｇ特異性が）（Ｂχタンパク質のアミノ酸残基７９〜１３１の間、７９− ９９ＳＪｉ域、すなわちポリペプチド７９のまわりの′ホットスポット′と共に 存在することを示している。おもしろいことに、肝臓傷害のあった（ＣＨ及びＨ ＣＣグループ）ヒトからの血清サンプルは、全タンパク質をカバーする特異性を 存するＨＢｘＡｂを含んでいた。すなわち、これらのサンプルのほとんどが、６ 個すべてのペプチドと反応した。この知見の有意性は未だ不明であるが、おそら く、ＨＢｘＡｇが、病気の段階によって１，１つ以上の構造をもつことを暗示し ている。

３、急性へバチチスＢ血清の継続サンプルのＨＢｘＡｂ検定急性ＨＢＶ怒染の患 者〔第１表中ＡＨ（Ｂ））由来の、特定のグループの血清サンプル中に検出量の ＨＢｘＡｂがないことは、このグループからの２６個の分析サンプルが、ＨＢｘ Ａｂを検出するには感染の早すぎる時期に収集されてしまっているのか、又は事 実、抗体の出現がＨＢＶの慢性感染を反映しているのかを決める実験を示差して いる。継Ｖｔ血清サンプルを、ＨＢＶで惣性感染した４名のヒトから入手した。

サンプルの収集の時点は、症状の出現で始められ、ＨＢｓＡｂの出現まで続けた 。例１で述べたようにポリペプチド７９．９９及び１００を用いたＥＬ　］　Ｓ Ａ検定法により、その継続サンプルについて、ＨＢｘＡｂの存否を調べた。

全ての４つのサンプル群は、嘗性怒染のすべての段階でＨＢｘＡｂ陰性であった 。しかし、実質的なＨＢｘＡｂｉ！検出されなかったが、急性ＨＢＶ惑染感染来 のマーカー、すなわち、ＨＢｓＡｇの早期検出、６ケ月にわたるＨＢｓＡｂへの 血清転換、ＨＢｅＡｂの検出によって証明される、突然のウィルス削減などが観 察された。従って、もし、Ｘタンパク質がこのウィルスの複製段階で発現される なら、この時点では分らないが、上述のデータは、ＨＢｘＡｂの出現は、慢性１ （ＢＶ感染とより密接に関連していることを示している。

これらの実験において、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｓＡｂレベルは、ピアス（〜’ｙａ ｓ）等（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、上１工、３３２−３３３　（１９７ ０））の方法に従かう能動的へマグルチネーション法によって測定した＊　ＨＢ 　ｅ　Ａ　ｇ及びＨＢｅＡｂレベルは、１１州、シカゴ、７ポツトラボラトリ一 社から市販されているキットを用いて測定した。ブレＳＡｇは、プレＳ２−特異 的モノクローナル抗体をマイクロプレートのウェルに（ウェル当り１００ナノグ ラム）固定した、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法で測定した。

この固相結合モノクローナル抗体を血清サンプルと混合及び反応させ、例１で述 べた条件下、ホースラディツシュ・パーオキシダーゼラベルした抗ＨＢｓモノク ローナル抗体を用いて検出される免疫反応産物を生成した。

これまでに述べてきた内容は、本発明を説明するためのものであり、これを制限 するものではない、多くの変化及び修正が、本発明の新しい概念の真の精神及び 範囲を逸脱することなしに行うことができる。

浮犯ｒ（内容、二Ｚコ更な巳） 浄書（内容に変更なし） 浄書′（内容に変更なし） ＦＩＧ、４ 汀Ｉ書（１）丁ｄ１こ変更なし） 沸Ｄ−内容に変更りし） 浄ｇ（内容に変更なし） ａｏ　ミ　−一−ｊ１駈’：Ｌ’＝、−−−−−１＝］！Ｔ１ 浄」（内容に変更なし） ■ 、づヨ　、−９−、−′：３ミ５こ・−一ノＫｂ　１２３４５６　履　７８９１ ０　旧２１３１４ＦＩＧ、　９ 浄書（内容に変更なし） ６．６− １．４− 抗・９９　・・・・・・・ 抗−１４２− ＦＩＧ、１０ 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称　発現マーカーとしてＨＢｘＡｇを含有するＳＶ４０発現ベクタ ー ３、補正をする者 事件との関係　出願人 ５、補正命令の日付　平成１年１０月３日国際調査報告 ＰＣＴ／１Ｊｓ８８１０１７１９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＨＢｘＡｇの抗原決定基のアミノ酸配列に対応する約６個乃至約４０個の アミノ酸を含み、かつ、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向に示さ れた次の式によって表わされるポリペプチドの群から選ばれるアミノ酸配列を含 む抗原性合成ポリペプチド。 【配列があります】及び【配列があります】（２）さらに、上記アミノ酵残基配 列のアミノ末端又はカルボキシ末端にシステイン残基を含む請求の範囲１記載の ポリペプチド。 （３）左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に示された式 【配列があります】及び【配列があります】（式中、Ｒ１及びＲ２のうちの１つ のみが存在するという条件でＲ１及びＲ２の各々はシステインである）からなる 群から選ばれた式で表わされる合成ポリペプチド反復ユニットが互いに酸化した システイン残基によって数多く結合したものを含む、水溶性又は水分散性の抗原 性ポリマー。 （４）上記合成ポリペプチド反復ユニットがさらに、左から右に、アミノ末端か らカルボキシ末端の方向で示された式【配列があります】及び【配列があります 】からなる群から選ばれた式によって表わされるポリペプチドを含む、請求の範 囲（３）記載の抗原性ポリマー。 （５）ＨＢｘＡｇの抗原決定基のアミノ酸残基配列に対応する、約６個乃至約４ ０個のアミノ酸残基を含み、かつ、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の 方向で示された式【配列があります】及び【配列があります】で表わされるポリ ペプチド配列の群から選ばれるアミノ酸残基配列を含む、抗原性合成ポリペプチ ドと免疫反応を起こすこができる抗体結合部位を含む受容体分子。 （６）左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で示されている式 【配列があります】及び【配列があります】で表わされるポリペプチド配列の群 から選ばれるアミノ酸残基配列を含み、かつアミノ酸残基配列がＨＢｘＡｇの抗 原決定基に対応する、約６個乃至約４０個のアミノ酸残基を含む抗原性合成ポリ ペプチド及びＨＢｘＡｇと免疫反応を起こしうる抗体結合部位を含む受容体分子 を含む第１の試薬の少なくとも１つの容器を含む、身体サンプル中のＨＢｘＡｇ の存在を測定する診断検定システム。 （７）さらに、上記受容体と免疫反応を起こす、上記抗原性合成ポリペプチドで ある、第２の容器に納めた第２の試薬を含む、請求の範囲（６）記載の診断検定 システム。 （８）さらに、上記受容体及びＨＢｘＡ８の間の免疫反応を知らせる指示手段を 含む、請求の範囲（７）記載の診断検定システム。 （９）（ａ）左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で示した式 【配列があります】及び【配列があります】で表わされるポリペプチド配列の群 から選ばれるアミノ酸残基配列を含み、かつ、ＨＢｘＡｇの抗原決定基のアミノ 酸残基配列に対応する約６個乃至約４０個のアミノ酸残基を含む抗原性合成ポリ ペプチド及びＨＢｘＡｇと免疫反応を起こしうる抗原結合部位を含む受容体分子 と、検定すべき身体サンプル由来の固体マトリクス結合タンパク質を、上記レセ プター及び上記ＨＢｘＡｇの間の免疫反応を知らせる指示手段の存在下で混合す る、 呵上記指示手段が、発生した免疫反応を知らせるのに十分な時間、上記混合物を 維持する、 （ｃ）上記シグナルの存在を確認する、以上（ａ）〜（ｃ）のステップを含む、 検出量のＨＢｘＡｇ又は、その実質的ポリペプチド部分の存在を検定する方法。 （１０）上記身体サンプル及び受容体を、上記指示手段の非存在下で混合し、そ の混合物を、結合した免疫反応産物が形成するのに十分な時間維持し、かつ、上 記免疫反応産物を洗浄後、上記指示手段を、上記産物と混合する、請求の範囲（ ９）記載の方法。 （１１）（ａ）実質的に純粋なＨＢｘＡｇ、ＨＢｘＡｇの実質的ポリペプチド部 分及び左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で示された式 【配列があります】及び【配列があります】で表わされるポリペプチド配列の群 から選ばれるアミノ酸残基配列を含み、かつＨＢｘＡｇの抗原決定基のアミノ酸 残基配列に対応する約６個乃至約４０個のアミノ酸残基を含むポリペプチドから なる群から選ばれる、抗原を固体マトリクスに固定して固体サポートを作る、 （ｂ）上記固体サポートを検定する液体身体サンプルと混合して、固液相を作る 、 （ｃ）この混合物を、身体サンプル中に存在する抗ＨＢｘＡｇ抗体が上記固体サ ポートの抗原と免疫反応を起こすのに十分な時間維持する、及び （ｄ）指示手段を使って、上記免疫反応の存在を確認する、以上（ａ）〜（ｄ） のステップを含む、検出量のＨＢｘＡｇ又はその実質的ポリペプチド部分の存在 を検出する方法。 （１２）上記抗原が、細胞を、ＡＴＣＣ受理番号４０１０２のベクターでトラン スフェクトしたとき発現する、約２４０００ダルトンの分子量をもつポリペプチ ドである、請求の範囲（１１）記載の方法。 （１３）上記固体マトリクスがニトロセルロースである、請求の範囲（１１）記 載の方法。 （１４）上記固体マトリクスがマイクロプレートである、請求の範囲（１１）記 載の方法。 （１５）上記身体サンプルが血清である、請求の範囲（１１）記載の方法。 （１６）上記指示手段がラベルした抗体、抗体結合部位又は上記抗ＨＢｘＡｇ抗 体と反応するＳ．オーレウスのプロテインＡである、請求の範囲（１１）記載の 方法。