DK174060B1 - Antigent syntetisk polypeptid, vandopløselig eller vanddispergerbar polymer indeholdende polypeptidet, receptormolekyle, der kan immunoreagere dermed, diagnostisk analysesystem til bestemmelse af HBxAg, samt fremgangsmåder til bestemmelse..... - Google Patents

Description

DK 174060 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår et antigent syntetisk polypeptid som angivet i krav 1-2, en vandopløselig eller vanddispergerbar antigenpolymer som angivet i krav 3--4, et receptormolekyle som angivet i krav 5, et diagnostisk 5 analysesystem som angivet i krav 6-8, en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af en detekterbar mængde HBxAg eller en væsentlig polypeptiddel deraf som angivet i krav 9-10 samt en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af anti-HBxAg-antistoffer, der er til stede i en 10 legemsprøve, som angivet i krav 11-15.

A. Kloning og vektorer.

Indføringen af exogent DNA i eucaryotiske celler er blevet et af molekylærbiologens mest kraftfulde værktøjer.

15 Denne fremgangsmåde kræver effektiv videregiven af DNA·et til kernen i modtagercellen og senere identifikation af celler, som udtrykker det fremmede DNA.

Splejsede vektorer, såsom plastnider eller bakterio-fager (fager) eller anden DNA-sekvens, som er i stand til 20 at danne kopier i en værtscelle, kan anvendes til at konstruere celler, der virker som fabrikker til produktion af store mængder specifikke virusproteiner. Rekombinante plasmider anvendes i den foreliggende beskrivelse som typiske eksempler på vektorer, ligeledes kaldet kloningsvehikler, jf. US pa-25 tentskrift nr. 4.338.397.

Plasmider er ekstrachromosomale genetiske elementer, som findes i forskellige bakteriearter. De er typisk dob-beltstrengede, lukkede, cirkelformede DNA-molekyler. Det mest almindeligt anvendte plasmid er pBR 322, en vektor, 30 hvis nuel eo tidsekvens og endonucleasespaltningssteder er velkendte.

Nucleinsyrefremstilling ved anvendelse af plasmid-eller fagvektorer er blevet særdeles ligetil. Plasmid- eller fag-DNA klippes over med en restriktionsendonuclease og 35 bindes in vitro til et foretrukket fremmed DNA. Det fremkomne rekombinante plasmid eller fag indføres derpå i en celle.

DK 174060 B1 2 såsom E. coli, og den således fremstillede celle induceres til fremstilling af mange kopier af den splejsede vektor.

Når først der er produceret en tilstrækkelig mængde DNA af kloningsvektoren, fjernes det fremstillede fremmede DNA og 5 anbringes i en anden vektor til produktion eller transcribe-ring af proteinet eller polypeptidet, kodet for med det fremmede gen.

Afhængigt af DNA1et {intakt gen, c DNA eller bakteriegen) kan det være nødvendigt at tilvejebringe eucaryotiske 10 transcriptions- og translationssignaler til direkte ekspression i modtagerceller. Disse signaler kan tilvejebringes ved at forene det fremmede DNA in vitro med en ekspressions-vektor.

Ekspressionsvektorer indeholder sekvenser af DNA, 15 som kræves til transcription af klonede gener og translation af deres messenger RNA'er (mRNA'er) til proteiner. Typisk er sådanne krævede sekvenser eller kontrolelementer: (1) en promotor, som signalerer startpunktet for transcription, (2) en terminator, som signalerer stoppunktet for transcription, 20 (3) en operator, som regulerer promotoren, (4) et ribosombin dingssted for startbindingen af cellernes proteinsyntesema-skineri, og (5) start- og stopcodons, som signalerer begyndelsen og afslutningen af proteinsyntesen.

For at være anvendelig bør en ekspressionsvektor 25 have adskillige yderligere egenskaber. Den bør være relativt lille og indeholde en kraftig promotor. Ekspressionsvektoren bør have en eller flere selekterbare markører for at muliggøre identifikation af transformanter. Den bør ligeledes indeholde et genkendelsessted for et eller flere restrik-30 tionsenzymer i områder af vektoren, som ikke er væsentlige for ekspression.

Konstruktionen af ekspressionsvektorer er derfor et kompliceret og noget uforudsigeligt foretagende. Den eneste sande afprøvning af effektiviteten af en ekspressionsvektor 35 er at måle frekvensen af opstart af syntese af et passende mRNA. Imidlertid er kvantificering af mRNA langsommelig, og 3 DK 174060 B1 det er ofte vanskeligt at opnå nøjagtige målinger. Man har derfor udviklet andre mere praktiserbare måder til detektering af transformation.

En sådan måde er at overvåge syntese af fremmede pro-5 teiner i transformerede celler med enzymatiske analyser.

Man har udviklet adskillige markørgener til at vise, at der er sket transformation.

Andre måder, anvendt til overvågning af transformation, indebærer anvendelsen af immunologe reagenser. Hvis 10 niveauet af udtrykt protein er tilstrækkeligt højt, kan man anvende cytoplasma- eller overflade-immunofluorescens med et antistof, konjugeret til et fluorescerende farvestof, såsom fluorescein eller rhodamin, til detektering af vektor--specifikke proteinekspressionsprodukter.

15 Mere almindeligt dyrkes transformerede celler i nær værelse af radioaktivitet efter immunofældning. Ved denne fremgangsmåde har man benyttet Staphyloccocus aureus-protein A-selektion af immunkomplekser [Kessler, (1975), J. Immunol., 115:1617-1624] og Western blotting-fremgangsmåde [Renart et 20 al., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3116-3120] til detektering af transformations-specifikke markører.

Analyse af genekspression ved anvendelse af Simian Virus 4 0 (SV40) -vektorer er langt den mest udforskede eucary-otiske transformationsteknik ved de biologiske og immunoke-25 miske niveauer. Genetisk og biokemisk information, relateret til SV40 genomets organisaiton, er blevet opstillet eller bekræftet ved virusgenomets nucleotidsekvens, jf. oversigt af Tooze (1980), Molecular Biology of Tumor Viruses, 2. udg., del 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring 30 Harbor, New York. Udformningen af forskellige SV40 vektormolekyler har været afhængig af den nøjagtige kortlægning af genetiske signaler og anvendelsen af restriktionsendonu-cleaser til isolation af bestemte fragmenter fra SV40 geno-met.

35 SV40 udvikledes oprindeligt som en eucaryotisk-trans ducerende vektor ved anvendelse af et lytisk system, jf.

DK 174060 B1 4

Mulligan et al., (1929), Nature (London), 277:108-114. Senere konstruerede man transformerende (ikke lytiske) vektorer med isolerede segmenter af SV40 genomet, jf. oversigt af Elder et al., (1981), Annu. Rev. Genet., 15:295-340.

5 Hamer et al. var de første til at foreslå, at SV40 eventuelt kunne anvendes til at klone gener, for hvilke der ikke var nogen probe til rådighed. De foreslog, at man kunne "skyde" dobbeltstrengede cDNA-kopier fra en heterogen mRNA--population ind i en SV40 vektor som hagl ("shotgunned"), og 10 virus, som har den ønskede sekvens, kunne identificeres ved anvendelse af et radioaktivt eller fluorescerende antistof.

Hamer et al. refererede første gang konstruktionen af en SV40 rekombinant ekspressionsvektor indeholdende en ekspressionsmarkør i 1979, jf. Hamer et al., (1979), Cell.

15 17:725-735. Deres SV40 vektor indeholdt vi rus-DNA-sekvenserne fra BamHI endonuclease-restriktionsstedet ved 0,14 kortenheder i retning med uret i forhold til HaelI restriktionsstedet ved 0,82 kortenheder. Foruden hele det tidlige gen A og udgangspunktet for virus DNA replikation indeholdt vek-20 toren viruspromotoren, signalfrekvensen, den mellemliggende sekvens, 5'-delen af stoffet og 31-terminalsekvenserne for det virale sene 195 mRNA. Den indeholdt ikke 1660 basepar af sene regionsekvenser, der koder for virusproteinet UPI.

2 og 3., jf. Priers et al., (1978), Nature, 173:113-120, og 25 Reddy et al., (1978), Science, 200:494-502.

Kanin-S-globin-genkodende sekvenser ligeres til den ovennævnte vektor som en ekspressionsmarkør. For at bestemme, om kanin-S-globin syntetiseres i abeceller, inficerede med deres rekombinante vektor, anvendte Hamer et al. , jf. oven-30 for, en radioimmunmåling, der kan detektere så lidt som 1,0 nanogram globin.

Skønt Hamer et al. kunne påvise positive spor af β--globin ekspression, udtrykte de adskillige reservationer med hensyn til anvendeligheden af SV40/S-globin-rekombinant-35 systemet. Eftersom globin kun er lidet opløseligt, kan man for det første have lidt signifikante tab under fremstilling 5 DK 174060 B1 af måleprøverne. Således kan bestemmelsen af mængden af globin i de inficerede celler have en fejl på så meget som ti gange. For det andet kan målingen ikke skelne mellem autentisk globin og andre immunologisk beslægtede produkter, 5 såsom "readthrough"-protein- eller polypeptidfragmenter.

En faktor, som Hamer et al. ikke omtaler, er den høje grad af homologi mellem alle eucaryotiske globiner. Denne homologi gør det vanskeligt at skelne mellem vektor-induceret globinekspression og globin, der stammer fra værtscellesy-10 stemet.

B. Hepatitis B virus-peptider og anti-polypeptid- antistoffer ♦

Hepatitis viraene er udpræget forskellige midler. De 15 grupperes sammen udelukkende i kraft af det "mål"-organ, de angriber, leveren. Skønt flere vira angriber leveren som del af systemiske infektioner, antages udtrykket "hepatitis vira" sædvanligvis at betyde type A (HAV) , type B (HBV) og ikke-A, ikke-B midlerne. Af de tre typer vira er HBV langt 20 den mest undersøgte på de biologiske, immunokemiske og kliniske niveauer.

HBV klassificeres som en DNA-virus og adskiller sig i mange henseender fra andre familier af DNA-vira. HBV er sammensat af et ydre overtræk (mere bastant end en membran 25 eller hylster) bestående af protein, fedt og carbohydrat og med et enestående antigen-kompleks, dvs. hepatitis-B-over-fladeantigenet (HBsAg). Det indeholder ligeledes et indvendigt nucleocapsid med en antigenspecificitet, som er forskellig fra overfladeantigenet, dvs. heptatitis-B-core-antigenet 30 (HBcAg).

Et opløseligt antigen (HBeAg) erkendes ligeledes inden for teknikken. Dette antigen menes at bestå af HBcAg-polypep-tider, som ikke er samlede i HBV-cores og følgelig har en enestående antigenspecificitet i den usamlede tilstand.

35 I typiske selv-begrænsende akutte HBV-infektioner viser de følgende serologiske markører sig sekventielt i 6 DK 174060 B1 serum fra en inficeret vært: HBsAg, HBeAg, anti-HBC, anti-HBE og anti-HBS. Forekomsten af anti-HBE signalerer det endelige tab af detekterbart HBsAg. Dette er sandt i alle tilfælde af selv-begrænset akut HBV-infektion. Efter at HBS 5 er forsvundet,er der en forsinkelse fra få uger til adskillige måneder, før anti-HBS viser sig.

Under den kroniske HBV-infektion er HBsAg og anti-HBC til stede. Værtens serum kan vise enten den HBeAg serologiske markør eller den anti-HBE serologiske markør, dvs., 10 at patienten kan være enten HBeAg-positiv eller anti-HBE--positiv.

Følsomme og specifikke radioimmunmålinger og enzymim-munanalyser for adskillige af HBV-markørerne er i almindelig brug. Disse særdeles følsomme serologiske undersøgelser har 15 tilvejebragt en basis for overvågning af fremkomsten af virus- og immunresponsmarkører under forløbet af en HBV--infektion.

I de sidste få år har mange undersøgelser vist, at hver serologisk markør er tegn på specifikke virale begi-20 venheder for værtsresponser under HBV-replikation. Profilen af serologiske markører ved forskellige stadier under det kliniske sygdomsforløb kan således give værdifuld diagnostisk og prognostisk information.

Forbindelsen mellem hepatitis B-virus og humant hepa-25 tocellulært karcinom (HCC), leverkræft, er blevet vidtgående undersøgt, og seroepedemiologiske samt histopathologiske resultater tyder stærkt på, at HBV er direkte eller indirekte involveret i leverkræftetologi. Man har afledt flere hepatom-cellelinier fra humant HCC, og man har rapporteret opdagelse 30 af HBV-specifikt DNA integreret i genomet fra to sådanne cellelinier, PLC/PRF/5 og RPH3B. I disse cellelinier er imidlertid kun hepatitis B-overflade-antigenet blevet udtrykt i vævskultur som et virus-specifikt genprodukt. Andre markører for HBV, såsom hepatitis B-core-antigen, hepatitis BE-35 -antigen og en DNA-polymerase, er ikke blevet detekteret.

Nogle DNA-tumor-vira fra dyr kan frembringe transfor- 7 DK 174060 B1 mation ved virkningen af virusgener, som regulerer replika-tionen og integrationen af virusgenomet, og celler, transformerede af sådanne vira, kan have et T (tumor) - eller neo(nyt)-antigen, udtrykt ved hjælp af de transformerende 5 gener. Nylige beviser for et antigen, analogt til T-antigen, har man fået i humane hepatomceller indeholdende integrerede HBV-gener ved anvendelse af anti-komplement-immunofluores-cens-farvnings-teknikken. Dette antigen er betegnet HBV--tilknyttet kerneantigen ("HBV-associated nuclear antigen", 10 (HBNA). Wen et al., (1983) Infect. Immun., 39:1361-1367.

HBNA blev detekteret i sera fra adskillige HBsAg--positive HCC-patienter, og ekspression af antigenet er påvist i både cellekultur og tumorvæv. Desuden fandt man anti-HBNA-antistoffer i sera fra nogle HBsAg-positive patien-15 ter med HCC. HBNA kan være den tidligere ikke-erkendte ekspression af et HBS-gen.

I 1979 rapporterede Galibert et al., Nature, 281:646-650, nucleotidsekvensen af HBV-genomet, et cirkulært DNA med ca. 3200 baser, som er delvis dobbelt- og delvis enkelt-20 -strenget, et særtræk, som er enestående blandt vira. Den lange streng eller L-strengen (fuldstændigt cirkelformet) af genomet viste sig at indeholde fire læserammer, som var store nok til at tegne sig for virusproteiner. Disse regioner betegnedes som S, C, P og X og er vist skematisk på tegningen 25 i fig. 1.

Det har vist sig, at regionerne S og C indeholder generne for henholdsvis HBsAg og HBcAg. P-regionen menes at kode for et protein, som i størrelse og aminosyregruppeindhold ligner en DNA-polymerase. X-regionen postuleredes af 30 Wen et al., jf. ovenfor, at være en af de mulige kilder til genkodningen for HBNA.

Den rent tentative tildeling af funktioner til generne i P- og X-regionerne viser den kløft, som stadigvæk eksisterer med hensyn til forståelse af HBV's genetiske organisation 35 og molekylærbiologi. En årsag til denne kløft har været fraværet af et in vitro-system til spredning af virusset.

8 DK 174060 B1

Indtil for nylig var den eneste kilde til HBV serum fra humane patienter. De fejlslagne forsøg på at dyrke virus i cellekultur er resultatet af dets særdeles snævre værtscel-leområde.

5 En måde at gribe problemet med at producere HBV-DNA

og dets genprodukter an på har været at anvende rekombinant DNA-teknologi. Denne teknologi muliggør produktion i stor skala af nucleinsyresekvenser, som koder for et bestemt virusprotein.

10 Tiollais et al. (1981), Science, 213:406-411 rap porterede transformation af E. coli med pBR322 indeholdende det gen, der koder for HBsAg, og indberettede om produktion af signifikante mængder af dette isolerede gen. De ønskede ligeledes at undersøge HBsAg-genets placering i HBV-genomet 15 og de faktorer, som påvirkede dets ekspression i vektorer.

For at gøre dette konstruerede de ekspressionsfaktorer indeholdende HBsAg-genet til anvendelse i både bakterie- og pattedyrceller.

En af de ekspressionsvektorer, der konstrueredes af 20 Tiollais et al., jf. ovenfor, præsterede bio-syntese af et protein i E. coli, som indeholdt HBsAg-antigene determinanter. Det blev bygget ved at skyde en portion af det gen, der koder for HBsAg, ind i bakteriofagen plac5-lUV5 for at bevare det naturlige HBV's læseramme.

25 For at undersøge HBV-gen-ekspressionen i pattedyr celler konstruerede Tiollais et al., jf. ovenfor, en serie HBsAg-ekspressionsplasmider ved at indskyde transfektions-elementer forskellige steder i hele HBV-genomet. Transfek-tionselementerne lader hele HBV-genomet blive integreret i 30 adskillige forskellige orienteringer i genomet fra museceller, transformerede med vektoren. For at forme vektorerne på denne måde forsøgte de at anvende HBVs naturligt forekommende genetiske kontrolelementer.

Kun tre af de seks ekspressionsvektorer, som er ind-35 berettet af Tiollais et al., jf. ovenfor, producerede ekspression af det ønskede HBsAg-protein. Produktionen deraf 9 DK 174060 B1 blev detekteret ved afprøvning for tilstedeværelsen deraf i vævskulturvæsker ved anvendelse af fåre-anti-HBsAG-antiserum. De andre virusmarkører, som var kendt på undersøgelsestidspunktet, dvs. HBcAg, HBeAg og DNA-polymerase, blev 5 ikke detekterede i de transformerede celler.

På tidspunktet for den ovennævnte undersøgelse af Tiollais et al. var den mulige eksistens af X-regionen kendt, ligesom muligheden for, at den kunne kode for et HBV-protein.

Det vil sige, det var kendt, at HBV-genomet indeholdt en 10 evne til at kode for flere proteiner, end man tidligere havde forbundet med virusset.

Dette problem er blevet kaldt genotype i efterforskning efter fænotype. Det er dette problem, blandt andet, som Wen et al., jf. ovenfor, omtalte, når de postulerede, 15 at X-regionen indeholdt genet, der koder for HBNA.

Forud for de ovennævnte undersøgelser af Tiollais et al. og Wen et al. viste Sutcliffe et al., (1980) Nature, 287:801-805, bl.a. en generel fremgangsmåde til at løse dette problem. De syntetiserede kemisk et polypeptid inde 20 fra det forudsete protein ved hjælp af nucleotidsekvenser af et viralt gen, hvis proteinprodukt var ukendt. Der blev produceret antistoffer mod polypeptidet, og de blev reageret mod alle proteinerne, produceret af celler, inficerede med virusset. Ved anvendelse af antistoffer mod dele af et forud-25 set protein opdagede Sutcliffe et al. et tidligere ukendt og uigenkendt virusproteinprodukt.

Til dato har man ikke refereret anvendelsen af denne eller nogen som helst anden fremgangsmåde til utvetydigt at identificere proteinproduktet fra HBV genomregion X. Dette 30 kan skyldes, at skønt man har beskrevet den generelle ide med fremstilling af syntetiske antigener og anvendelse af dem til at inducere antistoffer med på forhånd bestemt specificitet, resterer der et stort område af denne teknologi, som fortsætter med at undrage sig forudsigelighed.

35 Årsagerne til dette er adskillige. For det første er proteinaminosyregruppesekvenser, baserede fra en genetisk 10 DK 174060 B1 sekvens, af hypotetisk natur, medmindre nucleotidsekvenslæ-serammen er solidt etableret på grund af den genetiske kodes redundans.

For det andet inducerer et syntetisk antigen ikke 5 nødvendigvis antistoffer, som immunoreagerer med det intakte protein i dets native miljø. For det tredje immunoreagerer et værts naturlige antistoffer mod et immunogen sjældent med et polypeptid, som svarer til en kort lineær portion af immunogenets aminosyresekvens.

10 Den foreliggende opfindelse omfatter adskillige aspek ter. Et aspekt er et rekombinant DNA omfattende en ekspressionsvektor, bundet til genet kodende for HBxAg. I en især foretrukken rekombinant DNA omfatter DNA ekspressionsvektoren en første DNA-sekvens omfattende Simian Virus 40 virus-DNA-15 -sekvensen fra BamHI endonucleaserestriktionsstedet ved basepositionen 2468 i retning med uret til Haell endonucleaserestrikt ionsstedet ved baseposition 767 ifølge fig. 2, og genet kodende for HBxAg tilvejebringes med en anden gen--DNA-sekvens omfattende hepatitis B virus DNA-sekvensen fra 20 Haell endonucleaserestriktionsstedet ved baseposition 1437 i retning med uret til BamHI endonucleaserestriktionsstedet ved baseposition 28 ifølge fig. 1. Den første og anden DNA--sekvens er operativt bundet til fremme af ekspresion af HBxAg.

2 5 Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse udgøres af et rekombinant DNA, som omfatter et gen kodende for HBxAg eller for et polypeptid, som udgør en væsentlig del af HBxAg.

Et især foretrukket rekombinant DNA indeholder genet kodende for HBxAg og har basesekvensen, vist i fig. 1 som dækkende 30 fra baseposition 1437 i retning med uret til 28, eller en væsentlig del deraf.

Et plasmid kodende for mindst et rekombinant DNA, som omfatter et gen kodende for HBxAg eller et polypeptid udgørende en væsentlig del deraf, udgør et andet aspekt af 35 den foreliggende opfindelse. Dette plasmid kan omfatte den basesekvens, der er vist i fig. 1, dækkende basepositionerne 11 DK 174060 B1 fra nr. 1437 med uret til nr. 28 eller en væsentlig del deraf. I særligt foretrukket udførelsesform omfatter plas-midet en første DNA-sekvens omfattende Simian Virus 40 (SV40) virus-DNA-sekvensen fra BamHI endonucleaserestriktionsstedet 5 ved basepositionen nr. 2468 i urets retning til EcoRI endo-nucleaserestriktionsstedet ved baseposition nr. 1717 ifølge fig. 2, en anden DNA-sekvens omfattende plasmid-pBR322-DNA--sekvensen fra BamHI endonucleasepositionen ved baseposition nr. 375 i urets retning til EcoRI endonucleaserestriktions-10 stedet ved baseposition nr. 0 ifølge fig. 3, og en tredje DNA-sekvens omfattende hepatitis B virus DNA-sekvensen fra BamHI endonucleaserestriktionsstedet ved baseposition nr.

1400 i urets retning til BamHI endonucleaserestriktionsstedet ved baseposition nr. 28 ifølge fig. 1. I dette plasmid er 15 den første og anden DNA-sekvens operativt ligeret til deres respektive EcoRI endonucleaserestriktionssteder, den anden og tredje DNA-sekvens er operativt ligeret til deres respektive BamHI endonucleaserestriktionssteder, og den første og tredje DNA-sekvens er operatitvt ligeret til deres respektive 20 BamHI endonucleaserestriktionssteder ifølge fig. 4.

En fremgangsmåde til fremstilling af HBxAg eller en væsentlig polypeptidportion af HBxAg udgør et andet aspekt af den foreliggende opfindelse. Ifølge dette aspekt dyrkes en vært indeholdende et ekspressionssystem ifølge opfindelsen 25 i et kultursuppemedium, indtil der er produceret HBxAg eller en væsentlig polypeptidportion deraf, og akkumuleres i værten eller kultursuppen. Det akkumulerede HBxAg eller den væsentlige polypeptidportion deraf udvindes herefter.

Et andet aspekt ifølge opfindelsen angår et antigent 30 syntetisk polypeptid. Dette syntetiske polypeptid indeholder op til 40 aminosyregrupper og svarer i sekvens til sekvensen af en antigendeterminant af HBxAg. Et især foretrukket polypeptid omfatter en aminosyregruppesekvens, valgt blandt polypeptidsekvenser med formlerne 35 Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro- -Val-Gly, 12 DK 174060 B1

Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu--Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og

Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys- -Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly, 5 skrevet fra venstre til højre og i retning fra aminoter-minalen til carboxyterminalen.

En vandopløselig eller i vand dispergerbar antigenpolymer indeholdnde en flerhed af forbundne syntetiske poly-peptid-repeterende enheder, bundet sammen med oxiderede 10 cysteingrupper, er ligeledes omfattet af den foreliggende opfindelse. De repeterende enheder er omfattede af de ovenfor omtalte polypeptider, som indeholder cysteingrupper ved både amino- og carboxyterminalerne eller indeholder en cyste-ingruppe ved den ene terminal og en cysteingruppe i polypep-15 tidkæden. Særligt foretrukne polypeptid-repeterende enheder, herunder amino- og carboxyterminal-cysteingrupperne, repræsenteres af en formel, skrevet fra venstre mod højre og i retning fra aminoterminalen til carboxyterminalen, valgt blandt 2 0 R1-Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg- -Pro-Val-Gly-R2,

Cys-Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser--Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og

Cys-Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-25 -Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Cys, idet R1 og R2 hver gang er en cysteingruppe, med det forbehold at kun den ene af R1 og R2 er til stede.

Receptormolekyler, som omfatter et antistof-bindingssted, såsom antistoffer, der kan immunoreagere med et af de 30 ovennævnte antigene polypeptider, er ligeledes omfattede af den foreliggende opfindelse. De særligt foretrukne polypeptider, som disse receptormolekyler immunoreagerer med, er illustrerede af de polypeptider, der er beskrevet ovenfor.

Disse receptormolekyler immunoreagerer ligeledes med HBxAg 35 eller med en væsentlig polypeptidportion deraf.

Et diagnostisk analysesystem til bestemmelse af til- 13 DK 174060 B1 stedeværelse af en detekterbar mængde HBxAg i en legemsprøve, der skal analyseres, er ligeledes omfattet. Dette system omfatter mindst en beholder, som indeholder et reagens, som omfatter de ovenfor beskrevne receptormolekyler. Dette system 5 kan endvidere omfatte et andet reagens i en anden beholder, hvilket andet reagens er det antigene syntetiske polypeptid, som receptormolekylerne immunoreagerer med. En måde til signalering af immunoreaktionen mellem receptormolekylerne og HBxAg kan udgøre en yderligere del af det diagnostiske 10 analysesystem.

En fremgangsmåde til analyse af tilstedeværelsen af en detekterbar mængde HBxAg i en legemsprøve udgør et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse. Her blandes proteiner fra en legemsprøve, der skal analyse for tilstede-15 værelsen af en detekterbar mængde HBxAg, med de ovennævnte receptormolekyler i nærværelse af et indikatormiddel til signalering af en immunoreaktion mellem receptorerne og HBxAg. Blandingen opretholdes i en tidsperiode, som er tilstrækkelig til, at indikatormidlet kan signalere, at der er 20 sket en immunoreaktion. Tilstedeværelsen af dette signal konstateres derpå.

I tegningen, som udgør en del af beskrivelsen af den foreliggende opfindelse, er fig. 1 et skematisk diagram, som viser den fysiske 25 struktur og genetiske organisation af HBV/adw-genomet fra Tiollais et al. (1981), Science 213:406-411, modificeret af Ono et al. (1983), N.A.R., 11:1747-1757. 5'-Enden af den lange (L)-streng refereres som værende baseparret med 5'-enden af den korte (S)-streng. Visse restriktionssteder, 30 angivet med pile, knyttet til buer, og forkortelsen for restriktionsendonucleasen svarer til det fysiske kort over HBV/adw-genomet, analyseret af Ono et al., jf. ovenfor. De brede pile, som omgiver genomet, svarer til de fire store åbne regioner i L-strengen. Disse fire potentielle kodende 35 regioner er betegnet med S, P. X og C. Antallet af aminosyre-grupper i parenteser (aa) efter hver af de fire udpegede 14 DK 174060 B1 regioner svarer til længden af det hypotetiske polypeptid, som hver region koder for. De to regioner svarende til de angivne phosgener S og C, er vist med prikkede arealer inden for de brede pile. Det singulære EcoRI-endonucleaserestrik-5 tionssted er anvendt som begyndelsespunkt for kortet.

På fig. 2 ses skematisk et SV40 DNA restriktionskort fremstillet ud fra den primære sekvens, offentliggjort af Reddy et al. (1978), Science 200:494-501, modificeret af Van Heuverswyn og Piers (1979), Eur. J. Biochem., 100:51-60.

10 På fig. 3 ses skematisk et plasmid pBR322 restrik tionskort, fremstillet ud fra primærsekvensdata fra Sutcliffe (1979), Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77.

På fig. 4 ses skematisk den fremgangsmåde, der er 15 beskrevet nedenfor, som anvendes til at indskyde DNA-fragmenter i vektorer ifølge opfindelsen, fremstillet ud fra AM6 (bølgelinier), pBR322 (optrukne linier) og SV40 (punkterede linier), til fremstilling af kloningsvektoren SVAM191 og derpå ekspressionsvektoren SVHBV3, som udtrykker en væ-20 sentlig del af HBxAg. De relative positioner for restrik-tionsendonucleasesteder for BamHI, EcoRI og Haell er illustreret med henholdsvis lukkede cirkler, åbne cirkler og lukkede trekanter. Start (ori)- og de tidlige og sene promotorer for SV40-genomet er ligeledes vist.

25 På fig. 5 er vist en lineær del af SVHBV-3 rekombinant restriktionsvektoren indeholdende generne for den SV40 sene promotor, de aminoterminale 99 aminosyregrupper (99aa) og en væsentlig polypeptidportion (132aa, 132 af 154 aminosyregrupper) af HBxAg-gensekvensen kodende for de 132 carboxyter-30 minale aminosyregrupper. Der er ligeledes vist mRNA for VP2 HBxAg fusionsproteinet, udtrykt af vektoren.

X fig. 6 er vist den translaterede amino syregruppe sekvens, vist fra venstre mod højre og i retning fra aminoter-minalen til carboxyterminalen af genet kodende for HBxAg.

35 Den væsentlige portion af HBxAg, udtrykt af SVBHV-3, er illustreret med pilen ved aminosyregruppeposition nr. 23 15 DK 174060 B1 (Ala), som er aminoterminalgruppen i det udtrykte HBxAg polypeptid. De relative positioner af syntetiske polypeptider med betegnelserne 8, 42, 79, 99, 100 og 142 ifølge opfindelsen i HBxAg-sekvensen er illustreret med tre mærkede, under-5 stregede aminosyregruppesekvenser. Aminosyregruppesekvensen af det syntetiske polypeptid 99 svarer derfor til positionerne fra nr. 100 til nr. 115 fra den aminoterminale Met--gruppe, vist i figuren, sekvensen af det syntetiske polypeptid svarer til positionerne fra nr. 115 til 131 fra den 10 aminoterminale Met-gruppe i figuren, og sekvensen af det syntetiske polypeptid 142 svarer i sekvens til positionerne for nr. 144 til 154 fra den aminoterminale Met-gruppe i figuren, dvs. de elleve carboxyterminale grupper.

Fig. 7 er et fotografi af et autoradiogram, der viser 15 reaktiviteten af anti-X-antisera med to humane hepatom-cel-lelysater. To humane hepatom-cellelinier, PLC/PRF/5 og HepG2, dyrkes i Dulbecco's Modification af Eagle's Medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum til subsammenflydning(på den 6. dag af en i forholdet 1:5 delt kultur fra en sammenflydende 20 kultur) . De ovenstående væsker fjernes, kolberne indeholdende monolagene anbringes på is i 5 minutter, før cellerne opsamles ved skrabning, og de opsamlede celler pelletteres ved centrifugering. Cellepellets vaskes med phosphatpufret saltvand (phosphat buffered saline, PBS), lynfryses ved -70°C og 25 lyophiliseres natten over. De fremkomne cellepulvere opløses i PBS og bringes til en slutkoncentration på 2 mg pr. ml i en prøvepuffer. Prøverne koges i 5 minutter, og celleefterladenskaber fjernes ved centrifugering i en Beckmanmikrofuge i 30 minutter. Man inkuberer 50 mikrogram cellelysat i 15 30 minutter i RIPA buffer [PBS, indeholdende 1% "Nonidet" P-40 (polyoxyethylen-(9)-octylphenylether), 0,05% natriumdeoxy- cholat og 0,1% SDS] og radiomærkes med 3 mikrocurie 125I ved hjælp af chloramin T-reaktionen (McConahey et al. (1966),

Int. Arch. Allergy, 29:185-189). 1,5 x 10s impulser pr.

35 minut (counts per minute, cpm) af hver af de radiomærkede hepatomlysater omsættes i 10 mikroliter anti-X-polypeptid i 16 DK 174060 B1 60 minutter i RIPA. Antigen-antistof-komplekserne (immuno-reaktionsprodukter) fældes med formal in-immobiliseret Staphylococcus aureus. Pellets vaskes en gang med RIPA og to gange med 500 millimolar LiCl, 100 mM Tris (pH-værdi = 8,5) og 5 analyseres for radioaktivitet. Alle pellets opløses i 40 mikroliter prøvepuffer [0,0625 M Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol og 0,001% bromphenolblåt], koges i 3 minutter, centrifugeres til fjernelse af celleefterladenskaber og underkastes SDS-PAGE som følger.

10 De radiomærkede cellelysater sættes til denaturerende natrium-dodecylsulfat-polyacrylamid-geler (12,5%) (SDS-PAGE) og underkastes elektroforese efter fremgangsmåden ifølge Laemmli, (1970), Nature, 297:680:685. Proteinerne overføres elektroforetisk til nitrocelluloseplader som beskrevet af 15 Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350--4354. Nitrocelluloseblot’ene farves i araidosort forud for inkubering ved 4°C natten over i BLOTTO [Johnson et al. (1983), J. Exp. Med., 159;1751-1756] til reduktion af ikke--specifik binding. Nitrocellulosestrimlerne inkuberes i 3 20 timer ved stuetemperatur med en fortynding af anti-polypep-tid-antistoffer i et slutvolumen på 10 ml BLOTTO i forholdet 1:350. Strimlerne vaskes i BLOTTO forud for 1 times inkubering med i-røærket S. aureus-protein A (106 cpm pr = ml) .

Hvor konkurrence fra et polypeptid er angivet nedenfor, 25 inkuberes anti-polypeptidet-antiseraene med 100 mikrogram polypeptid i 60 minutter forud for tilsætning af det radiomærkede antigen. Strimlerne vaskes som ovenfor, skylles med vand, tørres og autoradiograferes. Lanes 1 og 5 omsættes med anti-polypeptid-99-antistoffer (anti-99), lane 2 omsættes 30 med anti-99, på forhånd inkuberet med polypeptid 99, lane 3 reageres med anti-99, på forhånd inkuberet med et ubeslægtet polypeptid, og lane 4 reageres med en på forhånd immun serumkontrol. Lysater fra HepG2 cellelanes 1-4) reagerer ikke med anti-polypeptid 99. Cifrene i den venstre margin angiver 35 relative proteinmigreringspositioner. Pile i højre hånds marginen viser migreringspositionerne af proteiner med mole- 17 DK 174060 B1 kylvægte fra 28.000 til 45.000 dalton.

Fig. 8 er et fotografi, der viser reaktiviteten af ant i-X-antiserum af chimpanse {C, lanes 3 og 4)- og humane (H, lanes 1 og 2) levervæv. Leversekt ioner fra chimpanser 5 og mennesker lynfryses i flydende nitrogen og formales til et fint pulver med en morter og støder. Cellepulverne opløses i prøvepuffer og underkastes gelelektroforese og blot'tes som beskrevet for fig. 7. Nitrocellulosestrimler fremkaldes med en fortynding i forholdet 1:50 af antiserum som beskrevet 10 i fig. 7 med to undtagelser: 1) 1% okse {"bovine") serumalbumin (BSA)-opløsning anvendes i stedet for BLOTTO i alle inkubationer og vaskeprocesser, og 2) de antigen-bundne antistoffer detekteres med peberrods-peroxidase-konjugeret gede - ant i -kanin- IgG. Ant igen-ant istof - iiranunoreaktions-prod.uk-15 terne visualiseres ved at dyppe strimlerne i den følgende fremkaldelsesopløsning. Fremkaldelsesopløsningen fremstilles ud fra 50 ml TBS-puffer ved 37°C, hvortil der sættes 750 mikroliter absolut ethanol indeholdende 8 mg 4-chlor-l-naph-thol og 330 mikroliter 30% hydrogenperoxid. Der anvendes 20 antiserum til polypeptid 99 (anti-99) i de to plader til venstre, blokerede og ublokerede, medens der anvendes antiserum til polypeptid 142 (anti-142) i de to plader til højre, blokerede og ublokerede. Cifrene på den venstre side af figuren illustrerer gelmigretionspositionerne for proteiner 25 med molekylvægte på henholdsvis 66, 54, 31, 21 og 14 kdalton.

Fig. 9 er et fotografi af en Southern blot-analyse af humane og chimpanse-restriktions-enzymspaltede lever--DNA'er fra levervæv, som udviser X protein, under anvendelse af hepatitis B virus (HBV) -DNA som bindingsproben. Alt DNA 30 ekstraheres fra cellepulverne, fremstillet ud fra de prøver, der er beskrevet i fig. 8. Derefter sættes der 10 mikrogram DNA til hver fordybning i en 1%'s agarosegel. Restriktionsenzymnedbrydningspuffere er ifølge producenten (BRL hvem, hvor), Alle nedbrydninger udføres natten over ved 37°C med 35 50 enzymenheder (5 x DNA koncentration i mikrogram) . Lanes 1-3 viser chimpanse A-243-lever-DNA, nedbrudt med henholdsvis 18 DK 174060 B1

BamHi, EcoRI eller uspaltet, bane 4-6 viser chimpanse 344--lever-DNA, spaltet med henholdsvis BamHi, EcoRI eller uspaltet, lanes 7-10 viser human HBcAg-positiv lever-DNA, klippet med henholdsvis Hindlll, BamHi, EcoRI eller uden nedbrydning, 5 og lanes 11-14 viser human HBsAg-negativ lever-DNA, nedbrudt med henholdsvis Hindlll, BamHi, EcoRI eller ikke-nedbrudt.

Fig. 10 er et fotografi af et autoradiogram, der viser reaktiviteten af anti-X-polypeptid-antisera med et X--rettet genprodukt. Sammenflydende monolag af BSC-l-celler 10 (2xio7 celler) inficeres med det rekombinante SVHBV-3-stam-virus, (en blanding af tsA239~ og SVHBV-3 virioner) eller vildtypen SV40 [Moriarty et al. (1981), Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 78:2606-2610], Kulturerne inkuberes i serumfri DMEM ved 40°C i 48-72 timer, til hvilket tidspunkt der er 15 indtruffet en ca. 50%'s cytopat i sk virkning. Supemantanteme fjernes, og kolberne indeholdende monolagene anbringes på is i 5 minutter, før cellerne opsamles ved afskrabning. De opsamlede celler centrifugeres, og de fremkomne cellepellets vaskes med PBS, lynfryses ved -70°C og lyofiliseres natten 20 over. De fremkomne cellepulvere opløses i PBS og bringes til en slutkoncentration på 2 mg pr. ml i prøvepuffer. Prøverne koges i 5 minutter, og celleefterladenskaber fjernes ved centrifugering i en Beckmancentrifuge i 30 minutter.

Fra 50 til 100 mikrogram cellelysat sættes til denaturerende 25 polyacrylamidgeler (12,5%) og underkastes elektroforese som ovenfor beskrevet. Proteinerne overføres elektroforetisk til nitrocelluloseplader som ovenfor beskrevet. Nitrocelluloseblot 'tene farves i amidosort forud for inkubering ved 4°C natten over i BLOTTO til reduktion af ikke-specifik 30 binding. Nitrocellulosestrimler inkuberes i 3 timer ved stuetemperatur med en fortynding i forholdet 1:350 af anti--peptid-antistoffer i et slutvolumen på 10 ml BLOTTO. Strimlerne vaskes i BLOTTO forud for en 1 times inkubation med 125I-mærket S-aureus-protein-A (106 cpm pr. 10 ml) . Strim-35 lerne vaskes som ovenfor, skylles med vand, tørres og auto-radiograferes. I tilfælde, hvor der gennemføres blokering 19 DK 174060 B1 med polypeptid, præinkuberes antisera med 100 mikrogram polypeptid-opløsning natten over ved 4°C eller 2 timer ved 37°C forud for inkubation med nitrocellulosestrimlerne. Molekylvægte baseres på lavmolekylvægt-standarder (BioRad) 5 og er vist i den venstre margin i figuren. Lanes 1 og 3 reagerer med henholdsvis anti-polypeptid-99- og anti-polypep-tid-142-antistoffer. Lanes 2 og 4 reageres med disse samme antistoffer, præinkuberede med henholdsvis polypeptid-99 eller med polypeptid-142. Lanes 5 og 6 viser reaktionen af 10 henholdsvis anti-polypeptid-99- og -142-antistoffer med kontrolcellelysater.

Den foreliggende opfindelse har adskillige goder og fordele. Et af disse goder er, at man for første gang har detekteret tilstedeværelsen af HBxAg i nogen celle.

15 Et andet gode er, at der ved opfindelsen tilveje bringes en analysemetoder og et system til detektering af tilstedeværelsen af HBxAg i et værtsdyr, kronisk inficeret med hepatitis B.

Et yderligere gode er, at anvendelse af opfindelsen 20 har muliggjort detektion af HBxAg i celler, afledt af humane hepatomer, hvorved man styrker den formodede forbindelse mellem hepatitis B-virus og denne form for cancer.

En af fordelene ved opfindelsen er, at der tilvejebringes måder til kloning af genet kodende for HBxAg.

25 En anden fordel ved opfindelsen er, at der tilveje bringes måder til ekspression af en væsentlig polypeptidportion af HBxAg, der kan anvendes som et antigen i en diagnostisk bestemmelse vedrørende tilstedeværelsen af antistoffer mod HBxAg (anti-X-antistoffer) , som er til stede i menneskers 30 serum.

En yderligere fordel ved opfindelsen er fremstillingen af et syntetisk polypeptid, hvis aminosyregruppesekvens svarer til sekvensen af en antigendeterminant af HBxAg, der kan anvendes til fremstilling af antistoffer, som immunorea-35 gerer med HBxAg samt med polypeptider, som deler en antigen determinant med HBxAg.

Yderligere goder og fordele ved den foreliggende opfindelse vil blive åbenbare for fagfolk ved hjælp af den detaljerede beskrivelse og kravene, som følger: 20 DK 174060 B1 5 Definitioner

Transfektion: er erhvervelsen af nye genetiske markører ved inkorporering af tilføjet DNA i eucaryotiske celler.

Transformation: er erhvervelsen af nye genetiske markører ved inkorporering af tilføjet DNA i procaryotiske 10 celler.

Klonincrsvektor: er hvilket som helst plasmid eller virus, hvori man kan indskyde et fremmed DNA til kloning.

Plasmid: er et autonom selv-kopierende ekstrachromo-somalt cirkelformet DNA.

15 Åben læseramme: er en DNA-sekvens, som (eventuelt) kan translateres til protein.

Hjælper-virus; er et virus, som tilvejebringer funktioner, som ikke er til stede i et defekt virus, hvorved det bliver muligt for det sidstnævnte at fuldende infek-20 tionskredsløbet under en sammenført infektion.

Gen (cistron) .· er det DNA-segment, som er involveret i fremstilling af en polypeptidkæde. Det omfatter regioner, som kommer før og følger efter den kodende region (signal og stop) samt mellemliggende sekvenser (introns) mellem 25 individuelle kodende segmenter (exons).

Ekspression: processen, der gennemgås af et strukturelt gen til fremstilling af et polypeptid. Det er en kombination af transcription og translation.

Klon: beskriver et stort antal identiske celler eller 30 molekyler med en enkelt stamcelle eller -molekyle.

Base Pair (bp) : er en pardannelse mellem adenin (A) og thymin (T) eller mellem cytosin (C) og guanin (G) i dobbeltstrenget DNA.

Ekspressionsvektor: er hvilket som helst plasmid 35 eller virus, hvori der kan indskydes eller udtrykkes et fremmed DNA.

21 DK 174060 B1

Nedstrøms; identificerer sekvenser, som fortsætter længere i ekspressionsretningen. Eksempelvis er den polypep-tidkodende region for et gen nedstrøms for startcodon.

5 A. Generel diskussion

Region X i hepatitis B virus-HBV-genomet er blandt andet af interesse, fordi nyere tegn peger på muligheden af, at den udtrykkes, og traditionel HBV-serologi har ikke fundet dens proteinprodukt eller antistoffer til et sådant produkt.

10 Nyrere udviklede rekombinant DNA- og syntetisk polypeptid-teknikker anvendes i den foreliggende beskrivelse for at overvinde nogle af de uheldige udfald, som man støder på med traditionel metodik med hensyn til ekspression af HBxAg, og for at illustrere ekspressionen af HBxAg i celler fra 15 human hepatom-afledte cellelinier og i leverceller fra chimpanser og mennesker med en kronisk HBV-infektion.

Til dette mål omfatter den foreliggende opfindelse kloning- og ekspressionsvektorer for HBxAg, syntetiske poly-peptider, som svarer til antigene determinanter af HBxAg og 20 til antistoffer, fremkaldt mod disse syntetiske polypeptider, som binder til polypeptiderne samt til HBxAg, eller til en væsentlig portion deraf, samt bestemmelse med hensyn til tilstedeværelsen af HBxAg,

De her omtalte kloningsvektorer anvendes blandt andet 25 til fremstilling af anvendelige mængder af et HBxAg-holdigt gen. Dette gen kan atter blandt andet anvendes til fremstilling af mængder af HBxAg og polypeptidfragmenter deraf, som kan anvendes til undersøgelse af selve heptatitis B-sygdom-men.

30 De hidtil ukendte syntetiske polypeptider ifølge opfindelsen er blandt andet anvendelige som antigener til fremstilling af antistoffer, som immunoreagerer med HBxAg og væsentlige polypeptidportioner deraf samt immunoreagerer med selve de syntetiske polypeptider. De således fremstillede 35 antistoffer kan herefter anvendes til bestemmelse af tilstedeværelsen af HBxAg eller en væsentlig polypeptidportion 22 DK 174060 B1 deraf i cellerne hos en inficeret dyrevært eller i vævskultur.

Ekspressionsvektoren kan anvendes til transficering af celler og inducering af ekspression af et polypeptid, 5 som omfatter en væsentlig del af HBxAg. Det udtrykte polypeptid kan derefter anvendes som et antigen i en analyse til bestemmelse af tilstedeværelsen af antistoffer mod HBxAg i en legemsprøve.

Ekspressionsvektoren og antistoffer ifølge opfindelsen 10 kan ligeledes anvendes som en markør for transficerede celler, som indeholder ekspresssionsvektoren og endvidere omfatter et yderligere ligeret gen, hvis tilstedeværelse kan være relativt vanskelig at konstatere. Således kan man åbne den nedenfor beskrevne ekspressionsvektor med betegnelsen 15 SVHBV-3 og ligere den til yderligere et andet fremmed gen, som koder for et protein, som kan være relativt vanskelig at bestemme. Efter recirkularisering, infektion af passende celler med den således dannede nye vektor og udplettering til enkeltcellekolonier kan man identificere disse celler, som 20 inkorporerer den nye vektor, ved hjælp af deres ekspression af den vektorkodede del af HBxAg, fusioneret til det protein, som det fremmede gen koder for, idet man anvender antistofferne ifølge opfindelsen. En sådan markør kan være særligt anvendelig, hvor man ønsker, at vektoren udtrykkes i eucaryo-25 tiske celler, dvs., hvor lægemiddelreistensmarkører, til stede i bakterielle cellevektorer, såsom pBR322, ikke er til stede.

1. Kloninasvektorer 30 Det rekombinante DNA ifølge opfindelsen, som indehol der HBxAg-genet, kan fremstilles eksempelvis ved kloning af en portion af HBV-DNA'et. For at tilvejebringe HBV-genom-materiale omdannes Dane partikel DNA indeholdende en enkelt-strenget portion til et helt dobbeltstrenget DNA ved anven-35 delse af virussets endogene DNA-polymerase.

Det således tilvejebragte cirkelformede dobbeltstreng- 23 DK 174060 B1 ede HBV indeholder to BamHI endonuclease-restriktionssteder.

Ved spaltning med BamHI fås typisk tre lineære produkter, der klassificeres efter størrelse. Det største er et 3200 bp fragment, som repræsenterer hele HBV-genomet, spaltet 5 ved kun et BamHI-sted. Fragmenter indeholdende 1850 bp og 1350 bp fremstilles, når HBV spaltes ved begge BamHI-steder.

Analyse af HBV-nucleotidsekvensen ifølge Galibert et al. (1979), Nature, 281:646-650 afslører, at det 1850 bp HBV-BamHI-fragment omfatter genet kodende for HBxAg. Imidler-10 tid har alle tre fragmenter BamHI komplementære terminaler og kan derfor indskydes i BamHI-stedet i et kloningsplasmid.

Plasmidet pBR322 har et enkelt BamHI-restriktionssted, som er placeret inden i dets tetracyclin-resistens-givende gen, som det kan ses ved gennemgang af fig. 3. Ved spaltning 15 af pBR322 DNA med BamHI fås et enkelt lineært fragment med terminaler, som er komplementære for hvert af de tre BamHI--HBV-DNA-fragmenter.

Ligering af hvert af de tre BamHI-HBV-DNA-fragmenter til pBR322 ved dets BamHI-sted med T4-DNA-ligase til om-20 dannelse og cirkularisering af plasmiderne resulterer i tre singulære rekombinante plasmid-DNA'er. De rekombinante klo-ningsplasmider er cirkelformede DNA'er og betegnes: AM7 indeholdende pBR322 DNA med det 1350 basepar BamHI-HBV-DNA--fragment indskudt ved pBR322's BamHI-sted, AM6 indeholdende 25 pBR322 DNA med hele HBV-genomet indskudt ved pBR322's BamHI--sted, og AMI indeholdende pBR322 DNA med det 1850 bp BamHI-HBV-DNA-fragment omfattende HBxAg-genet indskudt ved pBR322's BamHI-sted.

Når BamHI-HBV-DNA-fragmenterne er ligerede til pBR322-30 -BamHI-stedet med T4-DNA-ligase, har de således dannede rekombinante plasmider ikke længere evnen til at give tetra-cyclin-resistens. Ampicillin-resistente og tetracyclinføl-somme transformanter udvælges derved blandt kolonier af Escherichia coli-stammen HB101, transformeret med de oven-35 nævnte ligeringsprodukter.

Tre lægemiddel-selekterede stammer af E. coli HB101, 24 DK 174060 B1 transformerede med de rekombinante plasmider AMI, AM6 og AM7, betegnes henholdsvis ECAM1, ECAM6 og ECAM7. De ovennævnte plasmider fremstilles i relativt store mængder ved at dyrke de ovennævnte transformanter i et passende medium, 5 såsom LB-suppe som beskrevet nedenfor.

Et genfragment indeholdende hele eller en del af HBxAg-genbasesekvensen kan udskæres fra de ovennævnte plasmider AMI og AM6 ved anvendelse af hensigtsmæssige restriktionsenzymer. Når plasmiderne AMI og AM6 eksempelvis nedbry-10 des med restriktionsenzymet BamHI, isoleres et 1850 bp DNA--fragment omfattende genet kodende for HBxAg fra reaktions-produkterne. Ved at dyrke de rekombinante plasmid-trans-formerede E. coli HB101 stammer ECAM6 eller ECAM1 kan man få en relativ stor mængde af DNA-sekvensen kodende for HBxAg.

15 Fra det HBxAg-gen, for hvilket man har bestemt DNA- -basesekvensen og det locus, hvorpå man har bestemt HBV-genomet, er det åbenbart, at der ikke findes nogen introns deri. Dette betyder, at genet kan transcriberes, som det er, og føre til fænotypekspression som et messenger RNA i 20 dyreceller samt i bakterieceller.

2. Ekspressionsvektorer.

Indføringen af HBxAg genet sammen med et passende ekspressionssystem ind i en dyrecelle, såsom en afrikansk 25 grøn abe nyrecelle, ved fremgangsmåden ifølge Ganem et al. (1976), J. Mol. Biol., 101:57-83, kan føre til HBxAg-syntese i cellen. Endvidere muliggør dyrkning af disse abenyreceller indeholdende HBxAg genet med en hensigtsmæssig ekspressionsvektor masseproduktion af HBxAg til lave omkostninger.

30 Et rekombinant DNA, der kan udtrykke HBxAg-genet, konstrueres med fordel, uden at forskyde læserammen, ved at indbygge det fuldstændige HBxAg gen eller et fragment deraf i Simian Virus 40 (SV40) nedstrøms for SV40-gen regionpromotoren. En vektor til ekspression, som anvender SV40 sen 35 regionpromotoren, produceres i store mængder på følgende måde.

25 DK 174060 B1 SV40 DNA og pBR322 DNA underkastes BamHI og EcoRI dobbelt restriktionsenzymnedbrydning. De store SV40- og pBR322-fragmenter ligeres ved anvendelse af T4 DNA ligase. Ligeringsproduktet underkastes BamHI-nedbrydning til dannelse 5 af et lineært DNA med BamHI cohæsive ender. Ligering af dette SV40/pBR322 DNA med det 1850 bp store BamHI HBV DNA resulterer i et cirkulært rekombinant plasmid med betegnelsen SBAM191.

Det rekombinante DNA-SVAM 191 indeholder et intakt 10 E. coli ampicillinresistent gen. E. coli HB101, transformeret med SVA191( er ampicillin-resistent og tetracyclinfølsomt, og kan således udvælges, baseret på lægemiddelfølsomhed. E. coli, transformerede med SVAM191, betegnes EC-SVAM191 og kan dyrkes i et passende medium, såsom LB-suppe indehold-15 ende ampicillin, og man kan derved få en relativt stor mængde af plasmidet.

3. Cellekultur

Transformationen af en værtscelle med de således 20 tilvejebragte rekombinante DNA-plasmider AMI, AM6 og SVAM191 kan udføres ved kendte fremgangsmåder [Cohen et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110-2114 (1972)] eller en modifikation deraf. Værtscellerne omfatter blandt andet sådanne mikroorganismer som Escherichia coli, Bacillus subtilis og 25 gærarter, og er fortrinsvis en Escherichia coli-stamme, såsom stammerne med betegnelserne 294 (ATCC 31446) W3110 (ATCC) 27325 eller RR1 (ATCC 31447). E. coli stamme HB101 (ATCC 33694) er en særligt foretrukken værtscellelinie.

Isolering af en cellestamme med det HBxAg-genholdige 30 hidtil ukendte rekombinante plasmid DNA kan ske ved kendte fremgangsmåder, herunder eksempelvis den følgende fremgangsmåde.

Dane-partikel DNA, som kun er delvis dobbeltstrenget, kan blive radioaktivt mærkede ved at føje 3H-holdige dNTP'er 35 ind i den enkeltstrengede portion under anvendelse af den endogene DNA-polymerasereaktion, jf. Robinson (1975), AM.

26 DK 174060 B1 J. Med. Sci., 270:151-159. Derefter kan man under anvendelse af det mærkede produkt som en probe udtage en positiv klon blandt de allerede tilvejebragte lægemiddel-selekterede transformanter ved den kendte Southern Blot-hybridiserings-5 metode [Southern (1975), J. Mol. Biol., 98:503], eller ved den kendte kolohybridiseringsmetode [Grunstein et al. (1975)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965].

Værtsceller, transformerede og isolerede på denne måde, dyrkes i et kendt medium. Mediet kan eksempelvis være 10 LB-suppe, Penassay-suppe eller M9-medium indeholdende glucose og Casamino Acids [Miller, Experiments in Molecular Genetics, 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)] .

Dyrkningen udføres almindeligvis ved 15-43°C, for-15 trinsvis ved 28-40°C i 2-24 timer, fortrinsvis i 4-16 timer, om nødvendigt under lufttilsætning og/eller omrøring.

Efter dyrkningen opsamles bakteriecellerne, cellerne suspenderes i en puffer og lyseres, såsom ved lysozym-, nedfrysnings-optønings- eller ultralydsbehandling. Genet kodende 20 HBxAg kan isoleres ved en fremgangsmåde, som almindeligvis er kendt til DNA-rensning ud fra centrifugeringssupernatan-ten, der fås efter cellelyse.

Til fremstilling af en vektor til ekspression af HBxAg i eucaryotiske celler fjernes en portion af SVAM191-25 -DNA'et, herunder alt DNA af pBR322-oprindelse. Dette sker ved at underkaste SVAM191 Hael I-restriktionsenzymnedbrydning.

Når det største af Haell-SVAM191-nedbrydningsprodukterne er cirkulariserede, dannes der en vektor med betegnelsen SVHBV--3, som kan udtrykke HBxAg i dyreceller.

30 En pattedyrcellevært kan transficeres med SVHBV-3 ved kendte fremgangsmåder, hvorved man får et ekspressionssystem. Eksempelvis kan man indskyde SVHBV-3 i COS-7-celler (ATCC CRL 1651), når det spaltes med restriktionsenzymet Hindlll, jf. Gluzman (1981), Cell, 23:175-182, og Siddiqui 35 (1983), Mol. and Cell Biology, 3:143-146]. SVHBV-3 kan lige ledes indskydes i Bovin Papillom Virus og derved anvendes 27 DK 174060 B1 til at transficere musecellelinier.

Mere foretrukket anvendes SVHBV-3 sammen med SV40tsA239-hjælper-virus til at transficere den afrikanske grønne abenyrecellelinie BSC-1 (ATCC CCL 26) . Når BSC-1-5 -cellerne er således transficerede, producerer de et polypep-tid indeholdende HBxAg-antigene determinanter.

Det skal forstås, at den nucleotidsekvens eller det genfragment, som er indskudt ved det valgte restriktionssted i klonings- eller ekspressionsvehiklen, kan omfatte nucleo-10 tider, som ikke er del af det aktuelle gen for det ønskede protein eller kan omfatte blot et fragment af dette gen. På grund af den kendte redundans i den genetiske kode behøver det indskudte således ikke at være identisk med det heri beskrevne HBxAg-gen, men skal blot kode for HBxAg. Desuden 15 kan en DNA-sekvens, som koder for HBxAg, omfatte yderligere baser ved hver af eller begge 3'- eller 5'-enderne af den sekvens, som koder for HBxAg, så længe læserammen er uændret. Anderledes udtrykt kræves der, uanset hvilken DNA-sekvens , der indskydes, ved den foreliggende opfindelse blot, 20 at den transformerede eller transficerede vært producerer henholdsvis enten et DNA kodende for HBxAg, proteinet HBxAg eller et polypeptid, som omfatter en væsentlig portion af HBxAg-proteinet.

25 4. Polypeptider, antigener og antistoffer

Som beskrevet nedenfor kan man detektere ekspressionen af HBxAg ved anvendelse af antistoffer, inducerede af syntetiske polypeptider, hvis aminosyregruppesekvens svarer til aminosyresekvensen af en antigen determinant af HBxAg.

30 Polypeptiderne ifølge opfindelsen indeholder typisk fra ca.

6 til ca. 40 aminosyregrupper, især indeholder disse polypeptider fra ca. 10 til ca. 20 aminosyregrupper.

Aminosyregruppesekvensen af syntetiske polypeptider med betegnelserne 8, 42, 79, 99, 100 og 142, vist nedenfor 35 og i fig. 6, bestemmes ud fra HBV-nucleotidsekvensen, offentliggjort af Galibert et al., jf. ovenfor.

28 DK 174060 B1

Polypeptid 8: Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-

Cys -Leu-Arg-Pro-'Val-Gly,

Polypeptid 42: Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-

His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys, 5 Polypeptid 79: Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-

Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly,

Polypeptid 99: Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys,

Polypeptid 100: Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-10 Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val, og

Polypeptid 142: Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, idet hver af aminosyregruppesekvenserne er vist i retning fra venstre mod højre og i retning fra aminoter-15 minalen til carboxyterminalen.

Det bemærkes, at polypeptider svarende i aminosyre-gruppesekvens til sekvenserne af polypeptiderne 99 og 100 undtaget fraværet af henholdsvis carboxy- og amino-terminal--cystein-grupperne i polypeptiderne 99 og 100, ligeledes er 20 anvendelige heri og er omfattet af opfindelsen. Sådanne polypeptider, betegnet som polypeptiderne 99b og 100b, er anvendelige som immunogener, når de er bundne til en bærer gennem deres amino- eller carboxy-terminale grupper, og kan ligeledes anvendes i aminoreaktions-blokeringsundersøgelser, 25 som ligner dem, der er vist i portioner i fig. 7, 8 og 10, og er omtalt nedenfor.

Aminosyregruppesekvenserne af polypeptiderne 99b og 100b er vist i formlerne nedenfor fra venstre mod højre og i retning fra aminoterminale til carboxyterminalen: 30 Polypeptid 99B: Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-

Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp,

Polypeptid 100b: Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-

Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val.

35 a. X-Protein i transficerede celler

Kaniner, immuniserede med polypeptiderne 99, 100 29 DK 174060 B1 eller 142, bundet til en "keyhole limpet-hemocyanine" (KLH)--bærer som et konjugat, producerer antistoffer (henholdsvis anti-99, anti-100 og anti-142) , som immunoreagerer med det HBxAg-polypeptid, som er udtrykt i BSC-1-celler, transfice-5 rede med SVHBV-3, og viser derved for første gang ekspression af et HBxAg-polypeptid i disse eller hvilke som helst celler.

Disse anti-polypeptid-antistoffer immunoreagerer ikke med noget polypeptid, som findes i utransficerede BSC-l-celler, dvs. celler, inficerede med vild-type (wild type) (wt)-SV40.

10 Immunoreaktiviteten af de anti-polypeptid-antistoffer, som udtrykker HBxAg-polypeptidet, inhiberes eller blokeres desuden ved præ-inkubation af antistofferne med deres komplementære (tilsvarende) polypeptid, dvs. det polypeptid-immunogen, mod hvilket de er produceret. Denne blokering tyder 15 på, at antistofferne specifikt genkender en antigen determinant af polypeptidet, forudset at være HBxAg, og at de syntetiske polypeptider i aminosyregruppesekvens svarer til antigendeterminanter af det forudsete HBxAg-protein. Disse blokeringsresultater fås ved avendelse af Western Blot-tek-20 nikken, jf. nedenfor, fulgt af lokaliseringen af bundne antistoffer med 125I-mærket Staphylococcus aureus protein A, fulgt af autoradiografisk fremkaldelse af analysen.

Disse resultater er vist i fig. 10 for antisera mod polypeptiderne 99 og 142. Lane 1 i fig. 10 viser immunoreak-25 tionen af anti-99 med det SVHBV-3-inficerede cellelysat, medens lane 2 viser blokering af denne immunoreaktion ved præinkubation af antiserum med polypeptid 99. På lignende måde immunoreagerer anti-142 med et cellelysatprotein i lane 3, og denne immunoreaktion blokeres ved præ-inkubation 30 af dette antiserum med polypeptid-142. Lanes 5 og 6 viser, at der ikke sker nogen immunoreaktion med lysater fra kontrolceller.

Polypeptid-ekspressionsproduktet af SVHBV-3-trans-ficerede celler, som specifikt identificeres med antisera 35 mod polypeptiderne 99 og 142, vist i fig. 10, har en molekylvægt på ca. 24000 dalton. Som nedenfor omtalt har man 30 DK 174060 B1 identificeret et polypeptid med en molekylvægt på ca. 28000 dalton i lysater fra den humane hepatom-afledte cellelinie PLC/PRF/5. Man mener, at molekylvægtsforskellen i polypep-tiderne (proteinerne), udtrykt af de to cellelinier, stammer 5 fra det faktum, at de udtrykte polypeptider fremkommer ved fusion af X-proteinet med andre proteiner eller polypeptider.

Som allerede bemærket mangler SVHBV-3 således en portion af det fuldstændige X-kodende genom. I fig. 6 er vist, at portionen af X-genet, omfattet i SVBHV-3, udelukker 10 codons for de første 22 aminosyregrupper af det formodede X-protein, herunder methionin-start-codon ATG.

Man har derfor forudsagt, at polypeptidet, udtrykt af celler, transficerede med SVHBV-3, ville være et fusionsprodukt med de SV40 strukturelle protein VP2-sekvenser til 15 stede i vektoren. Den forudsagte størrelse af fusionsproteinet (polypeptidet) blev spået til at være 24500 dalton. Fundet af et udtrykt polypeptid med en molekylvægt på ca.

24000 dalton er derved i overensstemmelse med denne spådom.

Det 28000 dalton store fusionsprotein (polypeptid) omtales 20 nedenfor.

b. X-protein. udtrvkt i henatomceller.

Ekspression af HBxAg menes ligeledes at være en funktion af nogle HBV-sygdomstiIstande. Eksempelvis genkender 25 antistoffer til polypeptid-99 (anti-99) specifikt et 28000 dalton stort protein, udtrykt i den humane hepatom-afledte cellelinie PLC/PRF/5 (ATCC CRL 8024) . Normalt kaninserum genkender ikke dette protein, og anti-99-genkendelse blokeres med præinkubation med polypeptid-99. Denne cellelinie er 30 kendt for at indeholde integreret HBV-DNA, jf. Chakrabarty et al. (1980), Nature, 286:531-533, Edman et al. (1980), Nature, 286:535-538 og Marion et al. (1980), Virol, 33:795-806. HBsAg er blevet detekteret i denne hepatom-cellelinie [McNab et al. (1976), Cancer, 34:509-515; og Aden et al.

35 (1979), Nature, 282:615-616], medens alle standardanalyser for HBcAg og HBeAg har været negative. Cellelinien med beteg- 31 DK 174060 B1 nelsen HepG2 (ATCC CCL 23) er ligeledes en human hepatom--cellelinie, men indeholder ikke integrerede HBV-DNA-sekvenser, jf. Aden et al., ovenfor.

Disse resultater fås ved radiomærkning af PLC/PRF/5-5 -celleproteinerne, fulgt af gentagne immunfældninger ved anvendelse af anti-99 og Staphylococcus aureus protein A og derpå elektroforese af det udvundne bundfald. Det 28000 dalton store protein idenficeres derpå ved autoradiografi.

Denne fremgangsmåde omtales ligeledes nedenfor.

10 Resultater fra en lignende undersøgelse under anven delse af lysater fra både PLC/PRF/5- og HepG2-celler er vist i fig. 7. I fig. 7 vises det, at der detekteres et X-specifikt protein ved 28000 dalton i PLC/PRF/5-celler (lane 5). Immunreaktiviteten tabes, når antistoffet præinkuberes 15 med polypeptid-99 (lane 6), men ikke med et ubeslægtet poly-peptid (lane 7). Den præimmune serumkontrol immunoreagerer ikke (lane 8) . Der detekteres ikke nogen X-specifik reaktivitet i kontrol-HepG2-lysaterne (lane 1-4) . Disse resultater godtgør, at der udtrykkes et X-genprodukt i en human 20 hepatom-cellelinie indeholdende integrerede HBV-DNA-sek-venser.

c. X-proteinekspression i leverceller.

Endvidere undersøges fire leverprøver fra mennesker 25 og chimpanser, enten med eller uden en fortid med HBV-infektion, i en Western Blot-analyse for tilstedeværelsen af et X-beslægtet protein ved anvendelse af anti-X-polypeptid-antistoffer. Resultaterne af denne undersøgelse er vist i fig. 8. Den ene humane prøve (H) er fra en kronisk HBV-in-30 ficeret hepatomlever og den anden fra en HBV-infektion i den akutte fase (H). Der anvendes både en uinficeret chimpanse (C) og en chimpanse, kronisk inficeret med HBV (C) , for at få levercellelysater, som reageres mod anti-X-polypep-tid-antistoffer.

35 Anti-99 antistoffer reagerer mod både et 45000 dalton stort og et 28000 dalton stort (pil = venstre margin, højre 32 DK 174060 B1 p28) protein. Begge reaktiviteter blokeres, når disse antistoffer præinkuberes med polypeptid-99. Når anti-142-antistof fer reageres mod disse samme cellelysater, detekteres specifikke bånd ved 40000, (p40), 28000 (p28) og 17000 (pl7) .

5 Reaktiviteterne mod disse proteiner anses for at være specifikke, fordi de fjernes, når anti-142-antistoffer præinkuberes med polypeptid-142.

Kontrolprøven, en uinficeret chimpanselever (lane 3 i alle plader) viser det ca. 45000 dalton store protein 10 (p45) med anti-99-antistoffer og både p40 og pl7 med anti- -142-antistoffer. Protein P28 udtrykkes kun i HBV-inficerede væv (lane-celler (lane 5)). Immunreaktiviteten mistes, når antistof præinkuberes med polypeptid-99 (lane 6), men ikke med et ubeslægtet polypeptid (lane 7) . P ræ i mmun - se rumkontrol-15 len immunreagerer ikke (lane 8) . Der detekteres ikke nogen X-specifik reaktivitet i kontrol HepG2-lysaterne (lane 1- 4). Disse resultater fastslår, at et X-genprodukt udtrykkes i en human hepatomcellelinie indeholdende integrerede HBV--DNA-sekvenser.

20 Tilstedeværelsen af et 45000 dalton stort protein iagttages ligeledes i en relativt lille mængde i lysaterne fra PLC/PRF/5-cellerne, vist i fig. 7. Immunreaktionen mellem anti-99-antistoffer og det 45000 dalton store protein blokeres ligeledes ved præinkubation af antistofferne med immuni-25 seringspolypeptidet 99. Dette er vist i lane 6 i fig. 7.

Det viser sig, at normale levercelleekstrakter (HBV-seronegative) kun udtrykker det 45000 dalton store protein i Western Blot analysen ved anvendelse af anti-99. Desuden svigter kontrolanalyser, som er kørt ved anvendelse af kom-30 mercielt tilgængelige antistoffer, produceret mod HBs, HBc og HBe (Abbott Laboratoreis, North Chicago, IL, USA) med hensyn til at identificere begge proteiner, lokaliserede ved hjælp af de her omhandlede antistoffer. Dette tegn tyder atter på, at det 45000 dalton store protein har antigene 35 determinanter homologe med HBxAg, men at det 28000 dalton store protein, genkendt af anti-99, er specifikt for en 33 DK 174060 B1 HBV-sygdomstilstand og er forskellig fra HBsAg, HBeAg og HBcAg.

d. X-cren i leverceller.

5 Ekspressionen af p28 i PLC/PRF/5-celler integreres fra HBV-DNA i værts-DNA'et. Det er af interesse at bestemme, om dette er den eneste måde, på hvilken X-proteinet kan udtrykkes.

Derfor afprøves de chimpanse- og humane lever-DNA'er, 10 som udviser X-protein, med HBV-DNA (fig. 9) . Det samlede DNA isoleres fra lever-vævene, repræsenterede i fig. 8, og analyseres for tilstedeværelsen af HBV-DNA-sekvenser. DNA fra den 28000 dalton store protein-holdige chimpanse afslører homologe bånd, når det spaltes med BamHI, EcoRI, eller når 15 det er ikke-nedbrudt (fig. 9, lane nr. henholdsvis 1, 2 og 3). BamHI spalter cirkelformet HBV-DNA i to fragmenter (1850 og 1350 basepar), båndene ved 5,8 Kb (lane 1) repræsenterer en integreret sekvens, som er større end størrelsen af et genom. Eftersom der ikke ses nogen bånd under båndet med 20 DNA'et med den højre molekylvægt (lane 3), konkluderer man, at der kun er integrerede sekvenser af HBV til stede i dette DNA.

Desuden præpareres DNA fra en HBcAg-positiv menneskelever og afprøves med HBV-DNA. Restriktionsenzymspaltning 25 med Hindlll, BamHI, EcoRI eller ikke-nedbrudt DNA (fig. 7, lane henholdsvis 7-10) afslører homologe sekvenser, som enten er lig med eller mindre end genomstørrelse, og derved fjernes ethvert tegn på, at disse humane DNA-prøver indeholder integrerede sekvenser. Chimpanse- og menneskelevervæv, 30 hvori det 28000 dalton store protein mangler, er ligeledes negative med hensyn til HBV-DNA-sekvenser (fig. 9, henholdsvis lane 4-6 og lane 11-14). De data, som er vist i fig. 9, bekræfter, at X-protein udtrykkes i HBV-inficerede væv uden hensyn til tilstanden af HBV-genomet og fjerner derfor HBV-35 -DNA-integrationsbetingelsen for X-ekspression.

34 DK 174060 B1 e. Opsummering af resultaterne.

De ovenfor beskrevne resultater godtgør eksistensen af et tidligere uidentificeret viraltkodet protein i HBV--inficerede humane- og chimpanselevervæv. Dette 2800 dalton 5 store protein (p28) kodes for med HBV-genomet, hvad enten det foreligger frit i en ekstrachromosomal form, eller det forefindes integreret i celle-DNA'et.

Det 28000 dalton store protein (p28) er ikke produktet af X-regionen alene, men indeholder yderligere HBV-sekvenser.

10 Den forudsagte størrelse af X-protein, baseret på den sekvens, som er refereret af Galibert et al., jf. ovenfor, er ca. 17000 dalton (fig. 6) . Imidlertid er molekylvægten af X-proteinet, detekteret med anti-X-peptid-antistoffer i PLC/PRF/5-celler, samt i chimpanse- og humane HBV-inficerede 15 væv, 28000 dalton. Uoverensstemmelsen i størrelse skyldes ikke en fusion af X-genet med cellulære sekvenser, eftersom manglen på integreret HBV-DNA i humane væv udtrykkende p28 (fig. 9, lane 7-10) tyder på, at X-proteinet (p28) udelukkende translateres fra HBV-genomet.

20 Den øgede størrelse af X-proteinet kan forklares, hvis proteinet er enten en HBsAg-X- eller en X-HBcAg-fusion. Muligheden af en sådan fusion antydes ved disse HBV-geners nærhed til hinanden på genomet.

Et forsøg på at bestemme eksistensen af en sådan 25 fusion på RNA-niveauet gennemførtes uden held på grund af det faktum, at de transcripter, der fås i PLC/PRF/5-cellerne, som viste sig at indeholde X-sekvenser, ligeledes har enten overflade- eller coresekvenser samt X (data ikke vist). Lignende resultater rapporteres af Gough (1983), J. Mol.

30 Biol., 165:683-699. Påvisning af en X-core-fusion kommer fra DNA-sekvensen af et andet medlem af Hepadnavirus-familien, "duck” hepatitis B-virus (DHBV), hvor begge gener translateres som et enkelt protein [Mandart, et al. (1984), J. Virol., 49:782-792, og fra et arbejde af Feitelson et 35 al. (1982), J. Virol., 43:687-696.

Det faktum, at X-regionen af HBV udtrykkes, er blevet 35 DK 174060 B1 fastslået. Imidlertid forbliver funktionen af dette genprodukt ukendt. En proteinmolekyle, som man ligeledes har formodet er et translationsprodukt af X-regionen, er fundet i tilknytning til HBV-genomet eller nærmere bestemt er kovalent 5 bundet til 5'-nick'en af L-strengen, Gerlich et al. (1980),

Cell, 21:801-809. Ideen om, at X-proteinet repræsenterer et DNA-bindingsprotein, blev elimineret, når DNA-ase-behandling af PLC/PRF/5-celler eller HBV-inficerede væv ikke kunne fjerne eller ændre p28 aktivitet (data ikke vist).

10 For tiden er der kun kendt lidet vedrørende HBV-infek- tionens biologi eller den korrelation, der er fremsat mellem HBV-infektion og det følgende angreb af hepatocellulært carcinom. Vedrørende dette er hvilken som helst yderligere markør for HBV-infektion eller for tilstedeværelsen af HBV-15 -sekvenser af stor betydning. Humant sera undersøges for tiden for tilstedeværelsen af anti-X-antistoffer og X-proteinet .

Udtrykket "tilsvarende" i dets forskellige gramatiske former anvendes heri og i kravene i relation til polypeptid-20 sekvenser i betydningen den beskrevne polypeptidsekvens plus eller minus op til tre amino syregrupper ved den ene eller begge amino- og carboxyterminalerne og indeholdende kun konserverende substitutioner i bestemte aminosyregrupper langs med polypeptidsekvensen. Udtrykket "konserverende sub-25 stitution", som det anvendes ovenfor, skal betyde, at man har erstattet en aminosyregruppe med en anden biologisk lignende gruppe. Eksempler på konserverende substitutioner omfatter substitutionen af en hydrofob gruppe, såsom Ile,

Val, Leu eller Met, med en anden, eller substitutionen af en 3 0 polær gruppe med en anden, såsom Arg og Lys, Glu og Asp eller Gin og Asn.

I nogle tilfælde har man benævnt erstatningen af en iongruppe med en modsat ladet iongruppe, såsom Asp med Lys, konserverende ved, at disse iongrupper menes blot at virke 35 som hjælpestoffer med hensyn til opløselighed. Eftersom de ombytninger, som omtales heri, foregå på relativt korte 36 DK 174060 B1 syntetiske polypeptidantigener, sammenlignet med et helt protein, anses erstatning af en iongruppe med en anden iongruppe med modsat ladning imidlertid almindeligvis at være en "radikal ombytning", såsom ombytninger mellem ikke-ioniske 5 og ioniske grupper, og voluminøse grupper, såsom Phe, Tyr eller Trp, og mindre voluminøse grupper, såsom Gly, Ile og Val.

Udtrykkene "ikke-ioniske" og "ioniske" grupper anvendes heri i deres sædvanlige betydning til at betegne de 10 aminosyregrupper, som henholdsvis normalt ingen ladning har eller normalt har en ladning ved fysiologiske pH-værdier. Typiske eksempler på ikke-ioniske grupper omfatter Thr og Gin, medens eksempler på ioniske grupper omfatter Arg og Asp.

Udtrykket "antigen" har historisk været anvendt til 15 at betegne en entitet, som er bundet med et antistof, og ligeledes til at betegne entiteten, som inducerer produktionen af antistoffet. Mere aktuel anvendelse begrænser betydningen af antigen til den entitet, som er bundet af et antistof, medens ordet "immunogen" anvendes for den entitet, 20 som inducerer antistofproduktion.

I nogle tilfælde er antigenet og immunogenet den samme entitet, som når der anvendes et syntetisk polypeptid til at inducere produktion af antistoffer, som binder til polypeptidet. Imidlertid kan de samme polypeptider (99, 100 25 eller 142) ligeledes inducere antistoffer, som binder til et helt protein, såsom HBxAg, og i dette tilfælde er polypeptidet både immunogen og antigen, medens HBxAg er et antigen.

Når en entitet, omtalt heri, både er immunogen og antigen, betegnes den almindeligvis som et antigen.

30 5. Analysesysterner og -metoder.

De ovennævnte resultater tyder på, at man kan anvende SVHBV-3 som en ekspressionsvektor. Den tilvejebringer ekspressionskontrolelementer for fremmede DNA-sekvenser, ind-35 skudt i læseramme nedstrøms fra HBxAg-genet.

Resultaterne tyder ligeledes på, at syntetiske poly- 37 DK 174060 B1 peptider 99, 100 og 142 og antipeptid-antistoffer dermod kan anvendes som en del af et analysesystem og -metode til detektering af tilstedeværelsen af HBxAg i en legemsprøve, der skal analyseres, såsom hepatomceller eller leverceller 5 fra en dyrevært, der mistænkes for at have HBxAg, til detektering af heldig transfektion med SVHBV-3, og til at overvåge ekspression, når SVHBV-3 anvendes som en ekspressionsvektor.

Et sådant system omfatter mindst et første reagens indeholdende receptormolekyler, som omfatter et antistof 10 "combining site", såsom antistoffer, i det væsentlige hele antistoffer eller de velkendte Fab og F(ab')2-antistofpor-tioner, og som kan immunreagere med et syntetisk polypeptid ifølge opfindelsen, dvs. produceret mod de syntetiske poly-peptider ifølge opfindelsen. Indikatormidler, såsom et fluo-15 rescerende farvestof, såsom fluorescein eller rhodamin, et radioaktivt element, såsom iod-125 eller carbon-14, eller et enzym-bundet antistof, produceret mod den første reagens's receptorer {eksempelvis peroxidase-bundet gede-anti-kanin-IgG) , til at signalere immunoreaktion af receptorerne i det 20 første reagens med det ekspressionsspecifikke HBxAg, tilvejebringes ligeledes. Indikatormidlerne kan være bundet til at begynde eller frie fra det første reagens. Typiske anvendelser af et sådant HBxAg-analyse-reagens-system omfatter enzymimmunanalyse (ELISA) , radioimmunanalyser og im-25 munfluorescerende analyser (IF).

Diagnostiske analyser til bestemmelse af tilstedeværelsen af HBxAg i en legemsprøve ved anvendelse af polypep-tiderne ifølge opfindelsen og deres anti-polypeptid-antistoffer er allerede bredt beskrevet. I en kommerciel udførelses-30 form af en sådan diagnostisk analyse er et diagnostisk analysesystem omfattet.

Et sådant system omfatter tilvejebringelse af mindst en beholder med en anti-polypeptid-receptor, såsom anti-8, -42, -79, -99 eller -142, som det første reagens. En anden 35 beholder med en mængde af det polypeptid, som anti-polypep-tid-antistoffet er produceret mod, eksempelvis polypeptid 38 DK 174060 B1 8, -42, -79, -99 eller -142, kan ligeledes være et udstyr til tilvejebringelse af et andet reagens. Yderligere beholdere med de ovenfor beskrevne indikatormidler, en eller flere puffere og lignende, som er velkendt, kan ligeledes 5 tilvejebringes til det diagnostiske analysesystem.

En fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af et detekterbar mængde HBxAg er ligeledes beskrevet bredt ovenfor. I korthed omfatter denne fremgangsmåde, at man blander proteiner fra en legemsprøve, der skal analyseres, 10 såsom hepatom- eller leverceller, med receptorer, som omfatter et antistofbindingssted, der kan immunoreagere med et syntetisk polypeptid ifølge opfindelsen og med HBxAg, såsom anti-8, -42, -79, -99 eller -142 eller en Fab eller F(ab')--portion deraf, i nærværelse af et indikatormiddel, såsom 15 125I-mærket Staphylococcus aureus protein A eller en enzymmarkør, såsom peberrodsperoxidase, bundet til en af de ovennævnte receptorer til signalering af en immuno reakt ion mellem HBxAg og receptorerne. Blandingen opretholdes i en tidsperiode, som er tilstrækkelig til, at indikatormidlet kan sig-2 0 nalere, at der er sket en immunoreaktion, og tilstedeværelsen af signalet konstateres som ved et autoradiogram. Legemsprøven eller proteinerne derfra adsorberes fortrinsvis eller fæstnes (bindes) på anden måde til en faststofmatrix, såsom en nitrocelluloseplade eller præparatglas forud for blanding 25 med receptorerne.

Hvor indikatormidlet er et separat molekyle, såsom radiomærket S. aureus protein A, blandes den bundne legemsprøve og receptormolekylerne først i fravær af indikatormidlet, og blandingen opretholdes i en tidsperiode, som er 30 tilstrækkelig til at danne et bundet immunreaktionsprodukt.

Det bundne immunoreaktionsprodukt skylles derpå. Det separate molekyl-indikatormiddel blandes derpå med det bundne immunoreakt ionsprodukt , og denne blanding opretholdes i en tidsperiode, som er tilstrækkelig til, at et bundet, andet 35 reaktionsprodukt kan dannes. Det bundne andet reaktionsprodukt skylles derpå, og tilstedeværelsen af et signal fra 39 DK 174060 B1 indikatormidlet bestemmes.

Hvor indikatormidlet er en del af receptorerne ifølge opfindelsen, blandes de mærkede receptorer med den bundne legemsprøve, der skal analyseres, og blandingen opretholdes 5 i en tidsperiode, der er tilstrækkelig til, at et immunoreak-tionsprodukt kan dannes. Det bundne immunoreaktionsprodukt skylles derpå, og tilstedeværelsen af et signal fra indikatormidlet bestemmes.

Det ovennævnte andet reagens, eksempelvis polypep-10 tiderne 8, 42, 79, 99 eller 142, kan anvendes som et kontrolreagens i en immunoreaktions-blokeringsundersøgelse til at bekræfte, at der er sket en specifik, snarere end uspecifik immunobinding. Sådanne blokeringsundersøgelser er illustreret i figurerne 7, 8 og 10.

15 Til anvendelse af SVHBV-3 som en ekspressionsvektor indskydes fremmed DNA nedstrøms fra HBxAg-genet, fortrinsvis ved dets singulære BamHI-restriktionssted, og den således fremstillede nye vektor anvendes til at transficere celler. Ekspression af HBxAg i en transficeret celle er sandsyn-20 lighedsbevis på ekspression af det fremmede DNA, indskudt i SVHBV-3. Ekspression af HBxAg, detekteret med det ovenfor beskrevne HBxAg-ekspressions-analysesystem, viser ekspression af fremmed DNA, indskudt i SVHBV-3.

Således kan man anvende undersøgelse af cellekolonier, 25 produceret efter transfektionsforsøget ved anvendelse af det ovennævnte analysesystem til at udvælge de kolonier, hvori transfektion er vellykket. Eksempelvis høstes celler fra kolonier, der fremkommer ved forsøget på at indføre vektoren i eucaryotiske celler, de lyseres, og de cellulære 30 proteiner ekstraheres. De ekstraherede cellulære proteiner separeres herefter på en SDS-polyacrylamid-gel ved elektro-forese, og de adskilte proteiner blot'tes på nitrocellulose. Kontakt af de blot'tede proteiner i kontakt med et overskud af receptor og markør fra det ovenfor beskrevne analysesy-35 stem, såsom 125I-mærkede antistoffer mod syntetisk polypep-tid 99 eller polypeptid 142, fulgt af skylning til fjernelse 40 DK 174060 B1 af de ikke-immunoreagerede antistoffer (receptorer), kan derefter anvendes til fremstilling af et autoradiografi, som viser tilstedeværelsen af den udtrykte HBxAg-portion, som fusioneres til polypeptidet, som det fremmede gen koder 5 for.

De ovenfor beskrevne analysemetoder og -systemer er især anvendelige til identifikation af X-proteinet eller en væsentlig del deraf, som kan være til stede i en legemsprøve, især en vævsprøve, såsom i celler fra en leverbiopsi. Den 10 diagnostiske analyse og metode, beskrevet nedenfor, er især anvendelig til bestemmelse af tilstedeværelsen af antistoffer mod X-proteinet, som kan være til stede i en legemsprøve, såsom fuldblod, serum eller plasma. En Western blot analyse vil blive anvendt som typisk eksempel på en sådan diagnostisk 15 metode. Imidlertid er en kommerciel udførelsesform, hvori fremgangsmåden anvendes, et ELISA (enzymimmunanalyse) diagnostisk system.

Her anvendes et ekspressionsprodukt fra SVHBV-3-vek-tor-transficerede celler, såsom det ca. 2400 dalton store 20 protein (polypeptid), udtrykt i BSC-l-celler, omtalt i relation til fig. 10, fortrinsvis som antigenet, skønt man ligeledes kan anvende et foretrukket polypeptid ifølge opfindelsen, såsom polypeptid-99 eller polypeptid-142. Således kan man anvende selve HBxAg-molekylet, anvendt i i det væsentlige 25 ren form, opnået ved affinitetschromatografi, omtalt nedenfor, en væsentlig del af HBxAg-molekyle, såsom det er udtrykt ved SVHBV-3-transficerede BSC-l-celler (det 24000 dalton store polypeptid) eller et polypeptid i aminosyregruppese-kvensen svarende til en antigen determinant af HBxAg, som 30 antigenet.

Antigenet er fortrinsvis bundet til (adsorberet til) eller på anden måde fæstnet til en faststofmatrix, såsom den tværbundne dextran, der kan fås under varemærket "Sepha-dex" fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey, 3 5 USA) , agarose, glasperler, polyvinylchlorid, polystyren, tværbundet acrylamid, nitrocellulose eller fordybningerne i 41 DK 174060 B1 en mikrotiterplade til dannelse af en fast understøtning.

Antigenet, fortrinsvis bundet til en faststofmatrix som del af en fast understøtning, blandes med en flydende legemsprøve, der skal analyseres, til dannelse af en fast-5 stof/væskefase-blanding. Blandingen opretholdes i en tidsperiode, som er tilstrækkelig til, at anti-X-protein (anti-HBxAg)-antistofferne (HBxAb), som er til stede i legemsprøven, kan immunoreagere med antigenet. Tilstedeværelsen af denne immunoreaktion bestemmes derpå, såsom ved hjælp af et 10 indikatormiddel, til at signalere tilstedeværelsen af anti--X-protein-antistoffer i den analyserede legemsprøve.

Eksempelvis fremstilles i en undersøgelse SVHBV-3--vektor-transficerede BSC-l-cellelysater, de adskilles elektroforetisk og overføres og bindes til nitrocelluloseplader 15 som en faststofmatrix på en måde, som i det væsentlige er lig med den, som er omtalt i relation til fig. 10, til dannelse af en faststoffase. Sera, fortyndet i forholdet 1:50, fra seks patienter med forskellige hepatitissygdomme blandes derpå særskilt med de nitrocellulose-bundne transficerede 20 BSC-1-celleproteiner til dannelse af faststof/væskefase--blandinger. Disse blandinger opretholdes i en tidsperiode (2 timer), som er tilstrækkelig til, at anti-X-antistoffer, til stede i sera, kan immunoreagere med det bundne antigen.

Efter skylning for at adskille de faste og flydende 25 faser blandes de faste faser, som fremkommer ved de ovennævnte trin, særskilt med flydende opløsninger indeholdende fortyndinger i forholdet 1:200 af gede-anti-human- eller-anti-kanin-antistoffer, konjugerede til peberrodsperoxidase som et indikatormiddel til dannelse af andre, faststof/væske-30 faseblandinger. De særskilte andre faststof/væskefaseblandinger opretholdes i en tidsperiode (1 time) , der er tilstrækkelig til, at de mærkede antistoffer kan reagere med humane anti-X-antistoffer, som har immunoreageret med det matrixbundne antigen. Kanin-anti-polypeptid-antistoffer 35 anvendes som kontroller sammen med gede-anti-kanin-antistof-ferne. Den fremkome fastfase/væskefase-blanding separeres 42 DK 174060 B1 atter og skylles. Ved de fremkomne fastfaser anvendtes der derpå opløsninger indeholdende 4-chlor-l-naphthol som beskrevet vedr. fig. 8.

Resultaterne af denne undersøgelse viser, at serum 5 fra en patient med diagnosen heptacellulært carcinom indeholder antistoffer, som er bundet til polypeptidet, udtrykt ved SVHBV-3-vektoren i de transficerede BSC-l-celler. Disse antistoffer er således anti-X-antistoffer, og deres tilstedeværelse fastslår X-produktet som et ægte antigen i et eller 10 andet stadium af HBV-infektionen.

Når det ca. 24000 dalton store polypeptid ekspressionsprodukt, anvendt i den ovenfor beskrevne Western blot analyse, anvendes som antigenet i en ELISA, som omtalt nedenfor, eller i andre lignende analyser, renses og isoleres 15 dette polypeptid fortrinsvis forud for anvendelse. Denne rensning og isolering kan opnås ved velkendte fremgangsmåder.

Eksempelvis kan man fremstille anti-8-, -42-, -79-, -99- eller -142-antistoffer eller antistofbindingsstederne deraf som beskrevet heri, og de kan bindes til en faststof-20 matrix, såsom agarosen og tværbundne agarose-derivater, solgt under varemærkerne "Sepharose" 6B, CL6B, 4B og CL4B af Pharmacia Fine Chemicals, eller de, der sælges under varemærkerne "Bio-Gel" A-0,5M, A-1,5M og A-50M af Bio-Rad Laboratories of Richmond CA, USA. Den ovenfor beskrevne tværbundne 25 dextran, solgt under varemærket "Sephadex", og polyacrylamid-perler, solgt under varemærkerne Bio-Gel P-2, P-30, P-100 og P-300 ligeledes af Bio-Rad Laboratories, er ligeledes anvendelige faststofmatricer. Anvendelse af en matrix, der omfattes af et agarosederivat, diskuteres til belysning 30 nedenfor.

Agarose-matricen aktiveres typisk til binding ved anvendelse af bromcyanid. Den aktiverede matrix vaskes derpå og bindes til de ønskede antistof (receptor) molekyler uden tørring af den aktiverende matrix. Det matrix-bundne antistof 35 vaskes derpå og er parat til anvendelse. Uomsatte reaktive grupper på matricen kan omsættes med en amin, såsom ethanol- 43 DK 174060 B1 amin eller tris, om ønsket, skønt disse reaktive grupper hurtigt henfalder.

Affinitetssorbanten kan anvendes i løs tilstand, som i bæger eller kolbe, eller den kan være indespærret i en 5 søjle. Forud for anvendelse foretrækker man, at affinitetssorbanten vaskes i pufferen eller andet vandigt medium, anvendt til rensning af cellelysater indeholdende det ca.

24000 dalton store polypeptid til fjernelse af uspecifikt bundne proteiner eller de antistoffer, som er ustabilt bundne 10 til støttematerialet.

Der tilvejebringes en vandig sammensætning indeholdende det SVHBV-3-vektor-transficerede cellelysat, som derpå blandes med affinitetssorbanten. Denne blanding danner et reversibelt, bundet antistof-antigen (receptor-ligand)-kom-15 pleks mellem det bundne antistof (receptor) og det ca. 24000 dalton store polypeptid (antigen).

Det bundne receptor-ligandkompleks adskilles derefter fra resten af den ukompleksede vandige sammensætning for derved at få polypeptid-antigenet i renset form, bundet til 20 affinitetssorbanten. Når blandingen sker i et bæger eller kolbe, kan denne adskillelse foretages ved filtrering og vaskning. Når sorbanten er i en søjle, kan adskillelsen ske ved eluering af det ukompleksede vandige medium, atter fortrinsvis fulgt af et vasketrin.

25 Når det rensede polypeptid-antigen ønskes fri for affinitetssorbanten, kan det typisk opnås ved forskellige fremgangsmåder. I hvilke som helst af disse fremgangsmåder dissocieres det reversibelt bundne receptor-ligandkompleks i komponenterne: matrixbundet receptor og polypeptid-anti-30 gen-ligand, fulgt af fraskilelse af polypeptid-antigen-liganden fra den bundne receptor, hvorved man får en opløsning af den rensede polypeptid-antigen-ligand, fri for affinitetssorbanten. Opløsningen kan anvendes som sådan, eller den kan koncentreres eller tørres forud for anvendelsen som 35 ønsket. I nogle tilfælde kan det være ønskeligt at afsalte opløsningen forud for anvendelse, såsom det er kendt.

44 DK 174060 B1

Dissociationen af det reversible kompleks kan ske på adskillige måder. Der anvendes typisk en 0,2 molær glycin-hy-drochlorid-opløsning ved en pH-værdi på ca. 2,5. Alternativt kan man konkurrere den bundne polypeptid-antigen-ligand væk 5 fra den bundne receptor ved blanding af det reversible kompleks med et overskud af det immunogene polypeptid, anvendt til at producere antistofferne, dvs. polypeptid-99, hvor anti-99-antistoffer bindes til matricen. Ved en sådan konkurrence undgås mulig denaturering af polypeptid-antigenet.

10 Fraskillelse af det dissocierede polypeptid-antigen fra affinitetssorbanten kan opnås som ovenfor.

Fremstillingen af affinitetssorbanter og anvendelsen deraf er ganske gammel. Imidlertid har sådanne materialer og anvendelser, som inkorporerer antistoffet og antigen-15 molekylerne ifølge opfindelsen, ikke hidtil været tilgængelige. En detaljeret beskrivelse af affinitetssorbanter, fremgangsmåde til fremstilling og anvendelse deraf, hvor antigenet bindes til matricen, kan findes i Antibody as a Tool, Marchalonis og Warr udg., John Wiley & Sons, New York, 20 s. 64-67 og 76-96 (1982).

En ELISA, der skal tjene som eksempel, hvori der anvendes den ovennævnte fremgangsmåde, anvender et faststof-støttemateriale, som omfatter det ovenfor beskrevne antigen ifølge opfindelsen, adsorberet på eller på anden måde fæstnet 25 til en faststofmatrix, omfattet af fordybningerne i en mikro-titerplade med 12 eller 96 fordybninger, fremstillet af polystyren eller polyvinylchlorid, til udformning af faststof støttematerialet . Uspecifikke bindingssteder på mikro-titerfordybningsvæggene blokeres derefter typisk med et 30 protein, såsom bovinserumalbumin (BSA) . Hvilket som helst ubundet antigen og BSA fjernes fra mikrotiterfordybningen, eksempelvis ved skylning.

En legemsprøveportion, såsom humant serum, -blod eller -plasma, blandes med det ovenfor beskrevne antigen-35 bundne faststofstøttemateriale til dannelse af en blanding indeholdende faste og flydende faser. Faststof/væskefase- 45 DK 174060 B1 -blandingen opretholdes i en tidsperiode, som er tilstrækkelig til, at anti-X-protein-antistoffer i legemsprøven kan immunoreagere med polypeptid-antigenet til dannelse af et polypeptid-holdigt immunoreaktionsprodukt, dvs. fra ca. 30 5 minutter til ca. 2 timer. De faste og flydende faser adskilles derefter almindeligvis.

En flydende opløsning af et andet, mærket, indikatormiddel -holdigt antistof, antistofbindingssted eller S. aureus protein A, som reagerer med det førstnævnte antistof, blandes 10 derpå med den faste fase til dannelse af en anden faststof/-væskefaseblanding, dvs. en mærket reaktionsblanding. Et andet antistof, der skal tjene som eksempel, er et peroxi-dase-mærket gede-antihuman-Ig-antistof, hvor de førstnævnte antistoffer er fra en human legemsprøve. Desuden omfatter 15 anvendelige enzymmarkører alkalisk phosphatase, β-D-galacto-sidase og glucoseoxidase.

Blandingen, dannet ud fra den faste fase (det fast-stofmatrix-bundne antigen-antistof-immunoreaktions-produkt) og den anden, mærkede antistof-opløsning holdes (inkuberes) 20 i en tidsperiode (eksempelvis ca. 1 time) , som er tilstrækkelig til, at der dannes et reaktionsprodukt mellem det bundne førstnævnte antistof og indikatormidlerne, såsom en anden immunoreakt ion mellem de to antistoffer. De faste og flydende faser adskilles derefter.

25 Det andet antistof, beskrevet ovenfor, kan ligeledes være specifikt for og immunoreagere med kun en af klasserne af immunoglobulin (eksempelvis IgG, IgM, IgE, IgA eller IgD). Sådanne antistoffer giver mulighed for at identificere immunoglobulin-klassen af anti-X-protein-antistof, til stede 30 i legemsprøven. Desuden kan det andet antistof eller antistofbindingssted være specifikt for og immunoreagere med kun en af de to typer af immunoglobuliner med lette kæder (eksempelvis kappa eller lambda). Disse antistoffer giver mulighed for at identificere isotypen af det immunoglobulinmolekyle, 35 som er til stede i legemsprøven, og er velkendte.

En opløsning indeholdende et substrat for enzymmar- 46 DK 174060 B1 køren, såsom hydrogenperoxid for peroxidase og en farvedan-nende farvestof-forløber, såsom o-phenylendiamin eller 4--chlor-l-naphthol, eller p-nitrophenyl-phosphat for alkalisk phosphatase, blandes derefter med faststoffasen. Den optiske 5 densitet ved en på forhånd valgt bølgelængde (eksempelvis henholdsvis 490 eller 405 nanometer) kan derefter bestemmes, efter at en tilstrækkelig tidsperiode er forløbet (eksempelvis 60 minutter), og sammenlignes med den optiske densitet af en kontrol til bestemmelse af, om anti-X-protein-antistof-10 fer er til stede i legemsprøven.

En anden udførelsesform for opfindelsen omfatter et diagnostisk system i sætform, som omfatter et fast støttemateriale, der omfatter en faststofmatrix, såsom en mikro-titerstrimmel af polystyren med tolv fordybninger, og et 15 ovenfor beskrevet antigen ifølge opfindelsen, absorberet (bundet) eller på anden måde fæstnet til denne faststofmatrix til dannelse af et fast støttemateriale. Dette system omfatter fortrinsvis ligeledes særskilt pakkede anti-human-Ig--antistoffer med en bundet indikator, såsom peroxidase-mærket 20 gede-anti-human-Ig-antistoffer, og kan ligeledes omfatte et substrat for den bundne indikator, såsom hydrogenperoxid, og en farvedannende passende forløber, såsom o-phenylen-diamin, i yderligere, separate pakninger. Hydrogenperoxid er typisk ikke omfattet af sættet på grund af dets relative 25 ustabilitet og tilføres typisk af slutbrugeren, skønt en beholder med hydrogenperoxid ligeledes kan være en bestanddel at det diagnostiske system. Puffersalte, anvendelige i en analyse, hvori dette system anvendes, kan ligeledes være omfattet i en eller flere særskilte pakninger i tør eller 30 flydende form. Et foretrukket polypeptid ifølge opfindelsen, såsom polypeptid-99, kan ligeledes være omfattet i en særskilt pakning til anvendelse ved kompetitive bindingsundersøgelser som en kontrol. En analyse for tilstedeværelsen af anti-X-protein-antistoffer i en legemsprøve, såsom serum, 35 kan udføres med dette diagnostiske system ved anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.

47 DK 174060 B1 6. Fremstilling af polymere.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen kan forbindes til dannelse af en vand-opløselig eller vand-dispergerbar antigen polymer omfattende en flerhed af de polypeptid-repeterende 5 enheder. En sådan polymer har en fordel ved øget immunologisk reaktion. Når der anvendes forskellige polypeptider til at udgøre den polymere, har sådanne polymere en yderligere evne til at inducere antistoffer, som immunoreagerer med en flerhed af antigene determinanter af HBxAg.

10 En polymer kan fremstilles ved syntetisering af poly peptiderne som omtalt nedenfor til at indeholde to cystein-grupper. De to cysteingrupper kan være til stede på en terminal og i polypeptidkæden, eller både ved amino- og carb-oxyterminalerne. Et polypeptid indeholdende to cysteiner 15 omtales almindeligvis heri som et "diCys"-polypeptid, medens et polypeptid, som indeholder to endestillede cysteingrupper, heri omtales som et "diCys-termineret" polypeptid. Sådanne cysteingrupper i polypept idkæden eller ved polypeptidkædeter-minalerne kan være til stede i HBxAg-sekvensen, hvortil 20 polypeptidet svarer, eksempelvis det centrale cystein i polypeptid 142 (den 7. gruppe, regnet fra det carboxyter-minale alanin (Ala)), det carboxyterminale cystein (cys) af polypeptid-99, eller man kan tilsætte terminale cysteingrupper til fremstilling af den polymere.

25 Anvendelige diCys-polypeptider, der kan tjene som eksempel, er polypeptider, som er repræsenteret ved de nedenfor viste formler, skrevet fra venstre til højre og i retning fra aminoterminalen til carboxyterminalen:

Polypeptid 8a: R1-Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val- 30 Leu-Cys-Leu-Arg-Pro-Val-Gly-R2;

Polypeptid 42a: Cys-Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys,

Polypeptid 79a: Cys-Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Cys, 35 Polypeptid 99a: Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-

Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys, 48 DK 174060 B1

Polypeptid 100a: Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-

Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys og

Polypeptid 142a: R1-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2, 5 idet R1 og R2 hver for sig er en cysteingruppe, med det forbehold, at kun den ene af R1 og R2 er til stede.

Som vist i fig. 6 indeholder hver af polypeptiderne 8, 42, 99, 100 og 142 en cysteingruppe, som er til stede i aminosyregruppesekvensen af det translaterede X-genom. Det 10 gentages, at polypeptider med aminosyregruppesekvenserne af polypeptiderne 99 og 100 undtagen de terminale cy s teingrupper ligeledes er anvendelige heri til immunoreaktionsblokerings-undersøgelser og hvor kobling til en bærer ved hjælp af andet end MBS-reaktionen, omtalt nedenfor, anvendes.

15 Når der tilsættes en eller to endestillede cystein- grupper til polymerfremstilling, og den resterende aminosyre-gruppesekvens svarer til en antigen determinant af HBxAg, anses polypeptidgentagelsesenheden stadigvæk at svare til en antigen determinant af HBxAg.

20 Ved en typisk fremstilling i laboratorium opløses 10 mg af diCys-polypeptidet (indeholdende cysteingrupper i uoxideret form) i 250 ml 0,1 molær ammoniumhydrogencarbonat--puffer med en pH-værdi på ca. 8. Det opløste diCys-afsluttede polypeptid oxideres derpå ved hjælp af luft ved blid 25 omrøring af den fremkomne opløsning i en periode på ca. 18 timer, eller indtil der ikke kan detekteres fri mercaptan ved Ellman-prøven, jfr. [Ellman (1959), Arch. Biochem. Bio-phys., 82:70-77].

Den således fremstillede polymer indeholder en flerhed 30 af de her omhandlede polypeptider som repeterende enheder.

Disse polypeptidrepeterende enheder er bundet sammen med oxiderede cysteingrupper.

En sådan polymer indeholdende en flerhed af polypeptiderne ifølge opfindelsen kan repræsenteres med formlen, 35 skrevet fra venstre til højre og i retning fra aminoter-minalen til carboxyterminalen.· 49 DK 174060 B1 (A) a* (B)b idet A og B er forskellige polypeptidrepeterende enheder, 5 såsom polypeptiderne 8, 42, 79, 99, 100 og 142. Indexbog- staverne a og b er hele tal, som hver har en gennemsnitsværdi fra 0 til ca. 2000 med det forbehold, at summen af gennemsnitsværdierne for a og b er mindst 2 således, at der er mindst to polypeptidrepeterende enheder til stede i den 10 polymere.

Summen af gennemsnitsværdierne for indexbogstaverne foroven a og b er typisk ikke større end ca. 2000 således, at den fremkomne polymer har en gennemsnitsmolekylvægt på ca. 5.000.000 dalton. I en foretrukken udførelsesform er gen-15 nemsnitsmolekylvægten af den polymere fra ca. 50000 til ca.

1.000.000 dalton.

Den ovennævnte formel er tilsigtet at være en generaliseret repræsentation af gentagelsesenhederne i den polymere og af gennemsnitsantallet af hver tilstedeværende gentagel-20 sesenhed. De polymere ifølge opfindelsen, som indeholder to forskellige repeterende enheder, er typisk statistiske copo-lymere. Således er det ikke meningen, at den ovennævnte formel skal repræsentere den rækkefølge, hvori de polypeptid-- repeterende enheder er til stede i den polymere, eksempelvis 25 som i en blokcopolymer.

De ovenfor beskrevne vand-opløselige eller vand-dis-pergerbare polymere ifølge opfindelsen er både immunogene og antigene og beskrives derfor heri som antigene, som ovenfor omtalt. Sådanne antigene polymere kan, når de dispergeres 30 i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel og indføres såsom ved immuniserende injektion i en mængde på 400 mikrogram polymer pr. kanin, inducere produktionen af antistoffer i New Zealand Red kaniner, som immunoreagerer med HBxAg. Fysiologisk acceptable fortyndingsmidler, der skal tjene 35 som eksempler, er velkendte inden for immunologi og omtales i yderligere enkeltheder nedenfor.

50 DK 174060 B1 7. Kobling af oolvpeptider til dannelse af proteinbærere .

De heri anvendte syntetiske polypeptider kobles til "keyhole limpet hemocyanin" (KLH) ved anvendelse af den 5 følgende velkendte fremgangsmåde. KLH-bæreren aktiveres først med m-maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester og kobles derpå til polypeptidet ved hjælp af en cysteingruppe, som er til stede ved polypeptid-aminoterminalen (polypeptid 100) , carboxyterminalen (polypeptid 99) , eller ved at anvende 10 det centrale cystein i polypeptid 142, ved hjælp af en Michael additionsreaktion, som beskrevet i Liu et al. (1979), Biochem., 80, 690.

Man kan ligeledes koble et polypeptid ifølge opfindelsen til en bærer ved hjælp af andre måder, og det kan kobles 15 til bærere, som er forskellige fra KLH. Eksempelvis kan man koble et polypeptid, eksempelvis 99b, til en tetanus-toxoid-bærer ved hjælp af frie aminogrupper, idet man anvender en 0,04% glutaraldehyd-opløsning, såsom det er velkendt, jfr. eksempelvis Klipstein et al. (1983), J. Infect.

20 Disc., 147:318.

Cysteingrupper, som er til stede ved amino- eller carboxyterminalerne eller i den centrale del af det syntetiske polypeptid, har vist sig at være særligt anvendelige til dannelse af konjugater via disulgifbindinger og Michael-25 -additionsprodukter, men man kan ligeledes anvende andre velkendte fremgangsmåder til fremstilling af konjugater. Yderligere bindingsfremgangsmåder, der skal tjene som eksempler, omfatter anvendelsen af dialdehyder, såsom glutar-aldehyd (omtalt ovenfor), eller anvendelsen af carbodiimid-30 -teknik, som ved anvendelsen af vand-opløseligt carbodiimid, såsom i-ethyl-3 -(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, til dannelse af amidbindinger mellem bæreren og polypeptidet.

Anvendelige bærere er velkendte og er almindeligvis selv proteiner. Bærere, der skal tjene som eksempel, er 35 "keyhole limpet hemocyanin" (KLH), edestin, thyroglobulin, albuminer, såsom bovinserumalbumin eller human serumalbumin 51 DK 174060 B1 (henholdsvis BSA eller HSA), røde blodceller, såsom fåre ("sheep") erythrocyter (SRBC), tetranus toxoid, koleratoxoid samt polyaminosyrer, såsom poly(D-lysin:D-glutaminsyre).

Som det er velkendt, er det ofte gavnligt at binde 5 det syntetiske polypeptid til bæreren ved hjælp af en intermediær bindingsgruppe. Som ovenfor bemærket er glutaraldehyd en sådan bindingsgruppe.

Når cystein anvendes er den intermediære bindingsgruppe imidlertid fortrinsvis en m-maleimidbenzoyl-N-hydroxysuc-10 cinimidester (MBS), som ovenfor omtalt. MBS adderes typisk først til bæreren ved hjælp af en ester-imid-ombytningsreak-tion. Herefter kan man følge den ovennævnte Michael-reaktion, eller MBS-additionen kan følges af en Michael-addition af en blokeret mercaptogruppe, såsom thioleddikesyre (CH3COSH) 15 over maleimid-dobbeltbindingen. Efter spaltning af acyl--blokeringsgruppen dannes der en disulfidbinding mellem den deblokerede bindingsgruppe mercaptan og mercaptan i den adderede cysteingruppe i det syntetiske polypeptid.

Valget af bærer afhænger mere af den tiltænkte slut-20 anvendelse af antigenet end af determinantdelen af antigenet og er baseret på kriterier, som ikke specielt er involveret i den foreliggende opfindelse. Hvis et inoculum eksempelvis skal anvendes i pattedyr, såsom til produktion af anti-poly-peptid-antistoffer, der skal anvendes til analyse for til-25 stedeværelsen af HBxAg, bør man vælge en bærer, som ikke fremkalder en uheldig reaktion i det bestemte dyr. Hvis et inoculum, såsom en vaccine mod HBxAg, skal anvendes til mennesker, så er de alt overvejende bekymringer forbundet med mangelen på immunokemiske eller andre bireaktioner af 30 bæreren og/eller det fremkomne antigen, sikkerhed og effektivitet - de samme overvejelser, som gæld for hvilken som helst vaccine, der er tiltænkt til anvendelse i mennesker.

8. Immuniserinosfremqanqsmåder.

35 De inocula, der anvendes til immuniseringer, indehold er en effektiv mængde polypeptid, såsom en polymer af indi- 52 DK 174060 B1 viduelle polypeptider, bundet sammen ved hjælp af oxiderende cysteingrupper, eller som et konjugat af polypeptidet, bundet til en bærer. Den effektive mængde polypeptid pr. inokulering afhænger blandt andet af arten af det inokulerede dyr, dyrets 5 legemsvægt og det valgte inokuleringssystem, såsom det er velkendt. Inokula fremstilles typisk ud fra det tørrede, faste polypeptid-konjugat eller polypeptid-polymer ved suspension af polypeptid-konjugatet eller polypeptid-polymeren i vand, fysiologisk saltvand eller adjuvans.

10 Disse inokula indeholder typisk polypeptidkoncentra- tioner fra ca. 20 mikrogram til ca. 500 mg pr. inokulering.

De angivne mængder polypeptid refererer til vægten af polypeptid uden vægten af en bærer, når der anvendes en bærer.

Inokula indeholder ligeledes et fysiologisk accep-15 tabelt fortyndingsmiddel, såsom vand, phosphatpufret fysiologisk saltvand eller fysiologisk saltvand og omfatter yderligere en adjuvans som del af fortyndingsmidlet. Adjuvanser, såsom Freund's fuldstændige adjuvans (CFA), Freund's ufuldstændige adjuvans (IFA) og alun er materialer, som er vel-20 kendte, og som er kommercielt tilgængelige fra adskillige kilder.

Inokulumstamopløsninger fremstilles med CFA, IFA eller alun som følger: en mængde af det syntetiske polypeptid-konjugat eller polymere polypeptid, tilstrækkelig til 25 at give den ønskede mængde polypeptid pr. inokulering, opløses i phosphatpufret fysiologisk saltvand (PBS) ved en pH-værdi på 7,2. Ens rumfang CFA, IFA eller alun blandes derpå med polypeptidopløsningen, hvorved man får et inokulum indeholdende polypeptid, vand og adjuvans, hvori vand-til-30 -olie-forholdet er ca. 1:1. Blandingen homogeniseres derefter, hvorved man får inokulumstamopløsningen.

Kaniner, der anvendes heri til at producere anti--polypeptid-antistoffer, injiceres subkutant med et inokulum omfattende 200 mikrogram af et polypept idkon j ugat (polypeptid 35 plus bærer), emulgeret i Freund's fuldstændige adjuvans (CFA); 200 mikrogram polypeptidkonjugat, ufuldstændig i 53 DK 174060 B1

Freund's adjuvans (IFA), og 200 mikrogram polypeptidkonjugat med 4 mg alun injiceres intraperitonealt på dag henholdsvis 0, 14 og 21, i immuniseringsplanen. Hver inokulering (im munisering) består af fire injektioner af inokulet. Mus kan 5 immuniseres på lignende måde ved anvendelse af ca. 1/10 af den ovennævnte dosis pr. injektion.

Der udtages blodprøver fra dyrene typisk 4 og 15 uger efter den første injektion. Kontrolpræimmunserum fås fra hvert dyr ved at udtage en blodprøve lige før den ind-10 ledende immunisering.

Kontrolinokulumstamopløsninger kan ligeledes fremstilles med "keyhole limpet hemocyanin" (KLH), KLH i IFA, KLH-alun adsorberet, KLH-alun absorberet-pertussis, edestin, thyroglobulin, tetranustoxoid, tetanustoxoid i IFA, kolera-15 toxoid og koleratoxoid i IFA.

Ved injektion eller anden indførsel af antigenet eller inokulet i værtsdyret reagerer dyrets immunsystem ved at producere store mængder antistof mod antigenet. Eftersom den specifikke antigendeterminant af det fremstillede anti-20 gen, dvs. det antigen, der dannes af det syntetiske polypep-tid, bundet til bæreren eller til den polymere, svarer til determinanten i det naturlige antigen af interesse, fremstiller værtsdyret antistoffer ikke kun mod det syntetiske poly-peptidantigen, men ligeledes mod det protein eller polypep-25 tid, som det syntetiske polypeptidantigen svarer til, dvs. mod HBxAg, 9. Deponeringer.

De nedenfor opregnede materialer blev deponeret hos 30 American Type Culture Collection den 8. marts 1984 og har de for hvert materiale angivne accesssionsnumre. Alle betegnelser for cellelinier, vektorer og lignende, som omfatter bogstaverne "ATCC" fulgt af tal og/eller bogstaver og tal, refererer til materialer, deponeret hos den ovennævnte Ame-35 rican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA.

ATTC

54 DK 174060 B1

Materiale Accessionsnummer

Blanding af virus SVHBV-3 VR 2084 og SV 40 tsA239~hjælper-5 -virus

Vektor DNA

SVHBV-3 40102 AM6 40101 10 SVAM191 40103 E. coli EC-AM6 39630 EC-AM1 39629 15 EC-SVAM191 39631

Udover de ovennævnte materialer, der er deponert hos ATCC af opfinderne, er materialer, fremstillet af andre og anvendt heri, ligeledes blevet deponeret hos ATCC. Der er 20 angivet en liste over disse materialer:

ATTC

Materiale Accessionsnummer E. coli 25 W3110 27325 294 31446 RR1 31447 HB101 33694 3 0 Pattedyreceller

HepG2 CC1 23 BSC-1 CC1 26 COS-7 CRL 1651 35 PLC/PRF/5 CRL 8024

Vektor pBR322 37017 B. Materiale oa fremgangsmåde.

40 1. HBV-DNA-isolering oa fremstilling

Region XHBV-DNA isoleres fra Danepartikler, subtype adw, fra plasma fra en HBsAg-positiv human donor [National Institutes of Health #7371399) efter fremgangsmåden ifølge Robinson (Am. J. Med. Sci., (1975) 270:151-159]. I korthed 45 fortyndes 1,0 ml plasma til 3,0 ml med TN-puffer, som inde- 55 DK 174060 B1 holder 0,001 molær Tris-HCl (pH-værdi 7,4) og 0,5 M HC1.

Det fortyndede plasma centrifugeres ved 10.000 g i 10 minutter til fjernelse af store efterladenskaber og lagpåføres derpå over 2,5 ml 30 vægt/volumenprocent saccharose indehold-5 ende TN, 0,001 MEDTA (0,1% 2-mercaptoethanol og 1 mg bovin-serumalbumin pr. ml, som på forhånd er centrifugeret ved 10.000 g i 10 minutter for at fjerne udfældet BSA] . Efter centrifugering i 4 timer ved 50.000 opm og 4°C i en Spinco SW-65 rotor (Beckman Instruments, Inc.) fjernes den oven-10 stående væske forsigtigt, og pellet'en suspenderes atter i 50 mikroliter TN-puffer indeholdende 1% "Nonidet" P-40 (poly-oxyethylen (9) octyl-phenyl-ether, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) og 0,1% 2-mercaptoethanol.

Den enkeltstrengede del af HBV-DNA, isoleret ovenfor, 15 gøres dobbeltstrenget ved at sætte 25 mikroliter mix E [0,2 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,08 M MgCl2, 0,24 NH4C1, 1,0 millimolar (mM) af hvert af daTP, dTTP, dGTP og dCTP) til de 50 mikroliter gensuspenderet HBV-DNA, fulgt af inkubering ved 37°C i 3 timer, jfr. Robinson (1975), Am. J. Med. Sci., 270:151-20 -159.

Radioaktivt mærket HBV-DNA, der skal anvendes som en genomprobe, fremstilles ved anvendelse af den ovennævnte udfyldningsfremgangsmåde ved at erstatte dCTP og dGTP med henholdsvis 0,25 mikroliter hver af 3HdCTP og 3HdGTP (begge 25 21 curies per mM).

2. HBxAg kloning

En portion af HBV-genomet indeholdende DNA-sekvensen kodende for HBxAg klones ved anvendelse af plasmidet pBR322, 30 indført i E. coli. Dobbelt strenget, umærket HBV-DNA, isoleret ovenfor, nedbrydes med restriktionsendonuclease BamHI [50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl, 1 mM dithio-threitol]. Reaktionsblandingen underkastes elektroforese i en 0,6% agarosegel på en vandret plade ved 100 ampere i 2 35 timer (0,04 Tris-acetat, 0,002 M EDTA).

Farvning med 1% ethidiumbromid afslører tre HBV-DNA- 56 DK 174060 B1 -fragmenter, hvilket viser tilstedeværelsen af to BamHI restriktionssteder i genomet. En 3200 basepar stort fragment repræsenterer hele HBV-genomet i lineær form som et resultat af, at der kun klippes ved det ene af BamHI - stederne. De 5 1850 bp og 1350 bp store fragmenter repræsenterer genomet, skåret i to fragmenter som et resultat af fuldstændig BamHI--nedbrydning.

Der fås kopier af de tre BamHI HBV-DNA-restriktions-fragmenter, isoleret ovenfor, ved at klone i plasmidet pBR322 10 (ATCC 37017) [Sutcliffe (1978), P. Natl. Acad. Sci., USA, 75:3737-3791). For at indskyde HBV-DNA-BamHI-fragmenterne i pBR322 lineariseres plasmidet ved nedbrydning med BamHI [50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM dithio-threitol] til dannelse af terminaler, som er komplementære 15 til HBV-fragmenternes. De tre HBV-DNA-fragmenter og pBR322--fragmentet blandes og underkastes DNA-ligering med T4-DNA--ligase [66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 66 mM MgCl2, 10 mM dithio-theitol og 0,4 mM ATP). Ligeringsreaktionsproduktet, der fås i den ovennævnte reaktion, er et cirkulært DNA, afledt 20 af det lineariserede pBR322 og HBV-fragmenter, som forenes ved deres komplementære terminaler.

De cirkelformede rekombinante plasmider indføres i E. coli-stamme HB101 (ATCC 33694, tilvejebragt af Dr. Dean Hunter fra the National Cancer Institute, NIH, Bethesda, 25 MD, USA). Ved at følge fremgangsmåden ifølge Cohen et al. (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110-2114. I korthed inkuberes en E. coli HB101-kultur i en opløsning af 0,03 M calciumchlorid ved 0°C i 20 minutter. Der sættes ca. 5 x 109 bakterieceller til 0,3 ml af den samme opløsning, hvortil 30 der sættes 100 nanogram rekombinante plasmider. Denne transformationsreaktionsblanding inkuberes ved 0°C i 60 minutter.

Plasmidet pBR322 indeholder ampicillin- og tetracyc-linresistens-givende gener. Lægemiddelfølsomme bakterieceller, transformerede med dette plasmid, har ampicillin- og 35 tetracyclinresistens. Eftersom pBR322-DNA'et kun har et BamHI-spaltningssted, som ligger på tetracyclinresistensge- 57 DK 174060 B1 net, splitter indskydelse af HBV-fragmenterne ved BamHI-stedet dette gen. Lægemiddelfølsomt E. coli HB101, transformeret med et plasmid, afledt af pBR322, med et HBV-DNA-fragment, indskudt ved BamHI-stedet (kloningsvektor), har 5 derfor ampicillinresistens og tetracyclinfølsomhed.

Transformeret E. coli, dvs. de E. coli, som indeholder det plasmid-ampicillin-resistens-givende gen, vælges ved ud-plettering af transformationsreaktionsblandingen på et LB suppeagarmedium (et vækstmedium, som pr. liter deraf inde-10 holder 10 g Bactoagar, 10 g Bactotrypton, 5 g Bactogæreks-trakt (som hver for sig kommer fra Difco Labs, Detroit, MI, USA) og 5 g natriumchlorid) indeholdende 50 mikrogram ampi-cillin pr. ml. Den udpletterede E. coli inkuberes ved 37°C i 2 dage.

15 Blandt de kolonier, som viser ampicillinresistent efter transformation ved den ovennævnte fremgangsmåde, udvælges tetracycl in-følsomme kolonier ved udplet tering af kolonierne på en LB-suppe, ovenfor, indeholdende 50 mikrogram tetracyclin pr. ml i stedet for ampicillin. De udpletterede 20 kolonier inkuberes ligeledes ved 37°C i 2 dage. E. coli HB101 stammer indeholdende pB322 med HBV-DNA-fragmenter, indskudt ved BamHI-spaltningsstedet i tetracyclinresistens-genet, fås således.

25 3. Plasmid-DNA-ekstraktion.

E. coli HB101 celler indeholdende det rekombinante DNA som isoleret ovenfor dyrkes i LB-suppemediet indeholdende 20 mikrogram ampicillin pr. ml med tilsætning af chloramphenicol til en koncentration på 170 mikrogram pr. ml i den 30 logaritmiske vækstfase. Dyrkningen fortsættes i adskillige timer til amplifikation af plasmid-DNA'et.

Cellerne lyseres derpå ved at blande 5 ml af en 25%'s saccharose-opløsning i 50 mM Tris-HCl (pH-værdi 8,0)-opløsning til 500 ml celler. Efter inkubation i 10 minutter ved 35 0°C iblandes der 1 ml af en 1% lysozym i 0,25 M Tris-HCl (pH-værdi 7,5)-opløsning. Efter inkubering i 10 minutter 58 DK 174060 B1 ved 0°C iblandes der forsigtigt 2 ml 0,25 M EDTA (pH-værdi 8,0). Efter inkubation i 10 minutter ved 0°C iblandes der 8 ml 1% Triton X-100 [polyoxyethylen (9)-octylphenylether] i 0,15 M Tris-HCl (pH = 8,0), 0,2M EDTA (pH=8,0) og der in- 5 kuberes atter i 10 minutter ved 0°C.

Det fremkomne lysat centrifugeres ved 30.000 opm i en Spinco SW-65 rotor (Beckman Instruments) til fjernelse af denatureret protein og celleefterladenskaber. DNA fældes fra det klarede lysat ved at blande 1/10 rumfang 2,5 M na-10 triumacetat og 2,5 rumfang 99% ethanol og inkubering ved -2Q°C i 30 minutter. DNA-udfældningen pelletteres ved centrifugering ved 10.000 g i 30 minutter.

Fjernelse af protein udføres to gange med 1 ml phenol, mættet med 0,01 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 M NaCl og 0,0012 15 MEDTA, jf. Landers et al. (1977), J. Virol., 23:368-376.

Det vandige lag fra den ovennævnte fremgangsmåde tages op, og DNA'et fældes derfra ved tilsætning af 1/10 rumfang 2 M natriumacetat og 2,5 rumfang 99% ethanol og inkubering ved -20°C i 20 minutter. Ved centrifugering i 10 minutter ved 20 10.000 g fås en pellet af fuldstændigt dobbeltstrenget DNA

omfattende det gen, der koder for HBxAg.

4. Plasmid-DNA-analyse.

Tilstedeværelsen af HBV-DNA i klonerne bekræftes ved 25 anvendelse af Southern-overførings- og hybridiseringsteknik, jf. Southern (1975), Mol. Biol., 98:503. 10 mg plasmid-DNA fra hver klon, isoleret som ovenfor, nedbrydes med BamHI (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 10 mM MgCl2, 1 tnM

dithiothreitol). Reaktionsblandingen underkastes elektrofo-30 rese i en 0,6% agarosegel på vandret plade ved 100 ampere i 2 timer (0,04 M Tris-acetat, 0,002 M EDTA).

DNA i gelen denatureres ved at gennembløde gelen i adskillige rumfang 1,5 M natriumchlorid og 0,5 M natriumhydroxid i 1 time ved stuetemperatur under konstant omrøring 35 eller omrystning. I nogle tilfælde hydrolyseres DNA i gelen ved syrerensning forud for alkalidenaturering ved at gen- 59 DK 174060 B1 nembløde gelen to gange i 15 minutter i 0,25 M saltsyre ved stuetemperatur. Efter denaturering neutraliseres gelen ved gennemblødning i adskillige rumfang af en opløsning af 1 M Tris-HCl (pH-værdi 8,0) og 1,5 M natriumchlorid i 1 time 5 ved stuetemperatur under konstant omrystning.

DNA'et i gelen overføres på nitrocellulose i det væsentlige som beskrevet i Maniatis et al. (1982), J. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor. I korthed anbringes nitrocellulose (Katalognr. BA85, Schleicher & Schuel, Ohio) øverst 10 på gelen, og der anbringes adskillige lag Whatman 3MM-papir over nitrocellulosen. Denne sandwich anbringes derpå med gelsiden nedad på en Whatman 3MM væge, hvis ender neddyppes i en puffer indeholdende 0,9 M natriumchlorid og 0,09 M natriumcitrat. Kapillærbevægelsen af pufferen overfører 15 derved DNA’et fra gelen til nitrocellulosen. DNA'et fikseres til nitrocellulosen ved bagning ved 80°C i 2 timer under vakuum.

Plasmid-DNA'et på nitrocellulosen, fremstillet ovenfor (Southern filtre), afprøves for tilstedeværelsen af HBV-20 -DNA-fragmenter ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maniatis et al., jf. ovenfor.

Kort sagt præhybridiseres Southern-filtrene ved gennemblødning i præhybridiseringsvæske 0,9 M natriumchlorid, 0,09 M natriumcitrat, 0,5% SDS (natriumdodecylsulfat) , 100% 25 mg denatureret laksesperma DNA pr. ml og 5 x Denhart's opløsning (indeholdende pr. liter 1 g Ficoll, 1 g polyvinylpyr-rolidon og 1 g BSA-fraktion V) i 4 timer ved 68°C.

Hybridisering udføres i en plastpose, der kan varme-forsegles, med lige netop nok hybridiseringsopløsning til 30 at holde Southern-filtret vådt (50 mikroliter pr. cm2 filter) . Hybridiseringsopløsningen indeholder 0,9 M natriumchlorid, 0,09 m natriumcitrat, 0,01 M EDTA,5 x Denhard's opløsning, 0,5% SDS, 100 mikrogram denatureret laksesperma DNA pr. ml og 5 x 107 cmp af det ovenfor fremstillede radioaktivt 35 mærkede HBV-DNA. Southern-filtret inkuberes i hydridiserings-opløsningen i 12 timer ved 68°C.

60 DK 174060 B1

Efter vask af filtret i 2 timer (0,3 M natriumclorid, 0,03 M natriumcitrat), eksponeres røntgenfilm (XRP-1, Kodak) for filteret, hvorved man får et autoradiografisk billede.

Der isoleres tre rekombinante plasmider ved anvendelse 5 af den ovennævnte fremgangsmåde, og de betegnes AM6, AM7 og AMI. AM6 indeholder pBR322-DNA og hele HBV-genomet. AM7 indeholder pBR322-DNA og et 1350 bp HBV-DNA-fragment. AMI indeholder pBR322 DNA og et 1850 bp HBV-DNA-fragment, herunder det gen, der koder for HBxAg.

10

5 . Konstruktion af et replikationsnlasmid indeholdende et SV40/HBxAa-ekspressionsvektor-DNA

Uf uldkommet SV4 0 -virus, der fås fra Dean Hamer, jf. ovenfor, underkastes BamHI- og EcoRI-spaltning i en puffer 15 indeholdende 50 mM natriumchllorid, 10 mM Tris-HCl (pH-værdi 7.5) , 10 mM magnesiumchlorid og 1 mM dithiothreitol. Plasmid pBR322-DNA underkastes den dobbelte nedbrydning, som er omtalt ovenfor, for at danne terminaler, som er komplementære til det således spaltede SV40-DNA. Spaltningsprodukterne 20 fra hver af disse nedbrydninger separeres og renses ved hjælp af cesiumchloriddensitetsgradientcentrifugering, jf. Tanaka et al. (1975), J. Bact., 121:354-362. Det 4492 basepar store SV40-fragment og 3987 basepar store pBR322-fragment, der således isoleres, underkastes DNA-ligering med T4-DNA-25 ligase i en puffer indeholdende 66 mM Tris-HCl (pH-værdi 7.6) , 6,6 mM magnesiumchlorid, 10 mM dithiothreitol og 0,4 mM ATP, hvorved der dannes pBRSV (fig. 4).

Det ligeringsreaktionsprodukt, der fås ved den ovennævnte reaktion, er et cirkelformet DNA, afledt af de line-30 ariserede 3987 basepar store pBR322- og 4492 basepar store SV40-fragmenter, som forenes ved deres komplementære EcoRI-og BamHI-terminaler. Dette cirkelformede plasmid lineariseres derpå ved spaltning ved BamHI-restriktionsstedet, dannet under ligering, hvorved man danner BamHI-cohæsive terminaler 35 ved hver ende.

Der isoleres et 1850 stort basepar HBV-DNA-fragment 61 DK 174060 B1 omfattende det gen, der koder for HBxAg, ved at underkaste plasmidet AM6, isoleret ovenfor, nedbrydning med BamHI i en puffer indeholdende 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 10 mM MgCl2 og 1 mM dithiothreitol. Reaktionsblandingen 5 underkastes elektroforese ved 100 ampere i 2 timer, idet man anvender 0,8% agarose, og det 1850 pb store bånd skæres ud og smeltes ved 68°C i 15 minutter. Der tilsættes 1/10 rumfang 3 M natriumacetat, og den fremkomne opløsning underkastes den deproteiniseringsfremgangsmåde, der er beskrevet 10 ovenfor.

Det HBxAg-genholdige HBV-DNA-fragment, der således isoleres, har BamHI-komplementære terminaler. Dette DNA--fragment ligeres derpå til det pBR-SV, der er fremstillet ovenfor, ved at anvende T4-DNA-ligase i en puffer indehold-15 ende 66 mM Tris-HCl (pH-værdi 7,6), mM magnesiumchlorid, 10 mM dithiothreitol og 0,4 mM ATP.

Produktet fra den ovennævnte ligeringsreaktion er et cirkelformet plasmid DNA med betegnelsen SVAM191. Det indeholder i retning med uret et 4492 bp SV40 DNA fragment fra 20 dets BamHI-sted ved baseposition 2468 til dets EcoRI-sted ved baseposition 1717, et 3987 basepar stort pBR322-DNA-fragment fra dets EcoRI-sted ved baseposition 0 til BamHI-stedet ved baseposition 375 og et 1850 bp HBV-DNA-fragment fra dets BamHI-sted ved baseposition ved 1400 til BamHI-25 stedet ved baseposition 28. Plasmid SVAM191 er vist skematisk i fig. 4.

SVAM191 indføres i E. coli HB101 ved anvendelse af den ovenfor beskrevne transformationsfremgangsmåde. Eftersom disse transformerede E. coli ligeledes er ampicillinresi-30 stente og tetracyclinfølsomme, underkastes de den samme i sol at ions fremgangsmåde, som er beskrevet ovenfor for E. coli- -kloningsvektoren. Fremgangsmåderne til fremstilling, isolering, rensning og analyse, beskrevet ovenfor, anvendes, hvorved man får milligrammængder af i det væsentlige rent 35 SVAMI91 DNA.

62 DK 174060 B1 6. Konstruktion af SV40/HBxAg-ekspressionsvektor.

En vektor, der kan inducere produktion af HBxAg i eucaryotiske celler, fremstilles ved at udskære en portion af SVAM191 -DNA. Dette sker ved at nedbryde SVAM191-DNA med 5 Hael I-endonuclease i en puffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH-værdi 7,5), 10 mM magnesiumchlorid og 1 mM dithiothreitol til spaltning af SVAM 191 ved Haell-stederne ved baseposition 767 i SV40-DNA-regionen og baseposition nr. 1437 i HBV-DNA--regionen.

10 De to DNA-fragmenter, der fås ved den ovennævnte reaktion, separeres ved den elektroforetiske agarosedel--fremgangsmåde, som er beskrevet ovenfor. Det således isolerede største fragment indeholdende kun SV40- og HBV-DNA cirkulariseres ved at underkaste dets Haell-komplementære 15 terminaler den ovenfor beskrevne T4-DNA-ligeringsfremgangsmåde.

Den ovenfor dannede cirkulære ekspressionsvektor betegnes SVHBV-3 (fig. 4 og 5) . Den indeholder ekspressionskontrolelementer fra SV4 0 og et gen kodende for HBxAg fra 20 HBV.

63 DK 174060 B1 som hjælper. Kontrollerne får ækvivalente mængder af kun vektor-hjælper-DNA'erne. Kulturerne inkuberes ved 40°C i 12 dage og lyseres derpå ved nedfrysning/optøning og opbevares ved -70°C.

5 Cellulære proteiner ekstraheres fra de ovenfor til vejebragte nedfrosne/optøede cellepulvere ved først at sætte 2 mg cellepulver til 1 ml proteinekstraktionspuffer [2% SDS, 10% glycerol, ,08 M Tris-HCl (pH = 6,8), 2 mM phenyl-methylsulfonylfluorid, 0,1 M dithiothreitol, 0,001% brom- 10 phenolblåt]. Opløsningen koges derpå i 5 minutter, centrifugeres ved 15000 opm i 10 minutter, og de ovenstående væsker samles sammen derfra.

En mængde ovenstående væske, der er tilstrækkelig til at give 100 mikrogram prøveprotein, underkastes derpå 15 SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese ved den nedenfor beskrevne Western blot-fremgangsmåde.

8. Polvpeptidsvntese.

Polypeptiderne ifølge opfindelsen syntetiseres kemisk 20 ved fastfasemetoder som beskrevet i Merrifield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85:2149; Merrifield et al. (1970), A.

Rev. Biochem., 39:841-866 og Houghten et al. (1980), Int.

J. Peptide Prot. Res., 16:311-320. De relativt korte polypep-tider, anvendt heri, svarer til de antigene determinanter af 25 HBxAg.

I fig. 6 vises den 154 aminosyregruppe store sekvens af HBxAg. Aminosyregruppesekvenserne af de heri beskrevne foretrukne syntetiske polypeptider (99, 100 og 142), er ligeledes vist i fig. 6. Sammensætningen af begge syntetiske 30 polypeptider bekræftes ved aminosyreanalyse.

Almindeligvis fremstilles et immunogen eller syntetisk polypeptid ved at tilvejebringe en flerhed af passende beskyttede aminosyrer, som svarer til aminosyregrupperne i et antigendeterminantdomæne i HBxAg og at syntetisere disse 35 aminosyrer til et polypeptid, som har en aminosyregruppese-kvens, som svarer til polypeptidaminosyregruppesekvensen i 64 DK 174060 B1 denne antigene determinant. Det fremstillede syntetiske polypeptid kan anvendes til at fremstille et inokulum, sædvanligvis ved at binde det til en bærer til dannelse af et konjugat og derpå dispergere en effektiv mængde af konjugat 5 i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel.

Polypeptiderne syntetiseres fortrinsvis ifølge de referencer, som er angivet ovenfor for fastfasemetoder, ved anvendelse af en cysteinharpiks, jf. Merrifield et al., J.

Am. Chem. Soc., se ovenfor. Ifølge denne fremgangsmåde be-10 skyttes α-aminogruppen af hver enkelt tilsat aminosyre typisk med en tert.butoxycarbonyl (t-BOC)-gruppe forud for, at aminosyren føjes til den voksende polypeptidkæde. t-BOC--gruppen fjernes derpå forud for tilføjning af den næste aminosyre til den voksende polypeptidkæde. Sidekæderne på 15 individuelle aminosyrer beskyttes som følger: Arg-tosyl;

Ser-, Thr-, Glu- og Asp- O-benzyl; Tyr-O-brombenzyloxycarb-amyl; Trp-N-formyl; S-methoxybenzyl til cystein; 2-chlorbenz-oxycarbonyl til lysin og dinitrophenyl til histidin. Når der anvendes asparagin, tilsættes der den samme molære mængde 20 N-hydroxy-benztriazol sammen med den beskyttede aminosyre, og dimethyl formamid (DMF) anvendes som koblingsopløsningsmidlet. N-formylgruppen på Trp-grupperne fjernes efter spaltning af polypeptidet fra harpiksstøttematerialet ved behandling med 1,0 M ammoniumhydrogencarbonat ved en polypeptidkon-25 centration på 1,0 mg pr. ml i 16 timer ved stuetemperatur, jf. Yamashiro et al. (1973), J. Org. Chem. 38:2594-2597. Koblingseffektiviteten i hvert enkelt trin kan overvåges ved hjælp af ninhydrin eller picrinsyre og er fortrinsvis højere end 99% i alle tilfælde, jf. Gisin (1972), Anal.

30 Chem. Acta, 58:248-249 og Kaiser (1980), Anal. Biochem., 34:595-598.

Efter fremstilling af et ønsket polypeptid behandles en portion af det fremkomne beskyttede polypeptid (ca. 1 g) med 2 ml anisol, og der kondenseres vandfrit hydrogenfluorid, 35 ca. 20 ml, til reaktionsbeholderen ved tøristemperatur. Den fremkomne blanding omrøres ved ca. 4°C i ca. 1 time til 65 DK 174060 B1 spaltning af beskyttelsesgrupperne og til fjernelse af poly-peptidet fra harpiksen. Efter bortdampning af hydrogenfluoridet ved en temperatur på 4°C med en strøm af nitrogen ekstraheres remanensen med vandfri diethylether tre gange 5 til fjernelse af anisolen, og remanensen tørres i vakuum.

Det vakuumtørrede materiale ekstraheres med 5% vandig eddikesyre (tre gange 50 ml) til at skille det fri polypeptid fra harpiksen. Den ekstraktholdige opløsning lyofiliseres, hvorved man får et monomert uoxideret polypeptid.

10 I korthed omsættes som en generaliseret fremgangsmåde for hvert polypeptid 4 mg KLH i 0,5 ml 10 millimolar natrium-phosphatpuffer (pH-værdi 7,2) med 0,7 mg MBS, opløst i DMP, og den fremkomne blanding omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur. MBS-opløsningen tilsættes dråbevis for at sikre, 15 at den lokale koncentration af DMF ikke er for høj, idet KLH er uopløselig ved DMF-koncentrationer på ca. 30% eller højere. Reaktionsproduktet, KLH-MB, sendes igennem en chroma-tografisk søjle, præpareret med "Sephadex" G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) ækvilibreret med 50 millim-20 olar natriumphosphatpuffer (ph-værdi 6,0) til fjernelse af fri MBS. KLH-udbytte fra topfraktioner af søjleeluatet, overvåget ved 280 nanometer, er typisk ca. 80%.

Det således fremstillede KLH-MB omsættes derpå med 5 mg polypeptid, opløst i 1 ml puffer. pH-værdien af den frem-25 komne reaktionsblanding indstilles til 7-7,5, og reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 3 timer, hvorved man får et polypeptid-bærer-konjugat.

9. Western-blotting.

30 Anti-polypeptid-antistofferne (anti-99, anti-100 og anti-142) undersøges ved anvendelse af Wester-blot-fremgangsmåde for at bekræfte deres forudsagte specificitet for HBxAg og for at bekræfte ekspressionen af den væsentlige polypeptidportion af HBxAg i transficerede celler. De cel-35 lulære proteiner, herunder HBxAg, separeres ved hjælp af 12,5% SDS-polyacrylamid-gel-elektrofores, jf. Laemmli 66 DK 174060 B1 (1970), Nature, 277:680-685 og Towbin et al. (1979), Proc.

Natl. Acad. Sci., USA, 76:4350-4354.

Proteiner overføres elektroforetisk til nitrocellulose (Schleicher & Schuel, katalognr. BA85) som beskrevet af 5 Towbin et al., jfr. ovenfor, ved anvendelse af et elektro-blot-apparat (E.C. Apparatus Corp. of Jacksonville, Florida) med en puffer bestående af 25 mM Tris-Base, 192 mM glycin, 20% methanol og 0,1% SDS (pH 8,3). Efter overføringen blokeres nitrocellulosen i BLOTTO [Bovine Lacto Transfer Technique 10 Optimizer, Johnson et al. (1983), J. Exp. Med., 159:1751-1756, 5 vægt/volumen tørmælk uden fedt, 0,01% "anti-foam A" (Sigma, Katalog nr. A5758), og 0,0001% merthiolat (Sigma, katalog nr. 5125) i PBS ved pH-værdi 7,2] for at reducere uspecifik binding. Blot'ene reageres med 100 mikroliter 15 antipeptid-antistof i 10 ml BLOTTO i 3 timer og vaskes tre gange i 1 time med 50 ml frisk BLOTTO.

Anti-polypeptid-antistoffer, bundne til vektor-specifikt protein, detekteres ved at omsætte blottene med 20 20 mikroliter 125I-mærket Staphylococcus aureus protein A i 10 ml BLOTTO i 1 time. Blot'tene vaskes derpå i 50 ml frisk BLOTTO i 15 minutter fire gange og derpå under en kontinuert vandstrøm i 20 minutter.

25 10. -mærkning af hepatomcelleekstrakter.

Monolag af den humane heptatom-afledte cellelinie PLC/PRF/5, som er kendt for at indeholde integrerede sekvenser af HBV (Alexander et al. (1976), African Med. J., 50:21-30 24, ATCC CRL 8024] lyofiliseres. Cellepulveret opløses i phosphatpufret fysiologisk saltvand (PBS), hvorved man får en koncentration af protein på 1 mg/ml. Efter centrifugering ved 10.000 g til fjernelse af celleefterladenskaber blandes 50 mikroliter af den ovennævnte opløsning med 75 mikroliter 35 RIPA [0,15 M NaCl, 10 mM natriumphosphat (pH 7,5), 1% "Noni-det P-40", 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS] og 20 μΐ 0,2 M natriumphosphat (pH-værdi 7,5). I en undersøgelse mærkes 67 DK 174060 B1 det således solubiliserede celleprotein med 5 millicurie 125i Under anvendelse af chloramin-T-reaktionen. I den undersøgelse, som er vist i fig. 7, mærkes cellelysaterne med 3 mikrocurie 125I under anvendelse af den samme reaktion.

5 Den ovennævnte reaktionsblanding passeres derpå gennem "Sephadex" G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) søjlen, vasket med PBS. Den radioaktivt mærkede topfraktion (9 x 10® cmp/ml) , der fås, er præinkuberet med normalt kaninserum til fjernelse af uspecifik binding. Kort sagt blandes 10 20 mikroliter af en topfraktion med 1,0 ml RIPA, 20 mikro- liter "Trasylol" (et varemærke for et protinin (Sigma,

February, 1984, Katalog side 163)) og 100 mikroliter NRS.

Efter inkubation i 1 time ved 0°C iblandes der 500 mikroliter formalininaktiveret Staphylococcus aureus (Staph A: Cal ls biochem, La Jolla, CA, USA)-celler, og blandingen inkuberes ved 0°C i 30 minutter. Staph A-udfældningen fjernes ved centrifugering ved 10.000 g i 10 minutter, og den ovenstående væske udvindes.

20 11. Immunfældninger ("immunoprecipitations", IP)

Kanin-anti-polypeptid-antiserum mod polypeptid 99 (anti-99) reageres med de ovenfor tilvejebragte radioaktivt iod-mærkede celleproteiner. I korthed blandes 10 mikroliter anti-99 med 2 x 10® cpm mærket ekstrakt og inkuberes i 1 25 time ved 0°C. Derefter iblandes der 40 mikroliter Staph A, og der inkuberes i 30 minutter ved 0°C. Staph-A-fældningen fjernes ved centrifugering ved 10.000 g i 10 minutter, og pelleten udvindes. Pellet'en resuspenderes i 1 ml RIPA og centrifugeres som ovenfor. Den fremkomne pellet suspenderes 30 atter i en 1,0 ml lithiumchlorid-opløsning (100 mM Tris-HCl, 500 mM lithiumchlorid) og centrifugeres atter. Lithium-chlorid-opløsningsbehandlingen gentages, og pellet'en udvindes .

Den ovenfor tilvejebragte pellet suspenderes atter i 35 50 mikroliter prøvepuffer og koges i 3 minutter. Blandingen centrifugeres ved 10.0 00 g i 1 minut, og den ovenstående 68 DK 174060 B1 væske udvindes og underkastes 12,5% SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese. De ovennævnte geler eksponeres for XRP-1 røntgenfilm, hvorved man får et autoradiografi.

5 12. Fremstilling og analyse af chimpanse- og human- levercelekstrakter.

Leverprøver fra to chimpanser og et menneske, som kronisk er inficerede med HBV, og fra normale chimpanse- og human (HBV sero-negative)-levere lynfryses i flydende nitrogen og 10 formales til et pulver. Pulverne blandes med en prøvepuffer [0,0625 M Tris-HCl (pH 6,9), 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2- mercaptoethanol og 0,001% bromphenol-blåt] og koges i 5 minutter. Blandingen centrifugeres ved 10.000 g i 30 minutter til fjernelse af celleefterladenskaber. Prøverne under-15 kastes derpå Western blot-analyse som ovenfor beskrevet ved anvendelse af 75 mikrogram protein pr. gel-lane.

13. Identifikation af anti-HBxAg-antistoffer i human sera 20 mikrogram SVHBV3~transficerede BSC-l-celleekstrak-20 ter pr. lane underkastes SDS-page på 12% acrylamid-geler og de separerede proteiner overføres elektroforetisk til nitrocelluloseplader som ovenfor beskrevet. De fremkomne nitrocelluloseplader blandes med fortyndinger i forholdet 1:50 af serum fra 6 mennesker, som har fået diagnosen HBV-relaterede 25 infektioner, inklusive en bærer af symptomer og en patient med et hepatocellulært karcinom. Kontrolplader blandes med kanin-anti-polypeptid-antistoffer ifølge opfindelsen.

Nitrocellulose-protein-serum-blandinger holdes i 2 timer ved stuetemperatur. Pladerne skylles derpå og blandes med 30 en fortynding i forholdet 1:200 af gede-anti-human- eller anti-kanin-antistoffer, bundet til peberrodsperoxidase, såsom det er hensigtsmæssigt. Denne blanding holdes i en tidsperiode på 1 time for, at bundne anti-X-antistoffer kan reagere med de passende anti-antistoffer. Pladerne vaskes 35 og fremkaldes derpå som ovenfor beskrevet med 4-chlor-l--naphthol. Serum fra patienten med hepatocellulært karcinom 69 DK 174060 B1 viser stærk immunoreaktivitet med det ca. 24000 dalton store polypeptid, udtrykt af de SVHBV-3-transficerede celler.

14. Cellelinier og vævsprøver.

5 PLC/PRF/5- og HepG2-celler fås fra Drs. D. Milich Depart ment of Basic & Clinical Research, Scripps Clinic and Research Foundation (Scripps), La Jolla, Ca., USA. Chim-panselevervævsprøver fås fra henholdsvis dr. R. Purcell og dr. P. Kaplan fra the National Institute of Allergy and 10 Infectious Diseases, Bethesda MD, og Ortho Diagnostics,

Inc., Raritan NJ. Humanlevervævsprøver fås fra henholdsvis drs. F. Chisari, J. Dienstag og A. Yu fra Scripps, Department of Medicine, Harvard University, Boston MA, og Department of Pediatrics, University of California-San Diego, La Jolla, 15 CA, USA.

Eksempler.

1. Fremstilling og anvendelse af diagnostiske systemer til detektering af anti-HBxAg-antistoffer (HBxAb).

20 Polypeptiderne 8, 42, 79, 99, 100 og 142 (ligeledes omtalt heri som p8, p42, p79, p99, plOO og pl42) syntetiseres ved symmetrisk anhydrid-kemi på en MOdel 430A Applied Biosystems (Foster City, CA) fastfasepeptidsyntetiseringsanordning i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Hagenmeier 25 et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 353:1973-1976 (1972) .

Hvert polypeptid solubiliseres i deioniseret vand (pH-værdi 6) ved en koncentration på 1 mg/ml. Der blandes 100 mikroliter 10 mM natriumboratpuffer, pH-værdi 9, indeholdende 30 1 mikrogram af polypeptiderne p8, p42, p79, p99, plOO eller pl42 i fordybningerne i EIA-mikrotiterplader med 96 fordybninger (Costar, Van Nyes, CA, USA). Pladerne holdes derpå i ca. 16 timer ved 37°C for at lade pufferen fordampe og polypeptiderne adsorbere til (fæstne sig til) fordybningernes 35 vægge. Derefter blandes der 300 mikroliter T-wash (Trispuf ret saltvand: 50 mM Tris-base, 150 mM natriumchlorid, 70 DK 174060 B1 pH-værdi 7,6) indeholdende 10% normalt hesteserum, 5% normalt gedeserum, 5% føtalt kalveserum og 0,05% Tween-20 i hver fordybning for at blokere overskydende proteinbindingssteder.

Fordybningerne holdes i 2 timer ved 37°C, blokerings-5 opløsningen fjernes ved omrystning, og fordybningerne tørres ved at holde dem i 1 time ved 37°C, og derved dannes der et diagnostisk system ifølge den foreliggende opfindelse, dvs. et HBxAg-relateret polypeptid-holdigt fastfase-støttemate-riale (polypeptid-overtrukken fordybning).

10 De polypeptid-holdige fastfasestøttematerialer anven des til at udføre en ELISA-analyse for tilstedeværelsen og mængden af HBxAb i forskellige humansera. 100 mikroliter af hvert serum, fortyndet i forholdet 1:50 i T-wash, blandes i en polypeptid-overtrukken fordybning. Den fremkomne fast-15 stof/væskefaseimmunreaktionsblanding holdes ved 37°C i 2 timer for at tillade dannelse af polypeptid-holdige immunreaktionsprodukter. Fordybningerne skylles derpå fire gange med PBS indeholdende 0,05% Tween-20, fulgt af en slutskylning i deionisere vand (pH-værdi 6) , idet man derved skiller 20 hvilke som helst polypeptid-holdige (fastfase)-immunreaktionsprodukter fra ureagerede humane antistoffer.

300 mikroliter af et peberrods-peroxid-mærket gede- -anti-human-IgG (Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NH) , fortyndet i forholdet 1:5000 i T-wash, blandes derpå 25 til hver fordybning. De fremkomne mærkningsreaktionsblandinger (nr. 2 faststof/væskefase-blandinger) holdes derpå i 1 time ved 37°C for at tillade dannelse af polypeptidholdigt (fastfasebundet) mærket immunreaktionsprodukt. Fordybningerne skylles derpå som ovenfor beskrevet til fjernelse af ureage-30 ret mærket-antistof.

100 mikroliter o-phenylendiamin (OPD) blandes derpå til hver fordybning til dannelse af en fremkalderreaktions-blanding. Efter at have holdt fremkalderreaktionsblandingen i 30 minutter ved ca. 20°C iblandes der til hver fordybning 35 50 mikroliter 4 N svovlsyre for at stoppe fremkalderreak tionen, og de fremkomne opløsninger analyseres for absorbans ved 490 nanometer ved anvendelse af en mikrotiterplade-læse- anordning.

DK 174060 B1 71 2. ELISA-analvsedetektering af tilstedeværelsen af HBxAb.

5 I alt 130 serumprøver analyseres for tilstedeværelsen af HBxAb ved anvendelse af ELISA-systemerne og de fremgangsmåder, der er beskrevet i eksempel 1. Prøverne grupperes ifølge patientens diagnose på indsamlingstidspunktet. Alle serumprøver fra patienter, der kronisk er inficerede med 10 HBV (HBSAg-positive) fås fra Tokyo, Japan. Det normale serumpanel fås fra General Clinical Research Center (GCRC) Scripps Clinic, La Jolla, CA., USA. Serumprøver med hepatitis B i akut fase fås fra både Tokyo og La Jolla. Serumprøverne klassificeres som akut hepatitis B (AH(B)), asymptomatisk 15 bærer (ASC), kronisk hepatitis (CH), hepatocellulært carcinom (HCC) eller normale.

I tabel I er opsummeret resultaterne, der fås med serumprøver, analyseret ved anvendelse af hver af X-polypeptider-ne. Der registreres et positivt pointtal, hvis prøven er 20 reaktiv med enten et eller flere af polypeptiderne.

72 DK 174060 B1

Tabel I

Antal ana- Antal reaktive lyserede ovenfor et eller % af det 5 Diagnose1 prøver flere peptider samlede antal2 AH (B) 21 0 0 ASC 26 7 26,9 CH 26 8 30,7 10 HCC 21 18 85,7

Normal 36 0 0 130 33 25,3 15 1 Patientens diagnose ved screeningsprøveindsamlingstidspunktet: AH (B) = akut hepatitis B, ASC = asymptomatisk bærer, CH = kronisk hepatitis, HCC = hepatocellulært karcinom, normalt = ingen detekterbar tidligere eksponering for HBV (HBsAb negativ).

20 2 Procent af hver kategori af sera, som ved test er positiv over for mindst et polypeptid.

Som det fremgår af fig. 1, detekteres der ikke noget HBxAb i de 21 analyserede serumprøver fra den akutte fase.

Prøver fra de asymptomatiske og kroniske bæregrupper inde-25 holder omtrent den samme procentdel positive prøver (henholdsvis 26,9% og 30,7%). Et signifikant antal prøver (85,7%) af gruppen med hepatocellulært karcinom (HCC) viser sig at indeholde HBxAb. Det høje antal positive prøver i HCC-gruppen er konsistent med tidligere undersøgelser, hvori 8 af 11 30 serumprøver fra patienter med HCC er reaktive med peptiderne 100-115 og 144-154 [Moriarty et al., Science, 227:429-433 (1985) ] . Alle prøver, der er positive for HBxAb, er ligeledes HBsAg-positive. HBeAg/HBeAb-statusen har ikke nogen indflydelse på forudsigeligheden af HBxAb-detektion. Ca. 2/3 af 35 de positive prøver er HBeAb-positive.

Absorbansværdierne (A490) af de positive prøver er vist i tabel II til illustrering af de polypeptider, som 73 DK 174060 B1 antistof-responsen af hver serumprøve er rettet mod.

Tabel II

Detektion af HBx-antistof i humane sera 5

Dx1 nr.2 P83 P42 P79 P99 P100 P142 ASC 210 0,478 ASC 216 0,258 0,306 0,327 10 ASC 220 0,567 ASC 230 1,167 0,484 0,843 ASC 231 0,490 ASC 239 0,303 ASC 245 0,627 15 CH 204 0,478 CH 212 0,2034 0,402 0,356 0,507 0,333 0,424 CH 213 0,294 0,269 CH 219 0,348 0,549 0,483 0,235 0,206 0,325 CH 223 0,277 0,349 20 CH 234 0,300 CH 253 0,521 0,328 CH 250B 0,393 0,964 1,006 0,457 0,614 0,311 HCC 257B 0,286 0,402 0,445 0,476 0,650 HCC 258B 0,369 0,517 0,304 0,318 0,407 25 HCC 259B 0,312 0,528 0,628 HCC 260B 0,292 0,477 0,290 HCC 261B 0,365 0,344 0,465 0,347 0,325 HCC 263B 1,176 0,309 0,494 HCC 265B 0,314 0,278 0,357 0,271 30 HCC 266B 0,355 0,400 0,610 0,520 0,749 HCC 267B 0,586 0,607 0,749 0,516 0,643 0,348 HCC 268B 0,472 0,255 0,512 0,328 0,883 0,248 HCC 269B 1,126 0,346 0,600 0,411 0,845 0,247 HCC 270B 2,047 0,324 0,292 35 HCC 27IB 0,363 0,409

Patientdiagnose på prøveindsamlingstidspunktet.

2 ASC = asymptomatisk bærer, CH = kronisk hepatitis B, HCC = hepatocellulært karcinoma.

40 2 Serumaccessionsnummer.

3

Polypeptid, anvendt som fastfaseantigen i ELISA.

4

Absorbansværdi, der fås ved ELISA, målt ved 490 nm.

Tabel II illustrer, at specificiteten af HBxAb i ASC-gruppen er mellem aminosyregrupperne 79-131 i HBx-prote-45 inet, med en "varm plet" ("hot spot") omkring 79-99-regionen, dvs. polypeptid 79. Interessant nok indeholder serumprøver fra individer, som har tegn på leverskade (CH- og HCC-grup- 74 DK 174060 B1 per), HBxAb med en specificitets, som dækker hele proteinet, dvs. de fleste af disse prøver er reaktive med alle seks peptider. Signifikansen af dette resultat er uklar, men tyder på, at HBxAg måske foreligger i mere end en konformation i 5 de forskellige sygdomstilstand.

3 . Analyse af serieprøver af akut hepatitis B-sera for HBxAb.

Manglen på detekterbar HBxAb i en bestemt gruppe serumprøver fra patienter med akutte HBV-infektioner (AH(B) 10 i tabel I) giver anledning til en undersøgelse til bestemmelse af, om de 26 prøver, analyseret fra denne gruppe, blev indsamlet på et tidspunkt, der var for tidligt i forhold til infektionen til at detektere HBxAb, eller at forekomsten af antistof afspejler en kronisk infektion med HBV. Serie-15 serumprøver fås fra fire individer, som er akut inficerede med HBV. Tidspunkterne for prøverne begynder ved symptomernes indtræden og fortsætter frem til forekomsten af HBsAb. Serieprøverne undersøges for tilstedeværelsen af HBxAb ved hjælp af ELISA-undersøgelser under anvendelse af polypeptiderne 20 79, 99 og 100, som beskrevet i eksempel 1.

Alle fire deltagere er negative over for HBxAb ved alle stadier i den akutte infektion. Imidlertid iagttages de klassiske markører af en akut HBV-infektion, dvs. tidlig detektion af HBsAg, seroomdannelse til HBsAb efter 6 måneders 25 forløb sammen med eventuelt viral clearance, påvist ved detektion af HBeAb, selv om der ikke detekteres væsentlige HBxAb-niveauer. Selv om det ikke er kendt på dette tidspunkt, om X-proteinet udtrykkes under virusets replikationsstadium, tyder de ovennævnte data på, at forekomsten af HBxAb er 30 nærmere knyttet til kronisk HBV-infektion. 1 disse undersøgelser bestemmes HBsAg- og HBsAb-ni-veauerne ved hjælp af passive hæmaglutationsanalyser i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Vyas et al., Science, 35 170:332-333 (1970). HBeAg- og HBeAb-niveauer bestemmes ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt sæt fra Abbott 75 DK 174060 B1

Laboratories, Inc. , Chicago, II, USA. Pr e S Ag-niveauer bestemmes ved en ELISA-analyse, hvori et PreS2-specifikt monoklo-nalt antistof fæstnes til mikrotiterpladefordybninger (100 nanogram pr. fordybning). Det fastfasebundne monoklonale 5 antistof iblandes og omsættes med serumprøverne til dannelse af et immunreaktionsprodukt, som detekteres ved anvendelse af et peberrods-peroxidase-mærket anti-HBs-monoklonalt antistof ved anvendelse af de i eksempel 1 beskrevne betingelser.

Det ovenstående er tiltænkt som værende belysende 10 for den foreliggende opfindelse, men ikke begrænsende. Man kan gennemføre talrige variationer og modifikationer uden at afvige fra den sande ånd og ramme i de nye begreber ifølge opfindelsen.

Claims (15)

76 DK 174060 B1 Patentkrav.

1. Antigent syntetisk polypeptid indeholdende op til 40 aminosyrer, i aminosyresekvens svarende til en antigen determinant af HBxAg og omfattende en aminosyregruppesekvens, 5 valgt blandt gruppen af polypeptider, repræsenteret af formlerne, skrevet fra venstre mod højre og i retning fra amino-terminalen til carboxyterminalen; Gin-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp - Va1-Leu-Cys-Leu-Arg- Pro -Val-Gly,

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet 15 ved, at det endvidere omfatter en cysteingruppe i amino- eller carboxyterminalen af aminosyregruppesekvensen.

3. Vandopløselig eller vanddispergerbar antigen polymer indeholdende en flerhed af forbundne syntetiske polypep-tidrepeterende enheder, bundet sammen med oxiderede cyste- 20 ingrupper, idet de repeterende enheder er repræsenteret af en formel, skrevet fra venste mod højre og i retning fra aminoterminalen til carboxyterminalen, valgt blandt R1 - Gi n - Leu - Asp-Pro-Ala - Arg-Asp-Val - Leu-Cys-Leu - Arg --Pro-Val-Gly-R2,

25 Cys-Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser- -Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og Cys-Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gin-Ile-Leu-Pro--Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Cys, idet hver af R1 og R2 er en cysteingruppe, med det forbehold, 30 at kun én af R1 og R2-grupperne er til stede.

4. Antigenpolymer ifølge krav 3, kendetegnet ved, at de syntetiske polypeptidrepeterende enheder endvidere omfatter et polypeptid med en formel, skrevet fra venstre mod højre og i retning fra aminoterminalen til carb- 35 oxyterminalen, valgt blandt 77 DK 174060 B1 Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr--Phe-Lys-Asp-Cys, Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile--Arg-Leu-Lys-Val-Cys og

5. Receptormolekyle omfattende et antistofbindings-sted, der kan immunoreagere med et antigent syntetisk poly-peptid, kendetegnet ved, at polypeptidet indeholder op til 40 aminosyregrupper, i amino syregruppe sekvens 10 svarende til en antigen determinant af HBxAg og omfattende en aminosyregruppesekvens, valgt blandt gruppen af polypep-tidsekvenser med formlerne, skrevet fra venstre mod højre og i retning fra aminoterminalen til carboxyterminalen: Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-15 Pro-Val-Gly, Ser-Al a-Val - Pro-Thr-Asp-His -Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu--Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly.

5 R1-Ala-Pro-Ala-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2.

6. Diagnostisk analysesystem til bestemmelse af til stedeværelsen af HBxAg i en legemsprøve, kendetegnet ved, at det omfatter mindst én beholder med et første reagens, idet det første reagens omfatter receptormolekyler, som omfatter et antistofbindingssted, der kan immunoreagere 25 med HBxAg og med et antigent syntetisk polypeptid indeholdende op til 4 0 aminosyregrupper, som i aminosyregruppesekvens svarer til en antigen determinant af HBxAg, idet det syntetiske polypeptid omfatter en aminosyregruppesekvens, valgt blandt gruppen af polypeptidsekvenser med formlerne, skrevet 30 fra venstre mod højre og i retning fra aminoterminalen til carboxyterminalen: Gin - Leu - Asp - Pro - Ala - Arg - Asp - Val - Leu - Cys - Leu - Arg --Pro-Val-Gly, Ser-Ala-Val -Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-35 -Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu- 78 DK 174060 B1 -Pro-Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly.

7. Diagnostisk analysesystem ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et andet reagens i en anden beholder, hvilket andet reagens er det 5 antigene syntetiske polypeptid, med hvilket receptoren immun-reagerer.

8. Diagnostisk analysesystem ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter indikatormidler til at signalere immunreaktionen mellem receptorerne 10 og HBxAg.

9. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af en detekterbar mængde HBxAg eller en væsentlig polypep-tiddel deraf, kendetegnet ved, at den omfatter trinene: blanding af fastfasematrix-bundne proteiner fra en 15 legemsprøve, der skal analyseres, med receptormolekyler, som omfatter et antistofbindingssted, der kan immunoreagere med HBxAg og med et antigent syntetisk polypeptid indeholdende op til 4 0 aminosyregrupper, som i aminosyregruppesekvens svarer til en antigen determinant af HBxAg, i nærvær af et 20 indikatormiddel til signalering af en immunreaktion mellem receptorerne og HBxAg, idet polypeptidet omfatter en aminosy-regruppesekvens, valgt blandt gruppen af polypeptidsekvenser med formlerne, skrevet fra venstre mod højre og i retning fra aminoterminalen til carboxyterminalen:

25 A) Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg- -Pro-Val-Gly, B) Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser--Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og C) Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-30 -Lys-Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly, idet man holder blandingen i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at indikatormidlet kan signalere, at der er sket en immunreaktion, og konstatering af tilstedeværelsen af signalet.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendeteg net ved, at legemsprøven og receptoren blandes i fravær 79 DK 174060 B1 af indikatormidlet, og at blandingen holdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at danne et bundet immunreaktions-produkt, og at indikatormidlet blandes med immunreaktionsproduktet, efter at produktet er skyllet.

10 Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu- Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys--Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly.

11. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af anti-HBxAg-antistoffer, der er til stede i en legemsprøve, kendetegnet ved, at den omfatter trinene: a) tilvejebringelse af et antigen, fastgjort til en fast matrix til dannelse af en fast understøtning, idet anti- 10 genet er et polypeptid indeholdende op til 40 aminosyre-grupper i aminosyregruppesekvens svarende til en antigendeterminant af HBxAg, idet polypeptidet indeholder en aminosyregruppesekvens, valgt blandt gruppen af polypeptidsekvenser med formlerne, skrevet fra venstre mod højre og i retning 15 fra aminoterminalen til carboxyterminalen: Gln-Leu-Asp-Pro-Ala-Arg-Asp-Val-Leu-Cys-Leu-Arg-Pro- -Val-Gly, Ser-Ala-Val-Pro-Thr-Asp-His-Gly-Ala-His-Leu-Ser-Leu--Arg-Gly-Leu-Pro-Val-Cys og

20 Met-Glu-Thr-Thr-Val-Asn-Ala-His-Gln-Ile-Leu-Pro-Lys- -Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly, b) blanding af den faste understøtning med en flydende legemsprøve, der skal analyseres, til dannelse af faste og væskefaser, 25 c) opretholdelse af blandingen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at anti-HBxAg-antistoffer, der er til stede i legemsprøven, kan immunoreagere med antigenerne i den faste understøtning, og d) bestemmelse af tilstedeværelsen af immunreaktionen 30 med et indikatormiddel.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den faste matrix er nitrocellulose.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den faste matrix er en mikrotiterplade.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendeteg net ved, at legemsprøven er serum. 80 DK 174060 B1

15 Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at indikatormidlet er et mærket antistof, antistofbindingssted eller S.aureus-protein A, der reagerer med anti-HBxAg-antistoffet.