KR900006574B1 - 프리(pre)-S 유전자 코우드된 펩티드, B형 간염면역원, 왁찐, 진단법 및 합성지질소낭 담체 - Google Patents

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뉴욕 블러드센터 인코오퍼레이티드
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Abstract

내용 없음.

Description

프리(pre)-S 유전자 코우드된 펩티드, B형 간염면역된, 왁찐, 진단법 및 합성지질소낭 담체
제 1 도는 폴리펜티드 성분으로 분해된 환원된 HBsAg를 요소내에서 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동("SDS-PAGE")에 따르게 한 결과를 나타내며,
제 2 도는 HBV DNA의 서열로부터 유도원 프리-S 유전자 영역의 번역생성물의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열은 한글자의 아미노산 코우드로 나타내며(이러한 코우드는 본명세서 '정의'난에 기재하였다) 5가지 별개의 HBV아형(亞型)에 대한 서열을 제시하였다. 6번째 밑줄은 모든 5가지 아형에 공통인 아미노산잔기를 나타낸다.
제 3 도는 프리-S 유전자 생성물의 아미노산 서열에 해당하는 상대적인 친수성의 단면도를 나타낸다. ayw 이의의 아형에 대한 단면도도 이와 유사하다. 메티오닌 175로부터 오른쪽의 단면부분은 S-유전자 번역 생성물을 나타낸다.
제 4 도는 유리의 프리-S 120-145(제4a도)로 면역된 것과 L-티로신-아조벤젠-P-아르소네이트(RAT)기(제4b도)를 포함하는 가교결합된 리포소옴(liposome)에 연결된 같은 펩티드로 면역된 토끼의 평균항체반응에 대한 두세트의 막대 그래프를 나타낸다. 항-HBs(HBsAg에 대한 항체)는 교차선으로된 막대, 항-프리-S 120-145는 빗금친 막대이다. 리포소옴 결핍 RAT기로 제4b도와 유사한 결과를 얻되, 6주후의 반응은 더 낮았다. 시간=0에 해당하는 면역전의 혈청을 나타낸다.
제 5 도는 리포소옴에 결합된 프리-S 120-145로 면역된 토끼로부터의 혈청의 일련의 희석에 대한 방사면역 측정(radio immuno assays)을 표시한 그래프, 항-HBs(HBsAg에 대한 항체)는 ■로, 항-프리-S 120-145는 ●로 도시하였다. 면역전 혈청의 별개의 희석도에 해당하는 분망계수(cpm)를 항-프리-S 120-145의 희석도에 해당하는 cpm으로부터 감하여 그차이를 도시하였다. 혈청의 종말점 역가(titer)(1/163,840)는 cpm이 면역전 혈청의 같은 희석도에 해당하는 것보다≥2.1 더높은 최고희석도에 해당한다.
제 6 도는 항-프리-S 120-145의 P33 및 P36과의 반응을 웨스턴 얼룩(제 1 도와 비슷함)으로 보여준다. 제 7 도는 항-프리-S 120-145로 피복된 폴리스티렌 비이드를 기초로 한 B형 간염 항원에 대한 진단시험을 묘사한 그래프를 나타낸다.
제 8 도는 각개 토끼의 S 135-155(HBV env 유전자의 개방해독체계의 아미노산 309 내지 329)의 콘주게이트에 대한 항체반응의 편집을 나타내는 도시도이며 콘주게이트의 형은 제 1 도에 정의한 숫자로 표시되어있다. 세번째 면역 2주후 얻은 혈청의 항체를 S 135-155-베타-갈락토시다제 콘주게이트와 판소르빈을 사용하여 측정(asay)하였다. (Neurath, A. R., Kent, S. B. H. 및 Strick, N., "바이러스 단백질, B형간염 표면항원과 공통적인 서열을 갖는 합성펩티드에 의해 유도된 항체의 특이성", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 79, 7871-7875(1982)). 그들의 상대역가를 S 135-155-KLH 콘주게이트에 의해 유도된 항체수준과 비교하여 제공하였다. RIA에 의한 항-HBs 측정(AUSRIA 시험, Abbott 실험실, North chicago, Illinois)의 결과를 인터내쇼날 밀리유니트(mlU/ml ; Neurath et al., 1982, 위와같음)로 제공 하였다. 선은 항-HBs 반응과 함께 토끼에 관련되는 모든 데이타 세트에 최고 적합한 계산된 선형 회귀직선에 해당한다. 계산된 상관계수(=0.55)는 항-HBs와 항-S 135-155 반응간의 낮은 상관성을 가리킨다.
제 9 도는 별개의 S 135-155-콘주게이트(각 페널안에 수를 나타내었고 제 1 도에 정의하였다)로 면역된 토끼에서의 항체반응의 시간 경과의 예들을 묘사한 4개의 막대그래프시트(제9a도, 제9b도. 제9c도 및 제9d도)를 나타낸다.
제9a도는 콘주게이트 No.5에 해당하고, 제9b도는 콘주게이트 No.11, 제9c도는 콘주게이트 No.12 및 제9d도는 콘주게이트 No.19에 해당한다. 항-HBs(빗금친 막대)와 항-S-135-155(검은막대)를 제 8도에 기술한 바와 같이 측정하였다.
제10도는 네개의 도표(A,B,C 및 D)를 나타내는네, 비콘주게이트 펩티드 프리-S(120-145)에 의해 유도된 것과(도표 A)부착된 RAT(L-티로신 아조벤젠-p-아르세네이토기를 가진 가교결합된 시스테인 활성리포소옴에 연결된 같은 펩티드에 의해 유도된(도표 B)펩티드 프리-S(120-l45)에 대한 항체반응역학( )과 구형 HBsAg 입자 대략 22nm이내의 프리-S 단백질에 대한 항체반응역학( )을 묘사하였고, 4회 투여량의 펩티드-프리-S(120-145)(도표 C)와 프리-S (12-32)(도표 D)로 2주 떨어져서 면역시킨 토끼의 혈청내의 항-펩티드 항체역가에 대한 담체의 효과를 나타내었다 도표 C 및 D에 대한 담체는 ①은 없는것, ②는 키이흘드 림폣 헤모시아닌(Keyhold lympot hemocyanin, KLH), ③은 백반, ④와 ⑤는 가교결합된 시스데인 활성리포소옴의 부착된 RAT기가 있는것 또는 없는것이다 ③을 제의한 모든 경우에서 완전및 불완전 프룬드 보조액(Freund's adjuvant)을 사용하였다
제11도는 토끼 항혈청의 일련의 희석액내에서 IgG 항체의 방사면역 측정에 대한 두 그래프를 나타내는데, 프리-S (120-145)에 대한 것[●], RIA에 의해 검출가능한 항체가 없는 HBV입자와 관형의 HBsAg에 대한것[○]과 41C-말단 아미노산 잔기가 없는 프리-S 단백질 서열을 갖는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제의 용융단백질에 대한것(□), 그리고 B형 간염으로부터 회복된 환자의 혈청에서의 IgG(△)와 IgM(▲)항체의 방사 면역측정을 나타낸다. 후자의 혈청은 S-단백질에 대한 항체를 검출하기 이전에 뽑아내었다. 이뮬론 2리무버를 스트립스(immulon 2 Removable strips Dynatech Laboratories)를 유리펩티드 프리-S(120-145) 또는 프리-S(12-32) 20μg/ml로 피복하고 젤라틴(0.1M Tris중 2 5mg/ml, pH 8.8)으로 후-피복하였다. 피복조건과 이중항체 RIA는 뉴래스(A.R. Neurath), 켄트(S.B.H. Kent), 스트릭(N. Strik), 과학, 224, 392(1984)와 뉴래스, 켄트, 스트릭, Proc Natl. Acad. Sci USA 79,7871(1982)에 기재되어 있다.
제12도는 항-프리-(120-145) IgG(1 : 100으로 희석된 항혈청)의 프리-S(120-145)-β-갈락로시다제콘주게이트와의 반응의 억제를 묘사하는 그래프로서, 유리펩티드 프리-S(120-145)에 의한것[●], 20nm구형 HBsAg 입자에 의한것[▲], 그리고 HBV 입자에 의한것[■]을 나타내었다. 후자의 두 제제는 방사면역측정(AUSRIA, Abbott 실험실)에 의해 측정한 것과 같은 농도의 HBsAg S-단백질을 포함하였다.
제13도는 검사일에 대한 항-프리-S (120-145)역가의 도시도이며 급성 B형 간염의 동안에 프리-S 유전자 코우드로 뇐 HBV 단백질예 대한 IgM[●]과 IgG[■]항체의 발육을 가리킨다.
제14도는 항-프리-S (120-145) IgG(○,●,□)로 피복되거나 또는 HBV입자에 대한 토끼 항혈청의로 부터의 IgG와 관형의 HBsAg(▲,△)로 피복된 폴리스티렌비이드상에 HBV-특이성 단백질을 포함하는 여러가지 제제의 방사면역 측정에 대한 도시도를 나타낸다. 시험항원은 HBV입자와 관형(●,▲), 플라즈마로부터 분리한 대략 20nm의 구형 HBsAg 입자(○,△), 그리고 후자의 입자를 펩신으로 처리한것(1mg/ml HBsAg, 0.1M 글리신-HC1 중의 50μg/ml 펩신, pH 2.2 37℃에서 2시간)(□)이었다.
제15도는 인플라즈마로부터 분리되고 프리-S 유전자 코우드서열을 포함하는 HBsAg와 관련되거나(●)또는 HBV DNA S-유전자를 포함하면서 프리-S 유전자 코우드로 된 서열이 없는 재결합 DNA를 포함하는 이스트에서 생성된 HBsAg와 관련된(○)중합화된 알부민 결합부위의 방사면역측정에 대한 도시도를 나타낸다.
제16도는 사람의 간암 HeP G2 세포를 인식하는 영역에 대한 HBV env의 프리-S 부분을 주사한 결과를 묘사하는 일련의 4세트의 막대그래프이며,
제17도는 HBV env 단백질의 개략적 표현이며,
제18도는 리포소옴에 연결된 프리-S(21-47)로 면역된 토끼의 혈청에서 동종의 펩티드 또는 HBV를 인식하는 항체의 측정의 결과를 나타내는 그래프이며,
제19도는 간세포의 HBV 결합부위에 대한 항체의 검출에 관한 그래프이며,
제20도는 간세포에 대한 HBV 결합부위의 발생에 대한 결과에 관한 그래프이며,제21도는 HBsAg의 폴리아크릴아미드 셀 전기영동의 결과를 묘사하며,
제22도는 전자현미경(a 부분)에 의해서와 HBV DNA 혼성(b 부분)에 의해 표시한 바 항-프리-S(21-47)에 의한 HBV의 면역침전을 나타내며,
제23도는 급성 B형 간염이 발생한 개인의 혈청에서 B형 간염 표식(marker)의 출현의 시간경과에 관한그래프,
제24도는 이중항체 고체상 측정의 결과를 나타내는 그래프,
제25도는 토끼 항-프리-S[120-145)로 측정한 8개의 프리-S 펩티드에 대한 결과를 묘사한 그래프,
제26도는 토끼 항-프리-S(120-145)항 혈청이나 아니면 토끼 항-HBV 항혈청과의 프리-S(120-145)-베타-갈락토시다제 콘주게이트를 사용하는 억제측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 프리[pre)-S 유전자 코우드된 B형 간염 면역된, 왁찐 및 진단법에 관한 것이다. 더욱 상세히는, 본 발명은 신규한 프리-S 유전자코우드된 펩티드 및 신규한 단체, 특히 프리-S 유전자코우드된 펩티드에 대한 담체 관한 것이다 좀더 상세히는 본발명은 지질 부형제 담체에 공유 결합된 합성 프리-S 유전자코우드된 펩티드에 관한 것이다.
미국내에 B형 간염 바이러스의 대략 600,000개의 지속성 담체가 있다. 세계에서 담체의 추정총수는 2억이다.
HBV 담체의 상당한 부분이 만성 간질환을 갖는다. 간암에도 HBV가 관련됨이 증명되었다. (W. Szmunes, Prog. Med. Virol., 24 40(1978)과 R.P. Beasley, L.-Y. Hwang, C.-C. Ling C.-S.Chien, Lancet Nov., 21, 1129(1981)).
HBV 감염은 이와같이 세계적인 주요한 공중보건 문제를 제시하고 있다. HBV 담체의 혈청으로부터 생성된 이미 구입가능한 왁찐들(S. Knuman, in Viral Hepatitis : Laboratory and Clinical Science, F. Deinlnrdt, J. Deinhardt, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York-Basel,1983, pp 257-263)은 제한된 자원과 수반되는 생산가 때문에 세계적인 질병을 억제 및 근절하기 위한 적당한 수단을 제공하지 못한다. 그러나, 이것은 재결합 DNA 기법 및/또는 합성 켑티드를 기초로 한 왁찐에 의해 달성될 수 있다.
생물학, HBV의 구조 및 면역화학 그리고 DNA제놈(genome)의 유전조직을 조사하였다. (B.S.Blumberg, Science, 197, 17(1977)) 여러가지 간염 바이러스(HBV) 분리울의 제놈의 클로우닝 및 시퀀싱(squencing)은 바이러스성 DNA의 유전구조의 규명을 가져 왔다. (P. Tiollais, P. Charnay, G.N.Vyas, Science, 213, 406, (1981)).
HBV 감염의 면역학적 표지제는 표면 항원(HBsAg), 핵항원(HBcAg), ''e"항원(HBeAg) 및 그들의 각항체를 포함한다. HBsAg에 대한 항체는 HBV 감염에 대한 예방제이다.
HBV와 아바이러스성 대략 22nm 직경입자의 몇몇 항원성 아형(B형 간염 표면항원, HBsAg)이 알려지게 되었다. (G. Lebourvier, A. Williams, Am. J. Med Sci., 270, 165(1975)). 이들 모든 아형은(예를들면, ayw, adyw, adw2, adw 및 adr) 공통의(기-특이성)외피에피토우프(epitopes)를 갖고 어떠한 바이러스 아형에 의한 감염에 대해서는 예방이 충분한 것으로 나타나는 면역 반응을 갖는다. (W. Szmuness, C. E. Stevens, E.J Harley, E.A. Zang, H.J. Alter, P.E. Taylor, A. DeVera, G.T.S. Chen, AKellner, et al., N. ENgl J. Med., 307, 1481, (1982)).
HBV 제놈의 물리적 구조와 제안된 유전성 조직은 티올레이(Tiollals et. al., 1981 위와같음 pp. 408-409)가 기술하였다. 두가지 DNA 스트랜드, 즉 긴(L)스트랜드와 짧은(S)스트랜드가 있다.
스트랜드 전사(轉寫)는 (S+프리-S), C, P 및 X로 칭하는 네개의 개방해독체계영역을 갖는다.
개방해독체계영역(S+프리-S)은 HBV DNA의 외피(env)유전자에 해당하며 HBV 외피에서와 바이러스 관련입자에서 발견된 단백질과(枓)에 대한 코우드이다.
HBV DNA의 env유전자의 가능한 번역 생성물의 계통적 표현은 다음과 같다.
Figure kpo00001
Figure kpo00002
위의 도표에서 숫자는 아미노산(AA)을 말한다. Met1에서의 번역 개시부위는 adw2와 adr 아형에 대해서만 존재한다. 다른 아형에 대한 첫번째 아미노산은 프리-S 12 위치에 해당한다
이후부터 프리-S 영역(env 1내지 174)에 해당하는 아미노산 서열은 접두어 "프리-S"로 지칭하고 S영역(env 175 내지 400)에 해당하는 아미노산 서열은 접두어 "S"로 지칭한다. env유전자생성물 표현에서의 S영역은 "S 영역만"의 표현에서의 아미노산 1내지 226과 비교할때 아미노산 175 내지 400에 뻗쳐있다.
위의 도표에서 트리-S 영역은 아미노산 서열위치 프리-S 1내지 아미노산 서열위치 프리-S 174로 정의된다. S 영역은 서열위치 S 1(개방해독체계의 아미노산 175이며 프리-S 174에 입접한것)내지 서열 위치S 266(개방해독체계의 아미노산 400)으로 정의된다. S-유전자 생성물(S-단백질)은 이 226아미노산 서열로 구성된다.
바이러스-중화 항체를 유도하는데 필수적인 에피토우프는 아직 명백하게 정의되지 않았다. 기-특이성은 바이러스 외피와 B형 간염 표면항원(HBsAg)의 두가지 주요한 대략 22와 대략 26킬로달톤(killodalton) 성분 단백질(P22와 P26)각각에 위치한 결정인자 착물로 표현됨이 보고되어 있다. (J.W.-K. Shih, J.L.Gerin, J Immunol., 115, 634, (1975) ; J.W.-K. Shin, P.L. Tan. J.L. Gerin, J. Immuno1., 120, 520, (1978) ; S. mlshiro, M. Imai, K. Takahashi, A. Machida, T. Gotanda, Y. mlyakawa, M. Mayuml, J. Immuno1., 124, 1589, (1980) ; 그리고 G.R. Dreesnnn, R. Chairez, M. Suarez., F.B. Hollinger, R. J. Courtney, J. L. Melnick, J. Virol., 16, 508, (1975, 참조.)
이들 단백질은 HBV DNA의 S-유전자로 코우드된(Tiollais et al., 위와같음)동일한 아미노산 서열을 가지나 더큰 단백질은 또한 탄수화물 사슬을 가지고 있다. S-유전자 생성물의 선택된 단편에 해당하는 펩티드가 합성되었고 HBsAg(항-HBs)에 대한 항체를 이끌어 냄을 보여주었다. 그러나 이들 펩티드를 침판지에 면역했을매 HBV 감염에 대한 단지 부분적인 예방을 가져왔다(N. Williams, Nature, 306, 427, (1983)).
대략 33과 대략 36킬로달톤(P33, P36)의 Mr을 가진 HBsAg의 주요글리콜 단백질 성분은 HBV DNA로 코우드되며 P22서열(S 영역에 해당하는 226아미노산)을 포함하고 HBV DNA의 env 유전자의 프리-S 영역으로 코우드된 아미노-말단부에서 55개의 추가 아미노산을 갖는다는 것이 최근에 보고되었다. (W. Stibbe, W.H. Gerlich, Virology, 123, 436, (1982) ; M.A. Feitelson, P.L. Marion, W.S. Robinson, Virology, 130, 76, (1983) ; W. Stibbe, W.H. Gerlich, J. Virol., 46, 626, (1983) ; 그리고 A. Machida, S. Kishimoto, H. Ohnuma, H. mlyamoto, K. Baba, K. Oda, T. Nakamura, Y. mlyakawa, M. Mayuml, G Gastroenterology, 85, 268, (1983)참조). 마찌다(Machida)등은 중합화 혈청 알부민에 대한 수용기로서 아미노산 서열 조성물을 기술하고 있다.
이제까지, B형 간영 바이러스 DNA의 프리-S 영역으로 코우드된 아미노산 서열은 궁극적으로 합성왁찐을 생산하려는 목적으로 전적으로 무시되었다. 미국에서 현재 사용중인 B형 간염 왁찐은 프리-S 유전자코우드된 서열을 갗고 있지 않으며(그러므로 이러한 서열에 대한 항체를 이끌어내지 못한다) 따라서 자연적인 감염으로부터 회복하는 동안에 발생하는 것과 비교할때 불완전한 HBV 외피에 대한 면역반응을 유도하게 된다.
미리 선택된 단백질 단편의 서열에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 짧은 펩티드로 면역항에 의한 단백질에 대한 항체의 발생은 빈번한 일이 것으로 나타난다. (Nima, H.L., Houghten, R.A., Walker, L.E., Reisfeld, R.A., Wilson I.A., Hogle, J.M. 및 Lerner, R.A., "짧은 펩티드에 의한 단백질-반응 항체의 발생은 높은 빈도의 사건이다. 면역확인의 구조적 기초에 대한 암시", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 4949-4953, (1981)). 그럼에도 불구하고 천연 단백질을 확인하는 항체의 발생은 합성펩티드 면역된의 적당한 구조에 의존할 수도 있고 아직 이해되지 않은 다른 인자에 의존할 수도 있다(Pfaff, E., Musgay, M., Bohm, H.O., Schulz, G.E. 및 Schaller, H., "미리 선택된 펩티드에 대한 항체는 발 및 입 질병 바이러스를 확인, 중화시킨다", The EMBO Journal, 7, 869-874, (1982) ; Neurath, A.R., Kent, S.B.H. 및 Strick, N., "바이러스 단백질, B형 간염 표면항원과 공통적인 서열을 갖는 합성 펩티드에 의해 유도된 항체의 특이성", Proceedings of The National Academy of Sciences USA, 79, 7871-7875, (1982) ; Ionescu-Matiu, I., Kennedy, R.C., Sparrow, J. T., Culwel1, A.R. Sanchez, Y., Melnick, J.L. 및 Dreesman, G.R., "합성 B형 간염 표면항원 펩티드와 관련된 에피트우프", The Jounml Of Immunology, 130, 1947-1952, (1983) ; 그리고 Kennedy, R.C., Dreesman, G.R., Sparrow, J.T., Culwell, A. R., Sanchez, Y., Ionescu-Matiu, I., Hollinger, F.B. 및 Melnick, J .L. (1983) ; "환상 합성펩티드에 의한 일반인 항-B형 간염 표면항원 특수형의 억제", Journal of Virology, 46, 653-655, (1983)참조) 이런 이유로, 여러가기 바이러스 단백질의 합성펩티드유사물로 면역하는 것은 바이러스(바이러스 단백질)자체로 유도된 것과 비교할만한 바이러스-중화 항혈청의 생성을 단지 드물게만 가져왔다(Pfaff et a1., 1982, 위와같음) 따라서, 천연 바이러스에 대한 항혈청 결정인자를 알맞게 묘사하는 합성면역된의 제조는 도전의 여지가 있는 것이다.
통상 사용되는 단백질 담체, 즉, 키흘림폣 헤모시아닌(KLH), 알부민등의 합성담체에 의한 대치는 이리한 도전의 부분을 나타낸다. 최근의 보고서는 유리합성 펩티드가 면역된성이 있을 수 있음을 가리킬지라도, (Dreesnnn, G.R., Sanchez, Y ,Ionescu-Matiu,I., Sparrow, J.T., Six, H. R., Peterson, D L., Hollinger, F.B. 및 Melnick, J.L, "비결합(uncoupled) 합성 HBsAg 펩티드의 단독 접종후의 B형 간염표면항원에 대한 항체 "Nature, 295, 158-160, (1982), 그리고 Schmltz, H.E., Atasi, H., 및 Atassi, M.Z., "면역된으로서 유리합성 펩티드를 사용하는 단백질에서 비-면역성인 표면영역에 대한 모노클로낱항체항체의 생산 향유고래 미오글로빈으로 증명함" ,Immunological Communications, 12, 161-175, (1983))
이들 경우에서도 단백질 담체에 대한 펩티드의 결합으로 항체반응이 향상되었다. (Sanchez. Y., Ionescu-Matiu, I., Sparrow, J.T., Melnick, J. L., Dreesman, G.R ., "합성 B형 간염 포면항원 펩티드의 콘주게이트 및 미셀(mlcelles) 의 면역된성 ", Intervirology, 18, 209-213, (1982)).
B형 간염 바이러스는 시험관내에서 아직 전파되지 않았고 그의 반응과 표적세포에 대한 수용체에 관한지식이 부즉하다. 바이러스 표면 단백질의 필수기능중 하나는 표적 세포만에 대한 특이성 수용체의 인식이다. 세포에 대한 바이러스의 특이성 부착은 세포로의 바이러스 도입의 필수적인 제 1 단계이다.
바이러스 표면 구조의 제한된 영역에 코우드된 수용체 특이성은 바이러스 숙주범위, 조직굴성 및 병원학을 구할수 있다(K. Lonberg-Holm and L. Philipson, eds. Receptors and Recognition, Series B, Volume 8, Virus Receptors : Part 2-Animal Viruses. (London : Chapman and Hall), pp. 85-211, (1981) ; B.N. Fields and M.I. Gneene, "바이러스성 병원학의 유전자 및 분자 메카니즘 예방 및 치료를 위한 암시", Nature, 300, 19-23, (1982), A. H. Sharpe and B.B Fields, "바이러스성 감염의 병원학 : 레오바이러스 모델로부터 유도된 기초개념", New Engl J. Med., 312, 486-497, (l985)), 별개의 바이러스들에 대한 세포성 수용체들은 별개의 생리학적으로 중요한 리간드에 대한 수용체로서 확인 되었다(D.A. Eppstein, Y.V. Marsh, A.B. Schreiber, S.R. Newman, G.J. Todaro and J.J. Nestor, "표피성장인자 수용체는 우두 바이러스 감염을 억제한다." Nature, 318, 663-665, (1985)). 그러므로, 세포수용체 및 해당 바이러스 결합부위의 상세한 특징의 이해는 바이러스-세포 상호작용을 설명하는데 있어 중요한 단계이다.
더나아가서, 세포 수용체 인식에 수반된 바이러스 표면영역에 또는 이웃 영역에 대한 효과적인 면역반응은 숙주의 바이러스 중화반응의 중요한 성분이다(B. Mandel, 바이러스 중화. In Immunochemlstry of Viruses 혈청 진단법 및 왁찐에 대한 기초, M.H.V .Van Regenmortel and A.R. Neurath, eds. (Amsterdam Elsevier), pp. 53-70, (1985) ; A. Baltimore, "Picornavimses are No Longer Black Boxes, Science, 229, 1366-1367, (1985)).
바이러스성 표면 단백질상의 세포 수용체 인식 영역의 기초적인 생물학적 중요성에도 불구하고 단지 몇 바이러스의 영역들이 정의되었다. 현저하게, 인플루엔자 바이러스상의 수용체 결합부위(D.C. Wiley, I.A. Wilson 및 J.J. Skehel, "홍콩 인플루엔자 헤마글루티닌의 항체-결합부위의 구조적 확인 및 항원성 변이에 있어서 그들의 개선책", Nature, 289, 373-378, (1981) ; I.A. Wilson, J.J. Skehel 및 D.C. Wiley, "3A 분해에서 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌막 당단백질의 구조", Nature, 289, 366-373, (1981)) 및 피코르나 바이러스(J.M. Hogle, M. Chow 및 D.J. Filman, "2.9A 분해에서 폴리오바이러스의 3차원 구조", Science, 229, 1358-1365, (1985), M.G. Rossmann, E. Arnold, J.W. Erickson, E.A. Frankenberger, J.R. Griffith, H.-J. Hecht, J.E. Johnson, G. Kamer, M. Luo, A.G.Mosser, R.R. Rueckert, B. Sherry 및 G. Vriend "사람의 감기바이러스의 구조 및 다른 피코르나 바이러스에 대한 기능성관계, Nature, 317, 145-153, (1985))는 X-선 결정학법과 아미노산 서열 데이타를기준으로 바이러스 표면 단백질의 제한된 영역에 시험삼아 할당하였다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 1차적 간세포암에 내포된 주된 사람의 병원체이다. 바이러스는 헤파드나 비리데군의 멤버인네(W.S. Robinson, B형 간염 바이러스 In Viral Hepatitis Laboratory and Clinical Science, F. Deinhardt 및 J. Deinhardt, eds. (뉴욕 Marcel Dekker, Inc.), pp. 57-116, (1983)), 그의 표적은 간이다 지금까지, HBV env 단백질의 간세포 수용체 인식부위의 위치측정은 알려지지 않았다.
통상 사용되는 단백질 담체에 대하여 합성펩티드 뿐만 아니라 담체에 대한 강한 면역반응이 있다. 따라서, 스스로는 항체반응은 나타내지 않는 비-단백질 담체를 사용하여 펩티드와의 항-HBs 반응을 일으키는 것이 유리할 것이다
예방(prophylaxis)에 몇몇 별개의 왁찐의 가능한 사용은 충분한 합성 면역된의 유용성에 의해 실시 용이할 것이다.
Figure kpo00003
Figure kpo00004
이제 본 발명을 요약하면 다음과 같다.
출원인은 프리-S 단백질에 대한 항체는 B형 간염 감염의 과정에서 일찌기 나타나고 아마도 순환계로부터 HBV를 제거하며 따라서 감염이 더욱 퍼지는 것을 막는 항체의 역활을 나타낸다는 것을 발견하였다. 프리-S 단백질에 대한 항체는 바이러스-중화 항체를 나타내는 것같다. 어떠한 B형 간염 왁찐이 이러한 항체를 유도하는데 대한 실패는 S-단백질에 대한 검출 가능한 면역 반응에도 불구하고 어떤 모집단에서의 이러한 왁찐으로 유도하는 나쁜 면역 질병예방(immunoprophylactic)효과가 가리키는 바와 같이 상당한 생물학적 중요성이 있게된다.
출원인은 B형 간염 바이러스(HBV) DNA와 env 유전자의 프리-S 영역으로 코우드된 아미노산 서열은 본래의 HBsAg와 변성된 HBsAg에 공통인 지배적인 항원성 결정인자를 갖는다는 것을 발견하였다. 출원인은 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 인 항체로 확인된 면역-지배 디설파이드-결합 무관계 에피트우프가 HBV DNA의 프리-S 영역으로 코우드된 아미노산 서열을 포함하는 단백질내에 존재하는데 더 상세히는 아미노산 서열위치 프리-S 120에 N-말단 메티오닌을 갖는 N-말단부분(HBV DNA의 프리-S 영역으로 코우드된 것)을 포함하는 단백질내에 존재한다는 것을 발견하였다. 출원인은 더나아가서 프리-S 영역의, 더 상세히는 env 유전자 개방해독체계의 아미노산 120에서 출발하는 전술한 영역에서 아미노산 서열에 해당하는 펩티드는 인 항-HBs와 P33(P36)간의 반응을 억제하고 면역된성이 크며, HBsAg와 HBV에 대하여 높은 수준의 기-특이성 항체를 유도한다는 것을 발견하였다. 이러한 펩티드의 면역된성은 역시 출원인이 발견한 신규한 지질 소낭(리포소옴)담체에 대한 공유결합에 의하여 양상된다.
글루타르알데히드-고정 리포소옴은 항-HBs를 유도하기 위한 발명 펩티드에 대한 바람직한 담체인 것으로 발견되었다.
본 발명은 이와 같이 HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드를 함유하는, B형 간염 펩l티드 면역된에 관한 것이다 B형 간염 펩티드 면역된은 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산 사슬이 없다.
자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질은 다음을 포함한다 : (1) HBV의 env 유전자의전 길이 번역생성물, 즉, adw2와 adr 프리-S(1-174) +S(175-400)=400 아미노산에 대한것, ayw,adyw 및 adw 프리-S(12-174) +S(1-226)=389 아미노산(env 12-400) 에 대한것. (2) 프리-S(120-174)+S(175-400)=281 아미노산(env 120-400)=프리-S 영역의 말단 55 아미노산+전 S 영역으로 이루어지는 226 아미노산(해당 단백질은 크기가 대략 33과 36kD(P33과 P36)이머 글리코실화의 정도에 있어서서로 다르다) 그리고 (3) S(1-226)=226 아미노산, 즉, 전 S 영역(env 175-400) : 그들의 비-글리코실화 및 글리고실 형태("S-단백질")가 HBV 외피의 대략 22와 26kD인 주요성분을 나타낸다(P22와 P26).
본 발명의 B형 간염 펩티드의 구체예에서는 아미노산의 해당 사슬이 서열위치 프리-S 120과 프리-S174 사이에 놓인다. 발명의 다른 구체예에서는 아미노산 사슬이 서열위치 프리-S 1과 프리-S 120사이이다. 발명의 다른 구체예에서는 해당사슬의 아미노산은 서열위치 프리-S 120에서 메티오닌 아미노산을 포함한다. 또다른 구체예에서는 아미노산 사슬은 프리-S 영역에 적어도 26 아미노산을 포함하는 아미노산사슬이다. 또다른 것으로, 적어도 26 아미노산을 포함하는 아미노산 사슬은 서열위치 프리-S 120과 서열위치 프리-S 174사이에 배치된 적어도 26 연속아미노산 사슬에 해당될 수 있다. 일반적으로, 펩티드는 280이하의 아미노산, 바람직하게는 225 아미노산 이하, 더 바람직하게는 174 아미노산 이하, 또 더욱 바람직하게는 100 아미노산 이하, 그리고 또 더욱 바람직하게는 50 아미노산 이하를 갖는다. 본 발명 왁찐은 오로지 펩티드로 구성될 수 있거나 또는 바람직하게는 담체에 결합된 펩티드로 구성될 수 있다. 이러한 담체는 이하에 기술하는 바와 같은 본 발명에 따르는 편리한 담체 또는 신규한 담체가 될 수 있다.
본 발명 B형 간염 펩티드 면역된은 어떠한 혈청단백질도 없다.
본 발명은 또한 HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드의 생리적으로 허용되는 희석제, 예로써 인산염 완충 생리식염수를 포함하는 B형 간염 왁찐에 관한 것이다. B형 간염 펩티드 왁찐은 천연발생 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산 사슬이 없다.
본 발명은 또한 펩티드에 대한 신규한 담체에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서는 프리-S 영역의 아미노산 사슬에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 B형 간염 왁찐은 담체상의 활성부위에 의해 담체에 결합되어 있다. 더욱 바람직하게는 담체는 지질 소낭담체이다. 또 더욱 바람직하게는 지질 소낭담체는 가교결합에 의하여 안정화된다.
본 발명 담체는 가교결합으로 안정화된 지질소낭을 포함하며 그의 외표면에 공유결합원 활성부위를 갖는다. 합성펩티드는 담체상에 지질소낭의 외표면에 대한 이러한 활성부위에 의해 결합되어 있다. 이러한 활성부위는-COOH,-CHO,-NH2및-SH를 포함한다. 이러한 가교결합에 의한 안정화는 적어도 두 작용기를 갖는 알데히드와 같은, 예로써 글루타르 알데히드와 같은 이 작용기성 알데히드와 같은 안정제에 의해 달성된다. 본 발명 담체는 늘어진 작용기와 화학적으로 가교결합된다.
본 출원은 또한 진단법에 관한 것이다. 본 발명은 혈청중의 프리-S 유전자 코우드-B형 간염 항원이나 항체의 존재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
여기에 명시된 합성펩티드에 대한 항체는 a) HBV 외피의 프리-S유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 비-표지된(labelled)펩티드, 즉, 자연적으로 발생하는 형힝 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 펩티드로 피복된 고체기질로 시료를 접촉시키고 이 접촉시료를 배양, 세척시키는 단제, b) 위의 단계, a)에서 얻은 배양세척 생성를을 외피의 프리-S 유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 표지된 펩티드, 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 상기 펩티드와 접촉시키고 결과된 덩어리를 배양, 세척시키는 단계, 그리고 c) 위의 단계 b)에서 얻은 결과된 덩어리에 존재하는 표지된 펩티드의 정도를 결정하는 단계로 이루어지는 방법에 의해 시료중에서 검출될수 있다.
이러한 방법은 유용한 단백질 결합부위가 실질적으로 없는 고체기질을 사용하면서 보통 수행된다. 비표지된 펩티드로 결합되지 않은 부위를 단백질 결합부위 점유체, 예를 들면 알부민으로 결합시키는 것과 같다.
이러한 항체를 검출하는 또다른 방법은 a) HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 비표지 펩티드, 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 펩티드로 피복된 고체기질로 시료를 접촉시키고 상기 접촉시료를 배양, 세척하는 단계, b) HBV 외피의 프리-S 유전자-코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 펩티드로 이루어지는 면역된, 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 펩티드 면역된으로 접촉시킴에 의한 인 또는 동물 면역글로부린 생성물에 표시된 항체로 위의 a) 단계에서 얻은 배양세척물을 접촉시키고 접촉된 시료를 배양, 세척하는 단계, 그리고 c) 단계 b)의 결과된 덩어리에 존재하는 표지된 항체의 정도를 결정하는 단계로 이루어진다. HBV 또는 HBsAg는 a) HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 펩티드로 이루어지는 면역된, 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산서열이 없는 펩티드 면역된을 동물 또는 인간에 투입함으로써 생성된 항체를 포함하는 조성물의 첫부분을 상기 시료와 표지된 면역된의 혼합물과 접촉시키고 첫부분을 배양, 시척하는 단계, b) 항체를 포함하는 조성물의 두번째부분을 항원이 없는 대조표준에 같은 양의 표지될 면역된과 접촉시키고 두번째부분을 배양,세척하는 단계, c) 단계, a) 및 b)의 각 조성물에 같은 양의 포도상구균(staphylococci)을 지닌 단백질 A를 가하고 두 조성물을 배양시키며 각 조성물을 원심분리하고 그 안의 고체로부터 액체를 분리시키는 단계, d) 위의 단계 c)로부터 결과된 각 조성물내의 라벨된 면역된의 정도를 결정하는 단계, 그리고 d) 각각의 표지된 면역된의 상대량을 비교하여 만일 첫부분을 포함하는 결과 조성물의 활성이 두번째부분의 결과 조성물에 대한 활성보다 작으면 그때 시료는 HBV 또는 HBsAg를 포함시키도록 하는 단계로 이루어지는 방법에 의하여 시료에서 검출될 수 있다.
합성면역된은 일반적으로 샌드위치형 면역측정과 시료중의 항원이 항체에 대한 라벨면역된과 경쟁하는 면역측정과 같은 경쟁형 면역측정에 모두 사용될 수 있다
본 발명의 합성면역된과 그에 대한 항체와 관련하여 사용하기 위한 이들 및 다른 알맞는 면역측정체계가 본 양도인 한명에게 양도된, '진단용 시약으로서 표지된 펩티드'라는 제목으로 1982년 9월 29일 출원된 계류중인 출원일련번호 426,309호에 명시되어 있는데, 이 명세서를 참고로 여기에 병합하였다.
본 발명은 또한 a) HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드 영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드, 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는아미노산 사슬이 없는 펩티드에 대한 고체 지지체에 부착된 항체, b) 펩티드 또는 B형 간염 바이러스에 대한 표지된 항체로 이루어지는 혈청중의 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 진단용 시험킷트에 관한 것이다.
킷트는 면역착물의 형성효과가 상기 표지된 항체에 의해 나타나는 면역측정을 실행하기 위한 한 세드의 지침서로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 a) HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드영역내의 적어도 6개의 연속 아미노산 사슬을 포함하는 주어진 양의 펩티드, 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피 단백질에 해당하는 아미노산사슬이 없는 펩티드. 펩티드는 고체 지지체, 예를 들면 수용성 고체 지지체에 부착되어 있다. b) 예로써, 방사 표지되거나 또는 효소 표지된, 인 IgG 및/또는 IgM에 표지된 항체로 이루어지는 시험시료중의 B형간염 바이러스의 프리-S 유전자 코우드 항원에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 진단용 킷트에 관한 것이다.
킷트는 면역측정 실행에 대한 지침서 셋트로 이루어질 수 있으며, 여기에서 면역착물의 형성 정도는 상기표지된 항체에 의해 나타나게 된다.
특별한 점으로는, 본 발명은 HBV 감염된 사람 및 특정동물, 예를 들면, 침판지의 혈청에서 프리-S 유전자 코우드된 항원의 검출을 위한 다음 단계들로 이루어지는 방법에 관한 것이다 : (a) HBV DNA의 프리-S 유전자내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 갖는 펩티드, 자연적으로 발생하는 HBV의 외피 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 펩티드에 내한 항체로 고체기질을 피복하는 단계, (b) 피복된 기질을 세척하는 단계, (c) 세척된 피복기질, 예를 들면, 폴리스티렌비이드를 단백질-포함용액과 접촉시키는 단계, (d) 단계(c)로부터의 기질을 세척하는 단계, (e) 단계(d)로부터의 기질을 특정 HBV 또는 HBsAg를 포함하는 것으로 추정되는 시료와 배양시키는 단비, (f) 단계(e)로부터의 기질을 세척하는 단계, (g) 펩티드 또는 HBsAg에 대한 항체이면서 방사표지되거나 또는 효소표지된 항체를 가하는단계, (h) 단계(g)로부터 기질을 배양시키는 단계, (i) 단계(h)로부터의 기질을 세척하는 단계, 그리고 ⒥단계()의 기질을 감마계수기에서 계수하거나 또는 그의 효소활성을 측정하는 단계.
방법은 RIA 검출기법보다는 ELISA 기법을 사용하여서 행할 수 있다.
특별한 구체예로는 본 발명은 또한 B형 간염 바이러스 DNA의 프리-S 영역으로 코우드된 단백질에 대한 항체의 검출을 위한 다음 단계로 이루어지는 방법에 관한 것이다 : (a) 그위에 결합부위를 포함하는 고체기질, 예를 들면, 폴리스티렌 비이드 상에 HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스 외피 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 펩티드를 흡착시키는 단계, (b) 단계(a)로부터의 기질을 그위의 결합부위를 포화시키기 위한 물질로 접촉시키는 단계, (c) 단계(b)로부터의 기질을 세척하는 단계, (d) 단계(c)로부터 기질을 인 혈청으로 이루어지는 검체와 접촉시키는 단계, (e) 단계(d)의 결과된 덩어리를 배양시키는 단계, (f) 단계(e)의 결과된 덩어리를 세척하는 단계, (g) 인 IgG 또는 IgM에 대한 방사묘지된 항체를 단계(f)의 결과된 덩어리에 가하여 두번째 덩어리를 형성시키는 단계, (h) 단계(g)의 두번째 결과된 덩어리를 감마계수기에서 계수를 받게하는 단계, (i) 대조표준으로서 이용된 정상인 혈청을 단계(a) 내지(h)를 거치게 하는 단계, 그리고 (j) 단계(h)와 (i)의 계수를 비교하는 단계.
항체의 검출에 대한 위의 방법에서, ELISA 기법은 RIA 기법으로 대치할 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 B형 간염 펩티드 면역된을 일정간격으로 사용하는 B형 간염 바이러스 외피의 프리-S 유전자 코우드영역으로 코우드된 항원에 대한 항체의 존재를 검출하기 위하여 인 혈청으로 면역측정을 수행하고 데이타를 평가하는 것으로 이루어지는 B형 간염 감염결과를 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 더나아가서 B형 간염에 대한 왁찐으로 접종받은 사람이 B염 간염 바이러스로 면역되었는지를 결정하는 방법에 단계된다.
이러한 방법은 상기한 B형 간염 펩티드 면역된을 사용하는 B형 간염 바이러스 외피의 프리-S 유전자코우드영역으로 코우드된 항원에 대한 혈청중의 항체가 있는지 결정하기 위하여 이러한 사람의 혈청을 수회의 면역측정을 실행할 것을 수반한다. 여기서 면역측정은 각기 다른때에 사람으로부터 체취한 혈청으로 수행한다.
본 발명은 더나아가서 상기한 B형 간염 펩티드 면역된을 사용하여 B형 간염 바이러스 외피의 프리-S유전자 코우드영역으로 코우드된 항원에 대한 항체인 혈청내에 존재하는 항체의 양을 결정하기 위하여 사람으로부터 체취한 혈청시료에 대해 정량적인 면역측정을 실행하고 공지의 표준과 값을 비교하는 것으로 이루어지는 B형 간염 바이러스 감염의 존재를 검출하는 방법에 관련된다.
본 발명은 더나아가서 B형 간염 펩티드 면역된에 대한 상기 항체를 사용하여 B형 간염 바이러스 외피의 프리-S 유전자 코우드영역으로 코우드된 항원의 양을 결정하기 위하여 사람으로부터 체취한 혈청시료에 대해 정량적인 면역측정을 실행하고 공지의 표준과 값을 비교하는 것으로 이루어지는 B형 간염 바이러스감염의 존재를 검출하기 위한 방법에 관련된다.
본 발명은 또한 상기 B형 간염 펩티드 면역된을 동물에 투입시키는 것을 수반하는 항체를 기르는 방법에 관련된다.
또한, 본 발명은 a. 알파-아미노 보호기를 포함하는 첫번째 아미노산을 수지에 결합시키는 단계, b. 알파-아미노 보호기의 제거단계, c. 알파-아미노 보호기를 포함하는 두번째 아미노산을 첫번째 아미노산에 결합시키는 단계, d. 원하는 펩티드를 생산하기 위하여 알파-보호된 아미노산을 더 결합시킴으로써 단계(b)와 (c)를 반복하는 단계, 여기서 아미노산중 최소 한가지는 His이고 상기 아미노산의 최소 한가지는Trp이다. e. 수지로부터 펩티드를 분할하여 상기 첫번째 아미노산에서 남아 있는 보호기를 제거하는 단계, f. His(ImDNP)를 His로 치환하는 단계, g. Trp(Informyl)을 Trp로 치환하는 단계, h 보호기의 분할과 제거에 앞서 DNP를 제거하는 단계, 그리고 i. 보호기의 분할과 제거의 동안에 포르밀을 제거하는 단계,를 포함하는 His와 Trp를 포함하는 펩티드의 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 더나아가서 지금까지 기재한 바와 같이 유효 투여량의 왁찐을 이러한 환자, 예를 들면 사람에게 투여하는 것으로 이루어지는 B형 간염으로 감염되는 것으로부터 환자를 보호하는 질병예방법에 관한 것이다.
출원인은 또한 표적 간세포상의 수용체에 의해 인식된 영역의 위치에 대한 HBV env 단백질의 계통적 주사법을 개발하였다. 이러한 계통적 주사법은 일반적으로 바이러스상에서 전염성의 중화에 수반된 세포수용체 인식부위와 에피토우프의 확인에 기여할 수 있고 특히 HBV에 대한 수용체의 상세한 특성화에 기여할수 있다. 방법은 궁극적으로 바이러스 단백질에서 구조-기능관계의 연구를 의한 다든 방법을 보충하는 강력한 도구가 될수있다.
따라서, 본 발명은 또한 어느 펩티드가 바이러스 중화항체를 이끌어낼 것인지를 결정하는 방법에 관련되는데, 그 방법은 (a) 바이러스의 외피 유전자 생성물에 해당하는 복수의 마른 펩티드를 합성하는 단계, (b) 단계(a)에서의 펩티드에 대한 항체를 기르는 단계, 그리고 (c) 펩티드가 바이러스 수용체에 결합하는지와 펩티드와 항 펩티드 항체가 바이러스와 세포표면의 반응을 억제하는지를 확인하는 단계로 이루어진다.
이제 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
몇몇 HBV 아형(제 2 도참조)에 해당하는 env 유전자의 프리-S 부분의 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 S-단백질의 서열과는 다른 다음의 특성들을 갖는다 ; (i) 높은 친수성과 높은 백분율의 충전된 잔기(E. Schaeffer, J.J. Sninsky,Pro. Natl. Acad. Sci. USA,81, 2902 (1984)). (ⅱ) 시스테인 잔기의 부재 (ⅲi) HBV DNA 유전자 생성물중에서 최고의 아형-의존 변화성 그리고 (iv) 비인(非人) 헤파드나바이러스(hepadnaviruses)에 해당하는 유사 서열과의 적은 동족관계(F.Galibert, T.N. Chan, E. Mandart, J. Virol., 41, 51, (1982)).
이들특성은 HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드부분이 비리온의 표면에 노출되어 있으며 숙주의 면역반응에 대한 표적이 되고 HBV의 숙주범위(사람과 몇 영장류로 제한됨)의 원인이 된다는 것이다. 소정의 특이성을 갖는 합성 펩티드와 그들에 대한 항체는 HBV 외피의 프리-S]단백질부분의 생물학적 역할을 탐구하는 기회를 제공한다.
HBsAg내의 디실파이드 결합의 분열은 다음결과를 가져온다 : (a) 본래의 HBsAg에서 유도된 폴리클로날항체(G.N. Vyas, K.R. Rao, A.B. Ibrahim,Science, 178,1300, (1972) ; N.Sukeno, R.Shirachi, J. Yamaguchi, N. Ishida,J. Virol., 9, 182, (1972) ; G.R. Dreesnnn, F. B. Hollinger, R.M. McCombs, J.L. Melnick,J.Gen.Virol. 19, 129 (1973) ; 및 A.R. Neurath, N.Strick,J. Med. Virol., 6,309, (1980))와 몇 모노클로날항체 (J.Pillot, M.M.Riottot, C. Geneste, L.Phalente, R.Mangalo,Develop. Biol. Stand., in Press(984)의 결합의 실질적인 감소, 그리고 (b) 면역된성의 몇 에피로우프는 디설파이드 경합의 감소를 당하지 않는다(M.Imai, A.Gotoh K.Nishioka, S.Kurashina, Y.mlyakawa, M.Mayuml,J.Immunol., 112, 416, (1974)). 이들 에피토우프는 HBV의 모든 항원성 아형에 공통이나 HBV의 외피성분상의 그들의 위치는 결정되지 않았다. 본 발명은 보다 적은 HBsAg 단백질 P33과 P36의 N-말단부(HBV DNA의 프리-S 유전자로 코우드됨)상에와 프리-S 유전자로 코우드된 단백질의 다른 부분상에 디설파이드 결합 무관한 항원성 결정인자의 위치 측정의 이점이 있다.
이들 결정인자는 인 항-HBs와 반응하는 환원되고 분해된 HBsAg상에 지배적인 에피토우프를 나타낸다. 그들은 S-유전자에 해당하는 합성 펩티드 유사물보다 400배 더 효율적으로 HBsAg에 대한 항체를 유도하는 프리-S 120-145에 의하여 높은 신빙성으로모사된다(A.R. Neurath, S.BH. Kent, 와 Strick,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7871 (1982)). HBV 단백질의 합성펩티드 유사물에 대한 이러한 고수준의 바이러스 확인 항체에 대하여 선례가 없다. 이들 항체는 HBV 담체의 혈청중의 프리-S 유전자 코우드의 항원성 결정인자의 직접적인 검출을 허용하는 진단용 시험에 사용될 수 있다.
프리-S 유전자는 헤파드나 바이러스 제놈의 모든 영역 가운데 가장 다양하다(F.Galibert, T.N.Chen, E.Mandart,J.Virol.,41, 51 (1982))(HBV는 헤파드나 바이러스과의 일원이다).
본 발명 B형 간염 왁찐은 합성펩티드(화학적 방법에 의해서 또는 표현 벡터(DNA 경로)에 의해서 각개 아미노산을 조립함으로써 생성된 펩티드)나 아니면 천연자원으로부터 유도된 펩티드인 펩티드를 포함하며 이러한 펩티드는 B형 간염 바이러스의 표현항원의 프리-S 유전자 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 갖는다. 이러한 사슬은 예를 들면 최소 10,15,20 또는 26개의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에 따르는 바람직한 펩티드는 서열위치 프리-S 120과 프리-S 174사이에 배치된 아미노산 사슬이며, 더 바람직하게는 이러한 사슬은 서열위치 프리-S 120에 N-말단 메티오닌을 포함한다. 바람직한 펩티드는 서열위치 프리-S 120과 프리-S 145사이의 사슬, 즉, 프리-S(120-145)에 해당하는 아미노산 사슬이다.
사슬의 바람직한 위치는 다음을 포함한다 : (1) 아형 adw2와 adr에 대한 서열위치 프리-S 1과 프리-S11을 포함하고 완전히 둘사이의 아미노산 사슬, (2) 서열위치 프리-S 10과 프리-S 40을 포함하고 그를사이, (3) 서열위치 프리-S 15와 프리-S 120을 포함하고 그사이 (4) 서필위치 프리-S 15와 프리-S 55를 포함하고 그사이, 그러고 (5) 서열위치 프리-S 90과 프리-S 120을 포함하고 그사이. 본 발명에 따르는 특히 바람직한 사슬은 26개의 아미노산을 갖고 서열위치 프리-S 120에 N-말단 메티오닌을 포함하며 서열위치 프리-S 120과 프리-S 174사이에 배치된다.
본 발명에 따르는 바람직한 펩티드는 다음을 포함한다. (1) 프리-S(12-32), 여기서 서열은 (제 2 도참조) 아형 adw2에 대하여 MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDP 이다. (2) 프리-S(120-145), 여기서 서열은(제 2 도참조) 아형 adw2에 대하여 MQWNSTAFHQTLQDPRVRGLYLPAGG 이다. (3) 프리-S(32-53), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 PAFGANSNNPDWDFNPVKDDWP 이다. (4) 프리-S(117-134), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 PQAMQWNSTAFHQTLQDP 이다. (5) 프리-S(94-117), 여기서 서열은 (제 2 도참조) 아형 adw2에 대하여 PASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHP 이다. (6) 프리-S(153-171), 여기서 서열은 (제 2도참조)아형 adw2에 대하여 PAPNIASHISSISARTGDP이다. (7) 프리-S(1-21), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNP 이다 (8) 프리-S(57-73), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 QVGVGAFGPRLTPPHGG 이다. (9) 프리-S(1-11), a. adw2에 대하여, 여기서 서열은 (제 2 도참조) MGGWSSKPRKG이며, b. adr에 대하여, 여기서 서열은 (제 2 도참조) MGGWSSKPRQG 이다. (10) 드리-S(21-47), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 PLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFND 이다. (11)프리-S(12-47), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP 이다. (12) 프리-S(120-l53), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 MQWNSTAFHQTLQDPRVRGLYLPAGGSSSGTVNP 이다. (13) 프리-S(132-137), 여기서 서열은(제 2 도참조)아형 adw2에 대하여 QDPRVR 이다. (14) 프리-S(53-73), 여기서 서열은 (제 2 도참조)아형adw2에 대하여 PAANQVGVGAFGPRLTPDHGG 이다. (15) 프리-S(l28-139), 여기서 서열은 (제 2도참조)아형 adw2에 대해 HQTLQDPRVRGL 이다.
다른 아미노산에 의하거나 또는 동배체(isosteres ; 단백질 아미노산에 대해 밀접한 구조적, 공간적 유사성을 지닌 수정된 아미노산)에 의한 치환과 같은 아미노산 치환, 아미노산 삭제, 아미노산 첨가 또는 동배체 첨가를 수반하는 본 발명 프리-S 유전자 코우드 서열의 어떠한 유사물도 서열이 HBV 또는 B형 간염표면항원의 프리-S 단백질을 인식하는 항체를 유도하는 한 이용될 수 있다. 천연자원으로부터 유도된 펩티드의 형성에 있어서 요구되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 단백질을 화학시약으로 분할하거나 또는 효소를 사용함으로서와 같은 선택적인 단백질 분해를 받게한다. 펩티드의 합성에 의한 형성은 요구되는 사슬의 아미노산을 화학적으로 합성하는 것이 요구된다
본 발명에 따라 합성 왁찐을 형성하는데에 있어서, B형 간염 바이러스의 프리-S 유전가 코우드영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬(펩티드 잔기)이 B형 간염 바이러스에 대한 항체에 의하여 인식되는 공간구조를 가짐을 확실히 하는것이 바람직하다. 이끝에, 주어진 사슬의 아미노산은 하나또는 그 이상의 추가 아미노산을 어느 한쪽에, 또는 그의 양쪽에, 아미노산 사슬의 부분으로서 거기에 결합될 수 있다. 이들 추가 아미노산은 B형 간염 바이러스에 대한 항체에 의해 쉽게 인식되도록 아미노산 사슬의 안정성을 높이기 위하여 보조 아미노산으로서 제공할 수 있다. 추가 아미노산은 그들이 천연 단백질에서 발생하는 것과 같은 서열로 같은 아미노산 일 수 있으며, 또는 다른 아미노산을 사용할 수 있다.
발명의 한 형태로, 최소한 6개의 아미노산 사슬길이를 갖는 펩티드가 추가 아미노산과 그의 어느한편에 예를 들면, 잔기의 한쪽에 세 아미노산과 같이 결합되어 더 긴 사슬의 아미노산을 형성할 수 있다. 아미노산 사슬은 B형 간염 바이러스의 표면항원의 프리-S 영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
개개 아미노산 서열의 길이는 서열을 생성하는 방법에 의존할 것이다. 만일 서열이 화학적 방법에 의하여 각개 아미노산을 모음으로써 만들어진다면 그때 아미노산 길이는 일반적으로 50개의 아미노산을 초과하지않으며 바람직하게는 40개의 아미노산을 초과하지 않는다. 합성펩티드를 DNA 경로로부터 얻는다면 사슬길이는 예를 들어서 100 또는 그 이상의 아미노산으로 더 길이질 수 있다. 그러나, 보통은 더 짧으며 가장 알맞기는 천연 프리-S 단백질보다 상당히 더 짧다. 따라서, 펩티드가 S 영역과 프리-S 영역의 단위를 갖는구체예에서는 S 영역에 해당하는 펩티드부분은 천연 S 단백질보다 더 짧다. 예를 들어서, 100 아미노산 정도, 바람직하게는 40 아미노산 정도, 그리고 보통은 30 아미노산 이하이다. 이러한 경우에 프리-S 영역에 해당하는 펩티드부분은 전 프리-S 영역에 해당하는 길이일 수 있으나 일반적으로 전 프리-S 영역보다 더작다.
펩티드가 S 영역의 아미노산 서열에 해당하는 성분을 포함하지 않을때 전 프리-S 영역에 해당하는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며 또는 전 프리-S 영역보다 더 짧은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
그러나 아미노산 서열이 긴 사슬의 일부일때, 한 서열 이상의 아미노산이 있을 때와 같은경우, 사슬은 여러가지부분의 잔기, 예를 들면 폴리아미노산 또는 다당류의 단편들을 포함할 수 있다.
B형 간염 바이러스의 프리-S 영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 하나이상의 다른 서열 또는 같은 서연의 아미노산을 포함하는, 예를 들면 B형 간염 바이러스의 프리-S 영역내에 다른 에피트우프(항원성 결정인자)에 해당하는 한 서열이상의 아미노산을 포함하는 외에, 본 발명 왁찐은 B형 간염 바이러스와 하나 이상의 추가질병, 예를 들면, 홍역, 인플루엔자, 천연두, 소아마비, 디프테리아, 소수의 질병에 대한 왁찐을 형성하기 위하여 다른 항원 또는 알레르겐의 에피트우프를 포암하는 아미노산 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 추가 아미노산 서열은 아미노산 사슬 길이를 다양하게 할 수 있다.
본 발명에 따르는 B형 간염 왁찐은 B형 간염 바이러스의 표면항원의 프리-S 영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 하나 이상의 아미노산 서열이의에 B형 간염 바이러스의 표면항원의 S 영역내의 연속 아미노산에 해당하는 하나 이상의 아미노산 서열, 예를 들면
Figure kpo00005
를 포함할 수 있다. HBsAg(S 영역)의 항원성 결정인자에 해당하며 따라서 같은 사슬에 HBsAg의 프리-S 영역의 적어도 6개의 아미노산에 해당하는 하나이상의 아미노산 서열과 결합가능한 다른 펩티드들은 다음과 같은 것들을 포함한다.
Figure kpo00006
Figure kpo00007
Figure kpo00008
아미노산 서열은 가교결합에 의하거나 또는 분기사슬의 형태로 직접 결합되는 것과 같이 서로 상호 연결되어 있거나 또는 각 서열은 중심"담체"에 결합될 수 있다.
본 발명으로 자연적으로 발생하는 B형 간염 바이러스의 외피단백질의 부재로 특징 지어지는 합성왁찐,즉, 본 발명 왁찐은 B형 간염 바이러스 외피단백질의 제한된 부분에 해당하는 하나 이상의 펩티드 서열로 구성되도록 하는 것이 실현되었다.
본 발명 왁찍은 또한 비티온에서 발전되는 다른 단백질을 갗고 잇지 않다. 왁찐은 생물학적으로 생성된성분이 없고 활성 또는 비활성의 바이러스 성분이 없으며 항체가 없고 데옥시리보헥산(DNA)이 없으며, 그러므로 다른 왁찐에서 통상 발견되는 바람직하지 못한 부작용(예를 들면, 우연한 바이러스 감염, 알레르기반응, 발연등)이 실질적으로 없게 되도록 합성될 수 있다
본 발명 왁찍은 다른 단백질과의 혼합물일 수 있으며 이들 단백질은 공지의 항원 또는 알레르겐 단백질을 포함할 수 있음을 이해하여아 한다. 따라서 왁찐이 B형 간염바이러스의 자연발생 외피단백질에 해당하는아미노산 서열의 부재로 특징지어진다고 언급할때 이것은 이러한 단백질의 부재에도 불구하고 조성물은 왁찍으로서 작용하는데, 즉, 항체의 형성에 의한 예방면역성을 제공한다.
본 발명 펩티드는 "중화항체(neutralizing antjbodies)" 즉, B형 간염 바이러스로부터 환자를 보호하게되는 항체를 형성할 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 B형 간염에 걸리는 것으로부터 예방하는 방법을 제시한다.
본 발명 펩티드와 왁찍은 면역반응을 향상시키는데 사용할 수 있고 특정한 공지의 B형 간염 바이러스 왁찐(예로써, 프리-S 영역의 아미노산 서열에 해당하는 펩티드를 포함하지 않는 것)에 대한 비반응성을 정복하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명 펩티드는 HBsAg의 S유전자 코우드 영역내의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드와 관련하여 이용할 수 있다.
또한, 본 발명으로 구체화된 것은 프리-S와 S-영역 모두, 예를 들어서 프리-S 160 내지 S20에 걸치는 연속아미노산에 해당하는 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 담체는 본 발명 합성펩티드에 대하여 제공할수 있다. 그러나, 담체는 본 발명을 실행하는데 요구되지 않을 수도 있는 즉, 담체는 본 발명에 따라 항체를 생성하는데에 요구되지 않을 수 있다는 것을 이해 하여야 한다.
"담체"는 단순히 합성펩티드가 부착된, 면역반응을 높일 것이 기대되는 생리적으로 허용되는 덩어리이다.
담체는 단순히 아미노산 사슬 또는 다른 기로 이루어질 수 있으며 그 말단에 담체로서 이량체 올리고머 또는 발명 합성펩티드를 정의하는 아미노산 서열의 고분자량 중합체를 사용힐 것을 특별히 계획할 수도 있다.
다른말로, 합성펩티드를 형성하기 위하여 원하는 서열의 아미노산을 결정했을때 이들 아미노산은 천연적으로 구입 가능한 물질이나 합성에 의하여 형성될 수 있고 둘 또는 그 이상의 반복단위 사슬을 쌓도록 중합화하여 반복 서열이 "담체"와 합성펩티드 모두로서 제공되도록 할 수 있다
달리말해서, 독립된 담체가 요구되지 않을 수 있다. 또다른 방도로는 추가 아미노산을 합성펩티드를 정의하는 아미노산 사슬의 한쪽 또는 양끝에 첨가할 수 있다. 다른 담체로는 어떤 물질, 동물, 식물, 또는 광물등 생리적으로 허용되고, 합성펩티드를 제공하도록 작용하여 숙주의 면역체계로 인식되고 만족할만한 면역반응을 자극하도록 하는 것들로 이루어지는 것이 바람직하다.
따라서, 크게 다양한 담체들을 생각할 수 있으며 이들은 비활성인 물질, 생물학적 활성을 갖고, 또는 면역반응을 향상시키는 물질을 포함한다.
예를 들면, 단백질을 담체로서 사용할 수 있다. 단백질 담체의 예들은 파상풍록소이드, 키이홀 림펫 헤모시아닌둥을 포함한다. 다당류를 또한 담체로서 생각할 수 있는데, 이들은 특히, 스타아치, 덱스트란, 아가로우즈(agarose), 피콜(ficoll) 또는 그의 카르복시메틸 유도체와 카르복시 메틸 셀룰로오스를 포함하는 분자량 특히 10,000 내지 1,000,000의 것을 포함한다. 폴리아미노산을 또한 담체로서의 용도에 생각할 수 있으며 이를 폴리 아미노산은 다른것들중에 폴리리신, 폴리알라닐 폴리리신, 폴리글루타민산, 폴리아스파르트산 및 폴리(C2-C10) 아미노산을 포함한다.
유기중합체를 담체로서 사용할 수 있으며 이들 중합체는 예를 들면, 아민, 아미드, 올레핀, 비닐, 에스테르, 아세탈, 폴리아미드, 탄산염 및 에테르등의 중합체와 공중합체등을 포함한다.
일반적으로 말하면, 이들 중합체의 분자량은 극단적으로 변화할 것이다. 중합체는 2반복단위에서부터 몇천까지의 예를 들어서 2000반복단위까지를 갖는다. 물론, 반복단위의 수는 숙주동물의 왁찐의 사용과 일치할 것이다. 일반적으로 말해서, 이러한 중합체는 10,000과 100,000 사이의 더 낮은 분자량을 가질 것이다(분자량은 초원심분리로 결정된다). 무기 중합체도 또한 사용될 수 있다. 이들 무기 중합체는 유기 기를 포함하는 무기중합체일 수 있다.
특히, 규산염과 수산화알루미늄이 담체로서 사용될 수 있다. 담체는 면역성 보조액인 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 보조액은 특히 뮤라밀(muramyl)디펩티드 또는 그의 유사물인 것을 생각할 수 있다. 담체는 복수의 합성펩티드를 포함 사슬을 상호 연결시키기 위하여 사용된 가교결합제의 잔기일 수 있다. 가교결합제는 그들의 작용기로서 알데히드(글루타르 알데히드와 같은), 카르복실, 아민, 아미드, 이미도 또는 아지도 페닐기를 갖는다.
특히, 가교결합제로서 부티트알데히드, 이가이미드 에스테르 또는 카보디이미드의 사용을 생각할 수 있다. 특히 생각되는 이가이미도 에스테르는 다음 일반식의 화합물이다.
Figure kpo00009
여기서 m은 1내지 13이며 R은 1 내지 4탄소원자의 알킬기이다. 가교결합제로서의 용도로 특히. 고려되는 카보디이미드는 시클로헥실카르복시이미드, 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드, N-에틸모르폴리노시클로헥실 카보디이미드 및 디이소프로필 카보디이미드를 포함한다.
펩티드의 화학적 합성은 다음의 간행물에 기재되어 있다. S.B.H.Kent, Biomedical Polymers, eds. Goldberg, E.P.and Nakajima, A.(Academlc press, New York), 213-242, (1980) ; A.R. mltchell, S.B H. Kent, M. Engelhard, and R.B Merrifield, J.Org. Chem ,43, 2845-2852 (1978) ; J.P. Tam, T,-W.Wong, M. Riemen, F.-S. Tjoeng, and R.B. Merrifield, Tet.Letters, 4033-4036, (1979 ; S. Mojsov, A.R. Metchell, and R.B. mlrrifield, J.Org. Chem., 45, 555-561, (1980) ; J.P. Tam, R D. DiMarchi and R.B. Merrifield, Tet. Letters, 2851-2854, (1981) ; and S.B.H. Kent, M. Riemen, M. Le Doux and R.B. Merrifield, Proceedings of the IV International Symposium on Methods of Protein Sequence Analysis, (Brookhaven Press, Brookhaven, N.Y. ), in press, 1981.
화학적 합성 : 어른바 "네리필드(Merrifiel)고체 상방법"에서, 적당한 서열의 L-아미노산이 카르복시 말단아미노산으로부터 아미노말단 아미노산까지 설립된다. 화학적인 결합에 의하여 폴리스티렌(또는 다른 적당한)수지에 부착된 적당한 카르복시말단 아미노산에서 출발하여 클로로메틸기, 벤즈히드릴아민기, 또는 수지의 다른 반응기에 이르기까지 다음 방법을 사용하여 아미노산이 하나씩 첨가된다.
펩티드-수지는 (a) 염화메틸렌으로 세척하며, (b) 실온에서 10분간 염화메틸렌중의 5%(v/v) 디이소프로필 에틸아민(또는 다른 방해염기)과 혼합함으로써 중화시키고, (c) 염화메필렌으로 세척하며, (d) 성장하는 펩티드 사슬의 몰양의 6배의 해당하는 아미노산의 양을 0℃에서 10분간 1/2에 해당하는 만큼의 몰수의 카보디이미드(예를 들면, 디시클로헥실카브디이미드, 또는 디이소프로필카보디이미드)와 결합함으로써 활성화시켜 아미노산의 대칭성 무수물을 형성시킨다. 사용된 아미노산은 벤질에스테르(예를 들면, 아스파스트산 또는 글루타민산), 벤질에스테르(예를 들면, 세린, 트레오닌, 시스테인 또는 티로신), 벤질옥시카르브닐기(예를 들면, 리신)또는 펩티드 합성에 통상에 사용되는 다른 보호기들로 보호된 측쇄를 갖는 N-알파-t.부틸 옥시 카르보닐유도체로서 본래 제공되어야 한다
(e) 활성화된 아미노산은 실온에서 2시간동안 펩티드-수지와 반응하는데 성장하는 펩티드 사슬의 끝에 새로운 아미노산이 첨가된다.
(f) 펩티드-수지는 염화에틸렌으로 세척한다.
(g) 실온에서 10 내지 30분간 염화메딜렌중의 30 내지 65%, 바람직하게는 50%(v/v) 트리플루오로아세트산과 반응시킴으로써 가장 나중에 첨가된 아미노산으로부터 N-알파-(t, 부틸옥시카르보닐)기를 제거시킨다.
(h)펩티드-수지를 염화메틸렌으로 세척한다.
(i)단계(a) 내지 (h)를 요구되는 펩티드 서열이 구성될때까지 되풀이 한다. 다음에 10%(v/v)아니 솔 또는 다른 적당한(방향족) 스캐빈저를 포함하는 무수 히드로플루오르산과의 반응에 의하여 펩티드를 수지로부터 제거함과 동시에 측쇄보호기를 제거시킨다.
이어서, 펩티드는 겔투과, 이온교환 고압액체크로마트그래피, 또는 다른 알맞는 방법에 의하여 정제할 수 있다. 어떤 경우에는, 화학적인 합성은 고체상 수지없이 수행될 수 있는데, 이 경우에 합성반응은 전적으로 용액에서 수행된다. 반응은 비슷하며 기술상 공지이고 최종 생성물은 본질상 동일하다. 천연자원으로부터의 분리 : 만일 충분한 양의 전 단백질 항원을 구입할 수 있다면 원하는 서열의 아미노산을 지니는 분자의 제한된 부분을 다음 방법중 어느것으로도 삭제할 수 있다
(a) 단백질 분해효소, 특히 그의 기질 특이성이 원하는 서열의 아미노산에 직접 인접한 부위에서 단백질의 분할을 가져오는 효소들에 의한 단백질의 숙성.
(b) 화학적인 방법에 의한 단백질의 분할 아미노산간의 특별한 결합을 특정시약과의 반응에 의해 분할할 수 있다.
예를 들면, 메티오닌을 수반하는 결합은 브롬화 시아노겐으로 분할되며 아스파라지닐-글리신 결합은 히드록실아민으로 분할된다.
(c) 단백질분해와 화학적인 분할의 조합 천연자원으로부터나 또는 합성방법에 의해 제조함으로써 또는 둘을 조합하는 방법에 의하여 원하는 서열의 아미노산을 코우드하여 박테리아 또는 다른 세포들에 의한 펩티드의 생산을 가져오는 작은 부분의 DNA를 클로우닝 하는 것이 가능해야 한다. 비슷하게, 복수의 아미노산서열을 포함하는 사슬을 다음 방법에 의해 형성할 수 있다 : 펩티드 또는 펩티드들의 수용액을 수용성 카보디이미드(예를 들면, 에틸디메틸-아미노 프로필카보디이미드)와 혼합한다. 이것은 펩티드의 중합을 가져오는데 상기한 측쇄차단기의 사용에 따라 펩티드의 직쇄형 또는 분기형 중합체가 만들어질 수 있다.
만일 원한다면 본 발명 합성 펩티드는 거기에 다음 부분의 사슬을 결합시킬 수 있다 : 안정학사슬로서 제공할 수 있거나 또는 개개 사슬의 아미노산 사이에 다리로서 제공할 수 있는 폴리펩티드, 폴리아미노산, 다당류, 폴리아미드 또는 폴리아크릴아미드.
이러한 사슬들은 시중 구입 가능하며, 폴리아미노산의 경우에는, 원하는 아미노산 서열의 용액을 아미노산의 N-카르복실무수물 용액과 혼합하고 펩티드의 아민기에 의해 개시되는 염기-촉매 중합반응이 일어나게 두는 것으로 이루어지는 방법에 의해 형성된다. 담체가 요구되지 않을지라도 만일 담체가 사용된다면 사슬 또는 사슬들의 "담"상의 침착은 다음과 같이 실행될 수 있다 :
1. 단백질 담체 단백질과 합성펩티드를 물 또는 다른 적합한 용매에 함께 용해시키고 카보디이미드의 작용을 통해 형성된 아미도 결합에 의하여 공유결합시킨다. 결과 생성물은 단백질 단량체당 하나 이상의 펩티드 모사체를 포함할 수 있다. 또다른 방도로는, 환원된 펩티드를 술포히드릴기를 포함하는 담체에 가하여디설파이드 결합을 형성할 수 있다.
또다른 방법은 말레이미딜기를 포함하는 단백질 담체에 환원된 펩티드를 첨가하여 마이콜(mlchael)첨가 또는 어떤 다른 공유 부착방법에 의하여 공유결합을 형성시키는 것을 수반한다.
2. 다당류 담체 : 올리고 당류 담체는 1,000 내지 1,000,000 범위의 분자량을 가져야 한다.
이들을 합성 펩티드에 공유결합시키기 위하여는 적합한 작용기를 먼저 그들에 부착하여야 한다. 카르복실기는 요오드 아세트산과 반응시킴으로써 도입되어 카르복시메틸화원 다당류를 생산하거나 카르보닐디이미다졸과 반응시킴으로써 도입되어 활성화된 카르보닐 에스테르를 생산한다. 카르복시메틸 다당류는 카보디이미드반응에 의해 펩티드에 짝 지어지는 반면에 활성화된 카르브닐 에스테르는 펩티드와 동시적으로 반응한다.다중 모사뇐 합성펩티드는 각 올리고 당류 단위에 부착되어 한다.
3. 폴리아미노산담체 : 이들 담체는 1,000 내지 1,000,000 범위의 분자량을 가져야 한다,
폴리리신과 폴리오르니틴은 그들의 측쇄에 1차 아미노기를 갖는다. 폴리아스파르트산과 폴리글루 타민산을 카르복시가를 갖는다. 펩티드는 카보디이미드반응을 사용하여 이미드 결합에 의하여 이들에 짝지어질 수있다. 짝지음을 위한 아미노기를 제공하는 또다른 맘체는 러신잔기의 측쇄에 폴리알라닌이 부착될 수 있는 폴리리신이다. 합성펩티드는 폴리알라닌 사슬의 끝에, 또한 카보디이미드 반응에 의해 부착될 수 있다. 다중 모사된 합성펩티드는 각 올리고 펩티드 단위에 부착되어야 한다.
본 발명의 신규한 담체는 그의 외표면에 활성부위를 갖는 지질 소낭을 포함한다. 이러한 활성부위는-COOH,-CHO,-NH2및-SH를 포함한다. 지질 담체는 예를 들어서 글루타르 알데히드와 같은 이 작용기 알데히드와 같은 적어도 두기능기를 갖는 알데히드와 같은 안정확제에 의하여 가교결합에 의하여 안정화될 수 있다.
지질소낭담체에 대한 펩티드의 결합은 담체의 외부 표면의 지질소낭상의 활성부위에서 일어난다. 실시 가능한 어떠한 이론에 의해서 결합되기를 원하지 않고는, 이러한 결합은 적어도 공유 결합이다. 지질담체의의 표연상의 두활성 부위에 펩티드를 결합시키는 것이 가능하다. 예를 들면, 펩티드 한끝의-NH2기는 기질담체의 외표면상의-COOH 활성부위와 결합할 수 있다. 다음에 펩티드의 다른 끝은 지질담체의 다른활성부위와 결합될 수 있는데, 예를 들면 펩티드의 다른 끝의-COOH 키는 지질소낭상의-NH2활성 부위와 결합 할수 있다.
본 발명의 합성펩티드를 지지하기 위한 바람직한 담체는 지질소낭이다. 지질 소낭은 수성메제내에서 지질을 초음파 처리함으로써 건조한 지질층을 완충액에 재현탁시킴으로써 또는 유기용매에 용해된 지질을 선택한 완충액에 대해 투석함으로써 형성될 수 있다. 후자의 방법이 바람직하다. 지질소낭은 수성매제 부분을 둘러싸는 지질 이중층의 구로 구성되어 있다.
본 발명에 따르는 지질소낭(비-단백질)담체는 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 이러한 담체를 생산하기위한 바람직한 방법은 10 내지 18탄소원자를 갖는 아미노알칸과 디아미노알칸을 포함하는 지질소낭, 예를들면, 스테아릴아민, 세틸아민 및 미리스티스틸아민을 디일데히드, 예를 들면, 부탄디알(숙신알데히드), 펜탄디알(글루타르알데히드), 헥산디알(아디프알데히드), 헵탄디알(피멜릭알데히드) 및 옥탄디알(수베르알데히드)와 같은 폴리알데히드로 처리하는 것이다.
또다른 방도로는, 10 내지 18탄소원자를 갖는 아미노알켄 및 다아미노알켄을 포함하는 리포소옴, 예를 들면, 올레일아민을 전술한 폴리알데히드로 처리할 수 있다. 이와 같이 힝성된 지질소낭담체는 그들의 N-말단 또는 리신기에 의한 펩티드의 직접 결합을 허용하는 그 표면에 활성 알데히드기를 갖는다.
본 발명에 따르는 지질소낭 담체에 연결된 펩티드는 또한 상기한 바의 같이 지질소낭을 포함하는 아미노를 카보디이미드, 예를 들면, N-에틸-N'(디메틸아미노프로필)카보디이미드에 의해 활성화된 펩티드로 처리함으로써 제조될 수 있다. 또 마르게는 카보디이미드 활성화된 펩티드는 폴리알데히드, 예를들면, 디알데히드 처리된 지질소낭에 연결되어 있는데 이것은 수용성 디아미노알킨, 예를 들면, 에틸렌 디아민 및 프로필렌디아민과의 반응에 의해 더 유도되었다. 더 나아가서, 12 내지 18탄소원자를 갖는 지방산(포화 및 룰포화), 예를 들면, 스테아린산, 올레산, 팔미트산 및 미리스트산을 포함하는 지질소낭을 카보디이미드로 활성화시킨다. 그후 활성화된 지질소낭을 펩티드와 반응시킨다.
본 발명에 따라 담체를 형성하는 또다른 접근은 지질소낭의 성분으로서 지방상 알데히드를 사용하고 글루라르 알데히드 처리된 지질소낭에 대해 기술한 바와 같이 이러한 지질소낭을 처리하는 것을 수반한다. 이러한 지질소낭은 펩티드의 아미노기와 직접 반응한다.
본 발명에 따르는 맘체의 바람직한 구체예에서는, 10 내지 18탄소원자를 갖는 아미노 또는 디아미노알칼(또는 아미노 또는 디아미노알켄)을 폴리알데허드로 처리함으로써 형성된 전술한 지질소낭 맘체는 시스테인(L-또는 D-또는 LD-시스테인)과 더 반응한다.
이들 지질소낭은 다음에-SH기를 갖는 펩티드, 예를 들면 시스테인을 포함하는 펩티드와 반응한다. 지질소낭과 펩티드간의 결합은 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 또 다르게는, 지방산 메르캅탄을 지질소낭 예를 들면, 옥타데칸디올의 성분으로서 사용한다. 펩티드를 포함하는 시스테인은 이러한 지질소낭에 직접결합된다.
본 발명에 따라 맘체를 형성하기 위한 또다른 접근은 디말레이미드, 예를들면, 파라 또는 오르트 N-N'-페닐렌디말레이미드와 더 반응시키게 되는 지질소낭을 포함하는 상기한 지방산 메르캅탄의 제조를 수반한다. 이러한 지질소낭은 다음에 시스테인 포함 펩티드와 반응시킨다.
또 다르게는, 적당한 지질소낭과 적당한 텝티드간의 결합은 디메틸아디피미데이트, 디에틸-3,3'_디티오비스-프로피온이미데이트, 2-이미노티올란 ; 디-숙신이미딜 수베레이트 ; 비스[2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)-에틸]술폰 ; 디숙신이미딜 타르타레이트 ; 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트) ; 에틸렌글리콜 비스(숙신이미딜 숙시네이트) ; N-5-아지도-2-니트로벤조일윽시숙신이미드 ; p-아지도페나실브로마이드 ; p-아지도-페닐글리옥살 ; 4-플루오로-3-니트로페닐 아지드 ; N-히드록시 숙신이미딜-4-아지드벤조에이트 ; N-히드록시 숙신이미딜-4-아지드살리실산 ; m-말레이미도벤조일 N-히드록시숙신이미드 에스테르 ; 메틸-4-아지도벤조어미데이트 ; p-니트로페닐 2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트 ; N-숙신이미딜-6(4'-아지도-2'-니트로페닐아이노)헥사노에이트 ; 숙신이미딜 4-(N-말레이미도베틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 ; 숙신이미딜 4-(p-말레이미도 메틸)부티레이트 ; N-(4-아지도페닐티오)프탈이미드 ; 에틸 4-아지도페닐 1,4-디티오부티르이미데이트 ; N-숙신이미딜(4-아지도페닐디티오) 프로피오네이트 ; 1-5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 ; 4,4'-디플로오로 3,3'-디니트로디페닐-술폰 ; 4,4'-디이소티오시아노-2,2'-디술폰산스틸벤 ; p-페닐렌 디이소티오시아네이트 ; 4,4'-디티오비스페닐아지드 ; 에리트리롤비스카보네이트 ; N-숙신이미딜-3-(2-피리필디티올)프로피오네이트 ; 디메틸 피멜리미데이트 및 디메틸 수베로이미데이트와 같은 시중구입 가능한 가고결합 시약에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따르는 지질소낭은 담체로서만이 아니라 보조액으로서도 작용한다.
본 발명의 지질소낭 합성담체는 사람 및 동물의 여러가지 바이러스성, 박테리아성, 알레르겐 및 기생충단백질의 합성펩티드, 유사물(예방항체를 유도하는것), 그밖에 B형 간염 표면항원의 합성펩티드 유사물, 그리고 특히 HBV의 프리-S 유전자 코우드영역의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 B형간염 표면 항원의 신규한 합성펩티드 유사물을 결합시키기 위하여 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 지질소낭 합성담체는 다음의 바이러스들의 합성펩티드 유사물과 결합시키기 위하여 사용될 수 있다 : 인플루엔자 헤마글루티닌(A/memphis/10272 Strain, A/Eng 1878/69 strain, A/NT/60/68/29 C strain, 및 A/Qu/7/70 strain), 가금페스트 바이러스 헤마글루티닌, 우두, 소아마비, 풍진, 시토메갈로 바이러스, 마마, 단순포진 I 및 II형, 황열병, 전염성 엑트로멜리아 바이러스, 우두 바이러스, 전염성소 비강기관염 바이러스, 말비강 폐렴(말 낙태) 바이러스, 소의 악성 카타르(catarrh) 바이러스, 고양이 비강기관염 바이러스, 개 포진 바이러스, 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스(전염성 단핵증 및 버어킷(Burkitt)림프종과 관련딤), 매렉(Marek)병 바이러스, 양폐선종증(Jaagziekte) 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegaloviruses), 아네노 바이러스(adenovirus)군, 인 유두종 바이러스, 고양이 전신백혈구 감소증 바이러스, 밍크 장염 바이러스, 아프리카 말질병 바이러스(9 혈처타입), 푸른 혀 바이러스(12 혈청타입), 송어의 전염성 췌장회사 바이러스, 가금 육종 바이러스(여러가지 스트레인), 조류 백혈증 바이러스(내장, 적 아구 및 골수아구의 ), 골화석증 바이러스, 뉴우캐슬(newcastle) 병 바이러스, 파라인플로엔자 바이러스 1, 파라인플루엔자 바이러스 2, 파라인플루엔자 바이러스 3, 파라인플루엔자 4, 이하선염 바이러스, 터어키 바이러스, CANADA/58, 견온열 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기신시티얼(syncytial) 바이러스, 믹소바이러스(myxovirus), 인 인플루엔자 바이러스와 같은 A형 바이러스, 예를들면, A0/PR8/34, A1/CAM/46, 및 A2/싱가포르/1/57, 가금페스트 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스, 예를들면 B/리(Lee)/40 ; 광견병 바이러스 ; 이스턴말 뇌염 바이러스 ; 베네수엘라말 뇌염 바이러스 ; 웨스턴 말뇌염 바이러스 ; 황열병 바이러스, 뎅그(dengue)형 1바이러스(=형 6) ; 뎅그형 2바이러스(=형 5), 뎅그형 3바이러스 ; 뎅그형 4바이러스 ; 일본뇌염 바이러스, 기야사너르 포리스트(Kyasanur Forest) 바이러스 ; 도약병(Louping ill virus) ; 머례이밸리(murray valley)뇌염 바이러스 ; 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스(형 I 및 II) ; 성루이스 뇌염 바이러스 ; 인비강 바이러스, 발-과-입-질병 바이러스 ; 소아마비 바이러스형1 ; 장 바이러스 소아마비 3 ; 조류전염성 기관지염 바이러스 ; 인 호흡기 바이러스 ; 돼지의 투과성 위장염 바이러스 ; 림프구 맥락수막염, 라싸(Lasa) 바이러스 ; 매추포(machupo) 바이러스 ; 피친드(Pichinde) 바이러스 ; 타카티브(Tacaribe) 바이러스 ; 파필로마 바이러스(papillomavirus) 시미안(Simlan) 바이러스 ; 신드비스(Sindbis) 바이러스, 등 본 발명의 지질소낭 합성담체는 박테리아 예를들면, 나병, 결핵, 매독 및 임질의 합성펩티드 유사물을 결합시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 지질소낭 합성담체는 또한 다음 기생충의 합성펩티드 유사를을 결합시키기 위하여 사용될 수 있다. 말라리아를 가져오는 유기체(P. Falcipamm, P.Ovace, 등), 주혈흡충증, 회선사상충, 및 다른 자기생층, 트리파노소옴(Trypanosomes), 레이시마니 아(Leishnnnia), 샤가스(Chagas) 병, 아메바증, 십이지장층등.
본 발명의 지질소낭담체는 HBsAg의 프리-S 영역의 아미노산 서열에 해당하는 본 발명의 신규한 펩티드를 결합하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 지질소낭담체는 S 영역의 아미노산 사열 뿐만아니라 다른 바이러스등에 대한 다른 아미노산 서열을 결합하는데도 또한 사용될 수 있다.
B형 간염 표면항원에 대한 항원성 결정인자를 포함하는 아미노산 서일(S 영역의 아미노산에 해당함)을 본 발명의 지질소낭담체에 결합시킬 수 있다.
호프(T.P. Hopp, "B형 간염 표면항원 반응성을 갖는 합성펩티드",Mol. Imm., 18, 9, 869-872, 1981는 HBsAg의 S 영역에 해당하는 다음의 서열을 제안한다.
Figure kpo00010
HBsAg(S 영역)의 항원결정인자를 모사하는 다른 펩티드는 다음을 포함한다 :
(1)펩티드 1
Figure kpo00011
펩티드 2는 5개의 추가 아미노산 잔기를 포함한다.
Figure kpo00012
H.R. Six, D.L. Peterson, F.B. Hollinger and J.L. Melnick, "비결합(unconpled)합성 HBsAg 펩티드의 단일접종후의 B형 간염 표면항원에 대한 항체", Nature, 295,1 58-160, 1982 ; 그리고(2) 다음의 펩티드 :
Figure kpo00013
Figure kpo00014
(R. Amon", 합성콘주게이트로의 면역에 의해 달성된 항-인플루엔자 반응", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 569-573, 1982)펩티드는 바이러스의 아미노산 사슬의 서열 세린-91 내지 로이신-108에 해당한다.
폴리오마 바이러스 중간 크기 종 양항원의 항원 결정인자를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 Lys-Arg-Ser-Ars-His-Phe이다. (G. Walter, M.A. Hutchinson, T. Hunter 및 W. Echhart", 이뮤노어피니티 크로마트그라피에 의한 폴리오마 바이러스 중간크기 종양 항원의 정제",Prsc. Natl. Acad. Sci USA,79, 4025-4029, 1982).
소아미비 바이러스 리플라카제(replicase)항원의 항원 결정인자를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 다음과 같다 :
"소아마비 바이러스 리플리카제(replicase) 단백질의 합성펩티드에 대한 항체 : 선천성, 바이러스-코우드된 단백질과의 반응 그리고 바이러스-특이성 중합체 활성의 시험관내에서의 억제",Jour. Virology, 43, 3969-3978, 1982.
시미안 바이러스 40개의 큰 종양 항원의 항원 결정인자를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 다음과 같다
Met-Asp-Lys-Val-Leu-Asn-Arg와 Lys-Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Glu-Pro-Glu-Thr, (G. Walter, K.H. Scheidtmann, A. Carbone, A P. Laudano and R.A. Lerner, N. Green, H.Alexander, F.-T. Liu, J.G. Sutcliffe and T.M. Shinnick, ''데인(Dane)입자의 선천성 외피 단백질과 반응성이 있는 B형 간영 바이러스 제놈 유도함체의 뉴클레오티드 서열로부터 예측된 화학적으로 합성된 펩티드"Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78, 6, 3403-3407,(1981)
리트로 바이러스(retrovhus) R항원의 항원 결정인자를 모사하는 아미노산 사열을 포함하는 펩티드는 다음과 같다.
Leu-Thr-Gln-Gln-Phe-His-Gln-Leu-Lys-Pro-Ile-Glu-Cys-Glu-Pro, T.M. Shinnick, N. Green, F.-T. Liu, H.L. Niman 및 R.A. Lerner, "뉴클레오티드 서열로부터 예측된 폴리펩티드의 화학적 합성은 새로운 리트로 바이러스성 유전자 생성물의 검출을 허용한다",Nature, 287, 1980).
조류육종 바이러스 항원의 항원 결정인자를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 다음과 같다 : Glu-Asp-Asn-Glu-Tyr-Thr-Ala-Arg-Gln-Gly, (T.W. Wong 및 Alan R. Goldberg, "src유전자 생성물의 합성펩티드 단편은 src 단백질 키나제를 억제하며 조류 onc 키나제와 셀 모양인 단백질과 면역학적으로 교차반응한다", Proc. Natl. Acad. USA, 78, 12, 7412-7416, 1981).
발-및 입 질병 바이러스 항원의 항원 결정인자를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 다음과 같다.
Figure kpo00015
Lys Gln Lys Ile Val Pro Val Lys Gln Thr Leu(J.L. Bittle, R.A. Houghten, H. Alexander,T. M. Shinnick, J.G. Sutcliffe, R. A. Lerner, D.J. Rowlands AND F. Brown, "바이러스성 뉴클레오티드 서열로부터 예측된 화학적으로 합성된 펩티드와의 면역에 의한 발-및-입 질병에 대한 예방",Nature,298, 30-33, 1982).
헤모글루티닌×31(H3N2) 인플루엔자 바이러스 항원의 항원 결정기를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 다음과 같다 :
Figure kpo00016
Whitr, C. N. Fagan ALC G. W.Tregear, "인플루엔자 바이러스 헤모글루티닌의 루프(Loop)' 영역으로 이루어지는 합성펩티드의 항원활성",Virology, 120, 273-276, (1982).
A형 H3N2인플루엔자 바이러스 항원의 헤마글루티닌의 항원 결정기를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 멀러, 샤피라 및 두리틀(G.M. Muller, M. Shapira 및 R.F. Doolittle, "시미안 바이러스 40개의 콘 종양 항원의 카르복시-및 아미노-말단영역에 특이성인 항체",Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 9, 5179-5200, 1980)에 의해 합성되었다.
인플루엔자 바이러스 스트레인 3QB 항원의 항원 결정기를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 Ile1Val1Asx2Thr1Ser2Glx2Pro1Gly3Ala1Leu1Lys1이다.
(A. Aitken 및 C. Hannoun "인플로엔자 바이러스 스트레인 3QB로부터의 헤마글루티닌과 뉴라미니다제(neuramlnidase)의 정제와 헤마글루티닌의 항원 영역으로부터 펩티드의 분리",Eur.J.Biochem,107, 51-56, 1980).
디프테리아 항원의 항원 결정인자를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 다음과 같이 주어진다 :
Figure kpo00017
(F. Audibert, M. Jolivet, L. Chedid, R. Arnon 및 M. Sela,"완전히 합성 디프테리아 왁찐으로 히는성공적인면역법 ",Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 79, 5042-5046, 1982).
화농연쇄구균 M항원의 항원 결정기를 모사하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 다음과 같다 :
Figure kpo00018
(E.H. Beachey, J.M. Seryr, D.B. Dale W.A. Skmpson 및 A.H. Kang, "화농연쇄구균 M단백질의 합성펩티드에 의해 일어난 형-특이성 예방면역",Nature,292, 457-459, 1981).
본 발명의 지질소낭 담체는 이와같이 특수항원에 대한 항원 결정인자를 포함하는 어떠한 아미노산 서열과 결합 시키는데로 이용할 수 있다.
본 발명의 지질소낭 담체는 또한 효소와 함께 결합하는데에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 HBV 항원과 HBV 항체의 직접 검출을 위한 진단시험에 관련된다.
HBV-감염된 동물이나 사람 혈청중의 프리-S 유전자로 코우드된 단백질을 포함하는 HBV 항원을 검출하기 위하여, 방사면역측정(RIA) 또는 효소결합된 이뮤노소르번트 측정(ELISA)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 HBV 항원을 검출하는 한가지 시험은 다음과 같다 :
(1) 그위에 결합부위를 갖는 고체기질, 예를들면, 폴리스티렌 비이드를 HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드 영역내의 적어도 6개의 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 갖는 펩티드, HBV의 천연 발생 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 펩티드에 대한 항체로 피복한다.
(2) 다음에 피복된 비이드를 과량의 항체를 제거하기 위하여 예를들어서, 트리스(tris)완층 생리식염수로 세척한다.
(3) 다음에 비이드를 비이드상에 단백질 결합부위를 포화시키기 위해(비 특이성 결합을 방지 또는 감소시키기 위하여) 소혈청 알부민(BSA) 또는 젤라틴과 같은 단백질 함유 용액과 접촉시킨다-이러한 단백질 포함용액의 편리한 농도는 1mg/ml 내지 50mg/ml와 같이 사용할 수 있다.
(4) 다음에 비이드를 과량의 BSA 또는 젤라틴을 제거하기 위해 세척한다.
(5) 다음에 비이드를 HBV 또는 HBsAg를 포함하는 것으로 추측되는 시료와 함께 인큐베이트 시킨다. (정상 혈청을 대조표준으로 이용한다)
(6) 다음에 비이드를 용액, 예를들면, 트리스 완충 생리식염수와 같은 용액으로 세척하고 방사묘지항체, 예를들면, I125표지항체(펩티드나 또는 HBsAg에 대한 항체)와 혼합한다.
(7) 다음에 비이드를 인큐베이트 시킨다.
(8) 다음에 비이드를 세척하고 감마계수기에서 계수한다.
시험 표본이 대조표준의 계수보다 적어도 2.1배 더 높은 계수를 갖는다면 그때 시험표본은 양성이다.
본 발명에 따르는 프리-S 유전자 코우드 펩티드는 주어진 시료의 HBV의 프리-S 영역에 대한 항체를 검출하기 위한 진단도구로서 사용될 수 있다. 프리-S 유전자 코우드 펩티드, 예를들면, 프리-S(120-145), 프리-S(12-32), 프리-S(32-53), 또는 프리-S(117-134), 프리-S(1-21), 프리-S(94-117), 프리-S(153-171), 프리-S(32-53), 프리-S(57-73), 프리-S(21-47), 프리-S(12-47), 프리-S(120-153), 프리-S(132-137), 프리-S(53-73) 및 프리-S(128-139)을 폴리스티렌 비 이드와 같은 그위에 결합부위를 포함하는 고체기질상에 흡착시킨다
기질은 그후 그의 결합부위를 포화시키기 위해 예를듣어서, 젤라틴 BSA 또는 분유와 같은 물질(단백질함유 용액)과 접촉시킨다. 그후, 기질을 완충용액으로 세척하고 그후 완충액을 제거시킨다. 시험표본, 예를들면, 동물혈청으로 희석된 인혈청을 기질에 가한다.
다음에 결과된 덩어리를 인큐베이트시키고 세척한다. 그후, 인 IgG 또는 IgM에 대한 방사 표지된, 예를들어서 요오드화된 I125항체를 덩어리에 가한다, 결과 덩어리를 다음에 세척하고 예를들어 감마계수기에서 계수한다. 만일 계수가 정상 혈청 표준으로 수행한 계수보다 더 높다면 시험표본은 HBV의 프리-S 영역에 대한 항체를 포함한다.
HBV의 프리-S 영역에 대한 항체의 상기 검출방법은 B형 간염 바이러스 감염을 검출하는 진단도구로서 사용될 수 있는 것으로 믿어진다.
프리-S 단백질 부분은 숙주의 간세포에 대한 HBV의 부착에 직접 수반되는 것으로 나타난다. 유사한 단백질이 그 표적이 간인 다른 바이러스의 부착에 수반되는 것이 가능하다. 이런 이유로 프리-S 단백질에 해당하는 합성 펩티드는 그들에 대한 항체 뿐만아니라 B형 간염 바이러스가 하는 것과 같은 간 수용체와 반응하는 다른 간염 바이러스에 대한 왁찐과 진단용 측정(asay)에 대한 기초를 제공할 수 있다.
방사면역측정(RIA)을 수반하는 상기한 방법에 있어서 효소결합된 항체는 방사표지된 항체를 대신할 수 있고 ELISA 기법을 수행할 수 있다. 더 나아가서, 형광기법을 RIA 또는 ELISA의 대신으로 사용할 수 있다.
한가지 반응성분의 라벨링("표지")은 방사성 원자 또는 기의 병합에 의해서, 또는 이성분을 효소, 염료물질, 예를들면, 착색기 또는 형광성기에 이 성분을 결합시킴으로써와 같은 "표지제" 또는 "표지제 물질"의 사용으로 가져올 수 있다.
관련성분은 효소에의 결합에 의한 표지가 바람직한데 이것의 측정이 예를들어서 특수한 장치를 필요로 하는 방사능의 측정보다 훨씬 간단하다.
사용된 효소는 비색법으로, 분광광 도법으로 또는 형광광 도법으로. 측정필 수 있는 것들이 바람직하다.
본 발명의 사용을 위한 효소의 무한한 예들로서 카탈라제(catalase), 퍼옥시마제(peroxidase), 글루코스옥시다제, 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), 베타-D-글루코시다제, 베타-D-갈락토시다제, 우레아제(urease) 및 갈락토오스 옥시다제의 군으로부터의 효소를 포함한다.
효소의 짝지음과 면역학적 성분은 공지의 방법으로, 예를들면, 펩티드 화학으로부터 공지의 방법으로 아미드 결합을 형성함으로써 가져올 수 있다. 방사성 동위원소를 표지하는 것은 또한 공지의 방법으로 수행될 수 있다. 표지에 유용한 동위 원소는 주로 I125, I131, C14및 H3이다.
위의 방법을 수행하는데 유용한 인큐베이션 단계는 약 20℃와 약 50℃ 사이의 온도에서 약 1시간과 48시간 사이의 시간동안 인큐베이트함과 같은 공지의 방법으로 실행될 수 있다.
상기한 바와같은 세척은 등장성 생리식염수 용액을 사용하는 pH 6-8로, 바람직하게는 약 7로 완층시킨것과 같은 수용액을 사용하여 전형적으로 실행된다.
본 발명은 또한 항원과 항체를 검출하는 상기한 방법을 행하기 위한 진단용 시험킷트에 관련된다.
시험시료내의 HBV의 프리-S 유전자로 코우드된 항원을 검출하기 위한 본 발명에 따르는 진단시험킷트는 다음을 포함한다 : a. HBV 외피의 프라-S 유전자 코우드 영역내에 적어도 6개의 연속아미노산에 해당하고 아미노산 사슬을 갖는 펩티드, 천연발생 HBV 단백질에 해당하는 아미노산이 없는 펩티드에 대한 항체로 피복된 고체기질. b. 고체기질상의 단백질 결합부위를 포화시키기 위한 단백질-포함용액, 그리고 c. 펩티드나 또는 HBsAg에 대한 방사표지항체 소정량.
시험시료 중의 B형 간염 바이러스의 프리-S 영역에 대한 항체를 검출하기 위한 본 발명에 따르는 진단시험 킷트는 다음을 표현한다.
a. HBV 외피의 프리-S 유전자 코우드 영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 갖는 펩티드, HBV의 전연 발생 단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 펩티드가 위에 흡착된 고체기질, 기질은 고체기질상에 단백질 결합부위를 포화시키기 위한 단백질-포함용액에 노출되어 있다. 그리고 b. 인 IgG 또는 IgM에 대한 방사표지항체 소정량.
상기한 시험 킷트에 사용된 방사표지항체는 용액으로 포장할 수도 있고, 또는 재현시키기에 알맞는 동결건조 형태로 포장할 수도 있다..
상기한 시험 킷트에 있어서, 효소 또는 형광성 표지항체를 상기한 앙사표지항체에 대치할 수 있다. B형간염 바이러스의·프리-S 영역에 대한 항체의 검출을 위한 상기한 방법과 시험 킷트는 다음과 같은 많은용응분야에 이용될 수 있다.
(1) 환자로부터 혈청을 채취하고 상기한 시험을 적용하거나 또는 상기한 시험 킷트를 사용함으로써 환자의 HBV 감염을 검출할 수 있다. 그리고 (2) 감염된 환자로부터 혈창을 채취하고 상기한 항체검출방법을 적용함으로써 HBV 감염으로부터의 회복을 예측할 수 있다.
항체검출을 위한 상기한 시험 방법 빛 시험 킷트는 예방 접종된 환자로부터 혈청을 채취한 다음 상기한 시험방법 또는 항체검출용 킷트를 이용함으로써 다른 HBV 왁찐간의 정상적인 비교를 하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 이 항원을 시약으로 사용하는 모든 공지의 면역측정은 본 발명 합성펩티드를 사용하여서 수행될 수 있다. 일반적으로 혈청 또는 시약을 포함하는 항체를 사용하는 모든 공지의 면역측정은 본 발명 합성펩티드의 사용을 통하여 생성된 항체 혈청을 사용하여서 수행할 수 있다. 이를 면역측정은 랜곤 및 반부나키스(Langone 및 Van Vunakis, Methods of Enzymology, Academlc Pres, Volumes 70,73 및 74)에 의해 명시된 모든 것들을 포함한다. 다음의 U.S. 특허의 명세서에 명시된 이들 측정 : 4, 459, 359 ; 4, 343, 896 ; 4, 331,761 ; 4, 292, 403 ; 4, 228, 240 ; 4, 157, 280 ; 4, 152, 411 ; 4, 169, 043 ; 3, 839, 153 ; 3, 654, 090 및 Re 31,006 그리고 효소학의 방법의 Vol. 70, 73 및 74을 여기에 참고로 병합하였다.
B형 간염 왁찐은 적당한 완충액내에서 지질소낭의 콘주게이트와 B형 간염 바이러스의 표면항원의 프리-S 유전자 코우드 영역내의 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드를 직접 사용함으로써 제조할 수 있다. 적당한 농도의 펩티드를 갖는 콘주게이트는 예를 들면 수산화알루미늄 또는 다른 것과 같은 보조액과 함께, 또는 그것이 없이 왁찐으로서 사용될 수 있다.
왁찐의 활성부분은 생리적으로 허용되는 회석재(매제), 예를 들면, 인산염 완충 생리식염수와 함께 사용할 수 있다. 일반적으로 말해서, 생리적으로 허용되는 매제내의 합성펩트드 농도는 1회 분당 대략 1밀리그램 이하와 마이크로 그램 이상 사이일 것이다.
왁찐은 U.S.P 4, 118, 479에 명시된 바와 같은 일반적인 방법으로 제조, 사용될 수 있는데 그의 전 내용을 여기에 참고로 병합하었다.
왁찐은 피하, 복강내 또는 근육내 주사로써 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 특정 왁찐에 달려있는 반면에 근육주사가 일반적으로 적합한 것으로 믿는다. 투여의 빈도는 왁찐에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 말하면 왁찐은 약 한달간 떨어져서 2회 투여한다음 첫번 면역 후 6개월 내지 1년에 부우스터 투여한다. 후속투여 또는 부우스터는 초기면역의 결과에 따른 혈액중 항체의 수준에 달려있으며 어떠한 경우에는 불필요하기도 하다.
본 발명 간염 왁찐은 B형 간염 감염에 걸릴 위험이 있는 모든 사람 특히 환자 또는 현투석 유니트에 종사하는 직원, 의료종사자 열대주민 사람들 그리고 열대지방을 방문하는 사람들과 같은 특히 높은 위험이 있는 사람들에게 권장된다. 열대주민의 경우에 특히 아프리카, 아시아 지중해 지역 및 남아에리카의 경우, B형 간염 감염의 높은 발생빈도가 일관성있게 관찰되었는데, 생활 5년내에 이 지역에서 발생하는 경향이있는 만성 담체상태 감염에 걸리는 것을 방지하기 위하여 충분히 이른 시기에 왁찐을 투여해야 한다. 사실상, 왁찐은 사전면역의 결과로 B형 간염 감염에 이미 예방되어 있지 않은 모든 사람에게 유용한 것으로 기대한다.
본 발명의 성격과 그의 실시방법을 더욱 충분히 예시하기 위하여 다음의 무제한한 실시예를 제시하기로한다.
[실시예 1]
HBsAg의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동
HBsAg 약 20과 20μg 각각을 은채색을 위하여 따로 전기영동시키고 각각을 니트로셀룰로오스에 이동한다. 전기영동전에 HBsAg를 37V에서 30분간 α-에르캅토에탄올과 NaDodSO4(8M 요소중에 각각 10mg/ml, 0.0625M Tris, pH 7.2)로 처리하였다. 환원후 요오드 아세테이트로 알킬화한 HBsAg로 같은 결과를 얻었다.
HBsAg는 기재한 바와 같이 정제하고 방사표지시켰다(A.R. Neurath, N. Strick, C.Y. Huang. Intervirology, 10, 265 (1978)).
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동("SDS-PAGE")을 다음의 공지방법으로 수행하였다(V.K. Laemmli, Nature(London), 227, 680 (1970)참조). 그러나, 충분히 변성된 형태로 단백질을 유지하기 위하여, 8M 효소를 전기영동중의 흐르는 완충액으로 이용하였다.
SDS-PAGE에 의해 분리된 폴리펩티드를 TE42 트랜스포(Transphor)단위 9(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Califonha)를 사용하면서 니트로 셀룰로오스에 이동시킨 다음 제조업자가 권하는 방법을 행하였다. 이동된 단백질을 상용시험 킷트(Abbott 실험실, North Chicago, Illinois)의 부분품으로써 제공된125I-표지인지 항-HBs를 사용하여 본래의 HBsAg에 대한 항체(항-HBs)와 반응하는 결정인자를 기재된 대로 시험하였다(J.C. Mcmlchael, L.M. Greisiger, L. mlllnnn, J. Immunol. Meth., 45, 79, (1981)).
20μg 시료겔로부터, 분리된 HBsAg 폴리펩티드(그들의 Mr은 킬로달톤으로 주어짐)를 그 자리에서 은으로 채색하여(J.H. Morrissey, Anal. Biochem, 117, 307, (1981)), (제 1 도 패널 a참조). 기대한 바와 같이 두 주요 폴리펩티드와 몇몇 작은 폴리펩티드를 수득하였다. 다른 20μg 시료겔로부터 분리된 폴리펩티드는 다음에 전기영동에 의하여 니트로 셀룰로오스에 이동하였고 본래의 HBsAg에 대한125I-표지항체(항HBs)와 반응시키고(증명됨)방사선 시진법에 적용하였다(제1b도).
놀랍게도, 두 가장 풍부한 폴리펩티드보다는 33 및 36 킬로달톤(P33과 P36)이 항-HBs와 바람직하게 반응하였다(제 1 도, 패널 b). 이것은 HBV DNA와 S-유전자로 코우드되지 않은 아미노산 서열에 항-HBs와 반응하는 디설파이드결합 무관계 항원결정인자의 존재를 제안하였다. P33과 P36은 프리-S 유전자 영역의 위치 120의 Net으로 시작하는 아미노-말단부에서 S-유전자와 추가 55잔기의 생성물에 해당하는 서열을 포함한다(제 2 도 참조).
[실시예 2]
프리-S 유전자 생성물의 잔기 120-145에 해당하는 항원 결정인자를 모사하는 펩티드의 합성.
단백질상의 항원 결정인자의 위치는 아미노산 서열에 따라 상대 친수성을 산정하여서 예측할 수 있다(T.P Hopp, K.R. Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824 (1981)과 J. Kyte, R.F. Doolittle, J. Mol. Biol., 157, 105 (1982)참조).
프리-S 영역의 해석생성물에 대한 이러한 산정(J. Kyte et al 위와같음)의 결과를 제 3 도에 나타내었고 잔기 120-140 내의 Met 120부터 오른쪽 서열의 항원결정인자의 위치를 제안하고 있다. 잔기 120-145에 해당하는 부분(제 2 도)(프리-S 120-145, 아형 adw2)이 합성을 위해 선장되었다.
C-말단 Cys (-SH 포함)잔기를 가하여 담체분자와 친화성 모체에 분명한 콘주게이션을 하게하며, 반면에 N-말단은 본래의 단백질에 있는 것처럼 차단되지 않게 남겨둔다. 분자는 하나의 Tyr을 포함하므로 방사표지될 수 있다.
Tyr은 또한 그것이 항원 결정인자 부분일지라도 콘주게이션에 사용될 수 있다.
펩티드는 개드와 마스다(Gaehde와 Matsueda, Int. J. Peptide Protein Res., 18, 451, (1981))의 벤즈히드릴아민-형 수지상에 단계별 고체상 펩티드 합성의 가속화에 의하여, Boc-NH-CH (페닐)-페닐-OCH2COOH를 사용하여 NH2CH2-수지를 유도함으로써 (A.R. mltchell, S.B.H. Kent, M. Engelhard 및 R.B. Merrifield, J. Org. Chem., 43, 2845-2852, (1978))합성하였다. Cys가 결합된 후, 보호된 펩티드 사슬은 다음의 조성에 따라 조럽할 수 있다 ; 1. 탈보호 : 디클로로메탄내의 65% v/v 트리플루오로 아세트산, 1×10분 ; 2. 세척 : 디클로로메탄의 유동흐름을 애스피레이터로 20초간 흡인하에 수지에 흐르게 하였다. 3. 중화 : 디클로로메탄내의 10% v/v 디이소프로필 에틸아민, 2×1분 : 4. 세척 : 디클로로메탄의 유동흐름을 애스피레이터로 20초간 흡인하에 수지에 흐르게 하였다. 5 : 짝지음 : 2ml 디클로로메탄내의 2ml 디클로로메탄내의 2mmol tert, Boc-L-아미노산을 중화된 수지에 가한 다음 즉시 2ml 디클로로메탄내의 1mmol디클로로헥실 카보디이미드를 가하였다. 10분후 수지 시료(대략 5mg)을 취하여 정량적인 닌히드린에 의해 짝지음 수율을 결정하고 10ml 디베틸포름 아이드를 가하고 짝지음을 계속하였다(Asn과 Gln은 히드록시벤조트리아졸의 존재하에 짝지음되었다). 6. 만족할만한 짝지음의 닌히드린 측정후, 수지를 위의 단계 4와 같이 세척하였다. 뒤이은 잔기의 첨가 후, 방법을 반복하여 행하였다. 만일 재 짝지음이 필요하다면 단계 3-5를 되풀이한다. 합성은 0.5mmol 규모(1mmol/g 하중의 0.5그램 아미노메틸-수지)로 수행하였다. 모든부피는 표시했을 때를 제의하고는 10ml 였다.
사용된 보호된 아미노산 유도체는 다음과 같이 N-알파-tert. 부틸옥시카르보닐 보호되고 측쇄보호된 것이다. Arg(NGTosyl) ; Cys(4MeBzl) ; Tyr(BrZ) ; Asp(OBzl) ; Thr (Bzl) ; His(ImTosyl).
Met와 Trp는 측쇄가 보호되지 않았다. 또 다른 합성에서는, 다른 것은 같을지라도 His(ImDNP)와 Trp(InFomlyl)의 사용은 더 순수한 생성물을 내었다.
펩티드 사슬의 조립은 정량 닌히드린 반응으로 검사하였고(V.K. Sarin, S.B.H. Kent, J.P. Tam, R.B. Merrifield, Anal. Biochem, 117, 147-157, (1981)) 아마도 불순한 아미노산 유도체에 기인하는 반복짝지음시키는데도 불구하고 10% 불완전한 히스티딘 잔기의 첨가를 제의하는 어려움이 없었다. 보호된 펩티드 사슬의 조립후에, N-말단 Boc기는 트리플루오로아세트산 처리로써 제거되었고 수지는 위의 단계1-4에서와 같이 중화하였다. 다음에 펩티드를 분할하고 5% v/v p-크레졸과 5% v/v p-티오크레졸을 포함하는 HF로 0℃에서 1시간 처리함으로써 탈보호하여 C-말단 시스테인 아미드로서의 원하는 펩티드를 얻었다.
His(ImDNP)를 사용했을 때는 DNP를 HF 분할에 앞서 페닐페놀로 처리함으로써 제거하였다.
Trp(InFormyl)을 사용했을 때는 포르밀기를 제거하기 위하여 HF 조건을 조절하기를 10% 아니솔과 5% 1,4-부탄디티올을 포함하는 HF나 p-크레졸과 5% 1,4-부탄디티올을 포함하는 HF로 하였다. 생성물을 침전시키고 에테르의 첨가로 세척한 다음 수중의 5% v/v 아세트산에 용해시키고 동결 건조시켜 솜털같은 백색 고체를 얻었다.
조립된 펩티드 사슬의 정량적인 에드만 분해(Edman degradation ; H.D. Niall, G.W. Tregear, J. Jacobs, 펩티드의 화학 및 생물학, J. Meienhofer, Ed(Ann Arbor Pres, Ann Arbor, ml.1972), pp. 659-699)는 고효능의 사슬 조립을 나타내었는데(S.B.H. Kent, M. Riemen M. LeDoux, R.B, Merrifield, 단백질 서열 분석의 방법에 관한 제 4 회 국제 심포지움 회보, M. Elzinga, Ed. (Hunmna, Clifton, New Jersey, 1982), pp. 626-628). 이것은 서열 위치 프리-S 128의 히스티딘을 제의하고는 각단계에서
Figure kpo00019
9./9.7 퍼센트의 효율로 진행 되었다. 수지를 분할한 펩티드의 HPLC는 225nm에서 흡광하는 펩티드물질의 대략 85퍼센트에 해당하는 단일 주피이크를 나타내었다.
[실시예 3-6]
프리-S 유전자 생성물(프리-S 120-145)의 잔기 120-145에 해당하는 항원 결정인자를 모사하는 펩티드의 면역학적 특성
[실시예 3]
면역방법
유리의 또는 담체 결합된 프리-S 120-145(아형 adw2)로 토끼틀 면역시켰고 동족체 펩티드와 HBsAg에 대하여 모든 동물에서 항체반응을 가져왔다(제 4 도). HBV DNA의 프리-S 영역의 아미노산 서열 120-145(프리-S 120-145)에 해당하는 펩티드(아형 adw2, P. Valenzuela, P Gray, M. Quiroga, J. Zaldivar, H.M. Goodman, W.J. Rutter, Nature(London),280,815, (1979))는 담체에 대한 짝지음이 편리하기 때문에 첨가된 C-말단에 추가 Cys 잔기를 포함하는데, 개량된 고체상 기법으로 합성하였다(S.B.H. Kent, Biomedical Polymers, E.P. Goldberg, A. Nakajima, Eds. (Academlc, New York, 1980), pp. 213-242 ; A.R. mltchell, S.B.H. Kent, M. Engelhard, R.B. Mechifield. J. Org. Chem., 43, 2845, (1978), 그리고 S. Mojsov, A.R. mltchell, R.B. Merrifield, J.Org. Chem., 45, 555 (1980)).
면역측정을 위해서 담체에 연결시키기 위하여 펩티드를 2-베르캅토 에탄올로 처리하고 세파덱서 G-10상에서 크로마트 그라피에 의해 낮은 Mr 성분으로부터 분리하였다. (A.R Neurath, S.B.H. Kent, N.Strick, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7871 (1982)).
2 내지 3마리 토끼군을 유리의 프리-S 120-145나 또는, 글루타르 알데히드로 고정시키고 헵탄과의 항체 반응을 향상시키기 위하여 RAT기를 부착하거나 또는 하지 않은 스테아릴아민, 디라우로일 레시틴 및 클레스테롤을 포함하는 시스테인-활성 리포소옴에 연결된 펩티드로 면역시킨다(A.R. Neurath, S.B.H. Kent, N. Strick, J. Gen. Virol, in press (1984)) 완전 및 불완전 프룬드 보조액의 사용을 수반하는 면역 스케줄은 기술한 바와 같다(Neurath, Kent, Strick, et al(1984) 의와 같음). 프리-S 120-145로 면역된 토끼의 혈청중의 HBsAg에 대한 항체를 HBsAg-퍼복된 폴리스티렌 비이드와125I 표지된 항-토끼IgG를 사용하면서 이중항체 방사면역측정(RIA)으로 시험하였다 (Neurath, Kent, Strick, et al (1984)위와 같음).
동족체 펩티드에 대한 항체는 피복된 비이드 대신에 셀룰로오스-펩티드 콘주게이트 2.5mg을 사용하는것을 제외하고는 유사한 시험으로 시험하있다. 이 콘주게이트는 다음의 방법으로 제조하였다 : 기재된 대로제조한 (P.L. Feist, K.J. Danna, Biochemlstry, 20, 4243 (1981)). 술프히드릴 셀룰로오스 0.5g을 pH5, 0.1M인 아세트산나트륨 5ml에 부유시키고 30℃에서 1시간 동안 디메틸포름아미드중의 0.25M N-N'-P-페닐렌 디말레이미드 2.5ml와 혼합한 다음 pH 0.7인 0.1M 인산염-10mM EDTA로 세척하였다. 셀룰로오스 유도체를 프리-S 120-145 5mg을 포함하는 후자의 완충액 10ml에 부유시키고 20℃에서 적어도 16시간 동안 혼합하였다. 셀룰로오스 유도체를 광범위하게 세척하고 0.14M NaCl-10mM Tris-3mM NaN3(TS)에 부유시켰다. 최종 제제는 셀룰로오스 g당 프리-S 120-145를 8mg 포함하였다.
[실시예 4]
리포소옴에 결합된 프리-S 120-145로 면역된 토끼로부터의 혈청의 몇 희석액으로 방사면역측정을 행하였다(제 5 도 참조).
항체는 항혈청이 1.6×105배까지 희석되었을 때까지도(제 5 도) 여전히 검출 가능하였다.
프리-S 120-145 또는 항-프리-S 120-145는125I-표지된 항 HBs와 P33(P36)간의 반응을 억제하였다.125I-표지된 HBsAg는 RIA로 양성인 모든 희석액으로 항-프리-S 120-145와 면역침전되었다(제 5 도). HBV 입자는 면역착물내의 HBV-DNA의 검출에 의해서와 전자현미경으로 측정된 바와 같이 항-프리-S 120-145와 반응하였다(A.R. Neurath, N. Strick, L. Baker, S. Krugman, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 79, 4415 (1982)).
[실시예 5]
P33과 P36 검출을 위한 특수한 조사로서의 항-펩티드항체
항-프리-S 120-145를 P33 및 P36과 반응시켰다. 요소중의 SDS-PAGE 실행으로 분리된 HBsAg 폴리 펩티드를 니트로셀룰로오스에 이동하고 소혈청 알우민 10mg/ml와 젤라틴 2.5mg/ml(TS-BG)를 포함하는 TS 중에 1/80으로 희석된 항-프리-S 120-145와 20℃에서 5시간동안 반응시켰다. 결합된 IgG를 검출하기 위하여 니트로 셀룰로오스 시이트를 세척하고 20℃에서 5시간동안125I 표지된 단백질 A(0.4μC/100ml TS-BG)에 노출시켰다. 더욱 상세한 것은 제11도를 참조하라. 제 6 도에서 화살표는 P33과 P36의 위치를 가리킨다. 상단의 화살표는(분자량 66킬로달톤에 해당함) 항-프리-S 120-145와 반응하는 또 다른단백질, 가능하게는 P33의 이량체에 해당함을 가리킨다.
[실시예 6]
HBV-감염 개체의 혈청중 프리-S 유전자로 코우드된 항원의 검출을 위한 진단시험의 전개
제 7 도는 항-프리-S 120-145로 피복된 폴리스티렌 비이드를 기초로한 진단시험의 결과를 나타낸다. 정상인과 토끼 혈청의 혼합물중의 HBsAg-양성혈청의 TS에 1/10으로 각각 희석된 일련의 희석액을 시험하였다.125I-표지된 인 항-HBs(Abbott 실험실)를 본질적으로 AUSRIA Ⅱ 진단킷트(Abbott 실험실)에 기재된 대로 수행한 시험에 사용하였다. 결과는 RIA 비율 단위로서 표시하였고 양성의 시료에 해당하는 cpm을 정상인 혈청 대조표준에 해당하는 cpm으로 나눔으로써 구하였다. 종말점 역가는 RIA비가 2.1(파선)인 최고의 회석액에 해당한다.
AUSRIA에 의해 구한 바와 같은 혈청의 종말점 역가는 대략 1/106이었다. 음성의 결과는 정상 토끼 IgG로 피복된 대조표준 비이드로 얻어졌다.
마찬가지의 결과를 HBsAg 아형 ad 및 ay를 포함하는 혈청으로 얻었는데, 아형 adw에 해당하는 서열을 가진 합성펩티드(제 2 도)는 공통의 기-특이성 항원 결정인자를 지님을 알 수 있다.
[실시예 7]
S(135-155)유도체의 합성 및 시험
제 1 표에 기재된 콘주게이트(S(135-155)의 (1) 내지 (26)) 각각을 콘주게이트(3)만을 제의하고 완전프룬드 보조액과 1 : 1로 혼합하고 두마리의 뉴질랜드 백토끼(토끼당 펩티드 65 내지 160μg)에 주사하였다. 토끼에 2주 간격으로 같은 투여량의 불완전 프룬드 보조액내의 콘주게이트를 더 주사하였다. (콘주게이트(3)은 사용하지 않았다). 주사 2주후 혈 시험표본을 채취하였다. 콘주게이트 1, 그리고 4-8(제 1표)을 제조하기 위하여 env 유전자 생성물(S(135-155))의 펩티드 309-329의 1mg 양을 이어서 같은 몰량의 폴리-D-리신과 디아미노알칸 각각에 기재된 대로 결합시켰다(Fluka, AG, Buchs, Switzerland로부터)(Arnon, R., Sela, M., Parant, M 및 Chedid, L., "빌틴 어주번시티(Built-In Adjuvanticity)와의 완전 합성항원에 의해 유도된 항 바이러스성 반응",Proceedings of the National Academy of Science USA, 77, 6769-6772, (1980)) 콘주게이트 2와 3을 제조하기 위하여 각 EDAC-활성S(135-155)와 MDP(Calbiochem, San Diego, Califor'lia)의 1mg양을 폴리-D-리신10mg에 결합하였다. env 유전자 생성물의 펩티드 309-329(800μg)을 페리시아나이드로 산화시키고(Dreesman et al, 1982 위와 같음), 상기와 같이 EDAC로 활성화시키고 LPH 4mg에 연결시켰다. 세파덱스 G-25상의 크로마트그라피는 LPH에 대한 펩티드의 안전한 결합(콘주게이트 9)을 가리킨다. 산화된 EDAC-활성화된 펩티드(1mg)을 또한 pH 8 5인 1M NaHCO3, 2.5ml와 CHCl3, 10ml의 현탁액내의 폴리발린 1mg에 콘주게이트시켰다. 원심분리후 중간층 및 수층을 면역에 용하였다(콘주게이트 10).
리포소옴은 오쿠, 쉬러 및 맥도날드(Oku, N., Scheerer, J.F., 및 MacDonald, R.C., "거대 리프소옴의 제조'', 레시틴 및 콜레스테롤을 최종농도 각각 10,23 및 1.43mg/ml로 글루코오스-포화에탄올에 용해시켰다. 어떤 리포소옴 제조에 대하여는 디라우릴 레시틴의 농도를 17.5mg/ml로 감소시키고 스핀고미엘린(sphingomyelin)을 가하였다(10mg/ml). 다른 제법은 추가성분으로서 지질 A(420μg/ml ; Calbiochem)을 포함하였다. 103달톤의 분자량 차단을 갖는 투석백의 pH 8.5인 0.1M NaCHO3에 대하여 대략 16시간 동안 용액을 투석하였다. 리포소옴을 대략 6시간 동안 글루타르 알데히드(최종농도 30mg/ml)로 처리하고, 33.9%(w/w) 소디움 디아트리조에이트 0.5부피와 혼합하고, 10,000rpm에서 10분간 원심분리함으로써 1M NaCHO3로 4회 부유시키고,10mg 스테아릴아민 당 env 유전자 생성물의 펩티드 309-329 0.84 내지 1mg과 20℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이들 조건하에서 리포소옴에 대한 env 유전자 생성물의 펩티드 309-329의 결합은 완전하였다. 어떤 제법은 스테아릴아민 10mg당 RAT 7.5mg과 20℃에서 6시간 동안 추가 반응시킨다(Biosearch, San Rafael, California). 리포소옴을 0.14M NaCl, 0.01 Tris-Hcl-0.02% NaN3(TS)로 3회 부유시키고 TS-10-4M 산화 글루타치온에 대해 적어도 16시간 동안 투석하였다.
어떤 경우(20)과 (21)에서는 스테아릴아민 포함 리포소옴은 GA로 유도필 수 없으나 대신에 env 유전자생성물의 EDAC-활성펩티드 309-329와 직접 반응하였다. 또 다르게는, (18)과 (19), 유전자 생성물의 활성펩티드 309-329는 PH 8.5인 0.2M 에틸렌디아민과 20℃에서 하룻밤 반응시킴으로써 더욱 유도되는 글루타르 알데히드-처리된 리포소옴에 결합되었으며, 이어서 pH 8.5인 0.1M NaHCO3로 2회 부유시키고 20℃에서 1시간 동안 10μM 소디움 디티오나이트로 환원시키고 같은 완충액으로 부유시키기를 되풀이하였다. 이들 리포소옴 알리큇을 EDAC-활성 RAT와 추가반응시켰다. 리포소옴을 TS-10-4M 산화 글루타치온에 대해 최종적으로 투석하였다.
한 제법(22)에서는, 리포소옴의 제조를 위해 스테아릴아민 대신에 스테아르산을 사용하였다. 이들을 0.01M NaCl 내해 투석하고 pH 5.5의 20℃에서 EDAC로 활성화시키고(50mg/ml로 2시간 동안, 그리고 추가로 25mg/ml로 1시간 동안), 0.01M NaCl로 2회 부유시켰으며 pH 8.5인 M NaHCO3내의 env 유전자 생성물의 펩티드 308-329와 하룻밤 반응시켰다.
폴리글루타르 알데히드 미소구를 마겔, 지스블랏트, 램바움(Margel, S., Zisblatt, S 및 Rembaum,
A. "폴리글루타르 알데히드 : 미소구에 대한 단백질 짝지음과 세포-표면 수용기 Ⅱ를 표지하기 위한 새로운 시약. 비-자기 및 자기 폴리글루타르 알데히드 미소구에 의한 단순화된 표지법, "Jounal of Immunolgical Methods, 28, 341-353(1979)).에 의해 기재된 대로 폴리설프 10-36B(Bartig Industries Inc., New Canaan, Conn., Margel ＆ Offarim, (1983))을 사용하여 제조하였다. 유전자 생성물의 펩티드 309-329 1mg은 글루타르 알데히드 처리된 리포소옴을 위해 기재한 것과 비슷한 조건하에 대략 50mg의 미소구에 결합되었다. 콘주게이트(25)는 미소구를 pH 8.5에서 0.1m ε-아미노 카프로산 5ml로 하룻밤 처리리함으로써 제조하였다. 원심분리후, 미소구는 디에틸포름아미드(2ml)에 부유시키고, 20℃에서 1시간 동안 2mg EDAC와 670μg NHBTA로 반응시켰다. 원심분리후, 미소구를 env 유전자 생성물의 펩티드 309-329 1mg을 포함하는 pH 8.5인 0.1M NaHCO32ml에 재부유시켰다.
위에 나열한 모든 시약들은 분석용 등급이면 달리 표시하지 않는한 미주리주 세인트루이스의 시그마에서 구입하였다.
5개의 시스테인 잔기를 포함하는 env 유전자 생성물의 유리펩티드 309-320(분자량=2,664 달톤)는 지배적으로 단량체 형태이었는데, 분자배제 크로마토그라피후 인슈린 A 사슬과 거의 같은 분율로 용리되었기때문이다. 디아미노부탄과 다른 디아미노알칸에의 결합은(데이타는 나타내지 않았음)면역성인 항 펩티드와 항-HBs 항체 모두를 유도한 S(135-155)중합체의 형성을 가져왔다. 제법 (4), (5) 및 (7)도 또한 항-HBs를 유도했으나 디아미노옥탄 또는 도데칸 결합제(6)과 (8)을 가진 중합체는 알수 없는 이유로 그렇게 하지 못했다(제 8 도).
env 유전자 생성물의 펩티드 309-329의 산화는 중합화를 가져왔다(데이타를 나타내지 않았음).
LPH에 결합된 중합체(콘주게이트 9)는 높은 수준의 항-S(135-155)를 유도하나 그의 환원된 형태로 KLH 또는 LPH에 결합된 S(135-155)와는 달리 항-HBs는 유도하지 않는다(Neurath et al.,1 982, 위와 같음). 이 발견은 다시 천연단백질에 대한 항체를 유도하는데 있어서 펩티드 구조의 역할을 강조한다. 산화된 펩티드의 높은 친수성의 폴리-L-발린에 대한 결합은 저면역성의 콘주게이트(10)를 가져온다. 프룬드 보조액(1)을 투여한 폴리-D-리신에 연결되거나 또는 공유결합된 MDP를 갖는 보조액(3)이 없이 주어진 S(135-155)는 항-S(135-155)와 항-HBs를 모두 유도하였다. 프룬드 보조액(2)을 투여한 후자의 콘주게이트는 나쁜 면역성을 나타내었다. 스테아릴아민을 포함하는 글루타드 알데히드 처리된 리포소옴에 결합된 S(135-155)(콘주게이트 11)는 KLH 또는 LPH와의 콘주게이트에 의하여 유도된 것과 비교할만한 수준의 항-HBs를 유도하였다. (Neurath et al, 1982, 위와 같음). 스핑고미엘린 및/또는 지질 A 성분들의 병합은 리포소옴 막으로 삽입된 합텐(hapten)의 항원성을 높이는 것으로 보고되어 있으며(Yasuda, T., Dancey, G. F. 및 Kinsky, S.C., "쥐의 리포소옴 모델막의 면역학 : 인지길 조성물의 조성",Proceedings Of The National Academy Of Sciences, 74, 1234-1236(1977)). 리포소옴으로는 (콘주게이드 13, 15a, 16)은 항-HBs 반응을 향상시키지 못하였다.
S(135-155)를 직접적으로 보다는 에틸렌디아민 다리를 통하여 글루타르-알데히드-처리된 결합시킴으로서 제조원 콘주게이트(18 및 19)는 항-HBs를 유도하는 능력을 가지나 개개 토끼간의 반응에 있어서는 상당한 변동이 관찰되었다.
산화이전 또는 이후와 이어서 스테아릴-아민-포함 리포소옴(글루타르 알데히드로 고정되지 ; 제법 20 및 21) 또는 스테아르산-포함 리포소옴(22)에 결합된 S(135-155)는 저수준의 항-S-135-155를 유도하며 항-HBs는 측정할 수도 없다.
폴리글루타르 알데히드의 미소구에 직접 결합된 S(135-155)(제법 23 및 24)는 일차적인 항-HBs 반응을 유도하였다. 그러나, 항-HBs의 수준이 면역의 과정에서 감소하였다. 세번째 면역 2주후 수집한 혈청에서 항-HBs는 검출할 수 없었다.
ε-아미노카프로산(25)과 ℓ-시스테인(26)다리를 통하여 이들 미소구에 각각 결합된 S(135-155)는항-HBs를 유도하는데 실패하거나 (25) 또는 최저의 효과를 내었다.
S(135-155)-KLH 또는 LPH 콘주게이트는 일차적인 항-HBs 반응을 유도했으나 항-HBs의 수준은 추가 항원 투여후 토끼의 혈청에서 증가되지 못했다(Neurath et al., 1982, 위와 같음) 상기한 콘주게이트로는, 일반적으로, 일차 면역 4 또는 6주후 항-HBs 수준의 감소가 관찰되었으나(제9b도), 소수의 토끼에서는 예외가 관찰되었다(제9a도, 패널 5). 이 쇠퇴 경향은 RAT를 S(135-155)와 함께 리프소옴성 막으로 삽입했을 때 균일하게 역전되었다. (예를 들면 제9c도 및 제9d도).
리포소옴성 막에 삽입된 합텐의 면역성은 리포소옴의 인지질 조성에 의존하며 이들 막의 유동성에 역비례하는 것 같다 (Yasuda et al., 1977supra: Dancey, G.F., Yasuda, T. 및 Kinsky, S.C , "면역성에 대한 리포소옴성 모델막 조성물의 효과",The Jounlal of Immunology, 120, 1109-1113(1978)).
스테아릴아민-함유 리포소옴을 글루타르 알데히드로 처리하는 것은 합성펩티드의 결합에 적합한 반응기를 제공하며 동시에 지질막의 강직성을 증가시킴을 발견하였다. 이러한 리포소옴은 특히 RAT 부위를 향상시키는 담체기능을 포함할때(Alkan, S.S., Nitocki, D.E. 및 Goodman, J.W., "항원인식 및 면역반응 : 고분자합텐에 대한 담체로서 제공하는 1-트리오신-아조벤젠아르소네이트의 용량",The Journal of Immunology, 107, 353-358 (1971), 그리고 Alkan, S S , Williams, E.B , Nitocki D.E 및 Goodman, J.W., "항원인식 및 면역반응, 작은 모노-및 이 작용기성 항원 분자에 대한 액소성 및 세포성 면역반응",Thr Journal of Experimental Medicine, 135, 1228-1246, (1972)) 항-바이러스성항체를 유도하기 위한 충분한 합성면역원을 제조하는 유망한 도구이다.
[제 1 표]
S(135-155)콘주게이트의 제조에 사용된 가교결합제와 담체목록
(1) 폴리-D-리신(분자량 3-7×104)
(2) 1+N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(MDP)
(3) =2
(4) 1,4-디아미노부탄
(5) 1,6-디아미노헥산
(6) 1,8-디아미노옥탄
(7) 1,10-디아미노데칸
(8) 1,12-디아미노도데칸
(9) LPH에 결합된 산화된 S(135-155)
(10) 폴리 -L-발린에 결합된 산화된 S(135-155)
(11) 스테아릴아민을 포함하고 글루타르 알데히드로 처리된 리포소옴
(12) =11=L-티로신-아조벤젠-P-아르소네이트(RAT)
(13) =11+스핑고미엘린(소뇌로부터)
(14) =13+RAT
(15a) =11+지질 A
(15) =15a+RAT
(16) =13+지질 A
(17) =16+RAT
(18) =에틸렌디아민으로 처리된 11
(19) =18+RAT
(20) 산화된 S(135-155)와 반응시킨 스테아릴아민을 포함하는 리포소옴(9 참조)
(21) =S(135-155)를 제외한 20을 리포소옴에 부착시킨 후 산화시켰다.
(22) 리포소옴을 함유하는 스테아르산
(23) 폴리글루타르 알데히드 미소구
(24) =23+RAT
(25) =ε-아미노카프로산으로 처리한 23
(26) =L-시스테인으로 처리한 23
(실시예 8)
펩티드 프리-S(12-32)(아형 adw2)는 실시예2의 상기에 기재한 방박에 따라 합성하였다. 유리펩티드, KLH에 결합된 펩티드뿐만 아니라 글루타르 알데히드 가교결합된 리포스옴(±RAT기)(실시예7의 상기한 방법에 따름)을 토끼를 면역시키는데 사용하였다. 해당하는 항체는 펩티드뿐만 아니라 HBsAg와 HBV를 인식하였다. 위의 견해로, 이 펩티드는 B형 간염 바이러스에 대한 왁찐에 그리고 펩티드 자체(감염되거나또는 면역된 기체에서의 항-HBV 반응을 검출하기 위함), 또는 B형 간염 항원을 검출하기 위한 펩티드항체를 기초로 한 유용한 진단학의 기초로서 아주 유용한 것으로 믿는다.
[실시예 9]
펩티드 프리-S(117-134)(아형 adw2)를 실시예2의 상기한 방법에 따라 합성하였다.
[실시예 10]
실시예 9에 따라 제조하고 실시예 7의 방법에 따라 담체에 결합시킨 펩티드 프리-S(117-134)로 토끼를 면역하였다. 이러한 면역은 실시예 3의 상기한 방법에 따라 행하였고 접종된 토끼의 혈청에서 항체를 생산함을 발견하였다. 그러나, 항체역가는 프리-S(120-145)와 프리-S(12--32)의 사용에 대하여 관찰된것보다 실질적으로 더 적었다.
[실시예 11]
HBV DNA(아형 adw2)의 프리-S 유전자의 해서 생성물의 잔기 120-145와 12-32에 해당하는 두 합성펩티드 각각에 대한 토끼의 면역반응을 시험하였다. 펩티드 프리-S(120-145)를 실시예 2에 따라 제조하였고 펩티드 프리-S(12-32)를 실시예 8에 따라 제조하였다. 그들의 서열은 MQWNSTAFHQTLQD-PRVRGLYLPAGG(프리-S(120-145))와 MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDP(프리-S(12-32))이다. 면역을 위하여 펩티드를 유리의 형태로, 명반 또는 프룬드 보조액을 사용하여 또는 담체, 즉 키이흘 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 가교결합된 리포소옴에 결합된 것으로 각각 사용하였다. 리포소옴을 실시예 7에 기재된대로 제조하였다.
리프소옴의 표면에 공유결합된 펩티드로 최고의 결과를 얻었다(제10도 강조).
KLH 콘주게이트로의 면역은 명백히 펩티드에 대한 낮은 부우스터반응을 일으키면서 높은 항-KLH 반응을 가져왔다(방사면역측정에 의한 종말점역가는 1/5,000,000) 반면에 RAT-함유 리포소옴을 담체로서 사용했을때 RAT기에 대한 훨씬 더 낮은 항체반응(대략 1/103)이 검출되었다. 리포소옴(RAT가 없는)에 대한 항체는 검출할 수 없었다. 이것은 리포소옴은 합성펩티드로 면역하기 위한 선택성 담체임을 제안한다.
[실시예 12]
프리-S 유전자 코우드서열에 해당하는 항원결정인자가 HBV 입자상에 우선적으로 존재하는지 여부를 확립하기 위해, HBV 입자에 대해 기른 항혈청의 프리-S 단백질의 두 합성펩티드 유사물과의 반응을 시험하였다. 합성펩티드와 반응하는 항체가 여전히 검출가능한 이 항혈청의 최대 회석액은 프리-S(120-145)와 프리-S(12-32)에 대하여 각각, 대략 1/62,500(표지된 제 2 항체 대신에 1251-표지된 단백질 A를 이용한 시험으로는 1/2×106), 그리고 대략 1/2,560이었다(제11도 참조) 항혈청(S-단백질에 대한 항체를 제거하기 위하여 HBsAg-세파로우스에 흡착된 것)은 S 단백질의 합성펩티드 유사물, env 유전자 생성물(S(135-155))의 펠티드(309-329), env 유전자 생성물(S(48-65))의 펩티드(222-239) 및 env 유전자 생성물(S(69-79))의 펩티드(243-253)과 반응하지 않았고 그러므로 프리-S 유전자 코우드서열에 대해 특이성이 있다. 비교로서, 동족체 펩티드에 대해 제조된 항혈청의 희석 종말점은 항-프리-S(120-145)(제11도 참조)와 항-프리-S(12-32)(데이타를 나타내지 않았음) 각각에 대하여 대략 1/300,000과 대략 1/80,000 이었다.
합성펩티드는 또한 급성 B형 간염으로부터 금방 회복된 개인의 혈청중의 항체(IgG 및 IgM)에 의해서와 클로로암페리콜 아세틸 트랜지스터라제와 이이콜리(E. Coli)로 표현된 프리-S 단백질의 부분(제11도 참조)사이의 용융단백질에 대한 토끼 항체에 의해서도 인식될 수 있다.
반면에, 팹신처리된 HBsAg로 (M. R. Hilleman, E. B. Buynak, W.J. McAleer, A. A. McLean, P.J. Provost, A.A. Tytell, inVival Hepatitis, 1981 Intenmtional Symposium, W. Szmuness, H.J. Alter, J. E. Mayard, Eds(Franklin Institute Pres, Philadelphia, PA, 1982), pp. 385-397) 또는 이스트에서 생성된 HBsAg-로(프리-S 유전자 코우드서열이 없는것 : W. J. Mcaleer, E. B. Buynak, R.F. Maigetter, D. E. Wambler, W. J. milbur, M. R. Hilleman,Nature(London),307,178(1984))면역된 사람은 두 합성펩티드의 어느것을 인식하는 항체도 검출될만큼 발육되지 않았다. 반면에 천연 HBsAg로 구성되는 왁찐을 받은 개인 12명중 7명은 이들 항체를 발육시켰다.
[실시예 13]
HBV 입자(또는 HBsAg)에 노출된 프리-S 유전자 코우드서열과 합성펩티드 유사물간에 면역학적 교차반응성의 정량적인 관점을 시험하였다. 펩티드는 β-갈락토시다제에 콘주게이트되었고 효소-콘주게이트된 펩티드를 포함하는 면역착물의 형성에 대한 유리펩티드, HBV 및 HBaAg 각각의 억제효과를 연구하였다. 제12도에 나타낸 결과는 충분한 농도에서의 HBV는 항-프리-S(120-l45)와 프리-S(120-145)-P-갈락토시다제간의 반응을 완전히 억제하였음을 가리킨다.
HBsAg는 HBV에 해당하는 억제활성의 ＜1/5를 갖는다. 펩신처리된 HBsAg의 억제활성은 천연 HBsAg에 해당하는 활성의 ＜1/1,000이었다. 이들 결과는 합성펩티드를 인식하지 않으나 천연단백질을 인식하는 항체 아집단의 항-프리-S(120-145)혈청중의 존재를 가리킨다.
이러한 항체 아집단은 바이러스성 단백질의 합성펩티드 유사물에 대해 기른 많은 항혈청에서 관찰된다. 프리-S(120-145)-P-갈락토시다제의 항-프리-S(120-145)와의 반응을 대략 50% 억제하기에 충분한 유리펩티드의 농도는 중량기준으로 HBV에 대한 농도의 대략 1/100이다(제11도 참조). 그러나 프리-S(120-145)의 분자량은 대략 3kD이고 항-프리-S(120-145)와 반응하는 HBV 단백질성분의 분자량(총HBV 질량의 소수(＜20%)부분을 나타내는 것)은 대략 33과 대략 67kr)이기 때문에, 이 정도의 억제에 요구되는 HBV와 프리-S(120-145)의 몰농도는 대략 같다. 이것은 펩티드 유사물과 HBV 외피단백질의 해당단편에 대한 항원결정인자가 구조적으로 밀접하게 관련됨을 가리킨다.
[실시예 14]
펩티드 프리-S(94-177)(아형 adw2)를 실시예 2의 상기한 방법에 따라 합성하였다.
[실시예 15]
실시예 14에 따라 제조하고 실시예 7의 방법에 따라 담체에 결합시킨 펩티드 프리-S(94-117)로 토끼를 면역시켰다. 이러한 면역은 실시예 3에 대해 상기한 방법에 따라 행하였으며 접종된 토끼의 혈청중의 항체를 생산항을 발결하였다. 그러나, 항체역가는 프리-S(120-145)와 프리-S(12-32)의 사용에 대해 관찰된것보다 실질적으로 작았다.
[실시예 16]
펩티드 프리-S(153-171)(아형 adw2)는 실시예 2의 상기한 방법에 따라 합성하였다.
[실시예 17]
실시예 16에 따라 제조되고 실시예 7의 방법에 따라 담체에 연결된 펩티드 프리-(153-171)로 토끼를 면역시켰다. 이러한 면역은 실시예 3에 대해 상기한 방법에 따라 행하였고 접동된 토끼의 혈청중에 항체를 생산항을 발견하였다. 그러나 항체역가는 프리-S(120-145)와 프리-S(12-32)의 사용에 대해 관찰됫 것보다 실질적으로 더 작았다.
[실시예 18]
실시예 2의 상기한 방법에 따라 펩티드 프리-S(1-21) (아형 adw2)를 합성하였다.
[실시예 19]
실시예 18에 따라 제조되고 실시예 7의 방법에 따라 담체에 연결된 펩티드 프리-S(1-21)로 토끼를 면역하였다.
이러한 면역은 실시예 3에 대한 상기한 방법에 따라 행하였고 이렇게 접종시킨 토끼의 혈청중에 항체를 생산함을 발전하였다
그러나, 항체역가는 프리-S(120-145)와 프리-S(12-32)의 사용에 대해 관찰된것보다 실질적으로 더작았다.
[실시예 20]
실시예 2의 상기한 방법에 따라 펩티드 프리-S(32-53)(아형 adw2)를 합성하였다.
[실시예 21]
실시예 20에 따라 제조되고 실시예 7의 방법에 따라 담체에 결합된 펩티드 프리-S(32-53)으로 토끼를 면역시켰다. 이러한 면역은 실시예 3에 대해 상기한 방법에 따라 행하였고 이렇게 접종한 토끼의 혈청중에 항체를 생산항을 발견하였다.
그러나, 항체역가는 프리-S(120-145)와 프리-S(12-32)의 사용에 대해 관찰된 것보다 실질적으로 더작았다.
[실시예 22]
실시예 2의 상기한 방법에 따라 펩티드 프리-S(57-73)(아형 adw2)를 합성하였다.
[실시예 23]
실시예에 따라 제조되고 실시예 7의 방법에 따라 담체에 결합된 펩티드 프리-S(75-73)로 토끼를 면역시켰다. 이러한 면역은 실시예 3에 대해 상기한 방법에 따라 행하있고 이렇게 접종된 토끼의 혈청중에 항체를 생산항을 발견하였다.
그러나, 항체역가는 프리-S(120-145)와 프리-S(12-32)의 사용에 대해 관찰된것보다 실질적으로 더 작았다.
[실시예 24]
합성펩티드를 사용하는 인 혈청중의 항-프리-S-단백질 항체의 검출.
위에 논의 한대로 프리-S 단백질의 합성펩티드 유사물을 인식하는 항체를 B형간염으로부터의 회복기간에 인혈청중에서 검출하였다(제11도).
선택된 환자의 프리-S(120-145)를 인식하는 항체의 발육의 시간경과를 제13도에 나타내었다.
항-프리-S 단백질항체는 급성 B형간염의 초기에 인혈청에서 검출된다. 펩티드를 인식하는 IgM 항체는S-단백질에 대한 항체(항-HBs) 또는 B형간염 핵 항원에 대한 항체(항-HBc)를 검출할 수 있기 이전에 HBsAg 안티제네 미아(antigenemia)의 동안에 검출되었다. 후자의 두항체의 발육후, 항-프리-S 특이성을 가진 항체의 수준은 쇠퇴하였다.
B형간염을 가진 환자들 가운데 이 항-프리-S 발육 패턴의 변동이 관찰되었다. 어떤 경우에는, 합성펩티드를 인식하는 항체는 HBsAg가 혈장내에서 검출되기 이전에도 존재하거나 또는 HBsAg가 결코 혈액내에 나타나지 않았을때와 단지 B형간염에 대한 표식제가 항-HBc이고 후에 항-HBs인때에도 존재하였다.
프리-S(120-145)에 대한 항체를 RIA로 측정하였다. 프리-S(12-32)에 대한 항체를 측정함으로써도 유사한 결과를 얻었다. HBsAg 항-HBs 및 B형 핵항원에 대한 항체(항-HBc)를 상용시험킷드(Abbot 실험실, north Chicago, Illinois) 를 사용하여 측정 하였다.
HBV 감염의 다른 표식제에 해당하는 막대의 끝의 파선은 감시의 끝무렵에서의 실증성을 가리킨다. 항체역가는 시험표본에 해당하는 방사능 계수 나누기 균등하게 희석된 표준혈청에 해당하는 계수기 ≤2.1이었던 최고 회석액의 혈청을 나타낸다.
펩신처리된 HBsAg(Hilleman, M. R., Buynak, F.B., McAleer, W. J., McLean, A.A., Provost, P.J.＆ Tytell, A.A. in Viral Hepatitis, 1981 International Symposium (eds, Szmuress, W., Alter, H.J.＆ Maynard, J.E,) 385-397 (Franklin Institute Press, Philadelplina, PA, 1982), (펩신처리는 모든 항-프리-S(120-145) 반응성 물질을 제거한다)로 면역하거나 또는 이스트에서 생성된 HBsAg (프리-S 유전자 코우드 서열이 없음, McAIeer, W.J.Buynak, E.B.Maigetter, R.E., Wambler, D.E., mlller, W.J., Hillemann, M.R., Nature(London), 307, 178-180(1984))로 면역된 사람은 두 합성펩티드중 어느것을 인식하는 항체도 검출할 수 있을 만큼 발육시키지 못했다.
반면에, 천연 HBsAg(McAuliffe, V.J., Purcell, R.H.Gerin, J. L. ＆ Tyeryar, F.J. in Viral Hepatitis(eds Szmuness, E., Alter, H.J.＆ Maynard, J.E.) 425-435, Franklin Institute Press, Philadelphis, PA)로 구성되는 왁찐을 받은 12명의 개인중 7명이 이들항체를 발육하였다.
이들 7명의 개인은 또한 AUSAB 시험(Abbott)으로 측정할때 S-단백질에 대한 고도의 항체반응을 갖는데 프리-S 단백질에 대한 검출할만한 반응의 결핍은 시험의 강도의 한계에 기인하는 것으로 본다,
이점에 관하여 지금까지 사용된 B형간염 왁찐은 그의 생산은 HBsAg의 펩신처리를 수반하는데, 명백히 건강한 개인에게는 크게 효율적일지라도 저면역성을 가지며 혈투석 환자에게는 예방효과가 없다(Stevens, C.E., Alter, H.J., Taylor, P.E., Zang, E.A., Harley, E.J. ＆ Szmuness, W., N. Engl, J.Med. 311, 496-501(1984)).
펩신처리없이 생산된 다른왁찐들은 이 결점을 갖지 않는 것같다(Desmyter, J.In Viral Hepatitis and Liver Disease(sds Vyas, G.N., Dienstag, J. L. ＆ Hoofnagle, J ), in Press Grune and Stratton, Orlando, Fl, 1984)
[실시예 25]
HBV-특이성 단백질을 포함하는 제제의 RIA 시험 S-단백질에 대한 항체를 어피니티 크로마트그라피(Neurath,A.R., Trepo, C., Chen M., Prince, A N., J.Gen Virol., 30, 277-285(1976))에 의하여 HBV입자에 대한 토끼 항-혈청으로부터 제거하였다(제14도 참조). 시험항원은 HBsAg입자와 관형(●,▲), 혈장으로 부터 분리된 HBsAg의 대략 20nm 구형입자(○,△) : 그리고 펩신으로 처리한 후자의 입자(0.1M 글리신-HCl중의 1mg/ml HBsAg와 50ug/ml펩신, pH 2.2,37℃에서 2시간)(□). RIA 시험은 뉴래스, 켄트, 스트릭(neurath, A.R., Kent, S.B.H., Strick, N., Science, 244, 392-395(1984))에 의해 기재된대로 수행하였다.
HBsAg S-단백질의 농도는 RIA 시험(AUSRIA, Abbot 실험실)을 기준으로 시험한 모든 제재에서 같은수준으로 조절하였다. HBV입자(관형의 HBsAg로 오염된것) 를 스핑코(Spinco) 35회 전자에서 25,000rpm으로 4시간동안 원심분리에 의해 혈청을 대략 100배 농축시켰다. 농축액을 0.13M NaCl-0.01M 트리스-0.02% NaN3중의 20, 10 및 5% 수크로오스(w/w) 각각 11ml로 불연속 구배상에 두고 스핑코 회전자 SW27내에서 25,000rpm으로 16시간동안 원심분리하였다. 최종 펠릿을 TS에 재부유시켰다. HBV입자는 항-트리-S(120-145)로 피복되거나 또는 HBV 입자에 대한 토끼항체로 피복된 폴리스티렌비이드를 토대로한 RIA 시험에서 정재된 대략 22nm 구형 입자보다 훨씬 더 효율적으로 인식되었다.
HBsAg의 펩신으로의 처리는 어떠한 현행 B형간염 왁찐을 제조하는데 사용되는 단계인데, 항-프리-S(120-145)와의 반응성에 있어서 대략 103-배의 감소를 가져왔다. 감염된 혈장으로부터 유도되거나(Hilleman, M.R., et al, (1982) 위와같음), 또는 이스트에서 생산된(McAleer et al(1984), 위와 같음)왁찐으로부터의 HBsAg는 이들 시험에서 천연 HBsAg의 반응성의 /5.000이었다
역시험에는, HBsAg, HBV입자, 펩신-처리된 HBsAg 또는 상기한 왁찐에 해당하는 HBsAg로 피복된비이드를 이용하였다. 비이드와 반응하는 IgG항체(프리-S서열에 대한 다른 토끼항혈청으로부터 얻은 것)를 표지된 항-토끼 IgG의 잇다른 부착을 기초로 측정하였다. 천연 HBsAg 또는 HBV입자로 피복된 비이드로 된 것만 항-프리-S(120-145)를 사용하여 양성의 결과를 얻었다. 항-트리-S(12-32)는 오로지HVB-피복된 비이드와 반응하였다.
[실시예 26]
세포수용기에의 부착에 있어서 프리-S 유전자 코우드 HBV 영역의 수반
프리-S 단백질의 55C-말단 아미노산은 글루타르알데히드에 의해 중합화된 알부민(pHSA)에 대한 HBsAg의 부착을 중재하며 이 부착은 해파도사이트(hepatocytes)에 대한 HBV의 체내에서의 흡착에 있어서 필수적인 역할을 항이 제안되었다(Machida, A.et. al, Gastroenterology, 86, 910-918, (1984) : Machida, A. et. al, Gastroenterology, 85, 268-274. (1983)),
그러나, 간세포의 HBV에 의한 감염에 있어서 pHSA-HBV 상호작용의 역할을 지지하는 강력한 증거가없다. 게다가, 이들 55아미노산 잔기를 포함하거나 또는 그들 이 없는 HBsAg둘다 pHSA와 반응하는데(제15도), 반응이 프리-유전자코우드된 서열의 존재에 의해 향상된다.
제15도에 포함된 RIA 시험은 뉴래스, 스트릭(Neurath, A.R., Strick, N.Intervirology, 11, 128-132 (1979))에 의해 기제된대로 행하였다. HBsAg의 간세포와의 반응을 직접적으로 탐구하기 위하여 용해된 HBsAg에 대한 간세포의 부착을 기초로한 측정시스템을 개발하였다.
HBsAg(HBV)는 상기한 대로 프리-S(120-145)의 결합에 대해 기재된 조건하에 N-N'-P-페닐렌디말레이드-유도된 술포히드릴셀룰로오스에 부착되었다. 약 4mg의 HBsAg가 셀룰로오스유도체 1g에 결합되었다. 대조표분 셀룰로오스 유도체는 소혈청알부민을 활성화된 도체에 결합시킴으로써 제조하였다. 소혈청알부인 10mg/ml를 포함하는 TS에 부유된 셀룰로오스 유도체 40mg을 TS-BSA에 부유시킨 대략 2×106의 세착된 HepG2인 간암세포(Aden, D.P., Fogel, A., Plotkin, S., Damjanov, J., Knowles, B.B., Nature(London), 282, 615-617(1979)참조)와 혼합하고 37℃ 에 서 30분간, 이어서 4℃ 에서 1시간 인큐베이트시켰다. 헬라세포와 클론 9정상 쥐간세포(미국산 배양 클렉션)을 대조표분으로 사용하였다. 세포-셀룰로오스 혼합물을 33%(w/w) 히파크(Hypague) 1ml의 상부에 두고, 3,000rpm으로 2분간 원심분리하였다. 부착된 세포를 가진 셀룰로오스 유도체를 이들 조건하에서 펠릿화 하였다. 히파크-TS-BSA 중간층에서 회수한 미부착세포를 TS-BSA에 5배 희석시키고 원심분리에 의해 펠릿화하였다.
흡착된것과 미흡착된 세포의 상대적인 비율을, 청정제 Triton X-100(H2O중의 5mg/ml에 노출시킨 후 얻은 적당한 알리큇의 세포리신산염에서 락테이드 디히드로게나제(LDH) 활성을 측정함으로써 구하였다. LDH 활성은 진단용 킷트 No. 550(시그마)를 사용하여서 구하였다.
이 측정에서 대략 80 내지 95%인 간암 HepG2세포(Aden,D.P. 위와같음)가 비이동성 HBsAg에 부착되었다. 대조표준세포(Hela, 쥐 헤파로사이트)의 부착은 10 내지 20%의 범위내에 있었다. 약 10%의 HepG2세포가 대조표준셀룰로오스에 부착되었다. 항-프리-S(120-145)와 항-프리-S(12-32) IgG의 존재하에(15mg/ml), HBsAg-셀룰로오스에 대한 HepG2세포의 흡착은 각각 60과 30%로 감소되었다. 두 항체(각각 7.5mg/ml의 IgG)의 혼합물은 바탕수준과 구별되지 않을 정도의 20%까지의 세포흡착감소를 일으켰다.
S-단백질에 대한 항체)펩신-처리된 HBsAg로 면역하여 유도된것)뿐만 아니라 정상 쥐 IgG는 혈청중의 고수준의 항-HBs(AUSAB시험에서 10-6희석액에서 양성엄)의 존재이도 불구하고 세포부착을 감축시키지 못했다.
[실시예 27]
HBV에 대한 부분적으로 정제된 수용체의 세포배양 및 제조
(정상인 간 유조직세포의 생체합성능력을 갖는)사람의 간암 HepG2세포는 D.P.Aden, A.Fogel,S.Plotkin,I.Danjanov 및 B.B.Knowles, "분화된 사람의 간암-유도된 세포조", Nature, 282, 615-616(1979) 그리고 B.B. Knowles, C.C.Howe 및 D.P.Aden, "사람의 간세포성 암세포주는 주된 혈장단백질과 B형 간염 표면항원을 분비 한다", Science,209,497-499, (1980) 에 기술된 바와같이 전파되었다.
세포의 교회하는 단일층을 0.14M NaCl pH7.2인 0.01M 인산염(PBS)으로 2회 세척하고, 플라스크로부터 긁어모아 미리 냉각시킨(4℃) 0.025M HEPES, 0.05M KCl, pH 7.2인 2mM Mg 아세테이트, 1mM 디티오트레이톨, 10%(w/v)수크로오스에 재현탁시켰다. 10분후, 세포를 다운스(Dounce) 균질화기에서 80회 분쇄시켰다. 1,000rpm에서 10분간 원심분리에 의해 핵을 제거하였다. 이 세포질분율(H.F Lodish, N. Kong, N .Snider 및 G.J.A.M. Strous, "간암분비성 단백질은 특징적인 속도로 거칠은 소포체로부터 골기체로 이동한다", (Nature,304,80-83, (1983))을 HBsAg-HepG2세포상호작용의 연구에 있어서 억제제로서 사용하였다(제16도).
제16도는 사람의 간암 HepG2세포를 최적하게 인식하는 영역에 대한 HBV env 단백질의 프리-S 부분의 주사에 대한 결과를 나타낸다. 공유결합으로 부착된 HBsAg 아형 ad(패널A,B,C)나 아니면 합성펩티드 프리-S(21-47)(페널D)를 가진 셀룰로오스 유도체(40mg)를 10mg/ml 소혈청알부민(TS-BSA)과 만일 지시되어 있다면 억제활성을 차단하는 추가성분들을 함유하는 1ml TS(0.14M NaCl, 0.01M 트리스-HCl, 0.02% NaN3, pH7.2)에 부유시켰다.
이들 성분은 다음과 같다 : 4×106HepG2세포로부터의 핵없는 균질물, 어피니티 크로마토그라피-정제된 HepG2세포 "수용체"제제(1A280유니트); 항-"수용체"와 항-펩티드 항혈청(400μl); 및 합성 펩티드(C : 1mg ; D : 200μg), HepG2세포(2×106, 세척하여 1ml TS-BSA에 부유시킨것)를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 30분간 배양시키고 이어서 4℃에서 1시간 배양시켰다. 세포-셀룰로오스 혼합물을 33%(w/w)Hypaque(Stelling Organics, 뉴욕, NY 1ml의 상부에 층을 이루게 하고 3,000rpm에서 2분간 원심분리시켰다.
부착된 세포를 가진 셀룰로오스를 괠릿에서 회수시키고 Hypaque/TS-BSA 켸층에 존재하는 미부착원 세포를 TS-BSA에 5배 회석시키고 원심분리에 의해 폘릿화 시켰다
부착 및 미부착세포의 비율은 세정재 Triton X-100(물중에 5mg/ml)에 세포의 노출후 얻는 세포 용해질의 알키큇에서의 락테이트 디히드로게노우스(LDH)의 측정에 의해 구하였다. LDH는 시그마 진단키트 No.500을 사용하여 구하였다. 페널 A와 B에서 왼쪽막대의 상부위 수직선의 길이는 다섯 측정에 대한 평균값의 표준편차를 가리킨다.
부분적으로 정제된 HBV에 대한 수용체를 단리시키기 위해, HepG2세포 세포질분율(1ml,OD280=4)을 1mM CaCl2와 1mM MgCl2(TS-Ca-Mg)를 포함하는 TS로 미리 세척한 HBsAg-셀룰로오스 1ml 컬럼에 적용시켰다. 37℃에서 30분간 배양후, 4℃에서 1시간동안 배양시키고 칼럼을 유출액의 OD280이 제로에 접근할때까지 TS-Ca-Mg로 세척한 다음4M MgCl2로 용리시켰다. 원래 존재하는 2.4 내지 3.9%의 단백질을 포함하는 용출액을 TS에 대해 투석시키고 억제시험예(제16도) 항-수용체 혈청을 기르기 위하여 사용하였다. 후자의 목적을 위해, 토끼를 불완전 프룬드 보조액중의 수용체제제 800g으로 면역시키고 이어서 불완전 프룬드 보조액으로 2주 간격으로 4회 추가의 800μg 투여량을 제공하였다. 토끼를 마지막 항원 투여량의 투여 2주후 출혈시켰다.
[실시예 28]
펩티드-셀룰로오스 유도체의 펩티드 합성과 제조
C-말단부에서 추가의 Gly-Gly-Cys-아미드잔기를 갖는 HBV 외피 단백질 아형 adw2의 프리-S 영역에 해당하는 펩티드(짝지음의 편리상 담체에 첨가됨)을 최적화된 고체상기법에 의해 합성하였다(S.B.H.Kent and I. Clark-Lewis,"생물학적 활성펩티드의 화학적 합성을 위한 현대법, 생물학 및 의약의 합성 펩티드에서", K.Alltalo, P.Partanen 및 A.Vaheri, ads. (암스테르담 : Elsevier, pp.29-57(1985)).
사슬조립(S.B.H.Kent M. Riemen, M Le Doux 및 R. B. Merrifidld, 단백질 서열분석의 방법에 대한 제4회 국제심포지움의 회보에서 M.Elzinga ed.(Clifton, NJ : Humana), pp. 626-628, (1982)) 은 각 단계에서 99.5% 효율이상으로 진행되었다. 수지를 분열시킨 펩티드의 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)는 전행적으로 214nm에서 흡광도를 가진 물질85%에 해당하는 단일의 주 피이크를 나타내었다, 펩티드는 세파엑스 G-10 상에서 겔여과에 의해 더 정제되었다. 어떤펩티드는 반제제 HPLC에 의해 동질성으로 정제 되었다 셀룰로오스에 짝지음 하기 위해, 펩티드를 세파텟스 G-10상에서 크로마트그라피에 의해 저분자량 성분으로부터 분리된 2-메르캅토에탄올로 환원시키고(A.R.Neurath, S.B.H.Kent 및 N. Strick "바이러스 단박질의 단편과 공통의 서열을 갖는 합성펩티드에 의해 유도된 항체의 특이성, B형간염 표면항원", Proc Natl.Acad Sci. U.S.A., 79 ; 7871-7875, (1982)), N,N'-p-페닐렌-디말레이미드-활성된 SH-셀룰로오스와 혼합하였다. SH-셀룰로오스는 P.L.Feist, K.J. Danna, 술포히드릴셀롤로오스 : 수은화 폴리뉴클레오티드의 크로마트그래피를 위한 새로운 매질", Biochemistry, 20, 4243-4246(1981)의 과정에 의해 아미노에틸셀롤로오스로부터 제조하였다. 펩티드에 대한 토끼 항혈청은 담체로서 시스테인 활성화된 리포소옴을 사용하여 제조하였다.
[실시예 29]
HBsAg(HBV)의 제조 및 면역측정의 수행
HBsAg를 KBr 및 글리세롤 구배 각각에서 같은 밀도와 속도지대 원심분리의 조합에 의해 HBV 담체의 바다로부터 정제하였다(A.R.neurath, A.M. Prince 및 J.Glacalone, "어피니티 크로마토그다피를 사용하는 B형간염 표면항원의 대규모정제, Experlentla, 34, 414-415(1978). 혈청으로부터 펠릿학된 HBV는 불연속 수크로오스 구배에서 원심분리에 의해 정제하였다. W.S.Robinson, R.L. Greellnlan, "사람의 B형간염 바이러스 후보의 코어에서의 DNA 폴리머라제", J.Virok., 131231-1236 (1974)
HBsAg 및 HBV는 셀룰로오스에의 펩티드의 부착에 대한 상기한 방법을 사용하여 HBsAg-셀룰로오스에 연결시켰다. 페신처리된 HBsAg-셀룰로오스는 셀룰로오스 유도체를 37℃에서 2시간동안 펩신(50/'g/ml, pH2.2) 에 노출시킴으로써 제조하고 이어서 pH를 7.2로 조절하였다.
폴리스티렌비이드 또는 96-웰판의 웰을 HBsAg, HBV 및 별개의 합성펩티드 각각으로 면역측정을 위해 피복하였다. IgG에 대한것을 DEAE-셀룰로오스상의 크로마트그라피에 의해 단리시키고 요오드비이드(Pierce.Rockford, Illinois)를 사용하여128I로 표지시켰다. 면역화학적으로 정제된 항-프리-S (21-47)을 프리-S(21-47)-셀룰로오스 컬럼상의 어피니티 크로마트그라피에 의해 항혈청으로부터 프리-S(21-47)로 단리된 총 IgG로부터 제조되었다.
세척 및 용리 완충액은 각각 TS와 4M MgCl2이었다. 정제된 항체는 베타-릭타마제로 표지시켰다.
[실시예 27-29에 대한 결과]
간세포 수용체 인식부위에 대한 HBV Env 단백질의 프리-S 영역의 주사
예비측정에서, HBV 및 HBsAg-셀룰로오스로 비슷한 결과를 얻었고 HBsAg의 더 쉬운 유용성때문에 후자의 셀룰로오스로 곧이어 시험을 수행하였다.
HBsAg-셀룰로오스로의 세포의 부착은 항 수용체 항혈청(제16도, 패널A)에 의해서 뿐만 아니라 HBV에 대한 HepG2세포수용체의 거칠고 부분적으로 정제된 제제에 의해 차단시켰다.
HBsAg로부터 프리-S 서열을 제거하는것으로 공지된 HBsAg-셀룰로오스의 펩신으로의 전처리는 궁극적으로 HepG2세포를 흡착하는 셀룰로오스유도체의 용량을 궁극적으로 제거하였다.
세포수용체를 위한 바이러스 인식부위를 더 위치측정 하기위해 HBV env 단백질의 프리-S 부분의 서열을 프리-S서띨의 조각과 해당 항-폘티드 항혈청에 해당하는 합성펩티드를 사용하여 HepG2세포에 의해 인식된 영역에 대해 주사하였다.
프리-Sl-특이성 펩티드 1-21, 12-32, 32-53, 53-73, 94-177과 프리 S2-특이성펩티드 120-145 및 153-171에 대한 항혈청 가운데, 단지 프리-S(120-145), 프리-S(12-32) 및 프리-S(32-53)에 대한 항체만 각각 40%,70% 및 94%로 HBs-셀룰로오스에 대한 HepG2세포의 부학을 억제하였다(제16도, 패널 B). 따라서 단지 항-프리-S(32-53)만이 HepG2세포의 HBs-셀룰로오스에 대한 결합을 효율적으로 억제하였다. 그러나, 프리-S(12-32)와는 달리 프리-S(32-53)은 사람의 항-HBV에 의해 인식되지 않았고 토끼에서 단지 최저수준의 항-HBV를 이끌어내었다.
위에 나열한 펩티드는 하나도 사람의 항-HBV와 HepG2 세포 모두에 의해 효과적으로 인식되지 많음이 명백하였다. 그러므로, 프리-S(12-32)와 프리-S(32-53) 둘다의 서열을 부분적으로 겹치고 HBV 아형 adw2에 해당하는 펩티드프리-S(21-47) 을 합성 하였다(제17도 참조)
제17도는 HBV env 단백질과 그의 관련성의 계통적 표현이다 제17a도는 HBV env에 단백질을 코우드하는 HBVDNA에 대한 개방해독체계를 나타내고 HBV의 항원성 아형에 의존하여 389-400 아미노산(AA)으로 구성되는 단백질 코우드하는 용량을 갖는다.
가장 일찌기 확인된 HBV env 성분은 이 개방해독체계의 C 말단으로부터 유도된 226AA로 구성되는 25kD S-단백질이었다. (P.Channy, E.Mandart, A.Hampe, F.Fitoussi, P.Tiollais, F.Galibert, "B형간염 포면항원(HBsAg)의 주폴리펩티드를 코우드하는 유전자의 바이러스성 제놈과 뉴클레오티드 서열의 위치측정"Nucleic Acld Res, 7, 335-346, (1979) ; P.L.Peterso, I.M.Robelts 및 G.N. Vyas, "B형간염 표면항원의 두 주성분 폴리펩티드의 부분적인 아미노산 서열", Proc.Natl.Acad, Sici. U.S.A.74,1530-1534, (1977) 그것은 비글리고실화(P25) 및 글리고실화(GP 29)형태로 존재한다. 중간(M) 단백질(281 AA)은 HBV DNA의 프리-S2 영역에 의해 코우드된 55 추가의 N-말단 AA을 가진 S-단백질의 서열을 포함하고 두 별개의 글리코실화형태, GP33와 GP36으로 일어난다. 큰(L) 단백질(389 또는400AA)는 HBV DNA의 프리-S1 영역에 의해 코우드된 108 또는 119 추가의 N-말단 AA을 가진 M-단백질을 포함하고 비-글리코실화(P39) 및 글리코실화(GP42) 형태로 존재한다(K.H.Heemann, V.Goldmann, W.Schwartz, T.Seyfarth, H.Baumgarten 및 W.H.Gerlich, "프리-S 서열을 포함하는 B형간염바이러스의 큰 표면단백질", J.Virol., 52, 396-402(1984), P.Tiollais, P.Chanay 및 C.N.Vyas, "B형간염 바이러스의 생물학", Science, 213, 406-411. (1981) ; P.Tiollais, C.Pource1 및 A.Dejean ; "B형간염 바이러스", Nature, 317, 489-495, (1985) ; D.T Wong, N.Nath 및 J.J.Sninsky, "전적인 프리-S 개방해독체계에 의해 코우드된 B향간염 바이러스 폴리펩티드의 확인", J.Virol., 55, 223-231, (1985)). (제17b)도는 HBV의 5항원성 아형에 해당하는 L-단백질의 프리-S (21-47)영역의 아미노산 서열(HBV DNA 서열로부터 유도됨)을 나타낸다.
바닥선은 모든 5아형에 공통된 AA 잔기를 나타낸다. 프리-AS(21-47)에 대한 항혈청[=항-프리-S(21-47)]은 항-프리-S(32-53)만큼 효과적으로 HBs-셀룰로오스에의 HepG2 세포의 부착을 차단하였다(제16도 패널 B).
차단이 세포수용체 인식부위에 대한 항체의 직접결합에 기인함을 증명하기 위해, 펩티드 자체에 의한 HBsAg-HepG2세포 상호작용의 억제를 조사하였다. 프리-S(32-53)은 아니나 프리-s(21-47)은 반응(제16도, 패널 C)를 억제하였다. 프리-s(120-145)와 프리-S(12-32)는 억제성임이 발견되지 않았다. 더우기, HepG2 세포는 프리-S(21-47) 셀룰로오스에 부착되었고 부착은 동종의 펩티드에 의해 억제되었으나(제16도 패널 D), 프리-S(12-32)나 프리-S(32-53)에 의해서는 억제되지 않았다.
이들 결과는 (1)간세포에 대한 지배적인 결합부위가 HBV env 단백질의 프리-S1 서열에 위치되고 잔기 프리-S21과 프리-S47 사이에 놓이며, (2) 결합부위는 합성펩티드 유사체 프리-S(21-47)에 의해 모사되는데, 이것은 또한 항-HBV에 의해 인식되고 아래에 나타낸 바와같이 항-HBV 반응을 유도한다.
수용체 결합부위-특이성 시약 : 펩티드 프리-S(21-47)과 프리-S(21-47)에 대한 항혈청
프리-S(21-47)은 본래의 HBV(항-HBV)와 면역에 의해 토끼에서 기른 항체와 반응하였다. 제18도에 대해 기술된 바와같이 수행된 이중항체 RIA에서 항-HBV의 종말점 희석은 1/80,000이었다.
제18도는 리포소옴에 연결된 프리-S(21-47)을 가진 1차 면역 10주후 토끼의 혈청에서 동종의 펩티드 또는 HBV를 인식하는 항체의 측정의 결과를 나타낸다.125I-표지된 항-토끼 IgG를 사용하는 이중항체 RIA를 기술된 바와같이 수행하였다(Neurath et al. 1982, 위와같음), 희석된 대조표준혈청에 해당하는 계수를 항-프리-S(21-47)에 해당하는 계수로부터 빼었다.
펩티드는 또한 B형간염으로부터 회수된 어떤사람의 혈청에 존재하는 항체에 의해 인식되었다. 49항-HBs(항-S-단백질)-양성 개체중 28개는 제19도에 기술된 바와같이 측정한 검출가능한 항-프리-S1-특이성항체를 가쳤다.
제19도는 간세포에 대한 HBV결합부위에 대한 항체의 검출에 관련된다. 정상인 및 소혈청(TS-HB)의 각각 10%를함유하는 TS중의 혈청의 연속 3배 희석(400μl)을 20℃에서 30분간 HBsAg 4μg으로 배양시켰다. 혼합물을 항-프리-S(21-47) IgG로 피복된 폴리스티렌비이드에 첨가하고 측정을 제20도에 기술된 바와같이 완결하였다.
제20도는 간세포에 대한 HBV 결합부위의 발생에 대한 결과를 묘사한다. 정제된 HBV 또는 HBsAg(각각 20μg/ml)를 함유하는 제제 또는 TS-HB 중의 HBV 감염된 사람으로부터의 혈청의 연속 3배회석(400μl)을 항-프리-S(21-47)IgG로 피복된 폴리스티렌비이드로 20℃에서 하룻밤 배양시켰다.
비이드를 세척하고 항-프리-S(21-47) IgG-베타-락타마제 콘주게이트로 37℃에서 2시간동안 배양시키고 1mg/ml트윈 20(TS-HBT)를 함유하는 pH 7 6인 TS-HB중의 240ng/ml Ig의 최종 농도로 희석시켰다. 비이드와 관련된 베타-락타마제 활성을 측정하였다.
흡광도 해독은 항원의 증가하는 양에 따라 감소하고 이것은 기질의 탈색에 의한 효소학적 활성의 측정에 기인함이 주목된다. 프리-S(21-47)은 동종의 펩티드 및 HBV를 둘다 인식하는 항체를 토끼에서 유도하였다(제18도). 항-HBV는 프리-S(21-47)과 항-프리-S(21-47)간의 반응을 거의 완전히 억제한다(제19도)는 발견은 합성펩티드를 인식하나 본래의 HBV env 단백질은 인식하지 않는 항-펩티드항체의 상당한 개체수의 부재를 제안한다.
항-프리-S(21-47)은 L-단백질(제21도)에 해당하는 HBV(제17도)의 31 및 41kD 성분을 선택적으로 웨스턴 블럿에서 인식하였고 본래의 HBV입자(제22도)를 접합시켰다. 제21도는 HBsAg의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 묘사한다. 분리된 HBsAg 폴리펩티드를 패널 a 자체에서 은으로 더럽히거나(J.H.Morrissey, "폴리아크릴아미드겔에서의 단백질에 대한 은 오점 : 향상된 균일한 감도의 수정된 방법, Anal. Biochem., 117. 307-310, (1981)) 또는 니트로셀룰로오스에 이동시키고 항-프리-S(21-47)과 반응시키고 이어서125I-표지된 항-토끼 IgG(b)와 반응시켰다.
전기영동과 웨스턴 이동을 위한 조건은 전기한것들과 비슷하였다. 사전면역혈청으로부터의 IgG는 HBV env 성분중 어떤것도 인식하지 않았다.
제22도는 항-프리-S(2l-47)에 의한 HBV의 면역침전을 묘사한다. 약 50μg의 HBV와 2mg의 항-프리-S(21-47)IgG는 (TS 0.5ml에 각각) 5,000rpm에서 10분간 원심분리에 의해 정화하고 37℃에서 30분간 배양하고 이어서 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 혼합물을 TS 중의 15% 글리세롤 1ml의 상부에 층을 이루고 10,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 펠릿을 0.14M NaCl, pH7.2인 0.01M 인산염에 용해시켰다. 알리콘을 탄소피복된 그리드에 퇴적시키고 pH7.3인2%인 텅스텐산염으로 오염시키고 전자현미경으로 관찰하였다(a ; 막대길이=100nm).
같은 알리콘의 부유된 펠릿, 상징액 용액 및 HBV의 원래 제제를 각각 스포트혼성에 의해 HBV DNA에 대해 각각 측정하였다(J.Brandsma 및 G.Mlller, "핵산 스포트혼성 : 업스테인-바르 바이러스성 DNA에 대한 림포이드 세포주의 빠른 정량적 차페", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 6851-6855(1980)). (패널 b) HBV의 침전은 사전면역혈청으로 발견되지 않았다.
HBsAg-양성혈청의 감염에 대한 표식으로서 수용체결합부위-특이성 서열
다른 개체로부터 단리된 HBsAg 입자는 프리-S2 서열의 그들의 성분과 다르다(W .Stibbe 및 W.H.Gerlich, "다른 공여체로부터 B형 간염 표면항원의 변동하는 단백질 조성", Virology, 123, 436-442(1982)).
프리-S1 서열뿐만 아니라 프리-S2의 존재량은 HBsAg와 비교하여 정제된 HBV에서 일반적으로 더크다(Heermann et al, 1984, 위와같음). HBV-감염된 개체의 혈청으로부터 유도된 샘플에서 수용체 결합부위-특이성 서열의 존재량을 더 산정하기 위해 항-프리-S(21-47)을 기준으로 한 효소 표지된 면역측정(ELISA)을 개발하였다. 수용체 결합 부위-특이성 서열은 HBsAg에서보다 HBV에서 더 풍부하였고 HBeAg-음성(=항-HBe-양성) 헐정과 비교하여 HBsAg-양성혈청에서 더 풍부하였다. (제20도), HkAg의 존재는 혈청중의 전염성 HBV의 존재와 크게 상관된다(로빈슨, 1983 위와같음에 요약됨). 프리-S1 서열과 HBeAg의 존재사이의 상관관계가 있는지 확립하기 위해, 혈청견본 형 80 HBV 담체를 이하의 표2에 기술된 바와같이 차단시켰다.
결과는 이들 혈청중의 검출가능한 프리-S1 서열의 존재는 HBeAg의 존재와 상관되고 HBV DNA의 존재에 의해 나타낸 바 전염성과 상관됨을 증명하였다. 급성 HBV 간염에 걸린 개인으로부터의 연속적인 혈청견본은 또한 별개의 B형간염 표식에 대해 차단시켰다. 프리-S1 서열은 HBeAg와 HBV DNA의 피이크수준과 동시에 검출가능하였다(제23도).
제23도는 급성 B형간염에 걸린 개임의 혈청에서 별개의 B형간염 표식의 출현의 시간경과에 관한 것이다.
HBsAg, HBsAg에 대한 항체(항-HBs), B형간염 코어항원에 대한 항체(항-HBc) 및 Be형간염 항원(HBeAg)을 상용 방사면역측정(RIA) AUSRIA, AUSAB, CORAB 및 HBe 진단키트(아보트, 노오스시키고 일리노이주) 각각을 사용하여 측정하였다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 엔즈트레이트키드(Enztrate Kit, Beckman, Fullerton, Califonia)를 사용하여 분광 광도켸로 시험하였다.
간세포에 대한 HBV 결합부위는 제20도에 기술된 바와같이 10 내지 20배의 희석된 견본으로 RIA에 의해 측정하였다. 양의 샘플은 프리-S1+로 표시한다. HBV DNA는32P-표지된 니크-변역된 HBV DNA를 사용하여 스포트 혼성(Brandsma 및 miller, 1980, 위와같음)에 의해 10ml 혈청시료에서 측정하였다. 양의 시료는 제22도의 상부에서 +로 표시한다.
[표 2]
HBV에 대한 간세포 수용체인식부위와 HBV 전염성에 대한 두 혈청표식, HBeAg와 HBV DNA에 대한 면역 측정의 결과간의 상관관계
Figure kpo00020
혈청 견본은 제22, 20 및 23도에 기술된 바와같이 HBeAg, HBV DNA 및 프리-S(21-47)서열[프리-S1+]의 존재에 대해 측정하였다.
[실시예 30]
A. 일반적인 접근
서열 프리-S(120-145)(아형 adw2), Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Thr-Leu-Gln-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly의 다른 부분에 각각 해당하는 펩티드과를 공지된 방법(Clark-Lewis 및 Kent, 1985, 위와같음)에 따라 화학적으로 합성하였다. 결과 펩티드의 항원성을 토끼 항(120-145)펩티드 항혈청을 사용하여 어떤 경우에는 토끼 항-HBV 항혈청을 사용하여 평가하였다. 둘다 직접적인 결합측정 및 용액경쟁측정을 사용하였다,
B. "반(Halves)"겹침
120-145영역의 N-말단 프리-S(120-134)-Gly-Gly-Cys, C-말단 프리-S(134-145)-Cys 및 "중간" 프리-S(128-139)-Gly-Gly-Cys 절반에 해당하는 세 펩티드를 만들었다. 이들 펩티드를 세가지 별개의 측정 즉, 용해성 RIA, 펩티드 피복웰로 한 이중항체 RIA, 프리-S(120-145)에 대한 용해성 경쟁측정으로 전길이 펩티드 프리-S(120-l45)에 대해 항혈청으로 면역반응에 대해 차단시켰다. 용해성 경쟁측정(제24a도)에서, 펩티드 프리-S(128-139)는 전길이 펩티드와 구별할 수 없는 결과를 가져온 한편 다른 두펩티드는 단지 매우 약하게 반응하였다. 이중항체 고체상 측정(제24도)에서, 프리-S(128-139)는 또한 펩티드간의 구별이 감소되었을지라도, 세개의 더 짧은 펩티드중 가장 강하게 반응하는 것이었다. 억제 연구는 모든 세펩티드가 펩티드 프리-S(120-145)의 그의 동종의 항혈청에의 결합의 상당한 억제를 일으키나 단지 전길이 펩티드보다 10 내지 1000배 더큰 농도에서 일어나는 명쾌한 결과를 제공하지 않았다. 모든 세개의 짧은 펩티드의 "칵테일"을 토끼항-HBV 항혈청에의 프리-S(12Q-145)의 결합을 억제하는 능력에 대해 평가하였다. 프리-S(120-145)펩티드 자체로보다 약 5배 더 높은 농도에서 상당한 억제가 관찰되었다.
결합데이타는 만일펩티드 프리-S(120-145)에 단일의 짧은 B-세포 에피토우프가 있고 항체결합부위가 영역 프리-S(128-139)내에 전적으로 위치되고 만일 잔기 프리-S 134에 대한 본래의 서열이 높은 친화도 결합에 대해 필수적이라면 가장 간단히 해석된다.
C. 8-잔기펩티드의 분기
B-세포연속 에피토우프가 6 내지 8 아미노산잔기로 구성된다는 가정하에, 움직이는 프레임 이동방식으로 전영역 프리-S(120-145)를 덮는 길이로 8잔기 즉 19펩티드의 과를 합성하고 펩티드 프리-S(120-145)에 대한 항혈청과의 면역반응성을 평가하였다. 각 펩티드를 원하는 펩티드 서열이 조립되기 전에 Ala 잔기로 씌워진 두개의 6-아미노헥사노익산으로 구성되는 스페이서를 사용하여 아미노프로필-유도된 유리섬유 필터 페이퍼 디스크상에서 수정된 고체상 화학에 의해 합성하였다.
토끼 항-프리-S(120-145)를 가진 각 8-잔기서열의 면역반응성을 펩티드-디스크상에서 직접 RIA에 의해 구하였다. 단지 2펩티드가 명백히 확인되었다. 프리-S(132-139) 및 프리-S(129-136)(제25도). 이 실험을 일반구조 Ac-(8-잔기)아미드의 유리펩티드로서 합성된 같은 과의 8-잔기펩티드로 반복하였다. 이들 펩티드는 플라스틱 미소적정판의 웰의 알칼리성 완충액에 내려 놓고 또한 토끼 항-프리-S(l20-145)와의 면역 반응성을 차단시켰다. 단지 2펩티드가 명백히 확인되었다 : 프리-S(132-139)와 프리-S(130-137)(제25도).
제25도는 토끼 항-프리-S(120-145)로 측정한 서열 프리-S(l20-145)를 커버하는 8잔기펩티드에 관한 것이다.
하부선(○) : 유리섬유디스크에서 합성되고 그 자리에서 측정된 펩티드. 항혈청의 희석 : 1 : 200.
상부선(●) : 알칼리성 용액에서 미소적정 웰에 놓인 유리 펩티드. 항-혈청의 희석 1 : 1000.
각 경우에 바사표지된 염소 항-IgG를 사용하는 이중항체 RIA.
D. 펩티드의 "성장"
서열 프리-S(138-145)(Cys)아미드로 출발하여 프리-S(120-137)서열로부터 추가의 아미노산을 첨가하여 각각의 새로운 펩티드를 형성하여 세번째과의 19펩티드를 합성하였다. 이들 펩티드는 미소적정잔웰에 놓고 토끼 항-프리-S(120-l45)로 면역반응성을 차단하였다. 이 측정에서 도리어 불량한 구별이 있었는데, 이것은 프리-S(132-145)에 의한 결합에 있어서 50% 증가와 이어서 같은 수준의 결합의 플라토가 나타난 다음에 마지막 세잔기로서 결합하는데 50%더 증가가 첨가되었다.
직접 결합측정이외에, 용액에서 프리-S(120-145)-베타-갈락토시다제에 대한 항-프리-S(120-145)나 아니면 토끼 항-HBV의 결합을 억제하기 위해 "성장하는" 펩티드를 사용하여 일련의 억제연구를 수행하였다. 이들 데이타는 훨씬 더 명쾌하였다(제26도).
제26도는 토끼 항-프리-S(120-145)항혈청(●) 또는 로끼 항-HBV 항혈청(○)으로 프리-S(120-145)-베타-갈락토시다제 콘주제이트를 사용하여 용액에서 수행한 억제측정을 묘사한다. 과량의 표시된 펩티드를 β-갈락토시다제와 그의 항혈청에 대한 프리-S(120-145) 펩티드 콘주게이트와 사전 배양시키그 이어서 단백질 A침전시키고 침전에 존재하는 베타-갈락토시다제를 구하였다.
결과는 직접 결합측정(제25도)에서 얻은것과 유사하나 훨씬 더 명백한 형태이다. 즉, 잔기 132의 첨가는 제로에서50%까지 억제를 상승시켰고 마지막 세잔기의 첨가는 더이상의 증가를 일으켜 그의 균일한 펩티드와의 항-펩티드 항혈청의 반응의 억제를 완결시킨다. 항-HBV는 훨씬 더 극적인 결과를 가져왔다. 즉, 잔기 프리-S 134, 프리-133 및 프리-S 132의 첨가는 억제수준을 약 90%로 상승시켰다. 펩티드 사슬의 더 이상의 연장은 단지 고정된 증가를 이끌어 항-바이러스 항혈청의 프리-S(120-145) 펩티드와의 반응의 억제를 완결시킨다.
이들 결과는 항-프리-S(120-145) 펩티드 항혈청이 펩티드의 C-말단이 요구되는 에피토우프에 대해서와 잔기 프리-S(132-145)간의 에피토우프에 대하여 거의 같은 양으로 관련된 항체를 포함함을 가리킨다. 항-HBV 항-혈청은 반면에, 펩티드의 N-말단에 대한 어떤항체 및 현저하게 잔기 프리-S(132--145)사이에 결합하는 항체가 있다면 조금밖에는 포함하지 않는것 같다.
E. 짧은 펩티드의 면역화학적 반응성
전체적으로, 위에 보고된 데이타는 토끼 항-HBV에 대해 영역 프리-S(l20-145)에 대한 주 항체결합부위가 잔기 프리-S(132-137)내에 지배적으로 크게 편재됨을 가리킨다. 토끼 항-프리-S(120-145)의 항체의 약 50%가 또한 이영역에 관련된다. 그러므로, 출원인은 서열 프리-S(132-137) 즉 Gln-Asp-pro-Arg-Val-Arg의 항원성 및 면역원성을 조사하였다. 먼저, 면역원성 담체 단백질에의 콘주게이션을 위한 스페이서를 서열 즉, Ac-프리-S(132-137-Gly-Gly-Cys-아미드와 Cys-Gly-Gly-프리-S(132-137) 아이드의 어느한 단부에 놓았다 또한, 프로(134)는 Gly로 대 치되었다. 즉[Gly(134)]Ac-프리-S/132-137)-Gly-Gly-Cys-아미드, 펩티드는 KCH에 콘주게이트되었고 토끼에 주사하였다.
모든 세가지 결과는 항-펩티드 항혈청은 1 : 10,000 희석비로 전길이 펩티드 프리-S(120-145)와의 양호한 교차반응성을 나타내었다. 역실험에서, 1 : 10,000 희석비에서의 항-프리-S(120-145)는 모든 세개의 짧은 펩티드를 인식하였다. Cys-Gly-Gly-프리-S-(132-137)아미드에 대한 가장 강한 인식은 프리-S-(120-145)에 대한 항-프리-S(120-145)의 인식의 약 50% 이었다. 프로(134)에 대한 Gly의 치환은 감소하였으나 인식을 페지하지는 않았다. Cys-Gly-Gly 및-Gly-Gly-Cys-아미드 서열을 포함하는 미관련 펩티드로한 대조표준실험은 이들 스페이서 서열의 직접인식을 기준으로 교차반응성이 없음을 나타내었다.
위의 데이타는 HBV 외피의 L-및 M-단백질의 프리-코우드된 영역에서 주항체결합부위가 env 유전자 개방해독체계의 잔기 프리-S(132-137)을 중심으로 함을 확인한다. 홍미있게도 단백질서열의 이부분의 잔기 프리-S(125-l42)는 잔기 프리-S 132, 프리-S 133, 프리-S 135, 프리-S 136 및 프리-S 137이 한 조각의 극성잔기를 형성하는 면과 양친매성(amphiphilic) 헬릭스를 형성한다.
본 명세서 및 청구범위는 예시로서 제안하였고 제한을 의미하지 않음과 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 여러가지 수정과 변화를 할 수 있음은 인정해야 할 것이다.

Claims (14)

  1. HBV의 외피의 프리-S 유전자 코우드된 영역내에 적어도 6연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하는 펩티드로 이루어지는 B형간염 펩티드 면역원에 있어서, B형간염 바이러스의 천연발생 외피단백질에 해당하는 아미노산서열이 없는 상기 펩티드 면역원으로서, 여기서 펩티드는 프리-S(12-47), 프리-S(21-47), 프리-S(120-153), 프리-S(132-137), 프리-S(53-73) 및 프리-S(128-139)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B형간영 펩티드 면역원.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 프리-S(12-47)인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 프리-S(21-47)인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 프리-S(120-153)인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 프리-S(132-137)인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 프리-S(53-73)인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 프리-S(128-139)인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원.
  8. (a) 바이러스의 외피유전자 생성물에 해당하는 복수의 다른 펩티드를 합성하는 단계와, (b) (a)단계의 펩티드에 대한 항체를 기르는 단계, (c) 펩티드가 세포 바이러스 수용체에 결합하는지와 펩티드와 항펩티드 항체가 바이러스와 세포표면의 반응을 억제하는지를 확인하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 펩티드가 바이러스 중화항체를 유도할 것인지를 결정하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 3개 이하의 아미노산을 갖고 있고 그 일단에 Cys을 포함하고 있는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원.
  10. 제9항에 있어서, 서열은 상기 펩티드의 C말단에서 Gly-Gly-Cys인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원
  11. 제9항에 있어서, 서열은 상기 펩티드의 N말단에서 Cys-Gly-Gly인것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원.
  12. HBV의 외피의 프리-S 유전자 코우드된 영역내에 적어도 6개의 연속 아미노산에 해당하는 아미노산 사슬을 포함하고 있는 펩티드로 되어있고 B형간염 바이러스의 자연발생 외피단백질에 해당하는 아미노산 서열이 없는 B형간염 펩티드 면역원으로서, 상기 펩티드가 3개 이하의 아미노산을 갖고 있고 그 일단에 Cys를 포함하고 있는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 B형간염 펩티드 면역원.
  13. 제12항에 있어서, 서열은 상기 펩티드의 C말단에서 Gly-Gly-Cys인것을 특징으로 하는 B형간염 면역원
  14. 제12항에 있어서, 서열은 상기 펩티드의 N말단에서 Cys-Gly-Gly인것을 특징으로 하는 B형간염 면역원.
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