JPS58194897A - 新規ｄｎａ，その製造方法およびそれで形質転換させた宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なり　Ｎ　Ａに関する。さらに詳しくは
、本発明は、遺伝子操作の手法により創製しｆｔニー　
ａ　ｄ　ｗ型Ｂ型肝炎つィルスの表面抗原構造遺伝子２
表面抗原前駆体をコードする遺伝子およびコア抗原構造
遺伝子の１種以上を含有するＤＮＡに関するものである
。

ヒトＢ型肝炎は、Ｄ　Ｎ　Ｉ＋ウィルスの１種であるＢ
型肝炎つィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ
　；以下、ＨＢＶと略称することもある）の感染によっ
て発症する。ＨＢＶは、デン粒子としてその性状が知ら
れておシ、このウィルス粒子の表面にはＨＢＶ表面抗原
（以下、ＨＢｓＡｇと略称する）、粒子内部に一部分単
鎖部分をもつ二重鎖環状ＤＮＡ、ＨＢＶコア抗原（以下
、ＨＢｃＡｇと略称する）、ＨＢＶ　　ｅ抗原（ＨＢｅ
Ａｇ　）が存在し、また二重鎖ＤＮＡの単鎖部分を修復
する酵素として内在性ＤＮＡ合成酵素の活性が検出され
ている。ＨＢＶＤＮＡは分子量２．　ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏダ
ルトンで約３２００の塩基対を有する。ＨＢｓＡｇの抗
原性は共通抗原のａ’（ｉ７中心にａｄ、ｒ　、ａｄ　
ｗ　、ａｙｒ　、ａｙｗの４種類が知られており、この
うちａｙｗ型ＨＢ　Ｖ３− はＤ　Ｎ　Ａ　４基配列がすでに決定されており、その
ＨＢｓＡｇ構造遺伝子およびＨＢｃＡｇ構造遺伝子のゲ
ノム上の位置も決定されている。しかし、ａｄＷ型構造
遺伝子についてはＤＮＡ塩基配列もゲノム上の位置も知
られておらず、またこれを含む組換えＤＮＡの創製に成
功したとの報告もなされていない。

ＨＢｓＡｇおよびそのＡｆＪ駆体（ｐｒｅＨＢｓＡｇ　
）はＨＢＶの感染防御のためのワクチンとして使用可能
であり、この目的のためにはＨＢＩＪ子の混在しないＨ
ＢｓＡｇ、ｐ＋ｒｅＨＢｓＡｇを得ることが望まれる。

また、ＨＢｃＡｇは、ＨＢＶ感染の早期診断の念めの診
断用試薬として使用できる。すなわちＩ（Ｂ■に感染す
ると抗ＨＢｓ抗体が血中に現われる前に、抗ＨＢｃ抗体
が出現するので、これを検出することによすＨＢＶ感染
の有無を早期に判定できる。このＨＢｃＡｇを得るには
一度デン粒子を集め、この中のＨＢｃＡｇｅ分離しなけ
ればならない。しか１７、ダン粒子中に含まれるＨＢｃ
Ａｇｉｌ″ｔ＠量であ４− るため、これを大皿に得る方法の確立が望まれていた。

本発明者らはかかる技術的背景の下に鋭意研究した結果
、ａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡを単離し、ａｄ、　ｗ型Ｈ
ＢｓＡ、ｇ構造遺伝子（以下、ａ、　ｄ　ｗ型ＨＢｓＡ
ｇ遺伝子と略称する）、ａｄｗ型ｐｒｅＨＢＢＡｇをコ
ードする遺伝子（以下、ａｄｗ型１）ｒｅＨＢｓＡｇ遺
伝子と略称する）、ａｄｗ型ＨＢＣＡｇ構造遺伝子（以
下、ａｄｗ型ＨＢｃＡｇ遺伝子と略称する）を含む組換
えＤＮＡの創製に成功した。さらにこのａ、　ｄ、　ｗ
型ＨＢＶ　　ＤＮＡの全塩基配列全決定するとともに、
上記した各遺伝子のＤＮＡ１ｎ基配列ならびにゲノム上
の位置を決定した。これにより、組換えＤＮＡで形質転
換させた宿主を培養して■ＢＹ粒子の混在しないＨＢｅ
Ａｇ　、ｐｒｅＨＢｓＡｇならびにＨＢｃＡｇｅ大量に
生産する途を開いた１゜すなわち、本発明は、ｔｌ　ｃ
ｌ、　ｖｉ型ＨＢｓＡｇ遺伝子。

ａｄｗ型ｐｒｅＨＢｓＡｇ遺伝子およびａｄｗ型ＨＢ　
ｃＡｇ遺伝子の１種以上を含有するＩ）　ＩＪ　Ａとり
わけ組換えＤＮＡ、それらの製造法ならびに当該組換え
ＤＮＡで形質転換させた宿主を提供するものである。

本発明ＤＮＡの好ましい態様は、第１図に示される塩基
配列またはその断片を有するものである。

第１図はＨＢＶ　　ＤＮＡの二重鎖全塩基配列をＥｃｏ
Ｒエサイトから順番に示したものである。この第１図に
おいては、塩基配列１１［序１５５〜８３５として示さ
れる塩基配列がＨＢｓＡｇ遺伝子の塩基配列であり、塩
基配列順序２８４９〜３１８３〜１〜８３５がｐｒｅＨ
ＢｓＡｇ遺伝子の塩基配列であり、塩基配列順序＋８８
４−２４４１がＨＢｃＡｇ遺伝子の塩基配列である。

他の観点における本発明ＤＮＡの好ましい態様は、ＨＢ
ｓＡｇ遺伝子が第２図に示されるポリペプチドまたはそ
れと等価の免疫学的もしくは生物学的活性を有するボリ
ベフ゛チドをコードするものであり、またＨＢｃＡｇ遺
伝子が第３図に示されるポリペプチドまたはそれと等価
の免疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプチド
をコードするものである。本発明ＤＮ、Ａは、これらの
ポリペプチドをコードしうるかぎシ、ＨＢｓＡ、ｇ遺伝
子として上記配列順序１５５〜８３５で示される塩基配
列の断片を有するものであってもよく、まｆｃ　ＨＢ　
ｃＡＥ遺伝子として配列順序１８８４〜２４４１で示さ
れる塩基配列の断片を有するものであってもよい。

本発明のＤＮＡＩプロモーターの下流に連結されている
ことが好ましい。かかるプロモーターとしては、たとえ
ばトリプトファン（Ｔｒｐ）７’Ｉ：Ｉ−Ｆ＝−ター、
ラクトース（Ｌａｃ）プロモーター、蛋白質鎖伸長因子
Ｔ　ｕ　（ｔｕｆＢ　）プロモーターなどが挙げられ、
とシわけｔｒｐｌロモーターが好適である。

本願明細書および図面で用いる記号の意義は第１表に示
すとおりである。

“′、以下余白） ７− 第　　　１　　　表 ］）　Ｎ　Ａ　　　　　デオキシリボ核酸Ａ　　　　　
アデニン Ｔ　　　　ナミン Ｇ　　　　　グアニン Ｃシトシン ｄＡ’Ｉ’Ｐ　　　　　デオキンアデノンン五リン酸ｄ
Ｔ’Ｊ’Ｐ　　　　　デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴ
Ｐ　　　　　デオギシグアノンン三リン酸ｄＣＴＰ　　
　　　デオキシシチジン三リン酸ｄｄＡＴＰ　　　　ジ
デオキシアデノシン三リン酸ｄｄ’ｌ”ＩｉＰ　　　　
ジデオキンチミジン三リン酸ｄ、　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ　　
　　ジデオキングアノンン三リン酸ｄｄＣＴＰ　　　ジ
デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ　　　　　アデノシン
三リン酸 ＥＤＴＡ　　　　　エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　
　　　　ドデシ／Ｉ−／硫酸ナトリウムＧ１ｙ　　　　
グリシン Ａｌａ　　　　　アラニン Ｖ　ａ、　１　　　　バリン ８− Ｌｅｕ　　　　　ロイシン エ１ｅ　　　　イソロイシン Ｓｅｒ　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　スレオニン Ｃｙｓ　　　　　　シヌテイン Ｍｅｔ　　　　　メチオニン Ｇｌｕ　　　　　クルタミン酸 Ａｓｐ　　　　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　　　リジン Ａｒｇ　　　　　アルギニン Ｈ１日　　　　ヒスチジン Ｐｈｅ　　　　　フェニルアラニン Ｔｙ　ｒ　　　　　ｆ　＋］シン Ｔｒｐ　　　　　　）リプトファン Ｐｒｏ　　　　　プロリン Ａｓｎ　　　　　アスパラギン Ｇｌｎ　　　　　グルタミン 本発明のａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子、ｐｒｅＨＢｓＡｇ
遺伝子または（および）ＨＢｃＡｇ遺伝子を含むＤＨＡ
Ｉｄ、たとえばａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡ’！ｉクロ−
ユングすることによって得ることができる。たとえば、
第４図に示すように、その一部に単鎖部分をもつａｄｗ
型ＨＢＶのデン粒子ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ反応に
より完全な二重鎖ＤＮＡとした後、制限酵素ＥｃｏＲＩ
によシ切断する。一方、１ラスミドとしてのｐＢＲ３２
２Ｄ　Ｎ　Ａも同じ酵素ＥｃｏＲＩで切断し、両者ｋＥ
ｃｏＲ工部位で工部源せたもので大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈａ　　ｃｏｌｊ、　）χ１７７６株全形質転換さ
せることによりａ　ｄ、　ｗ型ＨＢＶＤＮＡをもつ組換
えＤＮＡ分子（ｐＢＦ３２２−ＥｃｏＲ工／ＨＢＶ９３
３）ｆ分離することができる。

次に、たとえばＨＢ８Ａｇ遺伝子を含む組換えＤＮＡを
得るには、上記ｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３
３を、第５図に示すように制限酵素Ｂ　ａ、　ｍ　Ｈ１
消化により断片化し、得られるＤＮＡ断片のうちａｄｗ
型ＨＢｓＡｇ遺伝子を含有する約１．４キロ塩基対（以
下ｋｂｐ　）のＤＮＡを分離し、これをｐＢＲ３２２の
ＢａｍＨＩ部位に結合させたフ“フスミド（ｐＢＲ３２
２−ＢａｍＨ工／ＨＢＶ９７１）　’ｆｒ得る。これで
大腸菌χ１７７６株を形質転換させる。このようにして
形質転換させたχｌ　７７６　／　ｐＢＲ３２２−Ｂａ
ｍＨＩ／ＨＢｖ９７１　′ｆ：培養するととにより上記
プラスミドを多量に得ることができる。当該プラスミド
はａ、　ｄ　ｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子を含むものであり、
これからさらに分子量の小さな組換えＤＮＡを得ること
もできる。

同様にして制限酵素ＢａｍＨ１によってＨＢｃＡｇ遺伝
子を含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡを分離し、ｐＢＲ３２
２に結合させた組換えＤＮＡを得ることができる。さら
にｐｒｅＨＢｓＡｇ遺伝子についても同様な操作が可能
である。

以下に、本発明のａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子、ＨＢｃＡ
ｇ遺伝子または（および）ｐｒｅＨＢｓＡｇ遺伝子を含
むＤＮＡを創製例に基づいてさらに具体的に説明するが
、当該創製例はなんら本発明を制限するものではない。

創製例 １、ａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡの調製 ａｃ１ｗ型ＨＢ　Ｖ　（Ｐｈｏｅｎｉｘ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓＤｉｖｉｓｉｏｎ　　、　　Ｃｅｎｔｅ
ｒ　　　ｆｏｒ　　Ｄｉｓｅａｓｅ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ
。

（Ｐｈｏｅｎｉｘ、　Ａｒ１ｚ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　）
より入手冨文献１〕接種後７３日目のチンパンジー（♀
１体重１２ｋｑ）から、その血中にＨＢｓＡｇが陽性と
なり、デン粒子の存在が電子顕微鏡で確認された血漿１
００譚ｌを採取、これをスビンコ５Ｗ２７　　ローター
（Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を使って遠心（２
４０００ｒｐｍ　、　１６時間、４℃）し、ａｄｗ型Ｈ
ＢＶを沈殿させた後、２０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｅ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，６）３０ｗ？に懸濁した。次に同条件（５Ｗ
２７０−ター、２４０００ｒｐｍ、ｌ　５時間、４℃）
で遠心してＨＢＶを洗い、血清成分を除去しＨＢＶを濃
縮した。この沈殿を５ｔｓｌの２０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）に懸濁し、ＤＮＡ合成反応に
使用するまで一２０℃で貯蔵した。

上記した沈殿０．８　ｙｔｔを使用し、Ｋａｐｌａｎら
の方法（文献２）に従い　３Ｈ−ｄＴＴＰを含む反応液
（１６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、
　　４０ｍＭＭｇＣＩ２．　ｌ　２０　ｍ　Ｍ　ＮＨ４
Ｃｌ、　０．３％２−メルヵプトエタ／−／Ｌ／、Ｑ、
５％／＝−テア）Ｐ−＋ｏ　、　１．ＯｍＭ　ｄＡＴＰ
、ｄ、ＣＴＰ、ｄＧＴＰ　）中で３７℃で１６時間イン
キュベートしてＨＢＶ　　ＤＮＡの単鎖部分を二重鎖に
した（文献３）。その際、酸不溶性画分への　Ｈ−ｄＴ
ＴＰの取り込みを指標にしてＤＮＡ合成反応を確認した
。得られた反応液を超遠心機（ペックマンＬ５−５０１
０−ター５ｗ５５を便用）で遠心（３５０００ｒｐｍ、
６時間、４℃）して、ＤＮＡ合成反応後のＨＢＶを沈殿
、採取し、１　ｍｌのＤＮＡ抽出用緩衝液（０，０２Ｍ
　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）　、　０．０２
　Ｍ　ＥＤＴＡ、、　１％８Ｄ８．プロディナーゼＫ　
（１ｑ／ｍｅ　）　）に懸濁し、３７℃で１６時間イン
キュベートした。次に０．０１ＭＴｒｉ８−ＨＣＩ　（
ｐＨ７，６）　、　０．　ｌ　Ｍ　ＮａＣ１および０．
００１Ｍ　ＥＤＴＡで飽和した１　ｍｌのフェノールで
２回線タンパク（文献４）を行い、水層部分をとシこれ
に０、２Ｍ　　ＮａＣ１，２，５倍量の９９％エタノー
ルを加えて、−２０℃でＨＢＶ　　ＤＮＡを沈殿させた
。

上記操作によシ、単鎖部分が修復された完全な二重鎖ａ
ｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡを得た。

２、ａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡのクローニング上記１．
によって得た二重鎖ａ、　ｄ　ｗ型ＨＢＶ　ＤＮＡを、
Ｄ、ＮＡ鎖の特定の部位を認識し単鎖の付着端を生じて
ＤＮＡを切断する制限酵素ＥｃｏＲＩにより、１００　
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、　７　ｍ
ＭＭｇＣ１２、５０ｍ　Ｍ　　Ｎａ、ＣＩおよび７ｍＭ
　　２−メルカフトエタノール存在下３７’Ｃで消化し
て、ａｄｗ型ＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＥｃｏＲＩ断片
を得た。一方、クローニンクヘクターには大腸菌のプラ
スミドｐＢＲ３２２（文献５　）を使用した。この１ラ
スミドは環状ＤＮＡで、その上にはテトラサイクリン耐
性およびアンピシリン耐性に関する二つの薬剤耐性遺伝
子が存在する。また、このプラスミドＤＮＡはＥｃｏＲ
Ｉにより１ケ所切断されるが、ＥｃＯＲ工切断箇所に他
のＤＮＡを組み込んでもアンピシリン耐性、テトラサイ
クリン耐性遺伝子は保存される。そこでＩ）ＢＲ３２２
ＤＮＡをＥｃｏＲ工消化して直鎖状ＤＮＡとしｆＣ後、
５′末端のリン酸基金アルカリ性ホスファターゼ処理に
より除去した（文献６）。このようにして得たａｄｗ型
ＨＢＶ　　ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは各々両端に
ＥｃｏＲＩ消化により生じた単鎖の付着端を有する。こ
れらのａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡＥｃｏＲ工断片と　ｐ
Ｂ’Ｒ３２２ＥｃｏＲ工断片とを混合し、５５　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ（ｐＨ７，６）　、　６．６　ｍＭ　
ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオスライトールおよび０．４
ｍＭ　ＡＴＰ存在下、１４℃でＴ＋ＤＮＡ！Ｊガーゼを
作用させてＩ）ＮＡを結合させた。得られた反応生成物
中にはｐＢＲ３２２由来の直鎖状ＤＮＡとａｄｗ型ＨＢ
Ｖ　　ＤＮＡが各々の両端にもつＥｃｏＲＩ付着端の塩
基の相補性により結合して生じた環状ＤＮＡが期待され
る。

この場合、ｐＢＲ３２２ＤＮＡは５′末端のリン酸が除
去されているためｐ１３２２　　ＤＮＡ自身が１本リガ
ーゼにより結合し、安定な環状ＤＮＡとなることはない
。そこで、７０　ｍＭ　ＭｎＣｌ３．３０ｍＭＣａＣｌ
２．４０ｍＭ酢酸ナトリウムからなる溶液（ｐＨ５，６
）によシ０℃で２０分間インキュベート（文献７）し、
同じ溶液１００μｌＫ懸濁した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈａ　　ｃｏｌｉ　）χ１７７６株（ＡＴＣＣ！１＆
１Ｌ３１２４４＋文献８）〔細菌数約５Ｘ１０　　）に
上記で得た反応液５μｌを添加し、０℃で６０分間イン
キュベートした。次に、この大腸菌を２０μｇ／ｍｌの
アンピシリン、５０μｇ／Ｍｔのチミジンおよび２０μ
ｇ／　Ｔｅ１ｌのジアミノピメリン酸を含むＬＢ寒天培
地（１４’当りバク））！Ｊ７”）ン１０ｇ、バクトイ
ースト抽出物５ｆ　、　ＮａＣ１，１０ｆ　。

グルコース０，８ｆを含む）上にまき、３７’Ｃで２日
間培養した。生じたアンピシリン剛性コロニー中、外来
性のＤＮＡを組み込んだ］）ＢＲ３２２プラスミドをも
つ大腸菌は“つまようじ”法（麹９）によシ選び出した
。すなわち、つまようじに付着させてとったコロニーを
１００μｌの可溶化溶液（１％８ＤＳ、１０％グリセロ
ール、０，０２ＭＥＤＴＡ、０．０４％キシレンシアノ
−）ｖ）に懸濁し、７０°Ｃ１１０分間熱処理した後、
１％アガロース電気泳動を行い、ｐＢＲ３２２よシ大き
いプラスミドをもつコロニーを選択、採取した。これに
ょシａ、　ｄ　ｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡのクローニングが
完成した。

３、　クローニングされたａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡの
性質 上記のようにしてクローニングされたａｄｗ型ＨＢＶ　
　ＤＮＡの大きさをしらべるため、上記２゜項で採取し
た組換えＤＮＡｔ−有する大腸菌を２０μｇ／＊ｌのア
ンピシリン、５０μｇ／ｇｉ！のチミジンおよび２０μ
ｇ／ＩＩｌのジアミノピメリン酸を含むＬＢ培地で増殖
させ、対数増殖期に１７０μｇ　／ｗｒｌになるように
クロラムフェニコールを加えて、数時間培養をつづけ、
プラスミドＤＮＡの増幅をはかった。次に、リゾチーム
、ＥＤＴＡ　、　ＳＤｓを用いて細菌をこわし、プラス
ミドＤＮＡを分離し、塩化セシウム密度勾配遠心法によ
り精製した（文献１０）。得られたプラスミドＩ）ｔＪ
ＡｉＥｃｏＲ工消化すると、全消化、　２　’１ｃｂｐ
のＤＮＡと４．３ｋｂｐのＤＭＡとに分かれた。４．３
　ｋｂｐ　　Ｄ　Ｎ　ＡはベクターであるｐＢＲ３２２
のＤＮＡであり、ａ　ｄ−ｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡとして
は３．２ｋｂｐ　（ＤＤ　Ｎ　Ａ　ｉｉミクロ−＝ング
されたことになる。このａｄｗ型ＨＢＶ３，２ｋｂｐＤ
ＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化すると約１．８ｋｂｐ
　　ＤＮＡ　、　ｉ、４ｋｂｐ　　ＤＮＡオヨび３゜ｂ
７）　　ＤＮＡに切断されることが判明した。上記のよ
うにして得たＨＢＶ３．２ｋｂｐ　　ＤＮＡとｐＢＲ３
２２１）ＮＡとの組換えＤＮＡ’ｉもつ大腸菌χ１７７
６株を大腸菌χ　１７７６／ｐＢＲ３２２−ＥｃｏＲＩ
／ＨＢＶ９３３と名づけた。さらに、上記の手法によっ
てｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ／ＩＪＢＶ９３３からＨＢＶ
ｌ、４ｋｂｐ　　ＤＮＡおよびＨＢＶｌ、８ｋｂｐＤ　
Ｎ　Ａ、　’ｉ尿採取、これらを上記２８項に記した方
法と同じ方法によりそれぞれｐＢＲ３２２ＤＮＡの３２
２ＤＮＡはＢａｍＨ工により１ケ所切断され、しかも切
断箇所はテトラサイクリン１制性遺伝子上に存在するの
で、ｐＢＲ３２２ＢａｍＨＩ部位に他のＤＮＡ１組み込
むと、このプラスミドをもつ大腸菌はアンピシリン調性
、テトラサイクリン感受性の性質を示し、他のＤＮＡを
組み込まないｐｉ　３２２をもつ大腸菌（アンピシリン
耐性、テトラザイクリン耐性）と容易に区別出来る。そ
こで大腸菌χ＋７７６’を上記のようにして形質転換さ
せて生じたコロニーの中からテトラサイクリン感受性の
コロニーを選択し、ついで゛つまようじ”法（文献９）
により外来性のＤＮＡ（ＨＢＶ　　ＤＮＡ断片）を組み
込んだｐＢＲ３２２フ”フスミドをもつ大腸菌全還び出
した（第５図参照）。ここに得られたＨＢＶ　　１．４
ｋｂｐ　ＤＮＡを組み込んだｐＢ′Ｒ３２２をもつ大腸
菌χ１７７６株を大腸菌χ　Ｉ　７７６／ｐＢＲ３２２
−Ｂａ、ｍＨＩ／ＨＢＶ　９７１　、ＨＢＶ　１，８ｋ
ｂｐ　］）ＮＡを組み込んだｐＢＲ３２２’ｅもつ大腸
菌１１７７６株全大腸菌χ１７７６／ｐＢＲ３２２−Ｂ
ａｍＨＩ／ＨＢＶ７００とそれぞれ名付けた。

さらに、前記した大腸菌χ１７７６／ｐＢＲ３２２−Ｅ
ｃｏＦｌ工／ＨＢＶ９３３から分胤した組換えＤＮＡｐ
ＢＲ３２２−ＥｃｏＲ工／ＨＢＶ９３３’ｅＥｃｏＲ工
で消化してＨＢＶ　　ＤＮＡ１切シ出し、これヲＴ＋リ
ガーゼで結合させて一度環状ＤＮＡとした。このＤＮＡ
を制限酵素ＡｖａＩで切断してｐｒｅＨＢｓＡｇ遺伝子
を含むＩ）　Ｎ　Ａ　’ｉ分離した後、Ｔ）ＢＲ３２２
のＡｖａＩサイトに組み込み大腸菌χ１７７６に形質転
換させ念。得られた２、２０７ｋｂｐのｐｒｅＨＢｓＡ
ｇＤＮＡをもむｐＢＲ３２２を持つ大腸菌χ１７７軸を
大腸菌χ１７７６／ｐＢＲ３２，２−Ａｖａ工／ＨＢＶ
　８００１９− と名づけた。

４、　　ａ、　ｄ　ｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子、ｐｒｅＨＢ
ｓＡｇ遺伝子。

Ｅ（ＢｃＡｇｉｉｉ伝千の同定 前記２項および３項でクローニングされたａ、　ｄＷ型
ＨＢＶ　　ＤＮＡ上に存在すると考えられるａｄｗ型Ｈ
ＢｅＡｇ遺伝子、ｐｒｅＨＢｓ　Ａｇ遺伝子。

ＨＢｃＡｇ遺伝子の位置を確認するため、このＩ）　Ｎ
Ａの全部の塩基配列を決定した。まず大腸菌χ１７７６
／ｐＢＲ３２２ＥｃｏｌＲ工／ＨＢＶ９３３株を前記３
項に記した方法によりふやし、クロラムフエニコー／Ｌ
’を用いてプラスミドＤＮＡ１増幅して、組換えＤＮ　
Ａ　ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３　　’ｅ抽
出、精製した。このＤＮＡ全ＥｃｏＲ工で消化し、１．
０％アガロ−スゲ）Ｖ電気泳動法によりｐＢＲ３２２（
７）ＤＮＡとＨＢＶ　　ＤＮＡ’ｉ分離して、３．２　
ｋｂｐのＨＢＶ　　ＤＮＡ１アガロースゲルより溶出し
た。

次にこの３．２ｋｂｐのＤＮＡの塩基配列をベセスダリ
サーチラボラトリーズ（米国）のＭ＋３−チェイン・タ
ーミネイティング・シーケンシング・システムを用いて
決定した（文献＋　１　、　＋　２．１３）。

２０− その概略は次の通りである。まず３４ｋｂｐ　　ＤＮＡ
を種々の制限酵素で切断しファージＭ１３ｍｐ７ＲＦ　
　ＤＮＡ（文献１３）の制限酵素切断部位に組み込みク
ローニングした後、大腸菌Ｋ１２株由来の、ＴＭＩ０３
株（文献１２）に感染させファージ粒子として成熟させ
る。このファージよりＨＢＶＤＮＡ断片（二重鎖）の一
方のＤＮＡ鎖を組み込んだ単鎖のファージＤ　Ｎ　Ａ　
’ｃ抽出、Ｖ４ｍし、これを鋳型に、組み込まれたＤＮ
Ａ断片に隣接する塩基配列と相補的な塩基配列をもつご
く短い単鎖ＤＮＡを１ライマーに、そしてｄＡ’ｌ’Ｐ
、ｄＴＴＰ　、ｄＧＴＰおよびｄｃＴＰ（１〜４種の基
質２ を　Ｐでラベルしておく）全基質としてＤＮＡ合成を行
う。この時適当な濃度のＤＮＡ合成阻害剤である４種の
ｄｃｉ　ＡＴＰ　、ｄｄＴＴＰ　、ｄ、ｄＧＴＰあるい
はｄ　ｄ　ＣＴ　Ｐ　’ｉ−各４加えて反応させると、
これらがＤＮＡにとり込まれた時点でＤＮＡ合成が停止
する。そこでＤＮｈ鎖ｆ単鎖に分け、８％アクリルアミ
トゲｌｖ電気泳動法およびラジオオートグラフィーによ
り分析すると、合成されたＤＮＡの長さによりその了末
端の塩基が決定される。このようにして決定されたＨＢ
Ｖ　　ＤＮＡの全塩基配列は第１図に示すとおりであっ
た。この第′１図ではＨＢＶ　　ＤＮＡの二重鎖塩基配
列をＥｃ　ｏＲエサイトから順番に示している３、この
塩基配列順序の１５５番目にａ　ｄ　Ｗ　５　ＨＢｓ　
Ａｇ　ｉｉＩ伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＡが、また
１８８４番目（Ｇ（Ｂ　ｃＡｇ遺伝子の翻訳開始コドン
ＡＴＧのＡが、２８４９番目にｐｒｅＨＢ　ｓ　Ａ、ｇ
遺伝子の翻訳開始コドンＡ’ＴＧのＡ（文献＋　４　、
　＋　５＃照）がそれぞれ見い出される。すなわち、Ｈ
ＢＶ　　ＤｙｑＡ＃ｉ基の塩基配列順序＋５５−８３５
がａ　ｔ−ｔ　ｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子。

＋８８４−２４４１がａ　ｄ、　ｗ型ＨＢｃＡｇ遺伝子
。

２８４９−３１８３−１−８３５がａｄｗ型ｐｒｅＨＢ
ｓＡｇｉｉｌ伝子である。この事実は、これらの遺伝子
から翻訳されるポリペプチドの分子量がそれぞれ約２５
０００　、約１９０００と約４３，０００であることを
示している。

このようにしてＨＢ　Ｖ　　ａ　ｄ　ｖｉ型のＤＮＡの
全塩基配列が決定され、ＨＢ　ｓ　Ａｇ遺伝子、ｐｒｅ
ＨＢｓ、Ａｇ遺伝子、ＨＢＣＡｇ遺伝子の位置が定めら
れた。このａｄｗ型ＨＢＶ　　ＤＮＡの全塩基配列は従
来報告されているａ　ｙ　ｗ　！！ｆｆの塩基配列と異
なり、また塩基数も異なっている。このａ　ｄ、　ｗ型
ＨＢｓＡｇｊｉ伝子は当然ながらａｙｗ型のＨＢＶのＨ
ＢｅＡｇ遺伝子とその塩基配列が異なり、第１図から明
らかなように遺伝子内に介在配列をもたない。またｐｒ
ｅＨＢｓＡｇ遺伝子、ＨＢｃＡｇ遺伝子についても同様
である。このことは動物細胞内および微生物内のいづれ
においても、そのまま転写され、メツセンジャーＲＮＡ
として形質発現しうろことを意味する。従って、この遺
伝子をそのままか、あるいは過当なベクターに組込み、
これを例えばカルシウム−燐酸法を用いて動物細胞たと
えばヒｌ−肝臓細胞内へ導入することにより、その細胞
内でａｄｗ型ＨＢ＋＋Ａｇ＋ＨＢｃＡｇｆ合成すること
ができる。

またこのａ’ｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子、ｐｒｅ　ＨＢｓ
Ａｇ遺伝子、ＨＢｃＡｇ遺伝子を適当な調節遺伝子と結
合し、プラスミドＤＮＡに組込んで大腸菌などの面生物
に導入した後、当該微生物を培養することにより、１（
ＢＹの感染性がないａｄｗ型ＨＢｓＡｇ。

ｐｒｅＨＢｓＡｇ　？：安価に大量生産することができ
、かくして得られるａ、　ｄ　ｗ２Ｊ　ＨＢｓＡｇは従
来の方法で得られたａｄｗ型ＨＢｓＡｇと同様にＢ型肝
炎ワクチンとして使用できる。

一般に構造遺伝子のみを採取するのは、種々の制限酵素
を用いても困難な場合が多い。しかるに、本発明により
創製されたａ、　ｄ、　ｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子は翻訳開
始コドンＡＴＧの直前で制限酵素８ａｕ３Ａにより切断
されるので、調節遺伝子との結合がきわめて容易である
という特性を有するものである。

なお、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子を微生物内で発現させ
た場合、合成されるポリペ１チドのアミノ酸配列は、第
２図に示されたアミノ酸配列からアミノ末端あるいは（
および）カルボキシル末端の若干のアミノ酸が除去され
たものであってもよい。

また微生物内で合成されるＨＢｓＡｇには、ヒト細胞内
で起りうるポリペプチドの翻訳後の修飾が見られ々い場
合もありうる。いずれの場合も、生成されたポリペプチ
ドがＨＢｓＡｇと類似する抗原性を有するかぎυ、Ｂ型
肝炎のワクチンとして使用することができる。

またＨＢｃＡ、ｇをＨＢｅＡｇ陽性の血液中にあるデン
粒子から分１１１ｉするには量的に困難である。本発明
によれば、遺伝子操作を利用してＨＢｃＡ、ｇｉ大量に
製造することができる。

ＨＢｃＡｇの抗原性については、ＨＢｓＡｇの抗原性の
亜型（ｓｕｂ　　ｔｙｐｅ）と関連しているかどうか確
定していないが、ＨＢＶの他の亜型の全塩基配列が決定
され、比較された時、その共通性もより明確になると推
定される。いづれにしても少くとも同一亜型のＨＢＶに
感染した場合には、抗ＨＢｓ抗体よりも、抗Ｈ’Ｂｃ抗
体の方が先に血中に出現する（文献１５）ので、抗ＨＢ
ｃ抗体をラジオイムノアッセイ法で検出することにより
早期にＨＢＶの感染の有無を高感度で診断できる。

文献 １、　　Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　３：３７８−３
８Ｈ１９７４）。

２、　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、１２：　　９９５−１００５
　　（１９７３）。

３．　工ｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　　１０：　２５４
　２６４（１９７８）。

４、　Ｊ、Ｖｉｒｏ１υ：３６８−３７６（１９７７）
。

５、　　Ｇｅｎｅ　２：９５１１３（１９７７）。

６、　５ｃｉｅｎｃｅ　　１７：１３１３−１３１９（
１９７９）。

７、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ　９６：４９５　５０９（
１９７５）。

８、　　Ｕ、Ｓ、Ｐ、４，１９０，４９５９゜　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　　１９５　：３９３−３９４（１９７７）　
。

１０、　　Ｊ、Ｂａｃｔ、１２１　：３５４−３６２（
１９７５）。

ＩＩ、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、Ｕ、８．Ａ、　７４　：５４６３−５４６７（１９７
７）。

１２、　　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｅｅ
ｓ　　８：　　１７３１−＋７４３（＋９８０）。

１３、Ｍ　　ｌ　３　　ｃｌｏｎｉｎｇ　／“ｄｉｄｅ
ｏｘｙ″ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍａｎｕａｌ　　　ｐｕ
ｂｌｉｓｂｅｄ　　　　ｂｙ　　ＢＲＴＪ　　　ＩＮＣ
，。

Ｍａ、ｒｙｌａｎｄ　　Ｕ、８．Ａ。

１４、　　　Ｎａｔｕｒｅ　　２８１　　：　　６４６
−６５０（１９７９）。

１５、　　５ｃｉｅｎｃｅ　　２１３：４０６−４１１
（１９８１）。

１６、　　Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　　Ｓｃｉ、　　２
７０：　　１７９〜ｌ８７（＋９７５）。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の創製例によって得られたａｄＷ型′Ｈ
ＢＶ　　ＤＮＡの全塩基配列を示し、第２図は本発明の
ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子がコードするポリペプチドの
アミノ酸配列の一例を示し、第３図は本発明のａ、　ｄ
　ｗ型ＨＢｃＡｇ遺伝子がコードするポリペプチドのア
ミノ酸配列の一例を示す。第４〜５図は本発明の創製例
の概略図である。 第２図 、Ｈｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　
ＰｈｅＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　工１ｅ　Ｌｅ
ｕ　Ｔｈｒ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ５ｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　ＡｓｎＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　
Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＧｌｎ　Ａｓ
ｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ
　Ａｓｎ　ＨｉｓＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃ
ｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ工ｌｅ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。 Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ工１ｅ工ｌｅ　Ｐｈｅ　
Ｌｅｕ　Ｐｈｅ工１ｅ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙ
ｓＬｅｕ　　工１ｅ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｉ＋ｅｕ
　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｉｊｉｊｕ　　Ａｓｐ　　Ｔ
ｙｒＧｉｎ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ
　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ工１ｅＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅ
ｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ
　Ｐｒ。 Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐ
ｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ＧｌｙＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ
　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　
ＴｈｒＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓ
ｎ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　工１ｅＰｒｏ　Ｉｌｅ　
Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｐｈｅ’Ａ
ｌａ　ＬｙｓＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ
　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ａｒｑ　ＰｈｅＳｅｒ　Ｔ
ｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒ
ｏ　Ｐｈｅ　ＶａｌＧｌｎ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　
Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＶａｌＴｒ
ｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ工１ｅ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　
Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　ＴｙｒＴｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅ
ｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ工１ｅ　Ｖａｌ　５ｅｒＰ
ｒｏ　Ｐｈｅ　　工ｌｅ　ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ
　Ｐｒｏ　　工ｌｅ　Ｐｈｅ　ＰｈｅＣｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ工１ｅ第３図 ｇｅｔ　Ａｓｐ工ｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　ＡｌａＴｈｒ　Ｖａｌ　
Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐ
ｒｏ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＰｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ
　Ｖａｌ　ｋｒ：ｑ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ
　ＴｈｒＡｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａ
ｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　５ａｒＰｒｏ
　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　
Ｉ（ｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＬｅｕＡｒｇ　Ｇｌｎ　Ａ
ｌａ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ
　Ｌｅｕ　ＭｅｔＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　’
Ｉ’ｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉ、ａｕ
　ＧｉｎＡｓｐ　ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａ
ａｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＴｙｒＶａｌ
　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　
Ｌｙｓ工１ｅ　Ａｒｇ　ＧｌｎＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ
　Ｐｈｅ　Ｉ（ｉｓ工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　ＰｈａＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａ
ｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　５ｅｒ
Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｈａ　ＴｙｒＡｒｑ　Ｐｒｏ
　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　Ｌａｕ　
Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈ
ｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ
　ＡｒｇＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａ
ｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。 Ａｒｑ　Ａｒｑ　Ａｒｇ　Ａｒｑ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓ
ｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　１ｕ：ｑ　ＡｒｇＡｒｑ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ
　Ｃ７１５竿４図 １°゛啼″′４ど ４、ｄＮＴＰ　　　　　　　　　Ｉ　ＥｃｏＲＩ拗吋尤
爲萌−１−１７７６ ”Ａｍｐ’、　Ｔｅ＋’ 火腸ｍ≠＋７７６　／　ｐＨＲ３２２−εｃｏＲ［／　
Ｈ８Ｖ９３３＄５　図 ρ８Ｒ３２２ 犬馬ｉ、、ｔ−１７７ｓ ／Ａｍ和。、５）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原構造遺伝子
   ９表面抗原前駆体をコードする遺伝子およびコア抗原構
   造遺伝子の１種以上を含有するＤＮＡ。 （２）表面抗原構造遺伝子を含有する特許請求の範囲第
   １項記載のＤＮＡ０ （３）表面抗原前駆体をコードする遺伝子を含有する特
   許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ０（４）コア抗原構造
   遺伝子を含有する特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 （５）第１図に示される塩基配列またはその断片を含有
   する特許請求の範囲第１項〜第４項記載のＤＮＡ０ （６）表面抗原構造遺伝子が第１図において塩基配列順
   序１５５〜８３５として示される塩基配列またはその断
   片である特許請求の範囲第１項、第２項または第５項記
   載のＤＮＡ。 （７）表面抗原前駆体をコードする遺伝子が第１図にお
   いて塩基配列順序２８４９〜３１８３〜１〜８３５とし
   て示される塩基配列またはその断片である特許請求の範
   囲第１項、第３項または第５項記載のＤＮＡ０ （８）コア抗原構造遺伝子が第１図において塩基配列順
   序１８８４〜２４４１として示される塩基配列またはそ
   の断片である特許請求の範囲第１項。 第４項または第５項記載のＤＮＡ０ （９）表面抗原構造遺伝子が第２図に示されるポリペプ
   チドまたはそれと等価の免疫学的もしくは生物学的活性
   を有するポリペプチドを特徴とする特許請求の範囲第１
   項、第２項、第５項または第６項記載のＤＮＡ０ ＱＩ　　コア抗原構造遺伝子が第３図に示されるポリペ
   １チドまたはそれと等価の免疫学約４しくけ生物学的活
   性を有するポリペプチドを特徴とする特許請求の範囲第
   １項、第４項、第５項または第８項記載のＤＮＡ。 叩　組換えＤＮＡ分子の一部である特許請求の範囲第１
   項〜第１０項記載のＤＮＡ０ 叫　プロモーターの下流に連絡されている特許請求の範
   囲第１項〜第１１項記載のＤＮＡ。 （ｌｕｌｌ　　ａｃ１ｗＱＢ型肝炎ウイルスデつ粒子内
   のａｄＷ型Ｂ型肝炎ウィつスＤＮＡの単鎖部分１Ｉ）Ｎ
   Ａ合成反応によカニ重鎖としたＤＮＡおよびベクターＤ
   ＮＡｊｊ、それぞれ制限酵素により切断した後に混合し
   てａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡまたはその断片全ベ
   クターＤＮＡの切断部位間に挿入することを特徴とする
   ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィつスの表面抗原構造遺伝子９表面
   抗原前駆体全コードする遺伝子およびコア抗原構造遺伝
   子の１種以上を含有する組換えＤ　Ｎ　Ａ、　１７）製
   造法（１４）ａｄｗ型Ｂ型肝炎ウイつスの表面抗原構造
   遺伝子２表面抗原１ａｉＴ駆体全コードする遺伝子およ
   びコア抗原構造遺伝子の１種以上を含有する組換えＤＮ
   Ａで形質転換させた宿主。