FR2637184A1 - Anticorps monoclonal reconnaissant une region pre-s1 de la grande proteine d'enveloppe du virus de l'hepatite b et ses applications, notamment pour le diagnostic in vitro et le traitement de l'hepatite b - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-S1 de la grande protéine S d'enveloppe du virus de l'hépatite B (HBV). L'invention a également pour objet les applications de cet anticorps monoclonal, notamment pour le diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez un individu infecté par l'HBV, ainsi que pour le traitement et la vaccination contre cette maladie.

Description

ANTICORPS MONOCLONAL RECONNAISSANT UNE REGION
PRE-S1 DE LA GRANDE PROTEINE D'ENVELOPPE DU VIRUS DE
L'HEPATITE B ET SES APPLICATIONS, NOTAMMENT POUR LE
DIAGNOSTIC IN VITRO ET LE TRAITEMENT DE L'HEPATITE
B.

L'invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope situé dans la région pré-Sl de la grande protéine d'enveloppe du virus de l'hépatite B (HBV). L'invention a également pour objet les applications de cet anticorps monoclonal, notamment pour le diagnostic in vitro de l'évolution de la maladie chez un individu atteint d'hépatite B chronique, ainsi que pour le traitement de l'hépatite
B, et la vaccination contre cette maladie.

L'enveloppe de 1'HBV contient trois types de protéines de surface (protéines S). Les protéines S sont les seuls composants viraux trouvés dans les particules antigéniques de surface de l'hépatite B (particules HBsAg) qui sont exprimées en grande quantité par rapport au virus lui-même lors d'une infection. Ces particules HBsAg se présentent sous forme sphérique ou tubulaire avec un diametre plus faible (22 nm) que les particules d'HBV infectieuses (42 nm).

Ces trois protéines S sont les suivantes - la "petite" protéine S, ou protéine S majeure, constituée de la séquence (ou région) S de 226 acides aminés, (PETERSON, D.L. et al, (1977) Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 74, 1530-1534) , - la protéine S "moyenne" constituée de la séquence S sus-mentionnée et de 55 acides aminés N-terminaux additionnels codés par la région pré-S2 de 1'ADN de l'HBV (MACHIDA, A. et al (1984), Gastroenterology, 86, 910-918) - la "grande" protéine S constituée des séquences S, pré-S2 et de 108 (sous-type antigénique ad) ou 119 (sous-type antigénique ay) acides aminés N-terminaux additionnels codés par la région pr6-Sl de l'ADN de 1'HBV (HEERMANN, K. et al (1984), J. Virol., 52, 396-402 t WONG, D.T. et al (1985) J. Virol., 55, 223-231).

Ces trois protéines S existent sous différentes formes glycosylées
- les protéines majeures P24 et GP27,
- les protéines moyennes GP33 et GP36,
- les grandes protéines P39 et GP42.

Les protéines moyennes et grandes ont été trouvées en plus forte concentration dans les particules infectieuses d'HBV (qui contiennent également l'antigène du core du virus, HBcAg) que dans les particules HBsAg sus-mentionnées (HEERMANN, K.H., et al précédemment cité, et TAKAHASHI, K. et al (1986) J.

Immunol., 136 , 3467-3472).

Ces protéines jouent donc probablement un rôle dans l'assemblage ou le fonctionnement des particules
HBV infectieuses.

Il est estimé que les régions pré-S2 et pré-Sl des protéines S jouent un rôle dans les mécanismes de reconnaissance et de pénétration des HBV dans les hépatocytes des individus infectés par 1'HBV. Ainsi le site de liaison d'HBV aux récepteurs des hépatocytes serait localisé entre les acides aminés situés aux positions 21 et 47 de la région (ou séquence) pré-S1 (NEURATH, A.R. et al, (1986) CE11, 46, 429-436).

Ces auteurs ont également démontré que l'interaction entre HBV et les cellules de l'hématome
HepG2 est fortement inhibée par des anticorps dirigés contre un peptide s'étendant entre les résidus d'acides aminés aux positions 21 et 47 de la séquence pre-Sl (d'ou la désignation "anticorps anti-pré-S (21-47) ") ainsi que par des anticorps anti-pré-S(32-53 > .

Compte tenu du rôle vraisemblablement important de la région pré-Sl dans la mécanisme infectieux de l'HBV, et notamment dans la reconnaissance des récepteurs des hépatocytes, les anticorps reconnaissant spécifiquement cette région, et plus particulièrement ltépitope responsable de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, seraient probablement d'une grande valeur dans le domaine de la lutte contre l'hépatite B.

Néanmoins, les anticorps monoclonaux connus å ce jour ne se sont pas avérés présenter les propriétés voulues à cet effet t on notera que l'anti-pré-S(32-53) susmentionné, a été obtenu à l'aide de la séquence pré
S(32-53) qui n'induit pas de réponse anti-HBV dans les sérum de malades. La vaccination à l'aide d'une telle séquence s'avère par conséquent peu envisageable.

Afin de disposer d'anticorps plus spécifiques de la région pré-Sl que ne le sont les actuels anticorps polyclonaux sus-mentionnés, d'autres anticorps monoclonaux ont été préparés à partir de lymphocytes d'animaux immunisés avec des particules HBV (TAKAHASHI,
K. et al (1986) précédemment cité), ou avec des peptides synthétiques tels que pré-S1(1-11) et pré
S(13-21) (OHNUMA, H, et al (1986) Gastroenterology, 90, 695-701). Ceux-ci n'ont pas été caractérisés en détail.

Un anticorps monoclonal (ACM) a été plus particulièrement décrit dans la demande de brevet européen publiée le 07/05/1986 sous le numéro 0 180 012 de GERLICH et al. Cet anticorps monoclonal (MA18/7) reconnaît spécifiquement la séquence pré-S(38-121) de la région pré-Sl, mais ne permet pas l'identification du site spécifique de liaison du virus sur les hépatocytes.

Cet ACM MA18/7 présente également l'inconvénient de donner lieu à des réaction immunologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV, ce qui représente un inconvénient majeur pour son utilisation dans des procédés de diagnostic in vitro.

La présente invention a pour objet un anticorps monoclonal présentant l'avantage par rapport aux anticorps anti-pré-S1 connus, d'une part, d'être plus spécifiques de la séquence en acides aminés de la région pré-Sl impliquée dans le mécanisme de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, et, d'autre part, de ne pas donner lieu à des réactions immunologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV.

L'invention concerne également une nouvelle méthode de détection, et de dosage in vitro de la grande protéine pré-Sl plus précise que celles élaborées à l'aide des anticorps connus, ainsi que l'application de cette méthode au diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique.

L'invention a également pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques pour le traitement de l'hépatite B et pour la vaccination contre cette maladie.

Il sera fait reférence dans la description qui suit aux dessins dans lesquels - la figure l est une représentation schématique du virus de l'hépatite B (HBV), - la figure 2a représente les résultats d'un dosage radio-immunologique (RIA) des séquences S, pré-S2, et pre-Sl dans les particules HBsAg et l'HBV. La figure 2b représente la spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal de l'invention déterminée par la technique des immuno-empreintes, - la figure 3 représente les séquences d'acides aminés des régions pré-S(2r-53), et pre-S(94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant à 5 sous-types antigéniques de l'HBV, - la figure 4 (a et b) représente les résultats d'un dosage radio-immunologique spécificité d'anticorps réalisé à l'aide de l'anticorps monoclonal de l'invention, - la figure 5 représente les effets inhibiteurs des peptides spécifiques de la région pré-Sl et des particules HBV vis-à-vis de la liaison de l'anticorps monoclonal de l'invention avec le peptide pré-S(32-53) (figure 5a), ou avec 1'HBV sous-type ad (figure 5b), - la figure 6 représente la sensibilité de l'anticorps monoclonal de l'invention pour la détection de la région pré-Sl, - la figure 7 représente les résultats de la digestion des particules d'HBV par la trypsine ou la protéase V8, - la figure 8 représente un gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad), - la figure 9 représente la détection de la séquence pré-S1(32-53) dans les particules d'HBV purifiées et suivant le système du dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps.

L'invention concerne un anticorps monoclonal (ciapres désigné par ACM F35-25) défini par la combinaison des propriétés suivantes - il forme un complexe immunologique avec
un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-Sl,
. la région pré-Sl de la grande protéine S d'enveloppe de l'HBV,
les grandes protéines d'enveloppe de l'HBV, P39 et GP42,
. la tres grande protéine d'enveloppe de 1'HBV de 66 kd (kilodaltons),
chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la trypsine, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pré-S1 de ladite grande protéine S et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500,
chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la protéase V8 de S. aureus, et dont les poids moléculaires sont de 15000, 16500, et 29000, respectivement, - il ne forme pas de complexe immunologique avec
. les (glyco)protéines S moyennes d'enveloppe de l'HBV, GP33 et GP 36
les glycoprotéines S majeures d'enveloppe de l'HBV P24 et GP27
. la sérum-albumine-humaine (HSA) ;
. la sérum-albumine humaine polymérisée (pHSA) t
les immunoglobulines G, A et M
les divers constituants de sérums d'individus non infectés par 1'HBV.

Les anticorps monoclonaux selon l'invention appartiennent de préférence à la classe des immunoglobulines Gl(IgGl).

L'anticorps monoclonal sus-mentionné peut être obtenu par un procédé comprenant la fusion de cellules myélomateuses et de cellules spléniques prélevées sur un animal immunisé avec des particules HBV, suivant la technique générale d'obtention des hybridomes, et la détection et la récupération de ceux des hybridomes qui secretent les anticorps monoclonaux possédant les propriétés définies ci-dessus.

L'invention vise également les hybridomes susceptibles de secréter des anticorps monoclonaux cidessus définis, notamment ACM F35.25.

L'invention a plus particulierement pour objet l'hybridome secrétant 1'ACM F35.25 et qui a été déposé à la COLLECTION NATIONALE DES CULTURES DE MICRO
ORGANISMES (C.N.C.M.) de 1'INSTITUT PASTEUR à PARIS sous le numéro I-796 le 5 août 1988.

L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de la présence éventuelle de la grande protéine S (comprenant la région pré-S1) dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite protéine, cette méthode comprenant - la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec l'ACM F35.25 dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pré-S1 de la grande protéine S et 1'ACM F35.25 - la détection du susdit complexe immunologique.

Une telle méthode de détection in vitro peut être réalisée suivant toute technique en soi connue de l'homme du métier.

Cette méthode comprend par exemple les étapes suivantes - fixation sur un support solide de 1'ACM F35.25 - addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pre-Sl de la grande protéine et l'ACM F35.25.

- addition ensuite sur le support solide d'autres anticorps à leur tour susceptibles de former un complexe immunologique avec le complexe précédent, tel que l'ACM F35.25 ; ces anticorps sont marqués, notamment de manière radioactive, ou enzymatique - détection a. l'aide de réactifs appropriés des anticorps marqués sus-mentionnés engagés dans le susdit complexe immunologique,
Une variante de la méthode de détection in vitro comprend encore les étapes suivantes - fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux, susceptibles de former un complexe immunologique avec la région S des proteines S;; - addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre les anticorps sus-mentionnés et la région S des protéines S contenues dans l'échantillon - addition de l'ACM F35.25, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre celles des protéines S contenues dans l'échantillon et portant la région peu S1 (c'est-à-dire les grandes protéines S) et l'ACM
F35.25 - détection à l'aide de réactifs appropriés de l'ACM
F35.25 marqué. et qui est engagé dans le susdit complexe immunologique, - ou, Si 1'ACM F35.25, n'est pas marqué, détection du dernier complexe immunologique sus-mentionné à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées (obtenues chez un animal d'une espece différente de celui utilisé pour l'obtention des anticorps fixes sur le support solide) susceptibles de former un complexe immunologique avec 1'ACM F35.25 engagé dans le dernier complexe immunologique obtenu lors de l'étape précédente.

Selon un mode de réalisation plus détaille d'une méthode de détection in vitro préférée de l'invention, cette derniere comprend les étapes suivantes - fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux (obtenus par exemple par immunisation de lapins) susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S d'enveloppe de l1HBV;; - rinçage du support afin d'éliminer ceux des susdits anticorps non fixés sur le support - addition sur le support de l'échantillon biologique, notamment du sérum, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre les anticorps polyclonaux sus-mentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans ledit sérum
- rinçage du support afin d'éliminer les différents constituants dudit sérum non reconnus par les anticorps sus-mentionnés ;;
- addition sur le support des anticorps monoclonaux ACM F35.25 selon l'invention, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre lesdits anticorps monoclonaux et celles des protéines S engagées dans le complexe immunologique précédent et comprenant la région pré-S1 des grandes protéines - rinçage du support afin d'éliminer ceux des anticorps monoclonaux non engagés dans une réaction immunologique avec ladite région pré-S1 des grandes protéines S - addition sur le support d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec 1'ACM F35.25 (obtenues par immunisation d'une espèce animale identique à celle utilisée pour l'obtention de l'ACM F35.25, et différente de celle utilisée pour l'obtention des anticorps polyclonaux fixés sur le support solide ; ces anti-immunoglobulines peuvent être obtenues dans l'exemple présent par immunisation de souris) dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique final formé entre lesdites antiimmunoglobulines et l'ACM F35.25 engagé dans le complexe immunologique obtenu à l'étape précédente.

- détection de la quantité d'anti-immunoglobulines marquées engagées dans le complexe immunologique final sus-mentionné, cette quantité pouvant être corrélée à la quantité de protéines S portant la région pre-Sl, ou encore grandes protéines S, présentes dans ledit sérum.

L'invention concerne également l'application de la méthode de détection in vitro sus-mentionnée au diagnostic in vitro de l'hépatite B aigue ou chronique réalisé à partir d'un échantillon biologique, tel que du sérum, prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par HBV.

L'invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez un individu porteur symptomatique ou asymptomatique des protéines S de i 'HBV.

La méthode de diagnostic in vitro sus-mentionnée est avantageusement réalisée par la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de détection in vitro de la quantité de grande protéine S sus-mentionnée, d'une méthode de détection in vitro de la protéine S majeure.

Cette dernière méthode est réalisée suivant les mêmes étapes que celles décrites ci-dessus pour la detection de la grande protéine, et dans lesquelles, d'une part, l'ACM F35.25, est remplacé par un anticorps, de préférence monoclonal, susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois), et d'autre part, les anti immmunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25 sont remplacées par des anti-immunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM susmentionné reconnaissant la protéine S majeure.

Parmi les anticorps monoclonaux susceptibles de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, et que l'on peut utiliser dans la méthode sus-mentionnée, on citera notamment l'ACM F39.20 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) J. Gen. Virol., 68, 2759-2767.

La comparaison des quantités détectées de grande protéine S et de protéine S majeure dans un même échantillon permet de connaître, à un temps donné, la proportion de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure présente dans ledit échantillon.

La mise en oeuvre répétée de la méthode susmentionnée permet de suivre l'éventuelle variation de cette proportion en fonction du temps.

La détection d'une-diminution de cette proportion en fonction du temps chez un individu atteint d'hépatite B chronique, permet d'émettre l'hypothèse que la maladie évolue favorablement chez cet individu c'est-à-dire qu'elle évolue probablement vers un état de guérison totale ou partielle (pseudo-guérison), qui se caractérise par une disparition complète de la grande protéine S dans l'échantillon prélevé chez ledit individu.

Le principe de la méthode de détection in vitro de la grande protéine S sus-mentionnée peut également être appliqué à la détection de la protéine S moyenne en utilisant, au lieu de l'ACM F35.25 et des antiimmunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25, un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la région pré-S2 de ladite protéine
S moyenne (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois), et des antiimmunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal, susmentionné reconnaissant la région pré-S2. A titre d'exemple de ce dernier type d'anticorps monoclonal, on citera l'ACM F124 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) précédemment cité.

Ainsi la méthode de l'invention permet la détection dans un échantillon biologique prélevé chez un individu atteint d'hépatite B chronique, de la proportion de la grande protéine S par rapport à la protéine S moyenne d'une part, et par rapport à la protéine S majeure d'autre part. Une telle méthode permet donc de suivre en fonction du temps les variations des proportions des trois protéines S les unes par rapport aux autres, et ainsi de juger de l'évolution favorable ou non de la maladie en fonction de ces variations.

La méthode de diagnostic in vitro de l'invention est réalisée à partir d'échantillons biologiques (prelevé chez des individus), tels que le sérum, ou des biospies du foie. Etant donné que l'expression des protéines S dans les lymphocytes se faisant de manière identique à celle de ces mêmes protéines S dans les cellules hépatiques, il est plus avantageux, compte tenu de l'opération délicate que constitue une biopsie du foie, de realiser la méthode de diagnostic de l'invention à partir d'un prélèvement de lymphocytes.

Avantageusement, la méthode de diagnostic in vitro de l'invention permet le suivi thérapeutique des patients atteints de l'hépatite B et qui sont traités avec des compositions pharmaceutiques comprenant, notamment, de I'interféron, ou avec des antiviraux, tels que la nidarabine.

La détection d'un diminution de la quantité de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure, et/ou la protéine S moyenne, chez un de ces patients, permet d'emettre l'hypothèse que la thérapeutique utilisée donne des résultats favorables, et que ce patient évolue vers la guérison.

L'invention concerne également l'utilisation de l'ACM F35.25 pour la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de diagnostic in vitro de l'invention, d'une méthode de détection in vitro des produits de clivage de la grande protéine S issus de la digestion in vivo de cette dernière par la trypsine, ou par des enzymes possédant des activités du type de la trypsine et présentes dans l'organisme de l'individu à partir duquel l'échantillon biologique a été prélevé.

Cette méthode de détection est réalisée suivant la technique des immuno-empreintes (ou Western blot) à partir d'un échantillon tel que les lymphocytes, et comprend les étapes suivantes - électrophorèse sur gel afin d'obtenir un séparation des divers constituants antigéniques de l'échantillon, - transfert de ces constituants ainsi séparés sur un support tel qu'une membrane de nitrocellulose, - incubation avec l'ACM F35.25, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre l'ACM F35.25 et chacun des produits de clivage de la grande protéine S, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pre-Sl, et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500, - détection à l'aide de réactifs appropriés de 1'ACM
F35.25 marqué engagé dans un complexe immunologique sus-mentionné avec un produit de poids moléculaire de 13500 ou 14500, - ou, dans le cas où l'ACM F35.25 n'est pas marqué, détection a l'aide d'une immunoglobuline marquée susceptible de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 engagé dans un complexe immunologique tel que défini ci-dessus.

Une telle méthode permet de quantifier la proportion de grandes protéines éventuellement dégradées dans l'organisme d'un individu et de déterminer ainsi le degré de resistance à l'infection par HBV de cet individu qui est fonction de la plus ou moins grande quantité de produits de clivage de la grande protéine S par la trypsine ainsi détectée.

L'invention a également pour objet des nécessaires ou kits, pour la mise en oeuvre d'une des méthodes de l'invention décrites ci-dessus.

A titre d'exemple, un kit selon l'invention comprend - une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux fixes sur un support solide et susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S, - une quantité déterminée de l'anticorps monoclonal
F35.25.

- éventuellement une quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure d'enveloppe de i 'HBV, - éventuellement un quantité déterminée d'un anticorps monoclonal - susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S moyenne d'enveloppe de 1 'HBV, - avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les anticorps susmentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique, - avantageusement des réactifs marqués, notamment des immunoglobulines marquées, permettant la détection des complexes immunologiques dans lesquels sont engagés les anticorps monoclonaux sus-mentionnés.

L'invention a également pour objet l'utilisation de l'anticorps monoclonal F35.25 de l'invention pour le traitement de l'hépatite B et plus particulièrement pour la prévention des phénomènes de réinfection du greffon lors de greffe du foie chez les individus atteints de hépatite B.

A ce titre, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques pour les traitements indiqués cidessus, et qui comprennent l'ACM F35.25 associé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'invention concerne également l'anticorps monoclonal anti-idiotype caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal
F35.25.

L'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné est obtenu par immunisation d'un animal (ou de i'homme) à l'aide d'un anticorps moncoclonal F35.25 selon l'invention, suivi de la récupération de ceux des anticorps susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps moncoclonal F35.25.

L'invention a également pour objet des compositions pour la vaccination contre l'hépatite B caractérisé par l'association de l'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit de l'obtention et de la caractérisation de l'anticorps moncoclonal F35.25, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications.

I MATERIELS ET MéTHODES
1) Obtention de l'anticoros monoclonal F35.25
Les particules HBV ont été purifiées à partir du sérum d'un individu atteint d'hépatite B chronique (sous type ad) comme il a été décrit dans PETIT et al (1985) Molec. Immunol., 22, 1279-1287, et ont été utilisées comme immunogène. Des souris BALB/c ont été inoculées intrapéritonéalement avec 100 Ag de virus purifié dans l'adjuvant complet de Freund, puis une semaine plus tard avec 100 Sg de virus dans l'adjuvant incomplet de Freund. Les trois souris immunisées ont développé de hauts titres en anticorps contre HBsAg, et qui ont été détectés par dosage radioimmunologique RIA.

Deux semaines plus tard, les souris ont été inoculées avec 50 pg de virus dans un tampon phosphate. Après cinq jours, l'injection a été répétée, et trois jours plus tard, leur rate ont été retirées pour réaliser une fusion avec les cellules du myélome X63 selon la procédure décrite par BUTTIN et al (1978 > , 81, 27-36.

Les surnageants de la culture d'hybridomes ont été sélectionnés pour leur présence en anticorps spécifique d'HBV par RIA indirect en utilisant le virus purifié immunisant en tant que phase solide (PETIT et al (1987)J. Gen. Virol., 68, 2759-2767). 30 % des clones de l'hybridome produit des anticorps contre HBV. Les hybrides donnant le plus fort signal (P/N > 10) (P = positif, N = négatif) avec les particules HBV sur la phase solide ont été reclonés par dilution limitante, et leur spécificité polypeptidique a été déterminée par
Western Blot en utilisant des protéines virales dissociées en tant que sonde antigénique (PETIT et al (1986) Molec. Immunol, 27, 511-523).

Les clones sélectionnés ont ensuite été injectés à des souris BALB/c pour la production d'ascites.

L'anticorps monoclonal spécifique de la région pre-Sl, F 35.25, a été purifié à partir du surnageant d'une culture cellulaire d'hybridomes par précipitation avec 50 % (NH4)2S04 saturé, et par filtration sur gel
SEPHADEX G-200 (PHAMACIA - FRANCE), suivi d'une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE-trisacryle M (IBF - FRANCE). L'isotype a été déterminé par immunodiffusion contre des antisérums de lapin spécifique pour les immunoglobulines M de souris (IgM),
IgGl, IgG2A, IgG2B et IgG3 (NORDIC IMMUNOLOGY
TILBURG-BERCHEM - LONDON)
2) Test d'immunotransfert (technique de
Western Blot)
La spécificité polypeptidique de l'ACM F 35.25 a été déterminée par immunotransfert en utilisant des préparations de virus non traités, ou digérés, en tant qu'antigènes (PETIT et al (1986) et (1987) précédemment cité).

La digestion par la protéase V8 de S.aureus (type
XVII de chez SIGMA) et par la trypsine (type XII de chez SIGMA) a été réalisée dans du bicarbonate d'ammonium O,lN, pH 7,8, a 37-C pendant trois heures.

Le rapport de la quantité d'enzymes au substrat était de 1:40-50 (par poids), et la concentration de protéine était de l mg/ml. La réaction a été arrêtée par addition d'un tampon contenant 2 % de SDS et 5 % de 2-mercaptoéthanol.

Les particules sphériques HBsAg de 22-nm ont été co-purifiées avec l'HBV provenant d'un sérum HBsAg positif, montrant seulement une reactivité pré-S2 (PETIT et al (1987) précédemment cité), une sérum albumine humaine (0,22 mg/ml) et un sérum humain normal dilué au 1/500 ont été utilisés en parallèle en tant qu'antigènes de contrôle. L'HBV purifié a été utilisé à différentes concentrations allant de 0,2 à 1 mg/ml.

Après électrophorèse utilisant le systeme de tampon décrit dans LAEMMLI (1970) Nature, London, 227,, 680-685, des bandes protéiniques ont été éluées électrophorétiquement et transférées sur des membranes de nitrocellulose pour y être détectées comme il a été décrit dans PETIT et al (1987) précédemment cité). Les bandes de transfert ont été incubées soit avec les surnageants de cellules d'hybridomes à une dilution de 1:2 dans un tampon bloquant (tris-NaCl contenant de l'albumine de sérum de boeuf et 50 % de sérum foetal de boeuf) ou avec 10 ng/ml d'IgG monoclonal purifié de souris.

3) Test radioimunoloqioue (RIA)
La liaison de l'ACM F 35.25 soit au virus à l'état natif, soit à des peptides synthétiques dérivant de la séquence pré-Sl de la grande protéine d'enveloppe
HBV sous-type adw2 (NEURATH et al (1986) précédemment cité) a été mesurée par RIA en utilisant un fragment
F(ab)'2 '2 anti-souris marqué radioactivement avec de l'iode 1125 (immunoglobuline de mouton, AMERSHAM
FRANCE). Des billes de polystyrène ont été enduites avec des antigènes individuels dilués dans un tampon TN (0,01 M-tris-HCl, 0,14 M-NaCl, pH 7,2) à une concentration de 20 pg/ml.

Après deux heures à 37'C et une nuit à 4*C, les solutions d'antigène ont été retirées et les billes ont été saturées avec 5 % (en poids par volume) de sérum d'albumine de boeuf dans un tampon TN pendant 6 heures à température ambiante.

Les billes enduites ont alors été incubées avec une dilution au 1:2 de surnageant de culture de cellules d'hybridomes pendant une nuit à température ambiante, lavées plusieurs fois avec de l'eau distillée et incubées pendant une heure à 37*C avec le fragment F(ab')2 anti-immunoglobuline de souris marqué avec de -l'iode I125. Le diluant utilisé était constitué de sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum foetal de boeuf dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et comptées dans un compteur gamma.

Le surnageant a également été testé par -RIA en utilisant des billes enduites de particules HBsAg recombinantes (produit du gène pré-S2 et du gène S) décrit dans MICHEL et al (1984) Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 81,, 7708-7712) de la sérum albumine humaine polymérisée (pHSA) et de la sérum albumine de boeuf polymérisé (pBSA).

Des expériences d'inhibition compétitive d'antigène ont eté utilisées pour étudier l'effet inhibiteur du virus à l'état natif ou de l'antigène peptidique sur la liaison de l'anticorps F 35.25 au virus et aux peptides synthétiques. Les échantillons de virus ou de peptides libres (20 pg/ml) ont d'abord été pré-incubés avec l'anticorps monoclonal dilué, purifié à partir du fluide de culture d'hybridomes (correspondant à 0,2 ng d'immunoglobuline de souris/ml) pendant l heure à 37-C.

Les mélanges ont été transférés dans des puits enduits soit avec un peptide synthétique de la région pre-Sl (5 Ag) ou avec des particules HBV (10 Ag/ml) purifiées à partir de sérum humain. La quantité d'anticorps monoclonal lié à la phase solide a été déterminée comme il a été décrit ci-dessus.

4) Test de RIA à double spécificité d'anticorps polyclonal-monoclonal (test DAS-RIA).

Ce test RIA a été réalisé afin de déterminer la présence de séquences pré-S1 dans les particules HBV purifiées à partir de sérum HBsAg positif de porteurs chroniques d'HBsAg par la procédure précédemment décrite dans PETIT et al (1985).

Cette technique a également été utilisée pour la quantification d'épitopes pré-Sl en relation avec l'activité HBsAg.

Des billes de polystyrène ont été enduites avec des IgG polyclonaux de lapin dirigés contre HBsAg (PETIT et al (1986)) à une concentration de 20 Mg/ml, et ont été alors incubées avec une série de préparations virales diluées de 10 en 10 (10 g à 1 ng/ml).

Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les billes ont été lavées avec de l'eau distillée et incubées pendant quatre heures à 37-C avec une dilution au 1:2 de la culture d'hybridomes.

La liaison de l'anticorps monoclonal F 35.25 spécifique de pré-S1 a alors été détectée par incubation (1 heure à 37C > avec le fragment F(ab')2 marqué à l'aide de l'iode 1125 d'anti-immunoglobulines de souris Le diluant utilisé était constitué de 5 % de sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum normal de lapin dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et leur radioactivité a été déterminée. Les résultats sont exprimés en cpm (coups par minute) d'anticorps marqué à l'iode 1125.

Dans les étapes finales de la purification de l'HBV, les aliquotes de chaque fraction de gradient entre 10 et 60 t de saccharose ont été sélectionnés par cette technique. Après quoi, les préparations virales ont été calibrées pour leur séquence pre-Sl avec l'anticorps F 35.25.

L'anticorps MA18/7 spécifique de la région de pré-Sl (HEERMANN et al (1984)), et les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes spécifiques des régions S et pré-S2 (PETIT et al (1987)) ont été utilisés en parallèle afin de déterminer des relations quantitatives entre les trois régions antigéniques de la protéine env.

II RESULTATS
1) Spécificité fine pré-S1 de l'anticorps monoclonal F 35.25.

Un test d'immunodiffusion contre une gamme d'antisérum mono spécifique a permis de déterminer que l'ACM F 35.25 appartient à la classe d'anticorps IgGî.

La spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal F 35.25 a été déterminée par sa réactivité vis-à-vis des trois composants d'enveloppe des particules virales purifiées à partir de plasma d'un porteur chronique d'HBV (sous type ad).

Deux préparations obtenues à partir de l'étape finale de centrifugation dans un gradient de saccharose ont été sélectionnées : A, particule sphérique de HBsAg 22-nm présentant une réactivité pré-S2, mais ne présentant pas d'épitopes pré-Sl détectable (30 t de saccharose, figure 2a), et B, particules d'HBV 42-nm positives en ce qui concerne l'activité DNA polymérase et 1'ADN d'HBV, présentant une quantité importante ( > 1 ng/ml) d'épitopes pré-S2 et pré-Sl (40 t de saccharose, figure 2a). Comme il est illustré dans la figure 2b, ligne B, l'ACM F 35.25 -se lie seulement aux protéines pré-Sl, P39 et GP42, dans les parties d'HBV purifiées.

CP42 a été plus intensément révélé que P39. De plus, F 35.25 réagit également avec un composant de 66000 ; par contre, aucune réactivité n'a été observée entre 1'ACM
F35.25 et toutes les protéines provenant de particules défectives d'HBsAg et prê-S2 positives (figure 2b, ligne A), ainsi qu'avec la sérum albumine humaine (HSA) ou avec du sérum humain normal (NHS) sans marqueur viral (figure 2b, lignes C et D respectivement).Les antigènes de contrôle ont été testés en parallele à une concentration similaire & celle des protéines HBV (environ 200 Ag/ml). Ces résultats suggèrent que l'anticorps F 35.25 est spécifique pour la région pré S1 de la protéine env d'HBV (l'expression protéine env est également utilisé pour désigner les protéines S d'une manière générale). De plus, sa reactivité avec la très grande protéine HBV(VL-) de 66000 confirme la présence d'épitopes(s) specifique(s) de pre-S1 sur ce composant VL HBsAg d'HBV (PETIT et al (1987)), qui est distinct de la protéine HSA présent dans NHS.

La localisation précise de l'épitope reconnu par
F 35.25 a été été étudiée par un test RIA impliquant des peptides synthétiques spécifiques de pré-Sl au niveau de la phase solide. Des peptides correspondant à la région pré-S1 de la protéine env d'HBV sous type adw2 ont été sélectionnés, synthétisés et purifiés comme il l'a eté décrit précédemment (NEURATH et al (1986)). Des analogues synthétiques de séquences pré S(1-21), (12-32), (32-53), (53-73) et (94-11) ont été utilisées (voir figure 3) dans un test RIA à double anticorps.Comme il est indiqué dans la figure 4a, seulement le peptide pré-S(32-53) a été reconnu de manière efficace par F35.25 (P/N 2 70). Une faible réaction a également été observée avec le peptide synthétique pré-S (94-117).

On peut remarquer que ces deux peptides possèdent une région N-terminale commune : proline (positions 32 et 94) et alanine (positions 33 et 95) (voire figure 3). Le double RIA impliquant l'utilisation de puit enduit avec des particules HBsAg recombinant à partir de cellules CHO (MICHEL et al (1981)), avec des particules d'HBV purifiées à partir de sérum (sous type ad) ainsi qu'avec HSA, pBSA et pHSA, a également été développé et révèle une liaison significative de F 35.25 seulement aux virions complets (P/N = 13, figure 4b). Ceci démontre la stricte spécificité HBV de l'ACM
F 35.25 dirigé contre la séquence pré-S1(32-53).

Les résultats de la liaison compétitive utilisant 20 Zg/ml des antigenes suivants : peptide pré-S(32-53) et des particules d'HBV purifiées en tant qu'antigène pré-S1 natif, ont démontré : (i) que la région pré
S(32-53) contient l'épitope F 35.25, (ii) qu'un tel épitope est exprimé à la surface des virions. En effet, la réaction de F 35.25 avec l'antigène natif F (HBV) est complètement inhibée par pré-S(32-53), mais pas par une autre séquence pré-S(1-21) (figure 5b).

Réciproquement, les particules d'HBV utilisées en tant qu'inhibiteurs présentent également un puissant effet de suppression ( > 70 5) de la liaison de F 35.25 à la séquence de pré-S(32-53) (figure 5a).

Afin de déterminer la sensibilité de F 35.25 pour détecter la séquence pr6-Sl, ce dernier anticorps se liant soit au peptide pre-S(32-53) ou au virus à l'état natif, des quantités décroissantes d'IgG purifiées spécifiques de souris (1 ng à 0,1 pg/ml) ont été utilisées dans la phase liquide du double RIA (figure 6). La limite de détection de HBV ainsi que celle de l'antigène peptidique a été trouvé comme étant du domaine du pg d'IgGl monoclonal, montrant que F 35.25 possède une affinité de liaison très forte. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'anticorps monoclonal purifié å partir de liquide d'ascites..

Enfin, de manière à déterminer la topographie de l'épitope pre-Sl reconnu par F 35.25 dans la protéine env d'HBV, la réactivité de F 35.25 a été étudiée par immunotransfert après digestion protéolytique limitée des particules purifiées d'HBV (sous type ad). Le traitement par la trypsine ou la protéase V8 de l'antigène a été réalisé dans des conditions bien définies de temps d'incubation, de tampon, de pH et de rapport enzyme-substrat : 3 heures à 37ic dans du bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 7,8 à une concentration finale de 20 Sg/ml d'enzymes pour 1 mg/ml d'antigènes, ces conditions étant différentes des conditions utilisées dans les expériences précédemment citées (HEERMAN et al (1984 > ; PETIT et al (1987)).

Ainsi, les résultats du clivage protéolytique révèle des peptides qui réagissent avec F 35.25 (figure 7). Il est intéressant de noter que deux bandes protéiniques correspondant à des poids moléculaires de 13500 et 14500, résultant du clivage par la trypsine (figure 7), et réagissent fortement avec F 35.25, mais pas avec l'anticorps monoclonal F 376 spécifique de la région pré-S2 (figure 7r ligne 5), ni avec l'anticorps monoclonal 6-16Al5 spécifique de la région S (COURROUCE et al (1983)) (figure 7, ligne 8). Ces produits tryptiques sont probablement générés à partir de P39 et
GP42 par clivage de la séquence pré-Sl au niveau des résidus arginine en position 99 et/ou 103, et en position 113 (voir figure 3).Ainsi l'épitope reconnue par F 35.25 est localisé sur la séquence pré-S1 entre pré-S(33) au niveau N-terminal et pré-S(53)-pré-S(99) au niveau C-terminal. De plus, la sensibilité du domaine pré-S2 pour la digestion par la trypsine a été confirmée (STIBBE et GERLICH, (1983 > Develop. Biol.

Standard, 54, 33-43 , HEERMANN et al (1984) ; PETIT et al (1987)) (figure 7, ligne 5 et figure 7, ligne 8).

Après traitement par la protéase V8 de la protéine
HBV, F 35.25 se lie à un fragment de poids moléculaire 16500 (figure 7, ligne 3) qui a été très probablement produit par clivage au niveau de l'acide glutamique en position 2 (GLU-176) du produit du gène S (HEERMANN et al, (1984)). La protéase V8 génère également deux fragments dont les poids moléculaires sont de 15000 et de 29000 réagissant avec F 35.25. Ceci suggère : (i) un autre clivage possible par la protéase dans le domaine pré-S2, donnant lieu à un fragment plus petit contenant les séquences pré-Si, et (ii) un clivage au niveau du résidu GLU-338 dans la séquence du gène S.

Ce dernier site semble effectivement accessible dans la structure secondaire prédite de la protéine env d'HBV (NEURATH et al (1987) Microbiol. Sci., 4, 45-51). Finalement, la figure 7 , ligne 6 et la figure 7 , ligne 9 illustrent la relative résistance des protéines pré-S2 (GP33 et GP36) à la digestion par la protéase VS.

2) Détection de l'épitope F 35.25 dans les articules d'HBV à partir de sérum humain
Dans l'étape finale de fractionnement dans le gradient de saccharose (ou sucrose), les particules d'HBV caractérisées par la présence d'ADN d'HBV et de la protéine majeure du core, P22c, (détectée par hybridation ou Western Blot respectivement) ont été trouvées dans les fractions 6-8 à 40-50 S de saccharose (figure 8). Ces fractions HbsAg positives ont été étudiées pour ce qui concerne la présence de ltépitope spécifique de pré-Sl reconnue par F 35.25.

Le test DAS-RIA décrit précédemment dans le chapitre MATERIELS ET METHODES, a permis de détecter l'épitope F 35.25 chez les virions complets (figure 8, fractions 6-8, 40-50 % de saccharose). La quantité de séquences pré-S1 en relation avec l'activité HBsAg a été déterminée comme étant de l'ordre de 50 t.

il y a par conséquent une proche corrélation entre la présence de l'épitope reconnu par F35.25 et la présence de 1'ADN d'HBV et de la protéine P22c dans les virions complets.

Les tests DAS-RIA ont aussi été appliqués afin d'évaluer la quantité des séquences pré-Sl dans 7 préparation d'HBV purifiés (sous type ad ou oy). Les particules d'HBV utilisées pour l'immunisation étaient des HBsAg sous type ad. L'ACM F 35.25 a réagit de façon significative avec 1'HBV ad et 1'HBV a liés aux grains enduits d'anti-HBs polyclonaux (figure 9).

Cependant, 1'ACM F35.25 semble reconnaître de façon préférée les séquences pré-S1 d'HBV sous type ad. La proportion des séquences pré-Sl en relation avec HBsAg a été déterminée comme étant de 1'ordre de 50 % seulement dans les préparations d'HBV de sous type ad, et seulement de 10 à 20 % dans les préparations HBV de sous type ay. Cette différence peut être imputée à la spécificité ad relative de 1'ACM F 35.25.

Par contre 1'ACM MA18/7 obtenu par imunisation avec des particules HBV de sous-type ayw, réagit aussi bien avec les particules de sous-type adw que celles de sous-type avw. L' L'unique acide aminé, compris à l'intérieur de la séquence pré-Sl(32-38), et qui diffère suivant les sous-type ad et oy, est situé en position 35 ; cet acide aminé en position 35 correspond à la glycine dans le sous-type ad, et à l'arginine dans le sous-type av. La substitution de la glycine en position 35 par l'arginine crée un site additionnel de clivage par la trypsine à l'intérieur de la séquence pré-S(21-47) impliquée dans la liaison aux récepteurs des hêpatocytes. Par conséquent, la spécificité de sous-type relative de 1'ACM F35.25 pourrait être attribuée à une perte de l'extrémité N-terminale de la séquence pré-Sl de 1'HBV de sous-type as sous l'effet d'une enzyme de type de la tryspine.Ceci pourrait expliquer la plus grande instabilité des particules de sous-type li (tellles que RE, BAY, PEI.) que celles de sous-type ad (telles que LIS/88 et LAM.).

Ainsi 1ACM F35.25 constitue un bon marqueur du caractere infectieux de 1'HBV puisqu'il est capable de former un complexe immunologique, détetable in vitro, avec l'épitope pré-S(32-53) comprenant la glycine (35) impliquée dans le mécanisme de fixation de sous-type ad sur les hépatocytes.

L'ACM MA18/7 ne reconnaît pas la région comprenant la glycine en position 35, puisqu'il est spécifique de la séquence pré-S(38-121), et n'est donc pas un aussi bon marqueur d'infectiosité des HBV circulants que ne l'est 1'ACM F35.25.

La mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, de détection in vitro de la proportion de la grande protéine S par rapport aux protéines S moyennes et majeures à partir de sérums d'individus atteints d'hépatite B chronique, a donné les résultats suivants 1) Chez un groupe d'individus porteurs chroniques symptomatiques, chez lesquels on peut détecter un réplication virale active (correspondant à la présence dans le sérum de ces individus d'ADN-polymérase, d'ADN d'HBV, et d'HBe qui est un antigène de la nucléocapside), il a été détecté par la méthode de l'invention que
- Chez 36 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est supérieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines S représentant respectivement environ 35 à 40 %, ét 20 % des protéines S contenues dans les sérums desdits individus.

- Chez 45 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est inferieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines S représentant respectivement 25 % et 50 S des protéines
S présentes dans les sérums desdits individus.

- Chez 18 % des individus de ce groupe la quantité de grande protéine S est à peu près identique à celle de protéine S moyenne, et représente pour ces deux protéines environ 25 % de la quantité de protéine S présente dans les sérum desdits individus.

Parmi ce groupe d'individus, deux cas ont évolue vers la guérison. I1 s'agit d'une part d'un individu ayant développé des anticorps anti-HBe, et d'autre part d'un individu ayant subi un traitement par l'interféron et chez lesquels on ne détecte plus, à l'aide de 1'ACM
F35 de grande protéine S, la quantité des protéines S à diminué de 60 %, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 55 t des protéines S présentes dans les sérums de ces deux individus.

2) Etude realisée sur un groupe d'individus porteurs symptomatiques chez lesquels la réplication virale est nulle (ADN d'HBV non détectable) et possédant des anticorps anti-HBe - chez 80 % de ces individus, la quantité de grande protéine S est nettement inférieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines représentant respectivement 15 % et 40 % des protéines S contenues dans le sérum desdits individus, - chez 20 t de ces individus, on ne détecte plus de grande protéine S, et la protéine S moyenne détectée représente environ 35 t des protéines S contenues dans le sérum de ces individus.

I1 faut noter que dans ce même groupe d'individus, la technique d'amplification d'ADN (technique PCR) conduit à la détection chez 80 t d'entre eux d'ADN d'HBV (correspondant & une réplication virale à bas bruit), tandis que chez 20 t d'entre eux, on ne détecte plus d'ADN de 1'HBV. I1 semble donc exister une bonne corrélation des résultats obtenus entre ces deux méthodes, celle de l'invention étant plus avantageuse que celle d'amplification de 1'ADN, compte tenu de la complexité de de mise en oeuvre de cette dernière.

3) Etude menée sur un groupe d'individus porteurs asymtomatiques (ou encore porteurs "sains") chez lesquels la réplication virale est nulle, et qui sont porteurs d'anticorps anti-HBe - chez 25 % des individus de ce groupe, aucune protéine
S n'a été détectée, - chez 18 t des individus de ce groupe, ne sont détectées que des protéines S majeures, - chez 46 % des indvidus de ce groupe, on ne détecte pas de grande protéine S, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 50 t des protéines
S présentes dans les sérums de ces individus.

Les légendes des figures mentionnées dans la description détaillée qui précède sont les suivantes - figure 1 : représentation schématique de 1'HBV structure, composants, et interaction(s) cellule-virus.

R1 est le récepteur cellulaire impliqué dans la liaison directe de 1'HBV par l'intermédiaire des séquences pré-Sl ; R2 est le récepteur cellulaire pour la p(HSA) probablement impliqué dans la liaison indirecte de llHBV et d'HBsAg par l'intermédiaire des séquences pré-S2 portant le récepteur viral pour la glutaraldehyde-pHSA.

- figure 2 : figure 2a ; dosage radio-immunologique des séquences S, pré-S2 et pre-S1 dans les particules HBsAg (A) et dans les préparations d'HBV purifié à partir de sérum humain (B), et utilisées comme sonde anti-génique dans la figure 2b. Les billes enduites d'anticorps anti-HBs ont été mises en présence avec des concentrations décroissantes soit d'HBsAg soit d'HBV et l'antigène lié a été détecte en utilisant l'anticorps monoclonal F39.20 spécifique de la région S

et l'anticorps monoclonal F124 spécifique de la région pré-S2

et l'anticorps monoclonal MA18/7 spécifique de la région pre-Sl

(i une concentration finale de 5 pg/ml). Figure 2b ;; spécificité polypeptidique de l'anticorps F35.25 par la technique des immuno-empreintes (Western blot). A, sérum HBs/pré-S2AG t B, sérum HBs/pré-S2/pré-SlAg (HBV)t C, HSA (200 Ag/ml) ; D, NHS (dilué au 1:500). La liaison des anticorps monoclonaux dans la figure 2a comme dans la figure 2b a été déterminée avec une anti-immunoglobuline de souris, le fragment F(ab')2 marqué à 1125 (rJl06 cpm par bille ou par bande de gel).

- figure 3 : séquence en acides aminés (déduites à partie des séquences d'ADN de 1'HBV) des régions pré
S(21-53), et pré-S(94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant å 5 sous-types antigéniques d'HBV. La localisation de l'épitope reconnu par F35.25 est indiqué sur la figure . Les résidus d'aciaes aminés communs aux 5 sous-types sont indiqués par des petits ronds sous chacun de ces acides aminés. Le dipeptide encadré PA est celui probablement requis pour la liaison å l'anticorps F35.25 t la séquence peptidique encadrée s'étendant des acides aminés 40 à 47 (NPDWDFNP), est conservée chez tous les sous-types HBV à l'intérieur du site de liaison de l'anticorps F35.25 ; T représente les sites de clivage par la trypsine accessible dans les particules HBV complètes.

- figure 4 : dosage radio-immunologique (RIA) à double anticorps, réalisé avec un fluide d'hybridome dilué deux fois contenant F35.25 ( ru 10 ng/ml). a, les peptides spécifiques de la région pré-Sl 1-21, 12-32, 32-53, 53-73, 94-117 ont été utilisés pour enduire des billes. F35.25 lié aux billes enduites de peptide synthétique a été détecté avec une anti-immunoglobuline de souris marquée avec 1125 comme il l'a été décrit dans la figure 2. Figure 4b, les particules HBsAg contenant les séquences pré-S2 de cellules recombinantes CHO, les particules d'HBV purifiées, HSA, pBSA et pHSAont été utilisées pour enduire des billes dans les mêmes conditions que pour la figure 4a. Chaque colonne représente deux déterminations.

- figure 5 : effet inhibiteur des peptides spécifiques de la région pré-Sl et des particules d'HBV purifiées (à une concentration finale de 20 ZgXml) sur la liaison de 1'ACM F35.25 aux puits enduits avec soit pré
S(32-53) (figure 5a) ou avec HBV sous-type ad (figure 5b). Les conditions de cette expérience ont été décrites dans le chapitre MATERIELS ET METHODES en utilisant un fluide d'hybridome dilué deux fois comme dans la figure 4.

- figure 6 : sensibilité de 1'ACM F35.25 pour détecter le peptide pré-S(32-53) et les séquences pré-S1 dans les particules d'HBV purifiées. Les puits enduits soit avec le peptide pré-S(32-53) ( u ) (5 pg/ml) ou avec
HBV sous-type ad ( il ) (10 pg/ml) ont été mis en présence avec des concentrations décroissantes de
F35.25 purifié à partir de surnageants de cellules d'hybridome.

- figure 7 : effet de la digestion par la trypsine ou la protéase V8 des particules HBV purifiées (sous-type ad) sur la liaison de 1'ACM F35.25 (a), de l'anticorps monoclonal F376 spécifique de la région pré-S2 (b) et de l'anticorps 6-16 A15 spécifique de la région S (c) à la protéine env par technique d'immuno-empreinte. Le traitement de l'antigène a été coalisé comme il ita été décrit dans le chapitre MATERIELS ET METHODES.Les lignes 1, 4, et 7 représentent des contrôles sans enzyme ; les lignes 2, 5 et 8 représentent les produits de la digestion par la trypsine ; les lignes 3, 6 et 9 -représentent les produits de digestion par la protéase
V8. les lignes 1 à 3 ont été sondées avec le surnageant d'hybridome dilue au 1:2, et les lignes 4 à 9 ont été sondées avec 5 pG/ml d'anticorps monoclonal purifié à partir de liquide d'ascites. L'anticorps se liant aux protéines transférées a été détecté avec l'antiimmunoglobuline de souris marquée avec 1125. les poids moléculaires des peptides ( x 10 3) sont indiquées sur la gauche.

- figure 8 : gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad). 1 ml de matériel enrichi en virus a été sédimenté dans un gradient linéaire de sucrose de 10 à 60 % dans un tampon TN pendant 18 heures à 160000 g et 4 c. Les fractions ont été réunies et sondées avec 1'ACM F39.20

ou 1'ACM F35.25

par dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps utilisant une phase solide portant des anticorps polyclonaux de lapin anti-HBs. La concentration de sucrose

a été testée par refraction. Les fractions 6-8 (40-50 % de sucrose) ont été testées pour leur teneur en ADN d'HBV par hybridation, et pour leur teneur en protéine majeure du corps P22', par immunotransfert (+).

- figure 9 : détection de la séquence pre-Sl (32-53) dans les particules d'HBV isolées (sous-type ad ou en utilisant le systeme de dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps, avec des immunoglobulines anti-HBs sur la face solide et l'anticorps F35.25 sur la face de révélation. Les particules d'HBV purifiées ont été utilisées å une concentration d'l g/ml. La liaison de F35.25 a été détectée avec l'anti-immunoglobuline de souris marquée avec 1125, fragment F(ab')2.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est défini par la combinaison des propriétés suivantes: - il forme un complexe immunologique avec

un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-Sl,

. la région pre-S1 de la grande protéine d'enveloppe de 1'HBV,

les grandes protéines d'enveloppe de 1'HBV, P39 et GP42,

chacun des produits de clivage de la région pre-S1 de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la trypsine, et dont les poids moléculaires sont de 13500 et 14500 respectivement, - il ne forme pas de complexe immunologique avec

les glycoprotéines moyennes d'enveloppe de llHBV, GP33 et GP36,

les (glyco)proteines majeures d'enveloppe de 1'HBV, P24 et GP27,

. la sérum albumine humaine (HSA),

. la sérum-albumine humaine polymérisée (pHSA),

. les immunoglobulines G, A, M,

. les divers constituants des sérums d'individus non infectés par l'HBV.

2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est défini par les propriétés suivantes

- il appartient à la classe de IgGi - il forme un complexe immunologique avec

. la très grande protéine d'enveloppe de 1'HBV de 66 kd (kilodaltons),

chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la protéase V8 de S. aureus, et dont les poids moléculaires sont de 15000, 16500, et 29000 respectivement.

3. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est secrété par l'hybridome qui a été déposé à la

C.N.C.M. sous le numéro I-796 le 5 août 1988.

4. Hybridome caractérisé en ce qu'il secrète l'anticorps monoclonal selon la revendication 1.

5. Méthode pour obtenir et isoler des hybridomes secrétant un anticorps monoclonal selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'elle comprend - la fusion de cellules spléniques d'un animal immunisé à l'aide des particules d'HBV, avec des cellules myélomateuses dans des conditions permettant la formation d'hybridomes , - la détection et la récupération de ceux des hybridomes sus-mentionnés qui secretent des anticorps monoclonaux possédant les propriétés de celui selon la revendication 1.

6. Méthode de détection in vitro de la présence événtuelle de la grande protéine S d'enveloppe d'HBV dans un échantillon biologique prélevé chez un individu infecté par HBV caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pré-S1 de la grande protéine S et ledit anticorps monoclonal ; - la détection du susdit complexe immunologique.

7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend plus particulièrement les étapes suivantes - fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux, susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S d'enveloppe de 1'HBV; - rinçage du support afin d'éliminer ceux des susdits anticorps non fixés sur le support ; - addition sur le support de l'échantillon biologique, notamment du sérum, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre les anticorps polyclonaux sus-mentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans ledit sérum ;

- rinçage du support afin d'éliminer les differents constituants dudit sérum non reconnus par les anticorps sus-mentionnés ;;

- addition sur le support des anticorps monoclonaux selon la reendication 1, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre lesdits anticorps monoclonaux et celles des protéines S engagées dans le complexe immunologique précédent et comprenant la région pre-Sl; - rinçage du support afin d'éliminer ceux des anticorps monoclonaux non engagés dans une réaction immunologique avec ladite région pré-Sl des grandes protéines S ;; - addition sur le support d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec les susdits anticorps monoclonaux dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique final formé entre lesdites anti-immunoglobulines et les anticorps monoclonaux engagés dans le complexe immunologique obtenu à l'étape précédente - détection de la quantité d'anti-immunoglobulines marquées engagées dans le complexe immunologique final sus-mentionné, cette quantité pouvant être corrélée à la quantité de grandes protéines S présente dans ledit sérum.

8. Méthode de détection in vitro de la proportion de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure présente dans un échantillon biologique prélevé chez un individu atteint d'hépatite B, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en oeuvre de la méthode décrite dans la revendication 7, - la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de la revendication 7, d'une méthode comprenant les mêmes étapes que celles décrites dans cette dernière, et dans lesquelles, d'une part l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 est remplacé par un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, et, d'autre part, les anti-immunoglobulines reconnaissant 1'ACM de la revendication 1 sont remplacées par des antiimmunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec 1'ACM reconnaissant la protéine S majeure sus-mentionné - la comparaison des quantités de grande protéine S et de protéine S majeure ainsi mesurées.

9. Application du procédé selon la revendication 8 au diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez des individus infectés par 1'HBV.

10. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'un méthode selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux fixés sur un support solide et susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S, - une quantité déterminée de l'anticorps monoclonal selon la revendication 1, - éventuellement une quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure d'enveloppe de 1'HBV, - avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les anticorps susmentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique, - avantageusement des réactifs marqués, notamment des immunoglobulines marquées, permettant la détection des complexes immunologiques dans lesquels sont engagés les anticorps monoclonaux squs-mentionnés.

11. Composition pharmaceutique pour le traitement de l'hépatite B, et plus particulièrement pour la prévention des phénomènes réinfection du greffon lors de greffe du foie chez les individus atteints d'hépatite B, caractérisée en ce qu'elle comprend l'anticorps monoclonal selon la revendication 1 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

12. Anticorps monoclonal anti-idiotype caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal selon la revendication 1.

13. Procédé d'obtention de l'anticorps monoclonal anti-idiotype selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on immunise un animal à l'aide d'un anticorps monoclonal selon la revendication 1 et que l'on récupère ceux des anticorps susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal selon la revendication 1.

14. Composition pour la vaccination contre l'hépatite B, caractérisée par l'association de l'anticorps monoclonal anti-idiotype selon la revendication 12 avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.