FR2637184A1 - MONOCLONAL ANTIBODY RECOGNIZING A PRE-S1 REGION OF THE HIGH HEPATITIS B VIRUS ENVELOPE PROTEIN AND ITS APPLICATIONS, IN PARTICULAR FOR IN VITRO DIAGNOSIS AND TREATMENT OF HEPATITIS B - Google Patents
MONOCLONAL ANTIBODY RECOGNIZING A PRE-S1 REGION OF THE HIGH HEPATITIS B VIRUS ENVELOPE PROTEIN AND ITS APPLICATIONS, IN PARTICULAR FOR IN VITRO DIAGNOSIS AND TREATMENT OF HEPATITIS B Download PDFInfo
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Abstract
Description
ANTICORPS MONOCLONAL RECONNAISSANT UNE REGION
PRE-S1 DE LA GRANDE PROTEINE D'ENVELOPPE DU VIRUS DE
L'HEPATITE B ET SES APPLICATIONS, NOTAMMENT POUR LE
DIAGNOSTIC IN VITRO ET LE TRAITEMENT DE L'HEPATITE
B.MONOCLONAL ANTIBODY RECOGNIZING A REGION
PRE-S1 OF THE LARGE ENVELOPE PROTEIN OF THE VIRUS
HEPATITIS B AND ITS APPLICATIONS, IN PARTICULAR FOR THE
IN VITRO DIAGNOSIS AND TREATMENT OF HEPATITIS
B.
L'invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope situé dans la région pré-Sl de la grande protéine d'enveloppe du virus de l'hépatite B (HBV). L'invention a également pour objet les applications de cet anticorps monoclonal, notamment pour le diagnostic in vitro de l'évolution de la maladie chez un individu atteint d'hépatite B chronique, ainsi que pour le traitement de l'hépatite
B, et la vaccination contre cette maladie.The present invention provides a monoclonal antibody that recognizes an epitope located in the pre-Sl region of the large envelope protein of hepatitis B virus (HBV). The subject of the invention is also the applications of this monoclonal antibody, in particular for the in vitro diagnosis of the course of the disease in an individual suffering from chronic hepatitis B, as well as for the treatment of hepatitis.
B, and vaccination against this disease.
L'enveloppe de 1'HBV contient trois types de protéines de surface (protéines S). Les protéines S sont les seuls composants viraux trouvés dans les particules antigéniques de surface de l'hépatite B (particules HBsAg) qui sont exprimées en grande quantité par rapport au virus lui-même lors d'une infection. Ces particules HBsAg se présentent sous forme sphérique ou tubulaire avec un diametre plus faible (22 nm) que les particules d'HBV infectieuses (42 nm). The envelope of HBV contains three types of surface proteins (S proteins). S-proteins are the only viral components found in hepatitis B surface antigenic particles (HBsAg particles) that are expressed in large amounts relative to the virus itself during an infection. These HBsAg particles are in spherical or tubular form with a smaller diameter (22 nm) than the infectious HBV particles (42 nm).
Ces trois protéines S sont les suivantes - la "petite" protéine S, ou protéine S majeure, constituée de la séquence (ou région) S de 226 acides aminés, (PETERSON, D.L. et al, (1977) Proc. Natl. Acad. These three S proteins are as follows - the "small" S protein, or major S protein, consisting of the 226 amino acid sequence (or region) S (PETERSON, D.L. et al., (1977) Proc Natl Acad.
Sci., USA, 74, 1530-1534) , - la protéine S "moyenne" constituée de la séquence S sus-mentionnée et de 55 acides aminés N-terminaux additionnels codés par la région pré-S2 de 1'ADN de l'HBV (MACHIDA, A. et al (1984), Gastroenterology, 86, 910-918) - la "grande" protéine S constituée des séquences S, pré-S2 et de 108 (sous-type antigénique ad) ou 119 (sous-type antigénique ay) acides aminés N-terminaux additionnels codés par la région pr6-Sl de l'ADN de 1'HBV (HEERMANN, K. et al (1984), J. Virol., 52, 396-402 t WONG, D.T. et al (1985) J. Virol., 55, 223-231).Sci., USA, 74, 1530-1534), the "average" S protein consisting of the above-mentioned S sequence and 55 additional N-terminal amino acids encoded by the pre-S2 region of the DNA of the HBV (MACHIDA, A. et al (1984), Gastroenterology, 86, 910-918) - the "large" protein S consisting of S, pre-S2 and 108 (antigenic subtype ad) or 119 (subclass) sequences. antigenic type ay) additional N-terminal amino acids encoded by the pr6-Sl region of HBV DNA (HEERMANN, K. et al (1984) J. Virol., 52, 396-402 t WONG, DT et al (1985) J. Virol., 55, 223-231).
Ces trois protéines S existent sous différentes formes glycosylées
- les protéines majeures P24 et GP27,
- les protéines moyennes GP33 et GP36,
- les grandes protéines P39 et GP42.These three S proteins exist in different glycosylated forms
the major proteins P24 and GP27,
the average proteins GP33 and GP36,
- the major proteins P39 and GP42.
Les protéines moyennes et grandes ont été trouvées en plus forte concentration dans les particules infectieuses d'HBV (qui contiennent également l'antigène du core du virus, HBcAg) que dans les particules HBsAg sus-mentionnées (HEERMANN, K.H., et al précédemment cité, et TAKAHASHI, K. et al (1986) J. The medium and large proteins were found in higher concentration in the infectious HBV particles (which also contain the HBcAg core) than in the above-mentioned HBsAg particles (HEERMANN, KH, et al previously cited , and TAKAHASHI, K. et al (1986) J.
Immunol., 136 , 3467-3472).Immunol., 136, 3467-3472).
Ces protéines jouent donc probablement un rôle dans l'assemblage ou le fonctionnement des particules
HBV infectieuses.These proteins therefore probably play a role in the assembly or functioning of the particles
HBV infectious.
Il est estimé que les régions pré-S2 et pré-Sl des protéines S jouent un rôle dans les mécanismes de reconnaissance et de pénétration des HBV dans les hépatocytes des individus infectés par 1'HBV. Ainsi le site de liaison d'HBV aux récepteurs des hépatocytes serait localisé entre les acides aminés situés aux positions 21 et 47 de la région (ou séquence) pré-S1 (NEURATH, A.R. et al, (1986) CE11, 46, 429-436). It is believed that the pre-S2 and pre-S1 regions of S proteins play a role in HBV recognition and penetration mechanisms in hepatocytes of HBV-infected individuals. Thus, the HBV binding site to the hepatocyte receptors would be located between the amino acids located at positions 21 and 47 of the pre-S1 region (or sequence) (NEURATH, AR et al., (1986) CE11, 46, 429- 436).
Ces auteurs ont également démontré que l'interaction entre HBV et les cellules de l'hématome
HepG2 est fortement inhibée par des anticorps dirigés contre un peptide s'étendant entre les résidus d'acides aminés aux positions 21 et 47 de la séquence pre-Sl (d'ou la désignation "anticorps anti-pré-S (21-47) ") ainsi que par des anticorps anti-pré-S(32-53 > . These authors also demonstrated that the interaction between HBV and hematoma cells
HepG2 is strongly inhibited by antibodies directed against a peptide extending between the amino acid residues at positions 21 and 47 of the pre-Sl sequence (hence the designation "anti-pre-S antibody (21-47) ") as well as anti-pre-S antibodies (32-53>.
Compte tenu du rôle vraisemblablement important de la région pré-Sl dans la mécanisme infectieux de l'HBV, et notamment dans la reconnaissance des récepteurs des hépatocytes, les anticorps reconnaissant spécifiquement cette région, et plus particulièrement ltépitope responsable de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, seraient probablement d'une grande valeur dans le domaine de la lutte contre l'hépatite B. Given the presumably important role of the pre-Sl region in the infectious mechanism of HBV, and especially in the recognition of hepatocyte receptors, the antibodies specifically recognize this region, and more particularly the epitope responsible for the binding of HBV. on hepatocytes, would probably be of great value in the field of hepatitis B control.
Néanmoins, les anticorps monoclonaux connus å ce jour ne se sont pas avérés présenter les propriétés voulues à cet effet t on notera que l'anti-pré-S(32-53) susmentionné, a été obtenu à l'aide de la séquence pré
S(32-53) qui n'induit pas de réponse anti-HBV dans les sérum de malades. La vaccination à l'aide d'une telle séquence s'avère par conséquent peu envisageable.Nevertheless, the monoclonal antibodies known to date have not been found to have the properties desired for this purpose. It will be appreciated that the above-mentioned anti-pre-S (32-53) has been obtained using the precursor sequence.
S (32-53) which does not induce an anti-HBV response in the serum of patients. Vaccination with such a sequence is therefore unlikely.
Afin de disposer d'anticorps plus spécifiques de la région pré-Sl que ne le sont les actuels anticorps polyclonaux sus-mentionnés, d'autres anticorps monoclonaux ont été préparés à partir de lymphocytes d'animaux immunisés avec des particules HBV (TAKAHASHI,
K. et al (1986) précédemment cité), ou avec des peptides synthétiques tels que pré-S1(1-11) et pré
S(13-21) (OHNUMA, H, et al (1986) Gastroenterology, 90, 695-701). Ceux-ci n'ont pas été caractérisés en détail. In order to have antibodies more specific for the pre-Sl region than the current polyclonal antibodies mentioned above, other monoclonal antibodies have been prepared from lymphocytes of animals immunized with HBV particles (TAKAHASHI,
K. et al (1986) previously cited), or with synthetic peptides such as pre-S1 (1-11) and pre
S (13-21) (OHNUMA, H, et al (1986) Gastroenterology, 90, 695-701). These have not been characterized in detail.
Un anticorps monoclonal (ACM) a été plus particulièrement décrit dans la demande de brevet européen publiée le 07/05/1986 sous le numéro 0 180 012 de GERLICH et al. Cet anticorps monoclonal (MA18/7) reconnaît spécifiquement la séquence pré-S(38-121) de la région pré-Sl, mais ne permet pas l'identification du site spécifique de liaison du virus sur les hépatocytes. A monoclonal antibody (ACM) has been more particularly described in the European patent application published on 07/05/1986 under the number 0 180 012 of GERLICH et al. This monoclonal antibody (MA18 / 7) specifically recognizes the pre-S (38-121) sequence of the pre-S1 region, but does not allow the identification of the specific binding site of the virus on hepatocytes.
Cet ACM MA18/7 présente également l'inconvénient de donner lieu à des réaction immunologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV, ce qui représente un inconvénient majeur pour son utilisation dans des procédés de diagnostic in vitro. This MCA MA18 / 7 also has the drawback of giving rise to cross-immunological reactions with the sera of individuals not infected with HBV, which represents a major drawback for its use in in vitro diagnostic methods.
La présente invention a pour objet un anticorps monoclonal présentant l'avantage par rapport aux anticorps anti-pré-S1 connus, d'une part, d'être plus spécifiques de la séquence en acides aminés de la région pré-Sl impliquée dans le mécanisme de la fixation de l'HBV sur les hépatocytes, et, d'autre part, de ne pas donner lieu à des réactions immunologiques croisées avec les sérums d'individus non infectés par l'HBV. The subject of the present invention is a monoclonal antibody having the advantage over known anti-pre-S1 antibodies, on the one hand, of being more specific of the amino acid sequence of the pre-Sl region involved in the mechanism. of HBV binding to hepatocytes, and, secondly, not to give rise to cross-reactive immunological reactions with the sera of individuals not infected with HBV.
L'invention concerne également une nouvelle méthode de détection, et de dosage in vitro de la grande protéine pré-Sl plus précise que celles élaborées à l'aide des anticorps connus, ainsi que l'application de cette méthode au diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique. The invention also relates to a new method for detecting, and in vitro assaying of, the large pre-Sl protein which is more accurate than those elaborated with the aid of known antibodies, as well as the application of this method to the in vitro diagnosis of evolution of chronic hepatitis B.
L'invention a également pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques pour le traitement de l'hépatite B et pour la vaccination contre cette maladie. The invention also relates to new pharmaceutical compositions for the treatment of hepatitis B and for vaccination against this disease.
Il sera fait reférence dans la description qui suit aux dessins dans lesquels - la figure l est une représentation schématique du virus de l'hépatite B (HBV), - la figure 2a représente les résultats d'un dosage radio-immunologique (RIA) des séquences S, pré-S2, et pre-Sl dans les particules HBsAg et l'HBV. La figure 2b représente la spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal de l'invention déterminée par la technique des immuno-empreintes, - la figure 3 représente les séquences d'acides aminés des régions pré-S(2r-53), et pre-S(94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant à 5 sous-types antigéniques de l'HBV, - la figure 4 (a et b) représente les résultats d'un dosage radio-immunologique spécificité d'anticorps réalisé à l'aide de l'anticorps monoclonal de l'invention, - la figure 5 représente les effets inhibiteurs des peptides spécifiques de la région pré-Sl et des particules HBV vis-à-vis de la liaison de l'anticorps monoclonal de l'invention avec le peptide pré-S(32-53) (figure 5a), ou avec 1'HBV sous-type ad (figure 5b), - la figure 6 représente la sensibilité de l'anticorps monoclonal de l'invention pour la détection de la région pré-Sl, - la figure 7 représente les résultats de la digestion des particules d'HBV par la trypsine ou la protéase V8, - la figure 8 représente un gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad), - la figure 9 représente la détection de la séquence pré-S1(32-53) dans les particules d'HBV purifiées et suivant le système du dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps. Reference is made to the following description of the drawings in which - Figure 1 is a schematic representation of hepatitis B virus (HBV); - Figure 2a shows the results of a radioimmunoassay (RIA) of S, pre-S2, and pre-S1 sequences in HBsAg particles and HBV. FIG. 2b represents the polypeptide specificity of the monoclonal antibody of the invention determined by the immunoblotting technique, FIG. 3 represents the amino acid sequences of the pre-S (2r-53) regions, and FIG. S (94-117) large surface proteins P39 and GP42, corresponding to 5 antigenic subtypes of HBV, - Figure 4 (a and b) represents the results of a radioimmunoassay antibody specificity made using the monoclonal antibody of the invention, FIG. 5 represents the inhibitory effects of the peptides specific for the pre-Sl region and the HBV particles with respect to the binding of the monoclonal antibody of the invention with the pre-S (32-53) peptide (FIG. 5a), or with the HBV subtype ad (FIG. 5b), FIG. 6 represents the sensitivity of the monoclonal antibody of the invention for the detection of the pre-Sl region; FIG. 7 represents the results of the digestion of the HBV particles by trypsin or protease V8; FIG. 8 represents a sucrose gradient of HBV particles (subtype ad); FIG. 9 represents the detection of the pre-S1 sequence (32-53) in HBV particles. purified and following the system of radioimmunoassay with dual specificity of antibodies.
L'invention concerne un anticorps monoclonal (ciapres désigné par ACM F35-25) défini par la combinaison des propriétés suivantes - il forme un complexe immunologique avec
un épitope compris entre les acides aminés situés aux positions 32 et 53 de la région pré-Sl,
. la région pré-Sl de la grande protéine S d'enveloppe de l'HBV,
les grandes protéines d'enveloppe de l'HBV, P39 et GP42,
. la tres grande protéine d'enveloppe de 1'HBV de 66 kd (kilodaltons),
chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la trypsine, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pré-S1 de ladite grande protéine S et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500,
chacun des produits de clivage de la grande protéine S d'HBV obtenus par digestion de cette dernière avec la protéase V8 de S. aureus, et dont les poids moléculaires sont de 15000, 16500, et 29000, respectivement, - il ne forme pas de complexe immunologique avec
. les (glyco)protéines S moyennes d'enveloppe de l'HBV, GP33 et GP 36
les glycoprotéines S majeures d'enveloppe de l'HBV P24 et GP27
. la sérum-albumine-humaine (HSA) ;
. la sérum-albumine humaine polymérisée (pHSA) t
les immunoglobulines G, A et M
les divers constituants de sérums d'individus non infectés par 1'HBV.The invention relates to a monoclonal antibody (ciapres designated ACM F35-25) defined by the combination of the following properties - it forms an immunological complex with
an epitope between the amino acids located at positions 32 and 53 of the pre-Sl region,
. the pre-Sl region of the large HBV envelope protein S,
the large envelope proteins of HBV, P39 and GP42,
. the very large envelope protein of the HBV of 66 kd (kilodaltons),
each of the cleavage products of the large HBV S protein obtained by digestion of the latter with trypsin, the two products of which are derived from the trypsin cleavage of the pre-S1 region of said large S protein and having respectively the molecular weights from 13500 and 14500,
each of the cleavage products of the large HBV S-protein obtained by digestion thereof with the S. aureus V8 protease, and whose molecular weights are 15000, 16500, and 29000, respectively, - it does not form immunological complex with
. the (Glyco) S average envelope proteins of HBV, GP33 and GP 36
the major envelope glycoproteins of HBV P24 and GP27
. serum albumin-human (HSA);
. Polymerized human serum albumin (pHSA) t
immunoglobulins G, A and M
the various constituents of sera of individuals not infected with HBV.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention appartiennent de préférence à la classe des immunoglobulines Gl(IgGl). The monoclonal antibodies according to the invention preferably belong to the class of immunoglobulins G1 (IgG1).
L'anticorps monoclonal sus-mentionné peut être obtenu par un procédé comprenant la fusion de cellules myélomateuses et de cellules spléniques prélevées sur un animal immunisé avec des particules HBV, suivant la technique générale d'obtention des hybridomes, et la détection et la récupération de ceux des hybridomes qui secretent les anticorps monoclonaux possédant les propriétés définies ci-dessus. The monoclonal antibody mentioned above can be obtained by a process comprising the fusion of myeloma cells and spleen cells taken from an animal immunized with HBV particles, according to the general technique for obtaining hybridomas, and the detection and recovery of those hybridomas that secrete monoclonal antibodies having the properties defined above.
L'invention vise également les hybridomes susceptibles de secréter des anticorps monoclonaux cidessus définis, notamment ACM F35.25. The invention also relates to hybridomas capable of secreting monoclonal antibodies defined above, in particular ACM F35.25.
L'invention a plus particulierement pour objet l'hybridome secrétant 1'ACM F35.25 et qui a été déposé à la COLLECTION NATIONALE DES CULTURES DE MICRO
ORGANISMES (C.N.C.M.) de 1'INSTITUT PASTEUR à PARIS sous le numéro I-796 le 5 août 1988.The invention more particularly relates to the hybridoma secreting ACM F35.25 and which has been deposited at the NATIONAL COLLECTION OF CULTURES MICRO
ORGANISMS (CNCM) of the INSTITUT PASTEUR at PARIS under number I-796 on August 5, 1988.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de la présence éventuelle de la grande protéine S (comprenant la région pré-S1) dans un échantillon biologique susceptible de contenir ladite protéine, cette méthode comprenant - la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec l'ACM F35.25 dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pré-S1 de la grande protéine S et 1'ACM F35.25 - la détection du susdit complexe immunologique. The invention also relates to a method for the in vitro detection of the possible presence of the large protein S (comprising the pre-S1 region) in a biological sample that may contain said protein, this method comprising - contacting the sample Biological Above mentioned with ACM F35.25 under conditions allowing the possible obtaining of an immunological complex formed between the pre-S1 region of the large protein S and ACM F35.25 - the detection of the aforesaid immunological complex.
Une telle méthode de détection in vitro peut être réalisée suivant toute technique en soi connue de l'homme du métier. Such an in vitro detection method can be carried out according to any technique known to those skilled in the art.
Cette méthode comprend par exemple les étapes suivantes - fixation sur un support solide de 1'ACM F35.25 - addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre la région pre-Sl de la grande protéine et l'ACM F35.25. This method comprises, for example, the following steps: - fixing on a solid support of ACM F35.25 - addition of the biological sample to the aforementioned support under conditions allowing the possible obtaining of an immunological complex formed between the Pre-Sl region of the great protein and ACM F35.25.
- addition ensuite sur le support solide d'autres anticorps à leur tour susceptibles de former un complexe immunologique avec le complexe précédent, tel que l'ACM F35.25 ; ces anticorps sont marqués, notamment de manière radioactive, ou enzymatique - détection a. l'aide de réactifs appropriés des anticorps marqués sus-mentionnés engagés dans le susdit complexe immunologique,
Une variante de la méthode de détection in vitro comprend encore les étapes suivantes - fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux, susceptibles de former un complexe immunologique avec la région S des proteines S;; - addition de l'échantillon biologique sur le support sus-mentionné dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique formé entre les anticorps sus-mentionnés et la région S des protéines S contenues dans l'échantillon - addition de l'ACM F35.25, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre celles des protéines S contenues dans l'échantillon et portant la région peu S1 (c'est-à-dire les grandes protéines S) et l'ACM
F35.25 - détection à l'aide de réactifs appropriés de l'ACM
F35.25 marqué. et qui est engagé dans le susdit complexe immunologique, - ou, Si 1'ACM F35.25, n'est pas marqué, détection du dernier complexe immunologique sus-mentionné à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées (obtenues chez un animal d'une espece différente de celui utilisé pour l'obtention des anticorps fixes sur le support solide) susceptibles de former un complexe immunologique avec 1'ACM F35.25 engagé dans le dernier complexe immunologique obtenu lors de l'étape précédente.then adding on the solid support other antibodies in turn capable of forming an immunological complex with the above complex, such as ACM F35.25; these antibodies are labeled, in particular radioactively, or enzymatically - detection a. using the appropriate reagents of the above-mentioned labeled antibodies involved in the above-mentioned immunological complex,
A variant of the in vitro detection method also comprises the following steps: fixation on a solid support of antibodies, preferably polyclonal, capable of forming an immunological complex with the S region of the S proteins; the biological sample is added to the aforementioned support under conditions allowing the possible obtaining of an immunological complex formed between the abovementioned antibodies and the S region of the S proteins contained in the sample; ACM F35.25, optionally labeled, in particular radioactively or enzymatically, under conditions making it possible to obtain an immunological complex formed between those of the S proteins contained in the sample and bearing the S1 little region (ie say the big S proteins) and the ACM
F35.25 - detection using appropriate ACM reagents
F35.25 marked. and which is engaged in the aforesaid immunological complex, - or, if the ACM F35.25, is not labeled, detecting the last immunological complex mentioned above with the aid of labeled anti-immunoglobulins (obtained in an animal of a species different from that used to obtain fixed antibodies on the solid support) capable of forming an immunological complex with the ACM F35.25 involved in the last immunological complex obtained in the previous step.
Selon un mode de réalisation plus détaille d'une méthode de détection in vitro préférée de l'invention, cette derniere comprend les étapes suivantes - fixation sur un support solide d'anticorps, de préférence polyclonaux (obtenus par exemple par immunisation de lapins) susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S d'enveloppe de l1HBV;; - rinçage du support afin d'éliminer ceux des susdits anticorps non fixés sur le support - addition sur le support de l'échantillon biologique, notamment du sérum, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre les anticorps polyclonaux sus-mentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans ledit sérum
- rinçage du support afin d'éliminer les différents constituants dudit sérum non reconnus par les anticorps sus-mentionnés ;;
- addition sur le support des anticorps monoclonaux ACM F35.25 selon l'invention, dans des conditions permettant l'obtention éventuelle d'un complexe immunologique entre lesdits anticorps monoclonaux et celles des protéines S engagées dans le complexe immunologique précédent et comprenant la région pré-S1 des grandes protéines - rinçage du support afin d'éliminer ceux des anticorps monoclonaux non engagés dans une réaction immunologique avec ladite région pré-S1 des grandes protéines S - addition sur le support d'anti-immunoglobulines marquées susceptibles de former un complexe immunologique avec 1'ACM F35.25 (obtenues par immunisation d'une espèce animale identique à celle utilisée pour l'obtention de l'ACM F35.25, et différente de celle utilisée pour l'obtention des anticorps polyclonaux fixés sur le support solide ; ces anti-immunoglobulines peuvent être obtenues dans l'exemple présent par immunisation de souris) dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique final formé entre lesdites antiimmunoglobulines et l'ACM F35.25 engagé dans le complexe immunologique obtenu à l'étape précédente.According to a more detailed embodiment of a preferred in vitro detection method of the invention, the latter comprises the following steps: - fixation on a solid support of antibodies, preferably polyclonal (obtained for example by rabbit immunization) susceptible to give rise to an immunological reaction with the S region of 11HBV envelope S proteins; rinsing of the support in order to eliminate those of the aforesaid antibodies not fixed on the support - addition on the support of the biological sample, in particular of the serum, under conditions allowing the possible obtaining of an immunological complex between the polyclonal antibodies above -mentionnés and S proteins likely to be contained in said serum
rinsing the support in order to eliminate the various constituents of said serum not recognized by the abovementioned antibodies;
addition on the support of the monoclonal antibodies ACM F35.25 according to the invention, under conditions allowing the possible obtaining of an immunological complex between said monoclonal antibodies and those of the proteins S engaged in the preceding immunological complex and comprising the pre-region -S1 large proteins - rinsing the support in order to eliminate those monoclonal antibodies not involved in an immunological reaction with said pre-S1 region of the large S-addition proteins on the support of labeled anti-immunoglobulins capable of forming an immunological complex with ACM F35.25 (obtained by immunization of an animal species identical to that used to obtain ACM F35.25, and different from that used to obtain the polyclonal antibodies fixed on the solid support; these anti-immunoglobulins can be obtained in the present example by immunization of mice) under conditions making it possible to obtain n final immunological complex formed between said anti-immunoglobulins and ACM F35.25 involved in the immunological complex obtained in the previous step.
- détection de la quantité d'anti-immunoglobulines marquées engagées dans le complexe immunologique final sus-mentionné, cette quantité pouvant être corrélée à la quantité de protéines S portant la région pre-Sl, ou encore grandes protéines S, présentes dans ledit sérum.detection of the amount of labeled anti-immunoglobulins involved in the final immunological complex mentioned above, this amount being correlatable to the amount of S proteins carrying the pre-Sl region, or large S proteins, present in said serum.
L'invention concerne également l'application de la méthode de détection in vitro sus-mentionnée au diagnostic in vitro de l'hépatite B aigue ou chronique réalisé à partir d'un échantillon biologique, tel que du sérum, prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par HBV. The invention also relates to the application of the above-mentioned in vitro detection method to the in vitro diagnosis of acute or chronic hepatitis B made from a biological sample, such as serum, taken from an individual who is susceptible to to be infected with HBV.
L'invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic in vitro de l'évolution de l'hépatite B chronique chez un individu porteur symptomatique ou asymptomatique des protéines S de i 'HBV. The invention more particularly relates to an in vitro diagnostic method for the evolution of chronic hepatitis B in a symptomatic or asymptomatic carrier individual of HBV S proteins.
La méthode de diagnostic in vitro sus-mentionnée est avantageusement réalisée par la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de détection in vitro de la quantité de grande protéine S sus-mentionnée, d'une méthode de détection in vitro de la protéine S majeure. The abovementioned in vitro diagnostic method is advantageously carried out by carrying out, in parallel with the in vitro detection method of the amount of large protein S mentioned above, a method for the in vitro detection of the major protein S. .
Cette dernière méthode est réalisée suivant les mêmes étapes que celles décrites ci-dessus pour la detection de la grande protéine, et dans lesquelles, d'une part, l'ACM F35.25, est remplacé par un anticorps, de préférence monoclonal, susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois), et d'autre part, les anti immmunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25 sont remplacées par des anti-immunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'ACM susmentionné reconnaissant la protéine S majeure.This latter method is carried out according to the same steps as those described above for the detection of the large protein, and in which, on the one hand, the ACM F35.25, is replaced by an antibody, preferably monoclonal, which is susceptible to to form an immunological complex with the major protein S, (or with one or other of its glycosylated forms or both at the same time), and on the other hand, anti immunoglobulins recognizing ACM F35.25 are replaced by anti-immunoglobulins capable of forming an immunological complex with the aforementioned ACM recognizing the major protein S.
Parmi les anticorps monoclonaux susceptibles de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure, et que l'on peut utiliser dans la méthode sus-mentionnée, on citera notamment l'ACM F39.20 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) J. Gen. Virol., 68, 2759-2767. Among the monoclonal antibodies that can form an immunological complex with the major protein S, and that can be used in the above-mentioned method, mention will be made in particular ACM F39.20 described in PETIT, MA et al (1987) J Gen. Virol., 68, 2759-2767.
La comparaison des quantités détectées de grande protéine S et de protéine S majeure dans un même échantillon permet de connaître, à un temps donné, la proportion de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure présente dans ledit échantillon. The comparison of the detected quantities of large protein S and major protein S in the same sample makes it possible to know, at a given time, the proportion of large protein S relative to the major protein S present in said sample.
La mise en oeuvre répétée de la méthode susmentionnée permet de suivre l'éventuelle variation de cette proportion en fonction du temps. The repeated implementation of the aforementioned method makes it possible to follow the possible variation of this proportion as a function of time.
La détection d'une-diminution de cette proportion en fonction du temps chez un individu atteint d'hépatite B chronique, permet d'émettre l'hypothèse que la maladie évolue favorablement chez cet individu c'est-à-dire qu'elle évolue probablement vers un état de guérison totale ou partielle (pseudo-guérison), qui se caractérise par une disparition complète de la grande protéine S dans l'échantillon prélevé chez ledit individu. The detection of a decrease in this proportion as a function of time in an individual suffering from chronic hepatitis B makes it possible to hypothesize that the disease evolves favorably in this individual, that is to say, that he is evolving. probably to a state of total or partial healing (pseudo-healing), which is characterized by a complete disappearance of the large protein S in the sample taken from said individual.
Le principe de la méthode de détection in vitro de la grande protéine S sus-mentionnée peut également être appliqué à la détection de la protéine S moyenne en utilisant, au lieu de l'ACM F35.25 et des antiimmunoglobulines reconnaissant l'ACM F35.25, un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la région pré-S2 de ladite protéine
S moyenne (ou avec l'une ou l'autre de ses formes glycosylées ou les deux à la fois), et des antiimmunoglobulines susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal, susmentionné reconnaissant la région pré-S2. A titre d'exemple de ce dernier type d'anticorps monoclonal, on citera l'ACM F124 décrit dans PETIT, M.A. et al (1987) précédemment cité. The principle of the above-mentioned large protein S in vitro detection method can also be applied to the detection of the average S protein using, instead of ACM F35.25 and anti-immunoglobulins recognizing ACM F35. 25, a monoclonal antibody capable of forming an immunological complex with the pre-S2 region of said protein
S average (or with either or both of its glycosylated forms), and anti-immunoglobulin capable of forming an immunological complex with the aforementioned monoclonal antibody recognizing the pre-S2 region. By way of example of the latter type of monoclonal antibody, mention may be made of ACM F124 described in PETIT, MA et al (1987) previously cited.
Ainsi la méthode de l'invention permet la détection dans un échantillon biologique prélevé chez un individu atteint d'hépatite B chronique, de la proportion de la grande protéine S par rapport à la protéine S moyenne d'une part, et par rapport à la protéine S majeure d'autre part. Une telle méthode permet donc de suivre en fonction du temps les variations des proportions des trois protéines S les unes par rapport aux autres, et ainsi de juger de l'évolution favorable ou non de la maladie en fonction de ces variations. Thus, the method of the invention allows the detection in a biological sample taken from an individual suffering from chronic hepatitis B, the proportion of the large protein S relative to the average protein S on the one hand, and with respect to the S major protein on the other hand. Such a method therefore makes it possible to follow, as a function of time, the variations of the proportions of the three S proteins relative to one another, and thus to judge the favorable or unfavorable evolution of the disease as a function of these variations.
La méthode de diagnostic in vitro de l'invention est réalisée à partir d'échantillons biologiques (prelevé chez des individus), tels que le sérum, ou des biospies du foie. Etant donné que l'expression des protéines S dans les lymphocytes se faisant de manière identique à celle de ces mêmes protéines S dans les cellules hépatiques, il est plus avantageux, compte tenu de l'opération délicate que constitue une biopsie du foie, de realiser la méthode de diagnostic de l'invention à partir d'un prélèvement de lymphocytes. The in vitro diagnostic method of the invention is carried out from biological samples (taken from individuals), such as serum, or liver biospas. Since the expression of S proteins in lymphocytes is identical to that of these S proteins in liver cells, it is more advantageous, given the delicate operation of liver biopsy, to achieve the diagnostic method of the invention from a lymphocyte collection.
Avantageusement, la méthode de diagnostic in vitro de l'invention permet le suivi thérapeutique des patients atteints de l'hépatite B et qui sont traités avec des compositions pharmaceutiques comprenant, notamment, de I'interféron, ou avec des antiviraux, tels que la nidarabine. Advantageously, the in vitro diagnostic method of the invention allows the therapeutic monitoring of patients with hepatitis B who are treated with pharmaceutical compositions comprising, inter alia, interferon, or with antivirals, such as nidarabine. .
La détection d'un diminution de la quantité de grande protéine S par rapport à la protéine S majeure, et/ou la protéine S moyenne, chez un de ces patients, permet d'emettre l'hypothèse que la thérapeutique utilisée donne des résultats favorables, et que ce patient évolue vers la guérison. The detection of a decrease in the amount of large protein S relative to the major protein S, and / or the average protein S, in one of these patients makes it possible to hypothesize that the therapeutic used gives favorable results. and that this patient is moving towards healing.
L'invention concerne également l'utilisation de l'ACM F35.25 pour la mise en oeuvre, parallèlement à la méthode de diagnostic in vitro de l'invention, d'une méthode de détection in vitro des produits de clivage de la grande protéine S issus de la digestion in vivo de cette dernière par la trypsine, ou par des enzymes possédant des activités du type de la trypsine et présentes dans l'organisme de l'individu à partir duquel l'échantillon biologique a été prélevé. The invention also relates to the use of ACM F35.25 for carrying out, in parallel with the in vitro diagnostic method of the invention, a method for detecting in vitro the large protein cleavage products. S derived from in vivo digestion of the latter by trypsin, or by enzymes with trypsin-like activities and present in the body of the individual from which the biological sample was taken.
Cette méthode de détection est réalisée suivant la technique des immuno-empreintes (ou Western blot) à partir d'un échantillon tel que les lymphocytes, et comprend les étapes suivantes - électrophorèse sur gel afin d'obtenir un séparation des divers constituants antigéniques de l'échantillon, - transfert de ces constituants ainsi séparés sur un support tel qu'une membrane de nitrocellulose, - incubation avec l'ACM F35.25, éventuellement marqué, notamment de manière radioactive ou enzymatique, dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe immunologique formé entre l'ACM F35.25 et chacun des produits de clivage de la grande protéine S, dont les deux produits issus du clivage par la trypsine de la région pre-Sl, et présentant respectivement les poids moléculaires de 13500 et 14500, - détection à l'aide de réactifs appropriés de 1'ACM
F35.25 marqué engagé dans un complexe immunologique sus-mentionné avec un produit de poids moléculaire de 13500 ou 14500, - ou, dans le cas où l'ACM F35.25 n'est pas marqué, détection a l'aide d'une immunoglobuline marquée susceptible de former un complexe immunologique avec l'ACM F35.25 engagé dans un complexe immunologique tel que défini ci-dessus.This detection method is carried out according to the immunoblot technique (or Western blot) from a sample such as lymphocytes, and comprises the following steps - gel electrophoresis in order to obtain a separation of the various antigenic constituents of the sample, transfer of these components thus separated on a support such as a nitrocellulose membrane, incubation with ACM F35.25, optionally labeled, in particular radioactively or enzymatically, under conditions making it possible to obtain an immunological complex formed between the ACM F35.25 and each of the cleavage products of the large S protein, whose two products derived from the trypsin cleavage of the pre-Sl region, and having respectively the molecular weights of 13500 and 14500 - detection with appropriate ACM reagents
F35.25 labeled engaged in an immunological complex above-mentioned with a product of molecular weight of 13500 or 14500, - or, in the case where the ACM F35.25 is not labeled, detection using a labeled immunoglobulin capable of forming an immunological complex with ACM F35.25 involved in an immunological complex as defined above.
Une telle méthode permet de quantifier la proportion de grandes protéines éventuellement dégradées dans l'organisme d'un individu et de déterminer ainsi le degré de resistance à l'infection par HBV de cet individu qui est fonction de la plus ou moins grande quantité de produits de clivage de la grande protéine S par la trypsine ainsi détectée. Such a method makes it possible to quantify the proportion of large proteins possibly degraded in the body of an individual and thus to determine the degree of resistance to HBV infection of this individual which is a function of the greater or lesser quantity of products. cleavage of the large protein S with trypsin thus detected.
L'invention a également pour objet des nécessaires ou kits, pour la mise en oeuvre d'une des méthodes de l'invention décrites ci-dessus. The invention also relates to kits or kits, for the implementation of one of the methods of the invention described above.
A titre d'exemple, un kit selon l'invention comprend - une quantité déterminée d'anticorps polyclonaux fixes sur un support solide et susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec la région S des protéines S, - une quantité déterminée de l'anticorps monoclonal
F35.25.By way of example, a kit according to the invention comprises a fixed quantity of polyclonal antibodies fixed on a solid support and capable of giving rise to an immunological reaction with the S region of the S proteins, a determined quantity of the monoclonal antibody
F35.25.
- éventuellement une quantité déterminée d'un anticorps monoclonal susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S majeure d'enveloppe de i 'HBV, - éventuellement un quantité déterminée d'un anticorps monoclonal - susceptible de former un complexe immunologique avec la protéine S moyenne d'enveloppe de 1 'HBV, - avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les anticorps susmentionnés et les protéines S susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique, - avantageusement des réactifs marqués, notamment des immunoglobulines marquées, permettant la détection des complexes immunologiques dans lesquels sont engagés les anticorps monoclonaux sus-mentionnés.optionally a determined amount of a monoclonal antibody capable of forming an immunological complex with the major HBV envelope protein S, optionally a determined amount of a monoclonal antibody, capable of forming an immunological complex with the S protein; HBV envelope means, advantageously a medium suitable for the formation of an immunological reaction between the aforementioned antibodies and the S proteins likely to be contained in the biological sample, advantageously labeled reagents, especially immunoglobulins labeled, allowing the detection of immunological complexes in which the above-mentioned monoclonal antibodies are involved.
L'invention a également pour objet l'utilisation de l'anticorps monoclonal F35.25 de l'invention pour le traitement de l'hépatite B et plus particulièrement pour la prévention des phénomènes de réinfection du greffon lors de greffe du foie chez les individus atteints de hépatite B. The subject of the invention is also the use of the monoclonal antibody F35.25 of the invention for the treatment of hepatitis B and more particularly for the prevention of re-infection of the graft during liver transplantation in individuals. with hepatitis B.
A ce titre, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques pour les traitements indiqués cidessus, et qui comprennent l'ACM F35.25 associé avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. In this respect, the invention relates to pharmaceutical compositions for the treatments indicated above, and which comprise ACM F35.25 combined with a pharmaceutically acceptable vehicle.
L'invention concerne également l'anticorps monoclonal anti-idiotype caractérisé en ce qu'il forme un complexe immunologique avec l'anticorps monoclonal
F35.25.The invention also relates to the monoclonal anti-idiotype antibody characterized in that it forms an immunological complex with the monoclonal antibody
F35.25.
L'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné est obtenu par immunisation d'un animal (ou de i'homme) à l'aide d'un anticorps moncoclonal F35.25 selon l'invention, suivi de la récupération de ceux des anticorps susceptibles de former un complexe immunologique avec l'anticorps moncoclonal F35.25. The abovementioned anti-idiotype monoclonal antibody is obtained by immunizing an animal (or man) with a F35.25 monoclonal antibody according to the invention, followed by the recovery of those antibodies. likely to form an immunological complex with monoclonal antibody F35.25.
L'invention a également pour objet des compositions pour la vaccination contre l'hépatite B caractérisé par l'association de l'anticorps monoclonal anti-idiotype sus-mentionné avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The invention also relates to compositions for vaccination against hepatitis B characterized by the combination of the above-mentioned anti-idiotype monoclonal antibody with a pharmaceutically acceptable vehicle.
Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit de l'obtention et de la caractérisation de l'anticorps moncoclonal F35.25, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications. Additional features of the invention will become apparent from the following description of the production and characterization of monoclonal antibody F35.25, it being understood that this description can not be interpreted as tending to restrict the scope of the claims. .
I MATERIELS ET MéTHODES
1) Obtention de l'anticoros monoclonal F35.25
Les particules HBV ont été purifiées à partir du sérum d'un individu atteint d'hépatite B chronique (sous type ad) comme il a été décrit dans PETIT et al (1985) Molec. Immunol., 22, 1279-1287, et ont été utilisées comme immunogène. Des souris BALB/c ont été inoculées intrapéritonéalement avec 100 Ag de virus purifié dans l'adjuvant complet de Freund, puis une semaine plus tard avec 100 Sg de virus dans l'adjuvant incomplet de Freund. Les trois souris immunisées ont développé de hauts titres en anticorps contre HBsAg, et qui ont été détectés par dosage radioimmunologique RIA.I MATERIALS AND METHODS
1) Obtaining the F35.25 monoclonal antibody
HBV particles were purified from the serum of an individual with chronic hepatitis B (ad type) as described in PETIT et al (1985) Molec. Immunol., 22, 1279-1287, and were used as immunogen. BALB / c mice were inoculated intraperitoneally with 100 Ag virus purified in complete Freund's adjuvant, and then one week later with 100 μg of virus in Freund's incomplete adjuvant. The three immunized mice developed high antibody titers against HBsAg, which were detected by radioimmunoassay RIA.
Deux semaines plus tard, les souris ont été inoculées avec 50 pg de virus dans un tampon phosphate. Après cinq jours, l'injection a été répétée, et trois jours plus tard, leur rate ont été retirées pour réaliser une fusion avec les cellules du myélome X63 selon la procédure décrite par BUTTIN et al (1978 > , 81, 27-36.Two weeks later, the mice were inoculated with 50 μg of virus in phosphate buffer. After five days, the injection was repeated, and three days later, their spleen was removed for fusion with X63 myeloma cells according to the procedure described by BUTTIN et al (1978>, 81, 27-36.
Les surnageants de la culture d'hybridomes ont été sélectionnés pour leur présence en anticorps spécifique d'HBV par RIA indirect en utilisant le virus purifié immunisant en tant que phase solide (PETIT et al (1987)J. Gen. Virol., 68, 2759-2767). 30 % des clones de l'hybridome produit des anticorps contre HBV. Les hybrides donnant le plus fort signal (P/N > 10) (P = positif, N = négatif) avec les particules HBV sur la phase solide ont été reclonés par dilution limitante, et leur spécificité polypeptidique a été déterminée par
Western Blot en utilisant des protéines virales dissociées en tant que sonde antigénique (PETIT et al (1986) Molec. Immunol, 27, 511-523).Hybridoma culture supernatants were screened for their presence of HBV-specific antibody by indirect RIA using the immunized purified virus as a solid phase (PETIT et al (1987) J. Gen. Virol., 68, 2759-2767). 30% of the clones of the hybridoma produce antibodies against HBV. Hybrids giving the strongest signal (P / N> 10) (P = positive, N = negative) with the HBV particles on the solid phase were recloned by limiting dilution, and their polypeptide specificity was determined by
Western blotting using dissociated viral proteins as an antigenic probe (PETIT et al (1986) Molec Immunol, 27, 511-523).
Les clones sélectionnés ont ensuite été injectés à des souris BALB/c pour la production d'ascites. The selected clones were then injected into BALB / c mice for ascites production.
L'anticorps monoclonal spécifique de la région pre-Sl, F 35.25, a été purifié à partir du surnageant d'une culture cellulaire d'hybridomes par précipitation avec 50 % (NH4)2S04 saturé, et par filtration sur gel
SEPHADEX G-200 (PHAMACIA - FRANCE), suivi d'une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE-trisacryle M (IBF - FRANCE). L'isotype a été déterminé par immunodiffusion contre des antisérums de lapin spécifique pour les immunoglobulines M de souris (IgM),
IgGl, IgG2A, IgG2B et IgG3 (NORDIC IMMUNOLOGY
TILBURG-BERCHEM - LONDON)
2) Test d'immunotransfert (technique de
Western Blot)
La spécificité polypeptidique de l'ACM F 35.25 a été déterminée par immunotransfert en utilisant des préparations de virus non traités, ou digérés, en tant qu'antigènes (PETIT et al (1986) et (1987) précédemment cité).The monoclonal antibody specific for the pre-Sl region, F 35.25, was purified from the supernatant of a hybridoma cell culture by precipitation with 50% (NH4) 2SO4 saturated, and by gel filtration.
SEPHADEX G-200 (PHAMACIA - FRANCE), followed by ion exchange chromatography on DEAE-trisacryl M (IBF - FRANCE). The isotype was determined by immunodiffusion against rabbit antisera specific for mouse immunoglobulin M (IgM),
IgG1, IgG2A, IgG2B and IgG3 (NORDIC IMMUNOLOGY)
TILBURG-BERCHEM - LONDON)
2) Immunoblotting test (technique of
Western Blot)
The polypeptide specificity of ACM F 35.25 was determined by immunoblotting using untreated, or digested, virus preparations as antigens (PETIT et al (1986) and (1987) previously cited).
La digestion par la protéase V8 de S.aureus (type
XVII de chez SIGMA) et par la trypsine (type XII de chez SIGMA) a été réalisée dans du bicarbonate d'ammonium O,lN, pH 7,8, a 37-C pendant trois heures.Digestion with S.aureus V8 protease (type
XVII from SIGMA) and trypsin (type XII from SIGMA) was carried out in 0.1N ammonium bicarbonate, pH 7.8, at 37 ° C for three hours.
Le rapport de la quantité d'enzymes au substrat était de 1:40-50 (par poids), et la concentration de protéine était de l mg/ml. La réaction a été arrêtée par addition d'un tampon contenant 2 % de SDS et 5 % de 2-mercaptoéthanol. The ratio of the amount of enzyme to the substrate was 1: 40-50 (by weight), and the protein concentration was 1 mg / ml. The reaction was stopped by adding buffer containing 2% SDS and 5% 2-mercaptoethanol.
Les particules sphériques HBsAg de 22-nm ont été co-purifiées avec l'HBV provenant d'un sérum HBsAg positif, montrant seulement une reactivité pré-S2 (PETIT et al (1987) précédemment cité), une sérum albumine humaine (0,22 mg/ml) et un sérum humain normal dilué au 1/500 ont été utilisés en parallèle en tant qu'antigènes de contrôle. L'HBV purifié a été utilisé à différentes concentrations allant de 0,2 à 1 mg/ml. The 22-nm HBsAg spherical particles were co-purified with HBV from an HBsAg positive serum, showing only pre-S2 reactivity (PETIT et al (1987) previously cited), human serum albumin (0, 22 mg / ml) and normal human serum diluted 1/500 were used in parallel as control antigens. Purified HBV was used at different concentrations ranging from 0.2 to 1 mg / ml.
Après électrophorèse utilisant le systeme de tampon décrit dans LAEMMLI (1970) Nature, London, 227,, 680-685, des bandes protéiniques ont été éluées électrophorétiquement et transférées sur des membranes de nitrocellulose pour y être détectées comme il a été décrit dans PETIT et al (1987) précédemment cité). Les bandes de transfert ont été incubées soit avec les surnageants de cellules d'hybridomes à une dilution de 1:2 dans un tampon bloquant (tris-NaCl contenant de l'albumine de sérum de boeuf et 50 % de sérum foetal de boeuf) ou avec 10 ng/ml d'IgG monoclonal purifié de souris.After electrophoresis using the buffer system described in LAEMMLI (1970) Nature, London, 227, 680-685, protein bands were electrophoretically eluted and transferred to nitrocellulose membranes for detection as described in PETIT and US Pat. al (1987) previously cited). The transfer bands were incubated with either the hybridoma cell supernatants at a 1: 2 dilution in blocking buffer (tris-NaCl containing beef serum albumin and 50% fetal bovine serum) or with 10 ng / ml of purified monoclonal IgG from mice.
3) Test radioimunoloqioue (RIA)
La liaison de l'ACM F 35.25 soit au virus à l'état natif, soit à des peptides synthétiques dérivant de la séquence pré-Sl de la grande protéine d'enveloppe
HBV sous-type adw2 (NEURATH et al (1986) précédemment cité) a été mesurée par RIA en utilisant un fragment
F(ab)'2 '2 anti-souris marqué radioactivement avec de l'iode 1125 (immunoglobuline de mouton, AMERSHAM
FRANCE). Des billes de polystyrène ont été enduites avec des antigènes individuels dilués dans un tampon TN (0,01 M-tris-HCl, 0,14 M-NaCl, pH 7,2) à une concentration de 20 pg/ml. 3) Radioimmunoassay (RIA)
The binding of ACM F 35.25 either to the native virus or to synthetic peptides derived from the pre-Sl sequence of the large envelope protein
HBV subtype adw2 (NEURATH et al (1986) previously cited) was measured by RIA using a fragment
F (ab) '2' 2 anti-mouse radioactively labeled with iodine 1125 (sheep immunoglobulin, AMERSHAM
LA FRANCE). Polystyrene beads were coated with individual antigens diluted in TN buffer (0.01 M-Tris-HCl, 0.14 M-NaCl, pH 7.2) at a concentration of 20 μg / ml.
Après deux heures à 37'C et une nuit à 4*C, les solutions d'antigène ont été retirées et les billes ont été saturées avec 5 % (en poids par volume) de sérum d'albumine de boeuf dans un tampon TN pendant 6 heures à température ambiante. After two hours at 37 ° C and overnight at 4 ° C, the antigen solutions were removed and the beads were saturated with 5% (w / v) beef albumin serum in a TN buffer for 1 hour. 6 hours at room temperature.
Les billes enduites ont alors été incubées avec une dilution au 1:2 de surnageant de culture de cellules d'hybridomes pendant une nuit à température ambiante, lavées plusieurs fois avec de l'eau distillée et incubées pendant une heure à 37*C avec le fragment F(ab')2 anti-immunoglobuline de souris marqué avec de -l'iode I125. Le diluant utilisé était constitué de sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum foetal de boeuf dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et comptées dans un compteur gamma. The coated beads were then incubated with a 1: 2 dilution of hybridoma cell culture supernatant overnight at room temperature, washed several times with distilled water and incubated for one hour at 37 ° C with mouse anti-immunoglobulin F (ab ') 2 fragment labeled with I125 iodine. The diluent used was beef serum albumin and 50% fetal bovine serum in TN buffer. Finally, the beads were washed and counted in a gamma counter.
Le surnageant a également été testé par -RIA en utilisant des billes enduites de particules HBsAg recombinantes (produit du gène pré-S2 et du gène S) décrit dans MICHEL et al (1984) Proc. Natl. Acad. The supernatant was also tested by -RIA using beads coated with recombinant HBsAg particles (pre-S2 gene product and S gene) described in MICHEL et al (1984) Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 81,, 7708-7712) de la sérum albumine humaine polymérisée (pHSA) et de la sérum albumine de boeuf polymérisé (pBSA).Sci., USA, 81, 7708-7712) of polymerized human serum albumin (pHSA) and serum albumin of polymerized beef (pBSA).
Des expériences d'inhibition compétitive d'antigène ont eté utilisées pour étudier l'effet inhibiteur du virus à l'état natif ou de l'antigène peptidique sur la liaison de l'anticorps F 35.25 au virus et aux peptides synthétiques. Les échantillons de virus ou de peptides libres (20 pg/ml) ont d'abord été pré-incubés avec l'anticorps monoclonal dilué, purifié à partir du fluide de culture d'hybridomes (correspondant à 0,2 ng d'immunoglobuline de souris/ml) pendant l heure à 37-C. Competitive antigen inhibition experiments were used to study the inhibitory effect of native virus or peptide antigen on the binding of F 35.25 antibody to virus and synthetic peptides. Virus or free peptide samples (20 μg / ml) were first preincubated with the diluted monoclonal antibody, purified from the hybridoma culture fluid (corresponding to 0.2 μg immunoglobulin mice / ml) for 1 hour at 37 ° C.
Les mélanges ont été transférés dans des puits enduits soit avec un peptide synthétique de la région pre-Sl (5 Ag) ou avec des particules HBV (10 Ag/ml) purifiées à partir de sérum humain. La quantité d'anticorps monoclonal lié à la phase solide a été déterminée comme il a été décrit ci-dessus.The mixtures were transferred to wells coated either with a synthetic peptide of the pre-Sl region (5 Ag) or with HBV particles (10 Ag / ml) purified from human serum. The amount of monoclonal antibody bound to the solid phase was determined as described above.
4) Test de RIA à double spécificité d'anticorps polyclonal-monoclonal (test DAS-RIA). 4) Polyclonal-monoclonal antibody dual-specific RIA test (DAS-RIA test).
Ce test RIA a été réalisé afin de déterminer la présence de séquences pré-S1 dans les particules HBV purifiées à partir de sérum HBsAg positif de porteurs chroniques d'HBsAg par la procédure précédemment décrite dans PETIT et al (1985). This RIA test was performed to determine the presence of pre-S1 sequences in purified HBV particles from HBsAg positive chronic HBsAg serum by the procedure previously described in PETIT et al (1985).
Cette technique a également été utilisée pour la quantification d'épitopes pré-Sl en relation avec l'activité HBsAg. This technique has also been used for the quantification of pre-Sl epitopes in relation to HBsAg activity.
Des billes de polystyrène ont été enduites avec des IgG polyclonaux de lapin dirigés contre HBsAg (PETIT et al (1986)) à une concentration de 20 Mg/ml, et ont été alors incubées avec une série de préparations virales diluées de 10 en 10 (10 g à 1 ng/ml). Polystyrene beads were coated with rabbit polyclonal IgG directed against HBsAg (PETIT et al (1986)) at a concentration of 20 μg / ml, and were then incubated with a series of 10-fold diluted viral preparations ( 10 g at 1 ng / ml).
Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les billes ont été lavées avec de l'eau distillée et incubées pendant quatre heures à 37-C avec une dilution au 1:2 de la culture d'hybridomes. After overnight incubation at room temperature, the beads were washed with distilled water and incubated for four hours at 37 ° C with a 1: 2 dilution of the hybridoma culture.
La liaison de l'anticorps monoclonal F 35.25 spécifique de pré-S1 a alors été détectée par incubation (1 heure à 37C > avec le fragment F(ab')2 marqué à l'aide de l'iode 1125 d'anti-immunoglobulines de souris Le diluant utilisé était constitué de 5 % de sérum albumine de boeuf et de 50 % de sérum normal de lapin dans un tampon TN. Enfin, les billes ont été lavées et leur radioactivité a été déterminée. Les résultats sont exprimés en cpm (coups par minute) d'anticorps marqué à l'iode 1125. The binding of the monoclonal antibody F 35.25 specific for pre-S1 was then detected by incubation (1 hour at 37 ° C) with the F (ab ') 2 fragment labeled with 1125 anti-immunoglobulin iodine. The diluent used consisted of 5% bovine serum albumin and 50% normal rabbit serum in TN buffer Finally, the beads were washed and their radioactivity was determined.The results are expressed in cpm ( counts per minute) of iodine-labeled antibody 1125.
Dans les étapes finales de la purification de l'HBV, les aliquotes de chaque fraction de gradient entre 10 et 60 t de saccharose ont été sélectionnés par cette technique. Après quoi, les préparations virales ont été calibrées pour leur séquence pre-Sl avec l'anticorps F 35.25. In the final steps of HBV purification, the aliquots of each gradient fraction between 10 and 60 t of sucrose were selected by this technique. After which, the viral preparations were calibrated for their pre-Sl sequence with the F 35.25 antibody.
L'anticorps MA18/7 spécifique de la région de pré-Sl (HEERMANN et al (1984)), et les anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes spécifiques des régions S et pré-S2 (PETIT et al (1987)) ont été utilisés en parallèle afin de déterminer des relations quantitatives entre les trois régions antigéniques de la protéine env. The MA18 / 7 antibody specific for the pre-Sl region (HEERMANN et al (1984)), and the monoclonal antibodies directed against epitopes specific for the S and pre-S2 regions (PETIT et al (1987)) were used. in parallel to determine quantitative relationships between the three antigenic regions of the env protein.
II RESULTATS
1) Spécificité fine pré-S1 de l'anticorps monoclonal F 35.25.II RESULTS
1) Fine pre-S1 specificity of the monoclonal antibody F 35.25.
Un test d'immunodiffusion contre une gamme d'antisérum mono spécifique a permis de déterminer que l'ACM F 35.25 appartient à la classe d'anticorps IgGî. An immunodiffusion test against a range of mono-specific antisera determined that ACM F 35.25 belongs to the IgG1 antibody class.
La spécificité polypeptidique de l'anticorps monoclonal F 35.25 a été déterminée par sa réactivité vis-à-vis des trois composants d'enveloppe des particules virales purifiées à partir de plasma d'un porteur chronique d'HBV (sous type ad). The polypeptide specificity of the monoclonal antibody F 35.25 was determined by its reactivity vis-à-vis the three envelope components purified viral particles from plasma of a chronic HBV carrier (sub-type ad).
Deux préparations obtenues à partir de l'étape finale de centrifugation dans un gradient de saccharose ont été sélectionnées : A, particule sphérique de HBsAg 22-nm présentant une réactivité pré-S2, mais ne présentant pas d'épitopes pré-Sl détectable (30 t de saccharose, figure 2a), et B, particules d'HBV 42-nm positives en ce qui concerne l'activité DNA polymérase et 1'ADN d'HBV, présentant une quantité importante ( > 1 ng/ml) d'épitopes pré-S2 et pré-Sl (40 t de saccharose, figure 2a). Comme il est illustré dans la figure 2b, ligne B, l'ACM F 35.25 -se lie seulement aux protéines pré-Sl, P39 et GP42, dans les parties d'HBV purifiées. Two preparations obtained from the final sucrose gradient centrifugation step were selected: A, HBsAg 22-nm spherical particle having a pre-S2 reactivity but lacking detectable pre-S1 epitopes (30). 2) sucrose, and B, 42-nm HBV particles positive for DNA polymerase activity and HBV DNA, with a significant amount (> 1 ng / ml) of epitopes. pre-S2 and pre-Sl (40 t of sucrose, Figure 2a). As shown in Figure 2b, line B, ACM F 35.25 binds only to pre-S1, P39 and GP42 proteins in the purified HBV portions.
CP42 a été plus intensément révélé que P39. De plus, F 35.25 réagit également avec un composant de 66000 ; par contre, aucune réactivité n'a été observée entre 1'ACM
F35.25 et toutes les protéines provenant de particules défectives d'HBsAg et prê-S2 positives (figure 2b, ligne A), ainsi qu'avec la sérum albumine humaine (HSA) ou avec du sérum humain normal (NHS) sans marqueur viral (figure 2b, lignes C et D respectivement).Les antigènes de contrôle ont été testés en parallele à une concentration similaire & celle des protéines HBV (environ 200 Ag/ml). Ces résultats suggèrent que l'anticorps F 35.25 est spécifique pour la région pré S1 de la protéine env d'HBV (l'expression protéine env est également utilisé pour désigner les protéines S d'une manière générale). De plus, sa reactivité avec la très grande protéine HBV(VL-) de 66000 confirme la présence d'épitopes(s) specifique(s) de pre-S1 sur ce composant VL HBsAg d'HBV (PETIT et al (1987)), qui est distinct de la protéine HSA présent dans NHS.CP42 was more intensely revealed than P39. In addition, F 35.25 also reacts with a 66000 component; however, no reactivity was observed between the ACM
F35.25 and all proteins from defective HBsAg and pre-S2 positive particles (Figure 2b, line A), as well as with human serum albumin (HSA) or with normal human serum (NHS) without viral marker (Figure 2b, lines C and D respectively). The control antigens were tested in parallel at a concentration similar to that of the HBV proteins (about 200 Ag / ml). These results suggest that the F 35.25 antibody is specific for the pre S1 region of the HBV env protein (the expression protein env is also used to refer to the S proteins in general). Moreover, its reactivity with the very large HBV (VL-) protein of 66000 confirms the presence of epitopes (s) specific for pre-S1 on this HBV HBsAg VL component (PETIT et al (1987)). , which is distinct from the HSA protein present in NHS.
La localisation précise de l'épitope reconnu par
F 35.25 a été été étudiée par un test RIA impliquant des peptides synthétiques spécifiques de pré-Sl au niveau de la phase solide. Des peptides correspondant à la région pré-S1 de la protéine env d'HBV sous type adw2 ont été sélectionnés, synthétisés et purifiés comme il l'a eté décrit précédemment (NEURATH et al (1986)). Des analogues synthétiques de séquences pré S(1-21), (12-32), (32-53), (53-73) et (94-11) ont été utilisées (voir figure 3) dans un test RIA à double anticorps.Comme il est indiqué dans la figure 4a, seulement le peptide pré-S(32-53) a été reconnu de manière efficace par F35.25 (P/N 2 70). Une faible réaction a également été observée avec le peptide synthétique pré-S (94-117).The precise location of the epitope recognized by
F 35.25 was studied by an RIA test involving synthetic peptides specific for pre-Sl in the solid phase. Peptides corresponding to the pre-S1 region of the HBV env protein under adw2 type were selected, synthesized and purified as previously described (NEURATH et al (1986)). Synthetic analogues of pre S (1-21), (12-32), (32-53), (53-73) and (94-11) sequences were used (see FIG. 3) in a double RIA assay. As shown in Figure 4a, only the pre-S (32-53) peptide was effectively recognized by F35.25 (P / N 2 70). A weak reaction was also observed with the pre-S synthetic peptide (94-117).
On peut remarquer que ces deux peptides possèdent une région N-terminale commune : proline (positions 32 et 94) et alanine (positions 33 et 95) (voire figure 3). Le double RIA impliquant l'utilisation de puit enduit avec des particules HBsAg recombinant à partir de cellules CHO (MICHEL et al (1981)), avec des particules d'HBV purifiées à partir de sérum (sous type ad) ainsi qu'avec HSA, pBSA et pHSA, a également été développé et révèle une liaison significative de F 35.25 seulement aux virions complets (P/N = 13, figure 4b). Ceci démontre la stricte spécificité HBV de l'ACM
F 35.25 dirigé contre la séquence pré-S1(32-53). It may be noted that these two peptides have a common N-terminal region: proline (positions 32 and 94) and alanine (positions 33 and 95) (see FIG. 3). Double RIA involving the use of wells coated with recombinant HBsAg particles from CHO cells (MICHEL et al (1981)), with HBV particles purified from serum (ad type) as well as with HSA , pBSA and pHSA, has also been developed and reveals a significant binding of F 35.25 only to complete virions (P / N = 13, Figure 4b). This demonstrates the strict HBV specificity of the ACM
F 35.25 against the pre-S1 sequence (32-53).
Les résultats de la liaison compétitive utilisant 20 Zg/ml des antigenes suivants : peptide pré-S(32-53) et des particules d'HBV purifiées en tant qu'antigène pré-S1 natif, ont démontré : (i) que la région pré
S(32-53) contient l'épitope F 35.25, (ii) qu'un tel épitope est exprimé à la surface des virions. En effet, la réaction de F 35.25 avec l'antigène natif F (HBV) est complètement inhibée par pré-S(32-53), mais pas par une autre séquence pré-S(1-21) (figure 5b). Results of competitive binding using 20 μg / ml of the following antigens: pre-S peptide (32-53) and purified HBV particles as native pre-S1 antigen, demonstrated: (i) that the region pre
S (32-53) contains the F 35.25 epitope, (ii) that such an epitope is expressed on the surface of virions. Indeed, the reaction of F 35.25 with native antigen F (HBV) is completely inhibited by pre-S (32-53), but not by another pre-S (1-21) sequence (Figure 5b).
Réciproquement, les particules d'HBV utilisées en tant qu'inhibiteurs présentent également un puissant effet de suppression ( > 70 5) de la liaison de F 35.25 à la séquence de pré-S(32-53) (figure 5a).Conversely, the HBV particles used as inhibitors also exhibit a strong suppressive effect (> 70%) of the binding of F 35.25 to the pre-S (32-53) sequence (Figure 5a).
Afin de déterminer la sensibilité de F 35.25 pour détecter la séquence pr6-Sl, ce dernier anticorps se liant soit au peptide pre-S(32-53) ou au virus à l'état natif, des quantités décroissantes d'IgG purifiées spécifiques de souris (1 ng à 0,1 pg/ml) ont été utilisées dans la phase liquide du double RIA (figure 6). La limite de détection de HBV ainsi que celle de l'antigène peptidique a été trouvé comme étant du domaine du pg d'IgGl monoclonal, montrant que F 35.25 possède une affinité de liaison très forte. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'anticorps monoclonal purifié å partir de liquide d'ascites.. In order to determine the sensitivity of F 35.25 to detect the pr6-Sl sequence, the latter antibody binding either to the pre-S (32-53) peptide or to the native virus, decreasing amounts of purified IgG specific to mice (1 ng at 0.1 μg / ml) were used in the liquid phase of the double RIA (Figure 6). The detection limit of HBV as well as that of the peptide antigen was found to be in the range of monoclonal IgG1 pg, showing that F 35.25 has a very strong binding affinity. Similar results were obtained with purified monoclonal antibody from ascites fluid.
Enfin, de manière à déterminer la topographie de l'épitope pre-Sl reconnu par F 35.25 dans la protéine env d'HBV, la réactivité de F 35.25 a été étudiée par immunotransfert après digestion protéolytique limitée des particules purifiées d'HBV (sous type ad). Le traitement par la trypsine ou la protéase V8 de l'antigène a été réalisé dans des conditions bien définies de temps d'incubation, de tampon, de pH et de rapport enzyme-substrat : 3 heures à 37ic dans du bicarbonate d'ammonium 0,1 M, pH 7,8 à une concentration finale de 20 Sg/ml d'enzymes pour 1 mg/ml d'antigènes, ces conditions étant différentes des conditions utilisées dans les expériences précédemment citées (HEERMAN et al (1984 > ; PETIT et al (1987)). Finally, in order to determine the topography of the F 35.25-recognized pre-Sl epitope in the HBV env protein, the reactivity of F 35.25 was studied by immunotransfer after limited proteolytic digestion of the purified HBV particles (subtype). ad). Treatment with trypsin or V8 protease of the antigen was carried out under well-defined conditions of incubation time, buffer, pH and enzyme-substrate ratio: 3 hours at 37 ° C. in ammonium bicarbonate. , 1 M, pH 7.8 at a final concentration of 20 Sg / ml of enzymes per 1 mg / ml of antigens, these conditions being different from the conditions used in the above-mentioned experiments (HEERMAN et al (1984); et al (1987)).
Ainsi, les résultats du clivage protéolytique révèle des peptides qui réagissent avec F 35.25 (figure 7). Il est intéressant de noter que deux bandes protéiniques correspondant à des poids moléculaires de 13500 et 14500, résultant du clivage par la trypsine (figure 7), et réagissent fortement avec F 35.25, mais pas avec l'anticorps monoclonal F 376 spécifique de la région pré-S2 (figure 7r ligne 5), ni avec l'anticorps monoclonal 6-16Al5 spécifique de la région S (COURROUCE et al (1983)) (figure 7, ligne 8). Ces produits tryptiques sont probablement générés à partir de P39 et
GP42 par clivage de la séquence pré-Sl au niveau des résidus arginine en position 99 et/ou 103, et en position 113 (voir figure 3).Ainsi l'épitope reconnue par F 35.25 est localisé sur la séquence pré-S1 entre pré-S(33) au niveau N-terminal et pré-S(53)-pré-S(99) au niveau C-terminal. De plus, la sensibilité du domaine pré-S2 pour la digestion par la trypsine a été confirmée (STIBBE et GERLICH, (1983 > Develop. Biol.Thus, the results of proteolytic cleavage reveal peptides that react with F 35.25 (Figure 7). It is interesting to note that two protein bands corresponding to molecular weights of 13500 and 14500, resulting from trypsin cleavage (Figure 7), and strongly react with F 35.25, but not with the F 376 monoclonal antibody specific to the region. pre-S2 (Figure 7r line 5), or with the specific monoclonal antibody 6-16Al5 specific for the S region (COURROUCE et al (1983)) (Figure 7, line 8). These tryptic products are probably generated from P39 and
GP42 by cleavage of the pre-Sl sequence at the arginine residues at position 99 and / or 103, and at position 113 (see FIG. 3). Thus the epitope recognized by F 35.25 is located on the pre-S1 sequence between pre -S (33) at the N-terminal level and pre-S (53) -pre-S (99) at the C-terminal level. In addition, the sensitivity of the pre-S2 domain for trypsin digestion has been confirmed (STIBBE and GERLICH, (1983> Develop Biol.
Standard, 54, 33-43 , HEERMANN et al (1984) ; PETIT et al (1987)) (figure 7, ligne 5 et figure 7, ligne 8).Standard, 54, 33-43, HEERMANN et al (1984); PETIT et al (1987)) (Figure 7, line 5 and Figure 7, line 8).
Après traitement par la protéase V8 de la protéine
HBV, F 35.25 se lie à un fragment de poids moléculaire 16500 (figure 7, ligne 3) qui a été très probablement produit par clivage au niveau de l'acide glutamique en position 2 (GLU-176) du produit du gène S (HEERMANN et al, (1984)). La protéase V8 génère également deux fragments dont les poids moléculaires sont de 15000 et de 29000 réagissant avec F 35.25. Ceci suggère : (i) un autre clivage possible par la protéase dans le domaine pré-S2, donnant lieu à un fragment plus petit contenant les séquences pré-Si, et (ii) un clivage au niveau du résidu GLU-338 dans la séquence du gène S.After treatment with protein V8 protease
HBV, F 35.25 binds to a 16500 molecular weight fragment (Figure 7, line 3) that was most likely produced by cleavage at the 2-position glutamic acid (GLU-176) of the S gene product (HEERMANN et al (1984)). The V8 protease also generates two fragments with molecular weights of 15,000 and 29,000 reacting with F 35.25. This suggests: (i) another possible cleavage by the protease in the pre-S2 domain, giving rise to a smaller fragment containing the pre-Si sequences, and (ii) cleavage at the GLU-338 residue in the sequence of the S gene
Ce dernier site semble effectivement accessible dans la structure secondaire prédite de la protéine env d'HBV (NEURATH et al (1987) Microbiol. Sci., 4, 45-51). Finalement, la figure 7 , ligne 6 et la figure 7 , ligne 9 illustrent la relative résistance des protéines pré-S2 (GP33 et GP36) à la digestion par la protéase VS. This latter site seems indeed accessible in the predicted secondary structure of the HBV env protein (NEURATH et al (1987) Microbiol Sci., 4, 45-51). Finally, Figure 7, line 6 and Figure 7, line 9 illustrate the relative resistance of pre-S2 proteins (GP33 and GP36) to VS protease digestion.
2) Détection de l'épitope F 35.25 dans les articules d'HBV à partir de sérum humain
Dans l'étape finale de fractionnement dans le gradient de saccharose (ou sucrose), les particules d'HBV caractérisées par la présence d'ADN d'HBV et de la protéine majeure du core, P22c, (détectée par hybridation ou Western Blot respectivement) ont été trouvées dans les fractions 6-8 à 40-50 S de saccharose (figure 8). Ces fractions HbsAg positives ont été étudiées pour ce qui concerne la présence de ltépitope spécifique de pré-Sl reconnue par F 35.25.2) Detection of the F 35.25 Epitope in HBV Articules from Human Serum
In the final stage of fractionation in the sucrose gradient (or sucrose), HBV particles characterized by the presence of HBV DNA and the core core protein, P22c, (detected by hybridization or Western Blot respectively ) were found in fractions 6-8 to 40-50 S sucrose (Figure 8). These HbsAg positive fractions were studied for the presence of the pre-S1 specific epitope recognized by F 35.25.
Le test DAS-RIA décrit précédemment dans le chapitre MATERIELS ET METHODES, a permis de détecter l'épitope F 35.25 chez les virions complets (figure 8, fractions 6-8, 40-50 % de saccharose). La quantité de séquences pré-S1 en relation avec l'activité HBsAg a été déterminée comme étant de l'ordre de 50 t. The DAS-RIA test described previously in the MATERIALS AND METHODS chapter, made it possible to detect the F 35.25 epitope in complete virions (FIG. 8, fractions 6-8, 40-50% sucrose). The amount of pre-S1 sequences in relation to HBsAg activity was determined to be of the order of 50 t.
il y a par conséquent une proche corrélation entre la présence de l'épitope reconnu par F35.25 et la présence de 1'ADN d'HBV et de la protéine P22c dans les virions complets. there is therefore a close correlation between the presence of the F35.25 recognized epitope and the presence of HBV DNA and P22c protein in complete virions.
Les tests DAS-RIA ont aussi été appliqués afin d'évaluer la quantité des séquences pré-Sl dans 7 préparation d'HBV purifiés (sous type ad ou oy). Les particules d'HBV utilisées pour l'immunisation étaient des HBsAg sous type ad. L'ACM F 35.25 a réagit de façon significative avec 1'HBV ad et 1'HBV a liés aux grains enduits d'anti-HBs polyclonaux (figure 9). DAS-RIA tests were also applied to evaluate the amount of pre-S1 sequences in the purified HBV preparation (ad or oy subtype). The HBV particles used for immunization were HBsAg subtype ad. ACM F 35.25 reacted significantly with HBV ad and HBV linked to the polyclonal anti-HBs-coated grains (FIG. 9).
Cependant, 1'ACM F35.25 semble reconnaître de façon préférée les séquences pré-S1 d'HBV sous type ad. La proportion des séquences pré-Sl en relation avec HBsAg a été déterminée comme étant de 1'ordre de 50 % seulement dans les préparations d'HBV de sous type ad, et seulement de 10 à 20 % dans les préparations HBV de sous type ay. Cette différence peut être imputée à la spécificité ad relative de 1'ACM F 35.25. However, ACM F35.25 seems to preferentially recognize pre-S1 sequences of HBV subtype ad. The proportion of pre-Sl sequences in relation to HBsAg was determined to be of the order of only 50% in HBV subtype preparations, and only 10 to 20% in HBV subtype preparations. . This difference can be attributed to the relative ad specificity of ACM F 35.25.
Par contre 1'ACM MA18/7 obtenu par imunisation avec des particules HBV de sous-type ayw, réagit aussi bien avec les particules de sous-type adw que celles de sous-type avw. L' L'unique acide aminé, compris à l'intérieur de la séquence pré-Sl(32-38), et qui diffère suivant les sous-type ad et oy, est situé en position 35 ; cet acide aminé en position 35 correspond à la glycine dans le sous-type ad, et à l'arginine dans le sous-type av. La substitution de la glycine en position 35 par l'arginine crée un site additionnel de clivage par la trypsine à l'intérieur de la séquence pré-S(21-47) impliquée dans la liaison aux récepteurs des hêpatocytes. Par conséquent, la spécificité de sous-type relative de 1'ACM F35.25 pourrait être attribuée à une perte de l'extrémité N-terminale de la séquence pré-Sl de 1'HBV de sous-type as sous l'effet d'une enzyme de type de la tryspine.Ceci pourrait expliquer la plus grande instabilité des particules de sous-type li (tellles que RE, BAY, PEI.) que celles de sous-type ad (telles que LIS/88 et LAM.). On the other hand, the mAb MA18 / 7 obtained by imunization with HBV particles of subtype ayw, reacts with both the subtype particles adw and those of subtype avw. The only amino acid, included within the pre-Sl sequence (32-38), which differs according to the subtypes ad and oy, is located at position 35; this amino acid at position 35 corresponds to glycine in the subtype ad, and to arginine in the subtype av. Substitution of 35-glycine with arginine creates an additional trypsin cleavage site within the pre-S (21-47) sequence involved in hepatocyte receptor binding. Therefore, the relative subtype specificity of F35.25 ACM could be attributed to a loss of the N-terminus of the pre-Sl sequence of HBV subtype as under the effect of This may explain the greater instability of subtype particles li (such as RE, BAY, PEI.) than those of subtype ad (such as LIS / 88 and LAM.) .
Ainsi 1ACM F35.25 constitue un bon marqueur du caractere infectieux de 1'HBV puisqu'il est capable de former un complexe immunologique, détetable in vitro, avec l'épitope pré-S(32-53) comprenant la glycine (35) impliquée dans le mécanisme de fixation de sous-type ad sur les hépatocytes. Thus, 1ACM F35.25 is a good marker of the infectious nature of HBV since it is capable of forming an immunological complex, detachable in vitro, with the pre-S (32-53) epitope comprising the glycine (35) involved. in the ad subtype binding mechanism on hepatocytes.
L'ACM MA18/7 ne reconnaît pas la région comprenant la glycine en position 35, puisqu'il est spécifique de la séquence pré-S(38-121), et n'est donc pas un aussi bon marqueur d'infectiosité des HBV circulants que ne l'est 1'ACM F35.25. ACM MA18 / 7 does not recognize the region comprising glycine at position 35, since it is specific for the pre-S (38-121) sequence, and is therefore not as good a marker of HBV infectivity. Circumstances than ACM F35.25.
La mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, de détection in vitro de la proportion de la grande protéine S par rapport aux protéines S moyennes et majeures à partir de sérums d'individus atteints d'hépatite B chronique, a donné les résultats suivants 1) Chez un groupe d'individus porteurs chroniques symptomatiques, chez lesquels on peut détecter un réplication virale active (correspondant à la présence dans le sérum de ces individus d'ADN-polymérase, d'ADN d'HBV, et d'HBe qui est un antigène de la nucléocapside), il a été détecté par la méthode de l'invention que
- Chez 36 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est supérieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines S représentant respectivement environ 35 à 40 %, ét 20 % des protéines S contenues dans les sérums desdits individus.The implementation of the method according to the invention, of in vitro detection of the proportion of the large protein S relative to the average and major S proteins from sera of individuals with chronic hepatitis B, gave the results. 1) In a group of symptomatic chronic carrier individuals, in whom active viral replication (corresponding to the presence in the serum of these individuals of DNA polymerase, HBV DNA, and HBe can be detected). which is an antigen of the nucleocapsid), it has been detected by the method of the invention that
- In 36% of the individuals in this group, the amount of large protein S is greater than that of the average protein S, these two S proteins respectively representing approximately 35 to 40%, and 20% of the S proteins contained in the sera of said individuals .
- Chez 45 % des individus de ce groupe, la quantité de grande protéine S est inferieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines S représentant respectivement 25 % et 50 S des protéines
S présentes dans les sérums desdits individus.- In 45% of the individuals in this group, the amount of high protein S is lower than that of the average protein S, these two proteins S respectively representing 25% and 50% of the proteins
S present in the sera of said individuals.
- Chez 18 % des individus de ce groupe la quantité de grande protéine S est à peu près identique à celle de protéine S moyenne, et représente pour ces deux protéines environ 25 % de la quantité de protéine S présente dans les sérum desdits individus. - In 18% of the individuals in this group the amount of large protein S is approximately identical to that of average protein S, and represents for these two proteins approximately 25% of the amount of protein S present in the serum of said individuals.
Parmi ce groupe d'individus, deux cas ont évolue vers la guérison. I1 s'agit d'une part d'un individu ayant développé des anticorps anti-HBe, et d'autre part d'un individu ayant subi un traitement par l'interféron et chez lesquels on ne détecte plus, à l'aide de 1'ACM
F35 de grande protéine S, la quantité des protéines S à diminué de 60 %, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 55 t des protéines S présentes dans les sérums de ces deux individus.Among this group of individuals, two cases have evolved towards healing. These include an individual who has developed anti-HBe antibodies, and an individual who has been treated with interferon and who is no longer detected with the help of 1'ACM
F35 of high S protein, the amount of S proteins decreased by 60%, and the amount of average protein S detected represents about 55 t of S proteins present in the sera of these two individuals.
2) Etude realisée sur un groupe d'individus porteurs symptomatiques chez lesquels la réplication virale est nulle (ADN d'HBV non détectable) et possédant des anticorps anti-HBe - chez 80 % de ces individus, la quantité de grande protéine S est nettement inférieure à celle de la protéine S moyenne, ces deux protéines représentant respectivement 15 % et 40 % des protéines S contenues dans le sérum desdits individus, - chez 20 t de ces individus, on ne détecte plus de grande protéine S, et la protéine S moyenne détectée représente environ 35 t des protéines S contenues dans le sérum de ces individus.2) Study performed on a group of symptomatic carriers with zero viral replication (undetectable HBV DNA) and anti-HBe antibodies - in 80% of these individuals, the amount of high protein S is clearly lower than that of the average protein S, these two proteins respectively representing 15% and 40% of the S proteins contained in the serum of said individuals, - in 20 t of these individuals, no longer detects large protein S, and protein S detected mean represents about 35% of the S proteins contained in the serum of these individuals.
I1 faut noter que dans ce même groupe d'individus, la technique d'amplification d'ADN (technique PCR) conduit à la détection chez 80 t d'entre eux d'ADN d'HBV (correspondant & une réplication virale à bas bruit), tandis que chez 20 t d'entre eux, on ne détecte plus d'ADN de 1'HBV. I1 semble donc exister une bonne corrélation des résultats obtenus entre ces deux méthodes, celle de l'invention étant plus avantageuse que celle d'amplification de 1'ADN, compte tenu de la complexité de de mise en oeuvre de cette dernière. It should be noted that in this same group of individuals, the DNA amplification technique (PCR technique) leads to the detection in 80 t of them of HBV DNA (corresponding to a low-noise viral replication). ), while in 20 t of them, HBV DNA is no longer detected. It seems therefore to be a good correlation of the results obtained between these two methods, that of the invention being more advantageous than that of amplification of DNA, taking into account the complexity of implementation of the latter.
3) Etude menée sur un groupe d'individus porteurs asymtomatiques (ou encore porteurs "sains") chez lesquels la réplication virale est nulle, et qui sont porteurs d'anticorps anti-HBe - chez 25 % des individus de ce groupe, aucune protéine
S n'a été détectée, - chez 18 t des individus de ce groupe, ne sont détectées que des protéines S majeures, - chez 46 % des indvidus de ce groupe, on ne détecte pas de grande protéine S, et la quantité de protéine S moyenne détectée représente environ 50 t des protéines
S présentes dans les sérums de ces individus.3) Study conducted on a group of asymptomatic carriers (or "healthy" carriers) in which viral replication is nil, and which carry anti-HBe antibodies - in 25% of the individuals in this group, no protein
S was not detected, - in 18 t of the individuals in this group, only S major proteins are detected, - in 46% of the indvidus of this group, no large protein S is detected, and the amount of protein S average detected represents about 50 t of proteins
S present in the sera of these individuals.
Les légendes des figures mentionnées dans la description détaillée qui précède sont les suivantes - figure 1 : représentation schématique de 1'HBV structure, composants, et interaction(s) cellule-virus. The legends of the figures mentioned in the foregoing detailed description are as follows: FIG. 1: schematic representation of HBV structure, components, and cell-virus interaction (s).
R1 est le récepteur cellulaire impliqué dans la liaison directe de 1'HBV par l'intermédiaire des séquences pré-Sl ; R2 est le récepteur cellulaire pour la p(HSA) probablement impliqué dans la liaison indirecte de llHBV et d'HBsAg par l'intermédiaire des séquences pré-S2 portant le récepteur viral pour la glutaraldehyde-pHSA. R1 is the cellular receptor involved in the direct binding of HBV through pre-Sl sequences; R2 is the cellular receptor for p (HSA) probably involved in the indirect binding of HBVV and HBsAg via pre-S2 sequences carrying the viral receptor for glutaraldehyde-pHSA.
- figure 2 : figure 2a ; dosage radio-immunologique des séquences S, pré-S2 et pre-S1 dans les particules HBsAg (A) et dans les préparations d'HBV purifié à partir de sérum humain (B), et utilisées comme sonde anti-génique dans la figure 2b. Les billes enduites d'anticorps anti-HBs ont été mises en présence avec des concentrations décroissantes soit d'HBsAg soit d'HBV et l'antigène lié a été détecte en utilisant l'anticorps monoclonal F39.20 spécifique de la région S
et l'anticorps monoclonal F124 spécifique de la région pré-S2
et l'anticorps monoclonal MA18/7 spécifique de la région pre-Sl
(i une concentration finale de 5 pg/ml). Figure 2b ;; spécificité polypeptidique de l'anticorps F35.25 par la technique des immuno-empreintes (Western blot). A, sérum HBs/pré-S2AG t B, sérum HBs/pré-S2/pré-SlAg (HBV)t C, HSA (200 Ag/ml) ; D, NHS (dilué au 1:500). La liaison des anticorps monoclonaux dans la figure 2a comme dans la figure 2b a été déterminée avec une anti-immunoglobuline de souris, le fragment F(ab')2 marqué à 1125 (rJl06 cpm par bille ou par bande de gel).- Figure 2: Figure 2a; radioimmunoassay of S, pre-S2 and pre-S1 sequences in HBsAg (A) particles and HBV preparations purified from human serum (B), and used as an anti-genic probe in Figure 2b . Beads coated with anti-HBs antibodies were brought into contact with decreasing concentrations of either HBsAg or HBV and the bound antigen was detected using the F39.20 monoclonal antibody specific for the S region.
and the monoclonal antibody F124 specific for the pre-S2 region
and monoclonal antibody MA18 / 7 specific for the pre-Sl region
(a final concentration of 5 μg / ml). Figure 2b; polypeptide specificity of the F35.25 antibody by the immunoblot technique (Western blot). A, HBs serum / pre-S2AG t B, HBs / pre-S2 / pre-SlAg serum (HBV) t C, HSA (200 Ag / ml); D, NHS (diluted 1: 500). The binding of the monoclonal antibodies in FIG. 2a as in FIG. 2b was determined with a mouse anti-immunoglobulin, the F (ab ') 2 fragment labeled at 1125 (rJ106 cpm per bead or gel band).
- figure 3 : séquence en acides aminés (déduites à partie des séquences d'ADN de 1'HBV) des régions pré
S(21-53), et pré-S(94-117) des grandes protéines de surface P39 et GP42, correspondant å 5 sous-types antigéniques d'HBV. La localisation de l'épitope reconnu par F35.25 est indiqué sur la figure . Les résidus d'aciaes aminés communs aux 5 sous-types sont indiqués par des petits ronds sous chacun de ces acides aminés. Le dipeptide encadré PA est celui probablement requis pour la liaison å l'anticorps F35.25 t la séquence peptidique encadrée s'étendant des acides aminés 40 à 47 (NPDWDFNP), est conservée chez tous les sous-types HBV à l'intérieur du site de liaison de l'anticorps F35.25 ; T représente les sites de clivage par la trypsine accessible dans les particules HBV complètes.FIG. 3: amino acid sequence (deduced from the HBV DNA sequences) from the pre-regions
S (21-53), and pre-S (94-117) large surface proteins P39 and GP42, corresponding to 5 antigenic subtypes of HBV. The location of the epitope recognized by F35.25 is shown in the figure. The amino acid residues common to the 5 subtypes are indicated by small circles under each of these amino acids. The PA-bound dipeptide is that probably required for binding to the F35.25 antibody; the framed peptide sequence extending from amino acids 40 to 47 (NPDWDFNP) is conserved in all HBV subtypes within the binding site of F35.25 antibody; T represents the accessible trypsin cleavage sites in the complete HBV particles.
- figure 4 : dosage radio-immunologique (RIA) à double anticorps, réalisé avec un fluide d'hybridome dilué deux fois contenant F35.25 ( ru 10 ng/ml). a, les peptides spécifiques de la région pré-Sl 1-21, 12-32, 32-53, 53-73, 94-117 ont été utilisés pour enduire des billes. F35.25 lié aux billes enduites de peptide synthétique a été détecté avec une anti-immunoglobuline de souris marquée avec 1125 comme il l'a été décrit dans la figure 2. Figure 4b, les particules HBsAg contenant les séquences pré-S2 de cellules recombinantes CHO, les particules d'HBV purifiées, HSA, pBSA et pHSAont été utilisées pour enduire des billes dans les mêmes conditions que pour la figure 4a. Chaque colonne représente deux déterminations.FIG. 4: Double antibody radioimmunoassay (RIA), performed with a twice diluted hybridoma fluid containing F35.25 (ru 10 ng / ml). a, peptides specific for the pre-Sl region 1-21, 12-32, 32-53, 53-73, 94-117 were used to coat beads. F35.25 bound to synthetic peptide-coated beads was detected with 1125-labeled mouse anti-immunoglobulin as described in Figure 2. Figure 4b, HBsAg particles containing pre-S2 sequences of recombinant cells CHO, the purified HBV particles, HSA, pBSA and pHSA were used to coat beads under the same conditions as for Figure 4a. Each column represents two determinations.
- figure 5 : effet inhibiteur des peptides spécifiques de la région pré-Sl et des particules d'HBV purifiées (à une concentration finale de 20 ZgXml) sur la liaison de 1'ACM F35.25 aux puits enduits avec soit pré
S(32-53) (figure 5a) ou avec HBV sous-type ad (figure 5b). Les conditions de cette expérience ont été décrites dans le chapitre MATERIELS ET METHODES en utilisant un fluide d'hybridome dilué deux fois comme dans la figure 4.FIG. 5: Inhibitory effect of peptides specific for the pre-Sl region and purified HBV particles (at a final concentration of 20 μg × ml) on the binding of ACM F35.25 to the wells coated with either pre
S (32-53) (Figure 5a) or HBV subtype ad (Figure 5b). The conditions of this experiment have been described in the MATERIALS AND METHODS chapter using a hybridoma fluid diluted twice as in FIG.
- figure 6 : sensibilité de 1'ACM F35.25 pour détecter le peptide pré-S(32-53) et les séquences pré-S1 dans les particules d'HBV purifiées. Les puits enduits soit avec le peptide pré-S(32-53) ( u ) (5 pg/ml) ou avec
HBV sous-type ad ( il ) (10 pg/ml) ont été mis en présence avec des concentrations décroissantes de
F35.25 purifié à partir de surnageants de cellules d'hybridome.Figure 6: Sensitivity of F35.25 ACM to detect pre-S (32-53) peptide and pre-S1 sequences in purified HBV particles. Wells coated either with the pre-S (32-53) peptide (u) (5 μg / ml) or with
HBV subtype ad (il) (10 μg / ml) were brought into contact with decreasing concentrations of
F35.25 purified from hybridoma cell supernatants.
- figure 7 : effet de la digestion par la trypsine ou la protéase V8 des particules HBV purifiées (sous-type ad) sur la liaison de 1'ACM F35.25 (a), de l'anticorps monoclonal F376 spécifique de la région pré-S2 (b) et de l'anticorps 6-16 A15 spécifique de la région S (c) à la protéine env par technique d'immuno-empreinte. Le traitement de l'antigène a été coalisé comme il ita été décrit dans le chapitre MATERIELS ET METHODES.Les lignes 1, 4, et 7 représentent des contrôles sans enzyme ; les lignes 2, 5 et 8 représentent les produits de la digestion par la trypsine ; les lignes 3, 6 et 9 -représentent les produits de digestion par la protéase
V8. les lignes 1 à 3 ont été sondées avec le surnageant d'hybridome dilue au 1:2, et les lignes 4 à 9 ont été sondées avec 5 pG/ml d'anticorps monoclonal purifié à partir de liquide d'ascites. L'anticorps se liant aux protéines transférées a été détecté avec l'antiimmunoglobuline de souris marquée avec 1125. les poids moléculaires des peptides ( x 10 3) sont indiquées sur la gauche.FIG. 7: effect of digestion by trypsin or V8 protease of purified HBV particles (ad subtype) on the binding of ACM F35.25 (a), of monoclonal antibody F376 specific for the pre-region -S2 (b) and the 6-16 A15 antibody specific for the S (c) region to the env protein by immunoblot technique. The antigen treatment was pooled as described in the MATERIALS AND METHODS chapter. Lines 1, 4, and 7 represent controls without enzyme; lines 2, 5 and 8 represent the products of trypsin digestion; lines 3, 6 and 9 -represent the products of protease digestion
V8. Lanes 1 to 3 were probed with the 1: 2 diluted hybridoma supernatant, and lines 4 to 9 were probed with 5 μg / ml of purified monoclonal antibody from ascites fluid. The transferred protein binding antibody was detected with the 1125-labeled mouse anti-immunoglobulin. The molecular weights of the peptides (x 10 3) are indicated on the left.
- figure 8 : gradient de sucrose des particules HBV (sous-type ad). 1 ml de matériel enrichi en virus a été sédimenté dans un gradient linéaire de sucrose de 10 à 60 % dans un tampon TN pendant 18 heures à 160000 g et 4 c. Les fractions ont été réunies et sondées avec 1'ACM F39.20
ou 1'ACM F35.25
par dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps utilisant une phase solide portant des anticorps polyclonaux de lapin anti-HBs. La concentration de sucrose
a été testée par refraction. Les fractions 6-8 (40-50 % de sucrose) ont été testées pour leur teneur en ADN d'HBV par hybridation, et pour leur teneur en protéine majeure du corps P22', par immunotransfert (+).FIG. 8: sucrose gradient of HBV particles (subtype ad). 1 ml of virus-enriched material was sedimented in a linear 10-60% sucrose gradient in TN buffer for 18 hours at 160000 g and 4 c. The fractions were pooled and probed with ACM F39.20
or ACM F35.25
by radioimmunoassay with dual antibody specificity using a solid phase carrying anti-HBs rabbit polyclonal antibodies. The concentration of sucrose
has been tested by refraction. Fractions 6-8 (40-50% sucrose) were tested for their HBV DNA content by hybridization, and for their major protein content of the P22 'body, by immunoblotting (+).
- figure 9 : détection de la séquence pre-Sl (32-53) dans les particules d'HBV isolées (sous-type ad ou en utilisant le systeme de dosage radio-immunologique à double spécificité d'anticorps, avec des immunoglobulines anti-HBs sur la face solide et l'anticorps F35.25 sur la face de révélation. Les particules d'HBV purifiées ont été utilisées å une concentration d'l g/ml. La liaison de F35.25 a été détectée avec l'anti-immunoglobuline de souris marquée avec 1125, fragment F(ab')2. FIG. 9: detection of the pre-Sl sequence (32-53) in the isolated HBV particles (subtype ad or using the dual antibody specific radioimmunoassay system, with anti-human immunoglobulins); HBs on the solid side and the F35.25 antibody on the reveal side The purified HBV particles were used at a concentration of 1 g / ml F35.25 binding was detected with mouse immunoglobulin labeled with 1125, F (ab ') 2 fragment.
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