WO2002096941A2 - Polypeptide reagissant avec les anticoprs de patients infectes par le vhc et utilisations - Google Patents

Polypeptide reagissant avec les anticoprs de patients infectes par le vhc et utilisations Download PDF

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WO2002096941A2
WO2002096941A2 PCT/FR2002/001797 FR0201797W WO02096941A2 WO 2002096941 A2 WO2002096941 A2 WO 2002096941A2 FR 0201797 W FR0201797 W FR 0201797W WO 02096941 A2 WO02096941 A2 WO 02096941A2
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antibodies
protein
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PCT/FR2002/001797
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Inventor
Colette Jolivet Reynaud
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bioMérieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Hepatitis C is the main cause of transfusion-acquired hepatitis. Hepatitis C can also be transmitted by other percutaneous routes, for example by injecting drugs intravenously. The risk of contamination of health professionals is also not negligible.
  • Hepatitis C is distinguished from other forms of liver disease associated with viruses, such as hepatitis A, B or D.
  • Hepatitis C virus (HCV or HCV) infections are often chronic, resulting in liver diseases, such as hepatitis, cirrhosis and carcinoma in a large number of cases (5 to 20%).
  • HCV was the first hepatotropic virus isolated using molecular biology techniques. The viral genome sequences were cloned before the viral particle was visualized.
  • HCV Due to its genomic organization and its supposed mode of replication, HCV has recently been classified into a new genus in the family of Flaviviridae, the hepaciviruses.
  • the genus hepacivirus currently includes the hepatitis C and hepatitis G viruses (GBV-C and the GBV-A and GBV-B viruses).
  • HCV is a positive single stranded RNA virus, 9.5 kb, which replicates with a copy of complementary RNA and whose translation product is a precursor of a single polyprotein of approximately 3,000 amino acids.
  • the 5 'end of the HCV genome corresponds to an untranslated region adjacent to the genes that code for structural proteins, the core protein of the nucleocapsid and the two envelope glycoproteins, E1 and E2.
  • the 5 'untranslated region and the core gene are relatively well conserved in the various genotypes.
  • Envelope proteins E1 and E2 are coded by more variable regions from one isolate to another.
  • the 3 'end of the HCV genome contains genes that code for non-structural proteins (NS2, NS3, NS4, NS5) and for a 3' non-coding region with a well conserved domain.
  • the NS2 protein is a protein linked to the viral membrane.
  • the NS3 protein has two domains, one in the NH 2 terminal part corresponding to a serine protease and the other in the COOH-terminal part corresponding to helicase.
  • the NS5 protein contains the RNA dependent RNA polymerase in the NS5B part. The function of NS4 is still poorly understood.
  • the present invention relates to the determination of polypeptides sufficiently immunoreactive to be used in routine use in diagnostic tests, said polypeptides being capable of reacting specifically with the antibodies of patients infected with the HCV virus, and the use of these polypeptides.
  • the Applicant has surprisingly shown that the polypeptides of the invention are capable of being recognized both by the majority of anti-NS3 monoclonal antibodies, but above all by individual human HCV positive sera.
  • the polypeptides of the invention therefore make it possible to overcome the aforementioned drawbacks which had been demonstrated with the Lys-Phe-Ser-Ser-Ser-Arg-Leu polypeptide of application EP-A-0 755 943.
  • the polypeptides of the invention are mimotopes, i.e. polypeptides which are capable of functionally mimicking a binding site for a monoclonal antibody.
  • the sequences of these mimotopes are by definition sequences which do not identify with a continuous linear native sequence or which do not appear in any way in the natural protein.
  • the polypeptide of the invention capable of reacting specifically with the antibodies of patients infected with the HCV virus, must moreover meet at least one of the following definitions:
  • its peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and the equivalent sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or
  • Its peptide sequence consists of a sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and the equivalent sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 are sequences selected from the sequences which retain the immunoreactive properties of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and which (a) have, with respect to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, at least one substitution of an amino acid with an equivalent amino acid and / or (b) are structurally modified.
  • Group 1 alamne, proline, glycine.
  • Group 2 aspartic acid, glutamic acid.
  • Group 3 histidine, lysine, arginine.
  • Group 4 asparagine, glutamine, serine, threonine.
  • Group 5 phenylalanine, tyrosine, tryptophan.
  • Group 6 isoleucine, leucine, valine, methionine.
  • a peptide sequence is also considered to be equivalent to SEQ ID NO: 1 OR SEQ JD NO: 2 if, insofar as it retains the immunoreactive properties of SEQ ED NO: 1 or SEQ ID NO: 2, it has, with respect to this, at least one of the following modifications:
  • a peptide sequence with respect to a reference peptide sequence by its identity or its homology, expressed as a percentage, with said reference sequence. This percentage is determined, for a series of a given number of contiguous amino acids, by alignment of the two sequences, displacement of one relative to the other, and comparison of the amino acids in the two sequences.
  • the percentage of identity is determined from the number of amino acids which are identical to amino acids of the reference sequence, in the same position.
  • the percentage of homology is determined from the number of amino acids which are equivalent to amino acids of the reference sequence, in the same position.
  • polypeptide is meant a peptide, in the isolated state, having a sequence of a variable number of amino acids, such as an oligopeptide, a protein, mie fusion protein, a fusion peptide, a peptide of synthesis.
  • a polypeptide can be obtained by various techniques well known to those skilled in the art, and in particular by chemical synthesis or by genetic recombination techniques.
  • polypeptides according to the invention can be obtained by conventional synthesis methods, for example with an automatic peptide synthesizer, or by genetic engineering techniques comprising the insertion of a DNA sequence coding for said polypeptide into a vector of expression such as a plasmid or a virus, and the transformation of cells with this expression vector and culture of these cells.
  • a vector of expression such as a plasmid or a virus
  • a polypeptide of the invention advantageously comprises at most 50 amino acids, preferably at most 30 amino acids, or better still at most 21 amino acids, or even at most 15 amino acids.
  • biological sample in particular blood, serum, plasma, primary hepatocyte cells, T lymphocytes, B lymphocytes, tissue extracts, in particular from the liver.
  • HCV is hepatotropic and it has been more recently shown that it is also lymphotropic.
  • the present invention also relates to a reagent for the detection and / or the quantification of anti-HCV antibodies in a biological sample taken from a patient infected with HCV which comprises:
  • kits for the detection and / or quantification of anti-HCV antibodies in a biological sample taken from a patient infected or suspected of having been infected with the HCV virus which comprises a reagent as defined above.
  • the invention also relates to several methods for the detection and / or the quantification of anti-HCV antibodies in a biological sample taken from a patient infected or likely to have been infected with the HCV virus which are described in more detail below.
  • the first process is a process called “sandwich” which can be carried out in one or more stages and which comprises at least the following stages:
  • the ligand is then either the NS3 protein or a fragment of said labeled protein, or a labeled synthetic polypeptide whose peptide sequence comprises or consists of the sequence of said NS3 protein or a fragment of said protein, or one of the two polypeptides of the invention marked in the case where the reagent included only one polypeptide of the invention immobilized on the solid phase, namely a labeled anti-immunoglobulin.
  • the second method is called "competition testing" and includes at least the following steps:
  • the mixture is incubated for a predetermined time; - the solid phase is separated from the liquid phase;
  • polypeptides of the invention are immunogenic and are therefore used for the production of monoclonal or polyclonal antibodies or fragments of said antibodies by immunological reaction with an animal organism, preferably a mouse, a rat or a rabbit with an immunogenic agent which consists of a polypeptide whose polypeptide sequence comprises or consists of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or their equivalent sequences which retain the immunogenic properties of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, as defined above.
  • an animal organism preferably a mouse, a rat or a rabbit with an immunogenic agent which consists of a polypeptide whose polypeptide sequence comprises or consists of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or their equivalent sequences which retain the immunogenic properties of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, as defined above.
  • polyclonal antibodies we mean polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, transmembrane antibodies and humanized antibodies or fragments of said antibodies.
  • the production of polyclonal and monoclonal antibodies is part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (peptide KLH) as a carrier for immunization or to serum albumin (peptide SA).
  • the animals are injected with immunogen using complete Freund's adjuvant.
  • the sera and hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests.
  • the hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected.
  • Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice.
  • the antibodies are then purified.
  • the purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A sufficient number of antibodies are screened in functional tests to identify the best performing antibodies.
  • the in vitro production of antibodies, antibody fragments or antibody derivatives, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering is well known to those skilled in the art.
  • transmembrane antibody an antibody whose at least the functional region capable of recognizing and binding to its specific antigen is expressed on the surface of the target cells to allow said recognition and fixation. More particularly, the antibodies according to the present invention consist of fusion polypeptides comprising the amino acids defining said functional region and an amino acid sequence (transmembrane polypeptide) allowing anchoring within the double lipid membrane layer of the target cell or to the external surface of this bi-layer.
  • the nucleic sequences encoding many transmembrane polypeptides are described in the literature.
  • humanized forms of non-human, for example murine, antibodies are chimeric antibodies which comprise a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are human immunoglobulins (receptor antibodies) in which residues of a hypervariable region of the receptor are replaced by residues of a hypervariable region of a donor species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit or non-human primate, having the specificity, affinity and capacity desired.
  • donor antibody such as mouse, rat, rabbit or non-human primate
  • the residues (FR) of the Fv region of human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may include residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody.
  • the humanized antibody will comprise at least and preferably two variable domains, in which all or almost all of the hypervariable loops correspond to a non-human immunoglobulin and all or almost all of the FR regions will be those of an immunoglobulin. human.
  • the optionally humanized antibodies may also comprise at least part of a constant region (Fc) of an immunoglobulin, such as a human immunoglobulin (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); and Presta et al., Curr. Op. Stract. Biol. 2: 593-596 (1992).
  • antibody fragment By antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ′, scFv (Blazar et al, 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al, 1988,
  • the invention therefore also relates to a reagent for the detection of an infection by the HCV virus which comprises at least one monoclonal antibody or a polyclonal antibody or their fragments as defined above and a kit comprising at least one such reagent, as well as the use of said monoclonal or polyclonal antibodies in several methods for the detection and / or quantification of the NS3 protein in a biological sample taken from a patient infected or likely to have been infected with the HCV.
  • the first two processes are called “sandwich” and are described in more detail below.
  • NS3 protein circulating in the plasma or the serum is not in sufficient quantity to allow a sufficiently sensitive detection test, it is possible to pretreat a biological sample to lyse the cells or dissociate the complexes and release the protein.
  • the first “sandwich” process of the invention comprises at least the following steps:
  • a mixture comprising: (i) a reagent which consists of at least one monoclonal antibody or a fragment of monoclonal antibody as defined above, which is or will be immobilized on a solid phase,
  • the potential presence of the NS3 protein in the sample is revealed by measuring the degree of labeling in the solid phase.
  • the labeled ligand is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or a fragment of said antibody.
  • the second “sandwich” process comprises at least the following steps: - a mixture is prepared comprising:
  • a reagent which consists of at least one polyclonal antibody or a fragment of said antibody as defined above, which is or will be immobilized on a solid phase
  • the labeled ligand is a monoclonal antibody or mi polyclonal antibody or their fragments.
  • the third process is a competitive process which includes at least the following steps: - a mixture is prepared comprising:
  • a reagent which comprises at least one monoclonal antibody or a polyclonal antibody or fragments of said antibodies of the invention, which is or will be immobilized on a solid phase
  • the solid phase is separated from the liquid phase; and - the potential presence of the NS3 protein in the sample is revealed by measuring the degree of labeling in the solid phase.
  • Another method for demonstrating the NS3 protein in a biological sample comprises at least the following steps:
  • tissue extract for example from the liver, is taken from an individual suspected of having been infected with HCV, and
  • tissue extract is brought into contact with at least one labeled monoclonal or polyclonal antibody of the invention.
  • the presence of HCV is demonstrated by direct immunofluorescence on the extract to be tested.
  • an object of the invention is also an immunotherapeutically active composition, in particular a vaccine preparation, which comprises at least one polypeptide of the invention as active ingredient and whose polypeptide sequence comprises or consists of a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and their equivalent sequences which retain the immunogenic properties of SEQ ID NO: 1 and of SEQ ID NO: 2, as defined above, and optionally a support for the said polypeptide (s) and / or a pharmaceutically acceptable excipient and / or an adjuvant and / or a diluent.
  • Such an immunotherapeutically active composition and in particular a prepared vaccine composition is injectable, that is to say in liquid solution or in suspension.
  • the preparation can also be emulsified.
  • the antigenic molecule that is to say the polypeptide or polypeptides of the invention, can be mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient or principle. Examples of favorable excipients are water, saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like and combinations thereof.
  • the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations.
  • the vaccine is administered conventionally by injection, for example intramuscularly.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is meant the supports and vehicles which can be administered to humans or to an animal, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed., Mack Publishing Co.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength.
  • the definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
  • the amount of active ingredient depends on whether an adjuvant or not is added to the composition. Generally, it is between 10 and 50 ⁇ g / ml of active ingredient and usually 20 ⁇ g / 0.5 ml in adults and 10 ⁇ g / 0.5 ml in children are administered per dose.
  • the vaccine composition may further include proteins that promote the immune response.
  • the invention therefore also relates to a method for the vaccination of an individual according to which a vaccine composition which meets the above definitions is administered to the individual, preferably by injection, and to a method for the treatment or for preventing an HCV infection in which an immunotherapeutically active composition as defined above is administered to an individual.
  • the invention relates to the use of a polypeptide of the invention, for fixing in a biological sample antibodies characteristic and or specific of infection with HCV.
  • SEQ ID NO: 1 is also called motif of clone 6 and SEQ JO NO: 2 is also called motif of clone 16.
  • Figure 1 shows the immunoreactivity of the selected clones.
  • On the ordinate is represented at 492 nm the DO of the clone - DO control x 100.
  • the histograms represent the results obtained with each selected clone.
  • FIG. 2 represents the recognition of clones 6 and 16 by anti-NS3 antibodies.
  • the numbers of the anti-NS3 monoclonal antibodies are given on the abscissa and the OD x 1000 at 492 nm is shown on the ordinate.
  • the histograms in dark gray correspond to the results obtained with the motif of the clone 16 and the histograms in light gray correspond to the results obtained with the motif of the clone
  • FIG. 3 represents the recognition of the motif of clone 6 by HCV positive sera. The sera are identified on the abscissa and the OD at 492 nm
  • FIG. 4 represents the recognition of the motif of clone 6 by HCV positive sera. The sera are identified on the abscissa and the OD at 492 nm
  • FIG. 5 represents the comparison of the sequence of the truncated NS3 recombinant protein and the sequences of the motifs of clones 6 and 16.
  • FIG. 6 represents experiments of inhibition of the binding of the monoclonal antibody 3B1C4 on clones 6 and 16 by synthetic peptides reproducing the truncated protein NS3 of 93 amino acids.
  • the peptides are identified on the abscissa and the residual activity (in percentage) is represented on the ordinate.
  • the histograms in dark gray represent the results obtained with the motif of clone 6 and the results in dark gray represent the results obtained with the motif of clone 16.
  • FIG. 7 represents the recognition of the motifs of clones 6 and 16 in MAP4 form by HCV positive human sera. Human sera are identified on the abscissa and the OD x 1000 at 492 nm is represented on the ordinate.
  • the histograms in dark gray represent the results obtained with the motif of clone 6 and the results in dark gray represent the results obtained with the motif of clone 16.
  • Example 1 Selection of phage clones coding for a dodecapeptide reacting specifically with an anti-NS3 monoclonal antibody.
  • a bank of dodecapeptides expressed on the surface of an M13 phage (Ph.D.-12TM Phage display Peptide Library Kit, New England BioLabs Inc) was screened by the anti-NS3 3B1C4 monoclonal antibody (bioMérieux). Four successive selections were made with decreasing amounts of antibody following the instructions in the bank's user manual provided by New England BioLabs. The phages of the fourth selection are then cloned and 35 clones chosen so are amplified and their DNA sequence.
  • the protein sequences deduced from the nucleotide sequences of the inserts made it possible to identify 26 different motifs, some of which are represented several times (see table 1 below).
  • the immunoreactivity of the various motifs expressed on the surface of the phages was then analyzed by ELISA, according to the protocol manual, with the selection antibody 3B1C4 and an irrelevant monoclonal antibody anti-Borrelia burgdorferi OSPA used as negative control.
  • One hundred ⁇ l of monoclonal antibody 3B1C4 or of the antiOSPA antibody used as negative control are fixed at 100 ⁇ g / ml in 0.1 M NaHCO 3 overnight at 4 ° C. at the bottom of wells of ELISA plates. The plate is then saturated for 2 hours at 4 ° C with a saturation solution as indicated by the supplier.
  • TBS-Tween buffer 100 ⁇ l of 0.5% TBS-Tween containing 10 11 phages are incubated for 2 hours at room temperature with shaking.
  • TBS-Tween 100 ⁇ l of biotinylated anti Ml 3 antibody (5 Prime 3 Prime Inc.) diluted to 1/500 are added for 2 hours at room temperature with stirring.
  • Four new washes are carried out before adding 100 ⁇ l / well of streptavidin conjugated with peroxidase diluted to 1/10000 in saturation solution. After one hour of incubation at 37 ° C the plate is washed four times.
  • the colorimetric reaction is carried out by adding a solution of ortho-phenylenediamine and hydrogen peroxide (colorEIA bioMérieux kit) for 10 min. in the dark before being stopped with 50 ⁇ l of 1.8N sulfuric acid.
  • the optical density is read at 492 nm.
  • the results are expressed by the average of the triplicate values obtained with 3B1C4 minus the average of the triplicate values obtained with the anti-OSPA control antibody.
  • the results are presented in FIG. 1. 17 patterns give a specific positive signal for 3B1C4 (FIG. 1). However, three motifs (clones 6, 16 and 17) appear to be much more immunoreactive than the others.
  • Biop.4 means: 4th selection
  • Example 2 Immunoreactivity of phage patterns towards sera from HCV positive patients.
  • the phage clones 6 and 16 were tested in ELIS A with human sera by fixing at the bottom of the wells of Nunc Maxisorb plates 100 ⁇ l of a dilution to l / 50 th of serum in 0.1 M NaHCO 3 buffer.
  • One hundred .mu.l of sérmn diluted to l / 50th 0.1M NaHCO 3 are added to the bottom of ELISA plate wells and incubated overnight at 4 ° C in a humid chamber. The plate is then emptied and saturated for 2 hours at 4 ° C in saturation solution.
  • the colorimetric reaction is carried out by adding a solution of ortho-phenylenediamine and hydrogen peroxide (colorEIA bioMérieux kit) for 10 min in the dark before being stopped with 50 ⁇ l of 1.8N sulfuric acid.
  • the optical density is read at 492 nm. The results are expressed by the average of the triplicate values obtained with each serum minus the average of triplicate obtained with the dilution buffer alone.
  • Example 3 Localization on the NS3 protein of the epitope mimicked by the motifs of phage clones 6 and 16
  • FIG. 5 represents the localization of the sequence similarities between motifs 6 (WHRHWPSHPTQK), 16 (AHKWYSQWLPHR) and the first 40 amino acids of the C33 protein truncated by 93 amino acids (1372-1464).
  • the location of peptides G19L and I18G on the C33 sequence is indicated by arrows.
  • 3 amino acids of clone 6 are identical with the sequence of NS3 (RH, 1389-1390; K1398) and 2 similar with SK1396-1397.
  • 2 amino acids are identical with Y1276; P1381 and 2 amino acids are similar with K1378; 11380.
  • Experiments of inhibition of binding of the monoclonal antibody 3B1C4 on clones 6 and 16 by synthetic peptides reproducing the sequence of the truncated protein NS3 of 93 amino acids show were carried out.
  • One hundred ⁇ l of 3B1C4 monoclonal antibody at 100 ⁇ g / ml are fixed overnight at 4 ° C. at the bottom of wells of ELISA plates.
  • the plate is then saturated for 2 hours at 4 ° C. with the saturation solution as indicated by the supplier.
  • 50 ⁇ l of a solution of peptides at 100 ⁇ g / ml in TBS are incubated for 30 min. at 37 ° C. before adding 50 ⁇ l of 0.5% TBS-Tween containing 2.5 ⁇ 10 10 phages for an additional 2 hours at room temperature with stirring.
  • 100 ⁇ l of biotinylated anti Ml 3 antibody (5 Prime 3 Prime Inc.) diluted to 1/500 are added for 2 hours at room temperature with stirring.
  • FIG. 6 show that only the peptide of 20 amino acids I18G (sequence 1392-1411) was capable of inhibiting the recognition of clones 6 and 16 by the antibody 3B1C4.
  • the peptide of 21 amino acids G19L (1371-1391) which however entirely contains the zone of similarity with clone 16 and 2 has no inhibitory power on the binding of the antibody 3B1C4 on clones 6 and 16.
  • the structure of the helicase domain of the NS3 protein of HCV was determined by crystallography by N Yao et al., 1997, Nature Struc. Biol. 4: 463-467.
  • the 1393-1402 region of NS3 corresponds to a perfectly accessible loop for my interaction with an antibody.
  • amino acids identified on mimotope 6 as being identical or similar to those of the sequence 1389-1398 are contiguous s the 3-D structure of helicase.
  • R1389; K1397; K1398 are part of the amino acids described by Yao et al. as candidates for promoting an electrostatic interaction RNA-helix sm the second domain of helicase.
  • the location of the epitope recognized by the monoclonal antibody 3B1C4 s the three-dimensional structure of the helicase part of the NS3 protein corresponds to the following amino acids also referenced by their positioning relative to the NS3 protein: Arg 18: R1389; Ser25: S 1396; Lys 26: K 1397; Lys 27: K1398; Lys28: K 1399.
  • Example 5 Immunoreactivity of synthetic peptides reproducing mimotopes 6 and 16 with respect to sera from HCV positive patients.
  • HCV positive human sera as well as sera from healthy individuals diluted to 1/50 th were tested with motifs 6 and 16 reproduced in the form of branched synthetic peptides (MAP4) and fixed to the bottom of the wells of ELISA plates at the final concentration of 10 ⁇ g / ml in 0.1 M NaHCO 3 .
  • MAP4 branched synthetic peptides
  • mimotopes 6 and 16 are significantly recognized by all the HCV positive sera tested ( Figure 7).
  • MAP4-6 and MAP4-16 peptides were also tested with a seroconversion panel (Boston Biomedica, Inc. Bridgewater, MA). As shown in Table 2 below, these peptides are recognized by 14 and 8 sera respectively out of the 18 sera tested. The addition of the two responses has no cumulative effect, however positive responses are obtained in pum sera in which the amount of anti-NS3 antibody is not or hardly detected by RIBA.
  • the peptides are tested by ELISA with sera diluted 1/50.
  • the responses against MAP4-6 and MAP4-16 are indicated by + or - depending on whether the values obtained are higher or lower than mid recognition threshold defined by the average of the values obtained with 12 negative sera + 3 standard deviations.

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Abstract

L'invention concerne un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par le virus VHC et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, et les séquences équivalentes de SEQ ID NO: 1 ou SEQ NO:2 sélectionnées parmi les séquences conservant les propriétés immunoréactives de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, et présentant, par rapport à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, au moins une substitution d'un acide aminé par un acide animé équivalent, les acides aminés équivalents étant choisis dans les groupes suivants: Groupe 1 : alanine, proline, glycine. Groupe 2 : acide aspartique, acide glutamique. Groupe 3 : histidine, lysine, arginine. Groupe 4 : asparagine, glutamine, sérine, thréonine. Groupe 5 : phénylalanine, tyrosine, tryptophane. Groupe 6 : isoleucine, leucine, valine, méthionine, et/ou structurellement modifiées. L'invention concerne aussi l'utilisation de ce polypeptide pour la détection et la quantification d'anticorps anti-VHC ou de protéine NS3, dans un échantillon biologique, et pour l'obtention d'anticorps.

Description

POLYPEPTIDE REAGISSANT AVEC LES ANTICORPS DE PATIENTS INFECTES PAR LE VHC ET UTILISATIONS
L'hépatite C est la cause principale des hépatites acquises par transfusion. L'hépatite C peut également être transmise par d'autres voies percutanées, par exemple par injection de drogues par voie intraveineuse. Le risque de contamination des professionnels de la santé n'est par ailleurs pas négligeable.
L'hépatite C se distingue des autres formes de maladies du foie associées à des virus, telles que les hépatites A, B ou D. Les infections par le virus de l'hépatite C (VHC ou HCV) sont souvent chroniques avec pour résultante des maladies du foie, telles que hépatite, cirrhose et carcinome dans un grand nombre de cas (5 à 20%).
Bien que le risque de transmission du virus par transfusion ait diminué du fait de la mise en place de tests de criblage dans les années 1990, la fréquence des hépatites C reste élevée. A titre d'exemple, une étude récente indique qu'il y aurait encore aujourd'hui 15 000 nouveaux cas d'infection par an en France (S. Deuffic et al., Hepatology 1999 ; 29 : 1596-1601). Actuellement, environ 170 millions de personnes à travers le monde sont infectées de manière chronique par le VHC. Les populations à risque élevé sont principalement le personnel hospitalier et les utilisateurs de drogues intraveineuses, mais il existe des dormeurs de sang asymptomatiques qui n'appartiennent pas à ces groupes à risque élevé et chez lesquels des anticorps anti- VHC circulants ont été retrouvés. Pour ces derniers, la voie de l'infection n'a encore pas été identifiée.
Le VHC a été le premier virus hépatotrope isolé au moyen des techniques de biologie moléculaire. Les séquences du génome viral ont été clonées avant que la particule virale ait été visualisée.
Du fait de son organisation génomique et de son mode présumé de réplication, le VHC a été classifié récemment dans un nouveau genre de la famille des Flaviviridae, les hepacivirus. Le genre hepacivirus regroupe actuellement les virus de l'hépatite C et de l'hépatite G (GBV-C et les virus GBV-A et GBV-B). Le VHC est un virus à ARN simple brin positif, de 9,5 kb, qui se réplique par une copie d'ARN complémentaire et dont le produit de la traduction est un précurseur d'une polyprotéine unique d'environ 3 000 acides aminés. L'extrémité 5' du génome du VHC correspond à une région non traduite adjacente aux gènes qui codent pour les protéines structurales, la protéine core de la nucléocapside et les deux glycoprotéines d'enveloppe, El et E2. La région non traduite 5' et le gène core sont relativement bien conservés dans les différents génotypes. Les protéines d'enveloppe El et E2 sont codées par des régions plus variables d'un isolât à un autre. L'extrémité 3' du génome du VHC contient les gènes qui codent pour les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4, NS5) et pour une région 3' non codante possédant un domaine bien conservé. La protéine NS2 est une protéine liée à la membrane virale. La protéine NS3 comporte deux domaines, l'un dans la partie NH2 terminale correspondant à une serine protéase et l'autre dans la partie COOH-terminale correspondant à l'hélicase. La protéine NS5 contient la ARN polymérase ARN dépendante dans la partie NS5B. La fonction de NS4 est encore mal connue.
Des études cliniques ont montré que des anticorps spécifiquement dirigés contre les régions conservées de la nucléocapside et contre NS3 apparaissent précocement après infection par le VHC. Ces deux protéines constituent donc de bons marqueurs pour la réalisation de tests diagnostiques des infections à VHC. D'autres études ont par ailleurs mis en évidence l'existence de plusieurs antigènes imunodominants, notamment l'antigène C33 de la région NS3 et plus particulièrement l'antigène dénommé C33c correspondant à une fraction de C33 (voir WO 9115771). Toutefois, l'obtention de ces peptides, de 266 et 93 acides aminés respectivement, sous une forme isolée, par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, présente un certain nombre d'inconvénients liés notamment aux modifications post-traductionnelles nécessaires pour obtenir des peptides suffisamment immunoréactifs, ou à des difficultés de synthèse chimique desdits peptides, en particulier en raison de leur taille.
Dans une précédente demande de brevet (EP-A-0 755 943) la Demanderesse avait décrit et revendiqué un polypeptide capable de se substituer à l'antigène C33 du virus de l'hépatite C. La séquence de ce polypeptide avait été déduite d'un clone phagique renfermant un hexapeptide (Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu) sélectionné par criblage d'une banque d'hexapeptides portés par des phages, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-C33 commercial (Anogen). Il avait par ailleurs été montré que le polypeptide (Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu) identifié en SEQ ID NO : 10 dans cette demande de brevet antérieure et porté par ce clone phagique était aussi reconnu par plusieurs anticorps monoclonaux qui entraient en compétition les uns avec les autres pour la reconnaissance, sur la protéine C33, d'un site immunodominant aussi reconnu par des sérums humains VHC positifs. Ainsi la forte réactivité de l'anticorps monoclonal 12A1H2 vis à vis du clone phagique avait été inhibée par pré-incubation d'un pool de 5 sérums humains VHC positifs.
Cependant, testées sous forme de polypeptides synthétiques et avec des sérums individuels, la séquence Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu ainsi que les séquences qui en découlent se sont avérées trop faiblement immunoréactives pour être utilisées de façon courante dans un test diagnostique. De plus le motif Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu n'était pas recoimu par tous les anticorps monoclonaux qui entraient en compétition avec la réponse humaine dirigée vers l'épitope immunodominant de la protéine recombinante C33. Aussi, la présente invention concerne la détermination de polypeptides suffisamment immunoréactifs pour être utilisés de manière courante dans des tests de diagnostic, lesdits polypeptides étant capables de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par le virus VHC, et l'utilisation de ces polypeptides. En effet, la Demanderesse a montré de manière surprenante que les polypeptides de l'invention étaient capables d'être reconnus à la fois par la majorité des anticorps monoclonaux anti-NS3, mais surtout par des sérums humains individuels VHC positifs. Les polypeptides de l'invention permettent donc de pallier les inconvénients précités qui avaient été mis en évidence avec le polypeptide Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu de la demande EP-A-0 755 943. Les polypeptides de l'invention sont des mimotopes, c'est à dire des polypeptides qui sont capables de mimer fonctionnellement un site de liaison pour un anticorps monoclonal. Les séquences de ces mimotopes sont par définition des séquences qui ne s'identifient pas à une séquence native linéaire continue ou qui n'apparaissent pas de quelle que manière que ce soit dans la protéine naturelle. Le polypeptide de l'invention, capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par le virus VHC, doit en outre répondre à au moins une des définitions suivantes :
- sa séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO :l, SEQ ID NO :2, et les séquences équivalentes de SEQ ID NO :l ou SEQ ID NO :2, ou
- sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 2, et les séquences équivalentes de SEQ ID NO :l ou SEQ ID NO :2.
Les séquences équivalentes de SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2 sont des séquences sélectionnées parmi les séquences qui conservent les propriétés immunoréactives de SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 et qui (a) présentent, par rapport à SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, au moins une substitution d'un acide aminé par un acide aminé équivalent et/ou (b) sont structurellement modifiées.
Sont considérés comme équivalents, des acides aminés appartenant au même groupe, parmi les six groupes suivants :
Groupe 1 : alamne, proline, glycine. Groupe 2 : acide aspartique, acide glutamique.
Groupe 3 : histidine, lysine, arginine.
Groupe 4 : asparagine, glutamine, serine, thréonine.
Groupe 5 : phénylalanine, tyrosine, tryptophane. Groupe 6 : isoleucine, leucine, valine, méthionine.
Cette équivalence a été déterminée à partir des informations contenues dans l'article de Kramer A. et al. (Molecular Immunology, Vol. 32, N°7, pp. 459-465 (1995)). Ces auteurs ont constitué des banques dans lesquelles pour réduire le problème de l'explosion combinatoire du nombre de molécules, ils ont utilisé des groupes d'acides aminés constitués d'acides aminés ayant des propriétés physico-chimiques similaires et les acides aminés regroupés dans chacun de ces six groupes, listés ci- dessus, sont considérés comme équivalents dans la présente invention.
Une séquence peptidique est aussi considérée comme équivalente de SEQ ID NO :1 OU SEQ JD NO :2 si, dans la mesure où elle conserve les propriétés immunoréactives de SEQ ED NO :l ou SEQ ID NO :2, elle présente, par rapport à celle-ci, au moins l'une quelconque des modifications suivantes :
Remplacement d'un ou plusieurs acides aminés de la série L par un acide aminé de la série D, et vice- versa,
Introduction d'une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions aminés, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques,
Modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.
Il est aussi possible de définir l'équivalence d'une séquence peptidique par rapport à une séquence peptidique de référence par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. Le pourcentage d'homologie est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position.
Avant d'exposer l'invention plus en détails, on définit ci-après différents termes employés dans la description et les revendications. Par "polypeptide", on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, mie protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules.
Un polypeptide de l'invention comporte avantageusement au plus 50 acides aminés, préférentiellement au plus 30 acides aminés, ou mieux encore au plus 21 acides aminés, voire au plus 15 acides aminés.
Par « échantillon biologique », on entend notamment le sang, le sérum, le plasma, les cellules d'hépatocytes primaires, les lymphocytes T, les lymphocytes B, des extraits tissulaires, en particulier de foie. En effet, il est connu que le VHC est hépatotrope et il a été plus récemment montré qu'il était également lymphotrope.
Outre les polypeptides définis ci-dessus la présente invention concerne également un réactif pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le VHC qui comprend :
- au moins un polypeptide dont la séquence peptidique comprend ou consiste en SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2 ou en des séquences équivalentes aux dites SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2 qui conservent les mêmes propriétés immunoréactives que SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2, telles que définies ci-dessus. - au moins deux polypeptides dont les séquences peptidiques comprennent ou consistent en SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 ou en des séquences équivalentes aux dites SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2 qui conservent les mêmes propriétés immunoréactives que SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, telles que définies ci-dessus ; et un kit pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou suspecté avoir été infecté par le virus VHC qui comprend un réactif tel que défini ci-dessus.
L'invention se rapporte également à plusieurs procédés pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou susceptible d'avoir été infecté par le virus VHC qui sont décrits plus en détail ci-dessous. Le premier procédé est un procédé dénommé « sandwich » qui peut être réalisé en une ou plusieurs étapes et qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant s'ils sont présents des anticorps anti-VHC,
(iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec les anticorps anti- VHC de l'échantillon ; - le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
Le ligand est alors soit la protéine NS3 ou un fragment de ladite protéine marqué, soit un polypeptide de synthèse marqué dont la séquence peptidique comprend ou consiste en la séquence de ladite protéine NS3 ou en un fragment de ladite protéine, soit un des deux polypeptides de l'invention marqué dans le cas où le réactif ne comprenait qu'un seul polypeptide de l'invention immobilisé sur la phase solide, soit une anti-immunoglobuline marquée. Le deuxième procédé est dénommé « test par compétition » et comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant s'ils sont présents des anticorps anti-VHC,
(iii) des anticorps anti-VHC marqués qui seront capables de réagir avec le réactif ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ; - la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
Les polypeptides de l'invention sont immunogènes et sont donc utilisés pour la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou de fragments desdits anticorps par réaction immunologique avec un organisme animal, de préférence une souris un rat ou un lapin à un agent immunogène qui consiste en un polypeptide dont la séquence polypeptidique comprend ou consiste en SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2 ou en leurs séquences équivalentes qui conservent les propriétés immunogènes de SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, telles que définies précédemment.
- Par anticorps, on entend les anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux, les anticorps transmembranaires et les anticorps humanisés ou des fragments desdits anticorps. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kohler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 :495-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G.F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp. 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Pour la production d'anticorps monoclonaux, F immunogène peut être couplé à de l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA). Les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quel que soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromato graphie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier.
- Par anticorps transmembranaire, on entend un anticorps dont au moins la région fonctionnelle capable de reconnaître et de se fixer à son antigène spécifique est exprimée à la surface des cellules cibles pour permettre lesdites reconnaissance et fixation. Plus particulièrement, les anticorps selon la présente invention consistent en des polypeptides de fusion comprenant les amino acides définissant ladite région fonctionnelle et une séquence d' amino acides (polypeptide transmembranaire) permettant l'ancrage au sein de la double couche lipidique membranaire de la cellule cible ou à la surface externe de cette bi-couche. Les séquences nucléiques codant pour de nombreux polypeptides transmembranaires sont décrites dans la littérature.
- Les formes " humanisées " d'anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d'une immunoglobuline non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l' immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains. De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobuline non humaine et tout ou à peu près tout des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine (Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1986) ; Reichmann et al, Nature 332 : 323-329 (1988) ; et Presta et al., Curr. Op. Stract. Biol. 2 : 593-596 (1992).
- Par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab', scFv (Blazar et al, 1997, Journal of Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al, 1988,
Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394-397).
L'invention se rapporte donc aussi à un réactif pour la détection d'une infection par le virus VHC qui comprend au moins un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou leurs fragments tel(s) que défini(s) ci-dessus et un kit comprenant au moins un tel réactif, ainsi que l'utilisation desdits anticorps monoclonaux ou polyclonaux dans plusieurs procédés pour la détection et/ou la quantification de la protéine NS3 dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou susceptible d'avoir été infecté par le VHC. Les deux premiers procédés sont dénommés « sandwich » et sont décrit plus en détail ci-dessous. Il convient par ailleurs de noter que dans certains cas dans lesquels la protéine NS3 circulante dans le plasma ou le sérum n'est pas en quantité suffisante pour permettre un test de détection suffisamment sensible il est possible de prétraiter un échantillon biologique pour lyser les cellules ou dissocier les complexes et libérer la protéine.
Le premier procédé « sandwich » de l'invention comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant : (i) un réactif qui consiste en au moins un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps monoclonal tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine NS 3, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine NS3 de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle de la protéine NS3 dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
Le ligand marqué est un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou un fragments desdits anticorps.
Le deuxième procédé « sandwich » comprend au moins les étapes suivantes : - un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif qui consiste en au moins un anticorps polyclonal ou un fragment dudit anticorps tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide,
(iï) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine NS3,
(iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine NS3 de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et - la présence potentielle de la protéine NS3 dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide. Le ligand marqué est un anticorps monoclonal ou mi anticorps polyclonal ou leurs fragments.
Le troisième procédé est un procédé par compétition qui comprend au moins les étapes suivantes : - mi mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif qui comprend au moins un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou des fragments desdits anticorps de l'invention , qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine NS 3,
(iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec le réactif (i) et qui consiste en un polypeptide de l'invention tel que défini précédemment ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et - la présence potentielle de la protéine NS3 dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
Un autre procédé pour la mise en évidence de la protéine NS3 dans un échantillon biologique comprend au moins les étapes suivantes :
- on prélève chez un individu suspecté avoir été infecté par le VHC un extrait tissulaire, par exemple de foie, par biopsie, et
- on met en contact ledit extrait tissulaire avec au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal marqué de l'invention. Généralement, la présence du VHC est mise en évidence par immunofluorescence directe sur l'extrait à tester.
En raison du pouvoir immunogène des polypeptides de l'invention qui induisent m e forte réponse immune ces derniers sont utilisables individuellement ou en combinaison comme composant(s) actif(s) de la réponse immune. Donc un objet de l'invention est également une composition immunothérapeutiquement active, notamment une préparation vaccinale, qui comprend au moins un polypeptide de l'invention comme ingrédient actif et dont la séquence polypeptidique comprend ou consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, et leurs séquences équivalentes qui conservent les propriétés immunogènes de SEQ ID NO : 1 et de SEQ ID NO : 2, telles que définies précédemment, et éventuellement un support pour le ou lesdits polypeptide(s) et/ou un excipient et/ou un adjuvant et/ou un diluant pharmaceutiquement acceptable. Une telle composition immunothérapeutiquement active et en particulier une composition vaccinale préparée est injectable, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique, c'est à dire le ou les polypeptides de l'invention, peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient ou principe actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifiants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxide d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations. Le vaccin est administré conventionnellement par injection, par exemple intramusculaire.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » on entend les supports et véhicules administrables à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16th éd., Mack Publishing Co. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington's Pharmaceutical Sciences précité.
La quantité d'ingrédient actif est fonction du fait qu'un adjuvant ou non est ajouté à la composition. Généralement, elle est comprise entre 10 et 50 μg/ml d'ingrédient actif et usuellement de 20μg/0,5 ml chez les adultes et de 10μg/0,5 ml chez les enfants sont administrés par dose. La composition vaccinale peut de plus comprendre des protéines qui favorisent la réponse immunitaire.
L'invention se rapporte donc également à un procédé pour la vaccination d'un individu selon lequel une composition vaccinale qui répond aux définitions ci- dessus est administrée à l'individu, de préférence par injection, et à un procédé pour le traitement ou pour la prévention d'une infection par le VHC dans lequel une composition immunothérapeutiquement active répondant aux définitions ci-dessus est administrée à un individu.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide de l'invention, pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et ou spécifiques de l'infection par le VHC.
Dans la description qui suit, SEQ ID NO : 1 est aussi dénommée motif du clone 6 et SEQ JO NO :2 est aussi appelée motif du clone 16.
La figure 1 représente l'immunoréactivité des clones sélectionnés. En abscisse est représenté les numéros des clones sélectionnés parmi les clones listés dans le tableau 1 de l'exemple 1. En ordonnée est représentée à 492 nm la DO du clone - DO contrôle x 100. Les histogrammes représentent les résultats obtenus avec chaque clone sélectionné.
La figure 2 représente la reconnaissance des clones 6 et 16 par des anticorps anti-NS3. Les numéros des anticorps monoclonaux anti-NS3 sont donnés en abscisse et la DO x 1000 à 492 nm est représentée en ordonnée. Les histogrammes en gris foncé correspondent aux résultats obtenus avec le motif du clone 16 et les histogrammes en gris clair correspondent aux résultats obtenus avec le motif du clone
6.
La figure 3 représente la reconnaissance du motif du clone 6 par des sérums VHC positifs. Les sérums sont identifiés en abscisse et la DO à 492 nm
(DO(clone)-DO(TBS T) x 1000 est représentée en ordonnée.
La figure 4 représente la reconnaissance du motif du clone 6 par des sérums VHC positifs. Les sérums sont identifiés en abscisse et la DO à 492 nm
[DO(clone)-DO(TBS T)] x 1000 est représentée en ordonnée. La figure 5 représente la comparaison de la séquence de la protéine recombinante NS3 tronquée et les séquences des motifs des clones 6 et 16.
La figure 6 représente des expériences d'inhibition de la fixation de l'anticorps monoclonal 3B1C4 sur les clones 6 et 16 par des peptides synthétiques reproduisant la protéine tronquée NS3 de 93 acides aminés. Les peptides sont identifiés en abscisse et l'activité résiduelle (en pourcentage) est représentée en ordonnée. Les histogrammes en gris foncé représentent les résultats obtenus avec le motif du clone 6 et les résultats en gris foncé représentent les résultats obtenus avec le motif du clone 16. La figure 7 représente la reconnaissance des motifs des clones 6 et 16 sous forme MAP4 par des sérums humains VHC positifs. Les sérums humains sont identifiés en abscisse et la DO x 1000 à 492 nm est représentée en ordonnée. Les histogrammes en gris foncé représentent les résultats obtenus avec le motif du clone 6 et les résultats en gris foncé représentent les résultats obtenus avec le motif du clone 16.
Exemple 1 : Sélection de clones de phage codant pour un dodecapeptide réagissant spécifiquement avec un anticorps monoclonal anti-NS3.
Une banque de dodécapeptides exprimés à la surface d'un phage M13 (Ph.D.-12TM Phage display Peptide Library Kit , New England BioLabs Inc) a été criblée par l'anticorps monoclonal anti-NS3 3B1C4 (bioMérieux). Quatre sélections successives ont été effectuées avec des quantités décroissantes d'anticorps suivant les instructions du manuel d'utilisation de la banque fourni par New England BioLabs. Les phages de la quatrième sélection sont ensuite clones et 35 clones choisis de façon aléatoire sont amplifiés et leur ADN séquence. Les séquences protéiques déduites des séquences nucléotidiques des inserts ont permis d'identifier 26 motifs différents dont certains représentés plusieurs fois (voir tableau 1 ci-dessous). L'immunoréactivité des différents motifs exprimés à la surface des phages a été ensuite analysée par ELISA, selon le manuel de protocole, avec l'anticorps de sélection 3B1C4 et un anticorps monoclonal non pertinent anti-Borrelia burgdorferi OSPA utilisé comme contrôle négatif. Cent μl d'anticorps monoclonal 3B1C4 ou de l'anticorps antiOSPA utilisé comme contrôle négatif sont fixés à lOOμg/ml dans du NaHCO3 0,1M pendant une nuit à 4°C au fond de puits de plaques d'ELISA. La plaque est ensuite saturée pendant 2 heures à 4°C avec une solution de saturation selon les indications du fomnisseur. Après 4 lavages en tampon TBS-Tween 0,5%, lOOμl de TBS-Tween 0,5% contenant 1011 phages sont incubés pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Après 4 nouveaux lavages en TBS-Tween , lOOμl d'anticorps anti Ml 3 biotinylé (5 Prime 3 Prime Inc.) dilué au 1/500 sont ajoutés pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Quatre nouveaux lavages sont effectués avant d'ajouter lOOμl /puits de streptavidine conjugée à la peroxydase diluée au 1/10000 en solution de saturation. Après une heure d'incubation à 37°C la plaque est lavée quatre fois. La réaction colorimétrique est effectuée par ajout d'une solution d'ortho-phénylènediamine et de peroxyde d'hydrogène (kit colorEIA bioMérieux) pendant 10 min. à l'obscurité avant d'être stoppée avec 50μl d'acide sulfurique 1,8N. La densité optique est lue à 492 nm. Pour chaque clone les résultats sont exprimées par la moyenne des valeurs de triplicate obtenues avec 3B1C4 moins la moyenne des valeurs de triplicate obtenues avec l'anticorps contrôle anti-OSPA. Les résultats sont présentés à la figure 1. 17 motifs donnent un signal positif spécifique de 3B1C4 (figure 1). Cependant trois motifs (clones 6, 16 et 17) apparaissent beaucoup plus immunoréactifs que les autres. De plus ces motifs sont aussi reconnus par différents anticorps monoclonaux anti-NS3 (figure 2). Dans les résultats présentés dans la figure 2, chaque anticorps monoclonal anti-NS3 ainsi que l'anticorps contrôle négatif anti-OSPA ont été ajoutés au fond des puits de la plaque d'ELISA à la concentration finale de lOOμg/ml. La suite de l'immunoanalyse a été effectuée comme celle décrite pour la figure 1.
Ces anticorps ont été précédemment caractérisés pour entrer en compétition avec l'anticorps 3B1C4 et avec un pool de sérums humains pour sa fixation sur la protéine recombinante NS3 (acides aminés 1372-1464 de la polyprotéine). Les motifs des clones 6 et 16 étant plus fortement reconnus que le motif 17, les résultats obtenus suggèrent fortement que ces deux motifs miment un épitope immunodominant sur NS3. Tableau 1
Figure imgf000015_0001
Biop.4 signifie : 4 ème sélection Exemple 2 : Immunoréactivité des motifs phagiques vis à vis de sérums de patients VHC positifs.
Les clones de phage 6 et 16 ont été testés en ELIS A avec des sérums humains en fixant au fond des puits de plaques Nunc Maxisorb lOOμl d'une dilution au l/50ème de sérum dans du tampon NaHCO30,1M. Cent μl de sérmn dilué au l/50ème en NaHCO3 0,1M sont ajoutés au fond des puits de plaque d'ELISA et incubés pendant une nuit à 4°C, en chambre humide. La plaque est ensuite vidée et saturée pendant 2h à 4°C en solution de saturation. Après 4 lavages en TBS-Tween 0,5%, 3,3 x 10u phages dilués dans lOOμl de TBS-Tween sont ajoutés et incubés pendant 2 heures à température ambiante, sous agitation. La plaque est à nouveau lavée en TBS-Tween et lOOμl d'anticorps anti Ml 3 biotinylé (5 Prime 3 Prime Inc.) dilué au 1/500 sont ajoutés pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Quatre nouveaux lavages sont effectués avant d'ajouter lOOμl /puits de streptavidine conjuguée à la peroxydase diluée au 1/10000 en solution de saturation. Après une heure d'incubation à 37°C la plaque est lavée quatre fois . La réaction colorimétrique est effectuée par ajout d'une solution d'ortho-phénylènediamine et de peroxyde d'hydrogène (kit colorEIA bioMérieux) pendant 10 min à l'obscurité avant d'être stoppée avec 50μl d'acide sulfurique 1,8N. La densité optique est lue à 492 nm. Les résultats sont exprimés par la moyenne des valeurs de triplicate obtenues avec chaque sérum moins la moyenne de triplicate obtenues avec le tampon de dilution seul.
Les résultats obtenus avec 12 sérums de patients VHC positifs et 12 sérums d'individus sains montrent qu'avec le clone 6 tous les sérums VHC+ donnent un signal positif significativement supérieur à une valeur seuil correspondant à la moyenne des valeurs obtenues par les 12 sérums d'individus sains augmentée de 3 déviations standard (figure 3). L'immunoréactivité du clone 16 a été testée avec des sérums dilués au l/50eme comme décrit ci-dessus. Avec le clone 16, 11 sérums sur 12 sérmns VHC+ donnent une valeur supérieure à une valeur seuil calculée de la même façon (figure 4).
Exemple 3 : Localisation sur la protéine NS3 de l'épitope mimé par les motifs des clones phagiques 6 et 16
Les séquences d'acides aminés des motifs des clones 6
(WHRHWPSHPTQK) et 16 (AHKWYSQWLPHR) ont été comparées à la séquence de la protéine NS3 tronquée recombinante de 93 acides aminés (positionnement 1373- 1464 par rapport à la polyprotéine) en utilisant le logiciel Mac Vector, Ver. 4.5
(Kodack). Les régions présentant les meilleures similarités ont été détectées par alignement avec le programme Clustal. La figure 5 représente la localisation des similarités de séquences entre les motifs 6 (WHRHWPSHPTQK), 16 (AHKWYSQWLPHR) et les 40 premiers acides aminés de la protéine C33 tronquée de 93 acides aminés (1372-1464). La localisation des peptides G19L et I18G sur la séquence de C33 est indiquée par des flèches.
Ainsi que le montre la figure 5, 3 acides aminés du clone 6 sont identiques avec la séquence de NS3 (RH, 1389-1390 ; K1398) et 2 similaires avec SK1396-1397. Pour le clone 16, 2 acides aminés sont identiques avec Y1276 ; P1381 et 2 acides aminés sont similaires avec K1378 ; 11380. Des expériences d'inhibition de fixation de l'anticorps monoclonal 3B1C4 sur les clones 6 et 16 par des peptides synthétiques reproduisant la séquence de la protéine tronquée NS3 de 93 acides aminés montrent ont été réalisées. Cent μl d'anticorps monoclonal 3B1C4 à lOOμg/ml sont fixés pendant une nuit à 4°C au fond de puits de plaques d'ELISA. La plaque est ensuite saturée pendant 2 heures à 4°C avec m e solution de satmation selon les indications du fournisseur. Après 4 lavages en tampon TBS-Tween 0,5%, 50μl d'une solution de peptides à lOOμg/ml en TBS sont incubés 30min. à 37°C avant d'ajouter 50μl de TBS-Tween 0,5% contenant 2,5 x 1010 phages pendant 2 heures supplémentaires à température ambiante sous agitation. Après 4 nouveaux lavages en TBS-Tween , lOOμl d'anticorps anti Ml 3 biotinylé (5 Prime 3 Prime Inc.) dilué au 1/500 sont ajoutés pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Quatre nouveaux lavages sont effectués avant d'ajouter lOOμl /puits de streptavidine conjuguée à la peroxydase diluée au 1/10000 en solution de satmation. Après mie heure d'incubation à 37°C la plaque est lavée quatre fois . La réaction colorimétrique est effectuée par ajout d'une solution d'ortho-phénylènediamine et de peroxyde d'hydrogène (kit colorEIA bioMérieux) pendant 10 min. à l'obscurité avant d'être stoppée avec 50μl d'acide sulfurique 1,8N. La densité optique est lue à 492 nm.
Les résultats de la figure 6 montrent que seul le peptide de 20 acides aminés I18G (séquence 1392-1411) était capable d'inhiber la reconnaissance des clones 6 et 16 par l'anticorps 3B1C4. Le peptide de 21 acides aminés G19L (1371-1391) qui contient cependant entièrement la zone de similarité avec le clone 16 et 2 n'a aucun pouvoir inhibiteur sur la fixation de l'anticorps 3B1C4 sur les clones 6 et 16. Ces résultats confirment donc la localisation d'au moins une partie de l'épitope reconnu par l'anticorps 3B1C4 ainsi que les autres anticorps anti-NS3 et les sérums humains NS3 positifs se situe entre les acides aminés 1389 et 1399 de la séquence de la protéine NS3 et que le motif du clone 16 est un vrai mimotope puisqu'il ne contient aucun acide aminé identique ou similaire à cette région . Exemple 4 : Modélisation moléculaire de l'épitope.
La structure du domaine hélicase de la protéine NS3 du VHC a été déterminée par cristallographie par N Yao et al., 1997, Nature Struc. Biol. 4 : 463-467. La région 1393-1402 de NS3 correspond à une boucle parfaitement accessible pour m e interaction avec un anticorps. De plus des acides aminés identifiés sur le mimotope 6 comme étant identiques ou similaires à ceux de la séquence 1389-1398 (R1389; S1396 ; K1397 ; K1398) sont contigus s la structure 3-D de l'hélicase. Par ailleurs, R1389; K1397 ; K1398 font parties des acides aminés décrits par Yao et al. comme candidats pour favoriser une interaction électrostatique RNA-hélicace sm le second domaine de l'hélicase. La localisation de l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal 3B1C4 s la structme tridimensionnelle de la partie hélicase de la protéine NS3 correspond aux acides aminés suivants référencés également par leur positionnement par rapport à la protéine NS3 : Arg 18 : R1389 ; Ser25 : S 1396 ; Lys 26 : K 1397 ; Lys 27 : K1398 ; Lys28 : K 1399.
Exemple 5 : Immunoréactivité des peptides synthétiques reproduisant les mimotopes 6 et 16 vis à vis de sérums de patients VHC positifs.
Des sérums humains VHC positifs ainsi que les sérums d'individus sains dilués au l/50eme ont été testés avec les motifs 6 et 16 reproduits sous forme de peptides synthétiques branchés (MAP4) et fixés au fonds des puits de plaques d'ELISA à la concentration finale de lOμg/ml dans duNaHCO30,1M.
Reproduits sous forme de peptides synthétiques branchés (multiple antigen peptide MAP4), les mimotopes 6 et 16 sont significativement reconnus par tous sérums VHC positifs testés (figure 7).
S une série étendue à 52 sérums testés par RIBA (Recombinant ImmunoBlot Assay Chiron Corporation, Emeryville, CA) pour leur positivité par rapport à NS3, les motifs 6 et 16 sous forme de MAP4 (appelés MAP4-6 et MAP4-16 respectivement), sont détectés respectivement par 35 et 32 sérums. De plus la combinaison des réponses des sérums à ces 2 peptides permet de détecter mie réponse positive dans 40 sérums sm les 52 testés.
Les peptides MAP4-6 et MAP4-16 ont été aussi testés avec un panel de seroconversion (Boston Biomedica, Inc. Bridgewater, MA). Ainsi que le montre le tableau 2 suivant, ces peptides sont reconnus respectivement par 14 et 8 sérums s les 18 sérums testés. L'addition des deux réponses n'a pas d'effet cumulatif, cependant des réponses positives sont obtenues dans des sérums pom lesquels la quantité d'anticorps anti-NS3 n'est pas ou peu détectée par RIBA.
Les peptides sont testés par ELISA avec des sérums dilués au 1/50. Les réponses contre MAP4-6 et MAP4-16 sont indiquées par + ou - selon que les valeurs obtenues sont supérieures ou inférieures à mi seuil de reconnaissance défini par la moyenne des valeurs obtenues avec 12 sérums négatifs + 3 écarts-types.
Tableau 2
Figure imgf000019_0001
18 14 8
a La présence d'anticorps anti-NS3 est évaluée par RIBA selon les indications du fournisseur.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par le virus VHC et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, les séquences équivalentes de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 sélectionnées parmi les séquences conservant les propriétés immunoréactives de SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :2, et : présentant, par rapport à SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO :2, au moins une substitution d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, étant considérés comme équivalents les acides aminés retenus au sein d'un même groupe parmi les groupes suivants :
Groupe 1 : alanine, proline, glycine. Groupe 2 : acide aspartique, acide glutamique. Groupe 3 : histidine, lysine, arginine. Groupe 4 : asparagine, glutamine, serine, thréonine. Groupe 5 : phénylalanine, tyrosine, tryptophane.
Groupe 6 : isoleucine, leucine, valine, méthionine, et/ou structurellement modifiées.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 et les séquences équivalentes de SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2.
3. Réactif pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le virus VHC, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide tel que défini à la revendication 1 ou 2.
4. Réactif pom la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans i échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le virus VHC, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux polypeptides tels que définis à la revendication 1 ou 2.
5. Kit pom la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le virus VHC, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 3 ou 4.
6. Procédé pom la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le virus VHC qui comprend au moins les étapes suivantes : - mi mélange est préparé comprenant : (i) mi réactif tel que défini à la revendication 3 ou 4, qui est ou qui sera immobilisé sm une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant s'ils sont présents des anticorps anti-VHC, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec les anticorps anti-
VHC de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesmant le degré de marquage dans la phase solide.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le ligand marqué est choisi parmi la protéine NS3 ou un fragment de ladite protéine, un polypeptide de synthèse dont la séquence peptidique comprend ou consiste en la séquence de ladite protéine NS3 ou en un fragment de ladite protéine, un des polypeptides de la revendication 1 ou 2 et une anti-immunoglobuline.
8. Procédé pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans mi échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le virus VHC qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant : (i) un réactif tel que défini à la revendication 3 ou 4 qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si ils sont présents des anticorps anti-VHC,
(iii) des anticorps anti-VHC marqués qui seront capables de réagir avec le réactif ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
9. Procédé pom la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou de fragments desdits anticorps, selon lequel on injecte un agent immunogène consistant en au moins un polypeptide tel que défini à la revendication 1 ou 2, à un organisme mammifère choisi parmi une souris, un rat et un lapin, et on obtient les anticorps monoclonaux à partir de cultures d'hybridome obtenues à partir de l'animal ainsi immunisé, ou on prélève les anticorps polyclonaux dans le sérum de l'animal ainsi immunise.
10. Anticorps monoclonal ou polyclonal ou leurs fragments susceρtible(s) d'être obtenu(s) par le procédé de la revendication 9.
11. Réactif pom la détection d'une infection par le virus VHC qui comprend au moins mi anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou leurs fragments tel(s) que défini(s) dans la revendication 10.
12. Kit pom la détection d'une infection par le virus VHC qui comprend au moins un réactif tel que défini dans la revendication 11.
13. Procédé pom la détection et/ou la quantification de protéine NS3 dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le virus VHC qui comprend au moins les étapes suivantes :
- mi mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif qui consiste en au moins un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps monoclonal tel que défini dans la revendication 10, qui est ou qui sera immobilisé sm une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine NS3,
(iii) m ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine NS3 de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle de la protéine NS3 dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le ligand marqué est un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou un fragments desdits anticorps.
15. Procédé pour la détection et/ou la quantification de protéine NS3 dans mi échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le virus VHC qui comprend au moins les étapes suivantes : - un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif qui consiste an au moins un anticorps polyclonal ou un fragment dudit anticorps tel que défini dans la revendication 10, qui est ou qui sera immobilisé s une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine NS 3, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine NS3 de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et - la présence potentielle de la protéine NS3 dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel le ligand marqué est un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou le s fragments.
17. Procédé pour la détection et/ou la quantification de protéine NS3 dans mi échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le virus VHC qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) mi réactif qui consiste tel que défini dans la revendication 11 , qui est ou qui sera immobilisé sur mie phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine NS 3,
(iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec le réactif (i) et qui consiste en un polypeptide tel que défini à la revendication lou 2 ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ; - la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle de la protéine NS3 dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
18. Procédé pom la détection de la protéine NS3 dans un échantillon biologique comprenant au moins l'étape selon laquelle on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal marqué selon la revendication 10.
19. Composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend comme ingrédient actif au moins un polypeptide selon la revendication 1 ou 2, et éventuellement un support pour ledit polypeptide et/ou un excipient et/ou un adjuvant et/ou un diluent pharmaceutiquement acceptable.
20. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 1 ou 2, pom fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de l'infection par le VHC.
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