WO2002096929A2 - Polypeptides réagissant avec les anticorps de patients infectés par le vhc et utilisations - Google Patents

Polypeptides réagissant avec les anticorps de patients infectés par le vhc et utilisations Download PDF

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    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Hepatitis C is the main cause of transfusion-acquired hepatitis. Hepatitis C can also be transmitted by other percutaneous routes, for example by injecting drugs intravenously. The risk of contamination of health professionals is also not negligible.
  • Hepatitis C is distinguished from other forms of liver disease associated with viruses, such as hepatitis A, B or D.
  • Hepatitis C virus (HCV or HCV) infections are often chronic, resulting in liver diseases, such as hepatitis, cirrhosis and carcinoma in a large number of cases (5 to 20%).
  • HCV was the first hepatotropic virus isolated using molecular biology techniques. The viral genome sequences were cloned before the viral particle was visualized.
  • HCV Due to its genomic organization and its supposed mode of replication, HCV has recently been classified into a new genus in the family of Flaviviridae, the hepaciviruses.
  • the genus hepacivirus currently includes the hepatitis C and hepatitis G viruses (GBV-C and the GBV-A and GBV-B viruses).
  • GBV-C and the GBV-A and GBV-B viruses hepatitis G viruses
  • HCV is a 9.5 kb positive single-strand RNA viras which replicates with a copy of complementary RNA and whose translation product is a precursor of a single polyprotein of approximately 3,000 amino acids.
  • the 5 'end of the HCV genome corresponds to an untranslated region adjacent to the genes that code for structural proteins, the core protein of the nucleocapsid and the two envelope glycoproteins, E1 and E2.
  • the 5 'untranslated region and the core gene are relatively well conserved in the various genotypes.
  • Envelope proteins E1 and E2 are coded by more variable regions from one isolate to another.
  • the 3 'end of the HCV genome contains genes that code for non-structural proteins (NS2, NS3, NS4, NS5) and for a 3' non-coding region with a well conserved domain. Clinical studies have shown that antibodies specifically directed against conserved regions of the nucleocapsid appear early after infection with HCV.
  • a more advantageous alternative solution has been developed to the problem posed by the above antigens and mimotopes, by determining polypeptides more specific than said antigens and inducing a higher immune response than said mimotopes.
  • These polypeptides are sufficiently immunoreactive to be used routinely in diagnostic tests, said polypeptides being capable of reacting specifically with the antibodies of patients infected with the HCV virus.
  • the Applicant has shown that the polypeptides of the invention are capable of being recognized both by the mouse monoclonal antibody 19D9D6 and by individual human HCV positive sera.
  • polypeptides of the invention are mimotopes, that is to say polypeptides which are capable of functionally mimicking a binding site for a monoclonal antibody.
  • sequences of these mimotopes are by definition sequences which do not identify with a continuous linear native sequence or which do not appear in any way in the natural protein.
  • polypeptide of the invention capable of reacting specifically with the antibodies of patients infected with the HCV virus, must also meet at least one of the following definitions: - its peptide sequence comprises at least one sequence chosen from
  • Its peptide sequence consists of a sequence chosen from SEQ TD NO: 2 to SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 29, and the equivalent sequences from SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 29.
  • its peptide sequence comprises or consists of a sequence chosen from SEQ ID NO: 2 to SEQ TD NO: 6, SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 26 to SEQ TD NO: 29.
  • An equivalent sequence of a reference sequence is a sequence which retains the immunoreactive properties of this reference sequence, and which (a) has, with respect to this reference sequence, at least one substitution of an amino acid by an acid equivalent amine and / or (b) is structurally modified.
  • the equivalent sequences of any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 29 are sequences selected from the sequences which retain the immunoreactive properties of said sequence of reference chosen from SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 29 and which (a) have, compared to any one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO : 17 and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 29, at least one substitution of an amino acid with an equivalent amino acid and / or (b) are structurally modified.
  • Group 1 alanine, proline, glycine.
  • Group 2 aspartic acid, glutamic acid.
  • Group 3 histidine, lysine, arginine.
  • Group 4 asparagine, glutamine, serine, threonine.
  • Group 5 phenylalanine, tyrosine, tryptophan.
  • Group 6 isoleucine, leucine, valine, methionine.
  • a peptide sequence, known as structurally modified, is also considered equivalent to one of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 29 if, insofar as it retains the immunoreactive properties of said SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 29, it has, with respect to it, at least any of the following modifications: Replacement of one or more amino acids of the L series by an amino acid of the D series, and vice versa,
  • a peptide sequence with respect to a reference peptide sequence by its identity or its homology, expressed as a percentage, with said reference sequence. This percentage is determined, for a series of a given number of contiguous amino acids, by alignment of the two sequences, displacement of one relative to the other, and comparison of the amino acids in the two sequences.
  • the percentage of identity is determined from the number of amino acids which are identical to amino acids of the reference sequence, in the same position.
  • the percentage of homology is determined from the number of amino acids which are equivalent to amino acids of the reference sequence, in the same position.
  • polypeptide is meant a peptide, in the isolated state, having a sequence of a variable number of amino acids, such as an oligopeptide, a protein, a fusion protein, a fusion peptide, a peptide of synthesis.
  • a polypeptide can be obtained by various techniques well known to those skilled in the art, and in particular by chemical synthesis or by genetic recombination techniques.
  • polypeptides according to the invention can be obtained by conventional synthesis methods, for example with an automatic peptide synthesizer, or by genetic engineering techniques comprising the insertion of a DNA sequence coding for said polypeptide into a vector of expression such as a plasmid or a virus, and the transformation of cells with this expression vector and culture of these cells.
  • a polypeptide of the invention advantageously comprises at most 50 amino acids, preferably at most 30 amino acids, or better still at most 21 amino acids, or even at most 15 amino acids.
  • biological sample in particular blood, serum, plasma, primary hepatocyte cells, T lymphocytes, B lymphocytes, tissue extracts, in particular from the liver.
  • HCV is hepatotropic and it has been more recently shown that it is also lymphotropic.
  • the present invention also relates to a reagent for the detection and / or the quantification of anti-HCV antibodies in a biological sample taken from a patient infected with HCV which comprises at least one, advantageously at least two polypeptides of the invention as defined above, as well as a kit for the detection and / or quantification of anti-HCV antibodies in a biological sample taken from a patient infected or suspected of having been infected with the HCV virus which includes a reagent of the invention.
  • the invention also relates to several methods for the detection and / or the quantification of anti-HCV antibodies in a biological sample taken from a patient infected or likely to have been infected with the HCV viras which are described in more detail below. -Dessous.
  • the first process is a process called "sandwich" which can be carried out in one or more times and which comprises at least the following steps:
  • a mixture comprising: (i) a reagent as defined above, which is or will be immobilized on a solid phase, (ii) the sample to be tested and comprising, if anti-HCV antibodies are present, (iii) a labeled ligand which will be able to react with the anti-HCV antibodies in the sample;
  • the solid phase is separated from the liquid phase; and the potential presence of anti-HCV antibodies in the sample is revealed by measuring the degree of labeling in the solid phase.
  • the ligand is then either the Core protein or a fragment of said protein, or a synthetic polypeptide whose peptide sequence comprises or consists of the sequence of said Core protein or a fragment of said protein, or one of the polypeptides of the invention labeled in the case where the reagent included only one polypeptide of the invention immobilized on the solid phase, namely an anti-immunoglobulin.
  • the second method is called “competition testing” and includes at least the following steps:
  • a reagent as defined above which is or will be immobilized on a solid phase
  • the sample to be tested comprising, if present, anti-HCV antibodies,
  • labeled anti-HCV antibodies which will be able to react with the reagent; - the mixture is incubated for a predetermined time; the solid phase is separated from the liquid phase; and the potential presence of anti-HCV antibodies in the sample is revealed by measuring the degree of labeling in the solid phase.
  • polypeptides of the invention are immunogenic and are therefore used for the production of monoclonal or polyclonal antibodies or fragments of said antibodies by immunological reaction with an animal organism, preferably a mouse, a rat or a rabbit with an immunogenic agent which consists of a polypeptide of the invention as defined above.
  • antibody polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, transmembrane antibodies and humanized antibodies or fragments of said antibodies.
  • the production of polyclonal and monoclonal antibodies is part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (peptide KLH) as a support for immunization or to serum albumin (peptide SA).
  • the animals are injected with immunogen using complete Freund's adjuvant.
  • the sera and hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests.
  • the hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected.
  • Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice. Whatever the mode of production, by supernatant or ascites, the antibodies are then purified.
  • the purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A a sufficient number of antibodies are screened in functional tests to identify the best performing antibodies.
  • the in vitro production of antibodies, antibody fragments or antibody derivatives, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering is well known to those skilled in the art.
  • transmembrane antibody an antibody in which at least the functional region capable of recognizing and binding to its specific antigen is expressed on the surface of the target cells to allow said recognition and fixation. More particularly, the antibodies according to the present invention consist of fusion polypeptides comprising the amino acids defining said functional region and an amino acid sequence (transmembrane polypeptide) allowing anchoring within the double lipid membrane of the target cell. or on the external surface of this bi-layer.
  • the nucleic sequences encoding many transmembrane polypeptides are described in the literature.
  • humanized antibodies are chimeric antibodies which comprise a minimal sequence derived from a non-human immunoglobul.
  • humanized antibodies are human immunoglobulins (receptor antibodies) in which residues of a hypervariable region of the receptor are replaced by residues of a hypervariable region of a donor species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit or non-human primate, having the specificity, affinity and capacity desired.
  • donor antibody such as mouse, rat, rabbit or non-human primate
  • the residues (FR) of the Fv region of human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may include residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to improve the performance of the antibody.
  • the humanized antibody will comprise at least and preferably two variable domains, in which all or almost all of the hypervariable loops correspond to a non-human immunoglobulm and all or almost all of the FR regions will be those of an immunoglobulin. human.
  • the optionally humanized antibodies may also comprise at least part of a constant region (Fc) of an immunoglobulin, such as a human immunoglobulin (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al. , Nature 332: 323-329 (1988); and Presta et al., Curr. Op. Stract. Biol. 2: 593-596 (1992).
  • antibody fragment By antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', scFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immuriology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science 242: 423- 426) of a native antibody and by derivative is understood, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al., 1989, Nature 339: 394-397).
  • the invention therefore also relates to a reagent for the detection of an infection by the HCV virus which comprises at least one monoclonal antibody or a polyclonal antibody or their fragments as defined above and a kit comprising at least one such reagent, as well as the use of said monoclonal or polyclonal antibodies in several methods for the detection and / or quantification of the Core protein in a biological sample taken from a patient infected or likely to have been infected with the HCV.
  • the first two processes are called “sandwich” and are described in more detail below.
  • the first “sandwich” process of the invention comprises at least the following steps:
  • a reagent which consists of at least one monoclonal antibody or a fragment of monoclonal antibody as defined above, which is or will be immobilized on a solid phase, (ii) the sample to be tested and comprising if it is presents the Core protein, (iii) a labeled ligand which will be able to react with the Core protein of the sample;
  • the ligand is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or a fragment of said antibody.
  • the second “sandwich” process comprises at least the following steps: a mixture is prepared comprising: (i) a reagent which consists of at least one polyclonal antibody or a fragment of said antibody as defined above, which is or will be immobilized on a solid phase,
  • the ligand is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or their fragments.
  • the third method is a competitive method which includes at least the following steps:
  • a reagent which comprises at least one monoclonal antibody or a polyclonal antibody or fragments of said antibodies of the invention, which is or will be immobilized on a solid phase, (ii) the sample to be tested and comprising if it is present the Core protein, (iii) a labeled ligand which will be capable of reacting with the reagent (i) and which consists of a polypeptide of the invention as defined above; the mixture is incubated for a predetermined time; - the solid phase is separated from the liquid phase; and
  • Another method for detecting the Core protein in a biological sample comprises at least the following steps: - a tissue extract, for example from the liver, is biopsied from an individual suspected of having been infected with HCV, and brings said tissue extract into contact with at least one labeled monoclonal or polyclonal antibody of the invention.
  • a tissue extract for example from the liver
  • HCV monoclonal or polyclonal antibody of the invention.
  • the presence of HCV is demonstrated by direct immunofluorescence on the extract to be tested. Due to the immunogenic power of the polypeptides of the invention which induce a strong immune response, the latter can be used individually or in combination as active component (s) of the immune response.
  • an object of the invention is also an immunotherapeutically active composition, in particular a vaccine preparation, which comprises at least one polypeptide of the invention as active ingredient, and optionally a support for the said polypeptide (s) and / or an excipient. and / or a pharmaceutically acceptable adjuvant and / or diluent.
  • Such an immunotherapeutically active composition and in particular a prepared vaccine composition is injectable, that is to say in liquid solution or in suspension.
  • the preparation can also be emulsified.
  • the antigenic molecule that is to say the polypeptide or polypeptides of the invention, can be mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient or principle. Examples of favorable excipients are water, saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like and combinations thereof.
  • the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations.
  • the vaccine is administered conventionally by injection, for example intramuscularly.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is meant the supports and vehicles administered to humans or to an animal, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed., Mack Publishing Co.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength.
  • the definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
  • the amount of active ingredient depends on whether an adjuvant or not is added to the composition. Generally, it is between 10 and 50 ⁇ g / ml of active ingredient and usually 20 ⁇ g / 0.5 ml in adults and 10 ⁇ g / 0.5 ml in children are administered per dose.
  • the vaccine composition may further include proteins that promote the immune response.
  • the invention therefore also relates to a method for the vaccination of an individual according to which a vaccine composition which meets the above definitions is administered to the individual, preferably by injection, and to a method for the treatment or for preventing an HCV infection in which a an immunotherapeutically active composition as defined above is administered to an individual.
  • the invention relates to the use of a polypeptide of the invention, for fixing in a biological sample antibodies characteristic and / or specific of HCV infection.
  • FIG. 1 represents the immunoreactivity of the polypeptide of SEQ ID NO: 26 with negative sera, that is to say samples taken from patients not infected with HCV.
  • the abscissa shows the numbers of the sera of healthy individuals.
  • the OD x 1000 is represented, at 492 nm.
  • the histograms represent the results obtained with each serum.
  • FIG. 2 represents the immunoreactivity of the polypeptide of SEQ ID NO: 13 with a pool of negative sera taken from healthy patients [pool (-)] and positive sera (p and h series) taken from patients infected with HCV .
  • the abscissa shows the numbers of the sera of healthy individuals.
  • the OD x 1000 is represented, at 492 nm.
  • the histograms represent the results obtained with each serum or pool of sera.
  • FIG. 3 represents the immunoreactivity of the polypeptide of SEQ ID NO: 6 with a pool of negative sera taken from healthy patients [pool (-)] and positive sera (p and h series) taken from patients infected with HCV .
  • the abscissa shows the numbers of the sera of healthy individuals.
  • the OD x 1000 is represented, at 492 nm.
  • the histograms represent the results obtained with each serum or pool of sera.
  • FIG. 4 represents the immunoreactivity of the polypeptide of SEQ ID NO: 6 with a pool of negative sera taken from healthy patients [pool (-)] and positive sera (p and h series) taken from patients infected with HCV .
  • the abscissa shows the numbers of the sera of healthy individuals.
  • the OD x 1000 is represented, at 492 nm.
  • the histograms represent the results obtained with each serum or pool of sera.
  • FIG. 4 represents the immunoreactivity of the polypeptide of
  • SEQ ID NO: 26 with a pool of negative sera collected from healthy patients [pool (-)] and positive sera (p and h series) collected from patients infected with HCV.
  • the abscissa shows the numbers of the sera of healthy individuals.
  • the OD x 1000 is represented, at 492 nm.
  • the histograms represent the results obtained with each serum or pool of sera.
  • FIG. 5 represents the immunoreactivity of the polypeptide of SEQ ID NO: 11 with a pool of negative sera collected from healthy patients [pool (-)] and positive sera (p and h series) collected from patients infected with HCV .
  • the abscissa shows the numbers of the sera of healthy individuals.
  • the OD x 1000 is represented, at 492 nm.
  • the histograms represent the results obtained with each serum or pool of sera.
  • FIG. 6 represents the immunoreactivity of the polypeptide of SEQ ID NO: 13 with a pool of negative sera taken from healthy patients [T (-)] and positive sera (p and h series) taken from patients infected with HCV .
  • the abscissa shows the numbers of the sera of healthy individuals.
  • the OD x 1000 is represented, at 492 nm.
  • the polypeptide is tested in three forms: in biotinylated form at the C-terminal end (peptide B), with a polylysine tail in the C-terminal position (KKK) and in the form of peptides branched four times (MAP4).
  • the histograms represent the results obtained with each serum or pool of sera.
  • the histograms in white correspond to peptide B
  • the histograms in gray correspond to peptide KKK
  • the histograms in black correspond to peptide MAP4.
  • Example 1 Selection of new folding clones encoding a dodecapeptide reacting specifically with the monoclonal anti-HCV core 19D9D6 antibody.
  • a bank of dodecapeptides expressed on the surface of a phage Ml 3 (Ph.D.-12TM Phage display Peptide Library Kit, New England BioLabs hic) was screened by the mouse monoclonal antibody 19D9D6.
  • This antibody specifically recognizes a conformational epitope of the Core protein.
  • Four successive selections were made with decreasing amounts of 19D9D6 antibody according to the instructions in the bank user manual provided by New England BioLabs.
  • the phages of the fourth selection are then cloned e; 14 clones chosen at random are amplified and their DNA sequenced.
  • two phage clones were selected, of sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 respectively, which were significantly recognized by the antibody 19D9D6 and by a pool of human sera.
  • the results are expressed by the average optical density of the values of triplicates obtained with the monoclonal antibody 19D9D6 against 2.5 x 10 10 phages minus the average optical density of triplicates obtained with the anti-Borrelia burgorferi OSPA control antibody same number of phages.
  • the results are expressed by the average optical density of the values of triplicates obtained with a pool of 10 human sera HCV positive against 2.5 ⁇ 10 10 phages minus the average optical density of triplicates obtained with a pool of 10 sera negative against the same number of phages.
  • Example 2 Optimization of the sequences recognized by the antibody 19D9D6.
  • the motifs selected for their immunoreactivity with the antibody 19D9D6 and the pool of human sera positive for the Core protein were synthesized on nitrocellulose membrane according to the method previously described (C. Jolivet-Reynaud et al., 1998, J. Med. Virol. 56: 300-309).
  • the sequence corresponding to the selected motif elongated in N and C terminal of the 2 flanking sequences of the PIII protein was reproduced in the form of overlapping dodecapeptides of an amino acid.
  • the immunoreactivity of the peptides synthesized on a nitrocellulose membrane was analyzed by an immunoenzymatic test with the antibody 19D9D6 diluted to the final concentration of 50 ⁇ g / ml. After development of the colorimetric reaction with 5-bromo-4-chloro-3-indoyl- ⁇ -d-galactopyranoside and potassium ferricyanide, the spots corresponding to the immunoreactive polypeptides produce a blue color whose relative intensity is evaluated on a scale ranging from 0 to 5. The results are collated in Tables 2 to 5 below. Table 2 The amino acids corresponding to the random peptide inserted into protein III of the phage (HKHAHNYRLPFS) are indicated in bold.
  • the antibody 19D9D6 does not recognize the dodecapeptides corresponding to the HKHAHNYRLPFS (Table 2) and GNAKQIVTTKST (SEQ ID NO: 1) motifs (Table 3) alone.
  • immunoreactivity maximum is obtained by the dodecapeptides of SEQ ID NOs: 6 and 11 also comprising 5 amino acids of protein III located upstream of the motifs.
  • the immunoreactivity of the GHIHSMR motif of the dodecapeptide of SEQ ID NO: 18 is increased by the addition of the sequence FYSHS (cf. table 4 above) and the immunoreactivity of the LNWPQIGSRMT motif of the dodecapeptide SEQ ID NO: 27 is increased by the supply of at least one serine in terminal NH 2 in accordance with the result obtained for the dodecapeptide of SEQ ID NO26 presented in table 5 above.
  • Example 3 Immunoreactivity of biotinylated synthetic peptides with respect to sera from HCV positive patients.
  • the immunoreactive sequences with respect to the antibody 19D9D6 and defined in Example 2 were reproduced in the form of synthetic peptides biotinylated in the C-terminal position. Initially, the biotinylated peptides were tested against
  • the mimotopes synthesized with a polylysine tail in the C-terminal position and in the form of peptides branched 4 times give a greatly increased response and also increases the specificity of recognition.
  • the mimotope FYSHSGHIHSMR SEQ ID NO 13
  • FYSHSGHIHSMR biotinylated peptide
  • polypeptides of the invention presented advantageously will be used via a poly-lysine (poly-K) tail or in the form of branched peptides for example in MAP4 form (cf. Lu YA, Clavijo P, Galantino M, Shen ZY, Liu W, Tarn JP. Chemically unambiguous peptide immunogen: preparation, orientation and antigenicity of purified peptide conjugated to the multiple antigen peptide system: Molecular Immunology (1991) vol. 28, No. 6, 623-630).
  • MAP4-coreB were tested on a series extended to 52 sera from HCV infected patients whose positivity with respect to Core was determined by RIBA (Recombinant ImmunoBlot Assay Chiron Corporation, Emeryville, CA). In this series, MAP4- coreA and MAP4-coreB are recognized by 34 and 35 sera respectively. The combination of the responses of the sera to these 2 peptides has no cumulative effect.
  • MAP4-CoreA and MAP4-CoreB peptides were also tested with a seroconversion panel (Boston Biomedica, Inc. Bridgewater, MA). As shown in the following table, the MAP4-CoreB peptide is not recognized by any of the 18 sera tested, but an anti-core response is detected in 16 sera using MAP4-CoreA. In addition, it should be noted that positive responses are obtained in sera for which the amount of anti-core antibody is not yet detected by RJJ3A.
  • the peptides are tested by ELISA with sera diluted 1/50.
  • the responses against MAP4-CoreA and MAP4-CoreB are indicated by + or - depending on whether the values obtained are higher or lower than a recognition threshold defined by the average of the values obtained with 12 negative sera + 3 standard deviations.
  • a recognition threshold defined by the average of the values obtained with 12 negative sera + 3 standard deviations.

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Abstract

L'invention concerne un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par levirus VHC et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 2 ô SEQ ID NO: 17 et SEQ ID NO: 19 ô SEQ ID NO: 29, et leurs séquences équivalentes. L'invention concerne aussi l'utilisation de ce polypeptide pour la détection et la quantification d'anticorps anti-VHC ou de protéine Core, dans un échantillon biologique, et pour l'obtention d'anticorps.

Description

POLYPEPTIDES REAGISSANT AVEC LES ANTICORPS DE PATIENTS INFECTES PAR LE VHC ET UTILISATIONS
L'hépatite C est la cause principale des hépatites acquises par transfusion. L'hépatite C peut également être transmise par d'autres voies percutanées, par exemple par injection de drogues par voie intraveineuse. Le risque de contamination des professionnels de la santé n'est par ailleurs pas négligeable.
L'hépatite C se distingue des autres formes de maladies du foie associées à des virus, telles que les hépatites A, B ou D. Les infections par le virus de l'hépatite C (VHC ou HCV) sont souvent chroniques avec pour résultante des maladies du foie, telles que hépatite, cirrhose et carcinome dans un grand nombre de cas (5 à 20%).
Bien que le risque de transmission du virus par transfusion ait diminué du fait de la mise en place de tests de criblage dans les années 1990, la fréquence des hépatites C reste élevée. A titre d'exemple, une étude récente indique qu'il y aurait encore aujourd'hui 15 000 nouveaux cas d'infection par an en France (S. Deuffic et al., Hepatology 1999 ; 29 : 1596-1601). Actuellement, environ 170 millions de personnes à travers le monde sont infectées de manière chronique par le VHC. Les populations à risque élevé sont principalement le personnel hospitalier et les utilisateurs de drogues intraveineuses, mais il existe des donneurs de sang asymptomatiques qui n'appartiennent pas à ces groupes à risque élevé et chez lesquels des anticorps anti- VHC circulants ont été retrouvés. Pour ces derniers, la voie de l'infection n'a encore pas été identifiée.
Le VHC a été le premier virus hépatotrope isolé au moyen des techniques de biologie moléculaire. Les séquences du génome viral ont été clonées avant que la particule virale ait été visualisée.
Du fait de son organisation génomique et de son mode présumé de réplication, le VHC a été classifié récemment dans un nouveau genre de la famille des Flaviviridae, les hepacivirus. Le genre hepacivirus regroupe actuellement les virus de l'hépatite C et de l'hépatite G (GBV-C et les virus GBV-A et GBV-B). Le VHC est un viras à ARN simple brin positif, de 9,5 kb, qui se réplique par une copie d'ARN complémentaire et dont le produit de la traduction est un précurseur d'une polyprotéine unique d'environ 3 000 acides aminés. L'extrémité 5' du génome du VHC correspond à une région non traduite adjacente aux gènes qui codent pour les protéines structurales, la protéine core de la nucléocapside et les deux glycoprotéines d'enveloppe, El et E2. La région non traduite 5' et le gène core sont relativement bien conservés dans les différents génotypes. Les protéines d'enveloppe El et E2 sont codées par des régions plus variables d'un isolât à un autre. L'extrémité 3' du génome du VHC contient les gènes qui codent pour les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4, NS5) et pour une région 3' non codante possédant un domaine bien conservé. Des études cliniques ont montré que des anticorps spécifiquement dirigés contre les régions conservées de la nucléocapside apparaissent précocement après infection par le VHC. D'autres études ont par ailleurs mis en évidence l'existence de plusieurs antigènes immunodominants qui constituent de bons marqueurs pour la réalisation de tests diagnostiques des infections à VHC. Dans la recherche de polypeptides plus spécifiques, la Demanderesse a apporté une solution qui fait l'objet du document WO-A-00/31130, en déterminant des polypeptides dits mimotopes à même de se substituer aux antigènes précités.
Selon la présente invention, on a mis au point une solution alternative plus avantageuse au problème posé par les antigènes et mimotopes ci-dessus, en déterminant des polypeptides plus spécifiques que lesdits antigènes et induisant une réponse immunitaire plus élevée que lesdits mimotopes. Ces polypeptides sont suffisamment immunoréactifs pour être utilisés de manière courante dans des tests de diagnostic, lesdits polypeptides étant capables de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par le virus VHC. En effet, la Demanderesse a montré que les polypeptides de l'invention étaient capables d'être reconnus à la fois par l'anticorps monoclonal de souris 19D9D6 et par des sérums humains individuels VHC positifs.
Les polypeptides de l'invention sont des mimotopes, c'est à dire des polypeptides qui sont capables de mimer fonctionnellement un site de liaison pour un anticorps monoclonal. Les séquences de ces mimotopes sont par définition des séquences qui ne s'identifient pas à une séquence native linéaire continue ou qui n'apparaissent pas de quelle que manière que ce soit dans la protéine naturelle.
Le polypeptide de l'invention, capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par le virus VHC, doit en outre répondre à au moins une des définitions suivantes : - sa séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi
SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29, et les séquences équivalentes de SEQ ID NO :2 à SEQ ID NO :17 et SEQ TD NO : 19 à SEQ ID NO: 29, ou
- sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ TD NO: 2 à SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29, et les séquences équivalentes de SEQ ID NO :2 à SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29. De préférence, sa séquence peptidique comprend ou consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :2 à SEQ TD NO :6, SEQ ID NO :9 à SEQ ID NO :14 et SEQ ID NO :26 à SEQ TD NO :29.
Une séquence équivalente d'une séquence de référence est une séquence qui conserve les propriétés immunoréactives de cette séquence de référence, et qui (a) présente, par rapport à cette séquence de référence, au moins une substitution d'un acide aminé par un acide aminé équivalent et/ou (b) est structurellement modifiée.
Ainsi, les séquences équivalentes de l'une quelconque des SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 19 à SEQ ID NO: 29 sont des séquences sélectionnées parmi les séquences qui conservent les propriétés immunoréactives de ladite séquence de référence choisie parmi SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29 et qui (a) présentent, par rapport à l'une quelconque des SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29, au moins une substitution d'un acide aminé par un acide aminé équivalent et/ou (b) sont structurellement modifiées.
Sont considérés comme équivalents, des acides aminés appartenant au même groupe, parmi les six groupes suivants :
Groupe 1 : alanine, proline, glycine.
Groupe 2 : acide aspartique, acide glutamique. Groupe 3 : histidine, lysine, arginine.
Groupe 4 : asparagine, glutamine, serine, thréonine.
Groupe 5 : phénylalanine, tyrosine, tryptophane.
Groupe 6 : isoleucine, leucine, valine, méthionine.
Cette équivalence a été déterminée à partir des informations contenues dans l'article de Kramer A. et al. (Molecular Immunology, Vol. 32, N°7, pp. 459-465 (1995)). Ces auteurs ont constitué des banques dans lesquelles pour réduire le problème de l'explosion combinatoire du nombre de molécules, ils ont utilisé des groupes d'acides aminés constitués d'acides aminés ayant des propriétés physico-chimiques similaires et les acides aminés regroupés dans chacun de ces six groupes, listés ci- dessus, sont considérés comme équivalents dans la présente invention.
Une séquence peptidique, dite structurellement modifiée, est aussi considérée comme équivalente de l'une des SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29 si, dans la mesure où elle conserve les propriétés immunoréactives de ladite SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 19 à SEQ ID NO: 29, elle présente, par rapport à celle-ci, au moins l'une quelconque des modifications suivantes : Remplacement d'un ou plusieurs acides aminés de la série L par un acide aminé de la série D, et vice- versa,
Introduction d'une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions aminés, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques,
Modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.
Il est aussi possible de définir l'équivalence d'une séquence peptidique par rapport à une séquence peptidique de référence par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. Le pourcentage d'homologie est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position.
Avant d'exposer l'invention plus en détails, on définit ci-après différents termes employés dans la description et les revendications. Par « polypeptide », on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules. Un polypeptide de l'invention comporte avantageusement au plus 50 acides aminés, préférentiellement au plus 30 acides aminés, ou mieux encore au plus 21 acides aminés, voire au plus 15 acides aminés.
Par « échantillon biologique », on entend notamment le sang, le sérum, le plasma, les cellules d'hépatocytes primaires, les lymphocytes T, les lymphocytes B, des extraits tissulaires, en particulier de foie. En effet, il est connu que le VHC est hépatotrope et il a été plus récemment montré qu'il était également lymphotrope. Outre les polypeptides définis ci-dessus, la présente invention concerne également un réactif pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le VHC qui comprend au moins un, avantageusement au moins deux polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus, ainsi qu'un kit pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou suspecté avoir été infecté par le virus VHC qui comprend un réactif de l'invention.
L'invention se rapporte également à plusieurs procédés pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou susceptible d'avoir été infecté par le viras VHC qui sont décrits plus en détail ci-dessous.
Le premier procédé est un procédé dénommé « sandwich » qui peut être réalisé en une ou plusieurs fois et qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant : (i) un réactif tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant s'ils sont présents des anticorps anti-VHC, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec les anticorps anti- VHC de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide. Le ligand est alors soit la protéine Core ou un fragment de ladite protéine, soit un polypeptide de synthèse dont la séquence peptidique comprend ou consiste en la séquence de ladite protéine Core ou en un fragment de ladite protéine, soit un des polypeptides de l'invention marqué dans le cas où le réactif ne comprenait qu'un seul polypeptide de l'invention immobilisé sur la phase solide, soit une anti- immunoglobuline.
Le deuxième procédé est dénommé « test par compétition » et comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant s'ils sont présents des anticorps anti-VHC, (iii) des anticorps anti-VHC marqués qui seront capables de réagir avec le réactif ; - le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ; la phase solide est séparée de la phase liquide ; et la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide. Les polypeptides de l'invention sont immunogènes et sont donc utilisés pour la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou de fragments desdits anticorps par réaction immunologique avec un organisme animal, de préférence une souris un rat ou un lapin à un agent immunogène qui consiste en un polypeptide de l'invention tel que défini précédemment.
Par anticorps, on entend les anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux, les anticorps transmembranaires et les anticorps humanisés ou des fragments desdits anticorps. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kohler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefmed specificity, Nature 256 :495-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli
G.F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry,
Vol. 13, pp. 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l'immunogène peut être couplé à de l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA). Les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quel que soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier. Par anticorps transmembranaire, on entend un anticorps dont au moins la région fonctionnelle capable de reconnaître et de se fixer à son antigène spécifique est exprimée à la surface des cellules cibles pour permettre lesdites reconnaissance et fixation. Plus particulièrement, les anticorps selon la présente invention consistent en des polypeptides de fusion comprenant les amino acides définissant ladite région fonctionnelle et une séquence d' amino acides (polypeptide transmembranaire) permettant l'ancrage au sein de la double couche lipidique membranaire de la cellule cible ou à la surface externe de cette bi-couche. Les séquences nucléiques codant pour de nombreux polypeptides transmembranaires sont décrites dans la littérature.
Les formes " humanisées " d'anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d'une immunoglobulme non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l'immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains. De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobulme non humaine et tout ou à peu près tout des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine (Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1986) ; Reichmann et al., Nature 332 : 323-329 (1988) ; et Presta et al., Curr. Op. Stract. Biol. 2 : 593-596 (1992).
Par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab', scFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immuriology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394-397).
L'invention se rapporte donc aussi à un réactif pour la détection d'une infection par le virus VHC qui comprend au moins un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou leurs fragments tel(s) que défini(s) ci-dessus et un kit comprenant au moins un tel réactif, ainsi que l'utilisation desdits anticorps monoclonaux ou polyclonaux dans plusieurs procédés pour la détection et/ou la quantification de la protéine Core dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou susceptible d'avoir été infecté par le VHC. Les deux premiers procédés sont dénommés « sandwich » et sont décrit plus en détail ci-dessous. Il convient par ailleurs de noter que dans certains cas dans lesquels la protéine Core circulante dans le plasma ou le sérum n'est pas en quantité suffisante pour permettre un test de détection suffisamment sensible il est possible de prétraiter un échantillon biologique pour lyser les cellules ou dissocier les complexes et libérer la protéine.
Le premier procédé « sandwich » de l'invention comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif qui consiste en au moins un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps monoclonal tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine Core, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine Core de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et la présence potentielle de la protéine Core dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide. Le ligand est un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou un fragments desdits anticorps.
Le deuxième procédé « sandwich » comprend au moins les étapes suivantes : un mélange est préparé comprenant : (i) un réactif qui consiste en au moins un anticorps polyclonal ou un fragment dudit anticorps tel que défini précédemment, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide,
(ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine Core,
(iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine Core de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et - la présence potentielle de la protéine Core dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide. Le ligand est un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou leurs fragments.
Le troisième procédé est un procédé par compétition qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif qui comprend au moins un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou des fragments desdits anticorps de l'invention , qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine Core, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec le réactif (i) et qui consiste en un polypeptide de l'invention tel que défini précédemment ; le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ; - la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle de la protéine Core dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
Un autre procédé pour la mise en évidence de la protéine Core dans un échantillon biologique comprend au moins les étapes suivantes : - on prélève chez un individu suspecté avoir été infecté par le VHC un extrait tissulaire, par exemple de foie, par biopsie, et on met en contact ledit extrait tissulaire avec au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal marqué de l'invention. Généralement, la présence du VHC est mise en évidence par immunofluorescence directe sur l' extrait à tester. En raison du pouvoir immunogène des polypeptides de l'invention qui induisent une forte réponse immune ces derniers sont utilisables individuellement ou en combinaison comme composant(s) actif(s) de la réponse immune. Donc un objet de l'invention est également une composition immunothérapeutiquement active, notamment une préparation vaccinale, qui comprend au moins un polypeptide de l'invention comme ingrédient actif, et éventuellement un support pour le ou lesdits polypeptide(s) et/ou un excipient et/ou un adjuvant et/ou un diluant pharmaceutiquement acceptable.
Une telle composition immunothérapeutiquement active et en particulier une composition vaccinale préparée est injectable, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique, c'est à dire le ou les polypeptides de l'invention, peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient ou principe actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifiants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxyde d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations. Le vaccin est administré conventionnellement par injection, par exemple intramusculaire.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » on entend les supports et véhicules administrâmes à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16th éd., Mack Publishing Co. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington's Pharmaceutical Sciences précité.
La quantité d'ingrédient actif est fonction du fait qu'un adjuvant ou non est ajouté à la composition. Généralement, elle est comprise entre 10 et 50 μg/ml d'ingrédient actif et usuellement de 20 μg/0,5 ml chez les adultes et de 10 μg/0,5 ml chez les enfants sont administrés par dose. La composition vaccinale peut de plus comprendre des protéines qui favorisent la réponse immunitaire.
L'invention se rapporte donc également à un procédé pour la vaccination d'un individu selon lequel une composition vaccinale qui répond aux définitions ci- dessus est administrée à l'individu, de préférence par injection, et à un procédé pour le traitement ou pour la prévention d'une infection par le VHC dans lequel une composition immunothérapeutiquement active répondant aux définitions ci-dessus est administrée à un individu.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide de l'invention, pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de l'infection par le VHC.
Les caractéristiques et avantages des objets de l'invention sont ci-après mis en évidence dans les exemples suivants et à l'appui des figures 1 à 6.
La figure 1 représente l'immunoréactivité du polypeptide de SEQ ID NO :26 avec des sérums négatifs c'est-à-dire prélevés sur des patients non infectés par le VHC. En abscisse, sont représentés les numéros des sérums des individus sains. En ordonnée, est représentée la DO x 1000, à 492 nm. Les histogrammes représentent les résultats obtenus avec chaque sérum.
La figure 2 représente l'immunoréactivité du polypeptide de SEQ ID NO : 13 avec un pool de sérums négatifs prélevés sur des patients sains [pool (-)] et des sérums positifs (séries p et h) prélevés sur des patients infectés par le VHC. En abscisse, sont représentés les numéros des sérums des individus sains. En ordonnée, est représentée la DO x 1000, à 492 nm. Les histogrammes représentent les résultats obtenus avec chaque sérum ou pool de sérums.
La figure 3 représente l'immunoréactivité du polypeptide de SEQ ID NO :6 avec un pool de sérums négatifs prélevés sur des patients sains [pool (-)] et des sérums positifs (séries p et h) prélevés sur des patients infectés par le VHC. En abscisse, sont représentés les numéros des sérums des individus sains. En ordonnée, est représentée la DO x 1000, à 492 nm. Les histogrammes représentent les résultats obtenus avec chaque sérum ou pool de sérums. La figure 4 représente l'immunoréactivité du polypeptide de
SEQ ID NO :26 avec un pool de sérums négatifs prélevés sur des patients sains [pool (-)] et des sérums positifs (séries p et h) prélevés sur des patients infectés par le VHC. En abscisse, sont représentés les numéros des sérums des individus sains. En ordonnée, est représentée la DO x 1000, à 492 nm. Les histogrammes représentent les résultats obtenus avec chaque sérum ou pool de sérums.
La figure 5 représente l'immunoréactivité du polypeptide de SEQ ID NO :11 avec un pool de sérums négatifs prélevés sur des patients sains [pool (-)] et des sérums positifs (séries p et h) prélevés sur des patients infectés par le VHC. En abscisse, sont représentés les numéros des sérums des individus sains. En ordonnée, est représentée la DO x 1000, à 492 nm. Les histogrammes représentent les résultats obtenus avec chaque sérum ou pool de sérums. La figure 6 représente l'immunoréactivité du polypeptide de SEQ ID NO :13 avec un pool de sérums négatifs prélevés sur des patients sains [T (-)] et des sérums positifs (séries p et h) prélevés sur des patients infectés par le VHC. En abscisse, sont représentés les numéros des sérums des individus sains. En ordonnée, est représentée la DO x 1000, à 492 nm. Le polypeptide est testé sous trois formes : sous forme biotinylée à l'extrémité C-terminale (peptide B), avec une queue polylysine en position C-terminale (KKK) et sous forme de peptides branchés quatre fois (MAP4). Les histogrammes représentent les résultats obtenus avec chaque sérum ou pool de sérums. Les histogrammes en blanc correspondent au peptide B, les histogrammes en gris correspondent au peptide KKK et les histogrammes en noir correspondent au peptide MAP4.
Exemple 1 : Sélection de nouveaux clones de pliage codant pour un dodecapeptide réagissant spécifiquement avec l'anticorps monoclonal anti-VHC core 19D9D6.
Une banque de dodécapeptides exprimés à la surface d'un phage Ml 3 (Ph.D.-12TM Phage display Peptide Library Kit , New England BioLabs hic) a été criblée par l'anticorps monoclonal de souris 19D9D6. Cet anticorps reconnaît spécifiquement un épitope conformationnel de la protéine Core. Quatre sélections successives ont été effectuées avec des quantités décroissantes d'anticorps 19D9D6 suivant les instructions du manuel d'utilisation de la banque fourni par New England BioLabs. Les phages de la quatrième sélection sont ensuite clones e ; 14 clones choisis de façon aléatoire sont amplifiés et leur ADN séquence. Parmi ceux-ci, on a sélectionné deux clones phagiques, respectivement de séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :2, qui ont été significativement reconnus par l'anticorps 19D9D6 et par un pool de sérums humains.
L'immunoréactivité des clones phagiques a été testée selon les indications fournies dans le manuel d'utilisation de la banque de dodécapeptides. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1
Séquence du clone Nombre de DO 19D9D6 DO Ser clones
DO anti-OSPA DO Ser"
SEQ TD NO :1 1/14 0,835a 0,345B SEQ TD NO :2 1/14 0,647 0,320
a) les résultats sont exprimés par la densité optique moyenne des valeurs de triplicates obtenus avec l'anticorps monoclonal 19D9D6 contre 2,5 x 1010 phages moins la densité optique moyenne de triplicates obtenus avec l'anticorps contrôle anti- Borrelia burgorferi OSPA contre le même nombre de phages. b) les résultats sont exprimés par la densité optique moyenne des valeurs de triplicates obtenus avec un pool de 10 sérums humains VHC positifs contre 2,5 x 1010 phages moins la densité optique moyenne de triplicates obtenus avec un pool de 10 sérums négatifs contre le même nombre de phages.
Exemple 2 : Optimisation des séquences reconnues par l'anticorps 19D9D6. Dans le but de déterminer les acides aminés responsables de l'interaction des clones phagiques avec l'anticorps monoclonal 19D9D6, les motifs sélectionnés pour leur immunoréactivité avec l'anticorps 19D9D6 et le pool de sérums humains positifs pour la protéine Core, ont été synthétisés sur membrane de nitrocellulose selon la méthode précédemment décrite (C. Jolivet-Reynaud et al., 1998, J. Med. Virol. 56 : 300-309). Pour cela la séquence correspondant au motif sélectionné allongée en N et C terminal des 2 séquences flanquantes de la protéine PIII a été reproduite sous forme de dodécapeptides chevauchants d'un acide aminé.
L'immunoréactivité des peptides synthétisés sur membrane de nitrocellulose a été analysée par un test immunoenzymatique avec l'anticorps 19D9D6 dilué à la concentration finale de 50 μg/ml. Après développement de la réaction colorimétrique avec du 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-d-galactopyranoside et du ferricyanure de potassium, les spots correspondant aux polypeptides immunoréactifs produisent une couleur bleue dont l'intensité relative est évaluée sur une échelle allant de 0 à 5. Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 2 à 5 suivants. Tableau 2 Les acides aminés correspondant au peptide aléatoire inséré dans la protéine III du phage (HKHAHNYRLPFS) sont indiqués en gras.
Figure imgf000015_0001
Tableau 3 Les acides aminés correspondant au peptide aléatoire inséré dans la protéine III (GNAKQIVTTKST) du phage sont indiqués en gras.
Figure imgf000015_0002
Ainsi que le montrent ces tableaux, l'anticorps 19D9D6 ne reconnaît pas les dodécapeptides correspondant aux motifs HKHAHNYRLPFS (tableau 2) et GNAKQIVTTKST (SEQ ID NO :1) (tableau 3) seuls. Cependant une immunoréactivité maximale est obtenu par les dodécapeptides de SEQ ID NOs :6 et 11 comprenant aussi 5 acides aminés de la protéine III située en amont des motifs.
Tableau 4 Les acides aminés correspondant au peptide aléatoire inséré dans la protéine III du phage (GHIHSMRHHRPT, SEQ ID NO :18) sont indiqués en gras.
Figure imgf000016_0001
Tableau 5 Les acides aminés correspondant au peptide aléatoire inséré dans la protéine III du phage (LNWPQIGSRMTP, SEQ IDS NO :27) sont indiqués en gras.
Figure imgf000017_0001
L'immunoréactivité du motif GHIHSMR du dodécapeptide de SEQ ID NO :18 est augmentée par l'ajout de la séquence FYSHS (cf. tableau 4 ci-dessus) et l'immunoréactivité du motif LNWPQIGSRMT du dodécapeptide SEQ ID NO :27 est augmentée par l'apport d'au moins une serine en NH2 terminal conformément au résultat obtenu pour le dodécapeptide de SEQ ID NO26 présenté dans le tableau 5 ci- dessus. Ces résultats indiquent que l'anticorps 19D9D6 reconnaît le motif ou une partie du motif sélectionné mais qu'il reconnaît aussi des acides aminés présents sur la protéine III du phage Ml 3.
Exemple 3: Immunoréactivité des peptides synthétiques biotinylés vis à vis de sérums de patients VHC positifs.
Les séquences immunoréactives vis à vis de l'anticorps 19D9D6 et définies dans l'exemple 2 ont été reproduites sous forme de peptides synthétiques biotinylés en position C-terminal. Dans un premier temps, les peptides biotinylés ont été testés vis à vis de
18 sérums d'individus sains et la réponse individuelle de ces sérums a été comparée à celle obtenue avec le pool des mêmes 18 sérums. Les sérums étaient dilués au 1/50 et les peptides testé étaient biotinylés en position C-terminale et fixés au fond de puits de plaques d'ELISA par l'intermédiaire de la streptavidine. La réponse du pool de sérums négatifs est très faible et est représentative des réponses individuelles des sérums (figure 1) permettant de calculer, pour chaque peptide, une valeur seuil correspondant à la moyenne des réponses individuelles + 3 déviations standard. Dans un second temps, les peptides biotinylés ont été testés vis à vis de 14 sérums VHC positifs contenant des anticorps anti-Core . Les résultats obtenus montrent que 11 sérums sur 14 reconnaissent le peptide FYSHSGHIHSMR (SEQ ID NO :13) avec un signal supérieur au seuil (figure 2), 13 sérums sur 14 reconnaissent le peptide FYSHSHKAHNY (SEQ ID NO :6), 12/14 avec un signal supérieur au seuil et 1/14 avec un signal égal au seuil (figure 3). Les peptide SLNWPQIGSRMT (SEQ ID NO :26) et FYSHSGNAKQTV (SEQ ID NO :11) sont tous 2 les reconnus par 12 sérums sur 14 avec un signal supérieur au seuil (figures 4 et 5). Il est à noter que les 2 sérums donnant une valeur en dessous du seuil pour les 4 peptides sont cependant au dessus de la valeur du pool négatif.
Exemple 4 : Optimisation de la réponse des sérums VHC positifs contre les mimotopes Core synthétiques
Les mimotopes synthétisés avec une queue polylysine en position C-terminale et sous forme de peptides branchés 4 fois (MAP4 pour Multiple Antigen Peptide 4) donnent une réponse fortement augmentée et augmente aussi la spécificité de reconnaissance. Ainsi que le montre la figure 6 le mimotope FYSHSGHIHSMR (SEQ ID NO 13) qui donnait la plus faible réponse sous forme de peptide biotinylé (FYSHSGHIHSMR) présenté avec l'intermédiaire d'une queue polylysine en C- terminal ou sous forme de peptides branchés est maintenant reconnu avec un signal significativement supérieur au seuil par les 14/14 sérums VHC positifs.
Dans une application à la détection dans un réactif ou un procédé de l'invention tel que décrit précédemment, on utilisera avantageusement les polypeptides de l'invention présentés par l'intermédiaire d'une queue poly-lysine (poly-K) ou sous forme de peptides branchés par exemple sous forme MAP4 (cf. Lu YA, Clavijo P, Galantino M, Shen ZY, Liu W, Tarn JP. Chemically unambiguous peptide immunogen: préparation, orientation and antigenicity of purified peptide conjugated to the multiple antigen peptide system: Molecular Immunology (1991) vol. 28, N°6, 623-630).
Exemple 5
Les séquences FYSHSHKAHNY (SEQ ID NO :6) et FYSHSGHIHSMR
(SEQ ID NO :13) reproduites sous forme de MAP4 (respectivement MAP4-coreA et
MAP4-coreB) ont été testées sur une série étendue à 52 sérums de patients infectés par le VHC dont la positivité par rapport à Core a été déterminée par RIBA (Recombinant ImmunoBlot Assay Chiron Corporation, Emeryville, CA). Dans cette série, MAP4- coreA et MAP4-coreB sont reconnus par respectivement 34 et 35 sérums. La combinaison des réponses des sérums à ces 2 peptides n'a pas d'effet cumulatif.
Les peptides MAP4-CoreA et MAP4-CoreB ont aussi été testés avec un panel de seroconversion (Boston Biomedica, Inc. Bridgewater, MA). Ainsi que le montre le tableau suivant, le peptide MAP4-CoreB n'est reconnu par aucun des 18 sérums testés mais une réponse anti-core est détectée dans 16 sérums à l'aide de MAP4-CoreA. De plus, il est à noter que des réponses positives sont obtenues dans des sérums pour lesquels la quantité d'anticorps anti-core n'est pas encore détectée par RJJ3A.
Tableau 6
Figure imgf000019_0001
18 16
Les peptides sont testés par ELISA avec des sérums dilués au 1/50. Les réponses contre MAP4-CoreA and MAP4-CoreB sont indiquées par + ou - selon que les valeurs obtenues sont supérieures ou inférieures à un seuil de reconnaissance défini par la moyenne des valeurs obtenues avec 12 sérums négatifs + 3 écarts-types. a La présence d'anticorps anti-Core est évaluée par RIBA selon les indications du fournisseur.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients infectés par le viras VHC et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO :17 et SEQ TD NO :19 à SEQ ID NO: 29, les séquences équivalentes de SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO .T7 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29 celles-ci étant sélectionnées parmi les séquences qui conservent les propriétés immunoréactives de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 17 et SEQ TD NO :19 à SEQ ID NO: 29, et : présentent, par rapport à l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 2 à
SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29, au moins une substitution d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, étant considérés comme équivalents les acides aminés retenus au sein d'un même groupe parmi les groupes suivants : Groupe 1 : alanine, proline, glycine. Groupe 2 : acide aspartique, acide glutamique.
Groupe 3 : histidine, lysine, arginine. Groupe 4 : asparagine, glutamine, serine, thréonine. Groupe 5 : phénylalanine, tyrosine, tryptophane. Groupe 6 : isoleucine, leucine, valine, méthionine, et/ou sont structurellement modifiées.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO :17 et SEQ TD NO :19 à SEQ ID NO: 29 et les séquences équivalentes de SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO :17 et SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO: 29.
3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que sa séquence peptidique comprend ou consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :2 à SEQ ID NO :6, SEQ TD NO :9 à SEQ TD NO :14 et SEQ ID NO :26 à SEQ ID NO :29.
4. Réactif pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le viras VHC, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Réactif pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le viras VHC, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux polypeptides tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3.
6. Kit pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté par le viras VHC, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 4 ou 5.
7. Procédé pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le viras VHC qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif tel que défini à la revendication 4 ou 5, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant s'ils sont présents des anticorps anti-VHC, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec les anticorps anti- VHC de l'échantillon ; le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ; - la phase solide est séparée de la phase liquide ; et la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le ligand marqué est choisi parmi la protéine Core ou un fragment de ladite protéine, un polypeptide de synthèse dont la séquence peptidique comprend ou consiste en la séquence de ladite protéine Core ou en un fragment de ladite protéine, un des polypeptides de l'une quelconque des revendications 1 à 3, et une anti-immunoglobuline.
9. Procédé pour la détection et/ou la quantification d'anticorps anti-VHC dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le viras VHC, qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif tel que défini à la revendication 4 ou 5, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant s'ils sont présents des anticorps anti-VHC,
(iii) des anticorps anti-VHC marqués qui seront capables de réagir avec le réactif ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et - la présence potentielle d'anticorps anti-VHC dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
10. Procédé pour la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou de fragments desdits anticorps, selon lequel on injecte un agent immunogene consistant en au moins un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, à un organisme mammifère choisi parmi une souris, un rat et un lapin, et
- on obtient les anticorps monoclonaux à partir de cultures d'hybridome obtenues à partir de l'animal ainsi immunisé, ou
- on prélève les anticorps polyclonaux dans le sérum de l'animal ainsi immunisé.
11. Anticorps monoclonal ou polyclonal ou leurs fragments susceptible(s) d'être obtenu(s) par le procédé de la revendication 10.
12. Réactif pour la détection d'une infection par le viras VHC qui comprend au moins un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou leurs fragments tel(s) que défini(s) dans la revendication 11.
13. Kit pour la détection d'une infection par le viras VHC qui comprend au moins un réactif tel que défini dans la revendication 12.
14. Procédé pour la détection et/ou la quantification de protéine Core dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le viras VHC qui comprend au moins les étapes suivantes : - un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif qui consiste en au moins un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps monoclonal tel que défini dans la revendication 11, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine Core, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine Core de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ; - la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle de la protéine Core dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel le ligand marqué est un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou un fragments desdits anticorps.
16. Procédé pour la détection et/ou la quantification de protéine Core dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le virus VHC qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant : (i) un réactif qui consiste en au moins un anticorps polyclonal ou un fragment dudit anticorps tel que défini dans la revendication 11, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine Core, (iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec la protéine
Core de l'échantillon ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ;
- la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle de la protéine Core dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel le ligand marqué est un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal ou leurs fragments.
18. Procédé pour la détection et/ou la quantification de protéine Core dans un échantillon biologique prélevé chez un patient infecté ou supposé être infecté par le viras VHC qui comprend au moins les étapes suivantes :
- un mélange est préparé comprenant :
(i) un réactif selon la revendication 12, qui est ou qui sera immobilisé sur une phase solide, (ii) l'échantillon devant être testé et comprenant si elle est présente la protéine Core,
(iii) un ligand marqué qui sera capable de réagir avec le réactif (i) et qui consiste en un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 ;
- le mélange est incubé pendant un temps prédéterminé ; - la phase solide est séparée de la phase liquide ; et
- la présence potentielle de la protéine Core dans l'échantillon est révélée en mesurant le degré de marquage dans la phase solide.
19. Procédé pour la détection de la protéine Core dans un échantillon biologique comprenant au moins l'étape selon laquelle on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps monoclonal ou plyclonal selon la revendication 11 marqué.
20. Composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend comme ingrédient actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et éventuellement un support pour ledit polypeptide et/ou un excipient et/ou un adjuvant et/ou un diluent pharmaceutiquement acceptable.
21. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de l'infection par le VHC.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995012677A2 (fr) * 1993-11-04 1995-05-11 Innogenetics N.V. Epitopes de lymphocytes t humains immunodominants du virus de l'hepatite c
WO2000031130A1 (fr) * 1998-11-20 2000-06-02 Bio Merieux Polypeptides synthetiques correspondant au virus de l'hepatite c (hcv) et applications

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995012677A2 (fr) * 1993-11-04 1995-05-11 Innogenetics N.V. Epitopes de lymphocytes t humains immunodominants du virus de l'hepatite c
WO2000031130A1 (fr) * 1998-11-20 2000-06-02 Bio Merieux Polypeptides synthetiques correspondant au virus de l'hepatite c (hcv) et applications

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE BIOSIS [en ligne] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; mars 2001 (2001-03) ZUCCHELLI SILVIA ET AL: "Mimotopes of the hepatitis C virus hypervariable region 1, but not the natural sequences, induce cross-reactive antibody response by genetic immunization." Database accession no. PREV200100152812 XP002189145 & HEPATOLOGY, vol. 33, no. 3, mars 2001 (2001-03), pages 692-703, ISSN: 0270-9139 *
PUNTORIERO GIULIA ET AL: "Towards a solution for hepatitis C virus hypervariability: Mimotopes of the hypervariable region 1 can induce antibodies cross-reacting with a large number of viral variants." EMBO (EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY ORGANIZATION) JOURNAL, vol. 17, no. 13, 1 juillet 1998 (1998-07-01), pages 3521-3533, XP002120168 ISSN: 0261-4189 *

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