JPH04502103A - Ｂ型肝炎ウイルスの大きいエンベロープタンパク質のプレＳ１領域を認識するモノクローナル抗体、及び、特にＢ型肝炎のｉｎｖｉｔｒｏ診断及び治療のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウィルスの大きいエンベロープタンパク質の７しＳ１領域を認識するモ ノクローナル抗体、及び、特にＢ型肝炎のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断及び治療のため のその使用本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の大きいエンベロープタンパ ク質のプレ８１領域に存在するエピトー７を認識するモノクローナル抗体に係る ０本発明はまた、特に慢性Ｂ型肝炎患者の病勢の進行をｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断す るため、及び、Ｂ型肝炎を治療するため、及び、この病気の予防ワクチンを得る ためのかかるモノクローナル抗体の使用に係る。

ＨＢＶのエンベロープは、３種類の表面タンパク質（Ｓタンパク質）を含む、Ｓ タンパク質は、感染中にウィルス自体に比較して大量に発現されるＢ型肝炎の抗 原性表面粒子（ＨＢｓＡｇ粒子）から検出される唯一のウィルス性成分である。

ＨＢｓＡｇ粒子は、感染性ＨＢＶ粒子（４２ｎｍ　）よりも小さい直径（２２ｎ ｍ　）の球状または管状の形態で存在する。

３種類のＳタンパク質は、以下のごとく分類されるニー２２６個のアミノ酸のＳ 配列（または領域）から成る［小ＪＳタンパク質、即ち、主要Ｓり〉′バク質即 ちＨＢ　ｓ　Ａ、　ｇ（ＰＥＴＥＲＳＯＮ、　Ｄ、　Ｌ、他、　（１９７７）、 　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、　７４．１５３０〜１５３４）　；−上記Ｓ配列と、ＨＢＶ　ＤＮＡの プレＳ２領域にコードされた追加の５５個のＮ末端アミノ酸とから成る「中」Ｓ タンパク質（ＭＡＣ）ＩＩＤ＾、＾、他、　（１９８４）、　Ｇａ５ｔｒｏｅｎ ｊ、ｅｒｏｌｏｇｙ。

覗、９１０〜９１８）　。

−８と、ブレＳ２配列と、ＨＢＶ　ＤＮＡのプレＳ１領域にコードされた追加の １０８個（抗原性亜型ａｄ＞または１１９個（抗原性亜型ａｙ）のＮ末端アミノ 酸とから成る「大」Ｓタンパク質（ＨＥＥＲＭＡＮＮ、　Ｋ、他、　（１９８４ ）、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　５２゜３９６〜４０２　、　ＷＯＮＩＩ；、　Ｄ、 Ｔ、他、　（１９８５）、　Ｊ、１／１ｒｏ１．、５５．２２３〜２３１）。

これらの３種類のＳタンパク質は異なるグリコジル化形態、即ちニ ー生要タンパク質Ｐ２４及びＧＰ２７、−中タンパク質ＧＰ３３及びＧＰ３６、 −大タンパク質Ｐ３９及びＧＰ４２ の形態で存在する。

中タンパク質及び大タンパク質は、感染性）（ＢＶ超粒子ウィルスのコア抗原Ｈ ＢｃＡｇも含む）中に、前記ＨＢｓＡｇ粒子よりも高い濃度で検出された（ＨＥ ＥＲＭＡＮＮ、　Ｋ、　ＩＩ。

他、麟、及び、ＴＡＫＡＩＩＡＳＨＩ、　Ｋ、他、　（１９８６）、　Ｊ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、。

じ互、　３４６７〜３４７２）。

従ってこれらのタンパク質は、感染性ＨＢＶ粒子の集合または機能に何らかの役 割を果たしていると推測される。

Ｓタンパク質のプレＳ２領域及びブレＳ１領域は、ＨＢ■感染した個体の肝細胞 中のウィルスの認識及び侵入のメカニズムにおいて何らかの役割を果たすと考え られる。即ち、肝細胞のレセプターへのＨＢＶの結合部位は、ブレＳ１領域（ま たは配列）の２１位〜４７位のアミノ酸中に局在すると推測される（ＮＥ旺＾Ｔ Ｈ１＾、Ｒ１他、　（１９８６）、　ＣＥＬＬ、組。

４２９〜４３Ｂ）。

これらの著者はまた、ＨＢＶと肝細胞癌ＨｅｐＧ２の細胞との間の相互作用が、 ブレＳ１配列の２１位〜４７位のアミノ酸残基中のペプチドに対する抗体く従っ て抗プレ５（２１〜４７〉抗体と呼ぶ）、及び、抗ブレ５（３２〜５３）抗体に よって強力に阻害されることを証明した。

ＨＢＶの感染メカニズム、特に肝細胞レセプターの認識においてブレＳ１領域が 重要な役割を果たすことが推測されるので、Ｂ型肝炎の克服には、この領域、特 に肝細胞にＨＢＶを結合させるエピトープを特異的に認識する抗体が極めて重要 であると考えられる。しかしながら、現在公知のモノクローナル抗体は、このよ うな目的に適う所望の特性を有していることが証明できなかった。前記の抗ブレ ５（３２〜５３）抗体が、患者の血清中で抗ＨＢＶ応答を誘発しないプレ５（３ ２〜５３）配列を用いて得られたことに注目されたい、その結果として、このよ うな配列によって予防ワクチンが得られる可能性はほとんどない。

現在入手できる上記のごときポリクローナル抗体よりもプレＳ１領域に対して有 効な特異的抗体を得るために、ＨＢＶ粒子（ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ、　Ｋ、他、　 （１９８６）、ＭＪＬ）、または、プレ５１（１〜１１）及びプレ５（１３〜２ １）などの合成ペプチド（０）ＩＮＵＭ＾、Ｈ１他、　（１９８６）、　ＧＩＬ ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、　９０゜６９５〜７０１）によって免疫した動 物リンパ球を出発物質として別のモノクローナル抗体が調製された。これらのモ ノクローナル抗体の詳細な特性決定はされなかった。

１９８６年５月７日付けのにＥＲＬＩＣＨ他の欧州特許出願公開第０゜１８０． ０１２号にモノクローナル抗体（ＭＣＡ＞が特に詳細に記載されている。このモ ノクローナル抗体（Ｍ　Ａ　１８／７）は、プレＳ１領域のプレ５（３８〜１２ １）配列を特異的に認識するが、肝細胞に対するウィルスの特異的結合部位を同 定することはできない。

このＭ　ＣＡ　Ｍ　Ａ　１８／７はまた、ＨＢＶ非感染個体の血清と免疫交差反 応を生じるという欠点がある。これは、ｉｒ＋ｖｉｔｒｏ診断手順で使用するた めには重大な欠点となる。

本発明の目的は、公知の抗プレＳ１抗体に比較して、一方では、肝細胞に対する ＨＢＶの結合メカニズムに関与するプレＳ１領域のアミノ酸配列に対してより特 異的であり、他方では、ＨＢＶ非感染個体の血清と免疫交差反応を生じないとい う利点を有するモノクローナル抗体を提供することである。

本発明はまた、公知の抗体によって得られるよりも正確で詳細な大プレＳ１タン パク質の新規な検出方法及び１ｎｖｉｔｒｏアツセイ方法、並びに、該方法を使 用した慢性Ｂ型肝炎の進行のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法に係る。

本発明の別の目的は、Ｂ型肝炎の治療及びこの病気に対する予防ワクチン用の新 規な医薬組成物を提供することである。

添付図面に基づいて本発明をより詳細に以下に説明する。

図１は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の概略説明図である。

図２ａは、ＨＢｓＡｇ粒子及びＨＢＶ中のＳ、プレＳ２及びプレＳ１配列のラジ オイムノアッセイ（ＲＩＡ）の結果を示す０図２ｂは、イムノプロット法によっ て判定した本発明のモノクローナル抗体のポリペプチド特異性を示す。

図３は、ＨＢＶの５つの抗原性亜型に対応する大きい表面タンパク質Ｐ３９及び ＧＰ４２のプレ５（２１〜５３）及びプレ５（９４〜１１７）領域のアミノ酸配 列を示す。

図４（ａ及びｂ）は、本発明のモノクローナル抗体を用いて行なったプレＳ１ペ プチド及びウィルス抗原に関するラジオイムノアッセイの結果を示す。

図５は、プレ５（３２〜５３）ペプチド（図５ａ＞またはＨＢＶ亜型ａｄ（図５ ｂ）に対する本発明のモノクローナル抗体の結合を阻害するプレＳ１領域及びＨ ＢＶ粒子の特異的ペプチドの阻害効果を示す。

図６は、本発明のモノクローナル抗体によるブレＳ１領域検出感度を示す。

図７は、トリプシンまたはプロテアーゼ■８によってＨＢＶ粒子を消化した結果 を示す。

図８は、ＨＢＶ粒子（亜型ａｄ）のショ糖勾配、及び、Ｆ３５．２５エピトープ の検出と血清中の完全ピリオンの存在との相関関係を示す。

図９は、二抗体特異性をもつラジオイムノアッセイ系による精製ＨＢＶ粒子中の プレ５Ｌ（３２〜５３）配列の検出を示す。

図１０は、慢性キャリアーの血清中のＳ抗原及びプレＳ抗原（プレＳｌＡｇ及び プレＳ２Ａｇ）の定量分析を示す。

図１１は、慢性Ｂ型肝炎患者におけるプレＳ１抗原（及びプレＳ１肝細胞レセプ ター）の発現の臨床的意義を示す。

本発明は、以下の諸特性を組み合わせて有することを特徴とするモノクローナル 抗体（以後ＭＣＡ　Ｆ３５．２５と略称）に係る。

即ち、本発明のモノクローナル抗体はニー　プレＳ１領域の３２位〜５３位に存 在するアミノ酸中に含まれるエピトープ、 ＨＢＶの大エンベロープＳタンパク質のプレＳ１領域、ＨＢＶの大エンベロープ タンパク質、Ｐ３９及びＧＰ４２．６６ｋｄ（キロダルトン）のＨＢＶの極大エ ンベロープタンパク質、 ＨＢ　Ｖの大Ｓタンパク質をトリプシンで消化して得られりＨＢ　Ｖの大Ｓタン パク質の各開裂産物（これは、該大Ｓタンパク質のブレＳ１領域のトリプシン開 裂によって得られた分子量１３，５００及び１４，５００を夫々有する２つの産 生物を含んでいる）、 ）ＩＢＶの大Ｓタンパク質をＳ、ａｕｒｅｕｓのプロテアーゼ■８で消化するこ とによって得られた分子量１５，０００．１６，５００及び２９，０００を夫々 有するＨＢＶの大Ｓタンパク質の各開裂産物、 と共に免疫複合体を形成する特性を有し、−ＨＢＶの中エンベロープＳ（糖）タ ンパク質、ＧＰ３３及びＧＰ３６、 ＨＢＶの主要Ｓエンベロープ糖タンパク質、Ｐ２４及びｃＰｚ’７、 ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）、 重合ヒト血清アルブミン（ｐ　ＨＳ　Ａ、　’）、イムノグロブリンＧ、Ａ及び Ｍ、 ＨＢＶ非怒染個体の種々の血清成分、 と共に免疫複合体を形成しない特性を有する。

本発明のモノクローナル抗体は好まし、くは、イムノグロブリンＧｌ　（ＩｇＧ １）クラスに属する。

上記モノクローナル抗体は、常用のハイブリドーマ調製法を使用し、ミエローマ 細胞と）（ＢＶ粉粒子免疫した動物から採取した肺細胞とを融合させ、前記に定 義した緒特性を有するモノクローナル抗体を分泌するバイブリドーマを検出し回 収する処理手順によって得られる。

本発明はまた、前記に定義したモノクローナル抗体、特にＭＣＡ　Ｆ３５．２５ を分泌し得るハイブリドーマに係る。

より特定的には本発明は、１９８８年８月５日に、パリ、パスツール研究所）Ｎ ＡＴＩＯＮＡＬ　Ｃ０ＬＬＥＣＴＩＯＮ　ＯＦ　ＣＬＩＬＴＵＲＥＳ　ＯＦＭＩ ＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ　（Ｎ　、　Ｃ、Ｃ、Ｍ、　＞　４：受託番号ｌ−７ ９６で寄託されたＭＣＡ　Ｆ３５．２５を分泌するハイブリドーマに係る。

本発明はまた、大Ｓタンパク質を含有すると予測される生物サンプル中の大Ｓタ ンパク質（ブレＳ１領域を含む）の有無をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出する方法に係る 。この方法はニー前記生物サンプルとＭＣＡ　Ｆ３５．２５とを、大Ｓタンパク 質のブレＳ１領域とＮＣＡ　Ｆ３５．２５との免疫複合体が形成され得る条件下 に接触させ、 一上記免疫複合体を検出する段階を含む。

かかるｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法は当業者に公知の方法で実施され得る。

例えば２該方法は以下の段階を含む： −−−ＨｃＡ　Ｆ３５．２５を固体支持体に結きさせる、−前記支持体に生物サ ンプルを、大タンパク質のブレＳ１領域とＭＣＡ　Ｆ３５．２５との免疫複合体 が形成され得る条件下に添方Ｕする、 −次いで、前記複合体との免疫複合体を形成し得る別の抗体く例えばＮＣＡ　Ｆ ３５．２’１など）を、特に放射性標識または＃素標識して固体支持体に添加す る、 一面記免疫複合体に含まれる前記標識抗体を適当な試薬で検出する６ 本発明のブレＳｌ抗原の独特なｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法は更に以下の段階を禽 む −Ｓり〉バク質の３つの領域と免疫複合体を形成し得る抗体、好ましくはポリク ローナル抗体を固体支持体に結合させる、 一生物サンプルを前記支持体に、ａｆ記抗体とサングル中に含まれる８タンパク 質のＳ領域との間で免疫複合体が形成され得る条件下に添加する、 一任意に標識、特に放射性標識または酵素標識されたＭＣ＾Ｆ３５．２５、また は、前段階で得られた複合体との免疫複合体を形成し得るその他の任意の抗体を 、サンプル中に含まれる７しＳ１領域を含むＳタンパク質（即ち大Ｓタンパク質 ）とＭＣＡ　Ｆ３５．２５との間で免疫複合体が形成され得る条件下に添加する 、 一前記免疫複合体に含まれた標識ＭＣＡ　Ｆ３５．２５を適当な試薬で検出する 、 −または、ＭＣＡ　Ｆ３５．２５が標識されていないとき、前段階で得られた免 疫複合体に含まれたＭＣＡ　Ｆ３５．２５との免疫複合体を形成し得る標識アン チイムノグロブリン（固体支持体に結合された抗体の調製に使用した動物とは異 なる種類の動物から得られたもの）によって前記免疫複合体を検出する。

本発明の好ましい：ｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法のより詳細な実施態様によれば、方 法が以下の段階を含む。

−ＨＢ　ＶのＳエンベロープタンパク質のＳ領域と免疫反応を生じ得る抗体、好 ましくはポリクローナル抗体く例えばウサギの免疫によって得られたもの）を固 体支持体に結合させる、 一支持体を洗浄し、支持体に結合しなかった前記抗体を除去する、 −特に血清などの生物サンプルを支持体に、前記ポリクローナル抗体と前記血清 に含まれる見込みのＳタンパク質との免疫複合体が形成され得る条件下に添加す る、−支持体を洗浄し、前記抗体によって認識されなかった前記血清の種々の成 分を除去する、 一支持体に本発明のモノクローナル抗体ＭＣＡ　Ｆ３５．２５を、このモノクロ ーナル抗体と、前段階で形成された免疫複合体に含まれる大タンパク質のプレＳ １領域を含むＳタンパク質との免疫複合体が形成され得る条件下に添加する、− 支持体を洗浄し、大Ｓタンパク質のプレＳ１領域との免疫反応に関与しなかった モノクローナル抗体を除去する、−ＭＣＡ　Ｆ３５．２５との免疫複合体を形成 し得る標識アンチイムノグロブリン（ＭＣＡ　Ｆ３５．２５の調製に使用した動 物と同じ種類の動物、固体支持体に結合させたポリクローナル抗体の調製に使゛ 用した動物とは異なる種類の動物の免疫によって得られたもの、この例ではこれ らのアンチイムノグロブリンをマウスの免疫化によって得る）を支持体に、この アンチイムノグロブリンと前段階で形成された免疫複合体に結合したＭＣＡ　Ｆ ３５．２５との間で最終免疫複合体が形成され得る条件下に添加する、 一前記最終免疫複合体に結合した標識アンチイムノグロブリンの量を検出し、こ の量を前記血清中に存在するプレ８１領域を含むＳタンパク質または大Ｓタンパ ク質の量と相関させる。

本発明はまた、上記に記載のごとき　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法において、ＭＣ Ａ　Ｆ３５．２５に代えて、固体支持体に結合させたポリクローナル抗体と生物 サンプルに含まれるＳタンパク質との間に形成された複合体とに対して免疫反応 を生じ得る抗体を使用し、標識アンチイムノグロブリンが、ＭＣ八へ３５．２５ に代えて使用された抗体と免疫複合体を形成し得るように変更した方法に係る。

かかるｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法においては、ＭＣＡ　Ｆ３５．２５に代えて、 Ｓタンパク質のアレＳｌ領域と免疫反応を生じ得るモノクローナル抗体が特に使 用される。

本発明はまた、前記ｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法を使用し、ＨＢＶ感染の疑いがあ る個体から採取した血清などの生物サンプルで、急性または慢性のＢ型肝炎をｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ診断する方法に係る。

より特定的には本発明は、症候性個体または無症候性個体即ちＨＢＶのＳタンパ ク質のキャリアーにおける慢性Ｂ型肝炎の進行をｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断する方 法に係る。

上記のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法では、前記の大Ｓタンパク質の量のｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ検出方法と並行して、主要Ｓタンパク質の１ｎｖｉｔｒｏ検出方法を行な うのが有利である。後者の検出方法は、大タンパク質の検出に関して前述した段 階と同じ段階を用いるが、一方では、ＭＣＡ　Ｆ３５．２５に代えて、主要Ｓタ ンパク質（または、そのグリコジル化形態のいずれか一方または双方）との免疫 複合体を形成し得る抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用い、他方では、Ｍ ＣＡ　Ｆ３５．２５を認識するアンチイムノグロブリンに代えて、主要Ｓ抗原を 認識する前記ＭＣＡとの免疫複合体を形成し得るアンチイムノグロブリンを使用 するように変更した方法である。

上記の方法において使用される抗体、即ち、主要Ｓタンパク質との免疫複合体を 形成し得るモノクローナル抗体の例は、特に、ＰＥＴＴＴ、　Ｍ、＾、他（１９ ８７）、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６８゜２７５９〜２７６７に記載 のＭＣＡ　Ｆ３９．２０である。

同じサンプル中で検出された大Ｓタンパク質の量と主要Ｓタンパク質の量とを比 較することによって、所与の時点での該サンプル中の主要Ｓタンパク質の存在量 に対する大Ｓタンパク質の存在量の割合を決定し得る。

上記方法を繰り返して行なうことによって、この割合の経時的変化をモニターし 得る。

慢性Ｂ型肝炎患者でこの割合の経時的減少が検出されるとき、病状が好転してい る、即ち、一部回復状Ｒ（寛解）または完全回復状態になりつつあると判断する ことができる。完全回復状態では、患者から採取されたサンプルから大Ｓタンパ ク質が完全に消失する。

前述の大Ｓタンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法の原理は中Ｓタンパク質の検 出にも適用し得、その場合はＮＣＡ　Ｆ３５．２５及びＭＣＡ　Ｆ３５．２５を 認識する抗イムノグロブリンに代えて、その中Ｓタンパク質のブレ８２部分との 免疫複合体（又はいずれか１つのグリコジル化形ＵＳタンペク質との複合体、あ るいはこれらを両方とも含む複合体）を形成することができるモノクローナル抗 体と、ブレ８２領域を認識する前記モノクローナル抗体との免疫複合体を形成す ることができる抗イムノグロブリンとを使用する。　ｆ＆者のタイプのモノクロ ーナル抗体の具体例としては、前出のＰＥＴＩＴ、Ｎ、八、らの文献（１９８７ ）に記載ＯＭＣＡ　Ｆ１２４が挙げられる。

従って本発明の方法では、慢性Ｂ型肝炎にかかつている個体から採取した生物学 的試料中の、中Ｓタンパク質に対する犬Ｓタンパク質の割合、並びに主要Ｓタン パク質に対する大Ｓタンパク質の割合を検出することができる。そこて、このよ うな方法を使用すれば、３種類のＳタンパク質の相対的割合の変化を時間の関数 としてモニターすることが可能であり、従って病気の進行が好ましいか又は好ま しくないかをこれらの変化の関数として評価することができる。

本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法は、血清又は肝生検試料のような（個体から 採取した）生物学的試料を出発材料として行う、リンパ球中でのＳタンパク質の 発現が肝細胞中での同−Ｓタンパク質の発現と同様に生起するのであれば、肝生 検試料は操作が難しいため、本発明の診断方法はリンパ球試料を出発材料として 行う方が有利ということになる。

本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法は有利なことに、特にインターフェロンを含 む医薬組成物又はビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）のような抗ウィルス剤に よる治療を受けているＢ型肝炎患者の治療の継続管理も行うことができる。

これらの患者のいずれかにおいて主要Ｓタンパク質及び／又は中Ｓタンパク質と 比べた大Ｓタンパク質の量の減少が検出されれば、使用した治療が好ましい結果 をもたらし、患者が回復に向かっていると推量することができる。

本発明は、トリプシンか又は１〜リブシン型の活性を有し且つ生物学的試料を採 取した個体の体内に存在する酵素による大Ｓタンパク質のｉｎ　ｖｉｖｏ消化の 結果生じる大Ｓタンパク質の開裂産物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出する方法と本発 明の１ｎｖｉＬｒｏ診断方法と平行して行うための、ＭＣＡ　Ｆ３５，２５の使 用にも係わる。

この検出方法は、リンパ球のような試料を出発材料とし”Ｃイム、ノブロッ１− 　（又はウェスターンプロット）により実施され、下記のステップを含むニ ー　種々の抗原成分を分ダすべく試料をゲル電気泳動にかけ、 −分離された成分をニトロセルロース膜のような支持体に移Ｌ７、 −１−リブシンによるブレＳ１領域の開裂によつＣ生じた分子量１３，５００及 び１４，５００の２つの開裂産物を含む大Ｓタンパク質の各開裂産物とＭＣＡ　 Ｆ３５．２５との免疫複合体を形成せしめる条件で、特に放射性ラベルもしくは 酵素で任意に標識したＭＣＡ　Ｆ３５．２５と一緒にインキュベ−１〜し、−分 子Ｊ１１３，５００又は１４，５００の産物との前記免疫複合体に含まれている 標識されたＭＣＡ　Ｆ３５．２５を適当な試薬と用いて検出するか、 −又はＭＣＡ　Ｆ３５．Ｚ５が標識されていない場合は、前述のごとき免疫複合 体に含まれでいるＭＣＡ　Ｆ３５．２５との免疫複合体を形成することかて゛き る標語された抗イムノグロブリンを用いてＭＣＡ　Ｆ３５．２５ｅ検出する。

このような方法を使用すると、大タンパク質が生体内で分解されていればその大 タンパク質の量を測定することができ、従って）ＩＢＶ感染に対する被検個体の 耐性の度合いを測定することができる。この度合いは、検出された大Ｓタンパク 質のトリプシン開裂産物の量の関数である。

本発明は、前述した本発明の方法のいずれかを実施するためのキットにも係わる 。

本発明のキットは例えば下記の構成要素を含むニー　Ｓタンパク質のＳ部分との 免疫反応を起こすことができる所定量のポリクローナル抗体を固体支持体に結合 したもの。

−所定量のモノクローナル抗体Ｆ３５．２５゜−）ＩＢＶの主要Ｓエンベロープ タンパク質との免疫複合体を形成することができる所定量のモノクローナル抗体 （任意）。

−ＨＢＶの中Ｓエンベロープタンパク質との免疫複合体を形成することができる 所定量のモノクローナル抗体（任意）。

〜　有利なものとして、前述の抗体と生物学的試料中に含まれている可能性のあ るＳタンパク質との免疫反応を生起させるのに適した媒質。

−有利なものとして、前記モノクローナル抗体を含む免疵種合体の検出を可能に する標識した試薬、特に標識イムノグロブリン。

本発明は、Ｂ型肝炎の治療における本発明のモノクローナル抗体ＮＣＡ　Ｆ３５ ．２５の使用、より特定的にはＢ型肝炎にがかった個体に肝臓移植をした場合の 移植片再感染現象を防止するための使用にも係わる。

そのために、本発明は前述の治療に使用するための医薬組成物であって、ＭＣＡ 　Ｆ３５．２５を医薬的に許容し得るビヒクルと組合わせて含む組成物を提供す る。

Ｂ型肝炎ウィルスの活発な複製を検出することができる患者への肝臓移植には、 大きな移植片再感染の危険が伴う（ＴＯＲＩＳＵら、１９７１．＾ｎｎａｌｓ　 ｏｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ、１７土、６２０−６３７）、　ＨＢｓＡｇの慢性キャリ ヤー状態はこれまで、特にＨＢｅＡｇに間して陽性のキャリヤー（即ちヌクレオ キャプシドの抗原であるＨＢｅ抗原のキャリヤーである個体）の場合には、肝臓 移植に対して禁忌であるとみなされてきた。ＨＢＶの主要Ｓタンパク質に対して 特異的なイムノグロブリン（抗ＨＢｓ）での短期免疫予防は効果がないことが判 明した（ｖａｎ　Ｔｈ１ｅｆ　ＤＨら（１９８４）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　４ ニア９Ｓ−８３Ｓ）、最近になって、予防接種による能動免疫予防と組合わせて 大量のイムノグロブリンを用いる長期受動免疫予防プロトコルが開発された。こ のプロトコルは再感染をより効果的に防止すると思われるが、その効果はＩＩＢ Ｖの複製を移植の前に検出することができた移植片の場合に限られる（Ｎｉｉｌ ｌｅｒ　Ｒ，ら、ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ａｎｄＬｉｖｅｒ　Ｄｉｓ ｅａｓｅ、ｐｐ、８１０−８１２（１９８８）、＾Ｉａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎ ｃ、）。

従って、抗ＨＢｓイムノグロブリンだけでは、移植前の患者の血清中に存在する 完全ピリオンの存在下で移植片の再感染を防止する効果は得られないと思われる 。実際ＨＢｓＡｇは、これらの抗体によって特異的に中和される非感染性欠陥粒 子（ヌクレオキャプシドではなくウィルスのエンベロープで構成された２２ｎｍ の粒子）の形態で極めて過剰に発現される。一方、感染性ウィルス粒子は相対的 に極めて少量しか存在せず、従って抗ＨＢｓイムノグロブリンを極めて大量に使 用しなければならないが、これは治療費が高くなるだけで効果は殆ど期待できな い、再感染を引き起こす完全ピリオンは、欠陥形態のＨＢｓＡｇと異なり、ブレ Ｓ１特異性を選択的に発現する。

ＭＣＡ　Ｆ３５．２５は、抗プレＳ１特異性を有し、より正確には肝細胞による ＨＢＶの認識部位（これらの部位は完全ピリオンの表面で発現される）に対して 特異的であるため、予防接種による能動免疫予防によって補完される抗ＨＢｓイ ムノグロブリンでの長期受動免疫予防（数年）の代わりに、又はこれと組合わせ て、短期受動免疫予防プロトコル（例えば月当たり３〜４回の注射）を実施する ために使用すると特に有利である。実際、最近になって判明したように、ヒト血 清に由来するＲｅｖｕｅ−Ｂ（ＰＡＳＴＥＵＲＶＡＣＣＩＮＳ　）での予防接種 は抗ブレＳ１抗体の産生を誘発することができる。

そこで本発明は、より特定的には、抗ＨＢｓイムノグロブリン（特にＨＢｓ／Ｂ ｓ／抗血Ｂｓ血清交換た血液ドナーに由来するもの）と組合わせ、且つ必要であ ればＢ型肝炎に対するワクチン特に前記ｔｌｅｖａｃ−Ｂ又は後述の抗イデイオ タイプモノクローナル抗体とも組合わせた所定量のＭＣＡ　Ｆ３５．２５を、医 薬的に許容し得るビヒクルと組合わせて含む医薬組成物を提供する。

本発明は、モノクローナル抗体Ｆ３５．２５との免疫複合体を形成するという特 徴をもつ抗イデイオタイプモノクローナル抗体にも係わる。

この抗イデイオタイプモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体Ｆ３ ５．２５で動物を免疫し、次いでモノクローナル抗体Ｆ３５．２５との免疫複合 体と形成できる抗体を取出すことによって得られる。

本発明は、前述の抗イデイオタイプモノクローナル抗体を医薬的に許容し得るビ ヒクルと組合わせて含むことを特徴とするＢ型肝炎予防接種用組成物にも係わる 。

本発明の他の特徴は、モノクローナル抗体Ｆ３５．２５の製造及び特徴分析に関 する以下の説明で明らかにされよう。尚、この説明は本発明の範囲を限定するも のではないと理解されたい。

■、　材料及び方法 １）モノクローナｌし　Ｆ３５．２５の　゛告ＰＥＴＩＴら（１９８５）Ｍｏ１ ｅｅ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、、２２．１２７９−１２８７に記載のように、慢性Ｂ型 肝炎（サブタイプａｄ）にかかった個体の血清からＨＢＶ粒子を精製し、これを 免疫原として使用した。フロイントの完全アジュバント中１００μｇの精製ウィ ルスをＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内接種し、次いで１週間後にフロイントの不完 全アジュバント中１００．．のウィルスを接種した。

免疫した３匹のマウスはＨＢｓＡｇに対する大きな抗体価を生じた。この抗体価 はラジオイムノアッセイＲＩ＾によって検出した。２週間後、これらのマウスに リン酸塩バッファ中５０１１ｇのウィルス分接種した。５日後にこの接種を繰返 し、３日後に肺臓を切除して、ＢｔｌＴＴＩＮら（１９８７）　、牡、２７−３ ６に記載の手順で骨髄ＩＩ　Ｘ６３細胞との融合を行った。

このハイブリドーマの培養上清を閉接ＲＩＡによるスクリーニングにかけ、免疫 用精製ウィルスを固相として使用１７“ζ特異的ＨＢＶ抗体の存在を調べた（Ｐ ＥＴｒＴら（１９８７）　、Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、、６８，２７５Ｌ２７６７ ）。ハイブリドーマクローンの３０％が１７１３■に対する抗体な産生じていた 。固相上にＨＢＶ粒子を有する最も強いシグナルを与えるハイブリッド（Ｐ／Ｎ ＞　１０＞（Ｐ＝−陽性、Ｎ−陰性）を限定希釈法で再クローニングにかけ、そ のポリペプチド特異性を、解離したウィルスタンパク質を抗原性プローブとして 用いながらウェスターンプロットにより調べた＜ＰＥＴｒＴら（１，９８６）　 、Ｍｏ１ｅｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７，５１１−５２３）　。

次いで腹水を産生ずべく、選択したクローンをＢＡＬＢ／ｅマウスに注射した。

ブレ８１部分に対して特異的なモノクローナ？し抗体Ｆ３５．２５を、５０％飽 和の（ＮＩｌ、）、ＳＯ，での沈澱と５ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−Ｚｏ。

（ＰＨＡＲＭ＾Ｃ１＾−ＦＲＡＮＣＥ）でのア過と、　ＤＥＡＥ−１−リサクリ ルＭ（ＩＢＦ−ＦＲＡＮＣＥ）でのイオン交換クロマトグラフィーとによってハ イプリドーマ細胞培貢物の上清から精製した。マウスのＭイムノグロブリン＜Ｉ ｓＭ）、１８Ｇ１、Ｉ　ｇＧ　２Δ、ｌ８−Ｇ２Ｂ及び１ｇＧ３（ＮＯＲＤＩＣ ＩＭＨＵＮＯＬＯＧＹ　−ＴＩＬＢＵＲＧ−ＢＥＲＣＲＥＭ−ＬＯＮＤＯＮ）に 対して特異的なウサギ抗血清に対する免疫拡散によりイソタイプを調べな。

２）漁左ｌ土二上ノア７−アッセイ　ウェス　−ンブロ・・−五上 札へＦ３５．２５のポリペプチド特異性を、ウィルスの未処理又は消化調製物を 抗原として用いてイムノトランスファーにより調べたく前出のＰＥ７１丁らの文 献（１９８６）及び（１９８７））。

Ｓ、５ｕｒｅｕｓのプロテアーゼＶ８（Ｓ［Ｍ＾社のタイプＸＶＩＪ）及びトリ プシン（Ｓｌ（：Ｍ＾社のタイプＸｌｌ＞による消化をｐＨ７，８の０．１Ｎ重 炭酸アンモニウム中３７℃で３時間行った。

酵素対基質の量の比は１；４０〜５０（重量比）にし、タンパク質濃度は１．Ｂ ／ｍｌにした１反応は、５ＤＳ２％と２−メルカプトエタノール５％とを含むバ ッファの添加によって停止させた。

２２ｎａの球状）ＩＢｓＡｇ粒子を、ブレＳ２反応性しか示さないＨＢｓＡｇ陽 性血清から誘導したＨＢＶと共に同時精製しく前出のＰＥＴＴＴらの文献（１９ ８７））、ヒト血清アルブミン（０，２２＋ｓｇ／論Ｉ）と１７５００で希釈し た正常ヒト血清とを対照抗原として並行使用した。精製ＨＢＶは０．２〜１＋ｇ ／ｍｌの種々の濃度で使用した。

１、ＡＥＭＭＬＩ（１９７０）　、Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、２２７，６８ ０−６８５に記載のバッファシステムを用いて電気泳動にかけた後、前出のＰＥ ＴＴＴらの文献（１９８７）に記載の方法で検出を行うべくタンパク質バンドを 電気泳動で溶離しニトロセルロース膜に移した。

移したバンドは、ブロッキングバッファ（ウシ血清アルブミンと５０％のウシ胎 児血清とを含むトリス−ＮａＣ１）中に１＝２で希釈したハイブリドーマ細胞の 上清又はＬｏｎｇ／ｍｌの精製マウスモノクｌコーナルＩｇＧと一緒にインキュ ベートした。

３）ラーにコニ仁ムノー月−コル１１ヱ」Ｌ歪■汎ｌＡｌ−くソ 自然の状態のウィルスの又はＨＢＶサブタイプａｄｗ２の大エンベロープタンパ ク質のブレＳ１配列から誘導した合成ペプチド（前出のＮＥＵＲＡＴＨらの文献 ＜１９８６））へのＭＣＡ　Ｆ３５．２５の結合を、ヨウ素１＋＝ｓで放射性標 識した抗マウスＦ（ａｂ’＞２（ヒツジイムノグロブリン、＾ＭＥＲ５Ｈ八Ｍ− ＦＲへＣＥ）を用いるＲ１八により訓電した。ポリスチレンビーズを、ＴＮバッ ファ　（０，ＯＩＭＩ・リス−ＭＣＩ、０．１４Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，２）中 に濃度２０μｇ／ｍｌで希釈ｔ、　ｉ（Ｈ個々の抗原でコーティングした。

３７℃で２時間おき且つ４℃で一晩おいた後、前記抗原溶液を除去し、ビーズを 室温で６時間にわたりＴＮＮバッファ中％〈体積当たり重量〉のウシ血清アルブ ミンで飽和した。

次いで、コーティングしまたビーズをハイブリドーマ細胞培養上清の１＝２希釈 物と一緒に室温で一晩インキユベートし、蒸留水で数回洗浄し、ヨウ素１１２５ で標識したマウス抗イムノグロブリンＦ（ａｂ’）２フラグメントと一緒に３７ ℃で１時間インキュベートした。使用した希釈物はＴＮバッファ中のウシ血清ア ルブミン及び５０％ウシ胎児血清からなっていた、最後にビーズを洗浄し、ガン マ計数器で計数した。

前記上清は、ＭＩＣＨＥＬらにより（１９８４）Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ　ｌ　、＾ ｅａｄ、ｓｃｉ。

、ＵＳＡ、８１．７７０８−７７１２＞４：記載されテイル組換えＨＢｓＡｇ粒 子（フレ３２遺伝子及びＳ遺伝子の産物）、重合ヒト血清アルブミン（ｐＨＳ＾ ）及び重合ウシ血清アルブミン（ｐＢＳ＾）でコーティングしたビーズを用いる Ｒ＋八によるアッセイにもかけた。

抗原での拮抗阻害実験によって、自然の状態のウィルス又はペプチド抗原がウィ ルス及び合成ペプチドへのＦ３５．２５抗体の結合を阻害する効果を調べた。ウ ィルス又は遊離ペプチドの試料（２０ｕｇ／１１１　）を先ず、ハイブリドーマ 培養物の液体から精製した希釈モノクローナル抗体（０，２ｎＢ／ｍｌのマウス イムノグロブリンに相当）と−緒に３７℃で１時間予備インキュベートした。こ の混合物を、ブレＳ１領域の合成ペプチド（５μｇ）又はヒト血清から精製した ＨＢＶ粒子（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングしたウェルに移した。固相に結合 した七ノクローナル抗体の量を前述の方法で測定した。

４）ボ１　ローナル−宅ノ　ローナル　いる二　、ＲＩ＾ＤＡＳ−Ｒ１＾アッセ イ このＲＩ＾アッセイは、前述のＰＥＴＩＴら（１９８５）の方法で、慢性ＨＢｓ ＡｇキャリヤーのＢＢｓＡｇ陽性血清から精製したＨＢＶ粒子中のプレＳ１配列 の存在を調べるために行った。

このアッセイはＨＢｓＡｇ活性に間するプレＳ１エピトープの定量にも使用した 。

ポリスチレンビーズを、ＨＢｓＡｇに対するウサギポリクローナルＩｇ（：（前 出のＰＥＴＩＴらの文献（１９８８））により濃度２０１ｇ７１でコーティング し、１０倍ずつ希釈した一連のウィルス調製物（ｌｈｇ〜ＩＢ／ｍｌ）と−緒に インキュベートした。

室温で一晩インキユベートした後、ビーズを蒸留水で洗浄し、ハイブリドーマ培 養物の１＝２希釈物と一緒に３７℃で４時間インキュベートした。

次いで、プレＳ１に対して特異的なモノクローナル抗体Ｆ３５．２５の結合を、 ヨウ素ｌ１２ｓで標識したマウス抗イムノグロブリンのＦ（ａｂ’）２フラグメ ントと一緒に（３７℃で１時間）インキュベートすることにより検出した。使用 した希釈物はＴＮバッファ中５％のウシ血清アルブミンと５０％の正常ウサギ血 清とからなっていた。最後にビーズを洗浄し、その放射能を測定した。結果はヨ ウ素工１０で標識した抗体のｅｌ）ＩＩ（ｃｏｕｎｔｓ　ｐｅｒ　ｍ１ｎｕｔｅ ）で表す。

ＨＢＶの精製の最終ステップで、１０〜６０％スクロースの各勾配フラクション のアリコートをこの方法でスクリーニングした。その後ウィルス調製物を、Ｆ３ ５．２５抗体を有するプレＳ１配列に対してキャリプレートした。

プレＳ１領域に対して特異的なＨ＾１８／７（ＨＥＥＲＮＡＮＮら（１９８４） ）とＳ及びプレＳ２領域の特異的エピトープに対するモノクローナル抗体（ＰＥ ＴＩＴら（１９８７））とを並行使用して、吐しタンパク質のこれら３つの抗原 部分の間の量的関係を調べた。

Ｉｌ、結果 １）モノ　ローナル　Ｆ３５．２５のプレＳ１フ　イン。

一連のモノ特異的抗血清に対する免疫拡散によって、札＾Ｆ３５．２５は１．に １クラスの抗体に属することが判明した。

モノクローナル抗体Ｆ３５．Ｚ５のポリベアチド特異性は、ＨＢＶ（サブタイプ ａｄ）の慢性キャリヤーの血漿から精製したウィルス粒子の３つのエンベロープ 成分に対する反応性によって調べた。

スクロース勾配の最終的遠心分離ステップで得られた２種類の調製物、即ち（Ａ ）プレＳ２反応性を示すが検出可能なプレＳ１エピトープは含まない２２ｎｍの 球状ＨＢｓＡｇ粒子（３０％スクロース、第２図）と、（Ｂ　）　ＤＮＡポリメ ラーゼ活性及びＨＢＶ　ＤＮＡに関して陽性であり有意量（＞ｌｏｇ／ｍｌ）の プレＳ２及びプレＳ１エピトープ（４０％スクロース、第２ａ図）を有する４２ １−のＨＢＶ粒子とを選択した。第２ｂ図のＢに示すように、ＭＣ八へ３５．２ ５はＢＢＶの精製部分のプレＳ１タンパク質、Ｐ３９及びＧＰ４２にしか結合し ない、　ＣＰ４２はＰ３９より強く現れた。

Ｆ３５．２５はまた、６６．０００の成分とも反応する。一方、ＭＣ＾Ｆ３５． ２５とブレＳ２陽性欠陥ＨＢｓＡｇ粒子から誘導した総てのタンパク質（第２ｂ 図、Ａ）との間の反応、並びにヒト血清アルブミン（Ｈ８式）（第２ｂ図のＣ） 又はウィルスマーカーのない正常ヒト血清（ＮＩＩＳ）　（第２ｂ図のＤ）との 反応は観察されなかった。これと並行して、対照抗原をＩＩＢＶタンパク質の濃 度と類似の濃度（約２００ｕｇ／ｍｌ）で検査した。これらの結果は、Ｆ３５． ２５抗体がＨＢＶのｅｎｖ−タンパク質のプレＳ１領域に対して特異的であるこ とを示唆する（υヱタンパク質という表現は一般にＳタンパク質を示すのにも使 用される）、また、Ｆ３５．２５が６６．０００という極メチ大きな（ｖＬ）Ｈ Ｂｖタンハク質と反応するという事実は、ＮＨＳ中に存在するｌ（Ｓ＾タンパク 質とは異なるＨＢＶのＶＬ　ＨＢＶｓＡｇ成分上に特異的プレＳ１エピトー１が 存在することを証明するものである。

Ｆ３５．２５によって認識されるエピトープの正確な位置を、固相上のプレＳｌ に対して特異的な合成エピトープを用いてＲ１＾アッセイで調べた。　）ＩＢＶ サブタイプａｄｗ２のｅｎｖタンパク質のプレＳ１領域に対応するペプチドを選 択し、合成し、前述のように精製した（ＮＥＵＲＡＴＨら（１９８６））、プレ Ｓ配列の合成雇似体（１−２１）、（１２−３２＞、（３２−５３）、＜５３− ７３）及び（９４−１１７）を二抗体Ｒ１＾アッセイで使用したく第３図参照） 、第４ａ図に示すように、Ｆ３５．２５によって効果的に認識されたのはペプチ ドプレＳ　（３２−５３）だけである（Ｐ／Ｎ≧７０）０合成ペプチドプレＳ　 （９４−１１７）との間にも弱い反応が観察された。

これら２種類のペプチドは共通のＮ末端部分、即ちプロリン（位置３２及び９４ ）及びアラニン（位置３３及び９５）（第３図参照）を有する。　ＣＦＩＯ細胞 に由来する組換えＨＢｓＡｇ粒子（ＭＩＣＨＥＬら（１９８１））、血清から精 製した）ＩＢＶ粒子（サブタイプ杖）、並びにＩｓ＾、ｐＢＳ＾及びｐＨ３＾で コーティングしたウェルを用いる二抗体Ｒ１ｈも行ったところ、完全ウィルスの みへのＦ３５．２５の結合が有意な程度で観察された（Ｐ／Ｎ＝１３、第４ｂ図 ）。

これは、配列プレ５１（３２−５３＞に対するＭＣＡ　Ｆ３５．２５の厳密な１ １ＢＶ特異性を立証するものである。

以下の抗原、即ちブレＳペプチド＜３２−５３）と天然ブレＳ１抗原と１２ての 精製）ＩＢＶ粒子とを２０１１ｇ／ｍｌ用いた競合的結合の結果から、（ｉ）ブ レＳ　（３２−５３）領域がＦ３５．２５エピトープを含み、（ｉｉ）このよう なエピトープがウィルスの表面で発現されることが判明した。実際、Ｆ３５　、 ２５と天然Ｆ抗原（ＨＢＶ）との反応はブレＳ　（３２−５３）によって完全に 阻害されるが、別の配列ブレ５（１−２１，）によって阻害されることはない（ 第５ｂ図）、逆の観点からみると、阻害物質として使用したＨＢＶ粒子はブレＳ 　（３２−５３＞配列（第５ａ図）へのＦ３５．２５の結合を抑制する効果が極 めで高い〈〉７０％）。

ブレＳ１配列を検出する１ごめのＦ３５．２５（この抗体はペプチドブレ５（３ ２５３）又は自然状態のウィルスに結合している）の感度を決定するために、漸 減Ｊｉ（Ｉｎｇ〜０．１ａｇ＃ｆ）の精製特異的マウスＩｇＧを二重Ｒ１への液 相で使用したく図６）、ＨＢＶ及びペプチド抗原の検出限界はモノクローナルＩ ｇＧ１のｐｇＳ領域あり、したがって、Ｆ３５．２５は非常に窩い結合親和性含 有することが判明【７た。腹水から精製したモノクローナル抗体でも同様の結果 が得られた。

ｆｓｌ後に、１（ＢＶのｅｎｖタンパク質中でＦ３５．２５により認諾されるブ レＳ１エピトープのトポロジーを決定するために、精製ＨＢＶ粒子（亜型１）の 制限タンパク質分解による消化後のイムノトランスファーにより、Ｆ３５．２５ の反応性を調査した。

トリプシン又はプロテアーゼｖ８による抗原の処理は、先行技術（ＨＥＥＲＭ＾ ＮＮ他（１９８４＞、　ＰＥＴＩＴ他（１９８７））で使用された条件と異なる インキュベーション温度、緩衝液、ｐｉ（及び酵素基質比の明確に定義された条 件（即ちＬａｙ／ｗｉ抗原で酵素の最終濃度が２０ｙｇ７ｉｎとなるようにｐｉ ７．ｓの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中で３７℃で３時間の条件）下で行う、こ うしてタンパク質分解による切断の結果、Ｆ３５．２５と反応するペプチドが形 成される（図７）、トリプシンで切断することにより得られる分子量１３５００ 及び１４５００に対応する２つのタンパク質バンド（図７）はＦ３５．２５と強 く反応するが、ブレＳ２領域に特異的なモノクローナルＦ３７６（図７、レーン ５）及びＳ領域に特異的なモノクローナル抗体６−１６＾１５（ＣＯ１ｌＲＲＯ ＵＣＥ他（１９８３）＞（図７、レーン８）とは反応しないという事実に留意さ れたい。

これらのトリプシン産物は恐らく、ブレＳ１配列を９９位及び／又は１０３位と １１３位（図３参照）のアルギニン残基で切断することによりＰ３９及びＧＰ４ ２から生成されると思われる。したがって、Ｆ３５．２５により認識されるエピ トープはＮ末端領域のブレ５（３３）とＣ末端領域のブレＳ＜５３）〜ブレ５（ ９９）との間のブレＳ１配列に位置する。更に、トリプシンによる消化に対する ブレＳ２領域の感度を確認しな（ＳＴＩＢＢＥ及びＧＥＲＬＴＣＩＩ。

＜１９８３＞　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ、　５４．３ ３−４３；　ＨＥＥＲＭ＾ＮＮ他（１９８４）；　ＰＥＴＩＴ他（１９８７）） （図７、レーン５及び図７、レーン８）。ＨＢＶタンパク質をプロテアーゼｖ８ で処理後、Ｆ３５．２５は恐らくＳ遺伝子産物の２位のグルタミン酸残基（ＣＬ Ｕ−１７６）の切断により生成されたと考えられる分子量１６５００のフラグメ ント（図７、レーン３）に結合する（ＨＥＥＲＨＡＮＮ他（１９８４））。

プロテアーゼｖ８は更に、Ｆ３５．２５と反応する夫々分子量１５０００及び２ ９０００の２−）のフラグメントを生成する。これは。

（ｉ）ブレ８２領域でプロテアーゼにより恐らく別の切断があり、ブレＳ１配列 を含むより小さいフラグメ〉・トが形成されたこと、及び（ｉｉ）Ｓ遺伝子の配 列中のＧＬＵ−３３８Ｗ基に切断があったこと？示唆している。

この部位は実際にＨＢＶｌ１１７）υリータンパク質に予想さね−る二次ＩｌＩ 造で得られると思われる（ＮＥＵＲＡＴＨ他＜１９８７）、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌＳｃｉ、、４．４５−５１）。Ｍｆｆｌに、図７、し−ン６及び図７、レーン ９はプロテアーゼｖ８による消化に対するブレＳ２タンパク質（ＧＰ３３及びＧ Ｐ３６）の相対耐性を示す。

２）ヒト血゛から単　したＨＢＶ粒　におけるＦ３５．２５工ビト二乙］１皿 スクロース勾配の最終分画段階で、ＨＢＶ　ＤＮＡ及びコアの主要タンパク質Ｐ ２２ｃの存在（夫々ハイブリダイゼーション及びウェスタンプロットにより検出 される）により特徴付けられるＨＶ粗粒子４０〜５０％スクロースで６〜８のフ ラクションに検出されたく図８）。これらの陽性ＨＢｓＡｇフラクションを、　 Ｆ３５．２５により認識されるブレＳ１の特異的エピトープの存在に関して調査 した。

材料及び方法の項に既に記載したＤＡＳ−Ｒ１＾アッセイは、完全ピリオン中で Ｆ３５．２５エピトープを検出することができた（図８、フラクション６〜８． ４０〜５０％スクロース）。

ＨＢｓＡ８活性に対するアシＳ１配列の量は５０％程度であることが判明した。

したがって、　Ｆ３５．２５により認識されるエピトープの存在と完全ピリオン 中のＩＩＢＶ　ＤＮＡ及びタンパク質Ｐ２２ｃの存在との間には緊密な相関関係 がある。

更に、Ｎ製）ｉＢＶ　（亜型嵯又は吐）の７個のサンプルにおけるブレＳ１配列 の量を算出するためにＤＡＳ−Ｒ１＾アッセイを適用した。免疫感作のなめに使 用したＨＢＶ粒子はＨＢｓＡＧ亜型己である、　ＮＣＡ　Ｆ３５．２５はポリク ローナル抗ＨＢｓで被覆したビーズに結合したＨＢＶ　ａｄ及びｌ１ＢＶ症と強 く反応した（図９）、一方、ＭＣＡ　Ｆ３５．２５はＨＢＶ亜型ａｄ＜７）　７ 　Ｌ／　Ｓｌ配列を好適に認識すると思われる。ＨＢｓＡＨに対するプレＳ１配 列の割合は亜型眩のＨＢＶサンプルでは５０％程度、亜型法のＩＩＢＶサンプル で１０〜２０％に過ぎないことが判明した。この差はＭＣＡ　Ｆ３５．２５の相 対ａｄ％異性によるものと考えられる。

他方、亜型■工のＨＢＶ粒子で免疫怒作することにより得られるＭＣＡ　Ｍ＾１ ８／７は亜型四の粒子と同様に亜型市の粒子とも反応する。ブレＳｌ　（３２− ３８）配列の内側に含まれ、亜型は及び吐により異なる固有のアミノ酸は３５位 に位置し、この３５位のアミノ酸は亜型はではグリシンに対応し、亜型症ではア ルギニンに対応する。３５位のグリシンをアルギニンにより置換すると、肝細胞 レセプターとの結合に関与するプレ５（２１−４７）配列の内側にトリプシンに よる別の切断部位が形成される。従って、ＭＣＡ　Ｆ３５．２５の相対亜型特異 性はトリプシン型の酵素の作用により生じる亜型リーのＨＢＶのブレＳ１配列の Ｎ末端の損失によると考えられる。このことから、亜型症（例えばＲＥ、ＢＡＹ 、ＰＥＹ）の粒子が亜型ａｄ（例えばＬＩＳ／８８及びＬＡＮ）の粒子よりも著 しく不安定であることを説明できる。

従って、ＭＣＡ　Ｆ３５．２５はＩｊ型の肝細胞との結合機序に関与するグリシ ン（３５〉を含むエピトープブレ５（３２−５３）との間にｉｎ　ｖｉｔｒｏで 検出可能な免疫複合体を形成することができるので、ＢＢＶの感染性の良好なマ ーカーを構成する。

ＭＣＡ　Ｎ＾１８／７は配列プレ５（３８−１２１）に特異的であるので３５位 にグリシンを含む領域を認識せず、従って、ＭＣＡ　Ｆ３５．２５はど良好な循 環ＨＢｖの感染性マーカーではない。

慢性Ｂ型肝炎に罹患した個体の血清中の中Ｓ及び主要Ｓタンパク質に対する大Ｓ タンパク質の割合のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出のために本発明の方法を実施した処、 次のような結果が得られた。

１）活発なウィルス複製（個体の血清中におけるＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＨＢＶ 　ＤＮＡ及びヌクレオキャプシドの抗原であるＨＢｅの存在に対応）を検出する ことができた症候性慢性キャリヤーの個体グループにおいては、本発明の方法に より、−このグループの個体の３６％において、大Ｓタンパク質の量は中Ｓタン パク質の量よりも多く、これら２種のＳタンパク質は該個体の血清中に含まれる Ｓタンパク質の夫々的３５〜４０％及び２０％に相当し、 一二のグループの個体の４５％において、大Ｓタンパク質の量は中Ｓタンパク質 の量よりも少なく、これらの２種のＳタンパク質は該個体の血清中に存在するＳ タンパク質の夫々２５％及び５０％に相当し、 一二のグループの個体の１８％において、大Ｓタンパク質の量は中Ｓタンパク質 の量にほぼ等しく、これらの２種のタンパク質は該個体の血清中に存在するＳタ ンパク質の量の約２５％に相当することが判明した。

このグループの２個体は快方に向かった。一方は抗ＨＢｅ抗体を発現した個体で あり、他方はインターフェロンによる治療を受けた個体であり、両者ともＭＣＡ 　Ｆ３５．２５により大Ｓタンパク質を検出することはできず、Ｓタンパク質の 量は６０％減少し、検出された中Ｓタンパク質の量はこれらの２個体の血清中に 存在するＳタンパク質の約５５％であった。

２）ウィルス複製（ＨＢＶ　ＤＮＡ）を血清中に検出できるか又はできず且つ抗 ＨＢｅ抗体を有する症候性キャリヤーの個体グループ（以下、グループ■と呼称 する）で調査した結果、−これらの個体の８０％において、大Ｓタンパク質の量 は中Ｓタンパク質の量よりも著しく少なく、これらの２種のタンパク質は該個体 の血清中に含まれるＳタンパク質の夫々１５％及び４０％に相当し、 −これらの個体の２０％において、大Ｓタンパク質は検出することができず、検 出された中Ｓタンパク質はこれらの個体の血清中に含まれるＳタンパク質の約３ ５％であった。

この同一個体グループにおいて、ＤＮＡ増幅技術（ＰＣＲ技術）を実施するとＩ ＩＢＶ　ＤＮＡを検出できた（ウィルス複製の低レベルに対応）が、個体の２０ ％では［ｌＢＶ　ＤＮＡを検出できなかったという点に留意されたい、従って、 これらの２種の方法により得られる結果の間には良好な相関間係が存在すると思 われ、ＤＮＡ増幅方法は実施平原が複雑であるので、本発明の方法のほうが有利 である。

３）ウィルス複製が検出されず、抗ＨＢｅ抗体のキャリヤーである非症候性キャ リヤー（「健康」キャリヤーに同じ）のグループで調査した処、 −このグループの個体の２５％ではＳタンパク質は検出されず、 −このグループの個体の１８％では主要Ｓタンパク質のみが検出され、 一二のグループの個体の４６％では大Ｓタンパク質は検出されず、検出された中 Ｓタンパク質の量はこれらの個体の血清中に存在するＳタンパク質の約５０％で あった。

ラジオイムノアッセイ（ＲＩ＾）に従い、１）ＦＩＢＶのエンベロープの主要成 分により）ＩＢＶのＨＢｓＡｇ粒子をトラップするために固相に固定した抗ＨＢ ｓポリクローナル抗体を使用し、 ２）ＨＢｓＡｇ活性又は関連するエピトープブレＳ２もしくはブレＳ１を選択的 に検出するためにモノクローナル抗体を使用し、３）”Ｊで標識したマウス抗イ ムノグロブリンのＦ（ａｂ”）フラグメントを使用することにより、慢性ＨＢｓ Ａｇキャリヤーの血清中のブレＳ抗原、即ち大Ｓタンパク質（ブレＳ１＾ｇに同 じ）と、中Ｓタンパク質（ブレＳ２＾ｇに同じ）との発現の臨床的意味をより詳 細に調査した。

ａ）材料及び方法 Ｗ ΔＢＢＯＴＴ　Ｌａｂｏｒａｔｉｒｉｅｓ（イリノワ州、シカゴ）により市販さ れているＲＴ＾アッセイキットを使用して慣用血清スクリーニングに基づいて３ ９人の慢性ＨＢｓＡｇキャリヤーのグループを選択した。これらの患者のうちで Δ型肝炎ウィルスに対する抗体を有する者は皆無であった。市販のＲ１八キット （八ＢＢＯＴＴ　Ｌａｂｏｒａｔｉｒｉｅｓ）を用いてＨＢｅＡｇ及び抗ＨＢｅ 抗体を決定した。５ＣＯＴＴＯＪ、他、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　（１９８３）； 　３：２７９−２８４により記載されているハイブリダイゼーション技術により 血清中のＨＢＶ　ＤＮＡを測定した。この方法はｏ、１μｇのＨＢＶ　ＤＮＡを 検出することができる。一部の患者から採取した新鮮な状態で冷凍した肝生検を 、ＦＩＢｃＡｇを検出するための免疫蛍光法（ＩＦ）により分析した。使用した ＩＦ法はＴＲＥＰＯＣ，他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、　（１９７６ ）；７１：　８０４−８０８により詳細に記載されている。臨床学的、血清学的 及び組織学的分析により診断を行った（ＣＡＨは慢性活動性肝炎に対応し、ＣＰ ）Ｉは慢性持続性肝炎ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔ ｉｓ及び肝硬変に対応する）。

先の調査の３グループを分類するために使用したと同一の基準に従って３９の事 例を３グループに分類した。

１）グループ■は血清中にｌ！ＢｅＡｇ（即ちＨＢｅ陽性）及びＨＢＶ　ＤＮＡ を示す１１人の患者（２８，２％）から構成した。

２）グループ■は抗ＨＢｅ抗体（即ち抗ＨＢｅ陽性）及び肝臓に関連する持続的 病理活性を示し、１８ｖＤＮ＾を検出できるか又はできない８人の患者（２０， ５％）から構成した。

３）グループ■はＨＢｓＡｇのキャリヤーであり、肝機能試験が正常であり、抗 ＨＢｅ抗体を示すが、血清中にＨＢＶの複製を検出することができなかった２０ 人の患者（５１，３％）から構成した。

ＨＢＶを含まない正常ヒト血清を陰性対照として使用した。

ＨＢＶによる急性悪染後に抗ＨＢｓ抗体を発現した８人の患者も同時に試験した 。

一、ｌ？Ｉ　Ｏ−１’ｙ−ノ　ロー　ルＲＩＡ　Ｐａｂ−Ｍａｂに゛　のＨＢｓ ＾　ブレＳ　の 血清中のＨＢｓＡｇ活性に関連するブレＳ１及びブレＳ２エピトープの正確な定 量のためにＲＴ＾アッセイを行った。ポリスチレンビーズ（ＮＯＲＴＨＵＭＢＲ ＩＡ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ、英国、ノーサンプリア）を濃度１０ｕｙ／ｉｆ の血清中のＨＢｓＡｇに対するウサギポリクローナルイムノグロブリン（ＰＥＴ ＩＴ他（１９８６））で被覆し、ＴＮ［衝液（０，ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 　０．１４８　ＮａＣ１，ｐＨ７，２）中の５ｗ／ｖ％ウジ血清アルブミンで飽 和した。次に抗ＨＢｓ抗体で被覆したビーズにヒト血清サンプルの１０−１〜１ ０−”逐次希釈液を加えた。室温で一晩インキュベーション後、ビーズを蒸留水 で洗い、モノクローナル抗体と共に４時間３７℃でインキュベートした。　ＨＢ ｓに特異的（即ち主要Ｓタンパク質に特異的）な上記モノクローナル抗体Ｆ３９ ．２０を使用することにより）ＩＢＳＡｌｌを決定した。上記ブレＳ２に特異的 なモノクローナル抗体Ｆ１２４を使用することにより又はブレＳ１に特異的なモ ノクローナル抗体（即ち肝細胞のＨＢＶレセプターに対するモノクローナル抗体 Ｆ３５．２５＞を使用することによりブレＳ抗原を検出した。　Ｆ３９．２０及 びＦ１２４を腹水から不完全に精製したＧイムノグロブリンとして５μｇ／ｗ１ の濃度で使用した。　Ｆ３５゜２５はハイブリドーマ培養液の１：１希釈液とし て使用した。

＋２ｓＩで標識したマウス抗イムノグロブリンのＦ（ａｂ’＞２７ラグメント（ 八ＭＥＲ５ＲＡＭ　、フランス、Ｌｅｓ　Ｕｌｉｓ）と共にインキュベート（３ ７℃で１時間）することにより特異的モノクローナル抗体の結合を検出した。上 記に使用した希釈剤はＴＮｉｆ衝液中の５０％正常ウサギ血清、５％ウシ血清ア ルブミンから構成した。ビーズを洗浄し、放射活性をγカウンターで測定した。

結果を１２５１で標識した結合抗体のｃｐｓ（カウント毎分）で表した。血清中 のＨＢＶエンベロープの３つの抗原特異性（Ｓ。

ブレＳ２及びブレＳｌ）の間の定量比を決定するために、力価の決定と行い、１ 〇−又は１０−２の血清希釈液でブレＳ１＾ｇ／ＨＢｓＡｇ及びプレＳ２＾ｇ／ ＨＢｓＡｇ比を計算した。

ｂ）結果 −Ｆ３５．２５のエピトープの　Ｊ　′　の６　ビリ　ンの夜よ！日Ｕ」 低速で第１の遠心（５００００ｘ　ｇで４時間）後、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶＤＮ ＾を含有するＨＢｓＡｇ　（亜型ａｄ）の慢性キャリヤーの血清を、１０〜６０ ％の線形スクロース勾配中で２０００００　ｘ　ｇで１８時間の遠心を最終段階 とする一連の超遠心にかけた。フラクションを回収し、上記ＰＡｂ−ＭＡｂ　Ｒ １＾技術を使用してＦＩＢｓに特異的なモノクローナル抗体Ｆ３９．２０及びプ レＳ１に特異的なモノクローナル抗体Ｆ３５．２５でアッセイした。

１１ＢＶ　ＤＮＡ及びそのコアの主要タンパク質Ｐ２Ｚｃの同時検出（夫々ハイ ブリダイゼーション及びイムノブロッティング技術により検出される）により特 徴付けられる完全ピリオンは、４０〜５０％スクロースの遠心バンドに対応する フラクション６〜８に見出された。この結果から明らかなように、モノクローナ ル抗体Ｆ３５．２５によるプレＳ１に特異的なエピトープの検出は血清中の怒染 性ＨＢＶの存在に密接に関連する。より低濃度（〈３０％）のスクロースに対応 する全フラクションはＨＢＶのプレＳ１の肝細胞レセプターを含まない。

−ＨＢｓ＾の１　ヤ１ヤーにお番るプレＳ１の　レセブーエピトープＦ３５．２ ５　びプレｍ、エピトープＦ１２４の　：　゛　のＨＢＶ　ＤＮＡ　ＨＢｃ＾　 びＨＢｅｌとの　゛ＨＢｓＡｇ粒子を保有する（即ちＨＢｓＡｇ陽性）１９人の 慢性肝疾患患者のうち１３人（即ち６８．４％）がｌ’ｌＢＶ　ＤＮＡのキャリ ヤー（即ちＩｆＢＶ−ＤＮＡ陽性）であり、これらの１３人の患者はグループＩ のＨＢｅＡｇ患者の全てに相当したが、グループＨの８人の抗ＨＢｅ患者のうち では２人だけであった（表■）、グループ■では６人（即ち７５％）が狂的ＨＢ ｅＡｇを有する。

１９人の慢性肝疾患患者のうち、ＨＢＶのプレＳ１の肝細胞レセプター（エピト ープｐ３５．２５）は１７人（即ち８９，５％）で検出され、これらのＦ３５． ２５エピトープは全ＦＩＢｅＡｇ陽性患者と、８人の抗ＨＢｅ陽性恵者のうちの ６人（７５％）に検出された。グループ■では２人（２５％）だけがブレＳ１抗 原に関して陰性であった。これらの２人の患者の一方は狂的ＨＢｃＡｇに関して も陰性であることが観察された。

他方、１（ＢＶのプレＳ１の肝細胞レセプターは、抗ＨＢｅ陽性ＨＢｓＡｇの２ ０人の健康キャリヤー（グループ■）のうち１８人（９０％）で検出されなかっ た。

プレＳ２抗原（エピトープＦ１２４）は、慢性肝疾患を示す）ＩＢｓＡｇ陽性患 者（グループ■及び■）から採取した全血清サンプル（１９人中１９人、１００ ％）及び抗ＨＢｅ抗体を有する２０人のＨＢｓＡｇキャリヤー（グループ■）の うちの１５人（７５％）に検出された。

急性Ｂ型肝炎に罹患後に抗ＨＢｓ血清変換を受けた全患者（８人中８人）はプレ Ｓ１及びブレＳ２抗原並びに血清中にＩＩＢＶマーカーを含まない正常ヒト血清 に関して陰性であることが判明した。

表Ｉに示すように、１（ＢＶのＰｒｅ−Ｓｔの肝細胞レセプターに関して陽性の １９人の患者のうち１３人（即ち６８．４％）が血清中の環状１（ＢＶ　ＤＮＡ を示し、１７人（即ち８９．５％）が狂的ＨＢｃＡｇを示し、１１人（即ち５７ ．９％）がＨＢｃＡｇと反応する。したがって、ＨＢｓＡｇ慢性キャリヤーの血 清中ＨＢＶのプレＳ１抗原の発現は、ＨＢＶ複製の２つの最も直接的なマーカー （血清中のＨＢＶ　ＤＮＡ及びＨＢｃＡｇの肝細胞発現）と、ＨＢｅＡｇ／抗Ｈ Ｂｅ系に有効に相関され得る（Ｐ＜　０．００１）、これに対して、ブレＳ２八 ｇ抗原の発現はＨＢｓＡｇタンパク質の連続産生に続くと思われ、血清中のＨＢ ＶＤＮ＾、狂的ＨＢｃＡｇ及びｌＢｅ系との間に有効な相関を示さない（Ｐ＞　 ０．５）　。

＠　ｌ　：　）ｌＢｓＡｇの慢性キャリヤーにおけるプレＳ１の肝細胞レセプタ ー（エピトープＦ３５．２５）及び７’Ｌ／Ｓ２抗Ｎ（エヒト−７Ｆ１２４）（ ７）検出：血清中ノｆ（ＢＶ　ＤＮＡ、狂的ＨＢｅＡｇ及び［ｌＢｅ系との相関 々のグループのＨＢｓＡ　の　におけるＨＢｓＡ　びプレＳ　の 図１０に示した結果は、ＨＢｅＡｇ陽性患者における２（ＢｓＡｇ及びプレＳｌ Ａｇの力価（図１０Ａでそれぞれ１・１０８及び１：１０Ｊが、抗ＨＢｅ陽性患 者く図１０Ｂでそれぞれ１：１０’及び１：１０２）におけるよりも高いことを 示している。グループＩにおいて１１人中５人の患者（即ち４５％）（図１ＯＡ の血清７６１６）は比較的低いブレＳ２抗原力価（１：１０’）を示し、一方６ 人（５５％）は最高１：１０’までの高いプレＳ２Ａｇ力価を示したく図１０Ａ の血清７９３６）ことに留意されたい、グループ■及び丁においては（図１０Ｂ の血清７１０６及び図１０Ｃの血清８５３５）、ＨＢｓＡｇ及びプレＳ２Ａｇの 力価はそれぞれ１：１０’及び１：１０’であった。即ち、プレＳ２Ａｇに対し て陽性を示した患者３４人中２７人（耶ち７９．４％）においてプレＳ２Ａｇの 力価はＨＢｓＡｇの力価と同様であった。グループ■においては２０人中５人（ 即ち２５％）の患者が、ＨＢｓＡｇにのみ力価１；１０ｓで反応したく図１０Ｃ の血清Ｈ３Ｏ５）、２０人中２人の患者（即ち１０％）のみ２つの抗原プレＳ２ Ａｇ及びプレＳｌＡｇに陽性を示したが、力価は最高で１：１０２と低く（図１ ０Ｃの血清Ｈ３９）、一方ＨＢｓＡｇの力価は１：１０５であった。

ＨＢＶに　感　にお番　プレｓ１の　レセスの　の 図１１には、３つのグループにおける血清（図１ｏ参照）を１０−１倍に希釈し たものに対して計算したプレＳｌＡｇ／ＨＢｓＡｇ及びプレＳ　２　Ａ　ｇ　／ 　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇの比を示す。

グループ■においては１１人中５人（即ち４５％）は、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ　 ＤＮＡを含む同じＨＢＶ血清型を示した残りの６人の患者よりも低いプレＳ　２ 　Ａ　ｇ　／　ＨＢ　ｓ　Ａｇ比（３５％）を示した。このサブグループを除き 、プレＳ　２　／　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ比は高いく６０％）ことが検出され、グル ープ１．２または３に属するプレＳ２陽性患者３４人中２７人（即ち７９．４％ ）において有意な差はなかった。

この結果は、プレＳ　２　Ａ　ｇ　／　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ比を、ウィルス複製の レベル、即ちＨＢＶによる慢性感染の際の相対感染度の信頼性のある指標とは見 なし得ないことを示唆する。

これとは対照的に、ブレＳｌＡｇ／ＨＢｓＡｇ比は、ウィルス複製が活発なグル ープＩのＨＢｅＡｇ陽性患者（約５０％）及び肝レベルで病因論的活性を表わす が血清中のＨＢＶ？！製のレベルは低いグループ■の抗ＨＢｅ陽性患者（約２０ ％）においてより高かった。この比は、ＨＢｓＡｇ及びプレＳ２Ａｇに対して陽 性であったがＨＢＶ複製も肝臓の疾病も示さなかったグループ■の健康な保因者 の１５患者中１３人（即ち８９％）の患者においては極めて小さかった。即ち、 プレＳｌＡｇ／ＨＢｓＡｇ比は実際にＨＢＶ複製と相関間係があると見られる。

有利なことに本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法によって、種々のグループのＨ ＢＶの慢性保因者を区別すること、及び、３つの抗原特異性（Ｓ、プレＳ１及び プレＳ２）の発現を同じ感度で比較することが可能となる。

前述の結果は、上記ＰＡｂ−ＭＡｂ　ＲＩＡ系による血清中のプレＳｌＡｇの検 出は、ＨＢＶ　ＤＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼが血清中で検出不可能である場合 でさえも、肝臓におけるＨＢｅＡｇの存在と相関性があることを示している。結 果として、プレＳｌＡｇは、ＨＢＶによる慢性感染の際のＨＢＶ複製レベルの特 異的マーカーである。

抗ＨＢｅ抗体を示す慢性肝炎の患者の血清中のプレＳｌＡｇ及び肝臓中のＨＢｅ Ａｇの存在の確認は、−組織中でウィルス複製が行われていること、一完全ビリ オンが血清中に遊離され続けていること、〜血清中に存在する）ＩＢＶ　ＤＮＡ の量が少な過ぎて従来のハイブリダイゼーション法では検出されないことを示唆 する。

更に前述の結果は、ＨＢｓＡｇの慢性の症候及び無症候保因者のほとんど（８７ ，２％）にプレＳ２Ａｇが存在することを示している。健康な保因者（グループ ■）に検出されたプレＳ　２　Ａ　ｇ　／　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ比にもグループ■ 及び■の患者のものと有意な差は見られず、ＨＢＶによる慢性感染の種々の段階 で高い値を維持する（最高６０％）。このことは、ＨＢｓＡｇの健康な保因者に おいてさえブレＳ２Ａｇタンパク質が連続的に合成されていることを示す。

以上に詳細分記載した図面は次の通りであるニー図１：ＨＢＶの構造、構成要素 及び細胞ウィルス相互作用の概略図、Ｒ１は、プレＳ１配列の介在によるＨＢＶ への直接結合に関与する細胞レセプタであり、Ｒ２は、グルタルアルデヒドロ　 ｉ（Ｓ　Ａに対するウィルスレセプタを担うブレＳ２配列の介在によるＨＢＶ及 びＨＢｓＡｇへの間接結合に恐らく関与するｐ　（Ｈ３Ａ）に対する細胞レセプ 夕である。

一図２二図２ａ；ＨＢｓＡｇ粒子（Ａ）及びヒト血清から精製し且つ図２ｂにお いて抗原プローブとして使用したＨＢＶ調製物（Ｂ）における配列Ｓ、プレＳ２ 及びプレＳ１のラジオイムノアッセイ、抗ＨＢｓ抗体で被覆したビーズをＨＢｓ ＡｇまたはＨＢＶの減量濃度勾配の存在下に置き、結合した抗原を、Ｓ領域に特 異的なモノクローナル抗体Ｆ３９．２０（・−・）、プレＳ２領域に特異的なモ ノクローナル抗体Ｆ１２４（ムーム）及びプレ８１領域に特異的なモノクローナ ル抗体ＭＡ１８／７（■−■）を（終濃度５μｇ　／　ｍ　ｌで）使用すること により検出した０図２ｂ；イムノプロット（ウェスタンプロット）法によるＦ３ ５．２５抗体のポリペプチド特異性、Ａ、ＨＢｓ／プレＳ２血清；Ｂ、ＨＢｓ／ Ｂｓ／プレＳ２／プレＳｌ（ＨＢＶ）血清；　Ｃ，Ｈ３Ａ　（２００ｇｇ／ｍ　 Ｉ　）　；　Ｄ、ＮＨ３（１：　５００に希釈）０図２ｂと同様に、図２ａにお けるモノクローナル抗体の結合を、１１２５標識マウス抗イムノグロブリンのＦ （ａｂ’）２フラグメントによって決定した（１ビーズまたは１ゲルバンド当た り約１０’ｃｐｍ）。

−Ｉ２１１３　：　ＨＢＶの５つの抗原亜型に対応する大表面タンパク質Ｐ３９ 及びＧＰ４２の領域プレ５（２１〜５３）及びプレ５（９４〜１１７）の（ＨＢ Ｖ　ＤＮＡの配列の一部から誘導した）アミノ酸配列、Ｆ３５．２５によって認 識されるエピトープの部位も図中に示されている。５つの亜型に共通のアミノ酸 残基を、これらアミノ酸の各々の下方に小さな黒点で示しである。実線で囲んだ ジペプチドＰＡは、恐ら＜Ｆ３５．２５抗体の結合に必要とされるものである。

破線で囲んだアミノ酸４０〜４７に広がるペプチド配列（ＮＰＤＷＤＰＮＰ）は 、全てのＨＢＶサブにおいてＦ３５．２５抗体の結合部位内に保存されている。

Ｔは、完全ＨＢＶ粒子中のトリプシンによる切断の許容部位を表わす。

一図４＝２倍に希釈したＦ３５．２５（約Ｌｏｎｇ／ｍｌ）を含むハイブリドー マ液を用いて実施した二抗体ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）。図４ａ：領域プ レＳ１の１〜２１．１２〜３２．３２〜５３．５３〜７３．９４〜１１７に特異 的なペプチドを使用してビーズを被覆した。合成ペプチドで被覆したビーズに結 合したＦ３５．２５を、図２に記載したごと＜工１２５標識マウス抗イムノグロ ブリンを用いて検出した０図４ｂ；ＣＨＯＭ換え細胞における組換えによって得 られたプレＳ２配列を含むＨＢｓＡｇ粒子、精製ＨＢＶ粒子、Ｈ３Ａ、ｐＢＳＡ 及びｐＨ５Ａを使フは２つの定量値を表わす。

一図５＝プレ５（３２〜５３）（図５ａ）またはＨＢＶ亜型ａｄ（図５ｂ）のい ずれかで被覆したウェルへのＭＣＡ　Ｆ３５．２５の結合に及ぼす（終濃度２０ μｓ／ｍｌでの）プレＳ１領域及び精製ＨＢＶ粒子に特異的なペプチドの阻害効 果、この実験の条件は、図４のごとく２倍に希釈したハイブリドーマ液を使用す る材料と方法のセクションに記載の通りである。

一図６＝ペプチドプレ５（３２〜５３）及び精製ＨＢ■粒子におけるブレＳ１配 列を検出するためのＭＣＡ　Ｆ３５．２５の怒度、ペプチド　プレ５（３２〜５ ３）（・）５μｇ／ｍ＋またはＨＢＶ亜型ａｄ（ム）（１０μｇ／ｍｌ）のいず れかで被覆したウェルを、ハイブリドーマ細胞の上清から精製したＦ３５．２５ の減量濃度勾配の存在下に置いた。

一図７：ＭＣＡ　Ｆ３５．２５＜ａ）、プレＳ２領域に特異的なモノクローナル 抗体Ｆ３７６　（ｂ）及びＳ領域に特異的な抗体６〜１６　Ａ１５（ｃ）のｅｎ ｖタンパク質への結合に及ぼすトリプシンまたはプロテアーゼＶ８による精製Ｈ ＢＶ粒子（亜型■）の消化作用（イムノブロッティング法使用）、抗原の処理は 、材料と方法のセクションに記載のごと〈実施した。レーン１．４及び７は酵素 を含まない対照を表わし、レーン２．５及び８はトリプシンによる消化産物を表 わし、レーン３．６及び９はプロテアーゼＶ８による消化産物を表わす、レーン １〜３は１：２に希釈したハイブリドーマ上滑でプローブし、レーン４〜９は、 腹水から精製したモノクローナル抗体５μｇ／ｍｌでプローブした。移入タンパ ク質に結合した抗体を工１２５標識マウス抗イムノグロブリンで検出した。ペプ チドの分子量（ＸＩＯ’）を左側に示す。

−７８二ＨＢＶ粒子（亜型■）のスクロース勾配、ウィルスに豊富に含まれる物 質１ｍｌをＴＮ緩衝液中の１０〜６０％のスクロース直線濃度勾配において１６ ０，０００ｇ、４℃で１８時間沈澱させた。フラクションを回収し、抗ＨＢｓウ サギポリクローナル抗体を担う固相を使用しての二特異抗体ラジオイムノアッセ イにより、ＭＣＡ　Ｆ３９．２０（−・−）またはＭＣＡ　Ｆ３５．２５（−ｍ −）について解析した。スクロース濃度（−〇−）は屈折によって決定した。フ ラクション６〜８（スクロース４０〜５０％）のＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ含有量を ハイブリダイゼーションによって、コア主要タンパク質Ｐ２２ｃ含有ｉをイムノ トランスファー（＋）によって試験した。

−図９：固体表面に抗ＨＢｓイムノグロブリン及び露出表面にＦ３５．２５抗体 を用いた二特異抗体ラジオイムノアッセイ系による単離）（ＢＶ粗粒子亜型葺ま たは主ヱ）における配列ブレＳｌ　（３２〜５３）の検出、精製ＨＢＶ粒子は濃 度１μｇ　／　ｍ　＋で使用した。１１２５標識マウス抗イムノグロブリンのＦ 　（ａｂ’）ｚフラグメントを用いてＦ３５．２５の結合を検出した。

一図１０二種々のグループのＨＢｓＡｇの慢性保因者におけるＨＢｓＡｇ及びブ レＳ抗原の定量分析、ＨＢｓＡｇ（主要Ｓタンパク質）（〜・−・−）、ブレＳ １肝細胞レセプタ（−ローロー）；ブレＳ２抗原（−０−○−）。前述のＰＡｂ −ＭＡｂラジオイムノアッセイに従ってアッセイを実施した。

−７１１＝慢性Ｂ型肝炎の患者におけるブレＳ１肝細胞レセプタの発現の臨床的 重要性、１０−２倍（図１０Ｂ及び図）　ＩＯＣ参照）または１０１倍（図１０ Ａ参照）に希釈した血清に対して、アレＳ　Ｉ　Ａ　ｇ　／　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ 比（黒色で示した棒グラフ）とブレＳ　２　Ａ　ｇ　／　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ比（ 灰色で示した棒グラフ）とを計算した。グループ■；慢性肝疾患を表わすＨＢｅ Ａｇ及びＨＢＶ　ＤＮＡ陽性患者、グループ■；慢性肝疾患を表わす抗ＨＢｅ陽 性患者、グループ■：抗ＨＢｅ陽性の健康な保因者、慢性Ｂ型肝炎の種々のウィ ルス学的段階の間数として、プレＳｌＡｇ／ＨＢｓＡｇ比（−）及びブレＳ２Ａ ｇ／ＨＢｓＡｇ　（−−−）比は変化する。

抗原濃度 Ｆ３５．２５　Ｆ３７６　６−１６Ａ１５モノクローナル抗体 分画数 患者数：５／１１　６／１１　６／ｓ　１３／２０（％ｔｏｔａｌ）　（４５％ ）　（５５％）（７５％）（６５％）Ｆｉｇｕｒｅ　１１ 国際調査報告 一−−−鋪噛−”−ＰＣＴ／ＦＲ８９１００５１７−−−−−−−−−ＰＣＴ／ ＦＲ８９１００５１７国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の諸特性、即ち： −ブレＳ１領域の３２位〜５３位に存在するアミノ酸中に含まれるエピトープ、 ＨＢＶの大エンベロープタンパク質のブレＳ１領域、ＨＢＶの大エンベロープタ ンパク質、Ｐ３９及びＧＰ４２、ＨＢＶの大Ｓタンパク質をトリプシンで消化し て得られた分子量１３，５００及び１４，５００を夫々有するＨＢＶの大Ｓタン パク質のプレＳ１領域の各開裂産物、 と共に免疫複合体を形成する特性、及び、−ＨＢＶの中エンベロープ（糖）タン パク質、ＧＰ３３及びＧＰ３６、 ＨＢＶの主要エンベロープ（糖）タンパク質、Ｐ２４及びＧＰ２７、 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、 重合ヒト血清アルブミン（ｐＨＳＡ）、イムノグロブリンＧ、Ａ及びＭ、 ＨＢＶ非感染個体の種々の血清成分、 と共に免疫複合体を形成しない特性の組み合わせによって定義されることを特徴 とするモノクローナル抗体。
2. ２．以下の諸特性、即ち、 −ＩｇＧ１クラスに属する特性、 −６６ｋｄ（キロダルトン）のＨＢＶの極大エンベロープタンパク質、 ＨＢＶの大Ｓタンパク質をＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のプロテアーゼＶ８で消化する ことによって得られた分子量１５，０００、１６，５００及び２９，０００を夫 々有するＨＢＶの大Ｓタンパク質の各開裂産物、 と共に免疫複合体を形成する特性によって定義されることを特徴とする請求項１ に記載のモノクローナル抗体。
3. ３．１９８８年８月５日、受託番号Ｉ−７９６でＮ，Ｃ．Ｃ．Ｍ．に寄託された ハイブリドーマによって分泌されることを特徴とするモノクローナル抗体。
4. ４．請求項１に記載のモノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリ ドーマ。
5. ５．請求項１に記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製及び 単離方法であって、−ＨＢＶ粒子で免疫した動物の脾細胞とミエローマ細胞とを ハイブリドーマ形成可能条件下に融合させ、−請求項１に記載のモノクローナル 抗体の諸特性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを検出し回 収することを特徴とする方法。
6. ６．ＨＢＶ感染個体から採取された生物サンプル中でＨＢＶの大Ｓエンベロープ タンパク質の有無をｉｎｖｉｔｒｏ検出する方法であって、 −大Ｓタンパク質のブレＳ１領域と請求項１に記載のモノクローナル抗体との免 疫複合体が形成され得る条件下に前記生物サンプルと前記モノクローナル抗体と を接触させ、−前記免疫複合体を検出する段階を含むことを特徴とする方法。
7. ７．特に、 −ＨＢＶのＳエンベロープタンパク質のＳ領域との免疫反応を生じ得る抗体、好 ましくはポリクローナル抗体を固体支持体に結合させる、 −支持体を洗浄し、支持体に結合しなかった前記抗体を除去する、 −特に血清などの生物サンプルを支持体に、前記ポリクロ−ナル抗体と前記血清 に含まれる見込みのＳタンパク質との免疫複合体が形成され得る条件下に添加す る、−支持体を洗浄し、前記抗体によって認識されなかった前記血清の種々の成 分を除去する、 −支持体に請求項１に記載のモノクローナル抗体を、該モノクローナル抗体と、 前段階で形成された免疫複合体に結合したプレＳ１領域を含むＳタンパク質との 免疫複合体が形成され得る条件下に添加する、 −支持体を洗浄し、大Ｓタンパク質のプレＳ１領域との免疫反応に参加しなかっ たモノクローナル抗体を除去する、−前記モノクローナル抗体との免疫複合体を 形成し得る標識アンチイムノグロブリンを支持体に、このアンチイムノグロブリ ンと前段階で形成された免疫複合体に結合したモノクローナル抗体との間で最終 免疫複合体が形成され得る条件下に添加する、 −前記最終免疫複合体に結合した標識アンチイムノグロブリンの量を検出し、こ の量を前記血清中に存在する大Ｓタンパク質の量と相関させる、 段階を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
8. ８．Ｂ型肝炎患者から採取した生物サンプル中に存在する主要Ｓタンパク質に対 する大Ｓタンパク質の割合をｉｎｖｉｔｒｏ検出するために、 −請求項７に記載の方法を実施すること、及び、−請求項７に記載の方法と同じ 段階を含み、請求項１に記載のモノクローナル抗体に代えて、主要Ｓタンパク質 との免疫複合体を形成し得る抗体モノクローナル抗体を用い、請求項１に記載の モノクローナル抗体を認識するアンチイムノグロブリンに代えて、前記主要Ｓ抗 原を認識するモノクローナル抗体との免疫複合体を形成し得るアンチイムノグロ ブリンを使用するように変形した方法を請求項７に記載の方法と並行して実施す ること、 −こうして測定した大Ｓタンパク質と主要Ｓタンパク質との量を比較することを 特徴とする方法。
9. ９．ＨＢＶ感染患者の慢性Ｂ型肝炎の進行をｉｎｖｉｔｒｏ診断するための請求 項８に記載の方法の使用。
10. １０．請求項５から９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであ って、 −Ｓタンパク質のＳ部分との免疫反応を起こすことができる所定量のポリクロー ナル抗体を固体支持体に結合したもの、 −所定量の請求項１に記載のモノクローナル抗体、−必要に応じて含むものとし て、ＨＢＶの主要Ｓエンベロ−プタンパク質との免疫複合体を形成することがで きる所定量のモノクローナル抗体、 −含むと有利なものとして、前述の抗体と生物学的試料中に含まれている可能性 のあるＳタンパク質との免疫反応を生起させるのに適した媒質、 −やはり有利なものとして、前記モノクローナル抗体が結合されている免疫複合 体を検出せしめる標識試薬、特に標識イムノグロブリン を含むことを特徴とするキット。
11. １１．Ｂ型肝炎の治療、より特定的にはＢ型肝炎にかかった個体に肝臓移植をす る場合の移植片再感染現象の防止に使用するための医薬組成物であって、請求項 １に記載のモノクローナル抗体を医薬的に許容し得るビヒクルと組合わせて含む ことを特徴とする組成物。
12. １２．請求項１に記載のモノクローナル抗体との免疫複合体を形成することを特 徴とする抗イディオタイプモノクローナル抗体。
13. １３．請求項１に記載のモノクローナル抗体で動物を免疫し、請求項１に記載の モノクローナル抗体との免疫複合体を形成できる抗体のそれを取出すことを特徴 とする請求項１２に記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体の製造方法。
14. １４．請求項１２に記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体を医薬的に許容 し得るビヒクルと組合わせて含むことを特徴とするＢ型肝炎予防接種用組成物。