JPH045300A - Ｂ型肝炎ワクチンおよびＨＢｓ抗原特異抗体 - Google Patents
Ｂ型肝炎ワクチンおよびＨＢｓ抗原特異抗体Info
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- JPH045300A JPH045300A JP2103177A JP10317790A JPH045300A JP H045300 A JPH045300 A JP H045300A JP 2103177 A JP2103177 A JP 2103177A JP 10317790 A JP10317790 A JP 10317790A JP H045300 A JPH045300 A JP H045300A
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＢ型肝炎ウィルス（以下ｒＨＢＶＪという）に
対する有効なワクチン、並びにＨＢＶ関連抗原の検出系
に供することのできる抗体に関する。
対する有効なワクチン、並びにＨＢＶ関連抗原の検出系
に供することのできる抗体に関する。
（従来の技術）
Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染するウィルス性疾
患である。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、１９７０年
にＤａｎｅによって、オーストラリア抗原（Ａｕ抗原、
ＨＢｓ抗原）陽性皿内に確認されたもので、二重構造を
した球形ＤＮＡウィルスである。
患である。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、１９７０年
にＤａｎｅによって、オーストラリア抗原（Ａｕ抗原、
ＨＢｓ抗原）陽性皿内に確認されたもので、二重構造を
した球形ＤＮＡウィルスである。
ＨＢＶに感染したヒトの血清を遠心して電子顕微鏡下で
観察すると、直径４２ｎｍの大型球形粒子（以下’Ｄａ
ｎｅ粒子」という）、直径２２ｎｍの小型球形粒子およ
び管状粒子が見出される。
観察すると、直径４２ｎｍの大型球形粒子（以下’Ｄａ
ｎｅ粒子」という）、直径２２ｎｍの小型球形粒子およ
び管状粒子が見出される。
Ｄａｎｅ粒子は、中心に直径２７ｎｍの内部粒子（以下
ｒｃｏｒｅ粒子」という）があり、また表面には外殻が
ある。ｃｏｒｅ粒子内には分子量１．６Ｘ１０６の２本
鎖ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼが含まれている。
ｒｃｏｒｅ粒子」という）があり、また表面には外殻が
ある。ｃｏｒｅ粒子内には分子量１．６Ｘ１０６の２本
鎖ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼが含まれている。
Ｄａｎｅ粒子の外殻は、ＨＢｓ抗原（以下ｒＨＢｓＡｇ
」という）活性を有し、これとは別にＣｏｒｅ粒子表面
にＨＢｃ抗原（ｒＨＢｃＡｇ」という）活性がある。ま
た、ｃｏｒｅ粒子には分子量的１９，０００の単位核蛋
白（以下ｒＰ１９Ｊという）の単位核蛋白が存在するが
、ＰＩ３の一部はｃｏｒｅ粒子の表面に露出して、その
Ｎ末端側の部分はＨＢｅ抗原（以下ｒＨＢｅＡｇ」とい
う）活性を有する。ＨＢｅＡｇは血中に出現することが
ある。
」という）活性を有し、これとは別にＣｏｒｅ粒子表面
にＨＢｃ抗原（ｒＨＢｃＡｇ」という）活性がある。ま
た、ｃｏｒｅ粒子には分子量的１９，０００の単位核蛋
白（以下ｒＰ１９Ｊという）の単位核蛋白が存在するが
、ＰＩ３の一部はｃｏｒｅ粒子の表面に露出して、その
Ｎ末端側の部分はＨＢｅ抗原（以下ｒＨＢｅＡｇ」とい
う）活性を有する。ＨＢｅＡｇは血中に出現することが
ある。
このように、ＨＢＶ関連抗原としては、ＨＢｃＡｇ、Ｈ
ＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇの三種類が現在知られている。
ＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇの三種類が現在知られている。
ＨＢｓＡｇには共通抗原として［ａ］があるが、さらに
抗原性の違いからａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｙｒの４
種のサブタイプが知られている。これらサブタイプはＨ
ＢＶ株の違いによって、産生されるＨＢｓＡｇのアミノ
酸配列に多少の違いを生じたものと考えられている。
抗原性の違いからａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｙｒの４
種のサブタイプが知られている。これらサブタイプはＨ
ＢＶ株の違いによって、産生されるＨＢｓＡｇのアミノ
酸配列に多少の違いを生じたものと考えられている。
無症候のＢ型肝炎ウィルス保有者（以下ｒＨＢ■キャリ
ア」という）は、世界で約２億人、わが国で約３００万
人も存在すると推定され、全人口に対するＨＢＶキャリ
アの割合は、先進国中日本が最高の値を示している。こ
のため、ＨＢＶキャリアの血液を介してＢ型肝炎が感染
する危険が極めて大きい。
ア」という）は、世界で約２億人、わが国で約３００万
人も存在すると推定され、全人口に対するＨＢＶキャリ
アの割合は、先進国中日本が最高の値を示している。こ
のため、ＨＢＶキャリアの血液を介してＢ型肝炎が感染
する危険が極めて大きい。
Ｂ型肝炎はＨＢＶ−ｉヤリアの血液が輸注されることに
より受血者に高率に発生するほか、注射針やカミソリの
刃についた微量の血液によっても感染することがある。
より受血者に高率に発生するほか、注射針やカミソリの
刃についた微量の血液によっても感染することがある。
日本において、年間の激痛の肝炎が約４，４００例、急
性肝炎が約１８万例、慢性肝炎が約３０万例、肝硬変が
約１２万例存在すると推定されるが、これらのうち各３
０％程度がＢ型肝炎ウィルスによって発生すると推定さ
れる。また、原発性肝癌、年間的８，４００例のうち実
に５０％程度がＢ型肝炎ウィルスによって発生すると推
定されている。
性肝炎が約１８万例、慢性肝炎が約３０万例、肝硬変が
約１２万例存在すると推定されるが、これらのうち各３
０％程度がＢ型肝炎ウィルスによって発生すると推定さ
れる。また、原発性肝癌、年間的８，４００例のうち実
に５０％程度がＢ型肝炎ウィルスによって発生すると推
定されている。
このような事悪の深刻さから、Ｂ型肝炎ウィルスに対す
るワクチネーションが望まれ、特に有効で、かつ副作用
の少ないワクチンの研究と開発が切望されている。
るワクチネーションが望まれ、特に有効で、かつ副作用
の少ないワクチンの研究と開発が切望されている。
現在供用されているＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢ■陽性血
からＨＢｓ抗原を分離精製し、不活性化したもの（第一
世代ワクチン）や、遺伝子組換えによりＨＢｓ蛋白質を
コードする遺伝子く以下「Ｓ遺伝子」という）を大腸菌
または酵母で発現させ、これを分離精製して製造されて
いる（第二世代ワクチン）。
からＨＢｓ抗原を分離精製し、不活性化したもの（第一
世代ワクチン）や、遺伝子組換えによりＨＢｓ蛋白質を
コードする遺伝子く以下「Ｓ遺伝子」という）を大腸菌
または酵母で発現させ、これを分離精製して製造されて
いる（第二世代ワクチン）。
つぎに、ＨＢｓＡｇの検出系には、Ｂ型肝炎患者やＨＢ
Ｖキャリアから血しょうを採取し、ＨＢｓＡｇを分離精
製したものを免疫原とし、これを各種動物に免疫して得
た抗ＨＢｓポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を
用いてキットを製造していた。このような従来技術にお
いては、ＨＢｓＡｇの精製が容易でないこと、人血しよ
う成分に対する抗体の混入による非特異的反応が生ずる
等、キットの特異性や感度についても信頼性の高い製品
を製造することが容易ではなかった。
Ｖキャリアから血しょうを採取し、ＨＢｓＡｇを分離精
製したものを免疫原とし、これを各種動物に免疫して得
た抗ＨＢｓポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を
用いてキットを製造していた。このような従来技術にお
いては、ＨＢｓＡｇの精製が容易でないこと、人血しよ
う成分に対する抗体の混入による非特異的反応が生ずる
等、キットの特異性や感度についても信頼性の高い製品
を製造することが容易ではなかった。
（発明が解決しようとする課題）
従来から使用されている血しよう由来のワクチンでは原
料たる血しようの確保が困難であるとともにエイズウィ
ルス（以下ｒＨＩＶＪという）等化のウィルスに由来す
る異種蛋白が混入する危険があった。
料たる血しようの確保が困難であるとともにエイズウィ
ルス（以下ｒＨＩＶＪという）等化のウィルスに由来す
る異種蛋白が混入する危険があった。
また、大腸菌や酵母を使用する組換えワクチンはＨＢｓ
抗原全体を免疫原とするものであったが、このような方
法ではなく、特定の抗原部位のみを選択的に免疫するこ
とにより高力価の抗体を産生するワクチンの開発が望ま
れていた。
抗原全体を免疫原とするものであったが、このような方
法ではなく、特定の抗原部位のみを選択的に免疫するこ
とにより高力価の抗体を産生するワクチンの開発が望ま
れていた。
本発明はＨＢｓ抗原全体を免疫原とすることなく、特定
の抗原部位のみを選択的に免疫することにより抗体を産
生ずるワクチンを提供することを目的とするものて′あ
る。
の抗原部位のみを選択的に免疫することにより抗体を産
生ずるワクチンを提供することを目的とするものて′あ
る。
また、本発明は従来の血しょう由来の精製ＨＢＳ抗原に
よることなく、共通抗原“ａ ”のエピトープを含むプ
ペタイドを用いることによりポリクローナル抗体および
モノクローナル抗体を産生じ、ＨＢｓ抗原検出系のため
の抗体を得ることを目的とするものである。
よることなく、共通抗原“ａ ”のエピトープを含むプ
ペタイドを用いることによりポリクローナル抗体および
モノクローナル抗体を産生じ、ＨＢｓ抗原検出系のため
の抗体を得ることを目的とするものである。
（課題を解決するための手段）
ａｄｒ型の小型粒子５−１０ｍｇ／ｍｌを１０ｍｍｏ
ｌ、Ｔｒｉ ５−ＨＣ［ｉ衡液（ｐＨ＝８゜１０）に溶
解し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と２−メルカ
プトエタノール（２ＭＥ）を最終濃度各１％となるよう
に加えた後、１００℃、５分間加熱処理して５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動すると分子量的２５，０００に相当する
メジャーペプタイドのバンドが出現する。このバンドを
蒸留水で抽出してポリペプタイドＰ２５を得た。このＰ
２５を免疫原として得られるマウスモノクローナル抗体
（Ｎｏ、５１２４）は上記粒子およびＰ２５の双方に反
応するので、このことからＮ０１５１２４は粒子表面上
にあるシークエンシアルな部位を認識していることが判
明した。
ｌ、Ｔｒｉ ５−ＨＣ［ｉ衡液（ｐＨ＝８゜１０）に溶
解し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と２−メルカ
プトエタノール（２ＭＥ）を最終濃度各１％となるよう
に加えた後、１００℃、５分間加熱処理して５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動すると分子量的２５，０００に相当する
メジャーペプタイドのバンドが出現する。このバンドを
蒸留水で抽出してポリペプタイドＰ２５を得た。このＰ
２５を免疫原として得られるマウスモノクローナル抗体
（Ｎｏ、５１２４）は上記粒子およびＰ２５の双方に反
応するので、このことからＮ０１５１２４は粒子表面上
にあるシークエンシアルな部位を認識していることが判
明した。
つぎに、異なる４つのサブタイプであるａｄｗ、ａｄｒ
、ａｙｗ、ａｙｒについてＮｏ、５１２４との反応性を
調べた。その結果、Ｎｏ、５１２４はいずれの抗原とも
反応した。このことからＮ０５１２４は共通抗原エピト
ープ「ａ」を認識していることが確認された。
、ａｙｗ、ａｙｒについてＮｏ、５１２４との反応性を
調べた。その結果、Ｎｏ、５１２４はいずれの抗原とも
反応した。このことからＮ０５１２４は共通抗原エピト
ープ「ａ」を認識していることが確認された。
以上の２点から、ＮＯ，５１２４と反応するニブトープ
が、ワクチンとして使用可能なペプタイドの最適な基本
単位と決定しうるものと確認できた。
が、ワクチンとして使用可能なペプタイドの最適な基本
単位と決定しうるものと確認できた。
Ｎｏ、５１２４が認識するエピトープには、ジスルファ
イド結合が関与していること、また、トリプシンで消化
するとＰ２５を構成する２２６箇のアミノ酸残基のＮ末
端から１２２番目のリジン（リジン１２２）と１２３番
目のスレオニン（スレオニン１２３）との間で切断され
、ＮＯ，５’１２４との反応性が消失するという実験結
果から、ＮＯ，５１２４が認識するエピトープはＰ２５
のＮ末端から１１１と１５６の間の領域にあり、さらに
、この抗原エピトープにはジスルファイド結合が関与し
ていること、Ｐ２５を構成する２２６個のアミノ酸残基
のＮ末端から１２１番目のシスティン（システィン１２
１）および１２４番目のシスティン（システィン１２４
）を含む部位に存在すると本発明者らは考察した。
イド結合が関与していること、また、トリプシンで消化
するとＰ２５を構成する２２６箇のアミノ酸残基のＮ末
端から１２２番目のリジン（リジン１２２）と１２３番
目のスレオニン（スレオニン１２３）との間で切断され
、ＮＯ，５’１２４との反応性が消失するという実験結
果から、ＮＯ，５１２４が認識するエピトープはＰ２５
のＮ末端から１１１と１５６の間の領域にあり、さらに
、この抗原エピトープにはジスルファイド結合が関与し
ていること、Ｐ２５を構成する２２６個のアミノ酸残基
のＮ末端から１２１番目のシスティン（システィン１２
１）および１２４番目のシスティン（システィン１２４
）を含む部位に存在すると本発明者らは考察した。
以上の考察、ならびにＰ２５の親水性スコアから推定さ
れる親水性領域から、ＮＯ，５１２４の反応部位はＰ２
５のＮ末端から１１５番目のスレオニン（スレオニン１
１５）から１２９番目のグルタミン（グルタミン１２９
）までであると本発明者らは確定した。
れる親水性領域から、ＮＯ，５１２４の反応部位はＰ２
５のＮ末端から１１５番目のスレオニン（スレオニン１
１５）から１２９番目のグルタミン（グルタミン１２９
）までであると本発明者らは確定した。
本発明者らは、上記の考察に基づき、本発明のペプタイ
ドＴｈ ｒ−Ｔｈ ｒ−８ｅ ｒ−Ｔ ｈ ｒ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＧｌｕならびにＴｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕを合成した。
ドＴｈ ｒ−Ｔｈ ｒ−８ｅ ｒ−Ｔ ｈ ｒ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＧｌｕならびにＴｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕを合成した。
さらに、抗原エピトープが、システィン１２１およびシ
スティン１２４を含む部位に存在するとの前記解析結果
にもとづき種々のペプタイドを合成した。
スティン１２４を含む部位に存在するとの前記解析結果
にもとづき種々のペプタイドを合成した。
その結果、抗原決定基としての最小ペプタイドは、Ｃｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅであり、
これがどのサブタイプのＨＢＶにも反応する抗体を産生
ずるアミノ酸配列であることを確認しな。
ｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−１１ｅであり、
これがどのサブタイプのＨＢＶにも反応する抗体を産生
ずるアミノ酸配列であることを確認しな。
また、上記へブタイドのＮ末端から２番目のアミノ残基
ＬｙｓをＡｒｇに置換したペプタイドＣｙｓ−Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉ ｌ ｅもまた全てのタイ
プのＨＢＶに反応する抗体を産生するペプタイドである
ことが確認された。
ＬｙｓをＡｒｇに置換したペプタイドＣｙｓ−Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉ ｌ ｅもまた全てのタイ
プのＨＢＶに反応する抗体を産生するペプタイドである
ことが確認された。
これらのことから、ＨＢＶの感染から防御するために必
須であるエピトープを特徴とする特許請求の範囲記載の
各ペプチドがＢ型肝炎に対するワクチンとして有効であ
ることが確認された。
須であるエピトープを特徴とする特許請求の範囲記載の
各ペプチドがＢ型肝炎に対するワクチンとして有効であ
ることが確認された。
本発明のワクチンはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法等公
知の方法により合成することが可能であり、また大腸菌
、酵母等を用いた遺伝子組換えの方法によっても製造す
ることができる。
知の方法により合成することが可能であり、また大腸菌
、酵母等を用いた遺伝子組換えの方法によっても製造す
ることができる。
さらに、本発明のワクチンは卵白アルブミンその他のキ
ャリア蛋白と結合して免疫原性を補強して使用すること
ができる。
ャリア蛋白と結合して免疫原性を補強して使用すること
ができる。
また、本発明者らは、本発明の上記各ペプタイドにより
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生せ
しめた。これらのポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体はＨＢｓ抗原検出系の製造に供することができ
る。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生せ
しめた。これらのポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体はＨＢｓ抗原検出系の製造に供することができ
る。
（作用効果）
本発明は、ＨＢＶ陽性血を使用することなく、また従来
の遺伝子組換え方法のようにＨＢｓ抗原全体を免疫原と
することなく、特定のペプチドを用いて効率的にＢ型肝
炎ワクチンおよびポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体を製造することができる。このため、本発明のワク
チン等は血しよう原料の確保に労する必要らなく、また
エイズウィルス（ＨＩＶ）等異種蛋白等異物が混入する
おそれもなく、安全で特異的なワクチンを安価に供給す
ることを可能とした。
の遺伝子組換え方法のようにＨＢｓ抗原全体を免疫原と
することなく、特定のペプチドを用いて効率的にＢ型肝
炎ワクチンおよびポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体を製造することができる。このため、本発明のワク
チン等は血しよう原料の確保に労する必要らなく、また
エイズウィルス（ＨＩＶ）等異種蛋白等異物が混入する
おそれもなく、安全で特異的なワクチンを安価に供給す
ることを可能とした。
（実施例）
以下、本発明の実施例について述べるが、もとより本発
明がこれらの実施例に限定されるのではない。
明がこれらの実施例に限定されるのではない。
実施例１
アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕのペプタイドについ
て、そのワクチン効果および抗体産生を次のように確認
した。
−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕのペプタイドについ
て、そのワクチン効果および抗体産生を次のように確認
した。
（１）へブタイドの製造
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法にもとづき、ペプタイド
のＣ末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させ
ておき、ついでＮ末端の方向へ向ってｔ−プトシキ力ル
ポニルアミノ酸を１箇づつ順次縮合させていき、アミノ
酸配列がＴｈｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ −Ｉ
ｌ ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕであるペプタイドを
合成した。
のＣ末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させ
ておき、ついでＮ末端の方向へ向ってｔ−プトシキ力ル
ポニルアミノ酸を１箇づつ順次縮合させていき、アミノ
酸配列がＴｈｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ −Ｉ
ｌ ｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕであるペプタイドを
合成した。
合成後、６Ｎ−ＨＣｌ、１１０℃、２４時間減圧下で加
水分解し、アミノ酸組成を確認した。このペプタイドに
は分子内にジスルファイド結合が存在する。
水分解し、アミノ酸組成を確認した。このペプタイドに
は分子内にジスルファイド結合が存在する。
（２）ペプタイドと担体との結合
卵白アルブミン（ＯＶＡ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を担
体とし、これとペプタイドを結合させた。卵白アルブミ
ンは米国Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社製の物を使
用し、ペプタイド５ｍｇに対し、０ＶＡＬ、５ｍｇを０
．５ｍｌの生理的食塩水に溶解し、１５ｍｇのカップリ
ング試薬を加えて室湯で１晩反応させたのち、生理的食
塩水で２日間透析した。カップリング試薬としては１−
エチル３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ゛イミ
ド（米国Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製社）を用い
た。
体とし、これとペプタイドを結合させた。卵白アルブミ
ンは米国Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社製の物を使
用し、ペプタイド５ｍｇに対し、０ＶＡＬ、５ｍｇを０
．５ｍｌの生理的食塩水に溶解し、１５ｍｇのカップリ
ング試薬を加えて室湯で１晩反応させたのち、生理的食
塩水で２日間透析した。カップリング試薬としては１−
エチル３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ゛イミ
ド（米国Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製社）を用い
た。
（３）ワクチン効果および抗体産生の検定（Ｅｎｚｙｍ
ｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓ５ａｙ＞１００μｇペアタ
イド−卵白アルブミン結合物０．１ｍｌを０．２ｍｌフ
ロイントの完全アジュバントのエマルジョンとし、これ
をマウスの腹腔に接種しな。
ｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓ５ａｙ＞１００μｇペアタ
イド−卵白アルブミン結合物０．１ｍｌを０．２ｍｌフ
ロイントの完全アジュバントのエマルジョンとし、これ
をマウスの腹腔に接種しな。
２０日後に同様に追加免疫を行った。その後１０日ごと
に眼底静脈より採血し、血液を凝固させ、遠心分離によ
り血清を得た。
に眼底静脈より採血し、血液を凝固させ、遠心分離によ
り血清を得た。
検定は、ポリビニルマイクロタイタープレートを用い、
サンドイツチ法で行った。すなわち、固相として小型粒
子および本発明のペプタイドをリン酸バッファーで各々
に１０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、５０μｍをウェルに
入れ室温で１時間吸着させたものを用いた。
サンドイツチ法で行った。すなわち、固相として小型粒
子および本発明のペプタイドをリン酸バッファーで各々
に１０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、５０μｍをウェルに
入れ室温で１時間吸着させたものを用いた。
血清サンプルは、１，０００倍に希釈した後、５０μｇ
をウェルに入れ、４℃で１晩インキユベートした。
をウェルに入れ、４℃で１晩インキユベートした。
標識抗体にはＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉ
ｄａｓｅ標識ラビット抗マウスＩうＧ／ＩｇＭを８μｇ
／ ｍ １の濃度に調整し５０μＩを室温で１時間反
応させた。
ｄａｓｅ標識ラビット抗マウスＩうＧ／ＩｇＭを８μｇ
／ ｍ １の濃度に調整し５０μＩを室温で１時間反
応させた。
発色には、０−）ユニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いた
。
。
抗体産生の結果を第１図に示す。第１図において縦軸は
吸光度、横軸は初回免疫からの日数を表わす。これによ
れば、本発明のペプタイドには、小型粒子におけると全
く同様の抗体反応が示され、これにより本発明のベブタ
イドに免疫原性があること、また、ワクチン効果がある
こと、ＨＢｓＡｇと反応する抗体を産生じ、ＨＢＶ抗原
検出系の製造に供しうろことが確認された。
吸光度、横軸は初回免疫からの日数を表わす。これによ
れば、本発明のペプタイドには、小型粒子におけると全
く同様の抗体反応が示され、これにより本発明のベブタ
イドに免疫原性があること、また、ワクチン効果がある
こと、ＨＢｓＡｇと反応する抗体を産生じ、ＨＢＶ抗原
検出系の製造に供しうろことが確認された。
さらに、本発明のペプタイドを同相としたコンペティシ
ョン法でもＮＯ，５１２４抗体により反応が阻止され、
このことにより本発明のペプタイドとＮｏ、５１２４の
特異性が同一であることが確認された。
ョン法でもＮＯ，５１２４抗体により反応が阻止され、
このことにより本発明のペプタイドとＮｏ、５１２４の
特異性が同一であることが確認された。
実施例２
アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＴｈｒ−
１１ｅのペプタイドについて、そのワクチン効果および
抗体産生を次のように確認した。
１１ｅのペプタイドについて、そのワクチン効果および
抗体産生を次のように確認した。
（１）ペプタイドの製造
実施例１と同様にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法にもと
づき、アミノ酸配列がＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｈｒ −Ｉ ｌ ｅであるペプタイドを合成し、こ
れをマウスに免疫した。初回免疫の後、２５日後に追加
免疫を行い、追加免疫の１５日後に抗体検出を行った。
づき、アミノ酸配列がＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−Ｔｈｒ −Ｉ ｌ ｅであるペプタイドを合成し、こ
れをマウスに免疫した。初回免疫の後、２５日後に追加
免疫を行い、追加免疫の１５日後に抗体検出を行った。
固相には、ポリペプタイドＰ２５を用い、これに結合し
た抗体を実施例１と同様に抗マウス抗体で検出しな。検
体は、表１に示すように１０倍から１，０００倍までの
希釈列を作り、免疫されないマウスと比較した。その結
果、あきらかに抗体産生がなされていることが確認され
た。
た抗体を実施例１と同様に抗マウス抗体で検出しな。検
体は、表１に示すように１０倍から１，０００倍までの
希釈列を作り、免疫されないマウスと比較した。その結
果、あきらかに抗体産生がなされていることが確認され
た。
したがって、本発明のペプタイドには免疫原性があり、
抗ペプタイド抗体はＰ２５と反応したことから、本発明
のベプイドとＮＯ，５１２４とはその特異性が同じであ
ることが確認された。
抗ペプタイド抗体はＰ２５と反応したことから、本発明
のベプイドとＮＯ，５１２４とはその特異性が同じであ
ることが確認された。
（実施例３〉
実施例１で産生された抗ペプタイド抗体をＨＢＶである
Ｄａｎｅ粒子と反応させ、免疫電顕法により観察した。
Ｄａｎｅ粒子と反応させ、免疫電顕法により観察した。
その結果は第２図に示すとおりであり、Ｄａｎｅ粒子が
抗体により凝集していることが確認された。これにより
本発明の抗ペプタイド抗体はＨＢＶに対する中和抗体と
して作用すること、ワクチンとして有効であることが確
認された。
抗体により凝集していることが確認された。これにより
本発明の抗ペプタイド抗体はＨＢＶに対する中和抗体と
して作用すること、ワクチンとして有効であることが確
認された。
第１図は、実施例１のペプタイドの免疫検定を示す。・
は実施例１のペプタイド、○はＨＢｓＡｇ ｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓ、縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度、横軸は
初回免疫からの日数（第２回免疫は２０日目）。 第２図は、実施例１の抗へブタイド抗体をＨＢＶである
Ｄａｎｅ粒子と反応した免疫電顕写真。 Ｄａｎｅ粒子が実施例１の抗ペプタイド抗体により凝集
している。 才 図 数 表１ ［４９２ｎｍ吸光度Ｘ１００Ｏコ
は実施例１のペプタイド、○はＨＢｓＡｇ ｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓ、縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度、横軸は
初回免疫からの日数（第２回免疫は２０日目）。 第２図は、実施例１の抗へブタイド抗体をＨＢＶである
Ｄａｎｅ粒子と反応した免疫電顕写真。 Ｄａｎｅ粒子が実施例１の抗ペプタイド抗体により凝集
している。 才 図 数 表１ ［４９２ｎｍ吸光度Ｘ１００Ｏコ
Claims (11)
- （１）アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ−Ｉｌｅのペプタイドか らなるＢ型肝炎ワクチン。 - （２）ペプタイドが合成ペプタイドである請求項第１項
記載のＢ型肝炎ワクチン。 - （３）ペプタイドが遺伝子組換えペプタイドである請求
項第１項記載のＢ型肝炎ワクチ ン。 - （４）ペプタイドを担体と結合させた請求項第１項記載
のＢ型肝炎ワクチン。 - （５）アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ−Ｉｌｅのペプタイドか らなるＢ型肝炎ワクチン。 - （６）アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙ ｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕのペプタイドからな るＢ型肝炎ワクチン。 - （７）アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒ ｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕのペプタイドからな るＢ型肝炎ワクチン。 - （８）アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ−Ｉｌｅからなるペプタ イドを免疫原として得るポリクローナル抗 体またはモノクローナル抗体。 - （９）アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ−Ｉｌｅからなるペプタ イドを免疫原として得るポリクローナル抗 体またはモノクローナル抗体。 - （１０）アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌ ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ− Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕからなるペプタイ ドを免疫原として得るポリクローナル抗体 またはモノクローナル抗体。 - （１１）アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａ ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ− Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕからなるペプタイ ドを免疫原として得るポリクローナル抗体 またはモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2103177A JPH045300A (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | Ｂ型肝炎ワクチンおよびＨＢｓ抗原特異抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2103177A JPH045300A (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | Ｂ型肝炎ワクチンおよびＨＢｓ抗原特異抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH045300A true JPH045300A (ja) | 1992-01-09 |
Family
ID=14347236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2103177A Pending JPH045300A (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | Ｂ型肝炎ワクチンおよびＨＢｓ抗原特異抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH045300A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997039029A3 (en) * | 1996-04-18 | 2001-06-28 | Abbott Lab | An antigenic epitope of the a determinant of hepatitis b surface antigen and uses thereof |
-
1990
- 1990-04-20 JP JP2103177A patent/JPH045300A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997039029A3 (en) * | 1996-04-18 | 2001-06-28 | Abbott Lab | An antigenic epitope of the a determinant of hepatitis b surface antigen and uses thereof |
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