CN87102945A

CN87102945A - 前s基因编码的乙型肝炎肽免疫原、疫苗、诊断剂及合成的脂质囊泡载体

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Publication number: CN87102945A
Application number: CN198787102945A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·罗伯特·纽拉斯; 斯蒂芬B·H·肯特
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; New York Blood Center Inc
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; New York Blood Center Inc
Priority date: 1986-04-28
Filing date: 1987-04-27
Publication date: 1988-04-20
Also published as: CA1283602C; AU7197887A; DK213987A; US4861588A; AU602894B2; AU6461390A; JPS6345226A; EP0243913A3; DK213987D0; EP0485361A1; ZA872165B; KR870010196A; EP0243913A2; KR900006574B1

Abstract

一种含有肽和生理上可接受稀释剂的乙型肝炎疫苗，其中的肽具有HBV被膜前S基因编码区中至少六个连续氨基酸。该疫苗不含对应于HBV天然被膜蛋白的氨基酸序列。肽游离或与载体连接。一种新载体包括由交联而稳定的脂质囊泡，其外表面有共价键合的活性位点。不仅可用于连接含HBV表面抗原前S基因编码区中氨基酸链的新肽，而且可连接其它病毒蛋白及细菌、人和动物变应原和寄生物蛋白的合成肽类似物。肽可用于检测抗原和抗体的诊断。

Description

本申请是1985年2月5日提交的698，499号专利申请的后续部分，而后一申请又是1984年3月7日提交的587，090号专利申请的后续部分，这一申请现在已被放弃。

本发明涉及前S基因编码的乙型肝炎免疫原、疫苗和诊断剂。更具体地说，本发明涉及前S基因编码的新的肽和新型载体，尤其是前S基因编码的肽的载体。进一步更具体地说，本发明涉及与脂质囊泡载体共价连接的合成的前S基因编码的肽。

在美国，大约有600，000个乙型肝炎病毒（HBV）的永久携带者，估计全世界的携带者总数为20亿人。很大比例的HBV携带者的肝脏具有慢性疾病。已经证实HBV与肝癌有关（W.Szmuness，Prog.Med.Virol.，24∶40，1978及R.P.Beasley，L.-Y.Hwang，C.-C.Ling，C.-C.Chien，Lancet Nov.，21∶1129，1981）。

因此，HBV感染代表了世界范围内主要的公众健康问题。已经从HBV携带者的血清中产生了可以得到的疫苗（S.Krugman，见于《病毒性肝炎：实验及临床科学》，F.Deinhardt，J.Deinhardt编，Marcel Dekker，Inc.，New York-Basel，1983，pp.257-263），但由于有关资源和生产费用有限，它们没有在世界范围内提供合适的控制手段并根除这种疾病。然而，有希望通过DNA重组技术和/或合成肽技术产生的疫苗达到这一目的。

HBV的生物学、结构和免疫化学及其DNA基因组的基因组成已经有过综述（B.S.Blumberg，Science，197∶17，1977）。对好几种肝炎病毒（HBV）分离物的基因组进行的克隆和序列测定，使人们弄清了此病毒DNA的基因结构（P.Tiollais，P.Charnay，G.N.Vyas，Science，213∶406，1981）。

HBV感染的免疫标记物包括表面抗原（HBs Ag）、核心抗原（HBc Ag）“e”抗原（HBe Ag）及其各自的抗体。抗HBs Ag的抗体可预防HBV的感染。

已经发现HBV及直径约为22nm的亚病毒颗粒（乙型肝炎表面抗原;HBs Ag）有好几种抗原亚型（G.Le Bouvier，A.Williams，Am.J.Med.Sci.，270∶165，1975）。所有这些亚型（例如，ayw、adyw、adw₂、adw和adr）具有共同的（组专一性）被膜抗原决定基，抗这些亚型的免疫应答似乎足以预防所有病毒亚型的感染（W.Szmuness，C.E.Stevns，E.J.Harley，E.A.Zang，H.J.Alter，P.E.Taylor，A.De Vera，G.T.S.Chen，A.Kellner等，N.Engl.J.Med.，307∶1481，1982）。

Tiollais等人（1981，见上，pp.408-409）描述过HBV基因组的物理结构并推测了基因组成。有两条DNA链，即长链（L）和短链（S）。长链转录本有四个开放读码框区，它们称为（S+前S）、C、P和X。

开放谈码框区（S+前S）对应于HBV DNA的被膜基因，并且编码一组HBV被膜及有关病毒颗粒的蛋白质。

HBV DNA被膜基因的潜在的转译产物示意图如下：

上面示意图中的数目指氨基酸（AA）。Met1转译起始位点仅仅供adw₂和adr亚型使用。其它亚型的第一个氨基酸对应于前S中的12位置。

此后，对应于前S区的氨基酸序列（被膜1至174）称为“前S”，对应于S区的氨基酸序列（被膜175至400）称为“S”。在被膜基因产物的示意图中，S区跨越氨基酸175至400，而在“单独的S区”示意图中，S区跨越氨基酸1至226。

在上面的图示中，前S区定义为氨基酸序列中的前S1位置至前S174位置。S区定义为序列的S1位置（开放读码框的氨基酸175并与前S174相邻）至序列的S266位置（开放读码框的氨基酸400）。S基因的产物（S蛋白）由此226个氨基酸的序列组成。

迄今为止，还没有清楚地确定对诱导中和病毒的抗体是至关重要的抗原决定基。有报道指出，组专一性是由一种复合的决定子代表的，这些决定子位于病毒被膜及乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）的两个主要蛋白组分上，二者分别约为22和26千道尔顿（P22和P26）。（参见J.W.-K.Shih，J.L.Gerin，J.Immunol.，115∶634，1975;J.W.-K.Shih，P.L.Tan，J.L.Gerin，J.Immunol.，120∶520，1978;S.Mishiro，M.Imai，K.Takahashi，A.Machida，T.Gotanda，Y.Miyakawa，M.Mayumi，J.Immunol.，124∶1589，1980;G.R.Dressman，R.Chairez，M.Suarez.，F.B.Hollinger，R.J.Courtney，J.L.Melnick，J.Virol.，16∶508，1975）。

这些蛋白具有相同的氨基酸序列，由HBVDNA的S基因编码（Tiollais等人，见上），但较大的蛋白还携有碳水化合物链。合成了对应于S基因产物中选择后段的肽，并表明这些肽能诱导抗HBs Ag的抗体（抗-HBs）。然而，用这些肽对黑猩猩进行免疫，仅仅产生对HBV感染的部分保护作用（N.Williams，Nature，306∶427，1983）。

最近有报道指出，HBV DNA编码的HBs Ag中的次要糖蛋白组分含有P22的序列（对应于S区的226个氨基酸），并在氨基末端部分含有55个额外的氨基酸，它们由HBV DNA被膜基因的前S区编码，这两个糖蛋白组分的分子量约为33和36千道尔顿（P33、P36）。参见W.Stibbe，W.H.Gerlich，Virology，123∶436，1982;M.A.Feitelson，P.L.Marion，W.S.Robinson，Virology，130∶76，1983;W.Stibbe，W.H.Gerlich，J.Virol.，46∶626，1983;A.Machida，S.Kishimoto，H.Ohnuma，H.Miyamoto，K.Baba，K.Oda，T.Nakamura，Y.Miyakawa，M.Mayumi，Gastroentero-logy，85∶268，1983。Machida等人描述了一种氨基酸序列的组成，认为它是聚合的血清清蛋白的受体。

迄今为止，人们几乎完全忽视了用乙型肝炎病毒DNA前S区编码的氨基酸序列生产合成疫苗。美国目前使用的乙型肝炎疫苗缺乏前S基因编码的序列（因此不能诱导抗此序列的抗体），因此所诱导的对于HBV被膜的免疫应答，与自然感染的痊愈过程中发生的相比不完全。

用具有对应于预选的蛋白片段的氨基酸序列的短肽进行免疫会产生抗蛋白的抗体似乎是经常发生的事情（Nima，H.L.，Houghten，R.A.，Walker，.L.E.，Reisfeld，R.A.，Wilson，I.A.，Hogle，J.M.和Lerner，R.A.，“通过短肽产生蛋白的免疫反应是经常发生的事件：与免疫识别的结构基础的关系”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80∶4949-4953，1983）。然而，识别天然蛋白的抗体的产生，可能取决于合成肽免疫原的合适构象及其它未知因子。参见Pfaff，E.，Mussgay，M.，Bohm，H.O.，Schulz，G.E.和Schaller，H.，“抗一种预选肽段的抗体识别及中和口蹄疫病毒”，The EMBO Journal，7∶869-874，1982;Neurath，A.R.，Kent，S.B.H.和Strick，N.，“一种具有与病毒蛋白片段相同序列的合成肽段的诱导抗体的特异性，乙型肝炎表面抗原”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.79∶7871-7875，1982;Ionescu-Matiu，I.，Kennedy，R.C.，Sparrow，J.T.，Culwell，A.R.，Sanchez，Y.，Melnick，J.L.，Dressman，G.R.，“与一种乙型肝炎表面抗原的合成肽段有关的抗原决定基，”The Journal of Immmunology，130∶1947-1952，J983;Kennedy，R.C.，Dressman，G.R.，Sparrow，J.T.，Culwell，A.R.，Sanchez，Y.，Ionescu-Matiu，I.，Hollinger，F.B.和Melnick，J.L.，“一种合成环肽对常见的人抗乙型肝炎表面抗原个体基因型的抑制”，Journal of Virology，46∶653-655，1983。由于此原因，用各种病毒蛋白的合成肽类似物进行免疫，所产生的中和病毒的抗血清很少能与病毒（病毒蛋白）本身所诱导的抗血清相比拟（Pfaff等人，1982，见上）。因此，制备出能最理想地模仿完整病毒抗原决定子的合成抗原仍是留给人们的一种挑战。

此挑战的部分内容是，用合成载体取代常用的蛋白载体，如钥孔

血蓝蛋白（KLH）、清蛋白等。虽然最近有报告指出，游离的合成肽能够具有免疫原性（Dressman，G.R.，Sanchez，Y.，Ionescu-Matiu，I.，Sparrow，J.T.，Six，H.R.，Peterson，D.L.，Hollinger，F.B和Melinick，J.L.，“抗乙型肝炎肽段的抗体能够具有免疫原性”，Dressman，G.R.，Sanchez，Y.，Ionescu-Matiu，I.，Sparrow，J.T.，Six，H.R.，Peterson，D.L.，Hollinger，F.B.，Melnick，J.L.，“用来偶联的HBs Ag合成肽段免疫一次后的抗乙型肝炎表面抗原的抗体”，Nature，295∶158-160，1982;Schmitz，H.E.，Atassi，H.，Atassi，M.Z.，“用游离的合成肽段作为免疫原产生抗蛋白的非免疫原性表面区域的单克隆抗体：用鲸精子肌红蛋白进行的演示”，Immunological Communications，12∶161-175，1983），但即使在这些情况中，使肽段与蛋白载体连接仍能增强抗体应答（Sanchez，Y.，Ionescu-Matiu，I.，Sparrow，J.T.，Melnick，J.L.，Dressman，G.R.“结合物及合成的乙型肝炎表面抗原肽段分子团的免疫原性”，Intervirology，18∶209-213，1982）。

乙型肝炎病毒迄今还没有进行过离体增殖，关于它的反应及其靶细胞受体所知仍然很少。病毒表面蛋白的主要功能之一是识别靶细胞膜上的特异受体。在病毒进入细胞的过程中，关键性的第一步是病毒与细胞的特异结合。由病毒表面结构的限定区域确定的受体专一性可能决定病毒的宿主范围、组织趋向性及病原性（K.Lonberg-Holm和L.Philipson编，《受体和识别》系列B第8卷，病毒受体：第二部分-动物病毒。

（London，Chapman and Hall），pp.85-211，1981;B，N.Fields，M.I.Greene，“病毒病原性的基因和分子机理：与预防和治疗的关系”，Nature，300∶19-23，1982;A.H.Sharpe和B.N.Fields，“病毒感染的病原性：从呼吸道肠道病毒模式产生的基本概念”，New Engl.J.Med.，312∶486-497，1985）。已经发现不同病毒的细胞受体是分离的有重要生理意义的配体的受体（D.A.Eppstein，Y.V.Marsh，A.B.Schreiber，S.R.Newman，G.J.Todaro和J.J.Nestor，“表皮生长因子受体的占据抑制牛痘病毒感染”，Nature，318∶663-665，1985）。因此，要解释病毒与细胞的相互作用，重要的一步是详细了解细胞受体及相应的病毒结合位点的特性。

此外，对病毒表面区域或相邻区域的有效的免疫应答与细胞受体的识别有关，在宿主的中和病毒的应答中，此免疫应答是一个重要的组成部分（B.Mandel，“病毒中和作用”，《病毒的免疫化学：血清诊断及疫苗的基础》，M.H.V.Van Regen mortel和A.R.Neurath编（Amsterdam∶Elsevier），pp.53-70，1985;A.Baltimore，“细小核糖核酸病毒不再是黑匣子”，Science，229∶1366-1367，1985）。尽管病毒表面蛋白上的细胞受体识别结构域在生物学上具有根本的重要性，但只有少数几个病毒的这种结构域已经确定。值得注意的是，在X射线晶格测定法和氨基酸序列数据的基础上，流感病毒（D.C.Wiley，I.A.Wilson和J.J.Skehel，“香港流感血细胞凝集素抗体结合位点的结构鉴定及其抗原性变异的改进”，Nature，289∶373-378，1981;I.A.Wilson，J.J.Skehel和D.C.Wiley，“在3

分辨率下流感病毒膜上糖蛋白血细胞凝集素的结构”，Nature，289∶366-373，1981）和细小核糖核酸病毒（J.M.Hogle，M.Chow和D.J.Filman，“脊髓灰质炎病毒在2，9A分辨率下的三维结构”，Science，229∶1358-1365，1985;M.G.Rossmann，E.Arnold，J.W.Erickson，E.A.Frankenberger，J.R.Griffith，H.-J.Hecht，J.E.Johnson，G.Kamer，M.Luo，A.G.Mosser，R.R.Rueckert，B.Sherry和G.Vriend，“常见的人类冷病毒的结构及与其它细小核糖核酸病毒的功能关系”，Nature，317∶145-153，1985）上的受体结合位点已暂时限定在病毒表面蛋白的某些区域。

乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的人类病原体，它与最初的肝癌细胞的出现有关。此病毒是肝病毒（hepadnaviridae）组中的一员（W.S.Robinson，“乙型肝炎病毒”，《病毒性肝炎，实验和临床科学》，F.Deinhardt和J.Deinhardt编，（New York∶Marcel Dekker，Inc，），pp.57-116，1983），它的靶子是肝脏。迄今为止，还不知道HBV被膜蛋白中的肝细胞受体识别位点的位置。

常用的蛋白载体与合成肽段一样会产生强烈的免疫应答。因此，用非蛋白载体连上肽段去刺激抗HBs的应答是有利的，非蛋白载体本身并不刺激抗体应答。

如果可以得到完全合成的免疫原，则将增强在预防中使用好几种不同疫苗的可能性。

D Asp 天冬氨酸

N Asn 天冬酰胺

T Thr 苏氨酸

S Ser 丝氨酸

E Glu 谷氨酸

Q Gln 谷氨酰胺

P Pro 脯氨酸

G Gly 甘氨酸

A Ala 丙氨酸

C Cys 半胱氨酸

V Val 缬氨酸

M Met 蛋氨酸

I Ile 异亮氨酸

L Leu 亮氨酸

Y Tyr 酪氨酸

F Phe 苯丙氨酸

W Trp 色氨酸

K Lys 赖氨酸

H His 组氨酸

R Arg 精氨酸

HBV 乙型肝炎病毒

HBs Ag 乙型肝炎表面抗原

DNA 脱氧核糖核酸

申请人发现，乙型肝炎感染早期出现的抗前S蛋白的抗体，也许起着从循环中去除HBV的抗体作用，因此阻断感染的进一步扩展。抗前S蛋白的抗体可能代表中和病毒的抗体。某些乙型肝炎病毒的疫苗不能诱导出这种抗体，这在生物学上可能具有重要意义，这种疫苗在某些群体中产生的免疫预防效果很差，尽管能够检测出对S蛋白的免疫应答。

申请人发现，乙型肝炎病毒DNA的被膜基因前S区编码的氨基酸序列，携有与完整的和失活的HBs Ag一致的优势抗原决定子。申请人发现，由人抗乙型肝炎病毒抗体识别的抗原决定基存在于含有HBV DNA的前S区编码的氨基酸序列的蛋白中，更具体地说，存在于含有一个N端部分（由HBV DNA的前S区编码）的蛋白中，此部分在氨基酸序列的前S120位置具有N端蛋氨酸，此抗原决定基具有免疫优势并且不依赖于双硫键。申请人进一步发现，对应于前S区中氨基酸序列的肽段，更具体地说，对应于被膜基因开放读码框中从前述区域中氨基酸120起始的氨基酸序列的肽段，抑制人HBs Ag的抗体和P33（P36）之间的反应，并且具有高度的免疫原性，诱导出高水平的抗HBs Ag和HBV的组专一性的抗体。申请人还发现，使这种肽段与新型脂质囊泡（脂质体）载体连接可以加强它的免疫原性。

申请人发现，对于本发明的诱导抗HBs Ag抗体的肽段来说，戊二醛固定的脂质体是较好的载体。

因此，本发明涉及一种乙型肝炎肽免疫原，它包括一个含有对于HBV被膜的前S基因编码区中至少六个连续氨基酸链的肽段。乙型肝炎肽免疫原不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸链。

乙型肝炎病毒天然具有的被膜蛋白包括下列：

（1）HBV被膜基因的完整长度的转译产物，即对于adw₂和adr来说是前S（1-174）+S（175-400）＝400个氨基酸，对于ayw、adyw和adw来说是前S（12-174）+S（1-226）＝389个氨基酸（被膜12-400）;

（2）前S（120-174）+S（175-400）＝281个氨基酸（被膜120-400）＝前S区终端55个氨基酸+包括完整S区的226个氨基酸（相应蛋白的大小约为33和36KD（P33和P36），相互之间糖基化程度不同）;

（3）S（1-226）＝226个氨基酸，即完整的S区（被膜175-400）;它们的非糖基化和糖基化形式（“S蛋白”）代表HBV被膜中约为22和26KD的主要组分（P22和P26）。

在本发明的乙型肝炎肽抗原的一个具体方案中，对应的氨基酸链位于序列位置的前S120和前S174之间。在另一个具体方案中，氨基酸链在序列位置的前S1和前S120之间。在本发明的进一步的具体方案中，对应的氨基酸链包括在序列位置前S120处的蛋氨酸。在进一步的另一个具体方案中，氨基酸链至少含有前S区中的26个氨基酸。进一步，至少含有26个氨基酸的氨基酸链能够对应于一个分布于序列位置前S120和前S174之间的至少为26个连续氨基酸的链。一般说来，肽段的氨基酸不多于280个，不多于225个氨基酸较好，更好不多于174个氨基酸，甚至更好不多于100个氨基酸，进一步更好不多于50个氨基酸。本发明的疫苗可以单独由肽组成，或更好是由肽和载体一起组成。这种载体可以是常规载体，或根据本发明的新载体，即下面所述的载体。

本发明的乙型肝炎肽免疫原不含有任何血清蛋白，如血液血清蛋白。

本发明还涉及这样一种乙型肝炎疫苗，它包括含有一个氨基酸链的肽段及一种生理上可接受的稀释剂如磷酸盐缓冲液，所述氨基酸链对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸。乙型肝炎疫苗不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸链。

本发明还涉及一种肽的新载体。在本发明特别好的一个具体方案中，乙型肝炎疫苗通过载体上的活性位点与载体连接，该疫苗含有对应于前S区中的氨基酸链的氨基酸链。进一步更好的是，载体是一种脂质囊泡载体。甚至更好的是，脂质囊泡载体通过交联而稳定化。

本发明的载体包括一个通过交联稳定的脂质囊泡，在其外表面上有共价键合的活性位点。合成肽通过载体上这种活性位点键合到脂质囊泡的外表面上。这种活性位点包括-COOH、-CHO、-NH₂和-SH。这种交联稳定作用通过稳定试剂完成，如至少有两个功能基团的醛，如双功能醛，如戊二醛。本发明的载体通过游离的功能基团进行化学交联。

本申请还与诊断方法有关。本发明涉及血清的检测方法，检测其中有没有前S基因编码的乙型肝炎抗原或抗体的存在。

能够在样品中检测到抗本申请公开的合成肽的抗体，检测方法包括：

（a）使样品与用一种未标记肽包膜的固体基质接触，该肽含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链，该肽不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列，保温并洗涤所述接触样品;

（b）使上述步骤a得到的保温并洗涤过的产物与一种标记肽接触，该肽含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链，所述肽不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列，保温并洗涤所得到的物质;以及

（c）测定由上述步骤b得到的物质中的标记肽的含量。

通常用基本上没有蛋白结合位点的固体基质进行此方法。例如用蛋白结合位点占据者如清蛋白结合那些未被标记肽结合的位点。

检测这种抗体的另一种方法包括：

（b）使上述步骤a得到的保温并洗涤过的产物与标记抗体接触，这是抗人或动物免疫球蛋白产物的抗体，该产物通过包括一个肽段的免疫原进行免疫而得到，所述肽对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸，该肽免疫原不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列，保温并洗涤该接触样品，以及

（c）测定步骤b得到的物质中的标记抗体的含量。

能够检测样品中的HBV或HBsAg，检测方法包括：

（a）使一种组合物的第一部分与所述样品和已经标记的免疫原的混合物接触，此组合物中含有一种抗体，此抗体是通过将包括对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸肽段的免疫原导入动物或人体中产生的，肽免疫原不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列，保温并洗涤此第一部分;

（b）使含有抗体的组合物的第二部分与同等数量的标记免疫原接触，以此作为无抗原的对照，保温并洗涤此第二部分;

（c）向上述步骤a和b的组合物中各自加入同样数量的葡萄球菌蛋白A，使两种组合物保温、离心，并从固体中分离出液体;

（d）测定由上述步骤C得到的组合物中各自的标记免疫原含量，以及

（e）比较每一种中的标记免疫原的相对数量，如果含有第一部分组合物的活性小于第二部分组合物的活性，则样品中含有HBV或HBs Ag。

一般说来，在夹层免疫检测和竞争免疫检测中都能使用合成免疫原，因为在这些免疫检测中，样品中的抗原与标记免疫原竞争抗体。

这些和其它合适的可以使用本发明合成免疫原及其抗体的免疫检测法公开于426，309号共同未决申请中，申请日是1982年9月29日，标题为《作为诊断试剂的标记肽》，它被转让于此处的受让人之一，此公开列为本文的参考文献。

本发明还涉及一种诊断测试箱，用以检测血清中的乙型肝炎病毒，它包括

（a）抗一种肽的抗体，该肽含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链，该肽不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列，所述抗体附着在一种固体基质上，

（b）抗肽或乙型肝炎病毒的标记抗体。

测试箱可以包括一套进行免疫检测的说明，其中，所述标记抗体揭示免疫复合物形成的效应。

本发明还涉及这样一种诊断箱，用以检测样品中抗乙型肝炎病毒的前S基因编码的抗原的抗体，它包括

（a）一定数量的一种肽，该肽含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链，该肽不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸链。该肽附着于一种固体基质，如一种不溶于水的固体基质。

（b）抗人Ig G和/或Ig M的标记抗体，如放射性标记或酶标记。

测试箱可以包括一套进行免疫检测的说明，其中，所述标记抗体揭示免疫复合物形成的程度。

在一个特殊的方面，本发明涉及一种方法，检测HBV感染的人和某些动物如黑猩猩的血清中由前S基因编码的抗原，该方法包括下列步骤：

（a）用抗一种肽的抗体包膜一种固体基质，该肽含有对应于HBVDNA的前S基因中至少六个连续氨基酸的氨基酸链，并且不含对应于HBV的天然被膜蛋白的氨基酸序列;

（b）洗涤包膜的基质;

（c）使洗涤并包膜过的基质如聚苯乙烯小球与一种含有蛋白的溶液接触;

（d）洗涤来自步骤C的基质;

（e）使来自步骤d的基质与可能含有HBV或HBs Ag的样品保温;

（f）洗涤来自步骤e的基质;

（g）加入放射性标记或酶标记的抗体，该抗体抗所述肽或HBs Ag;

（h）保温来自步骤g的基质;

（i）洗涤来自步骤h的基质;以及

（j）用γ计数器对步骤i的基质进行计数或测定其酶活性。

上述方法可不用RIA检测技术，而是用ELISA技术进行。

在一个特殊的具体方案中，本发明还涉及抗体的检测方法，该抗体抗乙型肝炎病毒DNA的前S区编码的蛋白，该方法包括下列步骤：

（a）在一种含有结合位点的固体基质如聚苯乙烯小球上吸附一种肽，该肽含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸序列，并且不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列，

（b）使来自步骤a的基质与一种物质接触，从而使基质上的结合位点饱和，

（c）洗涤来自步骤b的基质，

（d）使来自步骤c的基质与一种含有人血清的样品接触，

（e）保温步骤d得到的物质，

（f）洗涤步骤e得到的物质，

（g）在由步骤f得到的物质中，加入抗人Ig G或Ig M的放射性标记，以形成得到的第二种物质，

（h）用γ计数器对步骤g中的第二种物质进行计数，

（i）使用正常血清作为步骤a至h的对照，以及

（j）比较步骤h和i的计数。

在上述检测抗体的方法中，可用ELISA技术代替RIA技术。

本发明还涉及一种乙型肝炎感染结果的预测方法，包括对人血清中的抗体进行免疫检测，所述抗体抗由乙型肝炎病毒被膜的前S基因的编码区域所编码的抗原，该方法以有规则的间歇利用上述乙型肝炎肽免疫原进行，并对数据作出评价。

本发明进一步涉及这样一种方法，在已用抗乙型肝炎疫苗接种的人中，测定是否对乙型肝炎病毒具有免疫性能。此方法涉及用多种手段对来自这种人的血清进行免疫检测，确定血清中是否有抗HBV被膜的前S基因编码的区域抗原的抗体，该方法利用上述乙型肝炎病毒的肽免疫原进行，在不同时间对人血清取样进行免疫检测。

本发明进一步涉及检测乙型肝炎病毒感染的方法，包括对人血清样品进行定量免疫检测，以确定其中的抗体含量，即抗HBV被膜的前S基因编码区域的抗原的抗体，该方法利用上述乙型肝炎肽免疫原进行，并将数据与已知标准比较。

本发明进一步涉及检测乙型肝炎病毒感染的方法包括对人血清样品进行定量免疫检测，以确定由乙型肝炎病毒被膜的前S基因编码区域编码的抗原数量，该方法利用上述抗乙型肝炎肽免疫原的抗体进行，并将数据与已知标准比较。

本发明进一步涉及产生抗体的方法，包括将上述乙型肝炎肽免疫原导入一种动物中。

进一步，本发明涉及合成含有组氨酸和色氨酸的肽段的方法，包括下列步骤

a.将含有α氨基保护基团的第一氨基酸连接到一种树脂上;

b.去掉α氨基保护基团;

c.将含有α氨基保护基团的第二氨基酸偶联到第一氨基酸上;

d.通过进一步偶联α保护的氨基酸重复步骤b和c，产生一种所需的肽，其中至少有一个氨基酸是组氨酸，至少有一个氨基酸是色氨酸;

e.从树脂上切下肽，去掉所述第一氨基酸上残留的保护基团;

f.用组氨酸（Im DNP）取代组氨酸;

g.用色氨酸（In Formyl）取代色氨酸;

h.在切掉和去除保护基团以前，去掉DNP，以及

i.在切掉和去除保护基团过程中去掉甲酰基（Formyl）。

本发明进一步涉及一种帮助病体抵抗乙型肝炎感染的预防方法，包括给这种病体，例如人，施用有效剂量的上述疫苗。

申请人进一步发现一种筛选HBV被膜蛋白的系统方法，以对由肝细胞靶上受体识别的区域进行定位。这种系统的筛选方法一般可能有助于辨别病毒上的细胞受体识别位点及抗原决定基，它们与感染性的中和有关，并尤其有助于确定HBV受体的特征。在病毒蛋白结构与功能关系的研究中，此方法最终将成为补充其它方法的有力手段。

因此，本发明还涉及这样一种方法，即确定可能诱导出中和病毒的抗体的肽，此方法包括，

a.合成多种应于病毒被膜基因产物的不同肽段，

b.产生抗步骤a的肽的抗体，以及

c.确定与病毒受体结合的肽、肽和抗肽的抗体是否抑制病毒和细胞表面的反应。

图1表明通过还原而解离的HBs Ag的多肽成分在脲中进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（“SDS-PAGE”）的结果。a条表明通过银染色检测出来的分离蛋白，b条是与人抗乙型肝炎抗血清进行蛋白质印迹法的结果。

图2表明前S基因区转译产物的氨基酸序列，从HBV DNA的序列推测产生。序列以单字母氨基酸缩写符表示（这种缩写符已在本文中有定义）。指出了五种不同的HBV亚型的序列。底部第6行表明所有五种亚型共有的氨基酸残基。

图3表明对应于前S基因产物的氨基酸序列的相对亲水性图形。除了ayw以外，各亚型的图形相似。图中从蛋氨酸175至右边的部分代表S基因的转译产物。

图4中的两套柱图表明兔子的平均免疫应答，兔子用游离的前S120-145（图4A）及其与含有L-酪氨酸-偶氮苯基-对-胂酸盐（RAT）基团的交联脂质体相连后（图4B）进行免疫。抗HBs（抗HBs Ag抗体），交叉形线柱;抗-前S120-145，对角线形线柱。用没有RAT基团的脂质体得到与图4B相似的结果，只是在六周后的应答水平稍低。对应于零时的柱代表免疫前的血清。

图5描绘了用与脂质体连接的前S120-145免疫兔子，对其血清进行一系列稀释后进行的放射性免疫检测。抗-HBs（抗HBs Ag抗体），■;抗-前S120-145，●。从抗-前S120-145各种稀释度的每分钟计数（cpm）中，减去免疫前血清相应稀释度的cpm;用差值作图。血清的终点效价（1/163，840）对应于最高的稀释度，此处，它的cpm比同样稀释度的免疫前血清的cpm高≥2.1。

图6表明在蛋白质印迹法中，抗-前S120-145与P33和P36的反应（与图1相似）。

图7描绘了乙型肝炎抗原的诊断测试，以抗-前S120-145包膜的聚苯乙烯小球为基础。

图8汇集描绘了兔子个体对S135-155（HBV被膜基因的开放读码框的氨基酸309至329）结合物的抗体应答。结合物的种类由表1中定义的数目表明。使用S135-155-β-半乳糖苷酶结合物和Pansorbin，测定第三次免疫两周后得到的血清抗体（Neurath等人，1982，见上）。

与S135-155-KLH结合物诱导出的抗体水平相比较给出它们的相对效价。用RIA法（AUSR IA法，Abbott实验室，North Chicago，Illinois）对抗-HBs进行检测的结果用毫国际单位给出（mIU/ml;Neurath等人，1982，见上）。线条对应于计算出来的线性回归，它最适于兔的抗-HBs应答的所有数据。计算出的相关系数（＝0.55）表明，在抗-HBs和抗-S135-155的应答之间的相关性很弱。

图9表明了四套柱图（图9A、图9B、图9C和图9D），描绘了用不同的S135-155-结合物免疫兔子后的抗体应答的时间进程实例（每一种由表1定义的数目指明）。图9A对应于5号结合物;图9B对应于11号结合物;图9C对应于12号结合物，图9D对应于19号结合物。如图8中所述测定抗-HBs（虚线柱）和抗-S135-155（黑柱）。

图10给出了四个图（A、B、C和D），描绘了抗体应答的动力学，抗体抗前S（120-145）肽（

）和约为22nm的HBs Ag球形颗粒中的前S蛋白（），抗体由未结合的前S（120-145）肽诱导（图A），由与半胱氨酸活化的交联脂质体连接的同样肽诱导（图B），该脂质体上结合有RAT（L-酪氨酸-偶氮苯-对-胂酸盐）基团;以两周的间隔，用4次剂量的前S（120-145）肽（图C）和前S（12-32）肽（图D）免疫兔子后，载体对其血清中抗肽抗体效价的影响。图C和D中的载体为：（1）没有;（2）钥孔

血蓝蛋白（KLH）;（3）明矾;（4）和（5）有或没有结合RAT基团的半胱氨酸活化的交联脂质体。除（3）以外，所有情况中都使用完全或不完全的Freund氏佐剂。

图11中的两个图给出了不同稀释度的兔抗血清中Ig G抗体的放射性免疫检测结果：抗前S（120-145）抗体（●）;抗HBV颗粒及管形HBs Ag（○）抗体，缺乏可由RIA检测出来的抗S蛋白的抗体，以及抗氯霉素乙酰转移酶和缺乏C端41个氨基酸残基的前S蛋白序列的融合蛋白的抗体（□）;乙型肝炎病愈者血清中的IgG（△）和IgM（▲）抗体。后一种血清是在可以检测的抗S蛋白抗体出现之前抽出的。用20g/ml游离的前S（120-145）肽或前S（12-32）肽包膜Immulon2型可移条（Dynatech实验室），然后用明胶包膜（2.5mg/ml，在0.1M Tris中pH8.8）。包膜条件及双抗体RIA法见于A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，Science，224∶392，1984和A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick Proc，Natl.Acad.Sci.USA.79∶7871，1982。

图12表明对抗-前S（120-145）Ig G（抗血清以1∶100稀释）和前S（120-145）-β-半乳糖苷酶结合物反应的抑制，抑制剂为游离的前S（120-145）肽（●）;20nm的HBs Ag球形颗粒（▲）和HBV颗粒（■）。通过放射性免疫检测法（AUSRIA，Abbott实验室）测定后两种制备物含有同样浓度的HBs Ag S蛋白。

图13描绘监视过程中抗前S（120-145）-抗体的效价变化，并表明在急性乙型肝炎感染期间，抗前S基因编码蛋白的Ig M（●）和Ig G（■）抗体的发展。

图14表明含有HBV特异性蛋白的各种制备物在聚苯乙烯小球上的放射性免疫检测结果，所述小球用抗前S（120-145）Ig G包膜（○、●、□），或用抗HBV颗粒及管形HBs Ag兔抗血清Ig G包膜（▲、△）。测试抗原为：HBV颗粒及管形抗原（●、▲）;从血浆中分离的约为20nm的HBs Ag球形颗粒（○、△）;后一种颗粒用胃蛋白酶处理（1mg/ml HBs Ag，50μg/ml胃蛋白酶在0.1M甘氨酸-HCl中，pH2.2，37℃下2小时）（□）。

图15描绘了聚合的清蛋白结合位点的放射性免疫检测的结果，所述位点与人血浆中分离到的含有前S基因编码的序列的HBs Ag结合（·），或与重组DNA转染酵母产生的HBs Ag相结合，该重组DNA中含有HBV DNA的S基因，因此，此HBs Ag中缺乏前S基因编码的序列（○）

图16是一系列四套柱图，描绘了在HBV被膜的前S蛋白中筛选人Hep G2肝癌细胞的识别区域的结果。

图17是HBV被膜蛋白的示意图。

图18表明用与脂质体相连的前S（21-47）免疫兔子后，对其血清中识别同源肽或HBV的抗体进行检测的结果。

图19表明抗肝细胞上HBV结合位点抗体的检测结果。

图20表明HBV的肝细胞结合位点出现的检测结果。

图21表明HBs Ag的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。

图22是抗前S（21-47）对HBV的免疫沉淀的电镜照片（图a），和HBV DNA杂交对HBV的免疫沉淀（图b）。

图23表明在急性乙型肝炎患者的血清中，乙型肝炎标记物出现的时间进程。

图24A是用肽-β-半乳糖苷酶结合物进行ELISA试验的结果。

图24B是双抗体固相检测的结果。

图25表明用兔抗前S（120-145）抗体检测8种前S肽的结果。

图26表明用前S（120-145）-β-半乳糖苷酶结合物与兔抗前S（120-145）抗血清或兔抗HBV抗血清检测抑制作用的结果。

从对应于好几种HBV被膜基因亚型（见图2）的前S部分序列推导出的氨基酸序列，具有下列与S蛋白不同的性质：（ⅰ）高亲水性及高百分比的带电荷残基（E.Schaeffer，J.J.Sninsky，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶2902，1984）;（ⅱ）没有半胱氨酸残基;（ⅲ）在HBV DNA的基因产物中具有最高的亚型依赖的可变性;及（ⅳ）与对应于非人类肝病毒（hepadnaviruses）的类似序列很少有同源性（F.Galibert，T.N.Chan，E.Mandart，J.Virol.，41∶51，1982）。这些性质表明，HBV被膜的前S基因编码的部分暴露在病毒粒子的表面，是宿主免疫应答的靶子，并由此确定HBV的宿主范围（限于人类和某些灵长类动物）。具有预定特异性的合成肽及其抗体，提供了探索HBV被膜前S部分蛋白的生物学作用的手段。

HBs Ag中的二硫键断裂导致：

a.由完整HBs Ag诱导的多克隆抗体（G.N.Vyas，K.R.Rao，A.B.Ibrahim，Science，178∶1300，1972;N.Sukeno，R.Shirachi，J.Yamaguchi，N.Ishida，J.Virol.，9∶182，1972;G.R.Dressman，F.B.Hollinger，R.M.Mc Combs，J.L.Melnick，J.Gen，Virol.，19∶129，1973;和A.R.Neurath，N.Strick，J.Med.Virol.，6∶309，1980）和某些单克隆抗体（J.Pillot，M.M.Riottot，C.Geneste，L.Phalente，R.Mangalo，Develop.Biol.Stand.，印刷中，1984）的结合显著下降，和

b.免疫原性的降低（Y.Sanchez，I.Ionescu-Matiu，J.L.Melnick，G.R.Dressman，J.Med.Virol.，11∶115，1983）。然而，某些抗原决定基对于二硫键的还原作用具有抗性（M.Imai，A.Gotoh，K.Nishioka，S.Kurashina，Y.Miyakawa，M，Mayumi，J.Immunol.，112∶416，1974）。这些抗原决定基对于所有HBV抗原亚型是共同的，但还未确定它们在HBV被膜组分上的定位。本发明利用不依赖二硫键的抗原决定基进行定位的优越性，这些抗原决定基在HBs Ag次要蛋白P33和P36的N端部分（由HBV DNA的前S基因编码），以及在前S基因编码蛋白的其它区域。

这些还原并解离的HBs Ag上的决定子代表优势抗原决定基，它们与人抗-HBs反应。前S120-145高度精确地模仿它们，与对应于S基因的合成肽类似物相比较，前S120-145以高400倍的效率诱导抗HBs Ag抗体（A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79∶7871，1982）。对于HBV蛋白的合成肽类似物，还没有过以如此高的水平识别病毒的先例。这些抗体可用于诊断试验，对HBV携带者血清中的前S基因编码的抗原决定基进行直接测定。

前S基因在肝病毒（hepadnavirus）基因组的所有区域中差异最大（F.Galibert，T.N.Chen，E.Mandart，J.Virol.，41∶51，1982）（HBV是肝病毒科中的一个种）。

本发明的乙型肝炎疫苗含有一种肽，即可是一种合成肽（通过化学方法或表达载体（DNA途径）装配单个氨基酸而产生的肽），也可是产生于天然来源的肽，这种肽具有对应于乙型肝炎病毒表面抗原的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链。此链长度可以是，例如，至少10、15、20或26个氨基酸。根据本发明的具体方案，一个较好的肽是分布于序列位置前S120和前S174之间的氨基酸链，更好的这种链包括序列位置前S120处的N端蛋氨酸。一个较好的肽是对应于序列位置前S120和前S145之间的氨基酸链，也即前S（120-145）。

较好的链位置包括下列：（1）在亚型adw₂和adr中，完全在序列位置前S1和前S11之间并包括两端的氨基酸链;（2）在序列位置前S10和前S40之间并包括两端，（3）序列位置前S15和前S120之间并包括两端，（4）序列位置前S15和前S55之间并包括两端，（5）序列位置前S90和前S120之间并包括两端。本发明特别好的链有26个氨基酸，包括序列位置前S120处理的N端蛋氨酸，并位于序列位置前S120和前S174之间。

本发明较好的肽包括下列：

1.前S（12-32），此序列在亚型adw₂中是MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDP（见图2）;

2.前S（120-145），此序列在亚型adw₂中是

MQWNSTAFHQTLQDPRVRGLYLPAGG（见图2）

3.前S（32-53），此序列在亚型adw₂中是

PAFGANSNNPDWDFNPVKDDWP（见图2）;

4.前S（117-134），此序列在亚型adw₂中是

PQAMQWNSTAFHQTLQDP（见图2）;

5.前S（94-117），此序列在亚型adw₂中是

PASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHP（见图2）;

6.前S（153-171），此序列在亚型adw₂中是

PAPNIASHISSISARTGDP（见图2）;

7.前S（1-21），此序列在亚型adw₂中是

MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNP（见图2）;

8.前S（57-73），此序列在亚型adw₂中是

QVGVGAFGPRLTPPHGG（见图2）;

9.前S（1-11），a.在adw₂中，此序列是

MGGWSSKPRKG（见图2）;

b.在adr中，此序列是MGGWSSKPRQG（见图2）;

10.前S（21-47），此序列在亚型adw₂中是

PLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFND（见图2）;

11.前S（12-47），此序列在亚型adw₂中是

MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP（见图2）;

12.前S（120-153），此序列在亚型adw₂中是

MQWNSTAFHQTLQDPRVRGLYLPAGGSSSGTVNP（见图2）;

13.前S（132-137），此序列在亚型adw₂中是

QDPRVR（见图2）;

14.前S（53-73），此序列在亚型adw₂中是PAANQVGVGAFGPRLTPDHGG（见图2）;

15.前S（128-139），此序列在亚型adw中是

HQTLQDPRVRGL（见图2）。

本发明中前S基因编码的序列的任何类似物都可以使用，包括氨基酸缺失、氨基酸替换，例如由其它氨基酸替换、或由同配物（修饰过的氨基酸，与蛋白氨基酸有严格的结构和空间相似性）替换、氨基酸加入、同配物加入等，只要序列诱导的抗体能够识别HBV的前S蛋白或乙型肝炎表面抗原即可。

从天然来源产生肽时，通过化学试剂或酶对蛋白进行分解，使含有所需氨基酸序列的蛋白进行选择性蛋白水解。通过合成产生肽时，要求对所需氨基酸链进行化学合成。

产生本发明的合成疫苗时，最好是要保证氨基酸链（肽残基）的空间构型能被抗乙型肝炎病毒的抗体所识别，该氨基酸链对应于乙型肝炎病毒的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸。为达到这一目的，在给定氨基酸链的一侧或两侧，可能共价结合一个或更多的额外的氨基酸作为氨基酸链的一部分。这些额外氨基酸可作为辅助氨基酸提高氨基酸链的稳定性，使它容易被抗乙型肝炎病毒的抗体所识别。额外氨基酸可以是天然蛋白中同样序列的同样的氨基酸，或可以使用其它氨基酸。

在本发明的一种形式中，链长最少为六个氨基酸的肽的任一侧，都可以共价结合额外的氨基酸，例如，在残基的任一侧结合三个氨基酸，从而形成更长的氨基酸链。氨基酸链可含有不止一个对应于乙型肝炎病毒表面抗原的前S区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸序列。

单个氨基酸序列的长度取决于产生序列的方法。如果通过化学手段装配单个氨基酸而产生序列，则序列长度一般不超过50个氨基酸，更好是不超过40个氨基酸。如果通过DNA途径获得合成肽，链长度可更长些，例如，100个或更多的氨基酸。然而，它一般短于天然的前S蛋白，最佳情况是显著短于前S蛋白。因此，在肽具有S区和前S区二者的具体方案中，其相应于S区的肽部分短于天然的S蛋白，例如，不多于100个氨基酸，更好是不多于40个氨基酸，并且一般少于30个氨基酸。在这种情形中，相应于前S区的肽部分的长度可以对应于整个前S区，但一般少于整个前S区。

如果肽不含对应于S区的氨基酸序列的成分，则它可以含有对应于整个前S区的氨基酸序列，或短于整个前S区。

然而，如果氨基酸序列是一条长链的一部分，例如如果有不止一个的氨基酸序列时，链可以含有不同部分的残基，例如，多聚氨基酸或多糖的片段。

除了含有一个或多个不同的或同样的对应于乙型肝炎病毒前S区中至少六个连续氨基酸的氨基酸序列外，例如，含有不止一个对应于乙型肝炎病毒前S区中不同抗原决定基的氨基酸序列，本发明的疫苗还可含有包括不同抗原或变应原的抗原决定基的氨基酸链，以形成抗乙型肝炎病毒和一种或多种其它疾病的疫苗，例如，麻疹、流感、天花、脊髓灰质炎、白喉等，这只是提及了几种。这种额外基酸序列可以是不同长度的氨基酸链。

本发明的乙型肝炎疫苗，除了包括一个或多个对应于乙型肝炎病毒表面抗原的前S区中至少六个连续氨基酸的氨基酸序列外，还可包括一个或多个对应于乙型肝炎病毒表面抗原的S区中连续氨基酸的氨基酸序列，例如，

141 142 143 144 145 146

Lys Pro Thr Asp Gly Asn，

或

138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr

149

Cys

其它对应于HBs Ag（S区）的抗原决定基，并因此可在同一链中与一个或多个对应于HBs Ag前S区中至少六个氨基酸的氨基酸序列结合的肽包括下列：

位置氨基酸序列

（2）48-81 Cys-Leu-Gly-Gln-Asn-Ser-Gln-Ser-Pro-Thr-

Ser-Asn-His-Ser-Pro-Thr-Ser-Cys-Pro-Pro-

Thr-Cys-Pro-Gly-Thr-Arg-Trp-Met-Cys-Leu-

Arg-Arg-Phe-Ile

（3）2-16 Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-

Leu-Leu-Val-Leu-Gln-Cys

（4）22-35 Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-

Leu-Asp-Ser-Trp-Cys

（5）38-52 Ser-Leu-Asn-Phe-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Val-

Cys-Leu-Gly-Gln-Asn

（6）47-52 Val-Cys-Leu-Gly-Gln-Asn

（7）95-109 Leu-Val-Leu-Leu-Asp-Tyr-Gln-Gly-Met-Leu-

Pro-Val-Cys-Pro-Leu

（8）104-109 Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu

氨基酸序列之间可以相互连接，例如通过交联，或以支链的形式直接共价结合在上面，或者不同的序列可以共价结合到一种中心“载体”上。

本发明发现一种合成疫苗，其特征在于它不含乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白，即本发明的疫苗由一个或多个这样序列的肽组成，此序列对应于乙型肝炎病毒被膜蛋白的一个有限的部分。本发明的疫苗也不含病毒粒子中的其它蛋白。可以合成不含由生物产生的组分的疫苗，并且不含不论是活性的或失活的病毒组分、不含抗体、不含脱氧核糖核酸（DNA），因此可能基本上避免其它疫苗中常见的不利的副作用（如病毒的意外感染、过敏反应、发烧等）。

应当认识到，本发明的疫苗可与其它蛋白形成混合物，这些蛋白包括已知的抗原和变应原。因此，本文指出疫苗的特征在于不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列时，其意思是指，尽管缺乏这些蛋白，该组合物仍可作为疫苗使用，即通过产生抗体提供保护性免疫作用。

因此，本发明的肽能够形成“中和抗体”，即帮助病人抵抗乙型肝炎病毒的抗体。自然，本发明还涉及预防病人感染传染性乙型肝炎的方法。

本发明的肽和疫苗可用于提高免疫应答，并可克服某些已知的乙型肝炎病毒疫苗（如不含对应于前S区中氨基酸序列的肽段）的非应答性。

本发明的肽可与这样的肽一起使用，它含有对应于HBs Ag的S基因编码的区域中连续氨基酸的氨基酸链。另外，本发明的具体方案中还包括这样的肽，它含有对应于跨越前S和S区的连续氨基酸的氨基酸链和前S160至S20。

可为本发明的合成肽提供一种载体。但应当认识到，实施本发明可以不要求载体，即产生本发明的抗体时可以不使用载体。

“载体”是一种简单的生理上可接受的物质，合成肽结合在上面，载体可望提高免疫应答。载体可包括一个简单的氨基酸链或其它部分，就此而言，可特别地考虑作为载体使用的有二聚体、寡聚体、或对应于本发明合成肽的氨基酸序列的较高分子量的聚合物。换言之，确定了要形成的合成肽所需的氨基酸序列后，这些氨基酸可通过可得到的天然原料产生，或可通过合成产生，并能通过聚合作用构建两个或多个重复单位的链，使重复序列既可作为“载体”又可作为合成肽使用。换句话说，可以不要求独立的的载体。另外，在确定的合成肽的氨基酸两端可加入额外的氨基酸不同载体最好包括某些物质，动物的、植物的或矿物质都可，它们在生理上是可接受的，起着输送合成肽的作用，以使它被宿主的免疫系统所识别并刺激出令人满意的免疫应答。因此，考虑了大量具有生物活性和/或促进免疫应答的载体，其中包括惰性原料。例如，蛋白质可作为载体使用。蛋白载体的例子包括破伤风类毒素、钥孔

血蓝蛋白等。

还考虑用多糖作为载体，尤其包括分子量为10，000至1，000，000的多糖，具体地说，包括淀粉、葡聚糖、琼脂糖、ficoll或其羧甲基衍生物和羧甲基纤维素。

还考虑用多聚氨基酸作为载体，这些多聚氨基酸包括多聚赖氨酸、多聚丙氨酰多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸和多聚（C₂-C₁₀）氨基酸，这并不是全部。

有机聚合物可作为载体使用，例如，这些聚合物包括胺、酰胺、烯链、乙烯基、酯、乙缩醛、多酰胺、碳酸盐和醚及其类似物等等的聚合物和共聚物。一般说来，这些聚合物的分子量有显著差别。聚合物可以是两个至数千个重复单位，例如两千个重复单位。当然，重复单位的数目要适应于疫苗在动物宿主中的使用。一般说来，这种聚合物具有较低的分子量，比例在10，000和100，000之间（分子量由超速离心测定）。

还可使用无机聚合物。这些无机聚合物可以是包含部分有机物的无机聚合物。具体地说，硅酸盐和氢氧化铝可作为载体使用。载体最好同时是一种免疫学佐剂。在此情形中，特别考虑的佐剂是胞壁酰二肽及其类似物。

载体还可以是交联剂的残基，这是用以连接许多合成肽含有链的交联剂。交联剂含有醛（如戊二醛）、羧基、胺、酰胺、亚胺或迭氮基苯基作为其功能基团。具体地说，考虑使用丁醛、二价亚胺酯或碳化二亚胺作为交联剂。尤其考虑具有下述分子式的二价亚胺酯

其中m为1至13，R是一至四个碳原子的烷基。特别考虑作为交联剂使用的碳化二亚胺包括环乙基碳化二亚胺、乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺、N-乙基吗啉代环己基碳化二亚胺和二异丙基碳化二亚胺。

肽的化学合成的记述见于下列文献：S.B.H.Kent，《生物医学聚合物》，Goldberg，E.P.和Nakajima，A.编，（Academic Press，New York），213-242，1980;A.R.Mitchell，S.B.H.Kent，M.Engelhard，R.B.Merrifield，J.Org.Chem.，43∶2845-2852，1978;J.P.Tam，T.-W.Wong，M.Riemen，F.-S.Tjoeng，R.B.Merrifield，Tet.Letters，4033-4036，1979;S.Mojsov，A.R.Mitchell，R.B.Merrifield，J.Org，Chem.45∶555-560，1980;J.P.Tam，R.D.Di Marchi，R.B.Merrifield，Tet，Letters，2851-2854，1981;S.B.H.Kent，M.Riemen，M.Le Doux，R.B.Merrifield，《第四届国际蛋白质序列分析方法会议论文集》，（Brookhaven Press，Brookhaven，

N.Y.），印刷中，1981。

化学合成：在所谓的“Merrifield氏固相合成法”中，从羧基端氨基酸向氨基端氨基酸构建合适的L-氨基酸序列。首先，通过化学连接使羧基端氨基酸结合在聚苯乙烯（或其它合适的）树脂的氯甲基基团、二苯甲基胺基团或其它反应基团上，利用下述方法将氨基酸一个个地加上去。将肽-树脂：

a.用二氯甲烷洗涤;

b.在二氯甲烷中于室温下与5%（v/v）二异丙基乙基胺（或其它阻碍碱）混合10分钟使之中和;

c.用二氯甲烷洗涤;

d.使六倍于生长肽链摩尔数量的氨基酸活化，即使它与一半摩尔数量的碳化二亚胺（如二环己烷碳化二亚胺或二异丙基碳化二亚胺）在0℃下结合10分钟，使之形成对称的氨基酸酐。所用氨基酸的最初形式应该是N-α-叔丁基-氧羰基衍生物，侧链用苯基酯（如天冬氨酸或谷氨酸）、苯基醚（如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或酪氨酸）、苯基氧羰基（如赖氨酸）或其它肽合成中的常用保护基保护。

e.使活化氨基酸在室温下与肽-树脂反应两小时，使新的氨基酸加到生长肽链的末端;

f.用二氯甲烷洗涤肽-树脂;

g.从大多数刚加上去的氨基酸上去掉N-α叔丁基氧羰基基团，即在二氯甲烷中于室温下使之与30-65%，最好是50%（v/v）的三氟乙酸反应10至30分钟;

h.用二氯甲烷洗涤肽-树脂;

i.重复步骤a至h，直到建成所需的肽序列。然后从树脂上切下肽，并同时去掉侧链保护基团，即使之与含有1%v/v的苯甲醚或其它合适（芳香的）清除剂的无水氢氟酸反应。然后，通过凝胶过滤、离子交换、高压液相层析或其它合适方法可使肽纯化。

在某些情形中，可以不用固相树脂进行化学合成，在这些情况中，合成反应完全在溶液中进行。这些反应在现有技术中是相似和完全已知的，最终产物基本上是一致的。

从天然来源中分离：如果能够得到足够数量的完整的抗原蛋白，则可通过下述任一种方法，将携有所需氨基酸序列的有限部分从该分子上切下来：

a.用蛋白水解酶降解蛋白，尤其使用这样的酸，其底物专一性使蛋白在紧邻所需氨基酸序列的位点被切断;

b.通过化学方法切割蛋白。与专一性试剂反应可切断氨基酸之间的特殊化学键。例子包括：溴化氰切断涉及蛋氨酸的键;羟胺切断天冬酰胺酰-甘氨酸;

c.蛋白水解和化学切割相结合。

还应当可能克隆编码所需氨基酸序列的DNA小片段，DNA可来自天然来源，或通过合成程序制备，或通过两种方法的结合得到，从而通过细菌或其它细胞生产肽。

与此相似，还能够通过下述技术形成含有大量氨基酸序列的链：使一种肽或多种肽的水溶液与水溶性碳化二亚胺（如乙基二甲基-氨基丙基碳化二亚胺）混合。这可导致肽的聚合作用;根据上述所用的侧链阻碍基团，可制备成直链或支链的聚合物。

如果需要，在本发明的合成肽上面，可以共价结合下述任何一种链：多肽、多聚氨基酸、多糖、多酰胺或聚丙烯酰胺，它们可作为稳定链起作用，或可以作为单个链氨基酸之间的桥接。这些链可在市场上购得，或对于多聚氨基酸来说，可通过下述方法形成：使所需氨基酸序列的溶液与氨基酸的N-羧基酐溶液混合，使之发生碱催化的聚合作用，这是由肽的胺基启动的。

虽然可以不要求载体，但如果使用载体的话，可由下述方法使一种链或多种链在“载体”上沉积：

1.蛋白质载体：蛋白和合成肽共同溶于水中或其它合适的溶剂中，并通过由碳化二亚胺的作用形成的酰胺键共价连接。形成的产物可能在每个蛋白单体中含有一个或多个肽的拷贝。另外，可在含有巯基的载体中加入还原肽以形成二硫键。另一种方法是，在含有马来酰亚胺基的蛋白载体中加入还原肽，从而通过Michael氏加成作用或任何其它共价结合方式形成共价连接。

2.多糖载体：寡糖载体的分子量应在1，000至1，000，000范围内。为了使它们与合成肽共价连接，必须首先在上面结合合适的功能基团。通过与碘乙酸反应可导入羧基，产生羧甲基化的多糖，或通过与羰基二酰亚胺噁唑（Carbonyldiimidaazole）反应产生活化羰基酯。羧甲基多糖通过碳化二亚胺反应与肽偶联，而活化的羰基酯与肽进行自发反应。在每个寡聚糖单位上应结合多个合成肽的拷贝。

3.多聚氨基酸载体：这些载体的分子量应在1，000至1，000，000的范围内。多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸的侧链上有一级氨基，多聚天冬氨酸和多聚谷氨酸有羧基。肽可通过碳化二亚胺反应由酰胺键偶联在它们上面。另一种具有可用于偶联的氨基的载体是多聚赖氨酸，在此载体上，多聚丙氨酸能够结合在赖氨酸残基的侧链上。合成肽也可通过碳化二亚胺反应结合在多聚丙氨酸链的末端。在每个寡聚肽单位上应当结合多个合成肽的拷贝。

本发明的新型载体包括一种脂质囊泡，其外表面具有活性位点。这种活性位点包括-COOH、-CHO、-NH₂和-SH。脂质载体可通过稳定剂形成交联而稳定化，稳定剂包括例如至少有两个功能基团的醛，如一种双功能醛，如戊二醛。

在脂质囊泡载体的外表面的活性位点上，发生肽与脂质囊泡载体的键合。不期望通过任何适用性理论进行结合，这种键合相信至少是共价结合。

有可能使一个肽结合在脂质囊泡外表面的两个活性位点上。例如，肽一端的-NH₂基可与脂质囊泡外表面的活性位点-COOH结合。肽的另一端则可与脂质囊泡的另一种活性位点结合，例如，肽另一端的-COOH基可与脂质囊泡的活性位点-NH₂结合。

支持本发明合成肽的较好的载体是一种脂质囊泡。通过对水介质中的脂质进行声波处理，通过在缓冲液中再悬浮干燥过的脂质层，或通过在选择的缓冲液中透析溶于有机溶剂中的脂质可形成脂质囊泡。后一种方法更好。脂质囊泡由双层脂质的球体组成，其中含有部分水相介质。

本发明的脂质囊泡（非蛋白）载体可通过多种途径生成。产生这种载体的较好的方法是，用多醛，如二醛，例如丁二醛（琥珀醛）、戊二醛、己二醛、庚二醛和辛二醛处理含有氨基烷和二氨基烷的脂质囊泡，这些氨基烷和二氨基烷含有10至18个碳原子，例如十八烷基胺、十六烷基胺和十四烷基胺。另外，可用前面所述多醛处理含有氨基烯和二氨基烯的脂质体，这些氨基烯和二氨基烯含有10至18个碳原子，例如油胺。这样形成的脂质囊泡载体在其表面有活性醛基，可使肽通过其N端或赖氨酸基团直接连在上面。

连接在本发明脂质囊泡载体上的肽，还可如上述通过由碳化二亚胺，例如N-乙基-N′（二甲基氨基丙基）碳化二亚胺，活化的肽处理含有氨基的脂质囊泡来制备。

另外，碳化二亚胺活化的肽被连接到多醛如二醛处理过的脂质囊泡上，而该脂质囊泡是通过与一种水溶性二氨基烷，例如乙烯二胺和丙烯二胺，进行反应产生的。

进一步，含有12至18个碳原子脂肪酸（饱和及非饱和的），例如硬脂酸、油酸、棕榈酸和十四酸的脂质囊泡用碳化二亚胺进行活化。此后，使活化的脂质囊泡与肽反应。

形成本发明载体的另一种方法是，利用脂肪酸醛作为脂质囊泡的组分，如用戊二醛处理脂质囊泡一样处理这种脂质囊泡。使这种脂质囊泡直接与肽的氨基进行反应。

在本发明载体的一个较好的具体方案中，如前述用多醛处理10至18个碳原子氨基烷或二氨基烷（或氨基烯或二氨基烯）以形成脂质囊泡载体，然后使它进一步与半胱氨酸（L-或D-或LD-半胱氨酸）反应。然后使这些脂质囊泡与含有-SH的肽，例如含有半胱氨酸的肽进行反应。脂质囊泡和肽之间通过二硫键连接。

另外，用脂肪酸硫醇作为脂质载体的组分，例如十八烷硫醇。含有半胱氨酸的肽与此脂质囊泡直接相连。

形成本发明载体的另一种方法是，制备含有上述脂肪酸硫醇的脂质囊泡，使它进一步与二马来酰亚胺反应，例如对或邻N-N′-亚苯基二马来酰亚胺。然后使此脂质囊泡与含有半胱氨酸的肽反应。

另外，通过市售可得的交联剂的作用，可以完成合适的脂质囊泡和合适的肽之间的连接，交联剂有二甲基己二亚胺盐;二甲基3，3′-二硫二丙亚胺盐;2-亚氨基巯烷;二-琥珀酰亚胺基辛二酸盐;二[2-（琥珀酰亚胺基氧羰氧）-乙基]砜;二琥珀酰亚胺基酒石酸盐;二硫二（琥珀酰亚胺基）丙酸盐;亚乙基二醇二（琥珀酰亚胺基琥珀酸盐）;N-5-迭氮基-2-硝基苯甲酸基-琥珀酰亚胺;对-迭氮苯甲酰甲基溴;对-迭氮-苯基-乙二醛;4-氟-3-硝基苯基迭氮化物;N-羟基-琥珀酰亚胺基-4-迭氮-苯甲酸盐;N-羟基琥珀酰亚胺基-4-迭氮水杨酸;间-马来酰亚胺苯甲酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯;甲基-4-迭氮苯并亚胺盐;对-硝基苯基2-重氮基-3，3，3-三氟-丙酸盐;N-琥珀酰亚胺-6-（4′-迭氮-2′-硝基苯基氨基）己酸盐;琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐;琥珀酰亚胺4-（对-马来酰亚胺甲基）丁酸盐;N-（4-迭氮苯基硫）苯邻二甲酰亚胺;乙基4-迭氮苯基1，4-二硫丁酰亚胺盐，N-琥珀酰亚胺（4-迭氮苯基二硫）丙酸盐;1-5-二氟-2，4-二硝基苯;4，4′-二氟-3，3′-二硝基二苯基砜;4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺酸芪;对-亚苯基二异硫氰酸盐;4，4′-二硫二苯基迭氮化物;赤藓醇二碳酸盐;N-琥珀酰亚胺3-（2-吡啶基二巯）丙酸盐;二甲基庚二酰亚胺盐和二甲基辛二酰亚胺盐。

本发明的脂质载体不仅可起载体的作用，还可起佐剂的作用。

本发明合成的脂质囊泡载体可用来结合乙型肝炎表面抗原的合成肽类似物，尤其是乙型肝炎表面抗原的新的合成肽类似物，它含有的氨基酸序列对应于HBV前S基团编码的区域中的氨基酸序列，此外，还可用来结合各种病毒、细菌、人和动物的变应原和寄生物蛋白的合成肽类似物（诱导保护性抗体）。

因此，本发明合成的脂质囊泡载体可用来结合下列病毒的合成肽类似物：流感血细胞凝集素（A/memphis/102/72菌株、A/Eng 1878/69菌株、A/NT/60/68/29c菌株、A/Qu/7/70菌株）、家禽瘟疫病毒血细胞凝集素、牛痘、脊髓灰质炎、风疹、细胞肥大病毒、天花、疱疹单纯型Ⅰ和Ⅱ、黄热病、传染性小鼠脱脚病病毒、牛痘病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、马鼻-肺炎（马流产）病毒、家畜的恶性粘膜炎病毒、猫鼻气管炎病毒、犬疱疹病毒、EB病毒（与传染性单核和Burkitt淋巴瘤结合）、Marek氏病病毒、羊肺腺瘤病（Jaagziekte）病毒、细胞肥大病毒、腺病毒类、人乳头状瘤病毒、猫肠炎病毒、水貂肠炎病毒、非洲马病病毒（9种血清型）、蓝舌病病毒（12种血清型）、鲑鱼传染性胰坏死病毒、家禽肉瘤病毒（不同菌株）、鸟类白血病病毒（内脏的、成红血细胞的和成髓细胞的）、骨硬化病病毒、鸡瘟病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、流行性腮腺炎病毒、土耳其病毒、CANADA/58、犬热病病毒、麻疹病毒、呼吸道多核病毒、粘液瘤病毒、A型病毒如人流感病毒，例如，Ao/PR8/34、A1/CAM/4b和A2/Singapore/1/57;家禽瘟疫病毒、B型流感病毒如B/Lee/40、狂犬病病毒、东方马大脑炎病毒、西方马大脑炎病毒、黄热病病毒、登革热1型病毒（＝6型）、登革热2型病毒（＝5型）、登革热3型病毒、登革热4型病毒、日本脑炎病毒、Kyasanur森林病毒、绵羊跳跃病病毒、澳洲墨来溪谷脑炎病毒、Omsk出血热病毒（Ⅰ和Ⅱ型）、圣路易斯脑炎病毒、人鼻病毒、口蹄疫病毒、1型脊髓灰质炎病毒、肠病毒脊髓灰质炎2、肠病毒脊髓灰质炎3、鸟类传染性支气管炎病毒、人呼吸道病毒、猪传导性胃肠炎病毒、淋巴细胞性脉胳丛脑膜炎病毒、Lassa病毒、Machupo病毒、Pichinde病毒、Tacaribe病毒、乳头状瘤病毒、猿病毒、Sindbis病毒等等。

本发明合成的脂质囊泡载体可用来结合细菌的合成肽类似物，例如，麻风病、肺炎、梅毒和淋病。

本发明合成的脂质囊泡载体还可用来结合下列寄生物的合成肽类似物，携带疟疾的生物体（P.Falciparum，P.ovace等）、血吸虫、Onchocerca volvulus和其它丝虫寄生物、锥体虫、利什曼原虫、南美洲锥虫、变形虫、钩虫等。

本发明的脂质囊泡载体可用来结合本发明的新肽，它对应于HBs Ag的前S区中的氨基酸序列。本发明的脂质囊泡载体可用来结合S区的氨基酸序列，以及其它病毒的其它氨基酸序列等。

含有乙型肝炎表面抗原的抗原决定基的氨基酸序列（对应于S区中的氨基酸），可与本发明的脂质囊泡载体连接。T.P.Hopp在“具有乙型肝炎表面抗原反应活性的合成肽”（Mol.Imm.，18（9）：869-872，1981）中提出对应于HBs Ag的S区的下列序列：

138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr

149

Cys

模仿HBs Ag（S区）的抗原决定基的其它肽包括下列：

（1）肽1

肽2含有5个额外的氨基酸残基：

Ser-Thr-Gly-Pro-Ser-X

117 121

G.R.Dressman，Y.Sanchez，I.Ionescu-Matiu，J.T.Sparrow，H.R.Six，D.L.Peterson，F.B.Hollinger和J.L.Melnick，“用未偶联的HBs Ag合成肽一次接种后的抗乙型肝炎表面抗原的抗体”，Nature，295：158-160，1982;和（2），下述肽段：

位置序列

位置氨基酸序列

48-81 Cys-Leu-Gly-Gln-Asn-Scr-Gln-Ser-Pro-Thr-Ser-

Asn-His-Ser-Pro-Thr-Ser-Cys-Pro-Pro-Thr-Cys-

Pro-Gly-Tyr-Arg-Trp-Met-Cys-Leu-Arg-Arg-Phe-

Ile

2-16 Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-

Leu-Val-Leu-Gln-Cys

22-35 Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile-Pro-Gln-Ser-Leu-

Asp-Ser-Trp-Cys

38-52 Ser-Leu-Asn-Phe-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Cys-

Leu-Gly-Gln-Asn

47-52 Val-Cys-Leu-Gly-Gln-Asn

95-109 Leu-Val-Leu-Leu-Asp-Tyr-Gln-Gly-Met-Leu-Pro-

Val-Cys-Pro-Leu

104-109 Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu

R.Arnon，“通过一种合成的结合物进行免疫达到的抗流感应答”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：569-573，1982。肽对应于病毒氨基酸序列中的丝氨酸91至亮氨酸108。

一种肽的氨基酸序列为Lys-Arg-Ser-His-Phe，它模仿多瘤病毒中等大小瘤抗原的抗原决定基，G.Walter，M.A.Hutchinson，T.Hunter和W.Eckhart，“通过免疫亲和层析纯化多瘤病毒中等大小瘤的抗原”，Proc.Natl Acad.Sci.USA，79：4025-4029，1982。

一个肽含有模仿脊髓灰质炎病毒复制酶抗原的抗原决定基的氨基酸序列，该肽序列如下：

Tyr-Ser-Thr-Leu-Tyr-Arg-Arg-Trp-Leu-Asp-Ser450

-Phe

461

M.H.Baron和D.Baltimore“抗脊髓灰质炎复制酶蛋白的合成肽抗体：在离体中与天然的、病毒编码的蛋白的反应以及病毒专一性聚合酶活性的抑制，”Journal of Virology，43：3969-3978，1982。

含有模仿猿猴病毒40大瘤抗原的抗原决定基的氨基酸序列的肽如下：

Met-Asp-Lys-Val-Leu-Asn-Arg和

Lys-Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Pro-Glu-Pro-Glu-Thr G.Walter，K.H.Scheidtmann，A.Carbone，A.P.Laudano和R.A.Lerner;N.Green，H.Alexander，F.-T.Liu，J.G.Sutcliffe，T.M.Shinnick，“从乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列预测的化学合成肽诱导与Dane颗粒的天然被膜蛋白具有反应性的抗体”，Proc.Natl Acad.Sci.USA，78（6）;3403-3407，1981。

含有模仿轮转病毒R抗原的抗原决定基的氨基酸序列的肽如下：

Leu-Thr-Gln-Gln-Phe-His-Gln-Leu-Lys-Pro

Ile-Glu-Cys-Glu-Pro。J.G.Sutcliffe，T.M.Shinnick，N.Green，F-T.Liu，H.L.Niman和R.A.Lerner“从核苷酸序列推测的化学合成的多肽使得新的轮转病毒基因产物的检测成为可能”，Nature，287，1980。

含有模仿鸟类肉瘤病毒抗原的抗原决定基的氨基酸序列的肽如下：

Glu-Asp-Asn-Glu-Tyr-Thr-Ala-Arg-Gln-GlyT.W.Wong and Alan R.Goldberg，“src基团产物的合成肽片段抑制src蛋白激酶并与鸟类onc激酶和细胞磷蛋白发生免疫交叉反应”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78（12）：7412-7416，1981。

含有模仿口蹄疫病毒抗原的抗原决定基的氨基酸序列的肽如下：

141

Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gly Val

160

Leu Ala Gly Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro

和

201

His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys

Gln Thr Leu，

J.L.Bittle，R.A.Houghten，H.Alexander，T.M.Shinnick，J.G.Sutcliffe，R.A.Lerner，D.J.Rowlands和F.Brown，“通过一种由病毒核苷酸序列推测而化学合成的肽进行免疫预防口蹄疫”，Nature，298：30-33，1982。

含有模仿血细胞凝集素X-31（H3 N2）流感病毒抗原的抗原决定基的氨基酸序列的肽如下：

123 125

Glu-Gly-Phe-Thr-Trp-Thr-Gly-

130 135

Val-Thr-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser-

140

Asp-Ala-Cys-Lys-Arg-Gly-Pro-

145 150

Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Ser-Arg-

151

Leu，

D.C.Jackson，J.M.Murray，D.O.White，C.N.Fagen和G.W.Tregear，“包括流感病毒血细胞凝集素的‘环’区的合成肽的抗原活性，”Virology，120：273-276，1982。

含有模仿A型H3 N2流感病毒抗原血细胞凝集素的抗原决定基的氨基酸序列的肽已被合成，参见G.M.Muller，M.Shapira和R.F.Doolittle“专一于猿猴病毒40大瘤抗原的羧基-和氨基-端区域的抗体”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77（9）：5179-5200，1980。

含有模仿流感病毒3QB菌株抗原的抗原决定基的氨基酸序列的肽是Ilel Vall Asx2 Thrl Ser2 Glx2 Prol Gly3 Alal Leul Lysl，A.Aitken和C.Hannoum，“从流感病毒3QB菌株纯化血细胞凝集素和神经氨酸苷酶以及从血细胞凝集素的抗原区分离肽，”Eur.J.Biochem.107：51-56，1980。

含有模仿白喉抗原的抗原决定基的氨基酸序列的肽如下：

天然的PT环

-Cys-Ala-Gly-Asn-Arg-Val-Arg-Arg-Ser-Val-

186 190 195

Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Cys-

201

合成肽

十四肽 Gly（188）-Gys-（201）

十六肽 Cys（186）-Gys-（201）

十八肽 Ala-Ala-Cys（186）-Cys-（201）

F.Audibert，M.Jolivet，L.Chedid，R.Arnon和M.Sela，“用完全合成的白喉疫菌进行的成功免疫”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：5042-5046，1982。

含有模仿酿脓链球菌M抗原决定基的氨基酸序列的肽如下：

5

Asn-Phe-Ser-Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-Lys

10 15

Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-Ala-Glu-Lys-Ala-Ala-

20 25

Leu-Ala-Ala-Arg-Lys-Ala-Asp-Leu-Glu-Lys-

30 35

Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Met

E.H.Beachey，J.M.Seyer，D.B.Dale，W.A.Simpson和A.H.Kang，“由酿脓链球菌M蛋白的合成肽刺激的型专一性保护免疫”，Nature，292：457-459，1981。

因此，本发明的脂质囊泡载体可用于结合任何含有特异抗原的抗原决定基的氨基酸序列。

本发明的脂质囊泡载体还可用于结合酶。

本发明还涉及诊断测试方法，直接检查HBV抗原和HBV抗体。

为了检测含有HBV感染动物如人血清中前S基团编码蛋白的HBV抗原，可以使用放射性免疫检测法（RIA）或酶联免疫吸附检测法（ELISA）。

本发明检测HBV抗原的一种方法如下：

1.用抗体包膜一种含有结合位点的固体基质，如聚苯乙烯小球，所述抗体含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个氨基酸的氨基酸链的肽，其中不含对应于HBV天然蛋白的氨基酸序列;

2.然后，用例如Tris缓冲液洗涤包膜的小球，去除过剩的抗体;

3.然后使小球与含有蛋白质的溶液接触，如牛血清清蛋白（BSA）或明胶，使小球上的蛋白结合位点饱和（以防止或减少非专一性结合），这种含有蛋白质的溶液可以使用的合适浓度为例如1mg/ml至50mg/ml;

4.然后洗涤小球，去除过剩的BSA或明胶;

5.然后使小球与可能含有HBV或HBs Ag的样品保温（用正常血清作为对照）;

6.然后用一种溶液洗涤小球，如Tris缓冲液，并与放射性标记的抗体混合，如I¹²⁵标记的抗体（抗体抗肽或HBs Ag），

7.然后使小球保温;

8.然后洗涤小球，并用γ计数器计数。

如果样品的计数比对照至少大2.1倍，则样品是阳性的。

本发明的前S基团编码的肽可用作诊断工具，在一给定样品中检测抗HBV前S区的抗体。使前S基团编码的肽吸附在固定基质上，例如，含有结合位点的聚苯乙烯小球，所述肽包括，例如，前S（120-145）、前S（12-32）、前S（32-53）、或前S（117-134）、前S（1-21）、前S（94-117）、前S（153-171）、前S（32-53）、前S（57-73）、前S（21-47）、前S（12-47）、前S（120-153）、前S（132-137）、前S（53-73）和前S（128-139）。然后使基质与一种物质（含有蛋白质的溶液）相接触，例如，明胶，BSA或奶粉，使基质上面的结合位点饱和。然后用缓冲液洗涤基质，然后去掉缓冲液。向基质中加入一种样品，例如用动物血清稀释的人血清。然后保温并洗涤形成的物质。此后，向此物质中加入抗人IgG或Ig M的放射性标记的抗体，例如用I¹²⁵碘化的抗体。然后洗涤并计数形成的物质，例如用γ计数器。如果计数比正常血清对照的计数要高，样品则含有抗HBV前S区的抗体。

上述检测抗HBV的前S区抗体的方法，相信能用作诊断工具，以检测乙型肝炎病毒的感染。

前S蛋白部分似乎直接涉及HBV与宿主肝细胞的结合。相似蛋白可能涉及靶子为肝的其它病毒的结合。由于此原因，对应于前S蛋白的合成肽及其抗体能够作为诊断检测的基础，并用作预防其它肝炎病毒的疫苗，这些病毒与乙型肝炎病毒一样与同样的肝细胞受体反应。

在上述涉及放射性免疫检测的方法中，酶联抗体可取代放射性标记的抗体，可以使用ELISA技术。而且，可以使用荧光技术以代替RIA或ELISA。

反应成分之一的标记可利用“标记”或“标记物质”产生，例如结合一个放射性的原子或基团，或使此成分与一种酶、一种染料相偶联，例如发色基团或一种荧光基团。

所述成分更好是通过与酶相偶联而进行标记，因为它的测定比例如放射活性的测定简单得多，后者需要特殊的装备。

所用酶更好是能够进行比色测定、分光光度分析或荧光测定的酶。用于本发明的酶的非限制性例子包括来自氧化还原酶类的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶和半乳糖氧化酶。

酶与免疫成分的偶联可通过已知方法完成，例如，通过肽化学中的已知方法形成酰胺连接。

用放射性同位素进行标记也可使用已知方法。可用于标记的同位素主要是I¹²⁵、I¹³¹、C¹⁴和H³。

上述程序中的保温步骤可以已知方式进行，例如，在大约20℃至大约50℃的温度之间，保温大约1小时至大约48小时。

上述的洗涤主要利用水溶液进行，例如一种pH_6-8的缓冲液，较好是pH大约为7，使用一种等渗盐溶液。

本发明还涉及诊断测试箱，用于进行上述检测抗原和抗体的方法。

本发明检测样品中HBV前S基团编码的抗原的诊断测试箱包括下列：

a.一种用抗体包膜的固体基质，该抗体抗含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链的肽，此肽不含对应于HBV天然蛋白的氨基酸序列。

b.一种含有蛋白的溶液，用以饱和固体基质上的蛋白结合位点，和

c.一定数量的放射性标记的抗体，此抗体抗肽或HBs Ag。

本发明检测样品中抗HBV前S区抗体的诊断测试箱包括下列：

a.一种上面吸附有肽的固体基质，所述肽含有对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链，并且不含对应于HBV天然蛋白的氨基酸序列，该基质暴露于一种含有蛋白的溶液，使固体基质上的蛋白结合位点饱和，以及

b.一定数量的抗人Ig G或Ig M的放射性标记抗体。

上述测试箱中所用的放射性标记抗体，可以溶液形式包装，或以适于重建的冷冻干燥形式包装。

在上述测试箱中，酶或荧光标记的抗体可以取代上述放射性标记的抗体。

检测乙型肝炎病毒前S区的抗体时，可以多种方式使用上述方法及测试箱，例如

1.通过对病人血清取样来检测病人的HBV感染情况，并使用上述测试方法或使用上述测试箱，以及

2.通过对感染病人的血清取样来预测HBV感染的痊愈，并使用上述抗体检测程序。

上述用于抗体检测的测试程序和测试箱，可用来在不同HBV疫苗之间进行定量比较，从接种的病人中取出血清，然后利用上述测试程序或测试箱检测抗体。一般说来，所有已知的使用此抗原作为试剂的免疫检测法，都能够利用本发明的合成肽进行。一般说来，所有已知的使用含有抗体的血清或试剂的免疫检测法都能够利用通过本发明合成肽产生的抗体血清进行。这些免疫检测法包括Langone和Van Vunakis公开的所有方法，参见《酶学方法》，科学出版社，70、73和74卷。下述文献公开的检测法列为本文的参考文献：美国专利4，459，359，4，343，896，4，331，761，4，292，403，4，228，240、4，157，280、4，152，411、4，169，012、4，016，043、3，839，153、3，654，090和Re31，006，及《酶学方法》第70、73、74卷。

制备乙型肝炎疫苗可以直接利用在合适缓冲液中的脂质囊泡和肽的结合物，该肽含有对应于乙型肝炎病毒表面抗原的前S基团编码的区域中至少六个连续氨基酸的氨基酸链。含有合适浓度肽的结合物，可作为疫苗在有或没有佐剂的情况下使用，例如氢氧化铝或其它佐剂。

疫苗的活性组分可与生理上可接受的稀释剂（介质）一同使用，例如磷酸盐缓冲液。一般说来，在生理上可接受的介质中，每一剂量的合成肽浓度大约在少于1毫克和多于10微克之间。

疫苗的制备和使用可与US4，118，479公开的一般方法相同，该专利的所有内容列为本文参考文献。

疫苗可通过皮下，皮内或肌肉内注射施用。虽然较好的方式取决于疫苗的种类，但相信肌肉内注射一般比较合适。施用频率因疫苗而不同。一般说来，以大约一个月的间隔使用两次疫苗，然后在最初免疫的第六个月至一年后进行加强。第二次剂量或加强剂取决于初始免疫在血液中产生的抗体水平，而且在某些情况下是不必要的。

本发明的肝炎疫苗推荐给所有具有感染乙型肝炎危险的人，尤其推荐给那些具有高度感染危险的人，例如血液透析单位的病人和工作人员、医务人员、热带群体人员及那些仿问热带的人员。对于热带群体来说，尤其是非洲、亚洲、地中海地区和南美洲，这些地区一直可观察到的乙型肝炎感染的高发病率，为了预防这些地区容易发生的慢性携带状态感染，在生命的头五年中，应尽可能早的使用疫苗。事实上，作为一种预先免疫，此疫苗可望用于所有还未预防乙型肝炎感染的人员中。

为了更完全地说明本发明的本质和实施本发明的方法，给出下列非限制性实例。

实例1 HBs Ag的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

分别将大约20和200μgHBs Ag单独进行电泳和银染色，然后分别转移到硝化纤维素上。在电泳前，用2-巯基乙醇和Na Dod SO₄（每种10mg/ml，8M脲，0.0625M Tris，pH7.2）在37℃下处理HBs Ag30分钟。在还原后用碘乙酸盐对HBs Ag进行烷基化处理得到相似结果。如前人所述纯化HBs Ag并进行放射性标记（A.R.Neurath，N.Strick，C.Y.Huang，Intervirology，10∶265，1978）。

根据已发表的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（“SDS-PAGE”）。参见V.K.Laemmli，Nature（London），227∶680，1970。然而，为了使蛋白维持在完全钝化状态，在电泳的泳动缓冲液中使用8M脲。

用TE42Transphor unit9（Hoefer Scientific Instruments，San Francisco，CA），将SDS-PAGE分离的多肽转移至硝化纤维素上，根据生产厂家推荐的程序进行。根据前人所述方法（J.C.McMichael，L.M.Greisiger，L.Millman，J.Immunol.Meth.，45∶79，1981），使转移蛋白与抗完整HBs Ag的抗体（抗-HBs）反应，以测试蛋白的抗原决定基，反应利用¹²⁵I标记的人抗-HBs进行，此成分是一种市售测试箱（Abbott实验室，North Chicago，Illinois）的一部分。

在20μg样品的凝胶中，对分离的HBs Ag多肽（其分子量以千道尔顿给出）进行就地银染色（J.H.Morrissey，Anal.Biochem.，117∶307，1981），正如所期望的那样，产生两个主要及好几个次要多肽（见图1，a条）。然后，使另一个200μg样品凝胶中分离的多肽电泳转移到硝化纤维素上，与¹²⁵I标记的抗完整HBs Ag的抗体（抗-HBs）进行反应（接上探针），然后进行放射性自显影（图1b）。

令人惊异的是，不是那两种最丰富的多肽，而是33和和36千道尔顿（P33和P36）的多肽与抗HBs的反应更好（图1，b条）。这表明存在有不依赖双硫键的抗原决定基，它们在不是由HBVDNA S基因编码的氨基酸序列上与抗-HBs反应。

P33和P36包含的序列对应于S基因的产物，并在氨基端部分含有55个额外的残基，这些残基由前S基因区域中的位置120处的蛋氨酸开始（见图2）。

实例2合成模仿对应于前S基因产物的残基120-145抗原决定基的肽。

沿着氨基酸序列计算其相对亲水性，可以预测蛋白上抗原决定基的定位。参见T.P.Hopp，K.R.Woods，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78∶3824，1981和J.Kyte，R.F.Doolittle，J.Mol.Biol.，157∶105，1982。对前S区的转译产物进行此计算的结果示于图3中（J.Kyte等人，见上），这表明序列中抗原决定基的位置在起于Met 120的右边，在残基120-140之内。选择对应于残基120-145（图2）（前S120-145，daw₂亚型）的片段进行合成。

加上一个C端半胱氨酸（含有-SH）残基，以保证与载体分子和亲和基质的结合，并如完整蛋白中可能的那样，使N端维持不封闭状态。因此，能够对含有酪氨酸的分子进行放射性标记。酪氨酸也可用于结合，尽管它可能是抗原决定基的部分。

在Gaehde和Matsueda的二苯甲基胺型树脂上（Int.J.Peptide Protein Res.，18∶451，1981），通过固相分步肽合成的加速模式合成肽，利用Boc-NH₂-CH₂（苯基）-苯基-OCH₂COOH产生NH CH-树脂（A.R.Mitchell，S.B.H.Kent，MEngelhard和R.B.Merrifield，J.Org.Chem.，43∶2845-2852，1978）。在偶联半胱氨酸以后，根据下述方法装配保护的肽链：

1.去保护作用：含有65%v/v三氟乙酸的二氯甲烷，1×10分钟;

2.洗涤：使二氯甲烷液流在抽气器的抽吸下流过树脂20秒钟;

3.中和：含有10%v/v二异丙基乙基胺的二氯甲烷，2×1分钟;

4.洗涤：使二氯甲烷液在抽气器的抽吸下流过树脂20秒钟;

5.偶联：将2ml含有2mmol叔-Boc-L-氨基酸的二氯甲烷加到中和的树脂中，紧跟着加入2ml含有1mmol二环己烷基碳化二亚胺的二氯甲烷;10分钟后，取出树脂样品（大约5mg），通过定量茚三酮法测定偶联产率，然后加入10ml二甲基甲酰胺并继续进行偶联（天冬酰胺和谷氨酰胺在羟基苯并三唑的存在下进行偶联）。

6.对令人满意的偶联进行茚三酮测定后，如上述步骤4洗涤树脂。重复上述循环以加入随后的残基。如果有必要进行重偶联，重复步骤3-5。合成以0.5mmol的规模进行（0.5g氨基甲基树脂，每克负荷量为1mmol）。除非特别指出，所有的体积都是10ml。

所用的保护的氨基酸衍生物是用N-α-叔丁基氧羰基保护的，侧链如下述保护：Arg（N^GTosyl）;Cys（4Me Bzl）;Tyr（Br）;Asp（OBzl）;Thr（Bzl）;His（Im Tosyl）。蛋氨酸和色氨酸的侧链不进行保护。在另一种同样的合成中，使用His（Im DNP）和Trp（In Formyl）使产物更纯。

肽链的装配通过茚三酮定量反应进行监测（V.K.Sarin，S.B.H.Kent，J.P.Tam，R.B.Merrifield，Anal.Biochem.，117∶147-157，1981），并且除了组氨酸外装配中没有什么困难，组氨酸残基的加入尽管进行重复偶联也有10%不能进行完全，可能是由于氨基酸衍生物不纯。保护的肽链装配好以后，如上述步骤1-4，通过三氟乙酸处理去掉N端Boc基团并使树脂中和。然后在0℃下，用含有5%v/v对-甲酚和5%v/v对-硫甲酚的HF处理1小时，对肽进行切割并去掉保护基团，以产生C端为半胱酰胺的所需肽。如果使用了His（Im DNP），在HF切割之前用苯基苯酚处理以去掉DNP。如果使用了Trp（In Formyl）调节HF条件以去掉甲酰（Formyl）基团;使用含有10%苯甲醚和5%1，4-丁二硫醇的HF，或含有对-甲酚和5%1，4-丁二硫醇的HF。加入醚使产物沉淀并洗涤，然后溶于5%v/v乙酸水溶液中，进行冷冻干燥以产生膨松的白色固体。

对合成好的肽-树脂进行定量的Edman降解（H.D.Niall，G.W.Tregear，J.Jacobs，《肽的化学和生物学》，J.Meienhofer编，（Ann Arbor Press，Ann Arbor，MI，1972），pp.659-699）表明链合成的效率比较高（S.B.H.Kent，M.Riemen.M.Le Doux，R.B.Merrifield，《第四届国际蛋白质序列分析方法会议论文集》，M.Elzinga编（Humana，Clifton，New Jersey，1982），pp.626-628），每一步进行的效率>百分之9.0/9.7，除序列位置前S128处的组氨酸以外。对从树脂上切下的肽进行HPLC分析表明，相应于大约85%的肽物质在225nm处有一个光吸收主峰。

实例3-6模仿对应于前S基因产物中残基120-145（前S120-145）抗原决定基肽的免疫学性质

实例3 免疫

用游离的或结合载体的前S120-145（亚型adw₂）对兔子进行免疫在所有动物中产生对于同源肽和HBs Ag的抗体应答（图4）。

对应于HBV DNA前S区的氨基酸序列120-145（前S120-145）的肽（亚型adw₂;P.Valenzuela，P.Gray，M.Quiroga，J.Zaldivar H.M.Goodman，W.J.Rutter，Nature（London），280∶815，1979）在C端含有额外的半胱氨酸残基，这是为了易于与载体连接而加入的，通过改进的固相技术合成此肽（S.B.H.Kent，《生物医学聚合物》，E.P.Goldberg，A.Nakajima编，（Academic，New York，1980），pp.213-242;A.R.Mitchell，S.B.H.Kent，M.Engelhard，R.B.Merrifield，J.Org.Chem.，43∶2845，1978;和S.Mojsov，A.R.Mitchell，R.B.Merrifield，J.Org.Chem.，45∶555，1980）。

为了免疫检测和与载体连接，用2-巯基乙醇处理肽，并在SephadexG-10上通过层析法使之从低分子量组分中分离出来（A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79∶7871，1982）。

对两至三组兔子进行免疫，免疫用游离的前S120-145或与半胱氨酸活化的脂质体相连的肽进行，脂质体含有用戊二醛固定的硬脂酰胺、二月桂酰卵磷脂和胆甾醇，并且有或没有结合提高对半抗原抗体应答的RAT基团（A.R.Neurath，S.B.H.Kent，N.Strick，J.Gen.Virol.，印刷中，1984）。免疫方案与前人所述相同（Neurath，Kent，Strick等人，1984，见上），其中使用完全的不完全的Freund氏佐剂。通过双抗体放射性免疫检测法（RIA），测试用前S120-145免疫的兔子血清中的抗HBs Ag抗体，测定利用HBs Ag包膜的聚苯乙烯小球和¹²⁵I标记的抗兔Ig G进行（Neurath，Kent，Strick，等人，1984，见上）。

以类似的测试方法测定抗同源肽的抗体，只是不用包膜的小球，而是用2.5mg纤维素-肽结合物。此结合物通过下述方法制备：如前人所述制备0.5g巯基纤维素（P.L.Feist，K.J.Danna，Biochemistry，20∶4243，1981），将其悬浮在5ml0.1M乙酸钠中，pH5，并与2.5ml含有0.25M N-N′-对-亚苯基二马来酰亚胺的二甲酰甲酰胺在30℃下混合1小时，然后用0.1M磷酸盐-10mM EDTA，pH7.0洗涤。将纤维素衍生物悬浮在10ml后一种缓冲液中，其中含有5mg前S120-145，并在20℃下至少搅拌16小时。充分洗涤纤维素衍生物，并悬浮在0.14MNa Cl-10mM Tris-3mM Na N₃（TS）中。在最终制备物中，每克纤维素含有8mg前S120-145。

实例4

用好几种稀释度的血清进行放射性免疫检测，血清来自一只用与脂质体结合的前S120-145免疫的兔子（见图5）。

当抗血清稀释至1.6×10⁵倍时，仍然可以检测到抗体（图5）。

前S120-145或抗前S120-145抗体抑制¹²⁵I标记的抗-HBs和P33（P36）之间的反应。用RIA检测阳性的所有稀释度的抗-前S120-145对¹²⁵I标记的HBs Ag进行免疫沉淀（图5）。通过检测免疫复合物中的HBV-DNA和通过电镜照片，确定HBV颗粒与抗-前S120-145发生了反应（A.R.Neurath，N.Strick，L.Baker，S.Krugman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79∶4415，1982）。

实例5 抗肽抗体作为检测P33和P36的特异探针

使抗-前S120-145与P33和P36反应。将通过SDS-PAGE在脲中泳动分离的HBs Ag多肽转移至硝化纤维素上，与用TS稀释80倍的抗-前S120-145在20℃下反应5小时，此TS中还含有10mg/ml牛血清清蛋白和2.5mg/ml明胶（TS-BG）。为了检测结合的Ig G，洗涤硝化纤维素薄膜，并在20℃下使之与¹²⁵I标记的蛋白A（0.4μc/100mlTS-BG）接触5小时。进一步细节参见图1。在图6中，箭头标明P33和P36的位置。顶端箭头（对应于66千道尔顿分子量）表明另一种与抗-前S120-145反应的蛋白，也许是P33的二聚体。

实例6 一种诊断测试法的发展：HBV感染个体血清中前S基因编码抗原的检测

图7表明以抗-前S120-145包膜的聚苯乙烯小球为基础进行的诊断测试结果。

测定不同稀释度的HBs Ag阳性血清，所测定的血清是与用TS分别稀释10倍的正常人和兔血清的混合物。测试中使用¹²⁵I标记的人抗-HBs（Abbott实验室），测试基本上根据AUSRIAⅡ诊断箱所述方法进行（Abbott实验室）。结果用RIA比值单位表示，用阳性样品的cpm除以正常对照血清的cpm确定。效价终点对应于最高稀释度，此处的RIA比值为2.1（虚线）。用AUSRIA测试法测定的血清效价终点约为1/10⁶。用正常兔Ig G包膜的对照小球给出阴性结果。

含有HBs Ag亚型ad和ay的血清给出相似结果，表明具有对应于亚型adw（图2）序列的合成肽携有共同的组专一性的抗原决定基。

实例7 合成及测试S（135-155）衍生物

使表1中所列S（135-155）的每一种结合物（1至26），除结合物3以外，与完全Freund氏佐剂以1∶1的比例混合，并注射入新西兰白兔中（每只兔子65至160μg肽）。以两周的间隔和同样的剂量，进一步给兔子注射在不完全Freund氏佐剂中的结合物（不用结合物3）。每次注射两周后抽取血液样品。

为了制备结合物1、和4-8（表1），用两倍摩尔的过剩的N-乙基-N′（二甲基-氨基丙基）碳化二亚胺（EDAC）和N-羟基-苯并三唑（NHBTA）使数量为1mg的被膜基因产物（S（135-155））的肽309-329活化，然后根据前人所述方法（Arnon，R.，Sela，M.，Parant，M.和Chedid.，L.，“用具有佐性能的完全合成的抗原诱导的抗病毒应答”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，77∶6769-6772，1980），分别连接到等摩尔的多聚-D-赖氨酸和二氨基烷上（来自Fluka AG，Buchs，瑞士）。为了制备结合物2和3，使EDAC活化的S（135-155）和MDP（Calbiochem，Dan Diego，CA）各自1mg连接到10mg多聚-D-赖氨酸上。用氰化亚铁氧化被膜基因产物的肽309-329（800μg）（Dressman等人，1982，见上），如上述用EDAC活化并连接到4mg LPH上。在Sephadex G-25上的柱层析表明肽完全连接在LPH上（结合物9）。使氧化的、EDAC活化的肽（1mg）还与1mg的多聚缬氨酸结合，该缬氨酸在2.5ml的1M Na HCO₃、pH8.5和10ml CHCl₃的悬浮液中。用离心后的界面和水相进行免疫（结合物10）。

通过OKu，N.Scheerer，J.F.，和MacDonald，R.C.的方法（“大脂质体的制备”，BBA，692∶384-388，1982）制备脂质体。将硬脂酰胺、二月桂酰卵磷脂和胆甾醇溶于葡萄糖饱和的乙醇中，使其最终浓度为分别为10、23和1.43mg/ml。对于某些脂质体制备物来说，二月桂酰卵磷脂的浓度降到17.5mg/ml，并加入鞘磷脂（10mg/ml）。其它制备物含有作为额外组分的脂质A（420μg/ml;Calbiochem）。使溶液在0.1M NaHCO、pH8.5中透析至少16个小时，透析袋的分子量排除界限为10³道尔顿。用戊二醛（最终浓度30mg/ml）处理脂质体大约6小时，与0.5倍体积的33.9%（w/w）3，5-二乙酰基-2，4，6-三碘代苯甲酸钠（diatrizoate）混合，通过10，000rpm离心10分钟使之四次悬浮于1MNa HCO₃中，在20℃下，使每10mg硬脂酰胺与0.84至1mg被膜基因产物的肽309-329反应过液。在这些条件下，被膜基因产物的肽309-329与脂质体完全连接。某些制备物进行进一步反应，每10mg硬脂酰胺与7.5mg RAT（Biosearch，San Rafael，CA）在20℃下反应6小时。使脂质体三次悬浮于0.14M Nacl、0.01Tris-Hcl-0.02%NaN₃（TS）中，在TS-10^-4M氧化型谷胱甘肽中至少透析16小时。

在某些情况（20）和（21）中，含有硬脂酰胺的脂质体不是用GA产生，而是直接与被膜基因产物的EDAC活化的肽309-329反应。另外，对于（18）和（19）来说，使被膜基因产物的EDAC活化的肽309-329连接到戊二醛处理的脂质体上，通过与0.2M乙二胺在pH8.5和20℃下反应过夜而进一步衍生，然后两次悬浮于0.1M NaHCO₃、pH8.5中，用10μM连二亚硫酸钠在20℃下还原1小时，然后重复悬浮于同样的缓冲液中。使这些脂质体的一部分进一步与EDAC活化的RAT反应。脂质体最后在TS-10^-4M氧化型谷胱甘肽中透析。

在一种制备物（22）中，用硬脂酸代替硬脂酰胺制备脂质体。使其在0.01M Na Cl中透析，在pH5.5和20℃下用EDAC（50mg/ml两小时，再加上25mg/ml1小时）活化，两次悬浮于0.01M Na Cl中，在1M Na HCO₃、pH8.5中与被膜基因产物的肽309-329反应过夜。

利用Polysurf 10-36 B（Bartig Industries Inc.，New Canaan，Conn.，Margel & Offarim，1983），根据前人所述方法制备聚戊二醛微囊（Margel，S.，Zisblatt，S.和Rembaum，A.“聚戊二醛：一种偶联蛋白与微囊以及标记细胞表面受体的新试剂Ⅱ.通过非磁性和磁性聚戊二醛微囊技术的简化标记方法”，Journal of Immunological Methods，28∶341-353，1979）。使1mg被膜基因产物的肽309-329连接到大约50mg微囊上，所用条件相似于用戊二醛处理脂质体的条件。结合物25是通过用5ml0.1Mε-氨基乙酸在pH8.5下过夜处理微囊而制备。离心以后，使微囊悬浮于二甲基甲酰胺中（2ml），并与2mgEDAC加670μgNHBTA在20℃下反应1小时。离心以后，使微囊悬浮于2ml0.1M Na HCO₃、pH8.5中，其中含有1mg被膜基因产物的肽309-329。

除非特别指出，上面所述的所有试剂都是分析纯的，从Sigma，St.Louis，Missouri得到。

被膜基因产物的游离肽309-329（分子量＝2664道尔顿）含有5个半胱氨酸残基，它主要以单体形式存在，因为在分子排阻层析中，它与胰岛素A链差不多在同一组分中被洗脱。连接到二氨基丁烷和其它二氨基烷上（数据未给出）则形成S（135-155）聚合物，它具有免疫原性并诱导抗肽和抗-HBs的抗体。制备物（4）、（5）和（7）也诱导抗-HBs，但与二氨基辛烷或十二烷连接物形成的聚合物（6）和（8）没有这种能力，其原因还不清楚。被膜基因产物肽309-329的氧化导致发生聚合（数据未给出）。与LPH连接的聚合物（结合物9）诱导高水平的抗-S（135-155），但不能诱导抗-HBs，这一点与以还原形式连接在KLH或LPH上的S（135-155）不同（Neurath等人，1982，见上）。这一发现再次强调了在诱导抗天然蛋白抗体的过程中肽构象的作用。使氧化型肽连接到高度疏水性的多聚-L-缬氨酸上，所形成的结合物（10）的免疫原性很低。使S（135-155）与多聚-D-赖氨酸连接并与Freund氏佐剂一起施用（1），或与MDP共价连接而不利用佐剂施用（3），都可诱导抗-S（135-155）和抗-HBs。后一种结合物与Freund氏佐剂施用（2）的免疫原性似乎很差。S（135-155）与含有硬脂酰胺的戊二醛处理的脂质体连接（结合物11），诱导的抗-HBs的水平可与KLH或LPH结合物诱导的水平相比较（Neurath等人，1982，见上）。在脂质体中结合鞘磷脂和/或脂质A（结合物13、15a、16），这些据报道增强插入脂质体膜中的半抗原抗原性的成分（Yusuda，T.，Dancey，G.F.和Kinsky，S.C.，“鼠中的脂质体模式膜的免疫原性：对磷脂组分的依赖性”，Proc.Natl Acad.Sci.USA，74∶1234-1236，1977），都不能加强抗-HBs的应答。

使S（135-155）与戊醛处理的脂质体连接制备结合物（18和19），连接不是直接进行而是通过乙二胺桥键，这两种结合物能够诱导抗-HBs，但在不同兔子个体的应答中观察到显著的差异。

使S（135-155）在氧化之前或之后与含有硬脂酰胺的脂质体连接（不用戊二醛固定;制备物20和21），或与含有硬脂酸的脂质体连接（22），诱导低水平的抗-S135-155，没有可测水平的抗-HBs。

使S（135-155）直接与聚戊醛微囊连接（制备物23和24），诱导抗-HBs的初级应答。然而，抗-HBs的水平在免疫进程中下降。在第三次免疫两周后，收集的血清中检测不到抗-HBs。使S（135-155）分别通过ε-氨基己酸（25）和L-半胱氨酸（26）桥键与这些微囊连接，或者是不能诱导抗-HBs（25），或者是刚刚能够诱导抗-HBs（26）。

S（135-155）与KLH或LPH的结合物诱导初级的抗-HBs应答，但额外的抗原剂量不能提高兔血清中的抗-HBs的水平（Neurath等人，1982，见上）。一般说来，用上述结合物，在初级免疫四或六周后可观察到抗-HBs水平的下降（图9B），但在监测兔子时观察到了例外（图9A，5条）。将RAT与S（135-155）一起插入脂质体膜中，可一致逆转这种下降趋势（例如图9C和图9D）。

插入脂质体膜中半抗原的免疫原性取决于脂质体中磷脂的组成，并似乎与这些膜的流动性逆向相关（Yasuda等人，1977，见上;Dancey，G.F.，Yasuda，T.和Kinsky，S.C.，“脂质体模式膜的组成对免疫原性的效应”，J.of Immunol.，120∶1109-1113，1978）。

用戊二醛处理含有硬脂酰胺的脂质体，发现能提供适于与合成肽连接的反应基团，同时提高脂质膜的刚性。这样的脂质体，尤其是含有提高载体功能的RAT位点时（Alkan，S.S.，Nitecki，D.E.和Goodman，J.W.，“抗原识别与免疫应答：1-酪氨酸-偶氮苯胂酸盐作为大分子半抗原载体的能力”，The Journal of Immunology，107∶353-358，1971;Alkan，S.S.，Williams，E.B.Nitecki，D.E.Goodman，J.W.，“抗原识别与免疫应答，对小型单和双功能抗原分子的Hurmoral及细胞免疫应答”，The Journal of Experimental Medicine，135∶1228-1246，1972），在制备诱导抗病毒抗体的完全合成的免疫原时是一种有希望的工具。

表1

用于制备S（135-155）结合物的交联剂和载体

（1）多聚-D-赖氨酸（分子量为3-7×10⁴）

（2）1+N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺（MDP）

（3）＝2

（4）1，4-二氨基丁烷

（5）1，6-二氨基己烷

（6）1，8-二氨基辛烷

（7）1，10-二氨基癸烷

（8）1，12-二氨基十二烷

（9）与LPH连接的氧化型S（135-155）

（10）与多聚-L-缬氨酸连接的氧化型S（135-155）

（11）含有硬脂酰的脂质体，并用戊二醛处理

（12）＝11＝L-酪氨酸-偶氮苯-对-胂酸盐（RAT）

（13）＝11+鞘磷脂（来自牛脑）

（14）＝13+RAT

（15a）＝11+脂质A

（15）＝15a+RAT

（16）＝13+脂质A

（17）＝16+RAT

（18）＝11用乙二胺处理

（19）＝18+RAT

（20）含有硬脂酰胺的脂质体与氧化型S（135-155）反应（参见9）

（21）＝20，除了S（135-155）是与脂质体结合后氧化

（22）含有硬脂酸的脂质体

（23）聚戊二醛微囊

（24）＝23+RAT

（25）＝23用ε-氨基己酸处理

（26）＝23用2-半胱氨酸处理

实例8

根据实例2所述的程序合成前S（12-32）肽（亚型adw₂）。用游离肽、与戊二醛交联的脂质体连接的肽（±RAT基团）（根据实例7所述方法）以及与KLH连接的肽免疫兔子。产生的抗体不仅识别此肽，还识别HBs Ag和HBV。从上述观点看来，相信这种肽作为疫苗预防乙型肝炎病毒非常有用，并可作为HBV的诊断基础，可以肽本身为基础（在感染或免疫的个体中检测抗-HBV应答），或以肽抗体为基础来检测乙型肝炎抗原。

实例9

根据实例2所述程序合成前S（117-134）肽（亚型adw₂）。

实例10

使根据实例9制备的肽前S（117-134）根据实例7的程序与载体连接，然后用此免疫兔子。这种免疫根据实例3所述程序进行，并发现在接种兔子的血清中产生抗体。然后，抗体效价显著低于使用前S（120-145）和前S（12-32）时所观察到的。

实例11

分别测试了兔子对两种合成肽的免疫应答，这两种肽对应于HBV DNA（亚型adw₂）前S基因转译产物的残基120-145和12-32。前S（120-145）肽根据实例2制备，前S（12-32）肽根据实例8制备。它们的序列如下：前S（120-145）为：MQWNSTAFHQTLQDPRVRGLYLPAGG;前S（12-32）为：MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDP。在进行免疫时，分别使用肽的游离形式，并借助于明钒或Freund氏佐剂，或者连接在载体钥孔血蓝蛋白（KLH）和交联脂质体上使用。脂质体根据实例7制备。

使肽与脂质体表面共价连接可产生最佳效果（见图10）。用KLH结合物进行免疫导致很高的抗-KLH应答（放射性免疫检测的效价终点为1/5，000，000），显然会使对肽加强剂的应答很低。另一方面，使用含有RAT的脂质体作为载体时，检测到的对RAT基团的抗体应答低得多（约为1/10³）。不能检测到抗脂质体（没有RAT）的抗体。这表明可选择脂质体作为合成肽载体用于免疫中。

实例12

为了确定HBV颗粒上是否优先存在对应于前S基因编码序列的抗原决定基，测试抗HBV颗粒的抗血清的反应，此抗血清是用接种前S蛋白的合成肽类似物诱导产生的。可以检测到抗体与合成肽反应的抗血清的最大稀释度对于前S（120-145）和前S（12-32）肽分别为：大约1/62，500（用¹²⁵I标记的蛋白A代替标记的第二抗体进行测试为1/2×10⁶），以及大约1/2560（见图11）。抗血清（吸附在HBs Ag-Sepharose上以除去抗S蛋白的抗体）不与下列物质的合成肽类似物反应，即S蛋白、被膜基因产物肽（309-329）（S（135-155））、被膜基因产物肽（222-239）（S（48-65））和被膜基因产物肽（243-253）（S（69-79）），因此抗血清专一于前S基因编码的序列。与此相比较，由同源肽制备的抗血清的稀释终点，对于抗-前S（120-145）（见图11）和抗-前S（12-32）（数据未给出）来说分别为大约1/300，000和大约1/80，000。

刚从急性乙型肝炎中痊愈的个体，其血清中的抗体（Ig G和Ig M）也识别合成肽，兔中抗一种融合蛋白的抗体也识别合成肽，此蛋白是在大肠杆菌中表达的氯霉素乙酰基转移酶和前S蛋白的融合体（见图11）。

另一方面，用胃蛋白酶处理的HBs Ag（M.R.Hilleman，E.B.Buynak，W.J.Mc Aleer，A.A.Mclean，P.J.Provost，A.A.Tytell，《病毒性肝炎，1981年国际会议》，W.Szmuness，H.J.Alter，J.E.Maynard编（Franklin Insti-tute Press，Philadelphia，PA，1982），pp.385-397）或用在酵母中产生的HBs Ag（缺乏前S基因编码的序列;W.J.Ma Aleer，E.B.Buynak，R.F.Maigetter，D.E.Wambler，W.J.Milbuv，M.R.Hilleman，Nature（London），307∶178，1984）对人进行接种，都不能发展出可检测的识别两种合成肽中任一种的抗体。另一方面，在12个接受由完整HBs Ag组成的疫苗的个体中，有7个发展出了这些抗体。

实例13

对于HBV颗粒上（或在HBs Ag上）暴露的前S基因编码的序列和合成肽类似物之间的免疫交叉反应性进行了定量测定。肽结合在β-半乳糖苷酶上，研究了游离肽、HBV和HBs Ag分别对于含有与酶结合的肽的免疫复合物形成的抑制效应。图12所示结果表明，足够浓度的HBV完全抑制抗-前S（120-145）和前S（120-145）-β-半乳糖苷酶之间的反应。HBs Ag的抑制活性小于HBV的1/5。胃蛋白酶处理的HBs Ag的抑制活性小于完整HBs Ag活性的1/1，000。这些结果表明，抗-前S（120-145）的血清中没有只识别合成肽但不识别天然蛋白的抗体亚群。由病毒蛋白的合成肽类似物产生的许多其它抗血清中，都观察到有这种抗体亚群。游离肽抑制大约50%前S（120-145）-β-半乳糖苷酶与抗-前S（120-145）反应的足够浓度大约为HBV重量的1/100（见图11）。然而，由于前S（120-145）的分子量约为3KD，而与抗-前S（120-145）反应的HBV蛋白组分代表HBV全部物质的一小部分（＜20%）的分子量在大约33和大约67KD之间，达到这种程度抑制所需的HBV和前S（120-145）的摩尔浓度大约相同。这表明合成肽类似物和HBV被膜蛋白相应片段上的抗原决定基在结构上密切相关。

实例14

根据实例2的程序合成前S（94-117）肽（亚型adw₂）。

实例15

用前S（94-117）肽免疫兔子，此肽根据实例14制备，并根据实例7的程序连接到一种载体上。这种免疫根据实例3所述程序进行，并发现在这样接种的兔子的血清中产生抗体。然而，抗体效价显著低于使用前S（120-145）和前S（12-32）时所观察到的。

实例16

根据实例2所述程序合成前S（153-171）肽（亚型adw₂）。

实例17

用前S（153-171）肽免疫兔子，此肽根据实例16制备，并根据实例7的程序连接到一种载体上。这种免疫根据实例3所述程序进行，并发现在这样接种的兔子的血清中产生抗体。然而，抗体效价显著低于使用前S（120-145）和前S（12-32）时所观察到的。

实例18

根据实例2所述的程序合成前S（1-21）肽（亚型adw₂）。

实例19

用前S（1-21）肽免疫兔子，此肽根据实例18制备，并根据实例7的程序连接到一种载体上。此免疫根据实例3所述程序进行，并发现在这样接种的兔子的血清中产生抗体。然而，抗体效价显著低于使用前S（120-145）和前S（12-32）时所观察到的。

实例20

根据实例2所述程序合成前S（32-53）肽（亚型adw₂）。

实例21

用前S（32-53）肽免疫兔子，此肽根据实例20制备，并根据实例7的程序连接到一种载体上。此免疫根据实例3所述程序进行，并发现在这样接种的兔子的血清中产生抗体。然而，抗体效价显著低于使用前S（120-145）和前S（12-32）时所观察到的。

实例22

根据实例2所述的程序合成前S（57-73）肽（亚型adw₂）。

实例23

用前S（57-73）肽免疫兔子，此肽根据实例22制备，并根据实例7的程序连接到一种载体上。此免疫根据实例3所述程序进行，并发现在这样接种的兔子的血清中产生抗体。然而，抗体效价显著低于使用前S（120-145）和前S（12-32）时所观察到的。

实例24

用合成肽检测人血清中抗前S蛋白的抗体

如上面所述，在处于乙型肝炎恢复期的人血清中，检测到了识别前S蛋白的合成肽类似物的抗体（图11）。图13给出了某一病人中识别前S（120-145）抗体发展的时间进程。

在急性乙型肝炎早期的人血清中检测到抗前S蛋白的抗体。在能够检测到抗S蛋白（抗-HBs）或抗乙型肝炎核心抗原（抗-HBc）抗体之前，在抗原血症期间检测到识别肽的Ig M抗体。前两种抗体发展出来后，具有抗前S专一性的抗体的水平下降。在乙型肝炎病人中观察到这种抗-前S发展模式的不同情况。在某些情况中，甚至在血浆中能检测出HBs Ag之前，或者当血液中永不出现HBs Ag并且乙型肝炎的唯一标志是抗-HBc和后来的抗-HBs时，就存在着识别合成肽的抗体。

通过RIA测量抗前S（120-145）的抗体。检测抗前S（12-32）的抗体得到了类似结果。使用商业化测试箱（Abbott实验室，North Chicago，Illinois）检测HBs Ag、抗-HBs和抗乙型肝炎核心抗原的抗体。柱末端的虚线对应于HBV感染的不同标记物，表明监测结束时的阳性。最大稀释度血清中的抗体效价≥2.1，这是用样品的放射性计数以同样稀释度的对照血清的计数而得到的。

用胃蛋白酶处理的HBs Ag-（Hilleman，M.R.Buynak，E.B.Mc Aleer，W.J.Mclean，A.A.Provost，P.J.&Tytell，A.A.，《病毒性肝炎：1981年国际会议》，Szmuness，W.，Alter，H.J.&Maynard，J.E.编（Franklin Institute Press，Philadelphia，PA，（1982），pp385-397）（胃蛋白酶处理去除所有抗前S（120-145）的反应物质）或用在酵母中产生的HBs Ag（缺乏前S基因编码的序列;Mcleer，W.J.Buynak，E.B.Maigetter，R.Z.Wambler，D.E.Miller，W.J.Hilleman，M.R.，Nature（London），307∶178-180，1984）对人进行接种，都不能发展出可检测的识别两种合成肽中任一种的抗体。另一方面，在12个接受由完整HBs Ag组成的疫苗（Mc Auliffe，V.J.，Purcell，R.H.，Gerin，J.L.，Tyeryar，F.J.《病毒性肝炎》，Szmuness，W.，Alter，H.J.，Maynard，J.E.编（Franklin Institute Press，Philadelphia，PA），pp.425-435）的个体中，有7个发展出了这些抗体。通过AUSAB测试（Abbott）检测，7个个体对于S蛋白还具有最高的抗体应答，这表明缺乏对前S蛋白的可检测的应答是由于测试方法的敏感度所限制。在这方面，了解到这一点是很重要的，即迄今所用的乙型肝炎疫苗都是通过用胃蛋白酶处理HBs Ag而产生，尽管它们在表面健康的个体中有很好的效率，但它们的免疫原性很低，对于血液透析病人不具有预防效果（Stevens，C.E.，Alter，H.J.，Taylor，P.E.Zang，E.A.，Harley，E.J.，Szmuness，W.，N.Engl.J.Med.，311∶496-501，1984）。不用胃蛋白酶处理而生产的其它疫苗似乎没有这样的缺陷（Desmyter，J.，《病毒性肝炎和肝病》，Vyas，G.N.，Deinstag，J.L.和Hoofnagle，J.编，（Grune and Stratton，Orlando，F1。1984）印刷中）。

实例25含有HBV专一性蛋白制备物的RIA测试

通过亲和层析从抗HBV颗粒的兔抗血清中除掉抗S蛋白的抗体（Neurath，A.R.，Trepo，C.，Chen，M.，Prince，A.M.，J.Gen.Virol.，30∶277-285，1976）。参见图14。测试的抗原是：HBV颗粒和管形HBV（●、△）;从血浆中分离的HBs Ag的大约20nm的球形颗粒（0，△）;以及用胃蛋白酶处理的后一种颗粒（1mg/mlHBs Ag，50μg/ml胃蛋白酶，0.1M甘氨酸-HCl，pH2.2，37℃下2小时）（口）。RIA测试根据前人描述进行（Neurath，Kent，S.B.H.，Strick，N.，Science，224∶392-395，1984）。根据RIA测试方法（AUSRIA，Abbott实验室），在所有测试的制备物中都将HBs Ag S蛋白的浓度调整至相同的水平。用Spico 35型转子，使HBV颗粒（被管形HBs Ag污染）在25，000rpm下离心4小时而从血清中浓缩100倍。将2ml浓缩物铺在一非连续性梯度上，此梯度组成为20%、10%和5%（w/w）的蔗糖，每种11ml，并含有0.14M Na Cl，0.01M Tris，0.02%Na N₃pH7.2（TS），用Spico SW27型转子以25，000rpm离心16小时。最终沉淀再悬浮在TS中。

在以聚苯乙烯小球为基础进行的RIA测试中，对HBV颗粒识别的效率，比大约22nm的纯化球形颗粒高得多，所述聚苯乙烯小球用抗-前S（120-145）或兔抗HBV颗粒的抗体包膜。目前某些用于制备乙型肝炎疫苗的步骤之一是用胃蛋白酶处理HBs Ag，这一步骤使其与抗-前S（120-145）的反应降低大约10³倍。从感染血浆（Hilleman，M.R.等人，1982，见上）或从酵母中（Mcleer等人，1984，见上）产生的疫苗中的HBs Ag，在这些测试中的反应性只有完整HBs Ag的≤1/5，000。

在逆向测试中，用HBs Ag、HBV颗粒、胃蛋白酶处理的HBs Ag或对应于上述疫苗的HBs Ag包裹小球进行测试。使与小球反应的Ig G抗体（来自不同的兔抗前S序列的抗血清）随后与标记的抗-兔Ig G结合，从而对其进行检测。小球只有用完整HBs Ag或HBV颗粒包膜时，才能用抗-前S（120-145）得到阳性结果。抗-前S（12-32）只与HBV包膜的小球发生反应。

实例26前S基因编码的HBV结构域在细胞受体结合中的作用

有报告认为，前S蛋白的C端55个氨基酸在HBs Ag与通过戊二醛聚合的人血清蛋白（pHSA）的结合中起中介作用，而且，在HBV至肝细胞的活体吸附中，这种结合起着重要作用（Machida，A.等人，Gastroenterology，85∶910-918，1984）。然而，在HBV对肝脏细胞的感染中，没有有力的证据支持pHSA-HBV相互作用的作用。此外，尽管反应是由于前S基因编码序列的存在而加强的，但含有或缺少这55个氨基酸残基的HBs Ag都能与pHSA反应（图15）。图15中涉及的RIA测试根据前人所述进行（Neurath，A.R.，Strick，N.，Intervivology，11∶128-132，1979）。

为了直接探索HBs Ag与肝细胞的反应，发展了一种以肝细胞与不溶性HBs Ag结合为基础的检测系统。

使HBs Ag（HBV）与N-N′-对-亚苯基二马来酰亚胺衍生的巯基纤维素连接，连接条件如前述连接前S（120-145）的一样。大约4mgHBs Ag连接到1g纤维素衍生物上。通过使牛血清清蛋白连接到活化基质上制备对照纤维素衍生物。使40mg纤维素衍生物悬浮于含有10mg/ml牛血清清蛋白的TS（TS-BSA）中，使之与大约2×10⁶个悬浮在TS-BSA中洗过的Hep G₂人肝癌细胞（见Aden，D.P.Fogel，A.，Plotkin，S.，Damjanov，J.，Knowles，B.B.，Nature（London），282∶615-617，1979）混合，在37℃下保温30分钟，然后在4℃下1小时。用Hela细胞和Clone9正常鼠肝细胞（ATCC）作为对照。将细胞-纤维素混合物铺在1ml33%（w/w）Hypaque的顶部，以3，000rpm离心2分钟。带有附着细胞的纤维素衍生物在这些条件下沉淀。以Hypaque-TS-BSA界面回收的未结合细胞在TS-BSA中稀释5倍，然后通过离心沉淀。使细胞暴露于去污剂TritonX-100（5mg/ml，水中）中得到细胞溶解液，取出适量的等分试样沉淀乳酸脱氢酶（LDH）活性，通过此测定吸附的和未吸附细胞的相对比例。用500号诊断箱（Sigma）测定LDH活性。

在此检测中，大约80-95%的人肝癌HepG₂细胞（Aden，D.P.，见上）与固定化HBs Ag结合。对照细胞（Hela细胞，鼠肝细胞）的结合范围为10-20%。大约10%HepG₂细胞与对照纤维素结合。在抗-前S（120-145）和抗-前S（12-32）Ig G（15mg/ml）的存在下，HepG₂细胞至HBs Ag-纤维素的吸附分别降至60%和30%。两种抗体的混合物（每种7.5mg/ml Ig G）导致细胞吸附降低至20%，无法从背景水平中分辨出来。

正常的鼠Ig G以及抗S蛋白的抗体（通过用胃蛋白酶处理的HBs Ag免疫而诱导的）不能消除细胞结合，尽管在此血清中存在有高水平的抗-HBs（在AUSAB测试中稀释至10^-6为阳性）。

实例27 细胞培养及部分纯化的HBV受体的制备

根据前人所述（D.P.Aden，A.Fogel.S.Plotkin，I.Damjanov和B、B.Knowles，“在分化的人肝癌衍生物的细胞系中控制合成HBs Ag”，Nature，282∶615-616，1979;B、B.Knowles，C、C.Howe，D.P.Aden，“人肝癌细胞系分泌主要血浆蛋白和乙型肝炎表面抗原”，Science，209∶497-499，1980），增殖人肝癌HepG₂细胞（具有正常肝软组织细胞的生物合成能力）。

汇合的单层细胞用0.14M Na Cl、0.01M磷酸盐pH7.2（PBS）洗涤两次，从培养瓶中刮下后悬浮在预冷冻（4℃）的0.025MHEPES、0.05M KCl、2mM乙酸镁pH7.2、1mM二硫苏糖醇、10%（W/V）蔗糖中。10分钟后，在Dounce匀浆器中冲击80次使细胞破碎。以1000rpm离心10分钟去掉核。用此细胞质组分作为研究HBs Ag-HepG₂细胞相互作用的抑制剂（H、F.Lodish，N.Kong，M.Sni-der和G.J.A.M.Strous，“肝癌分泌蛋白以特殊速率从内质网迁移至高尔基体”，Nature，304∶80-83，1983）（图16）。

图16表明筛选HBV被膜蛋白的前S部分的结果，这是为了确定识别人肝癌HepG₂细胞的最佳区域。使共价连接HBs Ag亚型ad的纤维素衍生物（40mg）（A、B、C条）或合成的前S（21-47）肽（D条）悬浮在1ml TS中（0.14M Na Cl、0.01M Tris-HCl、0.02%Na N₃pH7.2），其中还含有10mg/ml的牛血清清蛋白（TS-BSA），并且，如果指明，还筛选具有抑制活性的额外组分。这些组分是：来自4×10⁶个HepG₂细胞无核匀浆物，亲和柱层析纯化的HepG₂细胞“受体”制备物（1个A280单位）;抗-“受体”和抗-肽抗血清（400μl;以及合成肽（C∶1mg;D∶200μl）;加入HepG细胞（～2×10;预先洗涤并悬浮在1ml TS-BSA中），使混合物在37℃下保温30分钟，然后在4℃下1小时。使细胞-纤维素混合物铺在1ml33%（W/W）Hypaque（Sterling Organics，New York，NY）顶部，以3000rpm离心2分钟。从沉淀中回收结合有细胞的纤维素，用TS-BSA使Hypaque/TS-BSA界面的未结合细胞稀释5倍，并通过离心进行沉淀。使细胞暴露于去污剂Triton X-100（5mg/ml，水中）中得到细胞溶解液，取出等分试样测定乳酸脱氢酶（LDH）活性，通过此测定吸附的未吸附的细胞的比例。使用Sigma500号诊断箱测定LDH。在A和B条中，左柱顶部的垂直线条长度表明5次检测平均值的标准误差。

为了分离部分纯化的HBV受体，使HepG₂细胞质组分（1ml，OD280＝4）上到1ml HBs Ag-纤维素柱中，该柱用含有1mM Ca Cl₂和1mM Mg Cl的TS（TS-Ca-Mg）预洗涤过。在37℃下保温30分钟后，然后在4℃下保温1小时，用TS-Ca-Mg洗涤柱子，直至洗出液的OD280值接近零为止，然后用4M Mg Cl₂洗脱。洗脱液含有2.4%至3.9%的原有蛋白，使此在TS中透析，并用于抑制测试（图16）和诱导抗-受体的血清。在后一目的中，用800g在完全Freund氏佐剂中的受体制备物免疫兔子，然后以两周的间隔额外施用4次带有不完全Freund氏佐剂的800μg剂量。在使用最后抗原剂量两周后从兔子中抽取血样。

实例28 肽合成及肽-纤维素衍生物的制备

通过改进的固相技术（S.B.H.Kent和I.Clark-Lewis，“生物活性肽的当代化学合成方法”，见于《生物学及医学中的合成肽》，K.Alitalo，P.Partanen和A.Vaheri编（Amsterdam∶Elsevier），pp.29-57，1985），合成对应于HBV被膜蛋白亚型adw₂的前S区，并在其C末端有额外的Gly-Gly-Cys-酰胺残基（为了易于与载体偶联而加入）的肽。

链装配过程中每一步的效率大于99.5%（S.B.H.Kent，M.Riemen，M.Le Doux和R、B.Merrifield，《第四届国际蛋白序列分析会议论文集》，M.Elzinga编，（Clifton，NJ∶Humana），pp.626-628，1982）。对从树脂上切下的肽进行高效液相层析（HPLC）表明，相应于85%的物质在214nm处的吸收有典型的主要单峰。在Sephadex G-10上进行凝胶过滤使肽进一步纯化某些肽通过半制备性HPLC纯化至均一状态。为了与纤维素偶联，用2-巯基乙醇使肽还原，并通过Sephadex G-10柱层析使之从低分子量的组分中分离出来（A、R.Neurath，S、B、H.Kent和N.Strick“合成肽诱导的抗体的专一性，该肽具有与一种病毒蛋白即乙型肝炎表面抗原的片段相同的序列”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79∶7871-7875，1982），然后与N-N-对-亚苯基二马来酰亚胺活化的巯基纤维素混合。通过P.L.Feist，K.J.Danna（“巯基纤维素：一种汞化多聚核苷酸层析的新介质”，Biochemistry，20∶4243-4246，1981）的方法从氨基乙基纤维素中制备巯基纤维素。利用作为载体的半胱氨酸活化的脂质体制备抗此肽的兔抗血清。

实例29 制备HBs Ag（HBV）及进行免疫检测

结合使用分别在KBr和甘油梯度中进行等密度和分级区带离心的方法，从大量HBV携带者中纯化HBs Ag（A.R.Neurath，A.M.Prince和J.Giacalone，“利用亲和层析大规模纯化乙型肝炎表面抗原”，Experientia，34∶414-415，1978）。通过在非连续的蔗糖梯度上进行离心来纯化从血清中沉淀的HBV（W.S.Robinson，R、L.Greeman，“人乙型肝炎病毒候补核心中的DNA聚合酶”，J.Virol.，13∶1231-1236，1974）。

将HBs Ag和HBV与SH-纤维素连接，所用方法与上述肽与纤维素的结合相同。胃蛋白酶处理的HBs Ag-纤维素通过下述制备：在37℃下使纤维素衍生物暴露于胃蛋白酶（50μl/ml，pH2.2）2小时，然后将pH调至7.2。为了进行免疫检测，分别将HBs Ag、HBV和各种合成肽包在聚苯乙烯小球或铺在96孔平板的孔中。通过DEAE-纤维素柱层析从血清中分离出Ig G，并利用Iodobeads（Pierce，Rockford，Illinois）用¹²⁵I进行标记。通过前S（21-47）-纤维素亲和柱层析，以抗前S（21-47）的抗血清中分离出全部IgG，并从中制备免疫化学纯的抗-前S（21-47）。洗涤和洗脱缓冲液分别是TS和4M Mg Cl₂。用β-内酰胺酶标记纯化的抗体。

实例27-29的结果筛选HBV被膜蛋白前S区中的肝细胞受体的识别位点

在最初的检测中，用HBV-纤维素和HBs Ag-纤维素得到相似的结果，后来用后一种纤维素衍生物进行测试，因为HBs Ag比较容易得到。HepG₂细胞的HBV受体的粗制物和部分纯化的制备物以及抗受体的抗血清（图16，A条），抑制细胞与HBs Ag-纤维素的结合。用角蛋白酶对HBs-纤维素进行预处理可从HBs Ag上去除前S序列，这一处理基本上去掉了纤维素衍生物吸附HepG₂细胞的能力。

为了进一步对病毒上的细胞受体识别位点进行定位，利用对应于前S序列片段和对应于抗肽抗血清的合成肽，筛选HBV被膜蛋白前S区序列中的HepG₂细胞的识别区域。在抗前S1专一性肽1-21、12-32、32-53、53-73、94-117和前S2专一性肽120-145和153-171的抗血清中，只有抗前S（120-145）、前S（12-32）和前S（32-53）的抗体抑制HepG₂细胞与HBs-纤维素的结合，抑制率分别为40%、70%和94%（图16，B条）。因此，只有抗-前S（32-53）高效率地抑制HepG₂细胞与HBs-纤维素的结合。然而，前S（32-53）与前S（12-32）不同，它不被人抗-HBV所识别，而且它在兔中只能诱导很为勉强的抗-HBV的水平。很显然，上述所列的肽中，没有一个能由人抗-HBV和HepG₂细胞二者有效地识别。因此，合成了一个对应于HBV亚型adw₂的前S（21-47）肽，它与前S（12-32）和前S（32-53）两种序列有部分重迭（参见图17）。

图17是HBV被膜蛋白及其相互关系的示意图。图17a代表HBVDNA中编码HBV被膜蛋白的开放读码框，而且根据HBV的抗原亚型，此读码框还能够编码由389-400氨基酸组成的蛋白。最早鉴别的HBV被膜组分是25KD的S蛋白，它产生于此开放读码框的C端并由226个氨基酸组成（P.Charnay，E.Mandart，A.Hampe，F.Fitoussi，P.Tiollais，F.Galibert，“病毒基因组和编码乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）主要多肽的基因的核苷酸序列的定位”，Nucleic Acid Res.，7∶335-346，1979;P.L.Peterson，I、M.Roberts，G.N.Vyas，“乙型肝炎表面抗原中两种主要多肽组分的部分氨基酸序列”，Proc、Natl.Acad.Sci.USA，74∶1530-1534，1977）。它以非糖基化（P25）和糖基化（GP29）的形式存在。中间蛋白（M）（281个氨基酸）含有S蛋白的序列及由HBV DNA前S2区编码的N端55个额外氨基酸，它以两种不同的糖基化形式存在，GP33和GP36。大蛋白（L）（389或400个氨基酸）含有中间蛋白的序列及由HBV DNA前S1区编码的N端108或119个额外氨基酸，它以非糖基化（P39）和糖基化（GP42）的形式存在（K、H.Heermann，V.Goldman，W.Schwartz，T.Seyfarth，H.Baumgarten和W、H.Gerlich，“乙型肝炎病毒中含有前S序列的大表面蛋白”，J.Virol.，52∶396-402，1984;P.Tiollais，P.Charnay和G.N.Vyas，“乙型肝炎病毒的生物学”，Science，213∶406-411，1981;P.Tiollais，C.Pourcel和A.Dejean，“乙型肝炎病毒”，Nature，317∶489-495，1985;D.T.Wong，N.Nath，J.J.Sninsky.“乙型肝炎病毒中由整个前S开放读码框编码的多肽的鉴别”，J.Virol.，55∶223-231，1985）。

图17b代表大蛋白前S（21-47）区的氨基酸序列（从HBV DNA序列推导而来），它对应于HBV的五种抗原亚型。底线标明对所有五种亚型是共同的氨基酸残基。

抗前S（21-47）的抗血清（等于抗-前S（21-47））与抗-前S（32-53）一样有效地抑制HepG₂细胞与HBs-纤维素的结合（图16，B条）。为了证实抑制是由于抗体与细胞受体的识别位点的直接结合导致，研究了由肽本身产生的对于HBs Ag-HepG₂细胞间作用的抑制。前S（21-47）抑制反应（图16，C条），但前S（32-53）不抑制。发现前S（120-145）和前S（12-32）也没有抑制性能。而且，HepG₂细胞与前S（21-47）-纤维素结合，此结合作用受到同源肽的抑制（图16，D条），但前S（12-32）或前S（32-53）都不抑制。

这些结果表明：（1）与肝细胞优先结合的位点位于HBV被膜蛋白的前S1序列，并且在残基前S21和前S47之间;（2）合成肽类似物前S（21-47）能够模仿结合位点，它还能由抗-HBV识别并诱导抗-HBV应答，正如下面所述。

专一于受体结合位点的试剂：前S（21-47）肽及抗前S（21-47）的抗血清

前S（21-47）与用完整HBV免疫的兔子中产生的抗体（抗-HBV）反应。如图18所述进行双抗体RIA检测，抗-HBV的稀释终点为1/80，000。

图18表明兔子血清中抗体的检测结果，该抗体识别同源肽或HBV，兔子用与脂质体相连的前S（21-47）进行免疫，初级免疫后10星期取血清样。

双抗体RIA检测如前人所述进行，使用¹²⁵I标记的抗-兔Ig G（Neurath等人，1982，见上）。从抗-前S（21-47）的计数中减去稀释的对照血清的计数。

某些从乙型肝炎痊愈的人血清中的抗体也识别此肽。如图19所述进行检测，49个抗-HBs（抗-S蛋白）阳性的个体中有28个具有可检测的抗-前S1的专一性抗体。

图19与检测抗HBV上肝细胞结合位点的抗体有关。用TS以三倍系列稀释的血清（400μl）与4μgHBs Ag在20℃下保温30分钟，该TS中含有正常人血清和牛血清各10%（TS-HB）。混合物加入用抗-前S（21-47）Ig G包膜的聚苯乙烯小球中，如图20所述完成检测。

图20描绘了检测HBV上肝细胞结合位点的结果。用TS-HB以三倍系列稀释含有纯化HBV或HBs Ag（分别为240μg/ml）或HBV感染人的血清的制备物（400μl），并与用抗-前S（21-47）Ig G包膜的聚苯乙烯小球在20℃下保温过夜。洗涤小球，然后与抗-前S（21-47）Ig G-β-内酰胺酶结合物在37℃下保温2小时，用TS-HB稀释至最终浓度为240ng/ml Ig G，TS-HB中含有1mg/ml Tween20，pH7.6（TS-HBT）。测量与小球结合的β-内酰胺酶活性。发现抗原数量增加时，光吸收读数下降;这是由于测量酶活性时底物去色的结果。

前S（21-47）在兔中诱导的抗体识别同源肽和HBV（图18）。发现抗-HBV几乎完全抑制前S（21-47）和抗-前S（21-47）之间的反应（图19），表明不存在大量识别合成肽、而不识别天然HBV被膜蛋白的抗肽抗体。

在蛋白质印迹法中，抗-前S（21-47）选择性地识别HBV的39和41KD组分（图17），它们对应于大蛋白（图21），并与天然HBV颗粒发生强烈的凝聚作用（图22）。

图21表明了HBs Ag的聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离的HBs Ag多肽在a条中就地进行银染色（J.H.Morrissey，“聚丙烯酰胺凝胶中蛋白的银染色：提高均匀的敏感度的改进方法”，Anal.Biochem.，117∶307-310，1981），或转移至硝化纤维素上，并与抗-前S（21-47）和随后与¹²⁵I标记的抗-兔Ig G（b）进行反应。电泳和蛋白质印迹法转移的条件与迄今所述的相似。来自预免疫血清中的Ig G不识别任何HBV被膜组分。

图22表明用抗-前S（21-47）对HBV进行的免疫沉淀。大约50μgHBV和2mg抗-前S（21-47）Ig G（各自在0.5ml TS中），以5000rpm离心10分钟而澄清，使之混合后在37℃下保温30分钟，然后在4℃下过夜。将混合物铺在1ml含有15%甘油的TS的顶部，以10，000rpm离心15分钟。沉淀溶于0.14M Na Cl、0.01M磷酸盐、pH7.2中。使等分试样沉积在碳包膜的格网上，用pH7.3，2%的磷酸钨染色，然后在电镜下观察（a;柱长度＝10nm）。通过印迹杂交法检测悬浮沉淀的等分试样、上清液和HBV初始制备物中的HBV DNA（J.Brandsma和G.Miller，“核酸印迹杂交法：迅速筛选类淋巴细胞系中EB病毒DNA”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77∶6851-6855，1980）（B条）。用预免疫的血清未观察到HBV的沉淀。

作为HBs Ag阳性血清感染性标志的专一于受体结合位点的序列

从不同个体中分离的HBs Ag颗粒的前S2序列的含量不同（W.Stibbe和W.H.Gerlich，“来自不同供体的乙型肝炎表面抗原中可变蛋白的组成”，Virology，123∶436-442，1982）。纯化的HBV与HBs Ag相比较，前S2以及前S1序列一般更为丰富（Heermann等人，1984，见上）。为了进一步评价来自HBV感染个体的血清样品中的专一于受体结合位点的序列的含量，发展以抗-前S（21-47）为基础的酶联免疫测定法（ELISA）。在HBV中，专一于受体结合位点的序列比HBs Ag中更为丰富;并且在HBe Ag阳性的血清中比HBe Ag阴性（＝抗-HBe阳性）血清中更为丰富（图20）。HBe Ag的存在与血清中传染性HBV的存在高度相关（由Robinson总结，1983，见上）。为了确定前S1序列的存在和HBe Ag是否有关，对80个HBV携带者的血清样品进行了筛选，所用方法如下面表2中所述。结果表明，这些血清中可检测的前S1序列的存在与HBe Ag的存在有关，并且与感染有关，正如HBV DNA的存在所表明的那样。从急性HBV感染的个体中连续取血清样品，并筛选不同的乙型肝炎标记物。当HBe Ag和HBV DNA峰值出现时可同时检测到前S1序列（图23）。

图23涉及血清中不同乙型肝炎标记物出现的时间进程，血清来自急性乙型肝炎感染的个体。分别用商业化的放射免疫检测法（RIA）AUSRIA、AUSAB、CORAB和HBe诊断箱（Abbott，North Chicago，Illinois）检测HBs Ag、抗HBs Ag的抗体（抗-HBs）、抗乙型肝炎核心抗原的抗体（抗-HBc）和肝炎Be抗原（HBe Ag）。使用Enztrate测试箱（Beckman，Fullerton，CA）通过分光光度法测试丙氨酸氨基转移酶（ALT）。通过RIA检测HBV上肝细胞结合位点，样品如图20所述稀释10-20倍;阳性样品以前S1+标明。使用³²P标记的、缺口转译的HBV DNA，通过印迹杂交法（Brandsma和Miller，1980，见上）检测10nl血清样品中的HBVDNA;阳性样品在图22顶部以+标明。

表2 HBV上的肝细胞受体识别位点和HBV感染的两种血清标记物免疫检测结果之间的关系：HBe Ag和HBV DNA

血清样品来自

已知与HBV感染性 HBs Ag- 阳性的同性随机的HBs Ag

雄性（50）

前S1+ 前S1- 阳性血液供体（30）

有关的血清标记物（29）（21）前S1+ 前S1-

（11）（19）

HBe Ag+ 27/29（93.1%）0/21（0%）9/11（81.8%）0/19（0%）

HBV DNA+22/29（75.9%）2/21（9.5%）5/11（45.5%）0/19（0%）

根据图22、20和23所述检测血清样品中的HBe Ag、HBV DNA和前S（21-47）序列（前S1+）的存在。

实例30

A.一般方法

根据发表的方法（Clark-Lewis和Kent，1985，见上）化学合成一组肽，它们中的每一个都对应于序列前S（120-145）（亚型adw₂）的不同部分：Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Thr-Leu-Gln-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly。使用兔抗（120-145）肽的抗血清，及某些情况下使用兔抗-HBV抗血清，测定所得肽的抗原性。直接结合检测法和溶液竞争检测法都使用到了。

B.重迭的“半肽”

制备三种肽，它们对应于120-145区域中N端的前S（120-134）-Gly-Gly-Cys、C端的前S（134-145）-Cys和“中间的”前S（128-139）-Gly-Gly-Cys部分。利用三种不同的检测法：可溶性RIA;用包有肽的滴定孔进行的双抗体RIA;对前S（120-145）的可溶性竞争检测法，用抗完整前S（120-145）肽的抗血清对这些肽的免疫反应性进行筛选。在可溶性竞争检测法中（图24A），前S（128-139）肽给出的结果不能从完整肽中分辨出来，而另外两种肽也只有微弱的反应。在双抗体固相检测中（图24B），三种短肽中前S（128-139）的反应仍然最强烈，尽管肽之间的差别有所降低。抑制性研究并未给出清晰的结果，所有三种肽都对前S（120-145）肽与其同源抗血清的结合产生显著的抑制，但浓度必须大于完整肽的100至1000倍。将所有三种短肽混合起来，测定它抑制前S（120-145）与兔抗-HBV抗血清结合的能力。当浓度比用前S（120-145）肽高大约5倍时，观察到显著的抑制作用。

这些结合数据可给以最简单的解释，只要：在前S（120-145）肽中有唯一一个短的B细胞抗原决定基;抗体结合位点完全位于前S（128-139）区域之内;包含前S134残基的完整序列对高亲和性结合是至关重要的。

C.补偿的8残基肽

根据B细胞连续的抗原决定基由六至八个氨基酸残基组成的假设，合成了一组19种肽，每种长度为八个氨基酸残基，它们以移码方式覆盖整个前S（120-J45）区域，并用抗前S（120-145）肽的抗血清测定其免疫反应性。每一种肽都是通过改进的固相化学法合成的，合成在氨基丙基衍生的玻璃纤维滤器纸盘上进行，在装配所需肽的序列之前，用两个6-氨基己酸残基接上一个丙氨基酸残基作为间隔物。

通过在肽固盘上的直接RIA法，测定每种8残基序列兔抗-前S（120-145）的免疫反应性。只有两种肽被明显识别：前S（132-139）和前S（129-136）（图25）。以一般结构为Ac-（8残基）酰胺的游离肽形式合成同组8残基肽，用它们重复上述实验。将这些肽置于塑料微量滴定板小孔中的碱性缓冲液中，也对它们与兔抗-前S（120-145）的免疫反应性进行筛选。只有两种肽被明显识别：前S（132-139）和前S（130-137）图25）。

图25表明覆盖前S（120-145）序列的8残基肽与兔抗-前S（120-145）反应的检测结果。下面的线条（O）：在玻璃纤维圆盘上合成并进行就地检测的肽。抗血清稀释度：1∶200。上面的线条（●）：置于微量滴定孔的碱性溶液中的游离肽。抗血清稀释度为1∶1000。两种情况中的双抗体RIA用放射性标记的山羊抗-Ig G进行。

D.“生长的”肽

合成第三组19种肽，从前S（138-145）（Cys）酰胺起始，并从前S（120-137）序列中加进一个额外的氨基酸形成每种新肽。将这些肽置于微量滴定板的孔中，并筛选它们与兔抗-前S（120-145）的免疫反应性。在此检测中的差别非常小，与前S（132-145）的结合表现出大约50%的上升，紧跟着是一个结合水平相同的平台，然后在加入最后3个残基时，结合率进一步上升50%。

除了检测直接结合外，还进行了一系列抑制作用研究，利用“生长的”肽抑制兔抗-前S（120-145）或兔抗-HBV与前S（120-145）-β-半乳糖苷酶在溶液中的结合。这些数据的分界线清楚得多（图26）。

图26描绘在溶液中进行的抑制作用检测，使用前S（120-145）-β-乳糖苷酶结合物和兔抗-前S（120-145）抗血清（●）或抗-HBV抗血清（○）。使标明的过剩的肽与前S（120-145）肽与β-半乳糖苷酶的结合物及其抗血清预保温，然后进行蛋白A沉淀作用和测定沉淀物中的β-半乳糖苷酶。

所得结果与直接结合检测（图25）的相似，但形式更为清楚：加入残基132使抑制作用从零上升到50%，加入最后三个残基则使其进一步提高，使抗肽抗血清的其同源肽的反应完全被抑制。抗-HBV产生甚至更令人惊异的结果：加入残基前S134、前S133和前S132使抑制水平上升到大约90%。肽链的进一步扩展只导致平稳上升，最后完全抑制抗病毒抗血清和前S（120-145）肽的反应。

这些结果表明，抗-前S（120-145）肽的抗血清中含的抗体，几乎以相等数量抗要求含有肽N端的抗原决定基和前S（132-145）残基间的抗原决定基。另一方面，在抗-HBV的抗血清中，很少含有抗肽N端的抗体和在前S（132-145）残基间结合的优势抗体。

E.短肽的免疫化学反应性

总的说来，上述数据表明，对于兔抗-HBV来说，在前S（120-145）区域中主要的抗体结合位点高度集中于残基前S（132-137）中。兔抗-前S（120-145）的抗体中有大约50%也是抗此区域的。因此，申请人研究了前S（132-137）序列的抗原性和免疫原性：即Gln-Asp-Pro-Arg-Val-Arg。首先，使与免疫原载体蛋白结合的隔离物置于序列的任一端：Ac-前S（132-137）-Gly-Gly-Gly-酰胺和Gly-Gly-Gly-前S（132-137）酰胺。而且，Pro（134）被Gly所取代：[Gly（134）]Ac-前S（132-137）-Gly-Gly-Gly-酰胺。

将所有三种物质得到的抗-肽抗血清以1∶10，000稀释后，与完整长度的前S（120-145）肽具有良好的交叉反应性。在变换实验中，以1∶10，000稀释的抗-前S（120-145）识别所有三种短肽。对于Gly-Gly-Gly-前S（132-137）酰胺的识别最强烈，相当于抗-前S（120-145）识别前S（120-145）的大约50%。用Gly取代Pro（134）降低，但并不消除识别作用。用含有Cys-Gly-Gly和-Gly-Gly-Cys-酰胺序列的无关肽做的对照实验表明，不存在直接识别这些隔离物序列的交叉反应。

上述数据证实，HBV被膜大蛋白和中间蛋白的前S编码的区域中主要的抗体结合位点，集中位于被膜基因的开放读码框的大约前S（132-137）残基中。有趣的是，来自蛋白序列这一亲水脂螺旋部分的前S（125-142）残基，具有一簇极性残基的外表，它由残基前S132、前S13、前S135、前S136和前S137组成。

应当识别到，本发明的说明书和权利要求书是通过说明而不是限制的方式给出的，而且，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明作出各种修饰和改变。

Claims

1、一种乙型肝炎肽免疫原，其特征在于它包括一种含有一个氨基酸链的肽，此氨基酸链对应于HBV被膜的前S基因编码的区域中至少六个连续氨基酸，所述肽免疫原不含对应于乙型肝炎病毒的天然被膜蛋白的氨基酸序列，该肽从下列一组肽中选择出来：前S(12-47)、前S(21-47)、前S(120-137)、前S(53-73)和前S(128-139)。

2、根据权利要求1的乙型肝炎肽免疫原，其中所述肽是前S（12-47）。

3、根据权利要求1的乙型肝炎肽免疫原，其中所述肽是前S（21-47）。

4、根据权利要求1的乙型肝炎肽免疫原，其中所述肽是前S（120-153）。

5、根据权利要求1的乙型肝炎肽免疫原，其中所述肽是前S（132-137）。

6、根据权利要求1的乙型肝炎肽免疫原，其中所述肽是前S（53-73）。

7、根据权利要求1的乙型肝炎肽免疫原，其中所述肽是前S（128-139）。

8、一种测定可能诱导中和病毒的抗体的肽的方法，其特征在于该方法包括

（a）合成许多对应于病毒被膜基因产物的不同肽，

（b）诱导抗步骤a中肽的抗体，和

（c）确定这些肽是否与细胞上的病毒受体结合，以及这些肽和抗-肽抗体是否抑制病毒与细胞表面的反应。