JP4293788B2 - Ｂ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4293788B2 JP4293788B2 JP2002537775A JP2002537775A JP4293788B2 JP 4293788 B2 JP4293788 B2 JP 4293788B2 JP 2002537775 A JP2002537775 A JP 2002537775A JP 2002537775 A JP2002537775 A JP 2002537775A JP 4293788 B2 JP4293788 B2 JP 4293788B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbsag
- monoclonal antibody
- hbsag antigen
- antigen
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 138
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 138
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 19
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical class N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims 2
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 claims 2
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 claims 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims 2
- VOOGILFUHUXBEV-ZBRNBAAYSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;(2s)-pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCCN1 VOOGILFUHUXBEV-ZBRNBAAYSA-N 0.000 claims 1
- MHJJUOJOAJLYBS-ZBRNBAAYSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical group C[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCCN1 MHJJUOJOAJLYBS-ZBRNBAAYSA-N 0.000 claims 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003148 prolines Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 7
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 4
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000937413 Axia Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 206010016100 Faeces discoloured Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WMFYOYKPJLRMJI-UHFFFAOYSA-N Lercanidipine hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC(C)(C)CN(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C1C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 WMFYOYKPJLRMJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102220472767 Ras-related protein Rab-10_T23N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010053614 Type III immune complex mediated reaction Diseases 0.000 description 1
- 101150003160 X gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000016178 immune complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
５つの型のウイルス性肝炎、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎は、現在かなりよく知られている。それぞれの場合、ウイルスは肝臓に侵入し、肝細胞の破壊を伴う炎症状態を引き起こす。
【０００２】
Ｂ型肝炎はウイルスの一種、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる。ＨＢＶウイルスは、Blumbergらにより発見された（A“new”antigen in leukemia sera, JAMA 191: 541, (1965)）。ウイルスは血液経由、性的接触または周産期ルートによって伝播する。
【０００３】
ＨＢＶは、感染しても大多数の症例において、まったく症状を発現することがなく、無症候性急性肝炎の原因となる。急性肝炎は、消化異常、腹痛、尿の異常着色および便の変色、無気力ならびに黄疸を特徴とする。急性肝炎は、肝臓の急速な壊死を伴う劇症型へと進展しうる。
【０００４】
ウイルス感染は、また、急性肝炎であった患者または感染が無症候性であった患者において、慢性型へと移行しうる。慢性キャリアは様々なサイズの肝病変を有し、肝硬変および初期癌を発症する危険性が増大している。感染の慢性化がしばしば起こるアジアやアフリカでは、肝臓の初期癌は重大な公衆の健康問題となっている。さらに、慢性キャリアはウイルスの保有宿主となり、そのウイルスを蔓延させるものであり、世界的レベルでの公衆の健康問題へと変化しつつある。
【０００５】
ＨＢＶ感染は、ヒトにおける最も一般的なウイルス感染の一種である。これは、地理的に特徴的な発生率を有する遍在的な疾患である。欧州および北米では、人口の約０．１％〜１％が感染しているが、アジアおよびアフリカでは人口の２０％までがキャリアである。全世界におけるＨＢＶ感染者の数は、約３億５千万人と推定される。
【０００６】
輸血後のウイルス感染を順に列挙すると、第一番目がＨＢＶであり、次いでＨＣＶ、ＨＩＶがこれに続く。
【０００７】
ＨＢＶは、肝親和性のＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス）である直径４２nmのＤＮＡを有する小ウイルスであり、ヘパドナウイルス科のファミリーに分類される。その遺伝子構造は、著しく小型なものである。ウイルスは、外殻およびヌクレオキャプシドからなる。殻は主として３つの表面抗原（ＨＢｓＡｇ、すなわちＢ型肝炎表面抗原）からなり、これらがＨＢＶ感染の診断において大きな役割を果たしている。ヌクレオキャプシドは、コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素およびウイルスゲノムを含有する。ウイルスの核がウイルスの感染要素を構成し、外膜はウイルスの主要な抗原決定基であるＨＢｓ抗原を担っている。ウイルスの核はヌクレオカプシド内にとどまる。ヌクレオカプシドの直径は約２８nmである。
【０００８】
サイズは小さいが（３２００塩基対）、環状で、部分的に二重鎖となっているＨＢＶのＤＮＡは、重複するＳ、Ｃ、ＰおよびＸ遺伝子から４つの型のウイルス生成物をコードしている。
【０００９】
Ｓ遺伝子は、ビリオンの外表面上に発現されるＨＢｓＡｇ殻タンパク質をコードしている。ＨＢｓＡｇ殻タンパク質は、２４kDaのポリペプチドおよびそれがグリコシル化された２８kDaのポリペプチドの２つの主要ポリペプチドで構成される。ＨＢｓＡｇは、１２４〜１４７位のアミノ酸に対応し、ＨＢＶのすべての分離株に共通する「ａ」決定基と呼ばれるＨＢＶの主要中和エピトープを含む。「ａ」決定基は、診断および予防接種において最も重用な標的である。急性または慢性感染後に抗ＨＢｓ抗体が産生されると、通常は回復し予後も好ましい。抗ＨＢｓ抗体には、ワクチン接種後には中和抗体の産生が伴う。回復期の個体の血清またはワクチン接種後の血清中に見出される抗ＨＢｓ抗体の大部分は、その「ａ」決定基の領域に結合する。ＨＢｓ抗原の三次構造は未だ決定されていないが、構造−機能研究の結果、「ａ」決定基がＨＢｓＡｇ抗原（残基９９から１６９）の主要親水性領域中に位置することが示されている。「ａ」決定基が高次構造を有することは明らかである。というのも、アルキル化または還元によりこの領域を変性させると、ＨＢｓＡｇ粒子を生じ、そのＨＢｓＡｇ粒子の抗原性が劇的に低下しているからである。おそらく、システイン間のジスルフィド架橋が適正なコンフォーメーションに関与している。「ａ」決定基（残基１２４〜１４７）は５つのシステインを含むが、「ａ」決定基の可能な構造には、第一のループを形成する１２４位と１３７位のアミノ酸の間および第二のループを形成する１３９位と１４７位のアミノ酸の間のジスルフィド架橋の存在が関与する。おそらく「ａ」決定基の配列全体が抗原構造に寄与している。さらに、ＨＢｓＡｇ抗原は、１２２位にそれぞれリシンまたはアルギニンが存在するｄまたはｙ決定基のいずれか、および１６０位にそれぞれリシンまたはアルギニンが存在するｗまたはｒ決定基を含む。したがって、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒおよびａｙｒの４つの主要なＨＢｓＡｇの抗原サブタイプがあり、それぞれが、地理的な分布に関連する。Ｓ遺伝子の上流、プレＳ遺伝子は種々のＨＢＶ表面抗原をコードする。
【００１０】
Ｐ遺伝子は、ウイルスの複製メカニズムにきわめて重要なＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素をコードする。
【００１１】
Ｃ遺伝子は、可溶性で分泌されるタンパク質であるＨＢｅＡｇおよび細胞内のコアタンパク質であるＨＢｃＡｇの２つのヌクレオカプシドタンパク質をコードする。ＨＢｅＡｇは、ウイルス複製が増大していることの血清学的マーカーである。
【００１２】
Ｘ遺伝子は、異なる生物学的効果を有し、特にウイルスおよび細胞の遺伝子の転写をトランスに活性化しうるＨＢｘＡｇをコードする。
【００１３】
ＨＢＶが個体に感染すると、ウイルスＤＮＡは、完全に宿主の肝細胞内で複製される。
【００１４】
ＨＢＶの感染後、患者の血清中で最初に検出可能なマーカーは、ＨＢｓＡｇ抗原であるが、このマーカーが、６ヶ月以上持続することは稀である。ＨＢｓ抗原が血清から消失した後、抗ＨＢｓＡｇ抗体が検出可能となり、持続する。ＨＢｃ抗原はＨＢｓ殻抗原によって隔離されているので、通常では、患者の血清中に検出することはできないが、抗ＨＢｃ抗体の存在は、ＨＢｓ抗原の出現後１〜２週間以内に容易に確認される。
【００１５】
しかし、上記のマーカーを用いる標準的な血清学的試験では、ＨＢＶの変異体の検出が可能にならないことは、現在明白である。ＨＢＶのキャリアであり、進展した慢性Ｂ型肝炎を有する患者が存在するという事実は、標準的な血清学的マーカーを用いてＨＢＶ感染を同定することができないで、最も重大な問題であり、より良い試験法の開発の必要があることを示す。
【００１６】
ＨＢＶ変異体の存在は、長年にわたり疑われていた。この仮定は、慢性肝炎の患者の血清中および／または肝臓中に、標準的な血清学的マーカー（ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｃ）が確認されなかったにもかかわらず、ウイルスＤＮＡが検出されたことに基づいている。
【００１７】
ウイルスのＤＮＡ配列のキャリアである患者においてＨＢｓＡｇが検出できないことについては、表面抗原の低発現またはＳタンパク質の抗原決定基のレベルでの突然変異の存在など、いくつかの説明が可能である。第一には、ウイルスの共感染がＨＢＶの複製を抑制しうる（Jilg W et al., Hepatol, 1995, 23: 14-20, Jylberberg et al., Clinical infection diseases, 1996, 23: 1117-1125, Ushida et al., J. of Med. Virol. 1997, 52: 399-405, Hofer et al., Eur.J. Clin; Microbiol. Infect. Dis., 1998, 17: 6-13）。別の説明は、インビボにおける抗ＨＢｓ抗体との免疫複合体形成の間にＨＢｓ抗原がマスクされたということであろう。
【００１８】
しかし、さらに最近になって、ＨＢｓＡｇの存在が、患者の抗ＨＢｓ血清中に観察されるようになってきた。これらの患者におけるＨＢｓＡｇ抗原の存在は、その抗原が存在する抗ＨＢｓによって中和されていないという事実と関連しており、変異体の存在を示唆している。
【００１９】
変異体または突然変異体の存在は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるワクチン接種および治療に関連してきている。突然変異体の分析は、突然変異体が混合したポピュレーションから選択されてきたものであり、「ａ」決定基中のアミノ酸置換を起こす点突然変異を有することを示しているようである。突然変異体は、遺伝子型のプールとなる、遺伝子中の任意の突然変異の産物であるらしい。さらに、免疫反応は、突然変体の選択における主な因子であると考えられる。一般に、インビトロでウイルス感染した細胞にモノクローナル抗体を添加すると、その抗体によって中和されない分離株が選択される。したがって、ウイルス複製が活性である患者に与えられたモノクローナル抗体が、エスケープ突然変異体（escape mutant）を選択することになっても驚くにはあたらない。臨床的に重要な数種のエスケープ突然変異体の分離株が、ワクチン接種を受けた個体中に見出されている。いくつかの場合では、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基内の１４５位のアミノ酸をコードするコドンのレベルで点突然変異を有し、グリシンがアルギニンに変化している。そのような突然変異体を含有する血清のチンパンジーへの投与は、これらの因子が伝播性であることを示している。「ａ」決定基の１４１位のリシンのグルタミン酸での置換を誘導する別の点突然変異も、ワクチン接種した患者において見出されている。したがって、野生型ＨＢＶのみならず突然変異体または変異体も、確実な方法で、検出可能とすることが重要である。実際、ＨＢｓＡｇエピトープのレベルで重要な突然変異が起こり、抗ＨＢｓ抗体がそれを認識しない場合には、その突然変異体が検出されないか、その試験が十分な感度を有するものではないということになる。現在、エスケープ突然変異体が検出されていないという事実は、そのキャリアに影響を与えるのみならず、血液、血液製剤および臓器の提供による感染の伝播にもつながりうる。さらに、突然変異体ＨＢｓＡｇは、個体が以前に免疫化されており、抗ＨＢｓタイプの応答を有していたとしても、その個体に感染しうる。国際公開公報第94/26904号には、１２２位での突然変異を含むエスケープ突然変異体からＨＢｓＡｇの野生型を区別することが可能なモノクローナル抗体が記載されている。しかし、確実な診断試験を開発するために、ＨＢｓＡｇの野生型および突然変異体型の両方を検出しうるモノクローナル抗体の特徴付けを求める深刻な必要性がある（Coleman et al. (1999), Journal of Medical Virology 59: 19-24; Ireland et al. (2000), Hepatology 31; 1176-1181）。実際、あるケースでは、「ａ」決定基をコードする殻遺伝子の領域に影響を及ぼすＨＢＶ変異体が、市販の診断試験で使用されるモノクローナル抗体では認識されない（Carman et al. (1990), Lancet 336: 325-329; Seddigh-Tonckaboni et al. (2000), Journal of Medical Virology 60: 113-121; Weinberger et al. (2000), Journal of General Virology 81: 1165-1174）。
【００２０】
したがって、本発明の主題は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび有利には３つ以上の突然変異体型ＨＢｓＡｇ抗原に結合可能なモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域中の少なくとも６個の連続するアミノ酸からなるペプチド配列に結合し、有利にはＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域により構成されるペプチド配列に結合する。
【００２１】
さらに、本発明の主題は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび有利には３つ以上の突然変異体型ＨＢｓＡｇ抗原に特異的に結合可能なモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域に特異的に結合する。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体が野生型および突然変異型ＨＢｓＡｇ抗原に特異的に結合する能力は、以下の事実に関係する。すなわち、本発明の発明者がエピトープ「マッピング」によって初めて明らかにしたように、本発明のモノクローナル抗体の能力は、ＨＢＶの野生型およびＨＢｓＡｇ抗原の１９９位と２０８位のアミノ酸の間に位置する領域またはエピトープに相当する突然変異型の両方において、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基のレベルまたは「ａ」決定基の近接部分で起こりうる他の突然変異またはアミノ酸置換の有無とは無関係に、表面抗原の高度に保存された領域を認識するとの事実につながる。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む少なくとも１つのＨＢｓＡｇ抗原の突然変異型、および具体的にはＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位での少なくとも１個のアミノ酸置換、および場合によりＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位での少なくとも１個の他のアミノ酸置換を有するＨＢｓＡｇ抗原の突然変異型を認識し、特異的に結合することが可能である。明らかにされた突然変異または置換は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列に関して位置付けられる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体によって特異的に認識される突然変異型は、以下の実施例において確認される。より具体的には、以下の突然変異体がある：
−１０４３Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−ＡＰ３．１：ＨＢｓＡｇ抗原の１４４位のアスパラギン酸がアラニンによって置換されている
−Ａｒｇ１．２：ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位のグリシンがアルギニンによって置換されている
−１１５７Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１２７位のプロリンがアラニンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−１０５６Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１２０位のプロリンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−Ｍ５：ＨＢｓＡｇ抗原の１００位のチロシンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１１８位のトレオニンがバリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１２２位のアルギニンがリシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１３３位のメチオニンがイソロイシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１３４位のチロシンがアスパラギンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４２位のプロリンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位のグリシンがリシンで置換されている。
【００２４】
上記の突然変異体は、モノクローナル抗体のスクリーニングに使用することができる。本発明の抗体を、たとえば、野生型ＨＢｓＡｇ抗原および１つ以上の上記のような突然変異体でスクリーニングすることができる。具体的には、本発明の抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位の少なくとも１つで、さらに具体的にはＨＢｓＡｇ抗原の１４３、１４４および１４５位の少なくとも１つで１個以上の置換を、および場合によりＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位の少なくとも１つで少なくとも１個の他の置換をそれぞれが有する１つ以上のＨＢｓＡｇ突然変異体でスクリーニングすることができる。
【００２５】
具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位のアミノ酸をコードする１つ以上のコドンのレベルで点突然変異を有する配列によってコードされる「ａ」決定基を保持する少なくとも１つのＨＢｓＡｇ突然変異体に結合することができる。本発明の好ましい抗体は、イムノグロブリンのクラスＧに属する、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７と呼ばれる抗体である。２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ｂイムノグロブリンクラスに属する。８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ａクラスに属し、２Ｇ２Ｇ１０抗体をＵＶ処理することによって得られた。
【００２６】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体、具体的にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）2およびｓＦｖフラグメント（Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833およびBird et al., 1988, Science 242: 423-426）およびそのコンジュゲートをも含む。本発明のモノクローナル抗体誘導体は特にヒト化抗体を含む。モノクローナル抗体のフラグメント、およびヒト化誘導体を含むモノクローナル抗体の誘導体の製造方法は、当業者には周知である。非ヒト、例えばネズミの「ヒト化」型抗体は、非ヒトイムノグロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどのヒト化抗体は、レセプターの超可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの所望の特異性、親和性および容量を有する非ヒトドナー種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられているヒトイムノグロブリン（レセプター抗体）である。ある種の場合には、ヒトイムノグロブリンのＦｖ領域の（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の機能を改善するために実施される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび好ましくは２つの可変ドメインを含み、その中では、すべてまたはほとんどすべての超可変ループは非ヒトイムノグロブリンに相当し、すべてのまたはほとんどすべてのＦＲ領域はヒトイムノグロブリンのものである。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒトイムノグロブリンなどのイムノグロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分をも含みうる（Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); およびPresta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)）。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体、具体的には、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７抗体は、下記の実施例１に記載のプロトコール、または実施例１に記載のプロトコールに由来するプロトコールに従いハイブリドーマ系により産生される。さらに、哺乳動物、好ましくはネズミ動物を、野生型ＨＢｓＡｇ抗原または場合によりフラグメントまたは適当な抗原誘導体の形態のＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型で免疫化し、ハイブリドーマを形成させるために抗体産生細胞を不死化させ、野生化ＨＢｓＡｇ抗原および場合によりフラグメントまたは適当な抗原誘導体の形態の少なくとも１つの上記突然変異体型でハイブリドーマ培養物をスクリーニングし、さらに野生型ＨＢｓＡｇおよび少なくとも１つの上記突然変異体型に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによってハイブリドーマ系を作製することからなる、本発明のモノクローナル抗体の製造方法も本発明の主題である。
【００２８】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ、上記方法に従ってインビボまたはインビトロで得られやすいハイブリドーマを培養することおよび培養培地からモノクローナル抗体を回収することからなる本発明のモノクローナル抗体の製造方法、ならびにこのハイブリドーマ培養方法によって得られそうなモノクローナル抗体をも含む。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原を含有すると思われる検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出および／または定量のための、したがって（野生型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスの検出のためのイムノアッセイにおける使用が可能である。このようなアッセイは、臨床診断においておよび血液製剤のスクリーニングにおいて使用可能である。さらに、本発明は、検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出および／または定量方法にも関し、その方法は、本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはそのようなモノクローナル抗体のフラグメントもしくは誘導体に検体を接触させること、および少なくとも１つの抗原／抗体、フラグメントまたは誘導体の複合体の存在を確認することからなる。
【００３０】
本発明の方法の一実施態様においては、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体、および本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体により認識されるものとは異なる領域またはエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体から選ばれる少なくとも１つの他の抗体と検体を接触させる。
【００３１】
このような方法は、当業者に周知の「サンドイッチ」法または「競合」法に従って一または二段階で、均質または不均質相で実施される。さらに、本発明の方法は、同じアッセイにおいて、分析されるべき検体中の抗ＨＢｃ抗体の検出と関連付けることも可能である。
【００３２】
対応する診断組成物は、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体を、場合により、抗ＨＢｃ抗体の検出のための少なくとも１つの試薬との組み合わせで含み、さらに本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体によって認識されるものとは異なる領域またはエピトープを認識する、ＨＢｓＡｇ抗原検出用の少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含みうる。本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体は、ＨＢｓＡｇ抗原捕獲抗体として固相上に固定化することが可能であり、または、あらゆる適当なマーカーで標識した場合には検出に使用することが可能である。また、本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体をＨＢｓＡｇ抗原捕獲相として使用し、本発明の抗体により認識されるものとは異なるエピトープに対する少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を検出コンジュゲートとして使用すること、またはその逆の使用も考えられる。同様に、本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体、および本発明の抗体により認識されるエピトープとは異なるエピトープに対する少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を同じ固相に固定化することが可能である。さらに、検体中の抗ＨＢｃ抗体を捕獲しうる試薬は、この同じ固相上、あるいは本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体、および場合により本発明の抗体により認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識する少なくとも１つの他の抗ＨＢｓＡｇモノクローナルまたはポリクローナル抗体が固定化されている固相とは異なる固相上に固定化し、本発明の組成物に含ませることが可能である。
【００３３】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはそのような抗体のフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせを含む、ＨＢＶに対する受動免疫のための治療または予防的使用に適した抗血清にも関する。その抗血清は、さらに、本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体以外の、少なくとも１つのモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または抗ＨＢｓＡｇモノクローナルおよびポリクローナル抗体の混合物を含みうる。
【００３４】
ＨＢＶに対する受動免疫のための治療または予防的使用のための適当な組成物は、薬学的に許容されうるビークルとの混合物の中に、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせを含む。
【００３５】
「薬学的に許容されうるビークル」とは、例えばRemingtonのPharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co.に記載されるようなヒトまたは動物に投与しうる支持体およびビークルを意味する。
【００３６】
本発明はしたがって、本発明のモノクローナル抗体、そのフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせの治療的または予防的に効果的な量を個体に投与することからなる、治療または予防目的のＨＢＶに対する受動免疫方法をさらに含む。本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体により認識されるエピトープとは異なるエピトープに対する１つ以上の他の抗ＨＢｓＡｇモノクローナルまたはポリクローナル抗体も投与しうる。
【００３７】
本発明は、上記に定義した本発明の抗体に対する抗イディオタイプまたは抗イディオタイプ抗体をも含む。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体に対して産生され、別の抗体の特異的抗原結合部位またはイディオタイプと反応する抗体である。抗イディオタイプ抗体は、イディオタイプにより認識される抗原として機能する。このような抗体は、コンフォーメーション依存エピトープの場合には特に有用である。ウイルスなどの外部病原体の内部イメージを表す抗イディオタイプ抗体は、ワクチン接種用の抗原の「代替物」として使用される。インビボにおける抗イディオタイプ抗体の重要性は、多数の実験において明らかにされている。インビボにおける抗イディオタイプ抗体の投与は、特異的イディオタイプに対する応答の抑制または増強という効果をもたらす。本発明の抗イディオタイプ抗体は、ＨＢｓＡｇの１９９〜２０８エピトープを認識する抗−抗イディオタイプ抗体を産生することにより動物における応答を誘導し、それにより動物をＨＢＶに対して免疫化し、さらにはＨＢＶ感染を中和することさえできる。したがって、本発明の主題は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域を認識する抗−抗イディオタイプ抗体の産生を動物において誘導する抗イディオタイプモノクローナル抗体または前記抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントまたはその混合物を、動物のＨＢＶへの免疫化に十分な量で含む活性組成物、および例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムといった薬学的に許容されうるアジュバントを含むワクチン組成物である。薬学的に許容されうるアジュバントは当業者に周知であり、参考としてRemingtonのPharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co.に記載のアジュバントを挙げることができる。所望ならば、ワクチンは湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助的物質を含有しうる。動物をＨＢＶに対して免疫化する方法は、上記に定義されたワクチン組成物を１回以上の投与において投与することからなる。無論、動物に対するインビボ試験の後には、ＨＢＶに対するワクチン接種の最終目的は、ヒトにおける感染予防である。したがって、上記に使用された「動物」という語は、動物およびヒトの両方を意味する。ワクチンは、適当な希釈剤（特に、リン酸緩衝液でありうる）の中に、タンパク質が１mg／mlのオーダーの最終濃度になるように、本発明の抗イディオタイプ抗体またはそのFabフラグメントを混合することにより製造する。通常のサイズのヒトに対しては、例えばその溶液の５０μl（５０μg）〜１００μl（１００μg）を４５００μl中に希釈し、５００μlの薬学的に許容されうるアジュバントと混合する（ｐＨ６．０±０．１）。用量は、動物、その年齢および体重により変わる。
【００３８】
本発明のイディオタイプモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法で製造される。ＨＢｓＡｇの１９９〜２０８エピトープまたは領域を得て、現在利用可能なあらゆる技術により精製する。イディオタイプ抗体（Ａｂ１）は、動物、好ましくはネズミ、具体的にはマウスを、抗原として上記エピトープで免疫化することにより製造する。次いで、動物の脾臓細胞を確認し、単離し、ポリエチレングリコールなどの融合剤の存在下でリンフォーマまたはミエローマ細胞と融合させる（Kohler and Milstein, Nature 256: 459 (1975)）。次に、融合させた細胞を、非融合悪性細胞の増殖を阻害する選択培地中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングし、求める特異性を有するモノクローナル抗体の分泌を試験する。モノクローナル抗体は、腹水での増殖によりインビボでも得られる。イディオタイプ抗体Ａｂ１は、ＨＢＶに対し免疫化し、中和さえする性質を有する抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を産生させるために使用される。抗イディオタイプ抗体Ａｂ２は、抗体Ａｂ１の製造に用いた方法と同じ方法で得られるが、このときは抗体Ａｂ１が使用される免疫原となる。
【００３９】
本発明の主題はさらに、本発明者が同定した配列番号１の配列中に示すＨＢｓＡｇ抗原の１９９位のアミノ酸から始まり２０８位のアミノ酸で終了するペプチド配列のＨＢｓＡｇ抗原の保存されたエピトープおよびその免疫原性ペプチドとしての使用であり、さらには、ペプチド配列が、配列番号１に示すエピトープのアミノ酸と相同または同一の少なくとも３個および少なくとも４個のアミノ酸をそれぞれ含むことで特徴付けられる免疫原性ペプチド、具体的には配列番号２および配列番号３に示す免疫原性ペプチドでもある。添付の図に示した配列番号１と配列番号２の配列を比較したところ、配列番号２の配列は、配列番号１の対応アミノ酸と厳密に相同あるいは同一である、Ｗ（トリプトファン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）の３個のアミノ酸および配列番号１のＬ（ロイシン）に等価（equivalent）なＩ（イソロイシン）を含む。添付の図に示した配列番号１と配列番号３の配列を比較したところ、配列番号３の配列は、配列番号１の対応アミノ酸と厳密に相同あるいは同一である、Ｗ(トリプトファン)、Ｐ（プロリン）、Ｙ（チロシン）、Ｓ（セリン）の４個のアミノ酸および配列番号１のＳ（セリン）およびＩ（イソロイシン）にそれぞれ等価なＴ（トレオニン）およびＬ（ロイシン）の２個のアミノ酸を含む。前記の等価なアミノ酸とは、ペプチドの免疫原性としての効率に影響を及ぼすことなく相互に置換しうるアミノ酸である。このような免疫原性ペプチドは、上記の定義に対応し、ＨＢｓＡｇ抗原の野性型および少なくとも１つの突然変異体型の両者を認識可能なモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメントまたはモノクローナル抗体の誘導体の製造に使用することができる。モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントもしくは誘導体の製造は当業者には周知である。例として、Kohler and Milstein, Nature 256: 45-47 (1975)、European Journal of Immunology 6: 511-519 (1976)、およびGalfre G. et al. Nature, 266: 522-550 (1977)が挙げられる。エピトープは、化学的合成、遺伝子組換えまたは異なる方法の組み合わせにより製造しうる。本発明のエピトープをコードする配列はしたがって、適当な宿主細胞内で適当なプロモーターの制御下で発現させることができる。宿主細胞には、哺乳類細胞、酵母および細菌を含む原核または真核生物に由来する細胞などの、組換えＤＮＡ分子を転写および翻訳することが可能で、かつ発現に必要な因子の制御下に置かれた、本発明のエピトープをコードするＳ遺伝子のフラグメントを発現させることができるあらゆる単細胞生物が含まれる。さらに、配列番号２および配列番号３の免疫原性ペプチドは、化学的合成により容易に得ることができる。
【００４０】
最後に本発明は、特定のストリンジェントな条件下で、配列番号１に示すエピトープをコードするＤＮＡヌクレオチド配列、配列番号１に示すエピトープをコードする前記ヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡヌクレオチド配列または前記ＤＮＡヌクレオチド配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる核酸プローブまたはプライマーに関する。
【００４１】
本発明は、特定のストリンジェントな条件下で、配列番号１に示すエピトープをコードする配列番号４に示すＤＮＡヌクレオチド配列、配列番号４の相補的ＤＮＡヌクレオチド配列または前記ヌクレオチドＤＮＡ配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる核酸プライマーまたはプローブ；生物学的検体中の（野性型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスの検出および／または定量のための、上記定義の少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーを含む診断組成物；ならびに生物学的検体中の（野性型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ診断の方法にも関する。この方法によれば、血清、血漿または組織検体などの生物学的検体を、少なくとも１つのＨＢＶウイルスによる感染が疑われる患者から採取し、必要ならば上記検体を、検体からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出するために処理し、上記検体を特定のストリンジェントな条件下で少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーと接触させ、上記ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡと少なくとも１個のプローブとのハイブリダイゼーションまたは上記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅を確認することにより検体中のウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを検出および／または定量する。核酸プローブを使用する場合には、ハイブリダイゼーション複合体の形成の確認は、標的配列に相補的またはほぼ相補的で、あらゆる適当なマーカーによって標識したプローブを使用することにより直接行うことが可能であり、または標的配列の一部に相補的またはほぼ相補的な捕獲プローブおよび適当なマーカーで標識したプローブまたは標的配列の別の部分に相補的またはほぼ相補的な検出プローブを使用することからなる、１または２段階の「サンドイッチ」法の実施によっても行うことが可能である。プライマーを使用する場合には、プライマーを、標識増幅産物の同定のために、直接標識することも可能であり、または標識しないことも可能であり、後者の場合には、生成した増幅産物は、アクリルアミドゲルを通過させることにより予測した大きさとの関係で選択したり、または適当な検出プローブを用いて分析しうる。
【００４２】
Galibertら（Nature 280: 646-650 (1979)）によるＨＢＶゲノムの７５１〜７８０位のヌクレオチドに相当する、配列番号４に示す本発明の１９９〜２０８エピトープをコードするＤＮＡヌクレオチド配列の選択、それに相補的な配列および対応するＲＮＡ配列を選択することに始まり、配列番号４、それに相補的な配列または対応するＲＮＡにハイブリダイズ可能なヌクレオチドプローブまたはプライマーを決定し、それを得ることは当業者の能力の範囲内である。オリゴヌクレオチドの製造の例として、制限酵素の使用および自動合成装置を用いる化学合成が挙げられる。特定のストリンジェント条件下で本発明のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブおよびプライマーは、この定義の一部を形成する。適当なストリンジェント条件を定義することも当業者の能力の範囲内である。特徴的なストリンジェント条件は、試験されたハイブリッドのＴｍ（「融解温度」）以下の約１２℃と２０℃との間から選択される温度と食塩液濃度の組合わせに対応するものである。これらはすべて当業者の一般的知識の一部をなすものであり、説明のために「DNA PROBES」(George H. Keller and Mark M. Manak著、 2nd Ed. (1993) Stockton Press, 49 West 24th St., New York, N.Y. 10010, USA（さらに具体的には、１〜２１ページの第１節“Molecular Hybridization Technology”を参照）)と題する書籍を挙げることができる。
【００４３】
図１
添付の図１は、ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列を示す。この図では、１９９〜２０８エピトープは、下記の実施例に説明するようにエピトープ「マッピング」により位置付けられ、確認されている。ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列の１９４〜２０９のアミノ酸からなる領域中の野性型ＨＢｓＡｇ抗原の配列のアミノ酸と共通または相同もしくは同一のアミノ酸、および等価なアミノ酸を有する２つのクローンＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧおよびＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩを、野性型ＨＢｓＡｇ抗原の配列の下に示す。共通または相同もしくは同一および等価なアミノ酸は図１において太字で示す。
【００４４】
実施例
実施例１：モノクローナル抗体の作製および特徴付け
４〜６週齢の雌BALB/c JYcoマウス（IFFA Credo）を、等容量のフロイント完全アジュバントで乳化させた組換えＨＢｓＡｇ ａｙ５０μgを腹腔内投与により免疫化した。組換えＨＢｓＡｇ ａｙタンパク質は、Pasteur Merieux Connaughtから入手した。このタンパク質は、Galibertら（Nature 280: 646-650 (1979)）により配列決定されたａｙｗ系統に相当し、ＣＨＯ細胞で発現している（Michel et al., PNAS 81/7708-7712 (1984)）。このタンパク質は、プレＳおよびＳ領域から構成される。ＮＨ2末端位に位置する５５アミノ酸がプレＳ２領域に相当する。
【００４５】
３回の注射を、２週ごとに、不完全アジュバントの存在下で行った。最後の注射から４日後に、脾臓細胞を取り出し、Kohler and Milstein (Nature 256: 45-47 (1975); European Journal of Immunology 6: 511-519 (1976))の方法に従って、Sp 2/0-Ag14マウスのミエローマ細胞系と融合させた。細胞を１２〜１４日間培養した後、固相上に固定化した血漿組換えａｙＨＢｓＡｇ抗原を用いて間接ＥＬＩＺＡ試験により培養上清をスクリーニングした。１０５８個の培養上清を１／１０に希釈し、そのようにスクリーニングした。４０５nmのＯＤが約２、すなわち同じ波長における閾値である０．３の６倍高い値を示す、６６個の陽性クローンが選択された。１／１０に希釈した６６個の陽性クローンの培養上清を、天然の血漿ａｙＨＢｓＡｇ抗原を用いて間接ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。４０５nmのＯＤが２を超える、すなわち同じ波長における閾値である０．１の２４倍高い値を示す２０個のクローンが選択された。これら２０個のクローンの中から１２個の培養上清を１／１０に希釈し、その後、固相に固定化した天然のａｙＨＢｓＡｇ抗原および天然のａｄＨＢｓＡｇ抗原をそれぞれ用いて間接ＥＬＩＳＡ試験により試験を行った。これらの試験の各々から、１／１６００に希釈した場合の４０５nmのＯＤが天然のａｙＨＢｓＡｇ抗原による試験では１．２以上であり、そして天然のａｄＨＢｓＡｇ抗原による試験では約１．１、すなわち閾値である０．１の約１０倍高いＯＤを有する６個のクローンが選択された。これら６個の陽性クローンのうち４個を、限界希釈法により２回サブクローニングし、腹水の形態で作製した。予めPristane（商品名）を注射したマウスから腹水を得て、１０6個のハイブリドーマ細胞を注射した。
【００４６】
上記のように得られた４つのＩｇＧを、製造元（Pharmacia）から供給されたプロトコールに従って、A 4FFタンパク質と結合させたセファロースのカラムで精製し、以下の実験に用いた。最後に、イムノグロブリン類のＩｇＧ２ｂクラスに属する２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体は、優れた機能を有するため保持された。
【００４７】
実施例２：２Ｇ２Ｇ１０抗体のクラス変換
Rosen and Klein (Nature 306: 189-190 (1983))のプロトコールに従ったＵＶ処理により、２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体のクラスをＩｇＧ２ｂからＩｇＧ２ａに変換した。修飾された抗体を８Ｂ４Ｈ７と命名した。
【００４８】
実施例３：ファージに担持されたペプチドバンクのスクリーニング
Gretchら（Analytical Biochemistry 163: 270-277 (1987)）の方法に従い、New England Biolabs Inc.から市販されているPh.D.-12（登録商標）バンクを、ビオチン化２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体によりスクリーニングした。これは、Ｍ１３ファージのマイナーエンベロープタンパク質（pIII）のＮ末端で発現されるドデカペプチドのコンビナトリアルバンクである。このバンクは、４×１０12ファージ／mlを含み、１．９×１０9個の様々な配列を表す。
【００４９】
最初の「バイオパニング」の間には、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．６）中の１０μgのストレプトアビジンを一晩、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながら直径３５mmのペトリ皿に固定化した。その後、ペトリ皿を、飽和溶液［０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．６）中の５mg／ml ＢＳＡ；０．０２％ ＮａＮ3］により２時間、４℃で飽和させた。ＴＢＳ（トリス緩衝食塩液）［０．５Ｍ トリス；０．７５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５］−０．１％Ｔｗｅｅｎ中で６回洗浄した後、ビオチン化２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を、０．０２％ ＮａＮ3およびＢＳＡ１mg／mlを含むＴＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ中１７０ｎMの濃度で一晩、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながらインキュベートした。抗体により占められない部位をブロックするために、ビオチン４０μgを加え、１時間、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながらインキュベートした。ＴＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、ＴＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ−０．１ｎＭビオチン中に希釈したバンク１０μl（４×１０9ファージ）を、１時間、周囲温度で撹拌しながらインキュベートした。未固定化ファージはその後、ＴＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎで１０回洗浄して除去した。固定化されたファージは、溶出緩衝液［０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン；ｐＨ２．２；１mg／ml ＢＳＡ；０．１mg／ml フェノールレッド］で７分間インキュベートすることにより溶出した。溶出物は、１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）２００μlで中和した。
【００５０】
２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７のいずれかによるバンクのスクリーニングに対応する溶出物は、ＬＢ培地［トリプトン １０ｇ／ｌ；酵母抽出物 ５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ；ｐＨ７．５］中の大腸菌（Escherichia coli）のＥＲ２５３７株への感染により個別に増幅した。３７℃、２５０rpmで４時間３０分インキュベートした後、溶出物残渣は、２回連続の１０分間の遠心を１０，０００rpmで行うことにより除去した。上清に含まれるファージは、１／６のポリエチレングリコール／ＮａＣｌ［１６．７％ ポリエチレングリコール、３．３Ｍ ＮａＣｌ］で２回沈殿させた。１４，０００rpmで１５分間遠心した後、ペレットをＴＢＳ−０．０２％ ＮａＮ3２００μlに取った。これらの増幅溶出物の１００μlを２回目のバイオパニングに使用した。
【００５１】
２回目、３回目および４回目のバイオパニングのために、その前の回の増幅溶出物の１００μlを、それぞれ１００Ｍ、１ｎＭおよび０．１ｎＭのビオチン化２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７抗体とともに一晩、４℃でプレインキュベートし、その間に、前記のようにストレプトアビジン１０μgをペトリ皿上に固定化した。１５分間、周囲温度でペトリ皿を飽和させた後、ファージ／抗体混合物を加えた。以下のプロトコールは、１回目の「バイオパニング」のプロトコールと同様である。
【００５２】
実施例４：ファージクローンのクローニングおよび増幅
大腸菌の培養物を、光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまで、２５０rpm、３７℃でインキュベートした。細菌を増殖させる間に、上層アガロース［ＬＢ １ｌ；バクト−ペプトン１０ｇ；酵母抽出物５ｇ；ＮａＣｌ５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ１ｇ；アガロース７ｇ］を溶かして３mlずつ分注し、５５℃で保存した。細胞の準備が整ったときに、培養物２００μlを、４回目のバイオパニングの後得られ、そしてＬＢ培地で希釈した溶出物１０μlとともに、１〜５分間、周囲温度でインキュベートした。混合物は、アガロースの入った２本のチューブに移し、撹拌し、迅速にＬＢ ＩＰＴＧ／ＸＧａｌのペトリ皿上に注いだ。ペトリ皿は、一晩、３７℃でインキュベートする。
【００５３】
２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７によるスクリーニングに対応するペトリ皿から無作為に選択した３６個のコロニーは、大腸菌培養物１mlに４〜５時間、３７℃で感染させることにより増幅させ、その後、１４，０００rpmで３０秒間遠心して細胞を除去した。上清５００μlをスクリーニングに用い、その残余を再び遠心し、グリセロールで１：１に希釈し、−２０℃で保存した。
【００５４】
ＬＢ／グリセロール中に保存されたファージ２μlを、大腸菌培養物１．７mlに３７℃、２５０rpmで２４時間感染させることにより増幅させた。１４，０００rpmで５分間遠心して細胞を除去した。上清は、ＰＥＧ／ＮａＣｌにより沈殿させた。１４，０００rpmで１５分間遠心した後、ペレットをＴＢＳ５００μlに取った。２６９nmの吸収スペクトロメトリによりこれらのファージ溶液をアッセイし、ＥＬＩＳＡ試験に用いた。
【００５５】
実施例５：ファージクローン中に挿入された配列のシークエンシング
ＰＥＧ／ＮａＣｌ２００μlにより１０分間、周囲温度で沈殿させた上清５００μlから始めて、種々のクローンのＤＮＡの抽出および精製を行った。１４，０００rpmで１０分間遠心した後、ペレットをトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μl、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４Ｍ ＮａＩおよび無水エタノール２５０μlに取り、次いで１０分間、周囲温度でインキュベートした。１４，０００rpmで１０分間遠心した後、ペレットを７０％エタノール５００μlを用いて１回洗浄し、その後真空下で１０分間乾燥させる。それを最終的には３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３０μl、１ｍＭＥＤＴＡに取った。
【００５６】
挿入物のヌクレオチドシークエンシングは、「Big Dye（登録商標）ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション」（Perkin Elmer）シークエンシングキットおよびファージの野性型配列に相当する５’ＨＯ−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−ＯＨ３’プライマーを用いて自動シークエンサー（377A型、Perkin Elmer）を使用するSangerの改変方法に従って行った。反応混合物は、配列決定すべきＤＮＡ５μl、水２．５μl中の２．５pmoleのオリゴヌクレオチド、ジデスオキシリボヌクレオチドおよびＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有する「Big Dye（登録商標）」混合物ならびに水４．５μlを含んだ。２５回のシークエンシングサイクル（９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分間）は、BiometraのTrioblock ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）装置中で実施した。配列画分は、ＴＥ［１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ］緩衝液で平衡化したセファデックスＧ５０カラムにより精製し、乾燥させ、シークエンシングを行うまで−２０℃で保存した。タンパク質の配列は、Geneworksソフトウェアを用いてヌクレオチドの配列から推定した。
【００５７】
実施例６：ファージクローンの免疫学的解析
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液中１００μg／mlの最終濃度で用いる２Ｇ２Ｇ１０もしくは８Ｂ４Ｈ７抗ＨＢｓＡｇ抗体または無関係の抗体（陰性対照として使用）１００μlを、一晩、４℃で加湿チャンバー内で、ＥＬＩＳＡ「Nunc Maxisorb」ウェルプレートの各列に固定化下。次いでそのプレートを２時間、４℃で飽和溶液［０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3；ＢＳＡ ５０mg／ml；ＮａＮ3 ０．０２％］中で飽和させた。ＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ＴＢＳＴｗｅｅｎ中に希釈した種々の濃度のファージ（１×１０12、２．５×１０11、６．２×１０10および４×１０9ファージ／ml）の１００μlを各ウェルに加え、撹拌しながら２時間、周囲温度でインキュベートする。ＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合させ、飽和溶液中に１／５０００に希釈した１００μl／ウェルの抗Ｍ１３抗体を撹拌しながら２時間、周囲温度でインキュベートした。１時間、３７℃でインキュベートしたのち、プレートをＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。発色のために、プレートをフェニレンジアミンおよび過酸化水素（カラーＥＩＡキット、bioMierieux）の溶液とともに暗所で１０分間インキュベートする。１．８Ｎ硫酸により反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Axiaマイクロリーダー）を用いてプレートの４９２nmでの吸収を読む。各クローンの各希釈について、結果は、抗ＨＢｓＡｇ抗体と対照抗体の差の値により表す。次いで、その結果は、至適希釈を３回試験することにより確認した。
【００５８】
２Ｇ２Ｇ１０抗体では、免疫反応性クローンはまったく選択することができなかった。一方、同じパラトープを有するがＩｇＧ２ａクラスに属する、同等な８Ｂ４Ｈ７抗体は、免疫反応性クローンの選択を可能にした（表１）。さらに、これらのクローンのうち２個（ＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧおよびＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩ）は、２Ｇ２Ｇ１０抗体によっても認識される。
【００５９】
【表１】
【００６０】
クローンの免疫反応性は、固相に固定化した８Ｂ４Ｈ７aまたは２Ｇ２Ｇ１０bおよび８×１０10ファージ／mlcおよび２×１０10ファージ／mldの最終濃度で添加されたファージクローンを用いて、実施例６に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００６１】
実施例７：ＨＢｓＡｇ配列上の免疫反応性ファージクローン配列の位置
Mac VectorソフトウェアVer.4.5（Kodak）を使用して、ペプチドのアミノ酸配列を、モノクローナル抗体を得るために用いたＨＢｓＡｇ組換えタンパク質の配列と比較した(Galibert et al., 1979)。簡潔に述べると、高度な類似性を有する領域を最適局所同一性を検索するＬＦＡＳＴＡプログラムにより検出する（Pearson and Lipman, PNAS 85: 2444-2448 (1988)）。２Ｇ２Ｇ１０に対して免疫反応性の２個のクローンにより、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７により認識されるエピトープのＨＢｓＡｇの１９９〜２０８領域内における明らかな位置付けが可能になった（図１）。実際、ＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧは、１９９〜２０８配列と同一の４残基および類似の３残基を有し、ＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩは、２０１〜２０５配列と３個の同一残基および１個の類似の残基を有する。
【００６２】
実施例８：２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を用いた野生型ＨＢｓＡｇ抗原およびＨＢｓＡｇ変異体の検出
使用した形式は、２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を捕獲に、そしてヤギ抗ＨＢｓポリクローナル抗体を検出に使用するサンドイッチタイプの形式である。
【００６３】
患者血清中の野生型ＨＢｓＡｇ抗原の検出：
Societe Nationale de Transfusion Sanguine of Lilleから供給された、いくつかのサブタイプを含む患者血清（希釈された検体）を、２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体を捕獲に、そしてヤギ抗ＨＢｓポリクローナル抗体を検出に用いて検査した。結果を下記の表２に示す。試験をした検体を、そのサブタイプおよび由来に従って同定する。結果は、閾値に対するシグナルとして表す。閾値は、陰性検体のシグナルの５倍に相当する。シグナル／閾値の値が１を超えるものを陽性とする。
【００６４】
【表２】
【００６５】
血漿中の野生型ＨＢｓＡｇ抗原の検出：
２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を捕獲に用いて、bioMerieux serothequeからの血漿を上記と同じ条件下で試験した。結果を下記の表３に示す。結果は、シグナル／閾値の値で表す。閾値は、陰性検体のシグナルの５倍に相当する。シグナル／閾値の値が１を超えるものを陽性とする。
【００６６】
【表３】
【００６７】
ＨＢｓＡｇ変異体の検出：
２Ｇ２Ｇ１０抗体について、Carmen博士から入手しIreland et al., (Hepatology 31: 1176-1181 (2000))により以前報告された方法に従って調製した組換えＨＢｓＡｇ変異体の培養上清からのＨＢｓＡｇ変異体を検出する能力を試験した。
【００６８】
アッセイは、Vidas（登録商標）自動分析機上で行う蛍光免疫酵素定性試験法を用いて行った（Weber et al., Journal of Virological Methods 42: 63-74 (1993); Mikkelsen et al., Gynecologic Obstetric Investigation 41: 35-40 (1996)）。この２段階捕獲試験法は、以下のように実施した。
【００６９】
２Ｇ２Ｇ１０抗体を、固相容器（ＳＰＲ）上に１０μg／mlの最終濃度で固定化した。その後、ＳＰＲを種々の変異体に相当する組換えタンパク質および抗ＨＢｓＡｇビオチン化ヤギポリクローナル抗体を含む培養上清と同時にインキュベートした。次いで第２段階では、蛍光測定反応にアルカリ性ストレプトアビジン−フォスファターゼ複合体を用いた。
【００７０】
表４に示すように、別の抗ＨＢｓＡｇ抗体である６Ｈ６Ｂ６と比べて、２Ｇ２Ｇ１０抗体は、試験した種々の変異体の検出が可能であった。実際には、ＢＡ３．２およびＴ５Ｎ検体は、Irelandら(Hepatology 31: 1176-1181 (2000))の報告があるように試験した培養上清中への抗原の分泌に影響を与えるＣ１２４ＲおよびＴ２３Ｎ突然変異をそれぞれ有する。したがって、これら２つの上清において検出されなかったことは、考慮に入れることはできない。
【００７１】
【表４】
【００７２】
ＭＨＲ：主要親水性領域（major hydrophilic region）を示す。
結果は、シグナル／閾値の２回の平均で示す。各抗体について、閾値は、精製された血漿ＨＢｓＡｇサブタイプａｄ／ａｙの０．１６ng／mlで得られたシグナルの２回の平均で定義した。
a非希釈検体
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列を示す図である。
５つの型のウイルス性肝炎、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎は、現在かなりよく知られている。それぞれの場合、ウイルスは肝臓に侵入し、肝細胞の破壊を伴う炎症状態を引き起こす。
【０００２】
Ｂ型肝炎はウイルスの一種、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる。ＨＢＶウイルスは、Blumbergらにより発見された（A“new”antigen in leukemia sera, JAMA 191: 541, (1965)）。ウイルスは血液経由、性的接触または周産期ルートによって伝播する。
【０００３】
ＨＢＶは、感染しても大多数の症例において、まったく症状を発現することがなく、無症候性急性肝炎の原因となる。急性肝炎は、消化異常、腹痛、尿の異常着色および便の変色、無気力ならびに黄疸を特徴とする。急性肝炎は、肝臓の急速な壊死を伴う劇症型へと進展しうる。
【０００４】
ウイルス感染は、また、急性肝炎であった患者または感染が無症候性であった患者において、慢性型へと移行しうる。慢性キャリアは様々なサイズの肝病変を有し、肝硬変および初期癌を発症する危険性が増大している。感染の慢性化がしばしば起こるアジアやアフリカでは、肝臓の初期癌は重大な公衆の健康問題となっている。さらに、慢性キャリアはウイルスの保有宿主となり、そのウイルスを蔓延させるものであり、世界的レベルでの公衆の健康問題へと変化しつつある。
【０００５】
ＨＢＶ感染は、ヒトにおける最も一般的なウイルス感染の一種である。これは、地理的に特徴的な発生率を有する遍在的な疾患である。欧州および北米では、人口の約０．１％〜１％が感染しているが、アジアおよびアフリカでは人口の２０％までがキャリアである。全世界におけるＨＢＶ感染者の数は、約３億５千万人と推定される。
【０００６】
輸血後のウイルス感染を順に列挙すると、第一番目がＨＢＶであり、次いでＨＣＶ、ＨＩＶがこれに続く。
【０００７】
ＨＢＶは、肝親和性のＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス）である直径４２nmのＤＮＡを有する小ウイルスであり、ヘパドナウイルス科のファミリーに分類される。その遺伝子構造は、著しく小型なものである。ウイルスは、外殻およびヌクレオキャプシドからなる。殻は主として３つの表面抗原（ＨＢｓＡｇ、すなわちＢ型肝炎表面抗原）からなり、これらがＨＢＶ感染の診断において大きな役割を果たしている。ヌクレオキャプシドは、コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素およびウイルスゲノムを含有する。ウイルスの核がウイルスの感染要素を構成し、外膜はウイルスの主要な抗原決定基であるＨＢｓ抗原を担っている。ウイルスの核はヌクレオカプシド内にとどまる。ヌクレオカプシドの直径は約２８nmである。
【０００８】
サイズは小さいが（３２００塩基対）、環状で、部分的に二重鎖となっているＨＢＶのＤＮＡは、重複するＳ、Ｃ、ＰおよびＸ遺伝子から４つの型のウイルス生成物をコードしている。
【０００９】
Ｓ遺伝子は、ビリオンの外表面上に発現されるＨＢｓＡｇ殻タンパク質をコードしている。ＨＢｓＡｇ殻タンパク質は、２４kDaのポリペプチドおよびそれがグリコシル化された２８kDaのポリペプチドの２つの主要ポリペプチドで構成される。ＨＢｓＡｇは、１２４〜１４７位のアミノ酸に対応し、ＨＢＶのすべての分離株に共通する「ａ」決定基と呼ばれるＨＢＶの主要中和エピトープを含む。「ａ」決定基は、診断および予防接種において最も重用な標的である。急性または慢性感染後に抗ＨＢｓ抗体が産生されると、通常は回復し予後も好ましい。抗ＨＢｓ抗体には、ワクチン接種後には中和抗体の産生が伴う。回復期の個体の血清またはワクチン接種後の血清中に見出される抗ＨＢｓ抗体の大部分は、その「ａ」決定基の領域に結合する。ＨＢｓ抗原の三次構造は未だ決定されていないが、構造−機能研究の結果、「ａ」決定基がＨＢｓＡｇ抗原（残基９９から１６９）の主要親水性領域中に位置することが示されている。「ａ」決定基が高次構造を有することは明らかである。というのも、アルキル化または還元によりこの領域を変性させると、ＨＢｓＡｇ粒子を生じ、そのＨＢｓＡｇ粒子の抗原性が劇的に低下しているからである。おそらく、システイン間のジスルフィド架橋が適正なコンフォーメーションに関与している。「ａ」決定基（残基１２４〜１４７）は５つのシステインを含むが、「ａ」決定基の可能な構造には、第一のループを形成する１２４位と１３７位のアミノ酸の間および第二のループを形成する１３９位と１４７位のアミノ酸の間のジスルフィド架橋の存在が関与する。おそらく「ａ」決定基の配列全体が抗原構造に寄与している。さらに、ＨＢｓＡｇ抗原は、１２２位にそれぞれリシンまたはアルギニンが存在するｄまたはｙ決定基のいずれか、および１６０位にそれぞれリシンまたはアルギニンが存在するｗまたはｒ決定基を含む。したがって、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒおよびａｙｒの４つの主要なＨＢｓＡｇの抗原サブタイプがあり、それぞれが、地理的な分布に関連する。Ｓ遺伝子の上流、プレＳ遺伝子は種々のＨＢＶ表面抗原をコードする。
【００１０】
Ｐ遺伝子は、ウイルスの複製メカニズムにきわめて重要なＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素をコードする。
【００１１】
Ｃ遺伝子は、可溶性で分泌されるタンパク質であるＨＢｅＡｇおよび細胞内のコアタンパク質であるＨＢｃＡｇの２つのヌクレオカプシドタンパク質をコードする。ＨＢｅＡｇは、ウイルス複製が増大していることの血清学的マーカーである。
【００１２】
Ｘ遺伝子は、異なる生物学的効果を有し、特にウイルスおよび細胞の遺伝子の転写をトランスに活性化しうるＨＢｘＡｇをコードする。
【００１３】
ＨＢＶが個体に感染すると、ウイルスＤＮＡは、完全に宿主の肝細胞内で複製される。
【００１４】
ＨＢＶの感染後、患者の血清中で最初に検出可能なマーカーは、ＨＢｓＡｇ抗原であるが、このマーカーが、６ヶ月以上持続することは稀である。ＨＢｓ抗原が血清から消失した後、抗ＨＢｓＡｇ抗体が検出可能となり、持続する。ＨＢｃ抗原はＨＢｓ殻抗原によって隔離されているので、通常では、患者の血清中に検出することはできないが、抗ＨＢｃ抗体の存在は、ＨＢｓ抗原の出現後１〜２週間以内に容易に確認される。
【００１５】
しかし、上記のマーカーを用いる標準的な血清学的試験では、ＨＢＶの変異体の検出が可能にならないことは、現在明白である。ＨＢＶのキャリアであり、進展した慢性Ｂ型肝炎を有する患者が存在するという事実は、標準的な血清学的マーカーを用いてＨＢＶ感染を同定することができないで、最も重大な問題であり、より良い試験法の開発の必要があることを示す。
【００１６】
ＨＢＶ変異体の存在は、長年にわたり疑われていた。この仮定は、慢性肝炎の患者の血清中および／または肝臓中に、標準的な血清学的マーカー（ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｃ）が確認されなかったにもかかわらず、ウイルスＤＮＡが検出されたことに基づいている。
【００１７】
ウイルスのＤＮＡ配列のキャリアである患者においてＨＢｓＡｇが検出できないことについては、表面抗原の低発現またはＳタンパク質の抗原決定基のレベルでの突然変異の存在など、いくつかの説明が可能である。第一には、ウイルスの共感染がＨＢＶの複製を抑制しうる（Jilg W et al., Hepatol, 1995, 23: 14-20, Jylberberg et al., Clinical infection diseases, 1996, 23: 1117-1125, Ushida et al., J. of Med. Virol. 1997, 52: 399-405, Hofer et al., Eur.J. Clin; Microbiol. Infect. Dis., 1998, 17: 6-13）。別の説明は、インビボにおける抗ＨＢｓ抗体との免疫複合体形成の間にＨＢｓ抗原がマスクされたということであろう。
【００１８】
しかし、さらに最近になって、ＨＢｓＡｇの存在が、患者の抗ＨＢｓ血清中に観察されるようになってきた。これらの患者におけるＨＢｓＡｇ抗原の存在は、その抗原が存在する抗ＨＢｓによって中和されていないという事実と関連しており、変異体の存在を示唆している。
【００１９】
変異体または突然変異体の存在は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いるワクチン接種および治療に関連してきている。突然変異体の分析は、突然変異体が混合したポピュレーションから選択されてきたものであり、「ａ」決定基中のアミノ酸置換を起こす点突然変異を有することを示しているようである。突然変異体は、遺伝子型のプールとなる、遺伝子中の任意の突然変異の産物であるらしい。さらに、免疫反応は、突然変体の選択における主な因子であると考えられる。一般に、インビトロでウイルス感染した細胞にモノクローナル抗体を添加すると、その抗体によって中和されない分離株が選択される。したがって、ウイルス複製が活性である患者に与えられたモノクローナル抗体が、エスケープ突然変異体（escape mutant）を選択することになっても驚くにはあたらない。臨床的に重要な数種のエスケープ突然変異体の分離株が、ワクチン接種を受けた個体中に見出されている。いくつかの場合では、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基内の１４５位のアミノ酸をコードするコドンのレベルで点突然変異を有し、グリシンがアルギニンに変化している。そのような突然変異体を含有する血清のチンパンジーへの投与は、これらの因子が伝播性であることを示している。「ａ」決定基の１４１位のリシンのグルタミン酸での置換を誘導する別の点突然変異も、ワクチン接種した患者において見出されている。したがって、野生型ＨＢＶのみならず突然変異体または変異体も、確実な方法で、検出可能とすることが重要である。実際、ＨＢｓＡｇエピトープのレベルで重要な突然変異が起こり、抗ＨＢｓ抗体がそれを認識しない場合には、その突然変異体が検出されないか、その試験が十分な感度を有するものではないということになる。現在、エスケープ突然変異体が検出されていないという事実は、そのキャリアに影響を与えるのみならず、血液、血液製剤および臓器の提供による感染の伝播にもつながりうる。さらに、突然変異体ＨＢｓＡｇは、個体が以前に免疫化されており、抗ＨＢｓタイプの応答を有していたとしても、その個体に感染しうる。国際公開公報第94/26904号には、１２２位での突然変異を含むエスケープ突然変異体からＨＢｓＡｇの野生型を区別することが可能なモノクローナル抗体が記載されている。しかし、確実な診断試験を開発するために、ＨＢｓＡｇの野生型および突然変異体型の両方を検出しうるモノクローナル抗体の特徴付けを求める深刻な必要性がある（Coleman et al. (1999), Journal of Medical Virology 59: 19-24; Ireland et al. (2000), Hepatology 31; 1176-1181）。実際、あるケースでは、「ａ」決定基をコードする殻遺伝子の領域に影響を及ぼすＨＢＶ変異体が、市販の診断試験で使用されるモノクローナル抗体では認識されない（Carman et al. (1990), Lancet 336: 325-329; Seddigh-Tonckaboni et al. (2000), Journal of Medical Virology 60: 113-121; Weinberger et al. (2000), Journal of General Virology 81: 1165-1174）。
【００２０】
したがって、本発明の主題は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび有利には３つ以上の突然変異体型ＨＢｓＡｇ抗原に結合可能なモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域中の少なくとも６個の連続するアミノ酸からなるペプチド配列に結合し、有利にはＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域により構成されるペプチド配列に結合する。
【００２１】
さらに、本発明の主題は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、および少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つおよび有利には３つ以上の突然変異体型ＨＢｓＡｇ抗原に特異的に結合可能なモノクローナル抗体であり、このモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域に特異的に結合する。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体が野生型および突然変異型ＨＢｓＡｇ抗原に特異的に結合する能力は、以下の事実に関係する。すなわち、本発明の発明者がエピトープ「マッピング」によって初めて明らかにしたように、本発明のモノクローナル抗体の能力は、ＨＢＶの野生型およびＨＢｓＡｇ抗原の１９９位と２０８位のアミノ酸の間に位置する領域またはエピトープに相当する突然変異型の両方において、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基のレベルまたは「ａ」決定基の近接部分で起こりうる他の突然変異またはアミノ酸置換の有無とは無関係に、表面抗原の高度に保存された領域を認識するとの事実につながる。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む少なくとも１つのＨＢｓＡｇ抗原の突然変異型、および具体的にはＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位での少なくとも１個のアミノ酸置換、および場合によりＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位での少なくとも１個の他のアミノ酸置換を有するＨＢｓＡｇ抗原の突然変異型を認識し、特異的に結合することが可能である。明らかにされた突然変異または置換は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列に関して位置付けられる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体によって特異的に認識される突然変異型は、以下の実施例において確認される。より具体的には、以下の突然変異体がある：
−１０４３Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−ＡＰ３．１：ＨＢｓＡｇ抗原の１４４位のアスパラギン酸がアラニンによって置換されている
−Ａｒｇ１．２：ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位のグリシンがアルギニンによって置換されている
−１１５７Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１２７位のプロリンがアラニンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−１０５６Ｓｐ：ＨＢｓＡｇ抗原の１２０位のプロリンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されている
−Ｍ５：ＨＢｓＡｇ抗原の１００位のチロシンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１１８位のトレオニンがバリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１２２位のアルギニンがリシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１３３位のメチオニンがイソロイシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１３４位のチロシンがアスパラギンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４２位のプロリンがセリンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位のセリンがロイシンで置換されており、ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位のグリシンがリシンで置換されている。
【００２４】
上記の突然変異体は、モノクローナル抗体のスクリーニングに使用することができる。本発明の抗体を、たとえば、野生型ＨＢｓＡｇ抗原および１つ以上の上記のような突然変異体でスクリーニングすることができる。具体的には、本発明の抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位の少なくとも１つで、さらに具体的にはＨＢｓＡｇ抗原の１４３、１４４および１４５位の少なくとも１つで１個以上の置換を、および場合によりＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位の少なくとも１つで少なくとも１個の他の置換をそれぞれが有する１つ以上のＨＢｓＡｇ突然変異体でスクリーニングすることができる。
【００２５】
具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、野生型ＨＢｓＡｇ抗原、およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位のアミノ酸をコードする１つ以上のコドンのレベルで点突然変異を有する配列によってコードされる「ａ」決定基を保持する少なくとも１つのＨＢｓＡｇ突然変異体に結合することができる。本発明の好ましい抗体は、イムノグロブリンのクラスＧに属する、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７と呼ばれる抗体である。２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ｂイムノグロブリンクラスに属する。８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ａクラスに属し、２Ｇ２Ｇ１０抗体をＵＶ処理することによって得られた。
【００２６】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体、具体的にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）2およびｓＦｖフラグメント（Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833およびBird et al., 1988, Science 242: 423-426）およびそのコンジュゲートをも含む。本発明のモノクローナル抗体誘導体は特にヒト化抗体を含む。モノクローナル抗体のフラグメント、およびヒト化誘導体を含むモノクローナル抗体の誘導体の製造方法は、当業者には周知である。非ヒト、例えばネズミの「ヒト化」型抗体は、非ヒトイムノグロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどのヒト化抗体は、レセプターの超可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの所望の特異性、親和性および容量を有する非ヒトドナー種（ドナー抗体）の超可変領域の残基によって置き換えられているヒトイムノグロブリン（レセプター抗体）である。ある種の場合には、ヒトイムノグロブリンのＦｖ領域の（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の機能を改善するために実施される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび好ましくは２つの可変ドメインを含み、その中では、すべてまたはほとんどすべての超可変ループは非ヒトイムノグロブリンに相当し、すべてのまたはほとんどすべてのＦＲ領域はヒトイムノグロブリンのものである。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒトイムノグロブリンなどのイムノグロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分をも含みうる（Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); およびPresta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)）。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体、具体的には、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７抗体は、下記の実施例１に記載のプロトコール、または実施例１に記載のプロトコールに由来するプロトコールに従いハイブリドーマ系により産生される。さらに、哺乳動物、好ましくはネズミ動物を、野生型ＨＢｓＡｇ抗原または場合によりフラグメントまたは適当な抗原誘導体の形態のＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型で免疫化し、ハイブリドーマを形成させるために抗体産生細胞を不死化させ、野生化ＨＢｓＡｇ抗原および場合によりフラグメントまたは適当な抗原誘導体の形態の少なくとも１つの上記突然変異体型でハイブリドーマ培養物をスクリーニングし、さらに野生型ＨＢｓＡｇおよび少なくとも１つの上記突然変異体型に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによってハイブリドーマ系を作製することからなる、本発明のモノクローナル抗体の製造方法も本発明の主題である。
【００２８】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ、上記方法に従ってインビボまたはインビトロで得られやすいハイブリドーマを培養することおよび培養培地からモノクローナル抗体を回収することからなる本発明のモノクローナル抗体の製造方法、ならびにこのハイブリドーマ培養方法によって得られそうなモノクローナル抗体をも含む。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ抗原を含有すると思われる検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出および／または定量のための、したがって（野生型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスの検出のためのイムノアッセイにおける使用が可能である。このようなアッセイは、臨床診断においておよび血液製剤のスクリーニングにおいて使用可能である。さらに、本発明は、検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出および／または定量方法にも関し、その方法は、本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはそのようなモノクローナル抗体のフラグメントもしくは誘導体に検体を接触させること、および少なくとも１つの抗原／抗体、フラグメントまたは誘導体の複合体の存在を確認することからなる。
【００３０】
本発明の方法の一実施態様においては、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体、および本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体により認識されるものとは異なる領域またはエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体から選ばれる少なくとも１つの他の抗体と検体を接触させる。
【００３１】
このような方法は、当業者に周知の「サンドイッチ」法または「競合」法に従って一または二段階で、均質または不均質相で実施される。さらに、本発明の方法は、同じアッセイにおいて、分析されるべき検体中の抗ＨＢｃ抗体の検出と関連付けることも可能である。
【００３２】
対応する診断組成物は、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体を、場合により、抗ＨＢｃ抗体の検出のための少なくとも１つの試薬との組み合わせで含み、さらに本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体によって認識されるものとは異なる領域またはエピトープを認識する、ＨＢｓＡｇ抗原検出用の少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含みうる。本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体は、ＨＢｓＡｇ抗原捕獲抗体として固相上に固定化することが可能であり、または、あらゆる適当なマーカーで標識した場合には検出に使用することが可能である。また、本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体をＨＢｓＡｇ抗原捕獲相として使用し、本発明の抗体により認識されるものとは異なるエピトープに対する少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を検出コンジュゲートとして使用すること、またはその逆の使用も考えられる。同様に、本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体、および本発明の抗体により認識されるエピトープとは異なるエピトープに対する少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を同じ固相に固定化することが可能である。さらに、検体中の抗ＨＢｃ抗体を捕獲しうる試薬は、この同じ固相上、あるいは本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体、および場合により本発明の抗体により認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識する少なくとも１つの他の抗ＨＢｓＡｇモノクローナルまたはポリクローナル抗体が固定化されている固相とは異なる固相上に固定化し、本発明の組成物に含ませることが可能である。
【００３３】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはそのような抗体のフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせを含む、ＨＢＶに対する受動免疫のための治療または予防的使用に適した抗血清にも関する。その抗血清は、さらに、本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体以外の、少なくとも１つのモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または抗ＨＢｓＡｇモノクローナルおよびポリクローナル抗体の混合物を含みうる。
【００３４】
ＨＢＶに対する受動免疫のための治療または予防的使用のための適当な組成物は、薬学的に許容されうるビークルとの混合物の中に、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせを含む。
【００３５】
「薬学的に許容されうるビークル」とは、例えばRemingtonのPharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co.に記載されるようなヒトまたは動物に投与しうる支持体およびビークルを意味する。
【００３６】
本発明はしたがって、本発明のモノクローナル抗体、そのフラグメントもしくは誘導体またはその組合わせの治療的または予防的に効果的な量を個体に投与することからなる、治療または予防目的のＨＢＶに対する受動免疫方法をさらに含む。本発明のモノクローナル抗体、フラグメントまたは誘導体により認識されるエピトープとは異なるエピトープに対する１つ以上の他の抗ＨＢｓＡｇモノクローナルまたはポリクローナル抗体も投与しうる。
【００３７】
本発明は、上記に定義した本発明の抗体に対する抗イディオタイプまたは抗イディオタイプ抗体をも含む。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体に対して産生され、別の抗体の特異的抗原結合部位またはイディオタイプと反応する抗体である。抗イディオタイプ抗体は、イディオタイプにより認識される抗原として機能する。このような抗体は、コンフォーメーション依存エピトープの場合には特に有用である。ウイルスなどの外部病原体の内部イメージを表す抗イディオタイプ抗体は、ワクチン接種用の抗原の「代替物」として使用される。インビボにおける抗イディオタイプ抗体の重要性は、多数の実験において明らかにされている。インビボにおける抗イディオタイプ抗体の投与は、特異的イディオタイプに対する応答の抑制または増強という効果をもたらす。本発明の抗イディオタイプ抗体は、ＨＢｓＡｇの１９９〜２０８エピトープを認識する抗−抗イディオタイプ抗体を産生することにより動物における応答を誘導し、それにより動物をＨＢＶに対して免疫化し、さらにはＨＢＶ感染を中和することさえできる。したがって、本発明の主題は、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域を認識する抗−抗イディオタイプ抗体の産生を動物において誘導する抗イディオタイプモノクローナル抗体または前記抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントまたはその混合物を、動物のＨＢＶへの免疫化に十分な量で含む活性組成物、および例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムといった薬学的に許容されうるアジュバントを含むワクチン組成物である。薬学的に許容されうるアジュバントは当業者に周知であり、参考としてRemingtonのPharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co.に記載のアジュバントを挙げることができる。所望ならば、ワクチンは湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助的物質を含有しうる。動物をＨＢＶに対して免疫化する方法は、上記に定義されたワクチン組成物を１回以上の投与において投与することからなる。無論、動物に対するインビボ試験の後には、ＨＢＶに対するワクチン接種の最終目的は、ヒトにおける感染予防である。したがって、上記に使用された「動物」という語は、動物およびヒトの両方を意味する。ワクチンは、適当な希釈剤（特に、リン酸緩衝液でありうる）の中に、タンパク質が１mg／mlのオーダーの最終濃度になるように、本発明の抗イディオタイプ抗体またはそのFabフラグメントを混合することにより製造する。通常のサイズのヒトに対しては、例えばその溶液の５０μl（５０μg）〜１００μl（１００μg）を４５００μl中に希釈し、５００μlの薬学的に許容されうるアジュバントと混合する（ｐＨ６．０±０．１）。用量は、動物、その年齢および体重により変わる。
【００３８】
本発明のイディオタイプモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法で製造される。ＨＢｓＡｇの１９９〜２０８エピトープまたは領域を得て、現在利用可能なあらゆる技術により精製する。イディオタイプ抗体（Ａｂ１）は、動物、好ましくはネズミ、具体的にはマウスを、抗原として上記エピトープで免疫化することにより製造する。次いで、動物の脾臓細胞を確認し、単離し、ポリエチレングリコールなどの融合剤の存在下でリンフォーマまたはミエローマ細胞と融合させる（Kohler and Milstein, Nature 256: 459 (1975)）。次に、融合させた細胞を、非融合悪性細胞の増殖を阻害する選択培地中でインキュベートする。ハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングし、求める特異性を有するモノクローナル抗体の分泌を試験する。モノクローナル抗体は、腹水での増殖によりインビボでも得られる。イディオタイプ抗体Ａｂ１は、ＨＢＶに対し免疫化し、中和さえする性質を有する抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を産生させるために使用される。抗イディオタイプ抗体Ａｂ２は、抗体Ａｂ１の製造に用いた方法と同じ方法で得られるが、このときは抗体Ａｂ１が使用される免疫原となる。
【００３９】
本発明の主題はさらに、本発明者が同定した配列番号１の配列中に示すＨＢｓＡｇ抗原の１９９位のアミノ酸から始まり２０８位のアミノ酸で終了するペプチド配列のＨＢｓＡｇ抗原の保存されたエピトープおよびその免疫原性ペプチドとしての使用であり、さらには、ペプチド配列が、配列番号１に示すエピトープのアミノ酸と相同または同一の少なくとも３個および少なくとも４個のアミノ酸をそれぞれ含むことで特徴付けられる免疫原性ペプチド、具体的には配列番号２および配列番号３に示す免疫原性ペプチドでもある。添付の図に示した配列番号１と配列番号２の配列を比較したところ、配列番号２の配列は、配列番号１の対応アミノ酸と厳密に相同あるいは同一である、Ｗ（トリプトファン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）の３個のアミノ酸および配列番号１のＬ（ロイシン）に等価（equivalent）なＩ（イソロイシン）を含む。添付の図に示した配列番号１と配列番号３の配列を比較したところ、配列番号３の配列は、配列番号１の対応アミノ酸と厳密に相同あるいは同一である、Ｗ(トリプトファン)、Ｐ（プロリン）、Ｙ（チロシン）、Ｓ（セリン）の４個のアミノ酸および配列番号１のＳ（セリン）およびＩ（イソロイシン）にそれぞれ等価なＴ（トレオニン）およびＬ（ロイシン）の２個のアミノ酸を含む。前記の等価なアミノ酸とは、ペプチドの免疫原性としての効率に影響を及ぼすことなく相互に置換しうるアミノ酸である。このような免疫原性ペプチドは、上記の定義に対応し、ＨＢｓＡｇ抗原の野性型および少なくとも１つの突然変異体型の両者を認識可能なモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメントまたはモノクローナル抗体の誘導体の製造に使用することができる。モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントもしくは誘導体の製造は当業者には周知である。例として、Kohler and Milstein, Nature 256: 45-47 (1975)、European Journal of Immunology 6: 511-519 (1976)、およびGalfre G. et al. Nature, 266: 522-550 (1977)が挙げられる。エピトープは、化学的合成、遺伝子組換えまたは異なる方法の組み合わせにより製造しうる。本発明のエピトープをコードする配列はしたがって、適当な宿主細胞内で適当なプロモーターの制御下で発現させることができる。宿主細胞には、哺乳類細胞、酵母および細菌を含む原核または真核生物に由来する細胞などの、組換えＤＮＡ分子を転写および翻訳することが可能で、かつ発現に必要な因子の制御下に置かれた、本発明のエピトープをコードするＳ遺伝子のフラグメントを発現させることができるあらゆる単細胞生物が含まれる。さらに、配列番号２および配列番号３の免疫原性ペプチドは、化学的合成により容易に得ることができる。
【００４０】
最後に本発明は、特定のストリンジェントな条件下で、配列番号１に示すエピトープをコードするＤＮＡヌクレオチド配列、配列番号１に示すエピトープをコードする前記ヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡヌクレオチド配列または前記ＤＮＡヌクレオチド配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる核酸プローブまたはプライマーに関する。
【００４１】
本発明は、特定のストリンジェントな条件下で、配列番号１に示すエピトープをコードする配列番号４に示すＤＮＡヌクレオチド配列、配列番号４の相補的ＤＮＡヌクレオチド配列または前記ヌクレオチドＤＮＡ配列のＲＮＡ転写産物にハイブリダイズしうる核酸プライマーまたはプローブ；生物学的検体中の（野性型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスの検出および／または定量のための、上記定義の少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーを含む診断組成物；ならびに生物学的検体中の（野性型および／または突然変異体）ＨＢＶウイルスのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ診断の方法にも関する。この方法によれば、血清、血漿または組織検体などの生物学的検体を、少なくとも１つのＨＢＶウイルスによる感染が疑われる患者から採取し、必要ならば上記検体を、検体からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出するために処理し、上記検体を特定のストリンジェントな条件下で少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーと接触させ、上記ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡと少なくとも１個のプローブとのハイブリダイゼーションまたは上記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅を確認することにより検体中のウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを検出および／または定量する。核酸プローブを使用する場合には、ハイブリダイゼーション複合体の形成の確認は、標的配列に相補的またはほぼ相補的で、あらゆる適当なマーカーによって標識したプローブを使用することにより直接行うことが可能であり、または標的配列の一部に相補的またはほぼ相補的な捕獲プローブおよび適当なマーカーで標識したプローブまたは標的配列の別の部分に相補的またはほぼ相補的な検出プローブを使用することからなる、１または２段階の「サンドイッチ」法の実施によっても行うことが可能である。プライマーを使用する場合には、プライマーを、標識増幅産物の同定のために、直接標識することも可能であり、または標識しないことも可能であり、後者の場合には、生成した増幅産物は、アクリルアミドゲルを通過させることにより予測した大きさとの関係で選択したり、または適当な検出プローブを用いて分析しうる。
【００４２】
Galibertら（Nature 280: 646-650 (1979)）によるＨＢＶゲノムの７５１〜７８０位のヌクレオチドに相当する、配列番号４に示す本発明の１９９〜２０８エピトープをコードするＤＮＡヌクレオチド配列の選択、それに相補的な配列および対応するＲＮＡ配列を選択することに始まり、配列番号４、それに相補的な配列または対応するＲＮＡにハイブリダイズ可能なヌクレオチドプローブまたはプライマーを決定し、それを得ることは当業者の能力の範囲内である。オリゴヌクレオチドの製造の例として、制限酵素の使用および自動合成装置を用いる化学合成が挙げられる。特定のストリンジェント条件下で本発明のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なプローブおよびプライマーは、この定義の一部を形成する。適当なストリンジェント条件を定義することも当業者の能力の範囲内である。特徴的なストリンジェント条件は、試験されたハイブリッドのＴｍ（「融解温度」）以下の約１２℃と２０℃との間から選択される温度と食塩液濃度の組合わせに対応するものである。これらはすべて当業者の一般的知識の一部をなすものであり、説明のために「DNA PROBES」(George H. Keller and Mark M. Manak著、 2nd Ed. (1993) Stockton Press, 49 West 24th St., New York, N.Y. 10010, USA（さらに具体的には、１〜２１ページの第１節“Molecular Hybridization Technology”を参照）)と題する書籍を挙げることができる。
【００４３】
図１
添付の図１は、ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列を示す。この図では、１９９〜２０８エピトープは、下記の実施例に説明するようにエピトープ「マッピング」により位置付けられ、確認されている。ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列の１９４〜２０９のアミノ酸からなる領域中の野性型ＨＢｓＡｇ抗原の配列のアミノ酸と共通または相同もしくは同一のアミノ酸、および等価なアミノ酸を有する２つのクローンＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧおよびＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩを、野性型ＨＢｓＡｇ抗原の配列の下に示す。共通または相同もしくは同一および等価なアミノ酸は図１において太字で示す。
【００４４】
実施例
実施例１：モノクローナル抗体の作製および特徴付け
４〜６週齢の雌BALB/c JYcoマウス（IFFA Credo）を、等容量のフロイント完全アジュバントで乳化させた組換えＨＢｓＡｇ ａｙ５０μgを腹腔内投与により免疫化した。組換えＨＢｓＡｇ ａｙタンパク質は、Pasteur Merieux Connaughtから入手した。このタンパク質は、Galibertら（Nature 280: 646-650 (1979)）により配列決定されたａｙｗ系統に相当し、ＣＨＯ細胞で発現している（Michel et al., PNAS 81/7708-7712 (1984)）。このタンパク質は、プレＳおよびＳ領域から構成される。ＮＨ2末端位に位置する５５アミノ酸がプレＳ２領域に相当する。
【００４５】
３回の注射を、２週ごとに、不完全アジュバントの存在下で行った。最後の注射から４日後に、脾臓細胞を取り出し、Kohler and Milstein (Nature 256: 45-47 (1975); European Journal of Immunology 6: 511-519 (1976))の方法に従って、Sp 2/0-Ag14マウスのミエローマ細胞系と融合させた。細胞を１２〜１４日間培養した後、固相上に固定化した血漿組換えａｙＨＢｓＡｇ抗原を用いて間接ＥＬＩＺＡ試験により培養上清をスクリーニングした。１０５８個の培養上清を１／１０に希釈し、そのようにスクリーニングした。４０５nmのＯＤが約２、すなわち同じ波長における閾値である０．３の６倍高い値を示す、６６個の陽性クローンが選択された。１／１０に希釈した６６個の陽性クローンの培養上清を、天然の血漿ａｙＨＢｓＡｇ抗原を用いて間接ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。４０５nmのＯＤが２を超える、すなわち同じ波長における閾値である０．１の２４倍高い値を示す２０個のクローンが選択された。これら２０個のクローンの中から１２個の培養上清を１／１０に希釈し、その後、固相に固定化した天然のａｙＨＢｓＡｇ抗原および天然のａｄＨＢｓＡｇ抗原をそれぞれ用いて間接ＥＬＩＳＡ試験により試験を行った。これらの試験の各々から、１／１６００に希釈した場合の４０５nmのＯＤが天然のａｙＨＢｓＡｇ抗原による試験では１．２以上であり、そして天然のａｄＨＢｓＡｇ抗原による試験では約１．１、すなわち閾値である０．１の約１０倍高いＯＤを有する６個のクローンが選択された。これら６個の陽性クローンのうち４個を、限界希釈法により２回サブクローニングし、腹水の形態で作製した。予めPristane（商品名）を注射したマウスから腹水を得て、１０6個のハイブリドーマ細胞を注射した。
【００４６】
上記のように得られた４つのＩｇＧを、製造元（Pharmacia）から供給されたプロトコールに従って、A 4FFタンパク質と結合させたセファロースのカラムで精製し、以下の実験に用いた。最後に、イムノグロブリン類のＩｇＧ２ｂクラスに属する２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体は、優れた機能を有するため保持された。
【００４７】
実施例２：２Ｇ２Ｇ１０抗体のクラス変換
Rosen and Klein (Nature 306: 189-190 (1983))のプロトコールに従ったＵＶ処理により、２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体のクラスをＩｇＧ２ｂからＩｇＧ２ａに変換した。修飾された抗体を８Ｂ４Ｈ７と命名した。
【００４８】
実施例３：ファージに担持されたペプチドバンクのスクリーニング
Gretchら（Analytical Biochemistry 163: 270-277 (1987)）の方法に従い、New England Biolabs Inc.から市販されているPh.D.-12（登録商標）バンクを、ビオチン化２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体によりスクリーニングした。これは、Ｍ１３ファージのマイナーエンベロープタンパク質（pIII）のＮ末端で発現されるドデカペプチドのコンビナトリアルバンクである。このバンクは、４×１０12ファージ／mlを含み、１．９×１０9個の様々な配列を表す。
【００４９】
最初の「バイオパニング」の間には、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．６）中の１０μgのストレプトアビジンを一晩、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながら直径３５mmのペトリ皿に固定化した。その後、ペトリ皿を、飽和溶液［０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．６）中の５mg／ml ＢＳＡ；０．０２％ ＮａＮ3］により２時間、４℃で飽和させた。ＴＢＳ（トリス緩衝食塩液）［０．５Ｍ トリス；０．７５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５］−０．１％Ｔｗｅｅｎ中で６回洗浄した後、ビオチン化２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を、０．０２％ ＮａＮ3およびＢＳＡ１mg／mlを含むＴＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ中１７０ｎMの濃度で一晩、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながらインキュベートした。抗体により占められない部位をブロックするために、ビオチン４０μgを加え、１時間、４℃で加湿チャンバー内で撹拌しながらインキュベートした。ＴＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、ＴＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ−０．１ｎＭビオチン中に希釈したバンク１０μl（４×１０9ファージ）を、１時間、周囲温度で撹拌しながらインキュベートした。未固定化ファージはその後、ＴＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎで１０回洗浄して除去した。固定化されたファージは、溶出緩衝液［０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン；ｐＨ２．２；１mg／ml ＢＳＡ；０．１mg／ml フェノールレッド］で７分間インキュベートすることにより溶出した。溶出物は、１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）２００μlで中和した。
【００５０】
２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７のいずれかによるバンクのスクリーニングに対応する溶出物は、ＬＢ培地［トリプトン １０ｇ／ｌ；酵母抽出物 ５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ；ｐＨ７．５］中の大腸菌（Escherichia coli）のＥＲ２５３７株への感染により個別に増幅した。３７℃、２５０rpmで４時間３０分インキュベートした後、溶出物残渣は、２回連続の１０分間の遠心を１０，０００rpmで行うことにより除去した。上清に含まれるファージは、１／６のポリエチレングリコール／ＮａＣｌ［１６．７％ ポリエチレングリコール、３．３Ｍ ＮａＣｌ］で２回沈殿させた。１４，０００rpmで１５分間遠心した後、ペレットをＴＢＳ−０．０２％ ＮａＮ3２００μlに取った。これらの増幅溶出物の１００μlを２回目のバイオパニングに使用した。
【００５１】
２回目、３回目および４回目のバイオパニングのために、その前の回の増幅溶出物の１００μlを、それぞれ１００Ｍ、１ｎＭおよび０．１ｎＭのビオチン化２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７抗体とともに一晩、４℃でプレインキュベートし、その間に、前記のようにストレプトアビジン１０μgをペトリ皿上に固定化した。１５分間、周囲温度でペトリ皿を飽和させた後、ファージ／抗体混合物を加えた。以下のプロトコールは、１回目の「バイオパニング」のプロトコールと同様である。
【００５２】
実施例４：ファージクローンのクローニングおよび増幅
大腸菌の培養物を、光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまで、２５０rpm、３７℃でインキュベートした。細菌を増殖させる間に、上層アガロース［ＬＢ １ｌ；バクト−ペプトン１０ｇ；酵母抽出物５ｇ；ＮａＣｌ５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ１ｇ；アガロース７ｇ］を溶かして３mlずつ分注し、５５℃で保存した。細胞の準備が整ったときに、培養物２００μlを、４回目のバイオパニングの後得られ、そしてＬＢ培地で希釈した溶出物１０μlとともに、１〜５分間、周囲温度でインキュベートした。混合物は、アガロースの入った２本のチューブに移し、撹拌し、迅速にＬＢ ＩＰＴＧ／ＸＧａｌのペトリ皿上に注いだ。ペトリ皿は、一晩、３７℃でインキュベートする。
【００５３】
２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７によるスクリーニングに対応するペトリ皿から無作為に選択した３６個のコロニーは、大腸菌培養物１mlに４〜５時間、３７℃で感染させることにより増幅させ、その後、１４，０００rpmで３０秒間遠心して細胞を除去した。上清５００μlをスクリーニングに用い、その残余を再び遠心し、グリセロールで１：１に希釈し、−２０℃で保存した。
【００５４】
ＬＢ／グリセロール中に保存されたファージ２μlを、大腸菌培養物１．７mlに３７℃、２５０rpmで２４時間感染させることにより増幅させた。１４，０００rpmで５分間遠心して細胞を除去した。上清は、ＰＥＧ／ＮａＣｌにより沈殿させた。１４，０００rpmで１５分間遠心した後、ペレットをＴＢＳ５００μlに取った。２６９nmの吸収スペクトロメトリによりこれらのファージ溶液をアッセイし、ＥＬＩＳＡ試験に用いた。
【００５５】
実施例５：ファージクローン中に挿入された配列のシークエンシング
ＰＥＧ／ＮａＣｌ２００μlにより１０分間、周囲温度で沈殿させた上清５００μlから始めて、種々のクローンのＤＮＡの抽出および精製を行った。１４，０００rpmで１０分間遠心した後、ペレットをトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μl、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４Ｍ ＮａＩおよび無水エタノール２５０μlに取り、次いで１０分間、周囲温度でインキュベートした。１４，０００rpmで１０分間遠心した後、ペレットを７０％エタノール５００μlを用いて１回洗浄し、その後真空下で１０分間乾燥させる。それを最終的には３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）３０μl、１ｍＭＥＤＴＡに取った。
【００５６】
挿入物のヌクレオチドシークエンシングは、「Big Dye（登録商標）ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション」（Perkin Elmer）シークエンシングキットおよびファージの野性型配列に相当する５’ＨＯ−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−ＯＨ３’プライマーを用いて自動シークエンサー（377A型、Perkin Elmer）を使用するSangerの改変方法に従って行った。反応混合物は、配列決定すべきＤＮＡ５μl、水２．５μl中の２．５pmoleのオリゴヌクレオチド、ジデスオキシリボヌクレオチドおよびＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有する「Big Dye（登録商標）」混合物ならびに水４．５μlを含んだ。２５回のシークエンシングサイクル（９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分間）は、BiometraのTrioblock ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）装置中で実施した。配列画分は、ＴＥ［１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ］緩衝液で平衡化したセファデックスＧ５０カラムにより精製し、乾燥させ、シークエンシングを行うまで−２０℃で保存した。タンパク質の配列は、Geneworksソフトウェアを用いてヌクレオチドの配列から推定した。
【００５７】
実施例６：ファージクローンの免疫学的解析
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液中１００μg／mlの最終濃度で用いる２Ｇ２Ｇ１０もしくは８Ｂ４Ｈ７抗ＨＢｓＡｇ抗体または無関係の抗体（陰性対照として使用）１００μlを、一晩、４℃で加湿チャンバー内で、ＥＬＩＳＡ「Nunc Maxisorb」ウェルプレートの各列に固定化下。次いでそのプレートを２時間、４℃で飽和溶液［０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3；ＢＳＡ ５０mg／ml；ＮａＮ3 ０．０２％］中で飽和させた。ＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ＴＢＳＴｗｅｅｎ中に希釈した種々の濃度のファージ（１×１０12、２．５×１０11、６．２×１０10および４×１０9ファージ／ml）の１００μlを各ウェルに加え、撹拌しながら２時間、周囲温度でインキュベートする。ＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合させ、飽和溶液中に１／５０００に希釈した１００μl／ウェルの抗Ｍ１３抗体を撹拌しながら２時間、周囲温度でインキュベートした。１時間、３７℃でインキュベートしたのち、プレートをＴＢＳ−０．５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。発色のために、プレートをフェニレンジアミンおよび過酸化水素（カラーＥＩＡキット、bioMierieux）の溶液とともに暗所で１０分間インキュベートする。１．８Ｎ硫酸により反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Axiaマイクロリーダー）を用いてプレートの４９２nmでの吸収を読む。各クローンの各希釈について、結果は、抗ＨＢｓＡｇ抗体と対照抗体の差の値により表す。次いで、その結果は、至適希釈を３回試験することにより確認した。
【００５８】
２Ｇ２Ｇ１０抗体では、免疫反応性クローンはまったく選択することができなかった。一方、同じパラトープを有するがＩｇＧ２ａクラスに属する、同等な８Ｂ４Ｈ７抗体は、免疫反応性クローンの選択を可能にした（表１）。さらに、これらのクローンのうち２個（ＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧおよびＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩ）は、２Ｇ２Ｇ１０抗体によっても認識される。
【００５９】
【表１】
クローンの免疫反応性は、固相に固定化した８Ｂ４Ｈ７aまたは２Ｇ２Ｇ１０bおよび８×１０10ファージ／mlcおよび２×１０10ファージ／mldの最終濃度で添加されたファージクローンを用いて、実施例６に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００６１】
実施例７：ＨＢｓＡｇ配列上の免疫反応性ファージクローン配列の位置
Mac VectorソフトウェアVer.4.5（Kodak）を使用して、ペプチドのアミノ酸配列を、モノクローナル抗体を得るために用いたＨＢｓＡｇ組換えタンパク質の配列と比較した(Galibert et al., 1979)。簡潔に述べると、高度な類似性を有する領域を最適局所同一性を検索するＬＦＡＳＴＡプログラムにより検出する（Pearson and Lipman, PNAS 85: 2444-2448 (1988)）。２Ｇ２Ｇ１０に対して免疫反応性の２個のクローンにより、２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７により認識されるエピトープのＨＢｓＡｇの１９９〜２０８領域内における明らかな位置付けが可能になった（図１）。実際、ＨＷＷＫＨＰＴＲＹＳＬＧは、１９９〜２０８配列と同一の４残基および類似の３残基を有し、ＨＰＬＫＱＹＷＷＲＰＳＩは、２０１〜２０５配列と３個の同一残基および１個の類似の残基を有する。
【００６２】
実施例８：２Ｇ２Ｇ１０および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を用いた野生型ＨＢｓＡｇ抗原およびＨＢｓＡｇ変異体の検出
使用した形式は、２Ｇ２Ｇ１０または８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を捕獲に、そしてヤギ抗ＨＢｓポリクローナル抗体を検出に使用するサンドイッチタイプの形式である。
【００６３】
患者血清中の野生型ＨＢｓＡｇ抗原の検出：
Societe Nationale de Transfusion Sanguine of Lilleから供給された、いくつかのサブタイプを含む患者血清（希釈された検体）を、２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体を捕獲に、そしてヤギ抗ＨＢｓポリクローナル抗体を検出に用いて検査した。結果を下記の表２に示す。試験をした検体を、そのサブタイプおよび由来に従って同定する。結果は、閾値に対するシグナルとして表す。閾値は、陰性検体のシグナルの５倍に相当する。シグナル／閾値の値が１を超えるものを陽性とする。
【００６４】
【表２】
血漿中の野生型ＨＢｓＡｇ抗原の検出：
２Ｇ２Ｇ１０モノクローナル抗体および８Ｂ４Ｈ７モノクローナル抗体を捕獲に用いて、bioMerieux serothequeからの血漿を上記と同じ条件下で試験した。結果を下記の表３に示す。結果は、シグナル／閾値の値で表す。閾値は、陰性検体のシグナルの５倍に相当する。シグナル／閾値の値が１を超えるものを陽性とする。
【００６６】
【表３】
ＨＢｓＡｇ変異体の検出：
２Ｇ２Ｇ１０抗体について、Carmen博士から入手しIreland et al., (Hepatology 31: 1176-1181 (2000))により以前報告された方法に従って調製した組換えＨＢｓＡｇ変異体の培養上清からのＨＢｓＡｇ変異体を検出する能力を試験した。
【００６８】
アッセイは、Vidas（登録商標）自動分析機上で行う蛍光免疫酵素定性試験法を用いて行った（Weber et al., Journal of Virological Methods 42: 63-74 (1993); Mikkelsen et al., Gynecologic Obstetric Investigation 41: 35-40 (1996)）。この２段階捕獲試験法は、以下のように実施した。
【００６９】
２Ｇ２Ｇ１０抗体を、固相容器（ＳＰＲ）上に１０μg／mlの最終濃度で固定化した。その後、ＳＰＲを種々の変異体に相当する組換えタンパク質および抗ＨＢｓＡｇビオチン化ヤギポリクローナル抗体を含む培養上清と同時にインキュベートした。次いで第２段階では、蛍光測定反応にアルカリ性ストレプトアビジン−フォスファターゼ複合体を用いた。
【００７０】
表４に示すように、別の抗ＨＢｓＡｇ抗体である６Ｈ６Ｂ６と比べて、２Ｇ２Ｇ１０抗体は、試験した種々の変異体の検出が可能であった。実際には、ＢＡ３．２およびＴ５Ｎ検体は、Irelandら(Hepatology 31: 1176-1181 (2000))の報告があるように試験した培養上清中への抗原の分泌に影響を与えるＣ１２４ＲおよびＴ２３Ｎ突然変異をそれぞれ有する。したがって、これら２つの上清において検出されなかったことは、考慮に入れることはできない。
【００７１】
【表４】
ＭＨＲ：主要親水性領域（major hydrophilic region）を示す。
結果は、シグナル／閾値の２回の平均で示す。各抗体について、閾値は、精製された血漿ＨＢｓＡｇサブタイプａｄ／ａｙの０．１６ng／mlで得られたシグナルの２回の平均で定義した。
a非希釈検体
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＢｓＡｇ抗原のアミノ酸配列を示す図である。
Claims (32)
- 野生型ＨＢｓＡｇ抗原および少なくとも１つのＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能なモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体が、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域中のアミノ酸からなるペプチドに結合する、モノクローナル抗体。
- 前記抗体が前記野生型ＨＢｓＡｇ及びＨＢｓＡｇの少なくとも２つの突然変異体型に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
- 前記抗体が前記野生型ＨＢｓＡｇ及びＨＢｓＡｇの２を超える突然変異体型に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中に少なくとも１個のアミノ酸置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型の少なくとも１つに結合可能な、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の「ａ」決定基中の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４または１４５位における少なくとも１個のアミノ酸置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型の少なくとも１つに結合可能な、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の１００、１１８、１２０、１２２位における少なくとも１個の他のアミノ酸置換を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の１４４位におけるアスパラギン酸のアラニンによる少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の１４５位におけるグリシンのアルギニンによる少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の１２７位におけるプロリンのアラニンによる少なくとも１個の置換およびＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の１２０位におけるプロリンのセリンによる少なくとも１個の置換およびＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる少なくとも１個の置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
- ＨＢｓＡｇ抗原の１００位におけるチロシンのセリンによる置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１１８位におけるトレオニンのバリンによる置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１２２位におけるアルギニンのリシンによる置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１３３位におけるメチオニンのイソロイシンによる置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１３４位におけるチロシンのアスパラギンによる置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１４２位におけるプロリンのセリンによる置換、ＨＢｓＡｇ抗原の１４３位におけるセリンのロイシンによる置換およびＨＢｓＡｇ抗原の１４５位におけるグリシンのリシンによる置換を含むＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型に結合可能な、請求項５に記載のモノクローナル抗体。
- 野生型ＨＢｓＡｇ抗原およびＨＢｓＡｇ抗原の１２７、１３３、１３４、１４２、１４３、１４４および１４５位のアミノ酸をコードする１つ以上のコドンのレベルで点突然変異を有する配列によってコードされる「ａ」決定基を保持する突然変異ＨＢｓＡｇの少なくとも１つに結合可能なモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体が、ＨＢｓＡｇ抗原の１９９〜２０８領域に結合するモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体が、イムノグロブリンのクラスＧに属することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体の誘導体が、ヒト化された形態のモノクローナル抗体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の誘導体。
- 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のフラグメントであって、該フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｕからなる群から選択される、フラグメント。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマの製造方法であって、
哺乳動物を野生型ＨＢｓＡｇ抗原またはＨＢｓＡｇ抗原の突然変異体型で免疫化すること、
ハイブリドーマを形成するために抗体産生細胞を不死化させること、
少なくとも１つの突然変異体型でハイブリドーマ培養物をスクリーニングすること、および
野生型ＨＢｓＡｇ抗原および少なくとも１つの突然変異体型に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択すること
からなる製造方法。 - 前記動物が、マウスである、請求項１７に記載の製造方法。
- 前記野生型ＨＢｓＡｇ抗原又は突然変異型ＨＢｓＡｇ抗原が、フラグメントの形態又は適切な免疫原性誘導体の形態である、請求項１７に記載の製造方法。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、
請求項２０に記載のハイブリドーマまたは請求項１７に記載の方法によりインビボまたはインビトロで得られやすいハイブリドーマを培養すること、および
培養培地からモノクローナル抗体を回収すること
からなる製造方法。 - 請求項２１に記載の方法により得ることができるモノクローナル抗体。
- 検体中のＨＢｓＡｇ抗原の検出方法であって、請求項１〜１４または請求項２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体または請求項１６に記載のフラグメントもしくは請求項１５に記載の誘導体と該検体とを接触させること、および
少なくとも１つの抗原／抗体、フラグメントまたは誘導体の複合体の存在を同定すること
からなる検出方法。 - 請求項１〜１４または請求項２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、または請求項１６に記載のフラグメントもしくは請求項１５に記載の誘導体、およびポリクローナルまたはモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体から選択される少なくとも１つの他の抗体と該検体を接触させることからなる、請求項２３に記載の方法。
- 「サンドイッチ」法または「競合」法により実施される、請求項２３または２４に記載の方法。
- ＨＢｓＡｇ抗原の検出を抗ＨＢｃ抗体の検出と同時に行う、請求項２３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１４または請求項２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体、または請求項１６に記載のフラグメントもしくは誘導体を含む、診断用組成物。
- 抗ＨＢｃ抗体検出用の少なくとも１つの試薬と組合わせて含む、請求項２７に記載の診断用組成物。
- ＨＢｓＡｇ抗原の検出のための少なくとも１つの他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体をさらに含む、請求項２７又は２８に記載の診断用組成物。
- 請求項１〜１４または請求項２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、または請求項１６に記載のフラグメントもしくは請求項１５に記載の誘導体、またはそれらの組合せを含む抗血清。
- 請求項１〜１４または請求項２２のいずれか１項記載のモノクローナル抗体または請求項１６に記載のフラグメントもしくは請求項１５に記載の誘導体以外の、少なくとも１つのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体または抗ＨＢｓＡｇモノクローナルおよびポリクローナル抗体の混合物をさらに含む、請求項３０に記載の抗血清。
- 請求項１〜１４または請求項２２のいずれか１項記載のモノクローナル抗体または請求項１６に記載のフラグメントもしくは請求項１５に記載の誘導体の製造に用いられる、配列番号１で示されるＨＢｓＡｇのアミノ酸１９９で始まりアミノ酸２０８で終わるペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0013454A FR2815634B1 (fr) | 2000-10-20 | 2000-10-20 | Anticorps monoclonaux diriges contre des virus de l'hepatite b |
| PCT/FR2001/003169 WO2002034789A1 (fr) | 2000-10-20 | 2001-10-12 | Anticorps monoclonaux diriges contre des virus de l'hepatite b |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004516824A JP2004516824A (ja) | 2004-06-10 |
| JP4293788B2 true JP4293788B2 (ja) | 2009-07-08 |
Family
ID=8855552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002537775A Expired - Lifetime JP4293788B2 (ja) | 2000-10-20 | 2001-10-12 | Ｂ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7785586B2 (ja) |
| EP (1) | EP1326895B8 (ja) |
| JP (1) | JP4293788B2 (ja) |
| AT (1) | ATE312846T1 (ja) |
| AU (1) | AU2001295700A1 (ja) |
| DE (1) | DE60115938T2 (ja) |
| ES (1) | ES2252301T3 (ja) |
| FR (1) | FR2815634B1 (ja) |
| WO (1) | WO2002034789A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7550558B2 (en) * | 2001-06-01 | 2009-06-23 | Fundacao De Ampara A Pesquiso Do Estado De Sao Paolo (Fapesp) | Antimicrobial peptides and methods for identifying and using such peptides |
| ES2488849T3 (es) * | 2004-06-07 | 2014-08-29 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Anticuerpos monoclonales de conejo a antígenos de superficie de hepatitis B y métodos de utilización de los mismos |
| EP1848740A1 (en) * | 2005-01-14 | 2007-10-31 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, the Department of Health and Human Services, | Monoclonal antibodies that bind or neutralize hepatitis b virus |
| JP4948783B2 (ja) * | 2005-05-18 | 2012-06-06 | シスメックス株式会社 | 抗ＨＢｓモノクローナル抗体 |
| KR101653261B1 (ko) * | 2012-07-10 | 2016-09-12 | 주식회사 녹십자 | B형 간염 돌연변이 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 항체 조성물 |
| KR101646830B1 (ko) * | 2013-05-31 | 2016-08-08 | (주)셀트리온 | Ｂ형 간염 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 |
| US9714284B2 (en) * | 2013-07-16 | 2017-07-25 | National Health Research Institutes | Antibodies and method for determining deletions in HBV pre-S2 region |
| CN104845938B (zh) * | 2015-04-17 | 2018-07-03 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体及其应用 |
| CN111234013B (zh) * | 2018-11-29 | 2022-01-11 | 清华大学 | 乙肝病毒的中和抗体b430及其应用 |
| CN116496389A (zh) * | 2022-01-25 | 2023-07-28 | 厦门大学 | 用于治疗hbv感染及相关疾病的表位肽及抗体 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5204095A (en) * | 1980-04-09 | 1993-04-20 | National Research Development Corporation | Monoclonal antibodies against hepatitis B virus |
| GB9007024D0 (en) * | 1990-03-29 | 1990-05-30 | Imperial College | Novel vaccine |
| US6030616A (en) * | 1993-03-24 | 2000-02-29 | Imperial College Of Science, Technology & Medicine | Hepatitis B escape mutant specific binding molecules |
| GB9325772D0 (en) * | 1993-12-16 | 1994-02-16 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| GB9608626D0 (en) * | 1996-04-25 | 1996-07-03 | Univ College Of London | Hepatitis b monoclonal antibodies |
| US6541011B2 (en) * | 1998-02-11 | 2003-04-01 | Maxygen, Inc. | Antigen library immunization |
-
2000
- 2000-10-20 FR FR0013454A patent/FR2815634B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-10-12 DE DE60115938T patent/DE60115938T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-12 WO PCT/FR2001/003169 patent/WO2002034789A1/fr active IP Right Grant
- 2001-10-12 JP JP2002537775A patent/JP4293788B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-12 US US10/399,668 patent/US7785586B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-12 EP EP01976422A patent/EP1326895B8/fr not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-12 AT AT01976422T patent/ATE312846T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-12 ES ES01976422T patent/ES2252301T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-12 AU AU2001295700A patent/AU2001295700A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1326895B8 (fr) | 2006-06-21 |
| JP2004516824A (ja) | 2004-06-10 |
| FR2815634A1 (fr) | 2002-04-26 |
| ATE312846T1 (de) | 2005-12-15 |
| FR2815634B1 (fr) | 2003-10-31 |
| US7785586B2 (en) | 2010-08-31 |
| WO2002034789A1 (fr) | 2002-05-02 |
| AU2001295700A1 (en) | 2002-05-06 |
| ES2252301T3 (es) | 2006-05-16 |
| DE60115938D1 (de) | 2006-01-19 |
| EP1326895B1 (fr) | 2005-12-14 |
| US20040219154A1 (en) | 2004-11-04 |
| DE60115938T2 (de) | 2006-07-27 |
| EP1326895A1 (fr) | 2003-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4430677B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の検出法 | |
| US5534405A (en) | Antibodies, diagnostic systems and methods for assaying HBxAg | |
| Colucci et al. | Identification of a major hepatitis B core antigen (HBcAg) determinant by using synthetic peptides and monoclonal antibodies. | |
| JPH11253184A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原の逸出突然変異体 | |
| JP4293788B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体 | |
| JP4118955B2 (ja) | Ｂ型肝炎モノクローナル抗体 | |
| JP2004043470A (ja) | 腸内伝達された非−ａ／非−ｂ肝炎ウィルス物質及びその特徴的なエピトープ | |
| AU628156B2 (en) | Monoclonal antibodies to pres2 and pres1 polypeptides of the hepatitis b viral envelope | |
| US20060269953A1 (en) | Novel hepatitis B virus | |
| JP4866238B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウィルスの新規の表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）変異体 | |
| Cheung et al. | Epitope mapping of neutralizing monoclonal antibodies against duck hepatitis B virus | |
| JP3847257B2 (ja) | Ｈｂｖの検出又は測定方法 | |
| AU646039B2 (en) | Monoclonal antibodies to Pres2 and Pres1 polypeptides of the hepatitis B viral envelope | |
| FI101966B (fi) | Antigeeninen, synteettinen polypeptidi sekä sen käyttö diagnostiikassa | |
| JP3242402B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体およびその使用法 | |
| CA2529986A1 (en) | Novel surface protein (hbsag) variant of hepatitis b virus | |
| KUMAR et al. | A monoclonal antibody against the X protein of hepatitis B virus: fine mapping of its epitope and application in a quantitative ELISA of the X protein in sera of hepatitis B patients | |
| KR20000064637A (ko) | 비(b)형 간염의 감염 결과를 예측하는 방법 | |
| US6787142B2 (en) | Mutant human hepatitis B viral strain and uses thereof | |
| WO1999066048A1 (en) | A mutant human hepatitis b viral strain and uses thereof | |
| REDDI et al. | A Monoclonal Antibody Against the X Protein of Hepatitis B Virus: Fine Mapping of its Epitope and Application in | |
| NO177310B (no) | Antigent polypeptid fra HBxAg, antistoff som reagerer med polypeptidet, diagnostisk analysesystem for bestemmelse av tilstedeværelsen av HBxAg i en kroppspröve, samt anvendelse av polypeptidet til in vitro diagnose |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040720 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061121 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070221 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070302 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070521 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080715 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081110 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090224 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090317 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090407 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120417 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4293788 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120417 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130417 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130417 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140417 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |