KR101653261B1

KR101653261B1 - B형 간염 돌연변이 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 항체 조성물

Info

Publication number: KR101653261B1
Application number: KR1020157000623A
Authority: KR
Inventors: 김세호; 홍광원; 신용원; 장기환
Original assignee: 주식회사 녹십자
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2016-09-12
Also published as: CA2878155A1; MY178496A; CN104487090B; ES2712686T3; BR112015000474A2; EA029321B1; AU2013287516B2; MX2015000349A; US20150166637A1; EA201500114A1; US20170260257A1; CN104487090A; EP2858674A1; CA2878155C; KR20160092042A; US9683029B2; EP2858674B1; EP2858674A4; HRP20190393T1; JP2017095504A

Abstract

본 발명에 따른 항체는 B형 간염 바이러스 (HBV)의 HBsAg에 결합하여 B형 간염바이러스를 중화하는 항체로서, 본 발명에 따른 항체의 표면항원 결합부위가 바이러스 복제에 매우 중요한 역할을 하는 부위라는 것을 기존에 확인하였으며 이 부분에 변이가 일어날 경우 바이러스 복제가 현저하게 저해되기 때문에 적어도 HBV 바이러스가 이 부위에는 변이를 유발시킬 수 없다. 따라서 본 발명에서는 종래의 바이러스 복제 억제제에 의해 생성된 YMDD 내성 B형 간염 바이러스 또는 혈장 유래 HBIG (hepatitis B immunoglobulin)이 결합하지 못하는 HBV 표면항원의 G145R 돌연변이에 본 발명에 따른 항체가 결합하는 것을 환자 유래 바이러스를 통해 확인하였으며, B형 간염 바이러스의 유일한 동물 모델인 침팬지를 이용하여 본 발명에 따른 항체의 in vivo 효능을 확인하였다. 그 결과 야생형 B형 간염 바이러스이기는 하지만 in vivo 모델에서 중화 효능을 가지고 있음을 확인하였다. 이에 본 발명의 항체는 야생형 B형 간염 바이러스 뿐만 아니라 B형 간염바이러스의 중합효소 내의 YMDD 변이형과 표면항원의 G145R 회피형 및 여러 환자들에서 유래된 변이형에 대해서도 모두 결합능을 가지고 있음을 확인 할 수 있어, B형 간염 야생형 바이러스 뿐만 아니라 돌연변이형 바이러스의 감염에 대한 예방 또는 치료에도 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

B형 간염 돌연변이 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 항체 조성물{An antibody composition for prevention or treatment of mutant hepatitis B virus infection}

본 발명은 종래의 바이러스 복제 억제제(라미부딘(lamivudine) 또는 아데포비어(adefovir dipivoxil) 등) 또는 혈장 유래 HBIG(hepatitis B immuneglobulin)이 결합하지 못하는 돌연변이 인간 B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 대한 중화 항체를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 돌연변이 바이러스에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 패밀리에 속하는 DNA 게놈을 갖는 바이러스로서, 급성 및 만성 간염을 유발한다. B형 간염 바이러스(HBV)는 서로 유전자 염기서열이 약 8% 이상 다른 8개의 유전자형으로 분류하거나 B형 간염 바이러스(HBV) 표면항원(HBsAg) 두 곳의 항원결정부위 (d/y, w/r)를 중심으로 4종의 혈청형(adw, adr, ayw, ayr 등)으로 구분한다. 전 세계 인구 중의 약 3.5억 명이 B형 간염 바이러스(HBV) 만성 감염자이며, 특히 한국 및 중국은 만성 감염자가 약 5~8%에 이르며, B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 이 지역의 간질환 및 간암의 주원인이다. 현재는 백신의 개발로 어느 정도 예방이 가능해졌지만 아직도 B형 간염 바이러스에 의한 만성 간염 환자가 상당수 존재하고 있는 현실이다. B형 간염 바이러스(HBV)의 만성 감염은 간염, 간경변 뿐만 아니라 간암을 유발하며 만성 감염자가 비감염자에 비해 간암 발생빈도가 약 300배 높게 나타나는데, WHO의 조사에 따르면 약 80%의 간암은 만성 B형 간염이 원인이라고 한다.

현재 알려진 B형 간염 치료제는 뉴클레오사이드 유사체(nucleoside analogue)인 라미부딘(lamivudine)과 아데포비어(adefovir dipivoxil)등이 있으며, 이들은 B형 간염 바이러스(HBV) 중합효소(HBV polymerase)의 역전사효소(reverse transcriptase)를 저해함으로써 B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA 복제를 저해한다. 하지만, 3년 투약시 약 75%의 환자에서 내성 바이러스가 발생하여 치료 효과가 저하되는 문제점이 있어, 바이러스 복제 저해제를 단독으로 사용하여 B형간염을 치료하는 것은 불가능하게 되어 이에 대한 대안으로 인터페론 제제와의 병용 치료를 시도하는데, 심각한 부작용으로 인해 현재는 사용하고 있지 않다.

유사한 치료 목적으로 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 항체를 역가가 높은 혈액에서 분리 및 정제한 B형 간염 항체(hepatitis B immune globulin; HBIG) 제제를 고려하는데 상기의 HBIG 제제의 항체는 혈장으로부터 분리정제 하여 제조하기 때문에 원료 혈장 확보, 바이러스 감염의 우려, 낮은 활성, 고비용 등의 문제점이 있다.

또한 최근에 이러한 항체들을 회피할 수 있는 돌연변이 바이러스들, 예를 들어 B형 간염 바이러스(HBV)의 표면 단백질의 145번 글리신(glycine)이 아르기닌(arginine)으로 치환된 돌연변이체 등을 보고하고 있으며, 이외에도 다양한 회피형 돌연변이들이 나타나고 있어, 기존의 B형 간염 바이러스(HBV) 치료제로는 만족스러운 치료효과를 거두기 어렵다.

따라서 B형 간염 바이러스(HBV)의 돌연변이가 일어나지 않는 에피토프에 특이적으로 결합함으로써, 돌연변이에 의한 치료효과의 저하가 발생하지 않는 B형 간염 바이러스(HBV) 치료용 항체 개발이 시급한 실정이다.

본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, 이하 'HBV'라고 한다.)의 예방 또는 치료를 위해 사용되고 있는 기존 치료제에 저항성을 갖는 돌연변이 바이러스의 감염에 의한 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 5 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역(VH); 및

서열번호 6 내지 서열번호 10 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(VL);을 포함하는 항체를 유효성분으로 포함하는,

HBV 표면항원(HBsAg)의 G145R 돌연변이 또는 HBV DNA 중합효소의 YMDD 돌연변이가 있는 HBV의 감염에 대한 예방 또는 치료용 항체 조성물을 제공한다.

본 발명의 항체 조성물은 기존 치료제에 저항성을 갖는 돌연변이 바이러스의 감염을 예방 하거나 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 G145R 돌연변이 HBV 또는 YMDD 모티프(motif) 돌연변이 HBV 감염에 대한 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 침팬지를 사용하여 본 발명에서 제공하는 항체의 HBV 중화효능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 B형 간염 환자 혈액중의 HBV와 본 발명의 항체가 결합하는 것을 면역침전법으로 확인한 사진(도 2 (a), 도 2(c)) 및 그래프(도 2(b))이다.
도 2(a)에서, 본 발명항체는 1: 0.1 ㎍, 2: 0.5㎍, 3: 1㎍ 및 4: 5㎍의 농도로 처리하였으며, (5)는 PBS 완충액이다.
도 2(c)에서, 1:PBS, 2:항-파상풍 톡소이드 인간항체(TT-F9) 1 ㎍ 처리군, 3: 헤파빅(Hepabig) 1㎍ 처리군, 4: 항-B형간염바이러스 표면항원 인간화항체(HuS 10) 1㎍, 5: 본 발명항체 1㎍ 처리군이다.
도 3은 HBV가 감염된 인간의 간 조직에서의 항체 결합하는 것을 면역조직화학염색법으로 확인한 사진이다. 구체적으로, 도 3의 (a)는 본 발명의 항체가 HBV 감염된 인간 간 조직에 강하게 결합한 사진이며, 도 3의 (b)는 아이소타입 음성대조 항체로서 동일 조직에 대해 결합하지 않았음을 나타낸 사진이다.
도 4는 B형 간염 바이러스 (HBV)의 유전자 지도를 나타낸 도면이다.
HBV(adr subtype) 유전자(Gene Bank accession No. DQ683578)의 1.3배 길이 서열(HBV 게놈의 인핸서(enhancer) I의 업스트림부터 시작해서 폴리아데닐레이션 위치의 다운스트림에서 끝나는 HBV의 유전자)을 pcDNA3.1(Invitorgen사, 미국)의 PmeI 제한효소 자리에 삽입함으로써 플라스미드 pHBV1.3-MBRI를 제조하는 것이다.
도 5는 유체역학 마우스 모델 (hydrodynamic mouse model)을 통해 G145R 변이가 일어난 바이러스에 대한 항체의 중화능을 확인하는 실험으로 마우스 혈액 내에서 wild-type 및 G145R 돌연변이 HBV의 표면항원 및 바이러스 입자가 모두 제거된 것을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

HBV 표면항원(HBsAg)의 G145R 돌연변이 또는 HBV DNA 중합효소의 YMDD 돌연변이가 있는 HBV의 감염에 대한 예방 또는 치료용 항체 조성물에 관한 것이다.

상기 항체는 세포주 HBAb-49(KCLRF-BP-00054)로부터 생산한 HBV 표면항원(HBsAg)의 G145R 돌연변이 또는 HBV DNA 중합효소 (Polymerase)의 YMDD 돌연변이 HBV 표면항원에 대한 항체인 것을 특징으로 한다. 상기 G145R 돌연변이는 혈장 유래 HBIG이 결합을 하지 못하는 HBV의 표면 단백질의 145번 글리신(glycine)이 아르기닌(arginine)으로 치환된 것이고, 상기 YMDD 모티프(motif)는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 유전자의 C영역에 위치하는 것으로 아미노산 서열상 552번째 메티오닌(methionine, M)이 발린(valine, V) 또는 이소루신(isoleucine)으로 치환된 돌연변이 바이러스이다.

상기 항체 조성물은 HBV 치료제인 라미부딘(lamivudine) 또는 아데포비어(adefovir dipivoxil) 내성 돌연변이 바이러스의 감염에 대한 예방 또는 치료 항체인 것이 특징이다.

또한, 상기 항체 조성물은 항바이러스제를 더 포함 할 수 있으며, 상기 항바이러스제는 인터페론, 항-HBV 모노클로날 항체, 항-HBV 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 폴리머라제 저해제, 및 siRNA 제제 중에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

상기 항체 조성물에서 항체는 0.1 내지 50㎎/㎖의 농도로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 항체 조성물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 제제를 제공하며, 상기 약제학적 제제는 인간을 포함하는 포유동물에 0.001 내지 10㎎/kg(체중)의 양으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항체 조성물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 상기 항체를 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체를 희석제로 사용하는 경우에는 항체에 대한 담체, 부형제 또는 매질(medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이(향낭, sachet), 엘릭서(elixir), 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 항체의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 침팬지를 이용한 HBV 중화효능 입증 실험에서, HBV와 상기 항체를 혼합하여 침팬지에 투여한 후, 1년간 HBV의 감염이 없었음을 확인하였다. 대조군으로 사용한 침팬지에서는 HBV 바이러스 입자 및 표면항원이 생성되었으며 이후 회복기에는 HBV 표면항원에 대한 항체가 생성되었음을 확인하였다 (도 1 참조).

또한, 상기 항체가 환자 혈액중의 HBV와 결합하는 능력이 탁월하다는 것을 면역침전법을 이용하여 확인하였으며 (도 2 참조), HBV가 감염된 인간의 간 조직에도 강하게 결합한다는 것을 면역조직화학 염색법을 이용하여 확인하였다 (도 3 참조).

본 발명에 따른 항체는 기존 치료제인 바이러스 복제 억제제(라미부딘 또는 아데포비어 등)와 혈장 유래 HBIG이 바이러스의 억제능을 갖지 못하는 저항성 및 회피형 HBV의 HBsAg에 결합하여 중화능을 가질 수 있는 것이 특징이며, 바이러스 복제 억제제에 저항성을 갖는 B형 간염 바이러스 폴리머라아제의 역전사효소(reverse transcriptase) 상에 YMDD 돌연변이 바이러스를 갖는 환자의 혈액을 이용하여 효소면역측정(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA)법을 통해 항체의 결합능을 확인하였다. 그 결과 모든 YMDD 돌연변이 바이러스에 상기 항체가 강하게 결합하는 것으로 확인하였다 (표 5 및 표 6 참조).

상기 항체의 가장 큰 특징은 혈장 유래 HBIG이 중화하지 못하는 HBV의 표면 단백질의 145번 글리신(glycine)이 아르기닌(arginine)으로 치환된 돌연변이체에 대해서도 결합하여 중화능을 갖는 것이며, 이를 입증하기 위해 유체역학 마우스 모델(hydrodynamic mouse model)을 이용하여 변이 바이러스를 생성시키고, 상기 항체가 중화능을 갖는지 확인하였다. 그 결과 상기 마우스 모델의 혈액 내에서 HBsAg 및 HBV 가 모두 제거된 것으로 확인하였다 (도 5 참조).

간 이식 후 재발된 환자의 B형 간염 바이러스 (HBV)에 상기 항체가 결합하는 것을 확인하였으며 이 모두가 HBV의 표면 단백질의 145번 글리신(glycine)이 아르기닌(arginine)으로 치환된 돌연변이체임을 확인하였다 (표 8 참조).

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 항체 및 이를 포함하는 조성물은 기존 치료제에 저항성을 갖는 돌연변이 바이러스의 감염을 예방 하거나 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 G145R 돌연변이 HBV 또는 YMDD 모티프(motif) 돌연변이 HBV 감염에 대한 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 침팬지에서의 HBV 중화능 실험

본 발명의 항체가 in vivo 에서 HBV 중화능을 나타내는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 실험하였다.

3개의 튜브에 간염연구재단(Hepatitis Research Foundation, 미국)에서 획득한 HBV 100 CID₅₀(50% chimpanzee infectious doses)을 넣고, 2개의 튜브에 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 본 발명의 항체(녹십자, 한국)를 각각 0.1㎎ 및 10㎎ 첨가하였으며, 1개의 튜브에는 항체를 첨가하지 않았다. PBS(phosphate buffered saline) 완충용액을 이용하여 튜브 내 혼합물의 부피를 모두 3㎖로 조정한 후, 37℃에서 1시간 반응시키고, 다시 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, 액체 질소로 동결하여 시험물질을 준비하였다.

동물실험을 위해 HBV에 감염된 적이 없는 침팬지 3 마리 각각에 상기 시험물질을 정맥투여 하였다 (표 1).

[표 1] 침팬지별 항체 투여량

항체 투여 1주일 전부터 항체 투여 후 8주까지는 1주 간격으로, 8주 이후부터는 2주 간격으로 채혈하여 HBV DNA, HBsAg(HBV 표면항원), 항-HBs(HBV 표면항원 항체), 항-HBc(HBV 코어항체), ALT, AST 등 HBV 감염과 관련된 지표들을 측정하였고, 또한 혈액 및 소변 검사를 통해 항체의 생체 내 안전성을 확인하였다.

또한, 침팬지 1에 대하여 HBV DNA, HBsAg 및 anti-HBs의 변화 양상을 측정하여 도 1에 그래프로 나타내었다.

표 2, 표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 침팬지 1에서는 HBV의 감염이 관찰된 반면, HBV와 함께 항체를 투여한 침팬지 2 및 3에서는 실험기간 내내 바이러스의 감염이 관찰되지 않았다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 항체가 우수한 HBV 중화능을 가진다는 것을 확인하였다. 또한, 간 기능 검사, 각종 혈액학적 검사, 소변 검사 등에서도 특별한 이상 소견을 보이지 않아 항체의 생체 내 안전성을 확인하였다.

[표 2] HBV 감염 지표 측정 (침팬지 1)

[표 3] HBV 감염 지표 측정 (침팬지 2)

[표 4] HBV 감염 지표 측정 (침팬지 3)

(* borderline (+))

실시예 2. 면역침전법(immunoprecipitation)에 의한 항체의 HBV 결합능 확인

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 본 발명의 항체가 B형 간염 환자의 혈액(아주대학교 의과대학에서 제공 받음)에 있는 HBV와 결합하는지를 면역침전법을 이용하여 확인하였다 (도 2 참조).

(1) B형 간염 환자의 혈액 준비

0.2% BSA/PBS 완충용액으로 10배 희석한 B형 간염 환자의 혈액 1,000㎕를 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적)-아가로스 접합체(Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ) 와 반응시켜 혈액 내에 존재하는 면역글로불린을 제거하였다.

(2) 항체와 염소 항-인간 IgG-아가로스 접합체의 결합 반응

10㎕의 본 발명에 따른 항체(0.1, 0.5, 1 및 5 ㎍), PBS 용액 및 50㎕의 염소 항-인간 IgG-아가로스 접합체(Research Diagnostics)를 혼합하여 실온에서 1시간 동안 흔들어 주면서 반응시킨 후, 여기에 다시 10㎎의 인간 면역 글로불린(I.V.-Globulin-S, 녹십자)을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 흔들어 주면서 반응시켜 염소 항-인간 IgG-아가로스 접합체의 결합부분을 차단하였다. 이때, 비교군으로서 혈액에서 정제한 HBV 항체(Hepabig), TT-F9(항-파상풍 톡소이드 인간항체) 및 HuS 10(항-B형간염바이러스 표면항원 인간화항체)에 대해서도 1㎍씩 상기와 동일하게 처리하였다.

(3) 항체가 결합되어 있는 염소 항-인간 IgG-아가로스 접합체와 환자 혈액의 결합 반응

실시예 2-(1)에서 준비한 혈액 200㎕와 실시예 2-(2)에서 준비한 항체가 결합되어 있는 염소 항-인간 IgG-아가로스 접합체를 혼합하여 실온에서 1시간 동안 흔들어 환자 혈액 중의 HBV와 항체를 반응시켰다.

(4) HBV의 침전 여부 확인

상기 (3)의 반응액을 원심분리한 후 상청액을 취하여 코바스 암플리코 HBV 모니터 테스트(Cobas Amplicor HBV Monitor Test, v2.0; Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)로 HBV를 측정하였다.

원심분리한 후 남아있는 아가로스는 0.2% BSA/PBS 완충액으로 10회 세척해 준 다음, 다시 상기 완충액 100㎕를 섞고 10% SDS 5㎕, 50 mM EDTA 2㎕ 및 200㎍의 프로티나아제 K (Sigma-Aldrich)를 첨가하여 55℃에서 30분간 반응시켰다. 그 다음, 상청액을 취해 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Hilden, Germany)로 DNA를 분리한 후, LiquiMix GM PCR premix(Neurotics, 한국), 프라이머 M3(서열번호 11) 및 POL8(서열번호 12)를 사용하여 HBV 특이 DNA를 증폭하였다. 이때, PCR은 55℃에서 5분간 반응 후, 95℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃ 1분의 사이클을 35회 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 반응하여 수행하였다. 증폭된 DNA는 1.0% 아가로스 젤에서 분석하였다. 대조군으로는 HBV 인간화 항체 및 파상풍 인간항체(녹십자, 한국)를 사용하였으며, 결과는 도 2에 나타내었다.

먼저, 도 2의 (a) 및 (b)에 표시된 바와 같이, 면역침전 반응에 사용한 항체의 양이 증가할수록 침전되는 HBV의 양도 증가하였고, 면역침전 반응 후 상청액의 HBV 양은 항체의 양이 증가함에 따라 감소하였으며, 침전된 HBV의 양은 항체의 양이 증가할수록 이에 비례하여 증가하였다. 또한, 도 2의 (c)에 표시한 바와 같이, 같은 양의 항체를 사용할 경우 혈액에서 정제한 HBV 항체(Hepabig)는 HBV 결합력이 약하여 HBV를 침전시키지 못하는 것에 반해 본 발명의 항체는 HBV와의 강한 결합력으로 인해 HBV를 침전시킴을 확인하였다.

실시예 3. 면역조직화학염색법(immnunohistochemistry)에 의한 항체의 HBV 결합능 확인

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 본 발명의 항체가 HBV 감염 조직에 결합하는지를 면역조직화학염색법을 이용하여 확인하였다.

HBV 감염된 인간 간 조직(Spring Bioscience, Fremont, CA, 미국. Catalog No. STS-025)의 냉동 슬라이드를 아세톤으로 고정시키고 메탄올에 희석한 과산화수소와 반응시켰다. 그 다음, 상기 조직 슬라이드를 정상 토끼 혈청과 반응시킨 후, 차례로 아비딘(avidin) 및 바이오틴(biotin)으로 반응시켰다. 여기에 이뮤노프로브(Immunoprobe; 시그마-알드리치) 바이오틴화 키트를 사용하여 바이오틴을 결합시킨, 본 발명에 따른 항체 및 이와 동일한 아이소타입의 인간 면역글로불린(IgG1 아이소타입 음성대조 항체; 시그마-알드리치)을 각각 반응시키고, StreptABComplex/HRP(Dako, 네덜란드)를 다시 반응시켰다. 상기 반응물들에 대해 각각 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride; DAB) 염색제로 염색을 하고 해마톡실린(haematoxylin)으로 대조 염색(counterstain)을 실시한 뒤, 본 발명의 항체 및 상기 IgG1 아이소타입 음성대조 항체를 반응시킨 결과를 각각 도 3의 (a) 및 (b)에 표시하였다.

도 3의 (a) 및 (b)에 표시한 바와 같이, 아이소타입 음성대조 항체 (도 3의 (b))는 HBV가 감염된 인간 간 조직에 결합하지 않은 반면, 본 발명의 항체 (도 3의 (a))는 동일 조직에 강하게 결합함을 확인하였다.

실시예 4. HBV 복제 억제제 저항성 변이체에 대한 결합능 확인

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 본 발명에 따른 항체의 결합 여부는 상기 발명의 항체를 코팅시킨 96웰 플레이트에 환자의 혈액 샘플(가톨릭의과대학 성모병원 제공)을 반응시키고 이를 Genedia HBsAg ELISA 3.0 kit (녹십자 MS, 한국)의 면양 anti-HBsAg/과산화효소 접합액으로 검출하였다. 그 결과 표 5에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 항체가 모든 YMDD 돌연변이 바이러스의 HBsAg에 강하게 결합하였다. 따라서, 표 5에 기재된 바와 같이 YMDD 돌연변이 바이러스를 갖는 만성 B형 간염 환자(Chronic hepatitis B, CHB)의 혈액을 이용하여 본 발명의 항체가 결합함을 확인할 수 있었다.

[표 5] 본 발명에 따른 항체의 YMDD 돌연변이 바이러스에 대한 결합능을 효소면역측정(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA)법으로 분석한 결과

실시예 5. 만성 B형 간염, 간 경변, 간암 환자군에서 나타난 다양한 HBsAg의 변이체에 대한 결합능 확인

만성 B형 간염 환자 (Chronic hepatitis B, CHB) 100명, 간경화 환자 (Liver cirrhosis, LC) 100명, 및 간암환자 (Hepatocellular carcinoma, HCC) 100명으로부터 유래한 바이러스 표면항원(HBsAg)에 대한 돌연변이를 분석하였고 본 발명에 따른 항체가 모든 돌연변이 바이러스에 결합하는지를 확인하였다.

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 본 발명에 따른 항체를 코팅시킨 96웰 플레이트에 환자의 혈액 샘플(가톨릭의과대학 성모병원 제공)을 반응시키고 이를 Genedia HBsAg ELISA 3.0 kit (녹십자 MS, 한국)의 면양 anti-HBsAg/과산화효소 접합액으로 검출하였다. 결과는 상기 표 6에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 항체가 환자에서 유래된 모든 HBsAg 변이체에 강하게 결합함을 확인하였다.

[표 6] 대표적인 표면항원 돌연변이 바이러스에 대한 본 발명에 따른 항체의 결합 측정 결과

CH: chronic hepatitis, 환자 100명; LC: liver cirrhosis, 환자 100명; HCC:

hepatocellular carcinoma, 환자 100명

실시예 6. 급성 B형 간염 유도 마우스를 이용한 in vivo 효력 시험 확인

본 실시예에서는 유체역학 주입법(Hydrodynamic injection)으로 HBV DNA를 주입하여 급성 B형간염과 유사한 징후를 나타내도록 만든 C57BL6 마우스에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 본 발명에 따른 항체의 B형 간염 표면항원(HBsAg)에 대한 마우스 혈액 내 중화능을 비교하였다.

사용된 C57BL6 마우스는 Charles Liver Laboratory(MA, USA)로부터 20g 내외의 6주령 암컷 총 20마리를 구입하였으며, 하기 표 7에서와 같이 5마리씩 4군으로 나누었다. 모든 마우스는 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)에 HBV DNA 염기서열이 삽입된 pHBV-MBRI 벡터(Shin et al., Virus Research 119, 146-153, 2006; 도 4 참조) 20 μg을 체중의 9.5% 부피로 마우스 꼬리 정맥을 통해 0.3 ㎖/min의 속도로 주사하여 급성 B형 간염을 유발하였으며, 24시간 후 표 7에 기재된 시험물질 0.2㎖를 마우스의 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 시험물질 주사 전(0시간), 주사 후 24시간 및 48시간에 채혈하여 혈청을 분리하였으며 염소 혈청(goat serum)으로 10배 희석한 후 Genedia HBsAg ELISA 3.0 (녹십자 MS, 한국)을 이용하여 혈중 HBsAg 농도를 측정하였다.

[표 7] B형 간염 표면항원(HBsAg)에 대한 마우스 혈액 내 중화능을 비교하기 위한 실험 디자인

측정결과는 도 5에 나타내었다. 도 5(a)에서 알 수 있는 바와 같이, 정상 바이러스 그룹에서 PBS를 정맥주사한 대조군은 48시간까지 혈중 HBsAg 농도 및 HBV DNA 복제가 최고점에서 유지되는 양상을 나타낸 반면, 상기 항체rHBIG 0.1㎎ 투여군은 24시간 이후 48시간까지 혈중 HBsAg 및 HBV DNA 복제가 완전 중화되어 거의 검출되지 않았다. 또한 도 5(b)에서 알 수 있는 바와 같이, G145R 돌연변이 바이러스 그룹에서도 마찬가지로 PBS를 정맥 주사한 대조군은 48시간까지 혈중 HBsAg 및 HBV DNA 복제 농도가 최고점에서 유지되는 양상을 나타낸 반면, 상기 항체 0.1㎎ 투여군은 24시간 이후 48시간까지 혈중 HBsAg 및 HBV DNA 복제가 완전 중화되어 거의 검출되지 않았다. 따라서 상기 결과로부터 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 본 발명의 항체가 야생형 및 G145R 돌연변이 HBV 표면항원에 대한 중화 효과가 매우 뛰어남을 알 수 있었다. 동일한 그룹에서 각각 HBV DNA 복제 수를 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법을 이용하여 정량한 결과 야생형과 G145R 돌연변이 HBV에서 모두 바이러스 DNA 가 검출되지 않았다. 이는 상기 항체가 야생형 및 G145R 돌연변이 모두에 중화 효과가 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 간이식 후 G145R 변이체에 의해 재발된 환자 유래 G145R HBsAg의 변이체에 대한 결합능 확인

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체의 결합 여부는 HBsAg의 G145R 변이가 일어나 HBV가 재발된 환자 유래 G145R HBsAg 변이체에 대한 결합능을 확인하였다. 상기 발명의 항체를 코팅시킨 96웰 플레이트에 환자의 혈액 샘플을 반응시키고 이를 Genedia HBsAg ELISA 3.0 kit (녹십자 MS, 한국)의 면양 anti-HBsAg/과산화효소 접합액으로 검출하였다. 그 결과 표 8에 기재한 바와 같이 상기 항체가 모든 G145R HBsAg 변이체에 강하게 결합함을 확인하였다.

[표 8] 본 발명에 따른 항체가 환자에서 유래된 모든 HBsAg 변이체에 결합함을 측정한 결과

없음

<110> GREEN CROSS CORPORATION <120> A antibody composition for prevention or treatment of mutant hepatitis B virus infection <130> P120614 <150> KR 12/075,063 <151> 2012-07-10 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of human antibody H chain <400> 1 Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Tyr 20 25 30 Lys Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Arg Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Gly Trp Leu Trp Gly Trp Asp Val Arg Ser Asn Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Asn Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable 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Ser Gly His Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Pro Thr Trp Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of human antibody H chain <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Pro Thr Trp Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial 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85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of human antibody L chain <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Lys Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M3 <400> 11 ctgggaggag ttgggggagg agatt 25 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer POL8 <400> 12 aggatagaac ctagcaggc 19

Claims

서열번호 2의 중쇄 가변영역(VH) 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체를 유효성분으로 포함하는,
HBV 표면항원(HBsAg)의 G145R 돌연변이 또는 HBV DNA 중합효소의 YMDD 돌연변이가 있는 HBV의 감염에 대한 예방 또는 치료용 항체 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항체 조성물은 항 바이러스제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 항 바이러스제는 인터페론, 항-HBV 모노클로날 항체, 항-HBV 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 리머라제 저해제, 및 siRNA 제제 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 YMDD 돌연변이는 M552V 또는 M552I 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이러스는 라미부딘(lamivudine), 아데포비어(adefovir dipivoxil), 또는 HBIG(hepatitis B immuneglobulin)에 내성을 가지는 돌연변이 B형 간염 바이러스(HBV)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항체가 0.1 내지 50㎎/㎖ 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 HBV 표면항원(HBsAg)의 G145R 돌연변이 또는 HBV DNA 중합효소의 YMDD 돌연변이가 있는 HBV의 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 제제.
제7항에 있어서,
상기 약제학적 제제는 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 약제학적 제제.
제7항에 있어서,
상기 약제학적 제제는 정제, 환제, 분제, 새세이 (sachet), 엘릭서 (elixir), 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 및 멸균 분제 중에서 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
제7항에 있어서,
상기 약제학적 제제는 포유동물에 대하여, 0.001 내지 10 ㎎/㎏의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.