ES2712686T3 - Una composición de anticuerpos para la prevención o el tratamiento de una infección por un virus de la hepatitis B mutante - Google Patents

Una composición de anticuerpos para la prevención o el tratamiento de una infección por un virus de la hepatitis B mutante Download PDF

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Abstract

Una composición de anticuerpos para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección por un VHB que tiene una mutación G145R del antígeno de superficie del VHB (AgsHB) o una mutación en YMDD (tirosinametionina- aspartato-aspartato) de la polimerasa de ADN del VHB, comprendiendo la composición, como principio activo, un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

Description

DESCRIPCION
Una composicion de anticuerpos para la prevencion o el tratamiento de una infeccion por un virus de la hepatitis B mutante
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a una composicion para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad causada por un virus mutante de la hepatitis B, que contiene, como principio activo, un virus de la hepatitis B (VHB) mutante, humano, con en el que no actua o se une un inhibidor convencional de replicacion de virus (por ejemplo, lamivudina o adefovir dipivoxil) o una IGHB (inmunoglobulina de la hepatitis B) procedente de plasma.
Tecnica anterior
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus con un genoma de ADN, que pertenece a la familia Hepadnaviridae y produce la hepatitis aguda y cronica. El virus de la hepatitis B (VHB) se clasifica en ocho genotipos que tienen una diferencia de aproximadamente 8 % o mas en la secuencia genica de nucleotidos, o se clasifica en cuatro serotipos (adw, adr, ayw y ayr) basandose en los dos determinantes antigenicos (d/y y w/r) del antigeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB). Aproximadamente 3,5 mil millones de personas en todo el mundo padece infeccion cronica por el virus de la hepatitis B (VHB), y particularmente, en Corea y China, las personas con infeccion cronica por virus de la hepatitis B alcanzan aproximadamente el 5-8 %, y la infeccion por el virus de la hepatitis B (VHB) es la causa principal de hepatopatia y cancer de higado. Las vacunas desarrolladas actualmente pueden ser algo eficaces en la prevencion de la infeccion causada por el virus de la hepatitis B, aunque aun existe una cantidad significativa de pacientes con infeccion cronica con virus de la hepatitis B. La infeccion cronica con virus de la hepatitis B (VHB) produce hepatitis, cirrosis y cancer de higado y la frecuencia de cancer de higado es aproximadamente 300 veces mayor en las personas con virus de la hepatitis B cronica en comparacion con las personas no infectadas. De acuerdo con informes de la OMS, aproximadamente el 80 % del cancer de higado esta producido por hepatitis B cronica.
Los agentes terapeuticos actualmente conocidos para la hepatitis B incluyen los analogos de nucleosidos entre los que se incluyen la lamivudina y el adefovir dipivoxil, que inhiben la replicacion del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) inhibiendo la transcriptasa inversa de la polimerasa del virus de la hepatitis B (polimerasa del VHB). Sin embargo, cuando estos farmacos se administran durante 3 anos, se produce un virus resistente al farmaco, en aproximadamente el 75 % de los pacientes lo que reduce su efecto terapeutico. Debido a este problema, es imposible tratar la infeccion por hepatitis B utilizando solo inhibidores de replicacion de virus. Por esta razon, se intento utilizar estos inhibidores junto con agentes interferones, aunque estos inhibidores no se utilizan actualmente debido a graves efectos secundarios.
Para un fin similar, se considero una preparacion de inmunoglobulina de hepatitis B (IGHB) que comprendia un anticuerpo del virus de la hepatitis B (VHB) aislado de sangre que tenia un titulo alto de anticuerpos. Sin embargo, existen problemas entre los que se incluyen la dificultad para obtener plasma, la posibilidad de que se produzca una infeccion virica, baja actividad, altos costes y problemas similares, debido a que el anticuerpo de la preparacion de IGHB esta aislado y purificado del plasma.
En los ultimos anos, ha habido informes de virus mutantes capaces de impedir dichos anticuerpos, por ejemplo, un mutante que tiene una sustitucion de glicina por arginina en la posicion 145 de la proteina de superficie del virus de la hepatitis B (VHB). Ademas, han aparecido diversos mutantes capaces de impedir los anticuerpos. Por esta razon, es dificil que los agentes terapeuticos convencionales del virus de la hepatitis B muestren efectos terapeuticos satisfactorios.
Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un anticuerpo para el tratamiento del virus de la hepatitis B (VHB), que se una especificamente a un epitopo del virus de la hepatitis B (VHB) en el que no se produzca mutacion, de tal manera que la mutacion no reduzca el efecto terapeutico del anticuerpo.
Divulgacion de la invencion
Es un objeto de la presente invencion, proporcionar una composicion para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad causada por una infeccion por un virus mutante que tiene resistencia a un agente terapeutico convencional que se ha utilizado para la prevencion o el tratamiento del virus de la hepatitis B (en lo sucesivo en el presente documento denominado "VHB").
Para conseguir el objeto anterior, la presente invencion proporciona una composicion de anticuerpos para su uso en la prevencion o el tratamiento de una infeccion por un VHB que tiene una mutacion G145R del antigeno de superficie del VHB (AgsHB) o una mutacion en el motivo YMDD (tirosina-metionina-aspartato-aspartato) de la polimerasa del ADN del VHB, comprendiendo la composicion un anticuerpo que comprende: una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2; y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7.
Otras caractensticas y realizaciones de la presente invencion seran mas evidentes a partir de las siguientes descripciones detalladas y de las reivindicaciones que se adjuntan.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es un diagrama grafico que muestra la actividad neutralizante contra el VHB del anticuerpo de la presente invencion en chimpances.
La FIG. 2 muestra fotograffas (veanse las FIGURAS 2a y 2c) y un diagrama grafico (vease la FIGURA 2b), que muestra los resultados de un ensayo de inmunoprecipitacion realizado para examinar si el anticuerpo de la presente invencion se une al VHB de la sangre de pacientes con hepatitis B.
En la FIG. 2(a), 1: 0,1 gg del anticuerpo de la presente invencion, 2: 0,5 gg del anticuerpo de la presente invencion, 3: 1 gg del anticuerpo de la presente invencion, 4: 5 gg del anticuerpo de la presente invencion y 5:tampon PBS.
En la FIG. 2(c), 1:PBS, 2:tratado con 1 gg del anticuerpo humano contra toxoides tetanicos (TT-F9), 3: tratado con 1 gg de Hepabig, 4: tratado con 1 gg del anticuerpo humanizado contra el antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HuS 10) y 5:tratado con 1 gg del anticuerpo de la presente invencion.
La FIG. 3 es un conjunto de fotograffas que muestran los resultados de un ensayo de tincion inmunohistoqmmica realizado para examinar si los anticuerpos se unen a tejido hepatico humano infectado con el VHB. Especfficamente, la FIG. 3(a) es una fotograffa que muestra que el anticuerpo de la presente invencion se unio con fuerza a tejido hepatico humano infectado con el VHB y la FIG. 3(b) es una fotograffa que muestra que el anticuerpo de control de isotipo negativo no se unio al mismo tejido.
La FIG. 4 es un mapa genetico del virus de la hepatitis B (VHB). El plasmido pHBV1.3-MBRI se construyo insertando una secuencia de 1,3 veces de un gen del VHB (subtipo adr) (n.° de Registro del Gene Bank DQ683578) (gen del VHB cadena arriba del potenciador I de un genoma del VHB y cadena debajo de una region de poliadenilacion) en el sitio de la enzima de restriccion Pmel de pcDNA3.1 (Invitrogen, USA).
La FIG. 5 muestra los resultados de un experimento realizado para examinar la actividad neutralizante de un anticuerpo contra un virus mutante G145R utilizando un modelo hidrodinamico de raton e indica que el antfgeno de superficie y las partfculas vfricas del VHB de tipo silvestre y del VHB mutante G145R estaban eliminados de la sangre del raton.
Mejor modo para llevar a cabo la invencion
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira con mas detalle.
La presente invencion se refiere a una composicion de anticuerpos para su uso en la prevencion o el tratamiento de una infeccion por un VHB que tiene una mutacion G145R del antfgeno de superficie del VHB (AgsHB) o una mutacion en YMDD (tirosina-metionina-aspartato-aspartato) de la polimerasa de ADN del VHB, comprendiendo la composicion, como principio activo, un anticuerpo que comprende: una region variable de cadena pesada (Vh) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera (Vl) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7.
En el presente documento se describe una composicion de anticuerpos para la prevencion o el tratamiento de una infeccion por un VHB que tiene una mutacion G145R del antfgeno de superficie del VHB (AgsHB) o una mutacion en YMDD (tirosina-metionina-aspartato-aspartato) de una polimerasa de ADN del VHB, comprendiendo la composicion un anticuerpo que comprende:
una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada entre una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5; y una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada entre una cualquiera de SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 10.
El anticuerpo de acuerdo con la presente invencion puede ser un anticuerpo contra un antfgeno de superficie del VHB (AgsHB) que tiene una mutacion G145R o una mutacion en el motivo YMDD de la polimerasa de ADN, que se produce a partir de la lfnea celular HBAb-49 (KCLRF-BP-00054). La mutacion G145R es una sustitucion de glicina por arginina en la posicion 145 de la protefna de superficie del VHB, a la que no se une la IGHB procedente de plasma, y el motivo YMDD se localiza en la region C terminal del gen de la polimerasa de ADN del virus de la hepatitis B y tiene una sustitucion de metionina (M) por valina (V) o isoleucina (I) en la posicion 552 de la secuencia de aminoacidos.
La composicion de anticuerpo se utiliza para la prevencion o el tratamiento de infeccion por un virus mutante resistente al agente terapeutico contra el VHB, lamivudina o adefovir dipivoxil.
Ademas, la composicion de anticuerpos puede comprender adicionalmente un agente antivrnco. El agente antivrnco es preferentemente uno o mas seleccionado de entre interferon, anticuerpos monoclonales contra el VHB, anticuerpos policlonales contra el VHB, analogos de nucleosido, inhibidores de la polimerasa de ADN y preparaciones de ARNip, pero sin limitarse a estos.
La composicion de anticuerpos contiene preferentemente el anticuerpo a una concentracion de 0,1-50 mg/ml. La presente invencion tambien proporciona una formulacion farmaceutica que contiene la composicion de anticuerpos como principio activo. La formulacion farmaceutica se administra preferentemente a mamiferos incluyendo seres humanos a una dosis de 0,001-10 mg/kg (de peso corporal).
La composicion farmaceutica puede prepararse en una formulacion farmaceutica de acuerdo con cualquier metodo convencional. En la preparacion de la formulacion, el anticuerpo se mezcla o diluye preferentemente con un transportador, o se incluye en un transportador. Cuando el transportador se utiliza como un diluyente, este puede ser un material solido, semisolido o liquido, que actua como un vehiculo, un excipiente o un medio para el principio activo. Por tanto, las formulaciones pueden estar en forma de un comprimido, una pildora, un polvo, una bolsita, un elixir, una suspension, una emulsion, una solucion, un jarabe, un aerosol, una capsula de gelatina blanda y dura, una solucion inyectable esteril, un polvo esteril envasado y similares.
Como ejemplos de transportadores, excipientes y diluyentes adecuados se incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arabiga, alginatos, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoatos, propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente cargas, agentes antiaglutinantes, agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes aromatizantes, emulsionantes, conservantes y similares. Las composiciones de la invencion pueden formularse de acuerdo con cualquier metodo bien conocido en la tecnica para proporcionar una liberacion rapida, sostenida o retardada del principio activo despues de su administracion a un mamifero.
En un experimento realizado para demostrar la actividad neutralizante contra el VHB del anticuerpo de la presente invencion utilizando chimpances, se observo que los chimpances no estaban infectados con el VHB durante un ano despues de la administracion de una mezcla de VHB y del anticuerpo. En los chimpances utilizados en un grupo de control, se observo que se producian las particulas de virus del VHB y que durante la fase de recuperacion (vease la FIG. 1), se producia un anticuerpo contra el antigeno de superficie del VHB.
Ademas, mediante un ensayo de inmunoprecipitacion se observo que el anticuerpo de la presente invencion tenia una excelente capacidad para unirse al VHB de la sangre del paciente (vease la FIG. 2). Ademas, mediante un ensayo de tincion inmunohistoquimica se observo que el anticuerpo de la presente invencion se unfa con fuerza a tejido hepatico humano infectado con VHB (vease la FIG. 3).
El anticuerpo de acuerdo con la presente invencion puede tener la capacidad de unirse al AgsHB, y neutralizar el AgsHB del VHB resistente a anticuerpos o puede tener la capacidad de escapar a anticuerpos que no pueden inhibirse mediante un inhibidor “convencional" de replicacion de virus (lamivudina o adefovir dipivoxil) o a IGHB procedente de plasma. En un ejemplo de la presente invencion, la capacidad de union del anticuerpo se examino mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando sangre de un paciente que contenia un virus mutante en YMDD que tenia una mutacion en YMDD en la transcriptasa inversa de la polimerasa del virus de la hepatitis B, que tenia resistencia a inhibidores de replicacion de virus. Como resultado, se observo que el anticuerpo se unfa con fuerza a todos los virus mutantes en YMDD (vease la Tabla 5 y la Tabla 6).
La principal caracteristica del anticuerpo de la presente invencion es su capacidad para unirse a, y neutralizar, un mutante que tiene una sustitucion de glicina por arginina en la posicion 145 de la proteina de superficie del VHB, que no puede neutralizarse mediante la IGHB procedente de plasma. Para verificar esta capacidad, se produjo un virus mutante utilizando un modelo hidrodinamico de raton y se examino si el anticuerpo tenia la capacidad de neutralizar el virus mutante producido. Como resultado, se observo que, en la sangre del modelo de raton, tanto el AgsHB como el VHB estaban eliminados (vease la FIG. 5).
Se demostro que el anticuerpo de la presente invencion se unfa a virus de la hepatitis B (VHB) de pacientes que, despues de un trasplante de higado, eran recurrentes, y que todos virus v Hb eran mutantes teniendo una sustitucion de glicina por arginina en la posicion 145 de la proteina de superficie del VHB (vease la Tabla 8).
Los resultados descritos anteriormente sugieren que el anticuerpo de la presente invencion y una composicion que lo comprende, pueden utilizarse de un modo eficaz para la prevencion o el tratamiento de infeccion causada por un virus VHB mutante que tiene resistencia a agentes terapeuticos convencionales. Particularmente, puede observarse que el anticuerpo y la composicion pueden ser muy eficaces cuando se utilizan para la prevencion o el tratamiento de infeccion causada por el VHB mutante G145R o el VHB mutante en YMDD.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira con mayor detalle con referencia a los ejemplos. Para un experto habitual en la materia sera obvio que estos ejemplos solo tienen fines ilustrativos y que no pretenden limitar el alcance de la presente invencion.
Ejemplo 1: experimento realizado con chimpances sobre la capacidad neutralizante del VHB
Para examinar si el anticuerpo de la presente invencion tenia la capacidad de neutralizar el VHB in vivo, se realizo el siguiente experimento.
Un VHB con una CID50 (dosis infecciosa de chimpance al 50 %) de 100 obtenido en la Hepatitis Research Foundation (USA) se coloco en tres tubos. El anticuerpo de la presente invencion, que comprende una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7, se anadio a dos de los tres tubos en cantidades de 0,1 mg y 10 mg, respectivamente, y al tubo restante no se le anadio ningun anticuerpo. En cada uno de los tubos, la mezcla se ajusto a un volumen de 3 ml con tampon PBS (solucion salina tamponada con fosfato), despues de lo cual la mezcla se dejo reaccionar a 37 °C durante 1 hora, y despues a 4 °C durante una noche, seguido de congelacion con nitrogeno liquido, preparando de este modo los materiales de ensayo.
Para un experimento realizado con animales, los materiales de ensayo se administraron por via intravenosa a tres chimpances, respectivamente, que nunca habian estado infectados con el virus VHB (vease la Tabla 1).
Tabla 1
T l 11
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A intervalos de 1 semana durante un periodo que variaba de 1 semana despues de la administracion del anticuerpo a 8 semanas despues de la administracion del anticuerpo y a intervalos de 2 semanas despues de la administracion del anticuerpo, se recogio sangre de los chimpances para medir los indices relacionados con la infeccion por VHB, incluyendo ADN del VHB, AgsHB (antigeno de superficie del VHB), anti HBs (anticuerpo contra el antigeno de superficie del VHB), anti HBc (anticuerpo contra el nucleo del VHB), ALT, AST y similares. Ademas, la seguridad in vivo del anticuerpo se analizo mediante analisis de sangre y orina.
Adicionalmente, se midieron los cambios en el ADN del VHB, AgsHB y anti HBs de los chimpances, y los resultados de las mediciones se muestran graficamente en la FIG. 1.
Como se muestra en las Tablas 2, 3 y 4, como control, en el chimpance 1, se observo infeccion por VHB, mientras que en los chimpances 2 y 3, a los que se administro anticuerpo junto con VHB, no se observo infeccion por VHB, durante todo el periodo experimental. Dichos resultados revelan que el anticuerpo de la presente invencion tiene una excelente capacidad para neutralizar el VHB. Ademas, al examinar la funcion hepatica, en diversos examenes hematologicos, en examenes de orina y similares, no se observaron hallazgos anomalos especiales, lo que sugiere que el anticuerpo es inocuo in vivo.
Tabla 2
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Tabla 3
T l
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Tabla 4
T l 41
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Ejemplo 2: examen mediante inmunoprecipitacion de la capacidad de union del anticuerpo al VHB Mediante inmunoprecipitacion (vease la FIG. 2) se examino si el anticuerpo de la presente invencion, que comprendia una region variable de cadena pesada que tenia la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera que tenia la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7, se unfa al VHB en la sangre de un paciente con hepatitis B (proporcionada por la Ajou University School of Medicine).
(1) Preparacion de sangre de un paciente con hepatitis B
Para retirar la inmunoglobulina de la sangre, se dejaron reaccionar 1.000 pl de una dilucion de sangre con factor 10 de un paciente con hepatitis B en tampon de BSA/PBS al 0,2 % con un anticuerpo de cabra anti IgG humana (especifica de Fc) conjugado con agarosa (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ).
(2) Reaccion de union entre el anticuerpo y el anticuerpo de cabra anti IgG humana conjugado con agarosa Se mezclaron entre si 10 pl del anticuerpo de la presente invencion (0,1, 0,5, 1 y 5 pg), solucion de PBS y 50 pl de un anticuerpo de cabra anti IgG humana conjugado con agarosa (Research Diagnostics) y se dejaron reaccionar con agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora, y despues, a esto, se anadieron 10 mg de inmunoglobulina humana (IV-Globulina-S, Green Cross) y se dejo reaccionar con agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear la parte de union del anticuerpo de cabra anti IgG humana conjugado con agarosa. Para realizar una comparacion, se utilizo 1 pg de cada uno del anticuerpo contra el VHB de sangre (Hepabig), TT-F9 (anticuerpo humano contra el toxoide tetanico) y HuS 10 (anticuerpo humanizado contra el antigeno de superficie del virus de la hepatitis B) de la misma manera que la indicada anteriormente.
(3) Reaccion de union entre anticuerpo de cabra anti IgG humana conjugado con agarosa unido a anticuerpo y la sangre del paciente
Se mezclaron 200 pl de la sangre preparada en el Ejemplo 2-(1) con anticuerpo de cabra anti IgG humana conjugado con agarosa unido al anticuerpo preparado en el Ejemplo 2-(2), y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 hora para permitir que el anticuerpo reaccionara con el VHB de la sangre del paciente.
(4) Examen de precipitacion del VHB
La solucion de reaccion del Ejemplo 2-(3) se centrifugo, el sobrenadante se recogio y el VHB existente en el sobrenadante se midio utilizando un Ensayo de control Cobas Amplicor del VHB (v2.0; Roche Diagnostics, Basel, Suiza).
Despues de la centrifugacion, la agarosa restante se lavo 10 veces con tampon BSA/PBS al 0,2 % y despues se anadio a 100 pl del mismo tampon, y a esto se anadieron 5 pl de SDS al 10 %, 2 pl de EDTA 50 mM y 200 pg de proteasa K (Sigma-Aldrich) y se dejo reaccionar a 55 °C durante 30 minutos. Despues, el sobrenadante se recogio y el ADN se aislo del mismo utilizando un kit de purificacion de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania), despues de lo cual el ADN especifico del VHB se amplifico mediante PCR utilizando una premezcla LiquiMix GM de PCR (Neurotics, Corea), el cebador M3 (SEQ ID NO: 11) y el cebador POL8 (SEQ ID NO: 12). En su interior, la PCR se realizo en las siguientes condiciones: desnaturalizacion inicial a 55 °C durante 5 minutos y despues 35 ciclos de 1 minuto a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de extension final a 72 °C durante 10 minutos. El ADN amplificado se analizo en gel de agarosa al 1,0 %. Como controles, se utilizo el anticuerpo humanizado contra el VHB y el anticuerpo humano contra el toxoide tetanico (Green Cross, Corea). Los resultados del analisis se muestran en la FIGURA 2.
Como se muestra en las FIGS. 2(a) y 2(b), la cantidad de precipitacion del VHB aumentaba a medida que lo hacia la cantidad de anticuerpo utilizada en la reaccion de inmunoprecipitacion, y la cantidad de VHB en el sobrenadante despues de la reaccion de inmunoprecipitacion aumentaba a medida que disminuia la cantidad del anticuerpo. Ademas, la cantidad de precipitacion del VHB aumentaba a medida que aumentaba la cantidad de anticuerpo. Ademas, como se muestra en la FIG. 2(c), cuando se utilizaba la misma cantidad de anticuerpo, el anticuerpo contra el VHB (Hepabig) purificado de sangre no precipitaba con el VHB debido a su baja capacidad para unirse al VHB, mientras que el anticuerpo de la presente invencion precipitaba con VHB debido a su alta capacidad para unirse al VHB.
Ejemplo 3: examen de la actividad de union del anticuerpo al VHB mediante inmunohistoquimica
Mediante inmunohistoquimica, se examino si el anticuerpo de la presente invencion, que comprendia una region variable de cadena pesada que tenia la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera que tenia la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7, se unfa a tejido infectado por VHB.
Un portaobjetos congelado, que tenia tejido de higado humano infectado con VHB (Spring Bioscience, Fremont, CA, USA, catalogo n.° STS-025), se fijo con acetona y se dejo reaccionar en metanol con una dilucion de peroxido de hidrogeno. Despues, el portaobjetos con el tejido se dejo reaccionar con suero normal de conejo, seguido de reacciones secuenciales con avidina y biotina. Despues, el portaobjetos con el tejido se dejo reaccionar con cada uno de: el anticuerpo de la presente invencion y una inmunoglobulina humana de isotipo (anticuerpo de control negativo de isotipo IgG1; Sigma-Aldrich), que se marcaron con biotina utilizando un kit de biotinilacion de inmunosonda (Sigma-Aldrich), y el portaobjetos con el tejido se dejo reaccionar con Complejo de estreptavidina-AB/HRP (Dako, Holanda). Cada uno de los productos de reaccion se tino con tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB) y se realizo tincion con contraste con hematoxilina y los resultados de la tincion se muestran en las FIG. 3(a) y 3(b).
Como puede observarse en las FIG. 3(a) y 3(b), el anticuerpo de control negativo de isotipo (vease la FIG. 3(b)) no se unio al tejido de higado humano infectado con VHB, mientras que el anticuerpo de la presente invencion (vease la FIG. 3(a))) se unio con fuerza al tejido de higado humano infectado con VHB.
Ejemplo 4: examen de la capacidad de unirse al mutante de resistencia al inhibidor de replicacion del VHB Para examinar si el anticuerpo de la presente invencion, que comprendia una region variable de cadena pesada que tenia la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera que tenia una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7 se unfa, muestras de sangre de pacientes (obtenidas en el Hospital St. Mary, Universidad Catolica) se dejaron reaccionar en una placa de 96 pocillos cubierta con el anticuerpo de la presente invencion y la deteccion se realizo en un kit de Genedia AgsHB ELISA 3.0 (Green Cross MS, Corea) utilizando un anticuerpo de cabra anti AgsHB conjugado con peroxidasa. Como resultado, como se muestra en la Tabla 5 a continuacion, el anticuerpo de la presente invencion se unio con fuerza al AgsHB de todos los virus mutantes en YMDD. Por tanto, como puede observarse en la Tabla 5, el anticuerpo de la presente invencion puede unirse a virus mutantes en YMDD en la sangre de pacientes con hepatitis B cronica (HBC).
Tabla 5
T l
Figure imgf000009_0001
Ejemplo 5: examen de la capacidad para unirse a diversos mutantes de AgsHB procedentes de pacientes con hepatitis B cronica, cirrosis hepatica y carcinoma hepatocelular
Se analizaron mutantes de antigeno de superficie del virus (AgsHB) procedentes de 100 pacientes con hepatitis B cronica (HBC), de 100 pacientes con cirrosis hepatica (CH) y de 100 pacientes con carcinoma hepatocelular (CHC) para examinar si el anticuerpo de la presente invencion, que comprendia una region variable de cadena pesada que tenia la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera que tenia la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7, se unfa a todos los virus mutantes. Las muestras de sangre de los pacientes (obtenidas en el Hospital St. Mary, Universidad Catolica) se dejaron reaccionar en una placa de 96 pocillos cubierta con el anticuerpo de la presente invencion y la deteccion se realizo en un kit de Genedia AgsHB ELISA 3.0 (Green Cross MS, Corea) utilizando anticuerpo de cabra anti AgsHB conjugado con peroxidasa. Como resultado, como se muestra en la Tabla 6 a continuacion, el anticuerpo de la presente invencion se unio con fuerza a todos los mutantes de AgsHB procedentes de los pacientes.
Tabla 6
T l 1
Figure imgf000010_0001
Ejemplo 6: examen del efecto in vivo del anticuerpo en ratones con hepatitis B aguda inducida
En este ejemplo, se crearon ratones C57BL6 que mostraban smtomas similares a los de la hepatitis B aguda, inyectando ADN del VHB en los ratones mediante inyeccion hidrodinamica y se midio la capacidad del anticuerpo de la presente invencion, que comprendfa una region variable de cadena pesada y que tenfa la secuencia de aminoacidos de SEQ. ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera que tenfa la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7, para neutralizar el antfgeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB).
Los ratones C57BL6 utilizados, eran ratones hembra de 26 semanas de vida (peso: aproximadamente 20 g; adquiridos en Charles Liver Laboratory, MA, USA) y se dividieron en 4 grupos, consistiendo cada uno de ellos en 5 ratones, como se muestra en la Tabla 7 a continuacion. Se diluyeron 20 pg de un vector pHBV-MBRI (Shin et al., Virus Research 119, 146-153, 2006; vease la FIG. 4) obtenido, insertando en pcDNA3.1 (Invitrogen, USA), una secuencia de nucleotidos de ADN del VHB, a un volumen que correspondfa a un 9,5 % del peso del raton y se inyectaron en la vena de la cola de cada uno de los ratones a una velocidad de 0,3 ml/min para inducir una hepatitis B aguda en los ratones. Despues de 24 horas, se inyectaron 0,2 ml del material de ensayo mostrado en la Tabla 7 a continuacion, en la vena de la cola de cada uno de los ratones. Antes de la inyeccion del material de ensayo (0 h) y a las 24 y 48 horas despues de la inyeccion, se extrajo sangre de los ratones, y el suero se separo de la misma y se diluyo 10 veces con suero de cabra, despues de lo cual, utilizando el kit de Genedia AgsHB ELISA 3.0 (Green Cross MS, Corea), se midio la concentracion del AgsHB en la sangre.
Tabla 7
T l 71
Figure imgf000010_0002
Los resultados de la medicion se muestran en la FIG. 5. Como puede observarse en la FIG. 5(a), en el grupo de control al que se inyecto PBS por vfa intravenosa entre los grupos de virus de tipo silvestre, la concentracion de AgsHB en sangre y la replicacion de ADN del VHB, se mantuvieron a los niveles pico de hasta 48 horas, mientras que en el grupo al que se le administraron 0,1 mg del anticuerpo contra rIGHB, el AgsHB en sangre y la replicacion de ADN del VHB no se detectaron sustancialmente despues de 24 horas hasta 48 horas debido a la neutralizacion completa. Ademas, como puede observarse en la FIG. 5(b), en el grupo de control al que se administro PBS por vfa intravenosa entre los grupos de virus mutantes G145R, la concentracion de AgsHB en sangre y el ADN del VHB se mantuvieron a los niveles pico hasta 48 horas, mientras que en el grupo al que se administraron 0,1 mg del anticuerpo, el AgsHB en sangre y la replicacion del ADN del VHB no se detectaron sustancialmente despues de 24

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion de anticuerpos para su uso en la prevencion o el tratamiento de una infeccion por un VHB que tiene una mutacion G145R del antfgeno de superficie del VHB (AgsHB) o una mutacion en YMDD (tirosinametionina-aspartato-aspartato) de la polimerasa de ADN del VHB, comprendiendo la composicion, como principio activo, un anticuerpo que comprende: una region variable de cadena pesada (Vh) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera (Vl) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7.
2. La composicion de anticuerpos para el uso de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente un agente antivrnco.
3. La composicion de anticuerpos para el uso de la reivindicacion 2, en la que el agente antivrnco comprende uno o mas seleccionados del grupo que consiste en interferon, anticuerpos monoclonales anti VHB, anticuerpos policlonales anti VHB, analogos de nucleosido, inhibidores de polimerasa de ADN, y preparaciones de ARNip.
4. La composicion de anticuerpos para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mutacion YMDD es una mutacion M552V o M552I.
5. La composicion de anticuerpos para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el virus es un virus de la hepatitis B (VHB) mutante, resistente a lamivudina, adefovir dipivoxil o a IGHB (inmunoglobulina de la hepatitis B).
6. La composicion de anticuerpos para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende el anticuerpo a una concentracion de 0,1-50 mg/ml.
7. Una formulacion farmaceutica para su uso en la prevencion o el tratamiento de una infeccion con un VHB que tiene una mutacion G145R del antfgeno de superficie del VHB (AgsHB) o una mutacion YMDD (tirosina-metioninaaspartato-aspartato) de la polimerasa de ADN del VHB, que contiene, como principio activo, la composicion de anticuerpos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. La formulacion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 7, que adicionalmente comprende uno o mas seleccionados del grupo que consiste en transportadores, excipientes y diluyentes.
9. La formulacion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 7 u 8, en la que la formulacion esta en la forma seleccionada del grupo que consiste en un comprimido, una pfldora, un polvo, una bolsita, un elixir, una suspension, una emulsion, una solucion, un jarabe, un aerosol, una capsula de gelatina blanda y dura, una solucion inyectable esteril y un polvo esteril envasado.
10. La formulacion farmaceutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la formulacion farmaceutica se administra a mamfferos a una dosis de 0,001 -10 mg/kg.
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