ES2961039T3 - Terapia combinada contra el VHB - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona métodos para tratar la infección por VHB usando terapias combinadas y kits y composiciones relacionados para su uso. Los componentes de las terapias combinadas incluyen un inhibidor de la expresión del gen del VHB o un agente que reduce la carga antigénica del VHB y un anticuerpo anti-VHB. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia combinada contra el VHB
Declaración referente al Listado de Secuencias
El listado de secuencias asociado a esta solicitud se proporciona en formato texto en lugar de una copa en papel y se incorpora como referencia en esta descripción. El nombre del fichero que contiene el Listado de Secuencias es 930485.401WO_SEQUENCE_LISTING.txt. El fichero de texto pesa 111KB, se creó el 17 diciembre de 2019 y se aporta electrónicamente vía EFS-Web.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En todo el mundo, más de 400 millones de personas padecen una infección crónica por VHB (HBC) y, por tanto, corren un mayor riesgo de desarrollar enfermedades hepáticas graves, como hepatitis crónica, cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular (HCC), lo que provoca unas 600.000 muertes al año. Estudios longitudinales de pacientes con HBC indican que la incidencia acumulada a los 5 años de desarrollar cirrosis oscila entre el 8 y el 20% y la incidencia acumulada a los 5 años de descompensación hepática es de aproximadamente el 20%. La incidencia mundial de HCC ha aumentado y actualmente constituye la tercera causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo (El-Serag H.B., y Rudolph K.L., Gastroenterology 132:2557-76 (2007)).
El VHB es un ADN-virus con envoltura lipídica y una nucleocápside icosaédrica que encierra el genoma viral de ADN y ADN polimerasa. La cápside del<v>H<b>se forma en el citosol de la célula infectada durante el empaquetamiento de un complejo de replicación del pregenoma de ARN y está compuesta por la proteína del núcleo, también conocida como HBcAg, y su variante de escisión, HBeAg. Cuando el ADN viral se disocia de la cápside por la entrada en una nueva célula, puede convertirse en ADN circular cerrado covalentemente (ADNccc), el cual puede permanecer en las células hepáticas tras el tratamiento del VHB y tiene el potencial de reactivar la infección. La envoltura lipídica incluye el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), que se refiere a tres proteínas individuales, S-HBsAg (antígeno pequeño), M-HBsAg (antígeno medio) y L-HBsAg (antígeno grande) que están codificadas por el mismo marco de lectura abierto, pero utilizan codones de inicio diferentes. El HBsAg es el antígeno presente en las vacunas contra la hepatitis B actualmente disponibles. El VHB también codifica la proteína HBx, que inhibe el supresor tumoral p53, promueve la progresión del ciclo celular y aumenta la producción de especies de oxígeno reactivas.
Además de producir viriones, el VHB también provoca la producción de partículas subvirales (SVP), que incluyen la envoltura lipídica de un virión de VHB pero no son competentes para la replicación y típicamente carecen de la nucleocápside. Las SVP pueden producirse con un exceso de hasta 3-4 log en relación a los viriones competentes para la replicación. Los elevados niveles de HBsAg preconfigurados en las SVP pueden agotar la respuesta de las células T específicas para el HBsAg, lo que probablemente es un factor importante que contribuye a la incapacidad del sistema inmunitario de eliminar la infección por VHB durante la hepatitis B crónica (Chisari, F. V., et al., Pathologie Biologie 58:258-66 (2010)).
La evolución natural de la infección CHB incluye cuatro fases consecutivas: (1) fase temprana "inmunotolerante", asociada a niveles elevados de replicación viral y a una mínima inflamación hepática; (2) fase inmunorreactiva, asociada a una inflamación hepática significativa y a una elevación de las aminotransferasas séricas; y algunos pacientes progresan a la fase (3) "no replicativa" o "inactiva", asociada a: seroconversión a anti-HBe; un nivel de viremia indetectable o bajo (por debajo de 2.000 UI/ml medida por ensayos basados en PCR); y la resolución de la inflamación hepática; y, para algunos individuos, (4) la reactivación del virus. La reactivación de la infección por VHB puede estar asociada a la aparición de mutaciones víricas específicas que impiden la producción de HBeAg pero no dificultan la replicación del virus, lo que se conoce como hepatitis B crónica HBeAg-negativa. La hepatitis B crónica HBeAg-negativa (también conocida como hepatitis mutante anti-HBe-positiva o precore) se caracteriza por la fluctuación de los niveles séricos de ADN del VHB y de las aminotransferasas séricas (ALT y AST), así como por una enfermedad hepática progresiva.
El objetivo principal de los tratamientos disponibles para el VHB actualmente es suprimir de forma permanente la replicación del VHB y mejorar la enfermedad hepática. Los objetivos clínicamente importantes a corto plazo son: lograr la seroconversión del HBeAg, normalizar la ALT y la AST séricas, resolver la inflamación hepática y prevenir la descompensación hepática. Un objetivo final a largo plazo del tratamiento del VHB es conseguir una respuesta inmunitaria duradera para prevenir el desarrollo de cirrosis y cáncer de hígado y, por tanto, prolongar la supervivencia. Los tratamientos disponibles actualmente para el VHB no suprimen completamente el virus debido a la persistencia del ADN del VHBc en los núcleos de los hepatocitos infectados. Sin embargo, la eliminación del HBsAg en suero inducida por el tratamiento es un marcador del fin de la infección crónica por VHB y se ha asociado con el mejor resultado a largo plazo.
Aunque las tres proteínas primarias del VHB (HBsAg, HBeAg y HBcAg) tienen propiedades inmunoinhibidoras, el HBsAg constituye la inmensa mayoría de las proteínas del<v>H<b>en la circulación de sujetos infectados por VHB.
Además, mientras que la eliminación (a través de la seroconversión) del HBeAg o la reducción de la viremia sérica no se correlacionan con el desarrollo de un control sostenido de la infección por VHB fuera del tratamiento, la eliminación del HBsAg sérico de la sangre (y la seroconversión) en la infección por VHB es un indicador pronóstico bien reconocido de la respuesta antiviral en el tratamiento, que conducirá al control de la infección por VHB fuera del tratamiento (aunque esto sólo ocurre en una pequeña fracción de los pacientes que reciben inmunoterapia). Así, la eliminación del HBsAg puede ser una estrategia importante para superar la inhibición viral de la función inmunitaria en sujetos con infección por VHB.
Los métodos estándar actuales de tratamiento del VHB incluyen inmunoterapias basadas en interferón o timosina a l y la supresión de la producción viral mediante la inhibición de la polimerasa del VHB. Los inhibidores de la polimerasa del VHB son eficaces para reducir la producción viral, pero tienen un efecto escaso o nulo en la reducción rápida del HBsAg o pueden reducir lentamente el HBsAg con un tratamiento a largo plazo en un número limitado de pacientes (como en el caso del fumarato de disoproxil-tenofovir). La inmunoterapia basada en el interferón puede lograr una reducción tanto de la producción viral como de la eliminación temprana del HBsAg sanguíneo, pero sólo en un pequeño porcentaje de los sujetos tratados. La función generalmente aceptada del HBsAg en la sangre es secuestrar los anticuerpos anti-HBsAg y permitir que las partículas víricas infecciosas escapen a la detección inmunitaria, lo que probablemente sea una de las razones por las que la infección por VHB sigue siendo una enfermedad crónica. Además, HBsAg, HBeAg y HBcAg tienen propiedades inmunoinhibidoras y la persistencia de estas proteínas víricas en la sangre de los pacientes tras la administración de cualquiera de los tratamientos disponibles actualmente para el VHB probablemente tenga un impacto significativo en la prevención de que los pacientes logren el control inmunológico de su infección por VHB.
La WO 2011/047312 A1 describe un oligómero antisentido para reducer la cantidad de ADN del VHB para su uso en el tratamiento de la infección por VHB. El oligómero antisentido puede administrarse en combinación con un agenbte terapéutico adicional, tal como una agente VHB, un agente VHC, un agente quimioterapéutico, un antibiótico, un analgésico, un agente antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un agente antifúngico, un agente antiparasitario, un agente antiemético, un agente antidiarreico y un agente inmunosupresor. El agente VHB adicional puede seleccionarse de interferón alfa-2b, interferón alfa-2a e interferón alfacon-1 (pegilado y no pegilado), ribavirina; un inhibidor de la replicación de ARN de VHB, un segundo oligómero antisentido, una vacuna trapeútica del VHB, una vacuna profiláctica del VHB, lamivudina (3TC), entecavir, tenofovir, telbivudina (LdT), adefovir y una terapia de anticuerpo VHB (monoclonal o policlonal).
La US 2015/166637 A1 describe una composición de anticuerpos para prevenir o tartar una infección por VHB que tienen una mutación G145R del antígeno de superficie de HBV (HBsAg) o una mutación YMDD (tirosina-metioninaaspartato-aspartato) de la ADN polimerasa del VHB. La composición puede comprender además un agente antiviral, que puede seleccionarse del grupo consistente en interferón, anticuerpos monoclonales anti-VHB, anticuerpos policlonales anti-VHB, análogos de nucleósidos, inhibidores de la ADN polimerasa y preparaciones de ARNsi.
Ninguno de los tratamientos actualmente disponibles restablece el control inmunológico del VHB en una gran proporción de pacientes. Por consiguiente, sigue siendo necesario un tratamiento eficaz contra la infección por VHB que pueda inhibir la replicación viral y restaurar el control inmunológico en la mayoría de los pacientes.
SUMARIO
La presente descripción proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una infección crónica por VHB en un sujeto, donde (a) la composición comprende un anticuerpo anti-VHB y el anticuerpo anti-VHB comprende (i) las secuencias de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 44, 45 o 46, y 47, respectivamente; y (ii) las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 48, 49 o 50, y 52 o 51, respectivamente, y (b) al sujeto se le ha administrado previamente un inhibidor de la expresión génica o un agente que reduce la carga antigénica del VHB, donde el inhibidor de la expresión génica o el agente que reduce la carga antigénica del VHB es un ARNsi que inhibe la expresión de un trascrito de VHB, teniendo el ARNsi una hebra sentido que comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO: 7) y una hebra antisentido que comprende 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO: 8), donde
i. a, c, g y u son 2'-O-metiladenosinea-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato y 2'-O-metiluridina-3'-fosfato, respectivamente
ii. Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoroadenosina-3'-fosfato, 2'-fluorocitidina-3'-fosfato, 2'-fluoroguanosina-3'-fosfato y 2'-fluorouridina-3'-fosfato, respectivamente;
iii. (Agn) is un ácido nucleico adenosina-glicol (GNA);
iv. s is una union fosforotioato y
v. L96 is N-[tris(GalNAc-alquil)amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: muestra el esquema de dosificación de un estudio de terapia combinada en un modelo murino de VHB (un modelo AAV-VHB), como se describe en el Ejemplo 1. Se administró Entecavir vía oral una vez al día. Se administró un ARNsi específico para VHB vía subcutánea una vez al inicio del estudio y se administró un anticuerpo anti-VHB de ratón vía intraperitoneal dos veces por semana durante las semanas tres y cuatro del estudio. Se sacrificó un subconjunto de ratones la cuarta semana y el otro la sexta semana del estudio.
Figura 2A: muestra los resultados de ensayos de carga viral de VHB en muestras de suero de ratón, medidos como número de copias de ADN de v Hb de ratones tratados con ARNsi VHB02 (cuadrados, línea continua); un anticuerpo HBC34 de ratón (HBC34v7; a 15 mg/kg) (círculos, línea continua); o solución salina (triángulos, línea continua).
Figura 2B: muestra los resultados de ensayos de la carga viral de VHB en muestras de suero de ratón, medidos como número de copias de ADN de VHB, de ratones tratados con un ARNsi de control y un anticuerpo de control (cuadrados, línea discontinua); entecavir solo ("ETV", rombos, línea discontinua); ARNsi VHB02 y el anticuerpo HBC34v7 de ratón (a 15 mg/kg) (círculos, línea discontinua); o ARNsi VHB02, anticuerpo HBC34v7 (a 15 mg/kg) y entecavir (triángulos, línea continua).
Figura 3a: muestra los niveles de HBsAg medidos en suero de los ratones tras el tratamiento con ARNsi VHB02 (cuadrados, línea sólida); el anticuerpo HBC34v7 de ratón a 15 mg/kg (círculos, línea sólida); o solución salina (triángulos, línea sólida).
Figura 3B: muestra los niveles de HBsAg medidos en suero de los ratones tras el tratamiento con un ARNsi de control y un anticuerpo de control (cuadrados, línea discontinua); entecavir solo ("ETV", rombos, línea discontinua); VHB02 ARNsi y anticuerpo HBC34v7 de ratón (a 15 mg/kg) (círculos, línea discontinua); o VHB02 ARNsi, anticuerpo HBC34v7 de ratón (a 15 mg/kg) y entecavir (triángulos, línea discontinua).
Figura 4: muestra los niveles de anticuerpos libres medidos en suero de los ratones entre el día 14 y el 42 después de la administración del ARNsi. Se representan los siguientes grupos de tratamiento: anticuerpo HBC34v7 de ratón solo (círculos); ARNsi VHB02, anticuerpo HBC34v7 de ratón y entecavir (cuadrados); y ARNsi VHB02 y anticuerpo HBC34v7 de ratón (triángulos).
Figura 5A: muestra los resultados de ensayos de carga viral de VHB en muestras de suero de los ratones, medida como número de copias de ADN de VHB, tras los tratamientos con ARNsi, anticuerpos y/o controles. Los ratones fueron inyectados con el virus AAV/VHB el día 28. A los ratones C57Bl/6 infectados por AAV/VHB se les administró uno de los once tratamientos diferentes en el día 0: (1) un ARNsi específico de v Hb (VHB02, con una hebra antisentido de SEQ ID NO.: 8; véase la descripción, Ejemplo 1); (2)-(3) un anticuerpo anti VHB (HBC24 totalmente murinizado), en una de dos dosis; (4)-(5) ARNsi de VHB02 en una dosis y HBC24 totalmente murinizado en una de dos dosis; (6-9) ARNsi VHB02 en una de las dos dosis y un anticuerpo anti-VHB totalmente murinizado HBC34 (HBC34v35) en una de las tres dosis de anticuerpo; (10) un ARNsi de control y un anticuerpo de control; u (11) sólo PBS, administrado vía intraperitoneal. Los resultados se muestran para los tratamientos 1-5, 10 y 11.
Figura 5B: muestra los resultados de ensayos de carga viral de VHB en muestras de suero de los ratones, medida como número de copias de ADN de VHB, tras los tratamientos con ARNsi, anticuerpos y/o de control. Los ratones fueron inyectados con el virus AAV/VHB el día 28. A los ratones C57Bl/6 infectados por AAV/VHB se les administró uno de los once tratamientos diferentes en el día 0: (1) un ARNsi específico de<v>H<b>(VHB02, con una hebra antisentido de SEQ ID NO.: 8; véase la descripción, Ejemplo 1); (2)-(3) un anticuerpo anti VHB (HBC24 totalmente murinizado), en una de dos dosis; (4)-(5) ARNsi de VHB02 en una dosis y HBC24 totalmente murinizado en una de dos dosis; (6-9) ARNsi VHB02 en una de las dos dosis y un anticuerpo anti-VHB totalmente murinizado HBC34 (HBC34v35), en una de las tres dosis de anticuerpo; (10) ARNsi de control y un anticuerpo de control; u (11) sólo PBS, administrado vía intraperitoneal. Los resultados se muestran para los tratamientos 1 y 6-11.
Figura 6A: muestra los niveles de HBsAg medidos en suero de los ratones tras los tratamientos con ARNsi, anticuerpos y/o controles, como se describe anteriormente para la Figura 5A.
Figura 6B: muestra los niveles de HBsAg medidos en suero de los ratones tras los tratamientos con ARNsi, anticuerpos y/o controles, como se describe anteriormente para la Figura 5B.
Figura 7A: muestra los niveles de HBeAg medidos en suero de los ratones tras los tratamientos con ARNsi, anticuerpos y/o controles, como se describe anteriormente para la Figura 5A.
Figura 7B: muestra los niveles de HBeAg medidos en suero de los ratones tras los tratamientos con ARNsi, anticuerpos y/o controles, como se describe anteriormente para la Figura 5B.
Figura 8: muestra el diseño experimental del estudio descrito en el Ejemplo 3, incluyendo un esquema de dosificación para evaluar el aclaramiento sérico de HBsAG y la inhibición de la entrada viral en un modelo de ratón tras el tratamiento con un anticuerpo anti-VHB y un ARNsi específico de VHB. A ratones SCID infectados con AAV/VHB con hepatocitos humanos primarios trasplantados (n=4 ratones por grupo de tratamiento) se les administró uno de siete tratamientos diferentes: (1) sólo PBS; (2-4) un anticuerpo anti-VHB (HBC34v35 totalmente murinizado), en una de tres dosis, administrado vía intraperitoneal dos veces por semana durante las semanas dos y tres; o (5-7) un ARNsi específico de VHB (VHB02, con una hebra antisentido de SEQ ID NO.: 8; véase la descripción del Ejemplo 1) administrado vía subcutánea una vez al comienzo del estudio y HBC34v35 totalmente murinizado, en una de las tres dosis de anticuerpos, administrado vía intraperitoneal dos veces por semana durante las semanas dos y tres. Los ratones fueron sacrificados la sexta semana.
Figura 9: muestra la concentración de ADN de VHB en suero en ratones SCID con hepatocitos humanos primarios trasplantados tras el tratamiento con PBS (control); anticuerpo HBC34v35; o anticuerpo VHB34v35 y ARNsi VHB02.
Figura 10: muestra la concentración de HBsAg en suero en ratones SCID con hepatocitos humanos primarios trasplantados tras el tratamiento con PBS (control); anticuerpo HBC34v35; o anticuerpo VHB34v35 y ARNsi VHB02.
Figura 11: muestra la concentración de HBeAg en suero en ratones SCID con hepatocitos humanos primarios trasplantados tras el tratamiento con PBS (control); anticuerpo HBC34v35; o anticuerpo VHB34v35 y ARNsi VHB02.
Figura 12: muestra la concentración de HBcrAg en suero en ratones SCID con hepatocitos humanos primarios trasplantados tras el tratamiento con PBS (control); anticuerpo HBC34v35; o anticuerpo VHB34v35 y ARNsi VHB02.
Figura 13: muestra un esquema de tratamiento diseñado para un estudio de fase 2 para evaluar la eficacia de una terapia combinada de ARNsi y anticuerpos en el tratamiento del VHB.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo anti VHB para su uso en el tratamiento de una infección crónica por VHB en un sujeto, donde
1) el anticuerpo anti-VHB comprende (i) las secuencias de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 44, 45 o 46, y 47, respectivamente; y (ii) las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 48, 49 o 50, y 52 o 51, respectivamente, y 2) al sujeto se le ha administrado previamente un inhibidor de la expresión génica o un agente que reduce la carga antigénica del VHB, donde el inhibidor de la expresión génica o el agente que reduce la carga antigénica del VHB es un ARNsi que inhibe la expresión de un transcripto de VHB, teniendo el ARNsi una hebra sentido que comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO: 7) y una hebra antisentido que comprende 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO: 8),
donde
i. a, c, g y u son 2'-O-metiladenosinea-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato y 2'-O-metiluridina-3'-fosfato, respectivamente
ii. Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoroadenosina-3'-fosfato, 2'-fluorocitidina-3'-fosfato, 2'-fluoroguanosina-3'-fosfato y 2'-fluorouridina-3'-fosfato, respectivamente;
iii. (Agn) is un ácido nucleico adenosina-glicol (GNA);
iv. s is una union fosforotioato y
v. L96 is N-[tris(GalNAc-alquil)amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol.
y kits que comprenden
1) Una composición farmacéutica que comprende un agente ARNi cuya diana es un ARNm codificado por un gen de VHB y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el agente ARNi es un ARNsi con una hebra sentido que comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO: 7) y una hebra antisentido que comprende 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO: 8),
donde
i. a, c, g y u son 2'-O-metiladenosinea-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato y 2'-O-metiluridina-3'-fosfato, respectivamente
ii. Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoroadenosina-3'-fosfato, 2'-fluorocitidina-3'-fosfato, 2'-fluoroguanosina-3'-fosfato y 2'-fluorouridina-3'-fosfato, respectivamente;
iii. (Agn) is un ácido nucleico adenosina-glicol (GNA);
iv. s is una union fosforotioato y
v. L96 is N-[tris(GalNAc-alquil)amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol y
2) Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VHB y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el anticuerpo anti-VHB comprende (i) las secuencias de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 44, 45 o 46, y 47, respectivamente; y (ii) las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 48, 49 o 50, y 52 o 51, respectivamente.
En algunas realizaciones, la expresión de al menos un gen del VHB se reduce después de administrar el inhibidor de la expresión del gen de VHB y el anticuerpo anti-VHB se administra al sujeto cuando se reduce la expresión del al menos un gen de VHB.
El inhibidor de la expresión génica de VHB es un agente ARNi que inhibe la expresión de un transcripto de VHB. Específicamente, el agente ARNi es un ARNsi (también denominado aquí "ARN de doble hebra" o "ARNds") que se dirige e inhibe la expresión de un ARNm codificado por el gen X del VHB.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB reconoce los genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J del VHB; y/o es un anticuerpo humano. El anticuerpo anti-VHB se selecciona entre: un anticuerpo HBC34 de tipo silvestre, una variante no natural de un anticuerpo HBC34 como se establece en las reivindicaciones independientes anexas y/o un anticuerpo HBC24.
En algunas realizaciones aquí descritas, el inhibidor de la expresión génica del VHB y el anticuerpo anti-VHB actúan de forma sinérgica para reducir la carga viral y el HBsAg circulante. Esta terapia combinada puede proporcionar una cura funcional para el VHB crónico, y puede permitir la administración de dosis más bajas de anticuerpos, lo que conduce a un potencial reducido de la toxicidad inducida por los anticuerpos.
I. Glosario
Las siguientes secciones proporcionan una descripción detallada de una terapia combinada contra VHB, que incluye: inhibidores de la expresión proteica de VHB; anticuerpos anti VHB; métodos de tratamiento de un sujeto usando un inhibidor de la expresión proteica de VHB en combinación con un anticuerpo anti VHB; y kits relacionados con las terapias combinadas. Aquí, las referencias a terapias de combinación y métodos de tratamiento han de interpretarse como referencias a la composición para su uso en dichas terapias de combinación o métodos de tratamiento tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. Antes de exponer la presente descripción con más detalle, puede ser útil para la comprensión de la misma proporcionar definiciones de ciertos términos que se usarán aquí. A lo largo de la presente descripción se establecen definiciones adicionales.
En la presente descripción, el término "aproximadamente" significa ± 20% del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario.
El término "comprende" significa la presencia de las características, enteros, pasos o componentes indicados en las reivindicaciones, pero no excluye la presencia o la adición de una o más características, enteros, pasos, componentes o grupos de ellos. El término "consistente esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o pasos especificados y a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la invención reivindicada.
Debe entenderse que los términos "un" y "una, uno", tal como se usan aquí, se refieren a "uno o más" de los componentes citados. El uso de la alternativa (por ejemplo "o") debe entenderse como uno, ambos o cualquier combinación de las alternativas y puede emplearse como sinónimo de "y/o". Tal y como se usa aquí, los términos "incluir" y "tener" se usan como sinónimos, términos que, junto con sus variantes, deben interpretarse como no limitantes.
La palabra "esencialmente" no excluye "completamente"; por ejemplo, una composición que está "esencialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "esencialmente" puede omitirse en las definiciones aquí proporcionadas.
El término "enfermedad", tal y como se usa aquí, pretende ser generalmente sinónimo y se usa indistintamente, de los términos "trastorno" y "afección" (como en la afección médica), en el sentido de que todos reflejan una afección anormal del cuerpo humano o animal o de una de sus partes que perjudica el funcionamiento normal, se manifiesta típicamente por signos y síntomas distintivos y hace que el ser humano o el animal tenga una duración o calidad de vida reducida.
Tal y como se usan aquí, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" y sus variaciones se refieren a una molécula, en particular un péptido, oligopéptido, polipéptido o proteína, incluyendo proteínas de fusión, respectivamente, que comprenden al menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico normal o por un enlace peptídico modificado, por ejemplo en el caso de péptidos isostéricos. Por ejemplo, un péptido, polipéptido o proteína puede estar compuesto por aminoácidos seleccionados entre los 20 aminoácidos definidos por el código genético, unidos entre sí por un enlace peptídico normal (polipéptido "clásico"). Un péptido, polipéptido o proteína puede estar compuesto por L-aminoácidos y/o D-aminoácidos. En particular, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" también incluyen "peptidomiméticos", que se definen como análogos de péptidos que contienen elementos estructurales no peptídicos y que son capaces de imitar o antagonizar la(s) acción(es) biológica(s) de un péptido madre natural. Un peptidomimético carece de las características clásicas de los péptidos, como enlaces peptídicos enzimáticos. En particular, un péptido, polipéptido o proteína puede comprender aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos definidos por el código genético, además de estos aminoácidos, o puede estar compuesto por aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos definidos por el código genético. En particular, un péptido, polipéptido o proteína en el contexto de la presente descripción puede también estar compuesto por aminoácidos modificados por procesos naturales, tales como procesos de maduración postraduccionales o por procesos químicos, bien conocidos por el experto en la técnica. Tales modificaciones se detallan ampliamente en la literatura. Estas modificaciones pueden aparecer en cualquier parte del polipéptido: en el esqueleto peptídico, en la cadena de aminoácidos o incluso en los extremos carboxi-terminal o amino-terminal. En particular, un péptido o polipéptido puede estar ramificado tras una ubiquitinación o ser cíclico con o sin ramificación. Este tipo de modificación puede ser resultado de procesos postraduccionales naturales o sintéticos que son bien conocidos por un experto en la técnica. Los términos "péptido", "polipéptido" o "proteína" en el contexto de la presente descripción en particular también incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas modificados. Por ejemplo, las modificaciones de péptidos, polipéptidos o proteínas pueden incluir acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o de un derivado lipídico, fijación covalente de fosfatidilinositol, reticulación covalente o no covalente, ciclización, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, glucosilación, incluida pegilación, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesos proteolíticos, fosforilación, prenilación, racemización, seneloilación, sulfatación, adición de aminoácidos, como arginilación, o ubiquitinación. Tales modificaciones se detallan ampliamente en la literatura (Proteins Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York (1993); Post-translational Covalent Modifications of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter, et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182:626-46 (1990); y Rattan, et al., Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann n Y Acad Sci 663:48-62(1992)). Por consiguiente, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" incluyen, por ejemplo, lipopéptidos, lipoproteínas, glucopéptidos y glucoproteínas.
Tal y como se usa aquí, un "(poli)péptido" comprende una única cadena de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, tal y como se ha explicado anteriormente. Una "proteína", tal como se usa aquí, comprende uno o más, por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (poli)péptidos, es decir, una o más cadenas de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos como se ha explicado anteriormente. En realizaciones particulares, una proteína según la presente descripción comprende 1, 2, 3 o 4 polipéptidos.
El término "recombinante", tal como se usa aquí (por ejemplo, anticuerpo recombinante, proteína recombinante, ácido nucleico recombinante, etc.), se refiere a cualquier molécula (anticuerpo, proteína, ácido nucleico, ARNsi, etc.) que se prepara, expresa, crea o aísla por medios recombinantes y que no es de origen natural. Tal y como se usan aquí, los términos "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se emplean indistintamente y pretenden incluir moléculas de ADN y de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser mono o bicatenaria. En realizaciones particulares, la molécula de ácido nucleico es un ARN de doble hebra.
Tal y como se usan aquí, los términos "célula", "línea celular' y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas estas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria del sujeto y cultivos derivados de ella, sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha examinado en la célula originalmente transformada. Cuando se pretenda hacer una designación distinta, quedará claro por el contexto.
Tal y como se usa aquí, el término "variante de secuencia" se refiere a cualquier secuencia que tenga una o más alteraciones en comparación con una secuencia de referencia, siendo una secuencia de referencia cualquiera de las secuencias enumeradas en el listado de secuencias, es decir las SEQ. ID NO:1 a SEQ ID NO:104. Así, el término "variante de secuencia" incluye variantes de secuencia de nucleótidos y variantes de secuencia de aminoácidos. Para una variante de secuencia en el contexto de una secuencia de nucleótidos, la secuencia de referencia es también una secuencia de nucleótidos, mientras que, para una variante de secuencia en el contexto de una secuencia de aminoácidos, la secuencia de referencia es también una secuencia de aminoácidos. Una "variante de secuencia", tal y como se usa aquí, es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a la secuencia de referencia. La identidad de la secuencia se calcula normalmente con respecto a la longitud completa de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia que se cita en la solicitud), a menos que se especifique lo contrario. El porcentaje de identidad, tal como se menciona aquí, puede determinarse, por ejemplo, mediante BLAST, usando los parámetros por defecto especificados por el NCBI (el Centro Nacional de Información Biotecnológica; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) matriz Blosum 62; penalización por apertura de hueco=1 1 y penalización por extensión de hueco=1]. Una "variante de secuencia" en el contexto de una secuencia de ácido nucleico (nucleótido) tiene una secuencia alterada en la que uno o más de los nucleótidos de la secuencia de referencia se suprimen o se sustituyen, o se insertan uno o más nucleótidos en la secuencia de la secuencia de nucleótidos de referencia. Los nucleótidos se denominan aquí con la designación estándar de una letra (A, C, G o T). Debido a la degeneración del código genético, una "variante de secuencia" de una secuencia de nucleótidos puede dar lugar a un cambio en la respectiva secuencia de aminoácidos de referencia, es decir, a una "variante de secuencia" de aminoácidos o no. En ciertas realizaciones, las variantes de la secuencia de nucleótidos son variantes que no dan lugar a variantes de la secuencia de aminoácidos (es decir, mutaciones silenciosas). Sin embargo, las variantes de secuencia de nucleótidos que dan lugar a mutaciones "no silenciosas" también están dentro del ámbito de aplicación, en particular aquellas variantes de secuencia de nucleótidos que dan lugar a una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia. Una "variante de secuencia" en el contexto de una secuencia de aminoácidos tiene una secuencia alterada donde uno o más de los aminoácidos se suprimen, sustituyen o insertan en comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia. Como resultado de las alteraciones, tal variante de secuencia tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, por cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia, una secuencia variante que no tenga más de 10 alteraciones, es decir, cualquier combinación de supresiones, inserciones o sustituciones, es "al menos un 90% idéntica" a la secuencia de referencia.
Si bien es posible tener sustituciones de aminoácidos no conservadoras, en ciertas realizaciones, las sustituciones son sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares a las del aminoácido correspondiente de la secuencia de referencia. A modo de ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos implican la sustitución de un aminoácido alifático o hidrofóbico, por ejemplo alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro; la sustitución de un aminoácido que contenga hidroxilo, por ejemplo serina y treonina, por otro; la sustitución de un residuo ácido, por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico, por otro; la sustitución de un residuo que contenga amida, por ejemplo asparagina y ácido aspártico, por otro; la sustitución de un residuo que contenga amida, por ejemplo asparagina y glutamina, por otro; la sustitución de un residuo aromático, por ejemplo fenilalanina y tirosina, por otro; la sustitución de un residuo básico, por ejemplo lisina, arginina e histidina, por otro; y la sustitución de un aminoácido pequeño, por ejemplo alanina, serina, treonina, metionina y glicina, por otro.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxi-terminales cuya longitud oscila entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de uno o varios residuos aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen la fusión al extremo N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos de una molécula reporter o una enzima.
A menos que se indique lo contrario, las alteraciones en las variantes de la secuencia no suprimen la funcionalidad de la respectiva secuencia de referencia, por ejemplo, en el presente caso, la funcionalidad de una secuencia de un anticuerpo contra VHB o un inhibidor de la expresión génica de VHB (por ejemplo un ARNsi) para neutralizar suficientemente la infección por VHB o reducir la expresión proteica de v Hb , respectivamente. La dirección para determinar qué nucleótidos y residuos de aminoácidos, respectivamente, pueden ser sustituidos, insertados o eliminados sin eliminar tal funcionalidad puede encontrarse usando programas informáticos bien conocidos en la técnica.
Tal como se usa aquí, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos "derivada de" un ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína designados se refiere al origen del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a esa secuencia o a una parte de la misma, de la que se deriva, por lo que "esencialmente idéntica" incluye variantes de secuencia como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos que se deriva de un péptido o proteína particular se deriva del dominio correspondiente en el péptido o proteína particular. Así, "correspondiente" se refiere en particular a la misma funcionalidad. Por ejemplo, un "dominio extracelular" se corresponde con otro "dominio extracelular" (de otra proteína) o un "dominio transmembrana" se corresponde con otro "dominio transmembrana" (de otra proteína). Las partes "correspondientes" de los péptidos, proteínas y ácidos nucleicos son, por tanto, identificables para un experto en la técnica. Del mismo modo, las secuencias "derivadas de" otra secuencia suelen ser identificables para un experto en la técnica como si tuvieran su origen en la secuencia.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser idéntica al ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del que se deriva). Sin embargo, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína también puede tener una o más mutaciones en relación con el ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del que se deriva), en particular, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser una variante de secuencia funcional como se ha descrito anteriormente del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (de la que se deriva). Por ejemplo, en un péptido/proteína pueden sustituirse uno o más residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos o pueden producirse una o más inserciones o supresiones de residuos de aminoácidos.
Tal como se usa aquí, el término "mutación" se refiere a un cambio en la secuencia de ácido nucleico y/o en la secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia, por ejemplo una secuencia genómica correspondiente. Una mutación, por ejemplo en comparación con una secuencia genómica, puede ser, por ejemplo, una mutación somática (de origen natural), una mutación espontánea, una mutación inducida, por ejemplo inducida por enzimas, productos químicos o radiación, o una mutación obtenida por mutagénesis dirigida al sitio (métodos de biología molecular para realizar cambios específicos e intencionados en la secuencia de ácidos nucleicos y/o en la secuencia de aminoácidos). Así, se entenderá que los términos "mutación" o "mutar" también incluyen la realización física de una mutación, por ejemplo en una secuencia de ácido nucleico o en una secuencia de aminoácidos. Una mutación incluye la sustitución, la supresión y la inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, así como la inversión de varios nucleótidos o aminoácidos sucesivos. Para lograr una mutación en una secuencia de aminoácidos, se puede introducir una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica tal secuencia de aminoácidos para expresar un polipéptido mutado (recombinante). Una mutación puede lograrse, por ejemplo, alterando, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio, un codón de una molécula de ácido nucleico que codifica un aminoácido para dar lugar a un codón que codifica un aminoácido diferente, o sintetizando una variante de la secuencia, por ejemplo conociendo la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido y diseñando la síntesis de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido sin necesidad de mutar uno o más nucleótidos de una molécula de ácido nucleico.
Tal y como se usa aquí, el término "secuencia codificante" se refiere a una molécula de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de un producto proteico. Los límites de la secuencia codificante están generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que suele comenzar con un codón de inicio ATG.
El término "expresión", tal y como se usa aquí, se refiere a cualquier paso implicado en la producción del polipéptido, incluyendo la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional, la secreción o similares.
En algunos aspectos, la presente descripción se refiere al uso de un inhibidor de la expresión génica de VHB. Tal como se usa aquí, un "inhibidor de la expresión génica de VHB" es cualquier agente que da lugar a una reducción al menos parcial de la expresión de un gen de VHB, tal como se manifiesta por una reducción de la cantidad de ARNm del VHB que puede aislarse o detectarse en una primera célula o grupo de células en las que se transcribe un gen de VHB y que han sido tratadas con un inhibidor de la expresión del gen de VHB, de manera que se inhibe la expresión del gen del VHB, en comparación con una segunda célula o grupo de células esencialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no han sido así tratadas (células de control). Específicamente, un inhibidor de la expresión génica de VHB es un agente ARNsi tal como se establece en las reivindicaciones independientes anexas. La expresión génica del VHB puede medirse por métodos conocidos en la técnica. A menos que se indique lo contrario, la "expresión génica del VHB", tal como se usa aquí, se determina usando PCRrt o midiendo la expresión proteica mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o inmunohistoquímica.
En algunos aspectos, la presente descripción se refiere al uso de un agente que reduce la carga antigénica del VHB. Tal como se usa aquí, un "agente que reduce la carga antigénica del VHB" se refiere a cualquier agente que da lugar a una reducción de la cantidad de un antígeno de VHB que puede aislarse o detectarse en una primera célula o grupo de células que ha sido tratado con el agente, en comparación con una segunda célula o grupo de células esencialmente idénticas a la primera célula o grupo de células, pero que no ha sido tratada (células de control). En algunas Específicamente, un agente que reduce la carga antigénica del VHB es un agente de ARNsi tal y como queda establecido en las reivindicaciones independientes anexas. La carga antigénica puede medirse por métodos conocidos en la técnica. A menos que se indique lo contrario, la "carga antigénica de VHB", tal como se usa aquí, se determina midiendo la cantidad de antígeno (por ejemplo HBsAg) mediante ELISA.
La presente descripción proporciona el uso de la composición reivindicada en una terapia combinada para tratar el VHB, donde la composición incluye un anticuerpo anti-VHB. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB se une a la región del bucle antigénico del HBsAg y neutraliza la infección por el virus de la hepatitis B.
Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo" abarca diversas formas de anticuerpos, incluyendo, sin limitarse a ello, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos, fragmentos de unión a antígenos, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes y anticuerpos modificados genéticamente (anticuerpos variantes o mutantes), siempre que se mantengan las propiedades características del anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanos y/o anticuerpos monoclonales. En determinadas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos. En ciertas realizaciones particulares, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos recombinantes. Tal como se usa aquí, los términos "fragmento de unión a antígeno", "fragmento" y "fragmento de anticuerpo" se usan indistintamente para referirse a cualquier fragmento de un anticuerpo de la terapia combinada que conserva la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, un anticuerpo de cadena única, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. Además, el término "anticuerpo", tal como se usa aquí, incluye tanto los anticuerpos como los fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Tal como se usa aquí, un "anticuerpo neutralizador" es aquel que puede neutralizar, es decir, prevenir, inhibir, reducir, impedir o interferir con la capacidad de un patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un huésped. Los términos "anticuerpo neutralizador" y " anticuerpo que neutraliza" o "anticuerpos que neutralizan" se usan aquí indistintamente. Estos anticuerpos pueden usarse solos o en combinación, como agentes profilácticos o terapéuticos, tras una formulación adecuada, en asociación con la vacunación activa, como herramienta de diagnóstico o como herramienta de producción, tal como se describe aquí.
Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M. A., y van de Winkel, J. C, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-74 (2001)). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la provocación con antígenos (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-55 (1993); Jakobovits, A., et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7:3340 (1993)). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en bibliotecas de visualización de fagos (Hoogenboom, H. R., y Winter, G., Mol. Biol. 227:381-88 (1992); Marks, J. D., et al., Mol Biol. 222:581-97 (1991)). Las técnicas de Cole, et al. y Boerner, et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner, P., et al., Immunol. 147:86-95 (1991)). En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan usando la inmortalización mejorada de células EBV-B como se describe en Traggiai, E., et al. (Nat Med. 10(8):871-5 (2004)). El término "anticuerpo humano", tal como se usa aquí, también comprende tales anticuerpos que están modificados, por ejemplo en la región variable, para generar propiedades como las aquí descritas.
Los anticuerpos de la composición para su uso en la terapia combinada pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo IgA, IgG, IgM, es decir, una cadena pesada<k>,<y>o |j); pero, en ciertas realizaciones particulares, los anticuerpos son IgG. Dentro del isotipo IgG, los anticuerpos pueden ser de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En determinadas realizaciones, los anticuerpos son IgG1. Los anticuerpos de la terapia combinada pueden tener una cadena ligera<k>o A. Los anticuerpos específicos del HBsAg del tipo IgG pueden bloquear ventajosamente también la liberación del VHB y el HBsAg de las células infectadas, basándose en la captación independiente del antígeno de IgG a través de los receptores FcRN-IgG en los hepatocitos. Por lo tanto, los anticuerpos específicos del HBsAg del tipo IgG pueden unirse intracelularmente y bloquear así la liberación de viriones de VHB y del HBsAg.
Tal como se usa aquí, el término "región variable" (región variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) denota la porción de una cadena ligera (LC) o de una cadena pesada (HC) de un anticuerpo (normalmente en torno a los 105-120 aminoácidos aminoterminales de una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo maduro) que comprende regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") y regiones marco ("FR") y que participa directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los términos "región determinante de la complementariedad" y "CDR" son sinónimos de "región hipervariable" o "HVR" y son conocidos en la técnica para referirse a secuencias no contiguas de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo que confieren especificidad y/o afinidad de unión al antígeno. En general, hay tres CDR en cada región variable de una proteína de unión a inmunoglobulina; por ejemplo, para los anticuerpos, las regiones VH y VL generalmente comprenden seis CDR (CDRH1, CDRH2, CDR<h>3;<c>D<r>L1, CDRL2, CDRL3). Las secuencias de inmunoglobulina pueden alinearse con un esquema de numeración (por ejemplo, Kabat, EU, International Immunogenetics Information System (IMGT) y Aho), que puede permitir la anotación de posiciones de residuos equivalentes y la comparación de diferentes moléculas mediante la herramienta de software Antigen Receptor Numbering And Receptor Classification (ANARCI) (Bioinformatics 15:298-300 (2016)). Se entenderá que, en ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción puede comprender todo o parte de una cadena pesada (HC), una cadena ligera (LC) o ambas. Por ejemplo, un monómero de anticuerpo IgG intacto de longitud completa incluye típicamente VH, CH1, CH2, CH3, VL y CL.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VHB de la terapia de combinación, según la presente descripción, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo purificado, un anticuerpo de cadena simple, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, o un scFv. Así, los anticuerpos de la terapia combinada pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos recombinantes y/o anticuerpos purificados. La presente descripción también proporciona fragmentos de los anticuerpos, en particular fragmentos que mantienen la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos. Tales fragmentos incluyen anticuerpos de cadena simple, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o scFv. Aunque, en algunos lugares, la presente descripción puede referirse explícitamente a fragmentos de unión a antígeno, fragmentos de anticuerpos, variantes y/o derivados de anticuerpos, tal como se usa aquí el término "anticuerpo" o "anticuerpo de la terapia combinada" incluye todas las categorías de anticuerpos, a saber, fragmentos de unión a antígeno, fragmentos de anticuerpos, variantes y derivados de anticuerpos.
Los fragmentos de los anticuerpos pueden obtenerse a partir de los anticuerpos por métodos que incluyen la digestión con enzimas, como pepsina o papaína, y/o por escisión de enlaces disulfuro mediante reducción química. Alternativamente, pueden obtenerse fragmentos de los anticuerpos por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. La presente descripción también abarca fragmentos Fv de cadena única (scFv) derivados de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de la descripción. Por ejemplo, la descripción incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la descripción. También se incluyen monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera, anticuerpos de cadena pesada de dominio único, anticuerpos de cadena ligera de dominio único, así como anticuerpos de cadena única, por ejemplo Fv de cadena única en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un enlazador peptídico.
Los fragmentos de anticuerpos de la presente descripción pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en una variedad de estructuras como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas scFv pueden sintetizarse para crear un "tri-cuerpo" trivalente o un "tetra-cuerpo" tetravalente. "Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc que da lugar a minicuerpos bivalentes. Además, las secuencias del fragmento de anticuerpo/anticuerpo pueden ser un componente de una molécula multiespecífica en la que las secuencias se dirigen a los epítopos aquí descritos y otras regiones de la molécula multiespecífica se unen a otras dianas. Moléculas multiespecíficas ilustrativas incluyen Fab2 biespecíficos, Fab3 triespecíficos, scFv biespecíficos y diacuerpos (Holliger y Hudson, Nature Biotechnology 9:1126-36 (2005)).
Los anticuerpos según la presente descripción pueden proporcionarse en forma purificada. Típicamente, el anticuerpo estará presente en una composición que está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo donde menos del 90% (en peso), usualmente menos del 60% y más usualmente menos del 50% de la composición está compuesta por otros polipéptidos.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de la presente descripción, en algunas realizaciones, pueden ser multiespecíficos (por ejemplo biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos o similares) y pueden proporcionarse en cualquier formato multiespecífico, como se describe aquí. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción es un anticuerpo multiespecífico, como un anticuerpo biespecífico o triespecífico. Los formatos para anticuerpos biespecíficos se describen en, por ejemplo, Spiess, et al. (Mol. Immunol. 67(2):95 (2015)), y Brinkmann y Kontermann (mAbs 9(2):182-212 (2017)), cuyos formatos biespecíficos y métodos de fabricación incluyen, por ejemplo Engagers de células T biespecíficos (BiTEs), DARTs, ensamblajes Knobs-Into-Holes (KIH), ensamblajes scFv-CH3-KIH, anticuerpos de cadena ligera comunes KIH, TandAbs, Triple Bodies, TriBi Minibodies, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, HCabs tetravalentes, Intracuerpos, CrossMabs, Fabs de doble acción (DAF, por sus siglas en inglés) (dos en uno o cuatro en uno), DutaMabs, DT-IgG, Pares de Carga, brazo de intercambio Fab, SEEDcuerpos, Triomabs, ensambles LUZ-Y, Fcabs, cuerpos-KÁ, Fabs ortogonales, DVD-IgGs, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zycuerpo, y DVI-IgG (cuatro en uno). Un anticuerpo biespecífico o multiespecífico puede comprender un dominio de unión específico del VHB y/o del HDV de la presente descripción en combinación con otro dominio de unión de la presente descripción, o en combinación con un dominio de unión diferente que se une específicamente al VHB y/o al HDV (por ejemplo, a un mismo epítopo o a uno diferente), o con un dominio de unión que se une específicamente a un antígeno diferente.
El término "vacuna", tal como se usa aquí, se entiende típicamente como un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un antígeno o inmunógeno. El antígeno o inmunógeno puede derivarse de cualquier material adecuado para la vacunación. Por ejemplo, el antígeno o inmunógeno puede derivarse de un patógeno, por ejemplo de bacterias o partículas virales, etc. o de un tumor o tejido canceroso. El antígeno o inmunógeno estimula el sistema inmunitario adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptativa. En particular, un "antígeno" o un "inmunógeno" se refiere típicamente a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmunitario (por ejemplo, el sistema inmunitario adaptativo) y que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria específica al antígeno, por ejemplo mediante la formación de anticuerpos y/o células T específicas al antígeno como parte de una respuesta inmunitaria adaptativa. Normalmente, un antígeno puede ser o comprender un péptido o una proteína que puede ser presentada por MHC a las células T.
Las dosis a menudo se expresan en relación con el peso corporal. Así, una dosis que se expresa como [g, mg u otra unidad]/kg (o g, mg, etc.) suele referirse a [g, mg u otra unidad] "por kg (o g, mg, etc.) de peso corporal", aunque no se mencione explícitamente el término "peso corporal".
Tal y como se usa aquí, "virus de la hepatitis B", usado indistintamente con el término "VHB", se refiere al conocido ADN-virus no citopático y hepatotrópico perteneciente a la familia Hepadnaviridae. El genoma del VHB es un ADN circular parcialmente bicatenario con cuatro marcos de lectura superpuestos (que pueden denominarse aquí "genes", "marcos de lectura abiertos" o "transcriptos"): C, X, P y S. La proteína central está codificada por el gen C (HBcAg). El antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) se produce mediante procesamiento proteolítico de la proteína pre-core (pre-C). La ADN polimerasa está codificada por el gen P. El gen S es el que codifica los antígenos de superficie (HBsAg). El gen del HBsAg es un marco de lectura abierto largo que contiene tres codones de "inicio" (a Tg ) en el marco que dan lugar a polipéptidos de tres tamaños diferentes denominados antígenos S grandes, medios y pequeños, pre-S1 pre-S2 S, pre-S2 S o S. Los antígenos de superficie, además de decorar la envoltura del VHB, también forman parte de las partículas subvirales, que se producen en gran exceso en comparación con las partículas del virión, y desempeñan un papel en la tolerancia inmunitaria y en el secuestro de los anticuerpos anti-HBsAg, permitiendo así que las partículas infecciosas escapen a la detección inmunitaria. La función de la proteína no estructural codificada por el gen X no se conoce del todo, pero desempeña un papel en la transactivación transcripcional y la replicación y está asociada al desarrollo de cáncer de hígado. Se han determinado ocho genotipos del<v>H<b>, designados de la A la H, y se han propuesto dos genotipos adicionales, el I y el J, cada uno con una distribución geográfica distinta. El término "VHB" incluye cualquiera de los genotipos del VHB (A a J). La secuencia codificadora completa de la secuencia de referencia del genoma del VHB puede encontrarse, por ejemplo, en los números de acceso del GenBank GI:21326584 y GI:3582357. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas C, X, P y S pueden encontrarse, por ejemplo, en los números de acceso del NCBI YP_009173857.1 (proteína C); YP_009173867.1 y BAA32912.1 (proteína X); YP_009173866.1 y BAA32913.1 (proteína P); y YP_009173869.1, YP_009173870.1, YP_009173871.1 y BAA32914.1 (proteína S). Hay ejemplos adicionales de secuencias de ARNm del VHB disponibles en las bases de datos públicas, por ejemplo, GenBank, UniProt y OMIM. Se puede acceder al International Repository for Hepatitis B Virus Strain Data en http://www.hpabioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.php. El término "VHB", tal y como se usa aquí, también se refiere a las variaciones de la secuencia de ADN del genoma del VHB que se producen de forma natural, es decir, los genotipos A-J y sus variantes.
II. Inhibidores de la expresión de la proteína del VHB y sistemas de suministro
La composición para su uso de acuerdo con la presente descripción se administra a un sujeto al que se ha administrado previamente un inhibidor de la expresión proteico de VHB en una terapia combinada para tratar el VHB. El inhibidor de la expresión génica del VHB es un agente ARNi. Tal como se usa aquí, el término "agente de interferencia de ARN" o "agente ARNi" se refiere a un agente que contiene ARN, tal como se define aquí, y que media la escisión dirigida de un transcripto de ARN a través de una vía de complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). En algunas realizaciones, un agente ARNi como el aquí descrito produce la inhibición de la expresión de un gen del VHB.
Sin querer ceñirse a una teoría concreta, el ARN de doble hebra largo (ARNds) introducido en plantas y células de invertebrados se descompone en ARNsi mediante una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharp, et al., Genes Dev. 15:485 (2001)). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa III, procesa el ARNds en un ARN de interferencia (ARNi) corto de 19-23 pares de bases con los característicos salientes 3' de dos bases (Bernstein, et al., Nature 409:363 (2001)). A continuación, los ARNsi se incorporan a un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) en el que una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNsi, permitiendo que la hebra antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001)). Al unirse al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001)). Los términos "silenciar", "inhibir la expresión de", "regular a la baja la expresión de", "suprimir la expresión de" y similares, en la medida en que se refieren a un gen de VHB, se refieren aquí a la reducción, al menos parcial, de la expresión de un gen de VHB, que se manifiesta por una reducción de la cantidad de ARNm del VHB que puede aislarse o detectarse en una primera célula o grupo de células donde se transcribe un gen del VHB y que han sido tratadas con un inhibidor de la expresión del gen del VHB, de forma que se inhibe la expresión del gen del VHB, en comparación con una segunda célula o grupo de células esencialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no han sido tratadas (células de control). El grado de inhibición puede medirse, por ejemplo, como la diferencia entre el grado de expresión del ARNm en una célula de control menos el grado de expresión del ARNm en una célula tratada. Alternativamente, el grado de inhibición puede darse en términos de una reducción de un parámetro que esté funcionalmente vinculado a la expresión del gen del VHB, por ejemplo la cantidad de proteína codificada por un gen del VHB, o el número de células que muestran un determinado fenotipo, por ejemplo un fenotipo de infección por VHB, como la infección por VHB, la expresión de proteínas de VHB (como el antígeno de superficie de la hepatitis B, HBsAg), o los cambios en la expresión de genes celulares que reflejan la expresión del gen del VHB (por ejemplo la expresión y localización de Smc5/6). El grado de inhibición también puede medirse usando una célula diseñada para expresar un gen reporter que refleje la expresión del ARN del<v>H<b>. En principio, el silenciamiento del gen del VHB puede determinarse en cualquier célula que exprese el gen de VHB, por ejemplo una célula infectada por VHB o una célula modificada para expresar el gen del VHB, y mediante cualquier ensayo apropiado.
El nivel de ARN de VHB expresado por una célula o grupo de células o el nivel de ARN de VHB circulante puede determinarse usando cualquier método conocido en la técnica para evaluar la expresión de ARNm, tal como el método PCRrt proporcionado en el ejemplo 2 de la publicación de solicitud internacional N°WO 2016/077321A1 y la solicitud de patente estadounidense N° US2017/0349900A1. En algunas realizaciones, se determina el nivel de expresión de un gen de VHB (por ejemplo ARN total de VHB, un transcrito de VHB, por ejemplo el transcrito de VHB de 3,5 kb) en una muestra detectando un polinucleótido transcrito, o una parte del mismo, por ejemplo ARN del gen de VHB. El ARN puede extraerse de las células mediante técnicas de extracción de ARN, incluyendo, por ejemplo, extracción con fenol ácido/isotiocianato de guanidina (RNAzol B; Biogénesis), kits de preparación de ARN RNeasy (Qiagen®) o PAXgene (PreAnalytix, Suiza). Los formatos de ensayo típicos que usan la hibridación del ácido ribonucleico incluyen ensayos “run-on” nuclear, RT-PCR, ensayos de protección de ARNasa (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), Northern blott, hibridaciónin situy análisis de microarrays. El ARNm del VHB circulante puede detectarse usando los métodos descritos en la publicación de la solicitud internacional N° WO 2012/177906A1 y en la solicitud de patente estadounidense N° US2014/0275211A1.
Tal y como se usa aquí, "secuencia diana" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de VHB, incluyendo el ARNm que es un producto del procesamiento del ARN de un producto de transcripción primario. La porción diana de la secuencia será al menos lo suficientemente larga como para servir de sustrato para la escisión dirigida por ARNi en esa porción o cerca de ella. Por ejemplo, la secuencia diana tendrá generalmente una longitud de entre 9 y 36 nucleótidos, por ejemplo entre 15 y 30 nucleótidos, incluyendo todos los subintervalos intermedios. Como ejemplos no limitantes, la secuencia diana puede ser de 15-30 nucleótidos, 15-26 nucleótidos, 15-23 nucleótidos, 15-22 nucleótidos, 15 21 nucleótidos, 15-20 nucleótidos, 15-19 nucleótidos, 15-18 nucleótidos, 15-17 nucleótidos, 18-30 nucleótidos, 18 26 nucleótidos, 18-23 nucleótidos, 18-22 nucleótidos, 18-21 nucleótidos, 18-20 nucleótidos, 19-30 nucleótidos, 19 26 nucleótidos, 19-23 nucleótidos, 19-22 nucleótidos, 19-21 nucleótidos, 19-20 nucleótidos, 20-30 nucleótidos, 20 26 nucleótidos, 20-25 nucleótidos, 20-24 nucleótidos,20-23 nucleótidos, 20-22 nucleótidos, 20-21 nucleótidos, 21 30 nucleótidos, 21-26 nucleótidos, 21-25 nucleótidos, 21-24 nucleótidos, 21-23 nucleótidos o 21-22 nucleótidos.
Tal y como se usa aquí, el término "cadena que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que es descrita por la secuencia referida usando la nomenclatura estándar de nucleótidos.
Tal como se usa aquí, y a menos que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos de hibridarse y formar una estructura dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como comprenderá el experto. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones estrictas, donde las condiciones estrictas pueden incluir: 400 mM de NaCl, 40 mM de PIPES de pH 6,4, 1 mM de EDTA, 50°C o 70°C, durante 12-16 horas, seguidas de lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, como las fisiológicamente relevantes que pueden encontrarse dentro de un organismo. El experto podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiado para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias complementarias dentro de un agente de ARNi, por ejemplo dentro de un ARNsi como se describe aquí, incluyen el emparejamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de toda la longitud de una o ambas secuencias de nucleótidos. Tales secuencias pueden denominarse "totalmente complementarias" entre sí en el presente documento. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina aquí "esencialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia, ambas secuencias pueden ser totalmente complementarias o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 5, 4, 3 o 2 pares de bases no coincidentes en la hibridación para un dúplex de hasta 30 pares de bases, conservando la capacidad de hibridar en las condiciones más relevantes para su aplicación final, por ejemplo inhibición de la expresión génica a través de una vía RISC. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos se diseñan para formar, al hibridarse, uno o más salientes monocatenarios, tales salientes no se considerarán como desajustes con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNsi que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es totalmente complementaria al oligonucleótido más corto, puede también denominarse "totalmente complementario" para los propósitos aquí descritos.
Las secuencias "complementarias", tal y como se usan aquí, también pueden incluir o estar formadas en su totalidad por pares de bases no Watson-Crick y/o por pares de bases formadas por nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad de hibridación. Tales pares de bases no Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, el emparejamiento de bases G:U Wobble o Hoogstein.
Los términos "complementario", "totalmente complementario" y "esencialmente complementario" aquí pueden usarse con respecto a la coincidencia de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNi o entre la hebra antisentido de un agente de ARNi y una secuencia diana, como se entenderá por el contexto de su uso.
Tal como se usa aquí, un polinucleótido que es "esencialmente complementario" a al menos parte de un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es esencialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo un ARNm que codifica una proteína de VHB). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos parte de un ARNm de VHB si la secuencia es esencialmente complementaria a una porción no interrumpida del ARNm de VHB.
a. ARNsi
El agente ARNi comprende un ARNsi. El término "ARNsi", tal como se usa aquí, se refiere a un ARNi que incluye una molécula de ARN o un complejo de moléculas que tienen una región dúplex hibridada que comprende dos cadenas de ácido nucleico antiparalelas y esencialmente complementarias, que se denominarán con las direcciones "sentido" y "antisentido" con respecto a un ARN diana. La región dúplex puede ser de cualquier longitud que permita la degradación específica de un ARN diana deseado a través de una vía RISC, pero típicamente oscilará entre 9 y 36 pares de bases de longitud, por ejemplo entre 15 y 30 pares de bases de longitud. Considerando un dúplex entre 9 y 36 pares de bases, el dúplex puede tener cualquier longitud en este intervalo, por ejemplo 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 y cualquier subintervalo entre ellos, incluyendo, pero sin limitarse a, 15-30 pares de bases, 15-26 pares de bases, 15-23 pares de bases, 15-22 pares de bases, 15-21 pares de bases, 15-20 pares de bases, 15-19 pares de bases, 15-18 pares de bases, 15-17 pares de bases, 18-30 pares de bases, 18-26 pares de bases, 18-23 pares de bases, 18-22 pares de bases, 18-21 pares de bases, 18-20 pares de bases, 19-30 pares de bases, 19-26 pares de bases, 19-23 pares de bases, 19-22 pares de bases, 19-21 pares de bases, 20-30 pares de bases, 20-26 pares de bases, 20-25 pares de bases, 20-24 pares de bases, 20-23 pares de bases, 20-22 pares de bases, 20-21 pares de bases, 21-30 pares de bases, 21-26 pares de bases, 21-25 pares de bases, 21-24 pares de bases, 21-23 pares de bases y 21-22 pares de bases. Los ARNsi generados en la célula mediante el procesamiento con enzimas Dicer y similares suelen tener una longitud de entre 19 y 22 pares de bases. El término "ARN de doble hebra" o "ARNds" también se usa aquí como sinónimo para referirse a un ARNsi como el descrito anteriormente.
Una estructura de la región dúplex de un ARNsi monohebra comprende una secuencia que es esencialmente complementaria a una región de un ARN diana. Las dos hebras que forman la estructura dúplex pueden proceder de una única molécula de ARN que tenga al menos una región autocomplementaria o pueden estar formadas por dos o más moléculas de ARN separadas. Cuando la región dúplex se forma a partir de dos hebras de una única molécula, la molécula puede tener una región dúplex separada por una cadena de nucleótidos de una sola hebra (denominada aquí "bucle de horquilla") entre el extremo 3' de una estructura y el extremo 5' de la otra estructura respectiva que forma la estructura dúplex. El bucle de horquilla puede comprender al menos un nucleótido no apareado; en algunas realizaciones el bucle de horquilla puede comprender al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 23 o más nucleótidos no apareados. Cuando las dos hebras esencialmente complementarias de un ARNsi están formadas por moléculas de ARN separadas, no es necesario que tales moléculas estén unidas covalentemente, pero sí pueden estarlo. Cuando las dos cadenas están unidas covalentemente por medios distintos a un bucle de horquilla, la estructura de conexión se denomina "enlazador".
El término "hebra antisentido" o "hebra guía" se refiere a la hebra de un agente de ARNi, por ejemplo un ARNsi, que incluye una región que es esencialmente complementaria a una secuencia diana. Tal como se usa aquí, el término "región de complementariedad" se refiere a la región de la hebra antisentido que es esencialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo a una secuencia diana tal como se define aquí. Cuando la región de complementariedad no es totalmente complementaria a la secuencia diana, los desajustes pueden estar en las regiones internas o terminales de la molécula.
Generalmente, los desajustes más tolerados están en las regiones terminales, por ejemplo dentro de los 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.
El término "hebra sentido" o "hebra pasajera", tal como se usa aquí, se refiere a la hebra de un ARNi que incluye una región que es esencialmente complementaria a una región de la hebra antisentido tal como se define aquí.
El experto en la técnica reconocerá que el término "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" abarca no sólo las moléculas de ARN tal como se expresan o se encuentran en la naturaleza, sino también análogos y derivados de ARN que comprenden uno o más análogos o derivados de ribonucleótidos/ribonucleósidos tal como se describen aquí o se conocen en la técnica. En sentido estricto, un "ribonucleósido" incluye una base nucleósido y un azúcar ribosa y un "ribonucleótido" es un ribonucleósido con una, dos o tres moléculas de fosfato. Sin embargo, los términos "ribonucleósido" y "ribonucleótido" pueden considerarse equivalentes tal y como se usan aquí. El ARNsi se modifica tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas. Sin embargo, las moléculas de ARNsi que comprenden análogos o derivados de ribonucleósidos conservan la capacidad de formar un dúplex. Específicamente, la molécula de ARNsi incluye ribonucleósidos modificados, que son nucleósidos modificados en 2'-O-metilo, tal como se establece en las reivindicaciones anexas. Ejemplos de modificaciones adicionales de ribonucleósidos incluyen: un nucleósido que comprende un grupo fosforotioato 5', un nucleósido terminal unido a un derivado de colesterol o a un grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico, un nucleósido bloqueado, un nucleósido no básico, un nucleósido modificado con 2'-desoxi-2'-fluor, un nucleósido modificado con 2'-amino, un nucleósido modificado con 2'-alquilo, un nucleósido morfolino, un fosforamidato o un nucleósido que comprende una base no natural o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, una molécula de ARN puede comprender al menos dos ribonucleósidos modificados, al menos 20, o más, hasta la longitud total de la molécula de ARNsi. Las modificaciones no tienen por qué ser las mismas para cada una de tal pluralidad de ribonucleósidos modificados en una molécula de ARN.
En algunas realizaciones, un ribonucleósido modificado incluye un desoxirribonucleósido. Por ejemplo, un agente de ARNi puede comprender uno o más desoxinucleósidos, incluyendo, por ejemplo, desoxinucleósido(s) en voladizo, o uno o más desoxinucleósidos dentro de la porción de doble hebra de un ARNsi. Sin embargo, el término "agente de ARNi" tal como se usa aquí no incluye una molécula de ADN completa.
Tal y como se usa aquí, el término "nucleótidos en voladizo" se refiere a al menos un nucleótido no apareado que sobresale de la estructura dúplex de un agente de ARNi, por ejemplo un ARNsi. Por ejemplo, cuando el extremo 3' de una cadena de un ARNsi se extiende más allá del extremo 5' de la otra cadena, o viceversa, hay un nucleótido en voladizo. Un ARNsi puede comprender un voladizo de al menos un nucleótido; alternativamente, el voladizo puede comprender al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos, o más. Un nucleótido en voladizo puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, incluyendo un desoxinucleótido/nucleósido. Lo(s) saliente(s) puede(n) estar en la hebra sentido, en la hebra antisentido o cualquier combinación de ambos. Además, el/los nucleótido(s) de un voladizo puede(n) estar presente(s) en el extremo 5', en el extremo 3' o en ambos extremos tanto de la hebra antisentido como de la hebra sentido de un ARNsi.
En algunas realizaciones, la hebra antisentido de un ARNsi tiene un voladizo de 1-10 nucleótidos en el extremo 3' y/o en el extremo 5'. En algunas realizaciones, la hebra sentido de un ARNsi tiene un voladizo de 1-10 nucleótidos en el extremo 3' y/o en el extremo 5'. En otras realizaciones, uno o más de los nucleótidos en el voladizo se sustituye por un nucleósido tiofosfato.
En algunas realizaciones, al menos un extremo de un ARNsi tiene un voladizo de nucleótidos monocatenario de 1 a 4, generalmente 1 o 2 nucleótidos. Los ARNsi que tienen al menos un voladizo de nucleótidos pueden tener propiedades inhibidoras sorprendentemente superiores en relación con sus homólogos de extremo romo.
Los términos "romo" o "con terminación roma" tal como se usan aquí en referencia a un ARNsi, significan que no hay nucleótidos o análogos de nucleótidos no apareados en un extremo terminal dado de un ARNsi, es decir, que no hay un voladizo de nucleótidos. Uno o ambos extremos de un ARNsi pueden ser romos. Cuando ambos extremos de un ARNsi son romos, se dice que el ARNsi tiene una "terminación roma". Un ARNsi con "extremo romo" es un ARNsi romo en ambos extremos, es decir, que no tiene un voladizo de nucleótidos en ninguno de los extremos de la molécula. En la mayoría de los casos, esta molécula será de doble hebra en toda su longitud.
En ciertas realizaciones, la composición para su uso como se describe aquí se utiliza en una terapia combinada incluyendo uno o más agentes de ARNi que inhiben la expresión génica del VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. En algunas realizaciones, el agente de ARNi incluye moléculas de ácido ribonucleico de interferencia cortas (ARNsi) para inhibir la expresión de un gen de VHB en un mamífero, por ejemplo en un humano infectado por VHB, donde el ARNsi incluye una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen de VHB, y donde la región de complementariedad tiene una longitud de 30 nucleótidos o menos, generalmente de 19 a 24 nucleótidos de longitud, y donde el ARNsi, al entrar en contacto con una célula que expresa el gen de VHB, inhibe la expresión del gen de VHB en al menos un 10%, tal y como se evalúa, por ejemplo, mediante un PCR o un método basado en ADN ramificado (ADNb), o mediante un método basado en proteínas, tal como Western blot. La expresión de un gen de VHB en un cultivo celular o la expresión de un gen celular como sustituto de la expresión del gen de VHB (por ejemplo Smc5/6), como en células COS, células HeLa, hepatocitos primarios, células HepG2, células cultivadas primarias o en una muestra biológica de un sujeto, puede ensayarse midiendo los niveles de ARNm del VHB, por ejemplo mediante un ensayo de ADNb o TaqMan, o midiendo los niveles de proteínas, como por análisis de inmunofluorescencia usando, por ejemplo, técnicas Western Blot o citometría de flujo.
Un ARNsi incluye dos hebras de ARN que son complementarias y se hibridan para formar una estructura dúplex bajo las condiciones en las que se usará el ARNsi. Una hebra de un ARNsi (la hebra antisentido) incluye una región de complementariedad que es esencialmente complementaria, y generalmente totalmente complementaria, a una secuencia diana. La secuencia diana puede derivarse de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen de VHB. La otra hebra (la hebra sentido) incluye una región que es complementaria a la hebra antisentido, de manera que ambas hebras se hibridan y forman una estructura dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Generalmente, la estructura dúplex tiene entre 19 y 24, ambos inclusive, y más generalmente entre 19 y 21 pares de bases de longitud, ambos inclusive. Del mismo modo, la región de complementariedad con la secuencia diana tiene entre 19 y 24, ambos inclusive, y más generalmente entre 19 y 21 nucleótidos de longitud, ambos inclusive. En algunas realizaciones, el ARNsi tiene entre 25 y 30 nucleótidos de longitud, ambos inclusive. Como reconocerá el experto en la técnica, la región diana de un ARN dirigido a la escisión a menudo formará parte de una molécula de ARN más grande, a menudo una molécula de ARNm. En su caso, una "parte" de una diana de ARNm es una secuencia contigua de un ARNm diana de longitud suficiente para ser un sustrato para la escisión dirigida por ARNi (es decir, la escisión a través de una vía RISC). Los ARNsi que tienen dúplex tan cortos como 9 pares de bases pueden, en algunas circunstancias, mediar la escisión de un ARN dirigida de un ARNi
Un experto en la técnica también reconocerá que la región dúplex es una porción funcional primaria de un ARNsi. Así, en algunas realizaciones, en la medida en que se procesa a un dúplex funcional que se dirige a un ARN deseado para la escisión, una molécula de ARN o un complejo de moléculas de ARN que tiene una región dúplex de más de 30 pares de bases es un ARNsi. Por tanto, el experto reconocerá que, en algunas realizaciones, entonces un ARNmi es un ARNsi. En algunas otras realizaciones, un ARNsi no es un ARNmi de origen natural. En algunas realizaciones, un agente de ARNi útil para dirigir la expresión de un gen de VHB no se genera en la diana objetivo por escisión de un ARN de doble hebra más grande.
Un ARNsi como el descrito aquí puede sintetizarse por métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo empleando un sintetizador de ADN automatizado, tal como los disponibles comercialmente, por ejemplo, de Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
En algunas realizaciones, el ARNsi que se dirige e inhibe la expresión de un ARNm del VHB. En algunas realizaciones, el ARNsi se dirige e inhibe la expresión de un ARNm codificado por un genoma de VHB según la secuencia de referencia NCBI NC_003977.2 (número de acceso GenBank GI:21326584) (SEQ ID NO:1). La transcripción del genoma del VHB resulta en ARN policistrónicos, ARN superpuestos, y, por tanto, en algunas realizaciones, un ARNsi de la terapia combinada dirigido a un único gen del VHB puede resultar en una inhibición significativa de la expresión de la mayoría o de todos los transcriptos de VHB. En algunas realizaciones, el ARNm diana del ARNsi puede ser un ARNm codificado por: Gen P, nucleótidos 2309-3182 y 1-1625 de NC_003977.1; gen S (que codifica las proteínas L, M y S), nucleótidos 2850-3182 y 1-837 de NC_003977; proteína X, nucleótidos 1376-1840 de NC_003977; y/o gen C, nucleótidos 1816-2454 de NC_003977.
En algunas realizaciones, el ARNsi se dirige e inhibe la expresión de un ARNm codificado por el gen X del VHB. En algunas realizaciones, el agente de ARNi o ARNsi se dirige a un ARNm codificado por una porción del genoma de VHB que comprende la secuencia GTGTGCACTTCGCTTCAC (SEQ ID NO:2), que corresponde a los nucleótidos 1579-1597 de NC_003977.2 (GenBank N° Acceso GI:21326584) (SEQ ID NO:1).
El experto sabe que los ARNsi que tienen una estructura dúplex de entre 20 y 23 pero específicamente de 21 pares de bases han sido aclamados como particularmente eficaces para inducir la interferencia del ARN (Elbashir, et al., EMBO 20:6877-88 (2001)). Sin embargo, otros han descubierto que estructuras dúplex de ARN más cortas o más largas también pueden ser eficaces. En las realizaciones descritas anteriormente, los ARNsi descritos aquí pueden incluir al menos una hebra de una longitud mínima de 21 nucleótidos.
Además, los ARNsi proporcionados aquí identifican un sitio en un transcripto del gen del VHB que es susceptible a la escisión mediada por RISC. Como tal, la tecnología aquí descrita además caracteriza agentes de ARNi que se dirigen dentro de una de tales secuencias. Como se usa aquí, un agente de ARNi se dirige a un sitio particular de un transcripto de ARN si el ARNi promueve la escisión del transcripto en cualquier lugar dentro de ese sitio particular.
Aunque una secuencia diana suele tener entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, existe una gran variación en la idoneidad de determinadas secuencias en este intervalo para dirigir la escisión de cualquier ARN diana. Varios paquetes de software y las directrices aquí establecidas ayudan a la identificación de secuencias diana óptimas para cualquier diana genética dada, pero también puede adoptarse un enfoque empírico en el que una "ventana" o "máscara" de un tamaño determinado (como ejemplo, 21 nucleótidos) se coloca literal o figurativamente (incluyendo, por ejemplo,in silico)en la secuencia de ARN diana para identificar secuencias en el intervalo de tamaño que pueden servir como secuencias diana. Moviendo la secuencia "ventana" progresivamente un nucleótido hacia arriba o hacia abajo de la ubicación de una secuencia diana inicial se puede identificar la siguiente secuencia diana potencial, hasta que se identifique el conjunto completo de posibles secuencias para cualquier tamaño objetivo seleccionado. Este proceso, junto con la síntesis sistemática y los ensayos de las secuencias identificadas (usando ensayos como los aquí descritos o conocidos en la técnica) para identificar aquellas secuencias que tienen un rendimiento óptimo, pueden identificar aquellas secuencias de ARN que, cuando se dirigen con un agente de ARNi, median la mejor inhibición de la expresión del gen diana. Se contempla que la optimización adicional de la eficacia de la inhibición puede lograrse "recorriendo la ventana" progresivamente un nucleótido aguas arriba o aguas abajo de las secuencias dadas para identificar secuencias con características de inhibición iguales o mejores.
Además, se contempla que, para cualquier secuencia identificada, podría lograrse una mayor optimización añadiendo o suprimiendo sistemáticamente nucleótidos para generar secuencias más largas o más cortas y probando esas y las secuencias generadas recorriendo una ventana del tamaño más largo o más corto hacia arriba o hacia abajo del ARN diana desde ese punto. De nuevo, el acoplamiento de este enfoque para generar nuevas dianas candidatas con la prueba de la eficacia de los agentes de ARNi basados en esas secuencias diana en un ensayo de inhibición como se conoce en la técnica o como se describe aquí puede conducir a mejoras adicionales en la eficacia de la inhibición. Además, tales secuencias optimizadas pueden ajustarse, por ejemplo mediante la introducción de nucleótidos modificados como se describe aquí o como se conoce en la técnica, por adición o cambios en los voladizos u otras modificaciones conocidas en la técnica y/o que no se discuten aquí para optimizar aún más la molécula (por ejemplo, aumentar la estabilidad en suero o la vida media circulante, aumentar la estabilidad térmica, mejorar el suministro transmembrana, dirigirse a una ubicación o tipo de célula particular, aumentar la interacción con las enzimas de la vía de silenciamiento, aumentar la liberación de endosomas, etc.) como inhibidor de la expresión.
Un agente de ARNi como se describe aquí puede contener uno o más desajustes con la secuencia diana. En algunas realizaciones, un agente de ARNi como se describe aquí no contiene más de 3 desajustes. En algunas realizaciones, si la hebra antisentido del agente de ARNi contiene desajustes con una secuencia diana, el área de desajuste no está situada en el centro de la región de complementariedad. En realizaciones particulares, si la hebra antisentido del agente de ARNi contiene desajustes con una secuencia diana, el desajuste se limita a los últimos 5 nucleótidos del extremo 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una hebra de ARN del agente de ARNi de 23 nucleótidos que es complementaria a una región de un gen del VHB, la hebra de ARN no puede contener ninguna discordancia dentro de los 13 nucleótidos centrales. Pueden emplearse los métodos aquí descritos o métodos conocidos en la técnica para determinar si un agente de ARNi que contiene una discordancia con una secuencia diana es eficaz para inhibir la expresión de un gen del VHB. La consideración de la eficacia de los agentes de ARNi con desajustes en la inhibición de la expresión de un gen de VHB es importante, especialmente si se sabe que la región particular de complementariedad del gen de VHB tiene una variación de secuencia polimórfica.
b. Agentes de ARNi modificados químicamente
El ARNsi está modificado químicamente, tal como se establece en las reivindicaciones, para mejorar la estabilidad u otras características beneficiosas. Los ácidos nucleicos que aparecen en la tecnología aquí descrita pueden sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L., et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU.
Las modificaciones incluyen, por ejemplo, (a) modificaciones terminales, por ejemplo modificaciones del extremo 5' (fosforilación, conjugación, enlaces invertidos, etc.), modificaciones del extremo 3' (conjugación, nucleótidos de ADN, enlaces invertidos, etc.), (b) modificaciones de bases, por ejemplo sustitución por bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras o bases que se emparejan con un repertorio ampliado de socios, eliminación de bases (nucleótidos no básicos) o bases conjugadas, (c) modificaciones de azúcar (por ejemplo en la posición 2' o 4') o sustitución del azúcar, así como (d) modificaciones de esqueleto, incluyendo modificación o sustitución de los enlaces fosfodiéster. Ejemplos específicos de compuestos de ARN útiles en las realizaciones aquí descritas incluyen ARN que contienen esqueletos modificados o enlaces internucleósido no naturales. Los ARN que tienen esqueletos modificados incluyen, entre otros, aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los fines de esta descripción, y como a veces se hace referencia en la técnica, los ARN modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto internucleósido también pueden considerarse como oligonucleósidos. En realizaciones particulares, el ARN modificado tendrá un átomo de fósforo en su esqueleto internucleósido.
No es necesario que todas las posiciones de un compuesto dado estén modificadas de manera uniforme y, de hecho, se puede incorporar más de una de las modificaciones mencionadas en un único compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un agente de ARNi. La tecnología aquí descrita también incluye compuestos de agentes de ARNi que son compuestos quiméricos. Los compuestos de agentes de ARNi "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de la presente descripción, son ARNsi que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una de ellas formada por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un ARNsi. Estos agentes de ARNi suelen contener al menos una región en la que el ARN está modificado para conferir al agente de ARNi una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, una mayor captación celular y/o una mayor afinidad de unión al ácido nucleico diana. Una región adicional del agente de ARNi puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por tanto, la activación de la ARNasa H resulta en la escisión del ARN diana, aumentando así en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica por parte del agente de ARNi. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con agentes de ARNi más cortos cuando se usan ARNsi quiméricos en comparación con ARNsi desoxi fosforotioatos que hibridan con la misma región diana. La escisión del ARN diana puede detectarse de forma rutinaria mediante electroforesis en gel y, si es necesario, mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.
Los esqueletos de ARN modificados incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos, incluyendo 3'-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo 3'-amino fosforamidatos y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, análogos de éstos con enlaces 2'-5' y aquellos con polaridad invertida donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas ácidas libres.
Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo arriba mencionados incluyen las Pat. de EE.UU. N° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6. 239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; y Pat. de EE.UU. RE39464.
Los esqueletos de ARN modificados que no incluyen un átomo de fósforo tienen esqueletos formados por enlaces internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y enlaces internucleósido alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósido heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Entre ellos se incluyen aquellos con enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción azúcar de un nucleósido); esqueletos siloxano; esqueletos sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos formacetilo y tioformacetilo; esqueletos metilen formacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos sulfamato; esqueletos metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos sulfonato y sulfonamida; esqueletos amida; y otros con componentes mixtos de N, O, S y CH<2>.
Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen las Patentes de EE.UU. N° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y. 5.677.439; cada una de los cuales proporciona enseñanzas relevantes de tales métodos de preparación.
Algunas realizaciones de la tecnología aquí descrita incluyen ARN con esqueletos fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos de heteroátomos, y en particular -CH<2>-NH-CH<2>-, -CH<2>-N(CH<3>)-O-CH<2>- [conocido como esqueleto metileno (metilimino) o MMI], -CH<2>-O-N(CH3)-CH<2>-, -CH<2>-N(CH3)-N(CH3)-CH<2>- y -N(CH3)-CH<2>-CH<2>- [donde el esqueleto fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH<2>-] de la Pat. de EE.UU. N° 5.489.677, y los esqueletos amida de la Pat. de EE.UU. N° 5.602.240. En algunas realizaciones, los ARN aquí caracterizados tienen esqueletos estructura morfolino de la Pat. de EE.UU. N° 5.034.506.
Los ARN modificados también pueden contener una o más moléculas de azúcar sustituidas. Los ARNsi, aquí caracterizados se modifican tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas, y además pueden incluir uno de las siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquilo-O-alquilo; donde el alquilo, alquenilo y alquinilo, sustituidos o no sustituidos, son alquilo C<1>a C<10>o alquenilo o alquinilo C<2>a C<10>. Modificaciones ilustrativas adecuadas incluyen O[(CH<2>)nO]mCH3, O(CH<2>)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH)nCH3, O(CH<2>)nONH<2>y O(CH<2>)nON[(CH<2>)nCH3)]<2>, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otras realizaciones, los ARNsi incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C<1>a C<10>, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO<2>CH3, ONO<2>, NO<2>, N<3>, NH<2>, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reporter, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un agente de ARNi o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un agente de ARNi y otros sustituyentes con propiedades similares. En algunas realizaciones, la modificación incluye un 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin, et al., Helv. Chim. Acta 78:486-504 (1995)), es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ilustrativa es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH<2>)<2>ON(CH3)<2>, también conocido como 2'-DMAOE y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.
Otras modificaciones ilustrativas incluyen 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2NH2) y 2'-fluor (2'-F). También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones del ARN de un agente de ARNi, en particular en la posición 3' del azúcar del nucleótido terminal 3' o en los ARNsi unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los agentes de ARNi también pueden tener miméticos de azúcar, como moléculas ciclobutilo, en lugar del azúcar pentofuranosilo.
Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcares modificados incluyen las Patentes de EE.UU. N° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920; cada una de las cuales proporciona enseñanzas relevantes para tales métodos de preparación.
Un agente de ARNi también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (a menudo denominadas en la técnica simplemente "base"). Tal y como se usa aquí, nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina 6-metil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y -citosina, 5-propinil-uracilo y -citosina, 6-azo -uracilo, -citosina y -timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, en particular 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina, y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Otras nucleobases incluyen las descritas en las Patatentesde EE.UU. N° 3.687.808, las descritas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine (Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, (2008)); las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering (páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed., John Wiley & Sons (1990)). John Wiley & Sons (1990)), las descritas por Englisch et al. (Angewandte Chemie, International Edición, 30, 613 (199l)), y las descritas por Sanghvi, Y S. (Chapter 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press (1993)). Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos que aparecen en la tecnología descrita aquí. Entre ellas se encuentran pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico a 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, pp.
276-278 (1993)) y son sustituciones de bases de ejemplao, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcares 2'-O-metoxietil.
Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como de otras nucleobases modificadas, incluyen las Patentes N° 3.687.808; 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; y 7.495.088; cada una de los cuales proporciona enseñanzas relevantes para tales métodos de preparación.
El ARN de un agente de ARNi también puede modificarse para incluir uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene una fracción ribosa modificada donde la fracción ribosa comprende un puente adicional que une los carbonos 2' y 4'. Esta estructura "bloquea" la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha demostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNsi aumenta la estabilidad del ARNsi en suero y reduce los efectos fuera de la diana (Elmen, J., et al., Nucleic Acids Research 33(l):439-47 (2005); Mook, O. R., et al., Mol Cane Ther 6(3):833-43 (2007); Grunweller, A., et al., Nucleic Acids Research 31(12):3185-93 (2003)).
Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de nucleótidos de ácido nucleico bloqueados incluyen las siguientes Patente de EE.UU. N° 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; y 7.399.845; cada una de los cuales proporciona enseñanzas pertinentes para tales métodos de preparación.
La terapia combinada incluye un ARNsi que está modificado para incluir uno o más ácidos nucleicos adenosinaglicol ("GNA"). Se puede encontrar una descripción de adenosina-GNA, por ejemplo, en Zhang, et al. (JACS 127(12):4174-75 (2005)).
Las abreviaturas de los monómeros de nucleótidos en las secuencias de ácido nucleico modificadas tal como se usan aquí se proporcionan en la Tabla 1.
Tabla 1. Abreviaturas de los monómeros de nucleótidos usados en la representación de la secuencia del ácido nucleico modificado.Se entenderá que, a menos que se indique lo contrario, estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están mutuamente unidos por enlaces 5'-3'-fosfodiéster
El ARNsi tiene una hebra sentido que comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO:7) y una hebra antisentido que comprende 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO:8).
Así, el inhibidor de la expresión génica de VHB comprende un ARNsi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, donde la hebra sentido comprende la SEQ ID NO.:7 y donde la hebra antisentido comprende la SEQ ID NO:8.
c. Agentes de ARNi conjugados con ligando
En algunas realizaciones, el agente de ARNi incluye modificaciones que implican la vinculación química con el ARN de uno o más ligandos, residuos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular del agente de ARNi. Tales residuos incluyen residuos lipídicos como un grupo colesterol (Letsinger, et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA 86:6553-56 (1989)), ácido cólico (Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Let. 4:1053-60 (1994) ), un tioéter, por ejemplo berilio-S-tritiol (Manoharan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:306-9 (1992); Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Let. 3:2765-70 (1993)), un tiocolesterol (Oberhauser, et al., Nucl. Acids Res.
20:533-38 (1992)), una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o grupos undecilo (Saison-Behmoaras, et al., EMBO J 10:1111-18 (1991); Kabanov, et al., FEBS Lett. 259:327-30 (1990); Svinarchuk, et al. Biochimie 75:49-54 (1993)), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato (Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651-54 (1995); Shea, et al., Nucl. Acids Res. 18:3777-83 (1990)), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan, et al., Nucleosides & Nucleotides 14:969-73 (1995) ) o el ácido adamantano acético (Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651-54 (1995)), una fracción palmitilo (Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta 1264:229-37 (1995)), o una fracción octadecilamina o hexilaminocarbonilcolesterol (Crooke, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:923-37 (1996)).
En algunas realizaciones, un ligando altera la distribución, la dirección o el tiempo de vida de un agente de ARNi al que se incorpora. En algunas realizaciones, un ligando proporciona una afinidad mejorada por una diana seleccionada, por ejemplo una molécula, una célula o un tipo de célula, un compartimento, por ejemplo un compartimento celular u orgánico, un tejido, un órgano o una región del cuerpo, en comparación, por ejemplo, con una especie que no tiene tal ligando. En tales realizaciones, los ligandos no tomarán parte en el emparejamiento dúplex en un ácido nucleico duplexado.
Los ligandos pueden incluir una sustancia natural, como una proteína (por ejemplo seroalbúmina humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); un hidrato de carbono (por ejemplo dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, como un polímero sintético, por ejemplo un poliaminoácido sintético. Entre los ejemplos de poliaminoácidos se encuentran polilisina (PLL), ácido poli L-aspártico, ácido poli L-glutámico, copolímero anhídrido de estireno-ácido maleico, copolímero poli(L-lactida-co-glicolada), copolímero divinil éter-anhídrido málico, copolímero N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli(2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Ejemplos de poliaminas inlcuyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, dendrímero-poliamina, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa-helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos diana, por ejemplo un agente de direccionamiento celular o tisular, por ejemplo una lectina, una glicoproteína, un lípido o una proteína, por ejemplo un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula hepática. Un grupo objetivo puede ser una tirotropina, una melanotropina, una lectina, una glicoproteína, una proteína tensioactiva A, un carbohidrato de mucina, una lactosa multivalente, una galactosa multivalente, una N-acetilgalactosamina, una N-acetilglucosamina multivalente, una fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina o un péptido RGD o un mimético de péptido RGD. Otros ejemplos de ligandos incluyen tintes, agentes intercalantes (por ejemplo acridinas), reticulantes (por ejemplo psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (por ejemplo EDTA), moléculas lipofílicas (por ejemplo colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina), conjugados peptídicos (p. ej. péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ej. PEG-40K), MPEG, [M<p>EG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p. ej. biotina), facilitadores de transporte/absorción (p. ej. aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (p. ej. imidazol, bisimidazol, histamina, grupos imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP y AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo glicoproteínas, o péptidos, por ejemplo moléculas con una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se une a un tipo de célula específica, como una célula hepática. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente y fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 MAP quinasa o un activador de NF-KB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de ARNi en la célula, por ejemplo alterando el citoesqueleto de la célula, por ejemplo alterando los microtúbulos, los microfilamentos y/o los filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.
En otro aspecto, el ligando es una fracción, por ejemplo una vitamina, que es absorbida por una célula diana, por ejemplo una célula hepática. Vitaminas ejemplares incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas ejemplares incluyen vitamina B, por ejemplo ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las células diana, como células hepáticas. También se incluyen HSA y la lipoproteína de baja densidad (LDL).
En algunas realizaciones, un ligando unido a un agente de ARNi como se describe aquí actúa como modulador farmacocinético (PK). Tal como se usa aquí, un "modulador PK" se refiere a un modulador farmacocinético. Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Moduladores PK ilustrativos incluyen colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se sabe que los oligonucleótidos que comprenden un número de enlaces fosforotioato se unen a la proteína sérica, por lo que los oligonucleótidos cortos, por ejemplo oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples enlaces fosforotioato en su esqueleto también son susceptibles de la tecnología aquí descrita como ligandos (por ejemplo como ligandos moduladores PK). Además, los aptámeros que se unen a componentes séricos (por ejemplo proteínas séricas) también son adecuados para su uso como ligandos moduladores PK en las realizaciones aquí descritas.
(i) Conjugados lipídicos. En algunas realizaciones, el ligando o conjugado es un lípido o una molécula basada en lípidos. Un ligando lipídico o basado en lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar la dirección o el transporte hacia una célula o membrana celular diana, y/o (c) puede usarse para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo HSA. Tal lípido o molécula basada en lípidos puede unirse a una proteína sérica, por ejemplo seroalbúmina humana (HSA). Un ligando que se une a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido diana, por ejemplo un tejido diana no renal del cuerpo. Por ejemplo, el tejido diana puede ser el hígado, incluidas las células del parénquima hepático. También pueden usarse como ligandos otras moléculas que pueden unirse a HSA. Por ejemplo, se puede usar neproxina o aspirina.
Un ligando basado en lípidos puede usarse para inhibir, por ejemplo controlar, la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o un ligando basado en lípidos que se une más fuertemente a HSA tendrá menos probabilidades de dirigirse al riñón y, por tanto, menos probabilidades de ser eliminado del organismo. Un lípido o ligando basado en lípidos que se une a HSA con menos fuerza puede usarse para dirigir el conjugado al riñón.
En algunas realizaciones, el ligando de base lipídica se une a HSA. El ligando de base lipídica puede unirse a HSA con una afinidad suficiente como para que el conjugado se distribuya en un tejido no renal. En ciertas realizaciones particulares, la unión del ligando a HSA es reversible.
En algunas otras realizaciones, el ligando basado en lípidos se une a HSA débilmente o no lo hace, de manera que el conjugado se distribuirá al riñón. También se pueden usar otras moléculas que se dirijan a las células renales en lugar o además del ligando basado en lípidos.
(ii) Péptidos y agentes de permeación celular. En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación celular, tal como un agente de permeación celular helicoidal. En algunas realizaciones, el agente es anfipático. Un agente de ejemplo es un péptido tal como tat o antenopedia. Si el agente es un péptido, puede estar modificado, incluyendo peptidilmimético, invertómeros, enlaces no-péptidos o pseudo-péptidos, y uso de D-aminoácidos. En algunas realizaciones, el agente helicoidal es un agente alfa-helicoidal. En ciertas realizaciones particulares, el agente helicoidal tiene una fase lipofílica y otra lipofóbica.
Un "péptido de permeación celular" es capaz de permeabilizar una célula, por ejemplo una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido de permeación celular microbiana puede ser, por ejemplo, un péptido lineal alfa-helicoidal (por ejemplo LL-37 o Ceropin PI), un péptido que contenga enlaces disulfuro (por ejemplo a-defensina, p-defensina o bactenecina), o un péptido que contenga sólo uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo PR-39 o indolicidina).
El ligando puede ser un péptido o un peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado aquí oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a la de un péptido natural. La unión del péptido y los peptidomiméticos a los agentes de ARNi puede afectar a la distribución farmacocinética del ARNi, por ejemplo mejorando el reconocimiento y la absorción celular. El péptido o la fracción peptidomimética puede tener una longitud de entre 5 y 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos.
Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, un péptido catiónico, un péptido anfipático o un péptido hidrofóbico (por ejemplo compuesto principalmente por Tyr, Trp o Phe). La fracción peptídica puede ser un péptido dendrímero, un péptido restringido o un péptido reticulado. En otra alternativa, la fracción peptídica puede incluir una secuencia hidrofóbica de translocación de membrana (MTS). Un péptido hidrofóbico de ejemplo que contiene MTS es RFGF, que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:9). Un análogo de RFGF (por ejemplo la secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:10) que contiene un MTS hidrofóbico también puede ser una fracción de dirección. La fracción peptídica puede ser un péptido de "suministro" que puede transportar grandes moléculas polares, incluyendo péptidos, oligonucleótidos y proteínas, a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha descubierto que las secuencias de la proteína Tat de VIH (GRKKRRQRRPPQ (SEQ ID NO:11) y la proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRMKWK (SEQ ID NO:12) son capaces de funcionar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede estar codificado por una secuencia aleatoria de ADN, como un péptido identificado a partir de una biblioteca de fagos, o una biblioteca combinatoria compuestoone-bead-one(OBOC) (Lam, et al., Nature 354:82-84 (1991)).
Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfipático bipartito, como MPG, que se deriva del dominio del péptido de fusión gp41 de VIH-1 y la NLS del antígeno T grande de SV40 (Simeoni, et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-24 (2003)).
(iii) Conjugados de carbohidratos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos agentes de ARNi aquí descritos comprenden además conjugados de carbohidratos. Los conjugados de carbohidratos pueden ser ventajosos para el suministroin vivode ácidos nucleicos, también como composiciones adecuadas para el uso terapéuticoin vivo.Tal como se usa aquí, "hidrato de carbono" se refiere a un compuesto que es un hidrato de carbonoper seformado por una o más unidades de monosacáridos con al menos 6 átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene, como parte del mismo, una fracción de hidrato de carbono formada por una o más unidades de monosacáridos con al menos seis átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Entre los carbohidratos representativos se encuentran azúcares (mono-, di-, tri- y oligosacáridos que contienen entre 4 y 9 unidades de monosacáridos) y polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa y gomas polisacáridas. Monosacáridos específicos incluyen azúcares C5 y superiores (en algunas realizaciones C5-C8); y los di- y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades de monosacáridos (en algunas realizaciones C5-C8).
En algunas realizaciones, el conjugado de carbohidratos se selecciona del grupo consistente en:
,
Fórmula V,
,
Otro conjugado de carbohidrato representativo para su uso en las realizaciones aquí descritas incluye
En algunas realizaciones, el conjugado de carbohidrato comprende además otro ligando, por ejemplo un modulador PK, un ligando endosomolítico o un péptido de permeación celular.
(iv) Enlazadores. En algunas realizaciones, los conjugados aquí descritos pueden unirse al oligonucleótido agente de ARNi con diversos enlazadores, que pueden ser escindibles o no escindibles.
El término "enlazador" o "grupo enlazador" significa una fracción orgánica que une dos partes de un compuesto.
Los enlazadores comprenden típicamente un enlace directo o un átomo tal como oxígeno o azufre, una unidad como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, o una cadena de átomos, tales como alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclalquenilo, heterociclalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenilarilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquilino, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenilheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterocicloalquilo, alquilheterocicloalquilenilo, alquilheterocicloalquinilo, alquenilheterocicloalquilo, alquenilheterocicloalquenilo, alquenilheterocicloalquinilo, alquinilheterocicloalquinilo, alquinilheteroclilalquenilo, alquinilheteroclalquinilo, alquilario, alquenilario, alquinilario, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo y alquinilhereroarilo, cuyos uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados en O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o heterociclo sustituido o no sustituido; donde R8 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido. En ciertas realizaciones, el enlazador tiene entre 1-24 átomos, entre 4-24 átomos, entre 6-18 átomos, entre 8-18 átomos o entre 8-16 átomos.
Un grupo de enlace escindible es aquel que es suficientemente estable fuera de la célula, pero que al entrar en una célula diana se escinde para liberar las dos partes que el enlazador mantiene unidas. En ciertas realizaciones, el grupo de enlace escindible se escinde al menos 10 veces o al menos 100 veces más rápido en la célula diana o bajo una primera afección de referencia (que puede seleccionarse, por ejemplo, para imitar o representar las condiciones intracelulares) que, en la sangre de un sujeto o bajo una segunda afección de referencia (que puede seleccionarse, por ejemplo, para imitar o representar las condiciones encontradas en sangre o en suero).
Los grupos de enlace escindibles son susceptibles a los agentes de escisión, por ejemplo el pH, el potencial redox o la presencia de moléculas degradantes. En general, los agentes de escisión son más frecuentes o se encuentran en niveles o actividades más altos dentro de las células que en el suero o la sangre. Ejemplos de tales agentes degradantes incluyen: agentes redox que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad de sustrato, incluyendo, por ejemplo, enzimas oxidativas o reductoras o agentes reductores tales como mercaptanos, presentes en las células, que pueden degradar un grupo de enlace escindible redox por reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un ambiente ácido, por ejemplo aquellos que resultan en un grupo de enlace escindible, p. ej. aquellos que resultan en un pH cinco o inferior; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo de enlace escindible por ácido actuando como ácido general, peptidasas (que pueden ser específicas de sustrato) y fosfatasas. Un grupo de enlace escindible, como un enlace disulfuro, puede ser sensible al pH. El pH del suero humano es de 7,4, mientras que el pH intracelular medio es ligeramente inferior, oscilando entre 7,1 y 7,3 aproximadamente. Los endosomas tienen un pH más ácido, en el intervalo de 5,5-6,0 y los lisosomas tienen un pH aún más ácido, alrededor de 5,0. Algunos enlazadores tendrán un grupo de enlace escindible que se escinde a un pH particular, liberando así el lípido catiónico del ligando dentro de la célula o en el compartimiento deseado de la célula.
Un enlazador puede incluir un grupo de enlace escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo de enlace escindible incorporado en un enlazador puede depender de la célula a la que se dirige. Por ejemplo, los ligandos dirigidos al hígado pueden unirse a los lípidos catiónicos mediante un enlazador que incluya un grupo éster. Las células hepáticas son ricas en esterasas y, por tanto, el enlazador se escindirá más eficazmente en las células hepáticas que en los tipos de células que no son ricas en esterasas. Otros tipos celulares ricos en esterasas son las células del pulmón, la corteza renal y los testículos.
Los enlazadores que contienen enlaces peptídicos pueden usarse cuando se dirigen a tipos celulares ricos en peptidasas, como las células hepáticas y los sinoviocitos.
En general, la idoneidad de un grupo de enlace escindible candidato puede evaluarse probando la capacidad de un agente degradante (o afección) para escindir el grupo de enlace candidato. Puede ser deseable probar también la capacidad del grupo de enlace escindible candidato para resistir la escisión en la sangre o cuando está en contacto con otro tejido no objetivo. Así, se puede determinar la susceptibilidad relativa a la escisión entre una primera y una segunda afección, donde la primera se selecciona para que sea indicativa de la escisión en una célula objetivo y la segunda se selecciona para que sea indicativa de la escisión en otros tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo sangre o suero. Las evaluaciones pueden llevarse a cabo en sistemas libres de células, en células, en cultivos celulares, en cultivos de órganos o tejidos o en animales enteros. Puede ser útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones libres de células o de cultivo y confirmarlas mediante evaluaciones posteriores en animales enteros. En ciertas realizaciones, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos 2, al menos 4, al menos 10 o al menos 100 veces más rápido en la célula (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre o el suero (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones extracelulares).
Una clase de grupos de enlace escindibles son los grupos de enlace escindibles redox que se escinden al reducirse u oxidarse. Un ejemplo de grupo de enlace escindible por reducción es un grupo de enlace disulfuro (-S-S-). Para determinar si un grupo de enlace escindible candidato es un "grupo de enlace escindible por reducción" adecuado o, por ejemplo, si es adecuado para usarse con una fracción de ARNi particular y un agente de dirección particular, se pueden usar los métodos aquí descritos. Por ejemplo, un candidato puede evaluarse mediante incubación con ditiotreitol (DTT) u otro agente reductor usando reactivos conocidos en la técnica que imitan la tasa de escisión que se observaría en una célula, por ejemplo una célula diana. Los candidatos también pueden evaluarse en condiciones que se seleccionan para imitar las condiciones de la sangre o el suero. En algunas realizaciones, los compuestos candidatos se escinden como máximo en un 10% en sangre. En ciertas realizaciones, los compuestos candidatos útiles se degradan al menos 2, al menos 4, al menos 10 o al menos 100 veces más rápido en la célula (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre (o en condicionesin vitroseleccionadas para imitar las condiciones extracelulares). La velocidad de escisión de los compuestos candidatos puede determinarse mediante ensayos cinéticos enzimáticos estándar en condiciones elegidas para imitar los medios intracelulares y comparadas con las condiciones elegidas para imitar los medios extracelulares.
Los grupos de enlace escindibles basados en fosfato son escindidos por agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de agente que escinde los grupos fosfato en las células son enzimas tales como las fosfatasas en las células. Ejemplos de grupos de enlace basados en fosfatos son -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -SP(O)(ORk)-O-, -O- P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -OP(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. En ciertas realizaciones, los grupos de enlace a base de fosfato se seleccionan entre: -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, - OP(0)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, - O- P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -SP(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S- y -O-P(S)(H)-S-. En realizaciones particulares, el grupo de enlace fosfato es -O-P(O)(OH)-O-. Estos candidatos pueden evaluarse usando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Los grupos de enlace escindibles por ácido son grupos de enlace que se escinden en condiciones ácidas. En algunas realizaciones, los grupos de enlace escindibles por ácido se escinden en un entorno ácido con un pH de aproximadamente 6,5 o inferior (por ejemplo aproximadamente 6,0, 5,5, 5,0 o inferior) o por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, los orgánulos específicos de pH bajo, como los endosomas y los lisosomas, pueden proporcionar un entorno de escisión para los grupos de enlace escindibles por ácido. Ejemplos de grupos de enlace escindibles por ácido incluyen hidrazonas, ésteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles por ácido pueden tener la fórmula general -C=N-, C(O)O, o -OC(O). En algunas realizaciones, el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, un grupo alquilo sustituido o un grupo alquilo terciario como dimetilpentilo o t-butilo. Estos candidatos pueden evaluarse mediante métodos análogos a los descritos anteriormente.
Los grupos de enlace escindibles basados en ésteres son escindidos por enzimas tales como esterasas y amidasas en las células. Ejemplos de grupos de enlace escindibles basados en ésteres incluyen los ésteres de los grupos alquileno, alquenileno y alquileno. Los grupos de enlace escindibles por ésteres tienen la fórmula general -C(O)O-o -OC(O)-. Estos candidatos pueden evaluarse mediante métodos análogos a los descritos anteriormente.
Los grupos de enlace escindibles basados en péptidos son escindidos por enzimas tales como peptidasas y proteasas en las células. Los grupos de enlace escindibles basados en péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para producir oligopéptidos (por ejemplo dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos. Los grupos escindibles basados en péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-). El grupo amida puede formarse entre cualquier alquileno, alquenileno o alquenileno. Un enlace peptídico es un tipo especial de enlace amida que se forma entre aminoácidos para producir péptidos y proteínas. El grupo de escisión basado en péptidos se limita generalmente al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos que dan lugar a péptidos y proteínas y no incluye todo el grupo funcional amida. Los grupos de enlace escindibles basados en péptidos tienen la fórmula general - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, donde RA y RB son los grupos R de dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos pueden ser evaluados mediante métodos análogos a los descritos anteriormente.
Conjugados de carbohidratos con enlazadores representativos incluyen
(Fórmula XXIII),
rmua ,
(Fórmula XXX),
donde cuando uno de X o Y es un oligonucleótido, el otro es un hidrógeno.
En ciertas realizaciones de las composiciones y métodos, un ligando es uno o más derivados de "GalNAc" (N-acetilgalactosamina) unidos a través de un enlazador ramificado bivalente o trivalente. Por ejemplo, en algunas
En algunas realizaciones, la hebra sentido del ARNsi se conjuga con un ligando unido al extremo 3' de la hebra sentido a través de un enlazador como se muestra en la siguiente estructura:
donde X es O o S.
En algunas realizaciones, la terapia combinada incluye un ARNsi que se conjuga con un enlazador ramificado bivalente o trivalente seleccionado del grupo de estructuras mostradas en cualquiera de las fórmulas (XXXI) -(XXXIV):
donde:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente para cada ocurrencia 0-20 y donde la unidad de repetición puede ser la misma o diferente;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T5B y T5C son c cada aparición, ausente, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH<2>NH, o CH<2>O;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B y Q5C son independientemente para cada ocurrencia ausente, alquileno o alquileno sustituido donde uno o más metilenos pueden ser interrumpidos o terminados por uno o más de O, S, S(O), SO<2>, N(RN), C(R')=C(R''), C<e>C o C(O);
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B y R5C son cada uno independientemente para cada ocurrencia ausente, NH,
o heterociclilo;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando; es decir, cada uno independientemente para cada ocurrencia un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido;
y Ra es H o cadena lateral de aminoácido. Los derivados de GalNAc conjugados trivalentes son particularmente útiles para usarse con agentes de ARNi para inhibir la expresión de un gen diana, como aquellos de fórmula (XXXIV):
Fórmula XXXIV
donde L5A, L5B y L5C representan un monosacárido, como el derivado GalNAc.
Ejemplos de grupos enlazadores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que conjugan derivados de GalNAc incluyen las estructuras citadas anteriormente como fórmulas I, VI, X, IX y XII.
Patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de conjugados de ARN incluyen las Patentes de EE.UU. N° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717.
5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802 5.138.045 5.414.077 5.486.603 5.512.439 5.578.718 5.608.046 4.587.044 4.605.735 4.667.025 4.762.779 4.789.737 4.824.941 4.835.263 4.876.335 4.904.582 4.958.013 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.245.022 5.254.469 5.258.506 5.262.536 5.272.250 5.292.873 5.317.098 5.371.241 5.391.723 5.416.203 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; y 7.037.646; cada uno de las cuales proporciona enseñanzas relevantes a tales métodos de preparación.
En ciertos casos, el ARN de un agente de ARNi puede estar modificado por un grupo no ligando. Se han conjugado varias moléculas no ligando con agentes de<a>R<ní>para mejorar la actividad, la distribución celular o la captación celular de los agentes de ARNi y los procedimientos para realizar tales conjugaciones están disponibles en la literatura científica. En estos elementos no ligandos se han incluido elementos lipídicos, como colesterol (Kubo, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 365(1):54-61 (2007); Letsinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U<s>A 86:6553 (1989)), ácido cólico (Manoharan, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:1053 (1994)), un tioéter, por ejemplo hexil-S-tritiol (Manoharan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:306 (1992); Manoharan, et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 3:2765 (1993)), un tiocolesterol (Oberhauser, et al., Nucl. Acids Res. 20:533 (1992)), una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o residuos undecilo (Saison-Behmoaras, et al., EMBO J. 10:111 (1991); Kabanov, et al., FEBS Lett.
259:327 (1990); Svinarchuk, et al., Biochimie 75:49 (1993)), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651 (1995); Shea, et al., Nucl. Acids Res. 18:3777 (1990)), una poliamina o una cadena polietilenglicol (Manoharan, et al., Nucleosides & Nucleotides 14:969 (1995)) o ácido adamantanoacético (Manoharan, et al., Tetrahedron Lett.
36:3651 (1195)), una fracción de palmitilo (Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta 1264:229 (1995)) o una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:923 (1996)).
Los protocolos típicos de conjugación implican la síntesis de un ARN que lleva un enlazador amino en una o más posiciones de la secuencia. A continuación, el grupo amino se hace reaccionar con la molécula que se va a conjugar usando reactivos de acoplamiento o activación adecuados. La reacción de conjugación puede llevarse a cabo con el ARN todavía unido al soporte sólido o tras la escisión del ARN, en fase de solución. La purificación del conjugado de ARN mediante HPLC suele proporcionar el conjugado puro.
d. Suministro de agentes de ARNi
"Introducir en una célula", cuando se refiere a un agente de ARNi, significa facilitar o efectuar la captación o absorción en la célula, como entienden los expertos en la materia.
La absorción o captación de un agente de ARNi puede producirse mediante procesos celulares activos o difusivos sin ayuda o con agentes o dispositivos auxiliares. El agente de ARNi también puede ser "introducido en una célula", cuando la célula forma parte de un organismo vivo. En tal caso, la introducción en la célula incluirá la entrega al organismo. Por ejemplo, para la administraciónin vivo,un agente de ARNi puede inyectarse en un tejido o administrarse sistémicamente. La administraciónin vivotambién puede realizarse mediante un sistema de administración de beta-glucano, como se describe en las Patentes de EE.UU. N° 5.032.401 y 5.607.677 y en la Publicación de EE.UU. N° 2005/0281781, que proporcionan enseñanzas pertinentes a tales sistemas de entrega. La introducciónin vitroen una célula incluye métodos conocidos en la técnica, como electroporación y lipofección. A continuación, se describen otros métodos o se conocen en la técnica.
El suministro de un agente de ARNi a un sujeto que lo necesita puede lograrse de varias maneras. El suministroin vivopuede realizarse directamente, administrando una composición que comprenda un agente de ARNi, por ejemplo un ARNsi, a un sujeto. Alternativamente, el suministro puede realizarse indirectamente mediante la administración de uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del agente de ARNi. Estas alternativas se discuten más adelante.
En general, cualquier método de administración de una molécula de ácido nucleico puede adaptarse para usarse con un agente de ARNi (véase, por ejemplo, Akhtar S. y Julian RL., Trends Cell. Biol. 2(5):139-44 (1992) y WO94/02595, que proporcionan enseñanzas pertinentes a tales métodos de administración). Hay tres factores que son particularmente importantes para administrar con éxito un agente de ARNiin vivo: (a) la estabilidad biológica de la molécula administrada, (2) la prevención de efectos inespecíficos y (3) la acumulación de la molécula administrada en el tejido objetivo. Los efectos inespecíficos de un agente de ARNi pueden minimizarse mediante la administración local, por ejemplop por inyección directa o implantación en un tejido (como ejemplo, en un tumor) o la administración tópica del preparado. La administración local en un lugar de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limita la exposición del agente a los tejidos sistémicos que de otro modo pueden verse dañados por el agente o que pueden degradar el agente y permite administrar una dosis total más baja del agente de ARNi. Varios estudios han demostrado el éxito de la eliminación de productos génicos cuando se administra un agente de ARNi localmente. Por ejemplo, la administración intraocular de un ARNsi de VEGF mediante inyección intravítrea en monos cynomolgus (Tolentino, M. J., et al., Retina 24:132-38 (2004)) y las inyecciones subretinianas en ratones (Reich, S. J., et al., Mol. Vis. 9:210-16 (2003)) demostraron prevenir la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular relacionada con la edad. Además, la inyección intratumoral directa de un ARNsi en ratones reduce el volumen del tumor (Pille, J., et al., Mol. Ther.
11:267-74 (2005)) y puede prolongar la supervivencia de ratones portadores de tumores (Kim, W. J., et al., Mol. Ther. 14:343-50 (2006); Li, S., et al., Mol. Ther. 15:515-23 (2007)). El ARN de interferencia también ha demostrado tener éxito con la administración local en el SNC mediante inyección directa (Dorn, G., et al., Nucleic Acids 32:e49 (2004); Tan, P. H., et al., Gene Ther. 12:59-66 (2005); Makimura, H., et al., BMC Neurosci. 3:18 (2002); Shishkina, G. T., et al., Neuroscience 129:521-28 (2004); Thakker, E. R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-75 (2004); Akaneya,Y., et al., J. Neurophysiol. 93:594- 602 (2005)) y a los pulmones por administración intranasal (Howard, K. A., et al., Mol. Ther. 14:476-84 (2006); Zhang, X., et al., J. Biol. Chem. 279:10677-84 (2004); Bitko, V., et al., Nat. Med. 11:50-55 (2005)). Para administrar un agente de ARNi de forma sistémica para el tratamiento de una enfermedad, el ARN puede modificarse o suministrarse alternativamente mediante un sistema de administración de fármacos; ambos métodos actúan evitando la rápida degradación del ARNsi por endo y exonucleasasin vivo.La modificación del ARN o del vehículo farmacéutico también puede permitir que la composición del agente de ARNi se dirija al tejido objetivo y evitar efectos indeseables fuera del mismo. Los agentes de ARNi pueden modificarse mediante la conjugación química con grupos lipofílicos, como colesterol, para mejorar la captación celular y evitar su degradación. Por ejemplo, un agente de ARNi dirigido contra ApoB conjugado con una fracción de colesterol lipofílica se inyectó sistémicamente en ratones y dio lugar a la eliminación del ARNm de la apoB tanto en el hígado como en el yeyuno (Soutschek, J., et al., Nature 432:173-78 (2004)). En otras realizaciones, el agente de ARNi puede administrarse mediante sistemas de administración de fármacos, como nanopartículas, dendrímeros, polímeros, liposomas o un sistema de administración catiónico. Los sistemas de administración catiónicos cargados positivamente suelen facilitar la unión de un agente de ARNi (cargado negativamente) y mejorar las interacciones en la membrana celular cargada negativamente para permitir la captación eficiente de un agente de ARNi por la célula. Los lípidos catiónicos, los dendrímeros o los polímeros pueden unirse a un ARNi o inducirse para formar una vesícula o micela (véase, por ejemplo, Kim, S,H., et al., Journal of Controlled Release 129(2):107-16 (2008)) que encierra un agente de ARN. La formación de vesículas o micelas evita además la degradación del agente de<a>R<ní>cuando se administra sistémicamente. Los métodos para fabricar y administrar complejos de agentes de ARNi catiónicos están dentro de las capacidades de un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sorensen, D. R., et al., J. Mol. Biol 327:761-66 (2003); Verma, U. N., et al., Clin. Cancer Res. 9:1291-1300 (2003); Arnold, A. S. et al., J. Hypertens. 25:197-205 (2007). Algunos ejemplos de sistemas de administración de fármacos útiles para la administración sistémica de agentes de ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, D. R., et al. (2003),supra;Verma, U. N., et al., (2003), supra), Oligofectamine, "partículas lipídicas de ácido nucleico sólido" (Zimmermann, T. S., et al., Nature 441:111-14 (2006)), cardiolipina (Chien, P. Y., et al., Cancer Gene Ther. 12:321-28 (2005); Pal, A., et al., Int J. Oncol. 26: 1087-91 (2005)), polietilenimina (Bonnet, M. E., et al., Pharm. Res. 25(12):2972-82; Aigner, A., J. Biomed. Biotechnol. 2006(4):71659 (2006)), péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S., Mol. Pharm. 3:472-487 (2006)) y poliamidoaminas (Tomalia, D. A., et al., Biochem. Soc. Trans. 35:61-7 (2007); Yoo, H., et al., Pharm. Res. 16:1799-1804 (1999)).
Tal como se usa aquí, el término "SNALP" se refiere a una partícula estable de ácido nucleico-lípido. Una SNALP representa una vesícula lipídica que recubre un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico tal como un agente de ARNi o un plásmido del que se transcribe un agente de ARNi. SNALP se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos de América N° US2006/0240093 y US2007/0135372, y en la publicación de solicitud internacional N° WO 2009/082817. Estas solicitudes proporcionan enseñanzas pertinentes a las SNALP.
En algunas realizaciones, un ARNi forma un complejo con ciclodextrina para su administración sistémica. Los métodos de administración y las composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas se pueden encontrar en la Patente US N° 7.427.605, que proporciona enseñanzas pertinentes a tales composiciones y métodos. En algunas realizaciones, un gen que codifica un ARNi se codifica y expresa a partir de un vector de expresión. Ejemplos de vectores y su uso en la administración de ARNi se describen en la solicitud de patente de EE.U<u>. N° US2017/0349900A1, en particular en sus ejemplos.
e. Composiciones y formulaciones farmacéuticas de agentes de ARNi
Además, se proporcionan aquí kits que comprenden composiciones farmacéuticas que contienen un agente de ARNi, es decir el ARNsi como se describe aquí, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que contiene el agente de ARNi también es útil en la terapia combinada aquí descrita con la composición para su uso como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas, para tratar la infección por VHB. Tales composiciones farmacéuticas se formulan en función del modo de administración. Por ejemplo, las composiciones pueden formularse para la administración sistémica vía parenteral, por ejemplo vía intravenosa (IV), o para la administración directa en el parénquima cerebral, por ejemplo por infusión en el cerebro, tal como por infusión de bomba continua.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" es un disolvente farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la forma de administración prevista, para proporcionar el volumen, la consistencia, etc. deseados cuando se combina con un ácido nucleico y los demás componentes de una composición farmacéutica determinada. Vehículos o excipientes típicamente aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen agentes aglutinantes (por ejemplo almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos, hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio); disgregantes (p. ej. almidón, glicolato de almidón sódico); y agentes humectantes (p. ej. laurilsulfato de sodio).
También pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables para la administración no parenteral que no reaccionen de forma perjudicial con los ácidos nucleicos para formular las composiciones de la presente descripción. Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.
Las formulaciones para la administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en disolventes comunes como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionen de forma nociva con los ácidos nucleicos.
Excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que contienen un agente de ARNi, es decir el ARNsi aquí descrito, se administran en dosis suficientes para inhibir la expresión de un gen de VHB. En general, una dosis adecuada de un agente de ARNi estará en el intervalo de 0,001 a 200,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día y más típicamente en el intervalo de 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, un ARNsi puede administrarse a 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg por dosis única. La composición farmacéutica puede administrarse una vez al día o el agente de ARNi puede administrarse como dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso usando una infusión continua o un suministro a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el agente de ARNi contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente menor para lograr la dosis diaria total. La unidad de dosificación también puede conformarse para su administración a lo largo de varios días, por ejemplo usando una formulación convencional de liberación sostenida que proporciona una liberación sostenida del ARNi durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica y son particularmente útiles para el suministro de agentes en un sitio particular, como podría usarse con los agentes de la tecnología descrita aquí. En esta realización, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
El efecto de una dosis única sobre el nivel de expresión de un gen de VHB puede ser duradero, de manera que las dosis posteriores se administran a intervalos no superiores a 3, 4 o 5 días o a intervalos no superiores a 1, 2, 3 o 4 semanas.
El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo necesarios para tratar eficazmente un sujeto, incluyendo la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos. Las estimaciones de las dosis efectivas y las semividasin vivode los agentes de ARNi individuales abarcados por la tecnología aquí descrita pueden realizarse usando metodologías convencionales o basándose en ensayosin vivousando un modelo animal apropiado, como se describe en otra parte del presente documento.
Existen modelos de ratón para el estudio de la infección por VHB y tales modelos pueden usarse para ensayarin vivoel ARNi, así como para determinar una dosis eficaz para reducir la expresión génica de VHB.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones y formulaciones farmacéuticas aquí descritas puede ser tópica (p. ej. mediante un parche transdérmico), pulmonar (p. ej. mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso con un nebulizador); intratraqueal; intranasal; epidérmica y transdérmica; oral; o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal e intramuscular; la administración subdérmica (por ejemplo mediante un dispositivo implantado); o la administración intracraneal (por ejemplo mediante la administración intraparenquimatosa, intratecal o intraventricular).
En ciertas realizaciones, un agente de ARNi usado en una terapia combinada para el tratamiento del VHB como se describe aquí se administra vía subcutánea.
En algunas realizaciones, los agentes de ARNi pueden administrarse de manera que se dirijan a un tejido concreto, como el hígado (por ejemplo, hepatocitos del hígado).
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas y espesantes. También pueden ser útiles cubiertas preservativas y guantes. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas donde los ARNsi caracterizados por la tecnología descrita aquí están mezclados con un agente de suministro tópico, como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lípidos y liposomas adecuados incluyen los neutros (por ejemplo dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, distearolifosfatidilcolina), los negativos (por ejemplo dimiristoilfosfatidiloglicerol DMPG) y los catiónicos (por ejemplo dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA). Los agentes de ARNi pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con ellos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los agentes de ARNi pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un alquil éster C<1-20>(por ejemplo isopropilmiristato IPM), un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Ejemplos de formulaciones tópicas se describen en detalle en la Patente US N° 6.747.014, que proporciona enseñanzas pertinentes a tales formulaciones tópicas.
Las vesículas, tales como liposomas, pueden usarse en las formulaciones para la administración de los agentes de ARNi aquí descritos; tal formulación puede tener propiedades deseables, como la especificidad y la duración de la acción. Como se usa aquí, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas.
Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada por un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición que se va a administrar. Los liposomas catiónicos pueden tener la ventaja de poder fusionarse con la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse tan eficazmente con la pared celular, pueden ser captados por los macrófagosin vivo.Las consideraciones importantes en la preparación de las formulaciones liposomales son la carga superficial de los lípidos, el tamaño de las vesículas y el volumen acuoso de los liposomas.
En algunas realizaciones, la administración liposomal puede tener las siguientes propiedades ventajosas: ser altamente deformable y capaz de atravesar los finos poros de la piel; biocompatibilidad y biodegradabilidad; capacidad de incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y lípidos; capacidad de proteger los fármacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc, Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245 (1998)); para la administración tópica, la reducción de los efectos secundarios relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, el aumento de la acumulación del fármaco administrado en el objetivo deseado y la capacidad de administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrofílicos como hidrofóbicos, en la piel; y la capacidad de administrar agentes que incluyen ácidos nucleicos de alto peso molecular, analgésicos, anticuerpos y hormonas en la piel.
Los liposomas se dividen en dos grandes clases. Los liposomas catiónicos son liposomas de carga positiva que interactúan con las moléculas de ácido nucleico de carga negativa para formar un complejo estable. El complejo ADN/liposoma cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido del endosoma, los liposomas se rompen y liberan su contenido en el citoplasma celular (Wang, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.147, 980-985 (1987)).
Los liposomas sensibles al pH o cargados negativamente atrapan los ácidos nucleicos en lugar de formar complejos con ellos. Dado que tanto el ADN como el lípido tienen una carga similar, se produce una repulsión en lugar de la formación de complejos. No obstante, parte del ADN queda atrapado en el interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han usado para administrar ácidos nucleicos a monocapas celulares en cultivo (por ejemplo, Zhou, et al., Journal of Controlled Release 19, 269-74 (1992)).
En algunas realizaciones, una composición liposomal está formada por fosfatidilcolina (PC), por ejemplo PC de soja y PC de huevo. En algunas realizaciones, las composiciones liposomales incluyen fosfolípidos distintos de fosfatidilcolina de origen natural. Las composiciones liposomales neutras, por ejemplo, pueden estar formadas por dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos pueden formarse a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos pueden formarse a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). En otras realizaciones, una composición liposomal se forma a partir de mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
En algunas realizaciones, las formulaciones farmacológicas liposomales se administran vía tópica en la piel.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi, es decir el ARNsi, usado en una terapia combinada aquí descrita está totalmente encapsulado en una formulación lipídica, por ejemplo para formar un SPLP, pSPLP, SNALP u otra partícula de ácido nucleico-lípido. Tal como se usa aquí, el término "SNALP" se refiere a una partícula estable de ácido nucleico-lípido, incluyendo SPLP. El término "SPLP" se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende ADN plasmídico encapsulado en una vesícula lipídica. Las SNALP y las SPLP suelen contener un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que impide la agregación de la partícula (por ejemplo un conjugado PEG-lípido). Las SNALP y las SPLP pueden usarse para aplicaciones sistémicas, ya que presentan tiempos de circulación prolongados tras la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (por ejemplo sitios físicamente separados del lugar de administración). Las SPLP incluyen a las "pSPLP", que incluyen un complejo encapsulado de agente condensador-ácido nucleico, tal como se establece en la publicación de solicitud internacional N° WO 00/03683. Las partículas de la tecnología aquí descrita suelen tener un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, más típicamente de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, más típicamente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm y más típicamente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, y son esencialmente no tóxicas. Además, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido son resistentes en solución acuosa a la degradación por una nucleasa. Partículas de ácido nucleico-lípido y los métodos de preparación relacionados se dan a conocer en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N° 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; y la Publicación de la Solicitud Internacional N°WO 96/40964.
En algunas realizaciones, el agente de ARNi se administra a través de un liposoma u otra formulación lipídica, estando la relación lípido-fármaco (relación masa/masa) (por ejemplo relación lípido-ARNsi) en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1, o de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1.
III. Anticuerpos anti-VHB
La presente descripción proporciona una composición que comprende anticuerpos anti-VHB para su uso en el tratamiento del VHB, tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas.
a. Anticuerpos que se unen a las proteínas del VHB
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB de la terapia combinada se une a la región del bucle antigénico de HBsAg. La envoltura del virus de la hepatitis B contiene tres "proteínas de envoltura VHB" (también conocidas como "HBsAg", "antígeno de superficie de hepatitis B"): proteína S (por"small” pequeña", también denominada S-HBsAg), proteína M (por "middle", mediana, también denominada M-HBsAg) y proteína L (por "large” grande, también denominada L-HBsAg). S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg comparten el mismo extremo C-terminal (también denominado "dominio S", 226 aminoácidos), que corresponde a la proteína S (S-HBsAg) y que está implicado en el ensamblaje y la infectividad del virus. S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg se sintetizan en el retículo endoplásmico (RE), se ensamblan y se secretan como partículas a través del aparato de Golgi. El dominio S comprende cuatro dominios transmembrana (TM) previstos, por lo que tanto el extremo N-terminal como el C-terminal del dominio S están expuestos al lumen. Los dominios transmembrana TM1 y TM2 son necesarios para la integración cotraslacional de la proteína en la membrana del RE y los dominios transmembrana TM3 y TM4 se encuentran en el tercer extremo C-terminal del dominio S. La "región del bucle antigénico" de HBsAg se encuentra entre los dominios transmembrana TM3 y TM4 previstos del dominio S de HBsAg, por lo que la región del bucle antigénico comprende los aminoácidos 101 - 172 del dominio S (Salisse J., y Sureau C. Journal of Virology 83:9321-8 (2009)). Un importante determinante de la infectividad reside en la región del bucle antigénico de las proteínas de la envoltura de VHB. En particular, los residuos entre 119 y 125 de HBsAg contienen un motivo CXXC, que ha demostrado ser la secuencia más importante requerida para la infectividad del VHB (Jaoude, G. A., y Sureau, C., Journal of Virology 79:10460-6 (2005)).
Tal como se usa aquí, el dominio S de HBsAg se refiere a una secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO:13 (mostrada a continuación) o a variantes de secuencia naturales o artificiales de la misma.
M E N IT S G F L G P L L V L Q A G F F L L T R IL T IP Q S L D S W W T S L N F L G G T T
V C L G Q N S Q S P T S N H S P T S C P P T C P G Y R W M C L R R F IIF L F IL L L C L IF
L L V L L D Y O G M L P V C P L IP G S S T T S T G P C R T C M T T A O G T S M Y P S C C
C T K P S D G N C T C IP IP S S W A F G K F L W E W A S A R F S W L S L L V P F V O W F
V G L S P T V W L S V IW M M W Y W G P S L Y S IL S P F L P L L P IF F C L W V Y I
(SEQ ID NO:13; los aminoácidos 101 -172 se muestran subrayados).
Por ejemplo, la expresión "aminoácidos 101 - 172 del dominio S" se refiere a los residuos aminoácidos de las posiciones 101 -172 del polipéptido según la SEQ ID NO:13. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que pueden producirse mutaciones o variaciones (incluyendo sustitución, supresión y/o adición, por ejemplo de HBsAg de un genotipo diferente o de un mutante de HBsAg diferente como se describe aquí) de forma natural en la secuencia de aminoácidos del dominio S de HBsAg o introducirse artificialmente en la secuencia de aminoácidos del dominio S del HBsAg sin afectar a sus propiedades biológicas. Por tanto, el término "dominio S de HBsAg" comprende todos estos polipéptidos, por ejemplo incluyendo el polipéptido según la SEQ ID NO:13 y sus mutantes naturales o artificiales. Además, cuando se describen aquí fragmentos de secuencia del dominio S de HBsAg (por ejemplo los aminoácidos 101 -172 o los aminoácidos 120 -130 del dominio S de HBsAg), se incluyen no sólo los fragmentos de secuencia correspondientes de SEQ ID NO:13, sino también los fragmentos de secuencia correspondientes de sus mutantes naturales o artificiales. Por ejemplo, la expresión "residuos aminoácidos de las posiciones 101 -172 del dominio S de HBsAg" incluye los residuos aminoácidos de las posiciones 101 -172 de la SEQ ID NO:13 y los fragmentos correspondientes de sus mutantes (naturales o artificiales).
Tal y como se usa aquí, la expresión "fragmentos de secuencias correspondientes" o "fragmentos correspondientes" se refiere a los fragmentos que se sitúan en posiciones iguales de las secuencias cuando las secuencias se someten a una alineación optimizada, es decir, las secuencias se alinean para obtener un mayor porcentaje de identidad. La proteína M (M-HBsAg) corresponde a la proteína S ampliada por un dominio N-terminal de 55 aminoácidos denominado "pre-S2". La proteína L (L-HBsAg) corresponde a la proteína M ampliada por un dominio N-terminal de 108 aminoácidos llamado "pre-S1" (genotipo D). Los dominios pre-S1 y pre-S2 de la proteína L pueden estar presentes tanto en la cara interna de las partículas virales (en el lado citoplasmático del RE), desempeñando un papel crucial en el ensamblaje del virus, como en la cara externa (en el lado luminal del RE), disponible para la interacción con las células diana y necesaria para la infectividad viral. Además, las proteínas de superficie de VHB (HBsAg) no sólo se incorporan a las envolturas del virión, sino que también brotan espontáneamente de las membranas del compartimento intermedio ER-Golgi para formar "partículas subvirales" (SVP) vacías que se liberan de la célula por secreción.
Dado que las tres proteínas de envoltura del VHB S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg comprenden el dominio S, las tres proteínas de envoltura del VHB S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg también comprenden la "región del bucle antigénico". Por consiguiente, un anticuerpo que se une a la región del bucle antigénico del HBsAg se une a las tres proteínas de la envoltura del VHB: S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg.
Además, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB de la terapia combinada neutraliza la infección por el virus de la hepatitis B. En otras palabras, el anticuerpo puede reducir la infectividad viral del virus de la hepatitis B.
Para estudiar y cuantificar la infectividad del virus (o "neutralización") en el laboratorio, el experto en la técnica conoce varios "ensayos de neutralización" estándar. "Para un ensayo de neutralización, los virus animales suelen propagarse en células y/o líneas celulares. En el contexto de la presente descripción, para un ensayo de neutralización, las células cultivadas pueden incubarse con una cantidad fija de VHB en presencia (o ausencia) del anticuerpo a ensayar. Como lectura, pueden usarse los niveles de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) o antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) secretados en el sobrenadante del cultivo celular y/o puede evaluarse la tinción de HBcAg. En una realización de un ensayo de neutralización del VHB, las células cultivadas, por ejemplo células HepaRG, en particular células HepaRG diferenciadas, se incuban con una cantidad fija de VHB en presencia o ausencia del anticuerpo a ensayar, por ejemplo durante 16 horas a 37°C. La incubación puede realizarse en un medio (por ejemplo complementado con PEG 8000 al 4%). Tras la incubación, las células pueden lavarse y seguir cultivándose. Para medir la infectividad del virus, los niveles del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y del antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) secretados en el sobrenadante del cultivo, por ejemplo del día 7 al día 11 después de la infección, pueden determinarse mediante un ensayo inmunoenzimático (E<l is a>). Además, la tinción de HBcAg puede evaluarse en un ensayo de inmunofluorescencia.
En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una alta potencia neutralizadora. La concentración de un anticuerpo de la presente descripción necesaria para una neutralización del 50% del virus de la hepatitis B (VHB) es, por ejemplo, de aproximadamente 10 pg/ml o menos. En ciertas realizaciones, la concentración de un anticuerpo de la presente descripción requerida para una neutralización del 50% del VHB es de aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml, o de aproximadamente 750 ng/ml. En ciertas realizaciones, la concentración de un anticuerpo de la presente descripción requerida para una neutralización del 50% del VHB es de 500 ng/ml o menos, por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, o unos 50 ng/ml o menos. Esto significa que sólo se requieren concentraciones bajas del anticuerpo para una neutralización del 50% del VHB. La especificidad y la potencia pueden medirse mediante ensayos estándar conocidos por un experto en la técnica.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB, como componente de la terapia combinada, es útil en la prevención y/o tratamiento de la hepatitis B.
En algunas realizaciones, un anticuerpo según la presente descripción promueve la eliminación del HBsAg y del VHB. En particular, un anticuerpo según la presente descripción puede promover la eliminación tanto del VHB como de partículas subvirales del virus de la hepatitis B (SVP). La eliminación del HBsAg o de las partículas subvirales puede evaluarse midiendo el nivel de HBsAg, por ejemplo en una muestra de sangre, por ejemplo de un paciente con hepatitis B. Del mismo modo, la eliminación del<v>H<b>puede evaluarse midiendo el nivel de VHB, por ejemplo en una muestra de sangre, por ejemplo de un paciente con hepatitis B.
En el suero de los pacientes infectados por el VHB, además de las partículas infecciosas (VHB), suele haber un exceso (normalmente de 1000 a 100.000 veces) de partículas subvirales vacías (SVP) compuestas únicamente por proteínas de la envoltura del VHB (HBsAg) en forma de esferas relativamente más pequeñas y filamentos de longitud variable. Se ha demostrado que las partículas subvirales potencian fuertemente la replicación viral intracelular y la expresión génica del VHB (Bruns, M., et al., J Virol 72(2):1462-8 (1998)). Esto también es importante en el contexto de la infectividad de los sueros que contienen el VHB, ya que la infectividad no sólo depende del número de virus, sino también del número de SVP (Bruns, M., et al., J Virol 72(2):1462-8 (1998)). Además, un exceso de partículas subvirales puede servir de señuelo al absorber anticuerpos neutralizantes y, por tanto, retrasar la eliminación de la infección. Típicamente, el logro de la pérdida del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se considera así un punto final ideal del tratamiento y el resultado más cercano a la curación de la hepatitis B crónica (HBC). En consecuencia, en algunas realizaciones, un anticuerpo según la presente descripción que promueve la eliminación del HBsAg y, en particular, la eliminación de las partículas subvirales del virus de la hepatitis B y del VHB permite mejorar el tratamiento de la hepatitis B, en particular en el contexto de la hepatitis B crónica. Además, en ciertas realizaciones, un anticuerpo según la presente descripción promueve la eliminación de partículas subvirales del virus de la hepatitis B y disminuye la infectividad del VHB en el suero.
El VHB se diferencia en muchos genotipos, según la secuencia del genoma. Hasta la fecha, se han definido ocho genotipos conocidos (A-H) del genoma del VHB. Además, también se han identificado dos nuevos genotipos, I y J (Sunbul, M., World J Gastroenterol 20(18):5427-34 (2014)). Se sabe que el genotipo afecta a la progresión de la enfermedad y se han determinado las diferencias entre genotipos en la respuesta al tratamiento antiviral. Por ejemplo, el genotipo A tiene tendencia a la cronicidad, mientras que las mutaciones virales son frecuentes en el genotipo C. Tanto la cronicidad como la frecuencia de las mutaciones son comunes en el genotipo D. Además, los genotipos del VHB se distribuyen de forma diferencial en el mundo (Sunbul, M., 2014, supra). En ciertas realizaciones, un anticuerpo según la presente descripción se une a por lo menos 6, a por lo menos 8, o a los 10 genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J de HBsAg. En ciertas realizaciones, un anticuerpo según la presente descripción se une a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J de HBsAg: Número de acceso del GenBank J02203 (VHB-D, ayw3), número de acceso del GenBank FJ899792.1 (VHB-D, adw2), número de acceso del GenBank AM282986 (VHB-A), número de acceso del GenBank D23678 (VHB-B1 Japón), número de acceso del GenBank AB1 17758 (VHB-C1 Camboya), número de acceso del GenBank AB205192 (VHB-E Ghana), número de acceso del GenBank X69798 (VHB-F4 Brasil), número de acceso del GenBank AF160501 (V<h>B-G EE.UU.), número de acceso del GenBank AY090454 (VHB-H Nicaragua), número de acceso del GenBank AF241409 (Vh B-I Vietnam) y número de acceso del GenBank AB486012 (VHB-J Borneo). Las secuencias de aminoácidos de la región del bucle antigénico del dominio S del HBsAg de los diferentes genotipos se muestran en la Tabla 2 (SEQ ID NO:14-42).
T l 2. n i l n i ni v ri n i VHB
En ciertas realizaciones, un anticuerpo según la presente descripción se une a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 de los mutantes del HBsAg que tienen mutaciones en la región del bucle antigénico: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121 S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141 E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A. Estos mutantes son mutantes naturales basados en el dominio S del HBsAg genotipo D (SEQ ID NO:43), número de acceso del Genbank. FJ899792 (donde el residuo o residuos de aminoácidos mutados se indican en el nombre).
MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT TVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWM-CLRRFIIFLFILLLCLI FLLVLLDYOOMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAOGTSMYPSC CCTKPSDGNCTCIPIPSS-WAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQ WFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVY I (SEQ ID NO:43i(la región del bucle antigénico, es decir, los aminoácidos 101 -172, se muestran subrayados).
En realizaciones particulares, un anticuerpo según la presente descripción se une a al menos 12, a al menos 15 o a todos los 18 de los mutantes infecciosos de HBsAg que tienen mutaciones en la región del bucle antigénico: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121 S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M1 33H, HBsAg M133L, HBsAg M1 33T, HBsAg K141 E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo según la presente descripción se une a un epítopo que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres aminoácidos o al menos cuatro aminoácidos de la región del bucle antigénico del HBsAg, donde los al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos se seleccionan entre los aminoácidos 115-133 del dominio S del HBsAg, los aminoácidos 120-133 del dominio S del HBsAg o los aminoácidos 120-130 del dominio S del HBsAg. Cabe destacar que la posición de los aminoácidos (por ejemplo, 115-133, 120-133, 120-130) se refiere al dominio S del HBsAg como se ha descrito anteriormente, que está presente en las tres proteínas de envoltura del VHB S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg.
En realizaciones particulares, un anticuerpo según la presente descripción se une a un epítopo en la región del bucle antigénico del HBsAg, por lo que el epítopo está formado por uno o más aminoácidos situados en posiciones seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 115-133, las posiciones de aminoácidos 120-133 o las posiciones de aminoácidos 120-130 del dominio S del HBsAg.
El término "formado por", tal como se usa aquí en el contexto de un epítopo, significa que el epítopo al que se une un anticuerpo de la presente descripción puede ser lineal (continuo) o conformacional (discontinuo). Un epítopo lineal o secuencial es un epítopo que es reconocido por los anticuerpos por su secuencia lineal de aminoácidos o estructura primaria. En cambio, un epítopo conformacional tiene una forma tridimensional y una estructura proteica específicas. Por consiguiente, si el epítopo es un epítopo lineal y comprende más de un aminoácido situado en posiciones seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 115-133 o las posiciones de aminoácidos 120-133 del dominio S del HBsAg, los aminoácidos comprendidos por el epítopo pueden estar situados en posiciones adyacentes de la estructura primaria (es decir, aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos). En el caso de un epítopo conformacional (estructura 3D), por el contrario, la secuencia de aminoácidos suele formar una estructura 3D como epítopo y, por tanto, los aminoácidos que forman el epítopo (o los aminoácidos "comprendidos por" el epítopo) pueden estar o no situados en posiciones adyacentes de la estructura primaria (es decir, pueden ser o no aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos). En ciertas realizaciones, el epítopo al que se une un anticuerpo de la presente descripción sólo está formado por aminoácidos seleccionados de las posiciones de aminoácidos 115-133, las posiciones de aminoácidos 120-133 o las posiciones de aminoácidos 120-130 del dominio S del HBsAg. En realizaciones particulares, no se requiere ningún aminoácido (adicional) -que esté situado fuera de las posiciones 115-133, las posiciones 120-133 o las posiciones 120-130- para formar el epítopo al que se une un anticuerpo de la presente descripción.
En ciertas realizaciones, el epítopo en la región del bucle antigénico del HBsAg al que se une un anticuerpo de la presente descripción está formado por dos o más aminoácidos situados en posiciones seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 115-133, las posiciones de aminoácidos 120-133 o las posiciones de aminoácidos 120 130 del dominio S del HBsAg. En ciertas realizaciones, el epítopo en la región del bucle antigénico del HBsAg al que se une un anticuerpo de la presente descripción está formado por tres o más aminoácidos situados en posiciones seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 115-133, las posiciones de aminoácidos 120-133, y las posiciones de aminoácidos 120 -130 del dominio S del HBsAg. En algunas realizaciones, el epítopo en la región del bucle antigénico del HBsAg al que se une un anticuerpo de la presente descripción está formado por cuatro o más aminoácidos situados en posiciones seleccionadas entre las posiciones de aminoácidos 115 -133, las posiciones de aminoácidos 120 -133 o las posiciones de aminoácidos 120-130 del dominio S del HBsAg. Como tal, un anticuerpo según la presente descripción puede unirse a al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos de la región del bucle antigénico del HBsAg seleccionados entre los aminoácidos 115 133 del dominio S del HBsAg, los aminoácidos 120-133 del dominio S del HBsAg o los aminoácidos 120-130 del dominio S del HBsAg. En realizaciones particulares, un anticuerpo según la presente descripción se une a un epítopo que comprende al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos de la región del bucle antigénico del HBsAg, donde los al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos se seleccionan entre los aminoácidos 120-133 o los aminoácidos 120-130 del dominio S del HBsAg y donde los al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos están situados en posiciones adyacentes (es decir, son aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos/estructura primaria).
En ciertas realizaciones, el epítopo al que se une un anticuerpo según la presente descripción es un epítopo conformacional. En consecuencia, un anticuerpo según la presente descripción puede unirse a un epítopo que comprende al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos de la región del bucle antigénico del HBsAg, en el que los al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos se seleccionan de entre los aminoácidos 120-133, o los aminoácidos 120-130, del dominio S del HBsAg y en el que al menos dos o al menos tres o al menos cuatro aminoácidos no están situados en posiciones adyacentes (de la estructura primaria).
En ciertas realizaciones específicas, un anticuerpo de la presente descripción es un anticuerpo biespecífico, con una primera especificidad para el HBsAg y una segunda especificidad que estimula una célula efectora inmunitaria (por ejemplo dirigiéndose a una proteína de superficie de células T como, por ejemplo, una porción extracelular de la proteína CD3). La segunda especificidad puede causar, por ejemplo, un efecto citotóxico o un efecto vacunal.
b. Fracciones Fc
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una fracción Fc. En ciertas realizaciones, la fracción Fc puede ser de origen humano, por ejemplo de IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 humanas. En realizaciones específicas, un anticuerpo puede comprender una fracción Fc derivada de IgG1 humana.
Tal como se usa aquí, el término "fracción Fc" se refiere a una secuencia que comprende o se deriva de una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina que comienza en la región bisagra justo antes del sitio de escisión de la papaína (por ejemplo el residuo 216 en la IgG nativa, tomando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada como 114) y que termina en el extremo C-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina. Por consiguiente, una fracción Fc puede ser una fracción Fc completa o una porción (por ejemplo un dominio) de la misma. En ciertas realizaciones, una fracción Fc completa comprende un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 (por ejemplo las posiciones de aminoácidos 216-446 UE). Un residuo de lisina adicional (K) está a veces presente en el extremo C-terminal de la fracción Fc, pero a menudo se escinde de un anticuerpo maduro. Las posiciones de aminoácidos dentro de una fracción Fc se han numerado de acuerdo con el sistema de numeración UE de Kabat (véase, por ejemplo, Kabat, et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 y 1987). Las posiciones de aminoácidos de una fracción Fc también pueden numerarse según el sistema de numeración IMGT (incluyendo la numeración única del dominio C y la numeración de exones) y el sistema de numeración Kabat.
En algunas realizaciones, una fracción de Fc comprende al menos una de las siguientes: un dominio bisagra (por ejemplo una región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante, porción o fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, una fracción Fc comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 o un dominio CH3. En otras realizaciones, la fracción Fc es una fracción Fc completa. La secuencia de aminoácidos de una fracción Fc de ejemplo del isotipo IgG1 humano se proporciona en la SEQ ID NO:96. La fracción Fc también puede comprender una o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en relación con una fracción Fc natural. Por ejemplo, puede suprimirse al menos uno de los dominios bisagra, CH2 o CH3 o parte de los mismos. Por ejemplo, una fracción Fc puede comprender o consistir en (i) un dominio bisagra (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH2 (o una porción del mismo), (ii) un dominio bisagra (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una porción del mismo), (iii) un dominio CH2 (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una porción del mismo), (iv) un dominio bisagra (o una porción del mismo), (v) un dominio CH2 (o una porción del mismo) o (vi) un dominio CH3 o una porción del mismo.
Una fracción de Fc de la presente descripción puede modificarse de manera que varíe en la secuencia de aminoácidos de la fracción de Fc completa de una molécula de inmunoglobulina natural, pero conservando (o mejorando) al menos una función deseable conferida por la fracción de Fc natural. Tales funciones incluyen, por ejemplo, la unión al receptor Fc (FcR), la modulación de la semivida del anticuerpo (por ejemplo, mediante la unión al FcRn), la función ADC<c>, la unión a la proteína A, la unión a la proteína G y la unión al complemento. Se han descrito en la técnica porciones de moléculas Fc naturales que están implicadas en tales funciones.
Por ejemplo, para activar la cascada del complemento, el complejo proteico C1q puede unirse al menos a dos moléculas de IgG1 o a una molécula de IgM cuando la(s) molécula(s) de inmunoglobulina está(n) unida(s) a la diana antigénica (Ward, E. S., y Ghetie, V., Ther. Immunol. 277-94 (1995)). La región de la cadena pesada que comprende los residuos de aminoácidos 318 a 337 está implicada en la fijación del complemento (Burton, D. R., Mol. Immunol. 22:161-206 (1985)). Duncan, A. R., y Winter, G. (Nature 332:738-40 (1988)), usando mutagénesis dirigida al sitio, informaron de que Glu318, Lys320 y Lys322 forman el sitio de unión a C1q. El papel de los residuos Glu318, Lys320 y Lys 322 en la unión de C1q fue confirmado por la capacidad de un péptido sintético corto que contiene estos residuos de inhibir la lisis mediada por el complemento.
Por ejemplo, la unión de los FcR puede estar mediada por la interacción de la fracción Fc (de un anticuerpo) con los receptores Fc (FcR), que son receptores especializados de la superficie celular de las células, incluidas las hematopoyéticas. Los receptores Fc pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se ha demostrado que median tanto la eliminación de patógenos recubiertos de anticuerpos mediante fagocitosis de complejos inmunitarios, como la lisis de eritrocitos y otros objetivos celulares (por ejemplo células tumorales) recubiertos con el anticuerpo correspondiente, a través de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC; Van de Winkel, J. G., y Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49:511-24 (1991)). Los FcR se definen por su especificidad para las clases de inmunoglobulina; los receptores Fc para anticuerpos IgG se denominan F<cy>R, para IgE como FceR, para IgA como FcaR, y así sucesivamente, y los receptores Fc neonatales se denominan FcRn. La unión del receptor Fc se describe, por ejemplo, en Ravetch, J. V., y Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel, P. J., et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995); y Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76:231-48 (1998).
La reticulación de los receptores por el dominio Fc de los anticuerpos IgG nativos (F<cy>R) desencadena una amplia variedad de funciones efectoras que incluyen fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y liberación de mediadores inflamatorios, así como la eliminación de complejos inmunitarios y la regulación de la producción de anticuerpos. Aquí se contemplan las moléculas Fc que proporcionan la reticulación de los receptores (por ejemplo F<cy>R). En humanos, se han caracterizado tres clases de F<cy>R: (i) F<cy>RI (CD64), que se une a la IgG monomérica con alta afinidad y se expresa en macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos; (ii) F<cy>RII (CD32), que se une a las IgG complejas con una afinidad de media a baja, se expresa ampliamente, en particular en los leucocitos, se cree que es un actor central en la inmunidad mediada por anticuerpos y que puede dividirse en F<cy>RIIA, F<cy>RIIB y F<cy>RIIC, que desempeñan diferentes funciones en el sistema inmunitario, pero se unen con una afinidad baja similar a las IgG-Fc, y los ectodominios de estos receptores son altamente homólogos; y (iii) F<cy>RIII (CD16), que se une a la IgG con una afinidad de media a baja y se ha encontrado en dos formas: F<cy>R<i>IIA, que se ha encontrado en las células NK, los macrófagos, los eosinófilos y algunos monocitos y células T, y se cree que media en la ADCC; y FcyRIIIB, que se expresa mucho en los neutrófilos.
F<cy>RIIA se encuentra en muchas células implicadas en la muerte (por ejemplo macrófagos, monocitos y neutrófilos) y parece capaz de activar el proceso de muerte. El FcyRIIB parece desempeñar un papel en los procesos inhibitorios y se encuentra en los linfocitos B, los macrófagos y los mastocitos y eosinófilos. Se ha demostrado que el 75% de todos los FcyRIIB se encuentran en el hígado (Ganesan, L. P., et al., Journal of Immunology 189:4981-8 (2012)). El F<cy>RIIB se expresa abundantemente en el endotelio sinusoidal del hígado, llamado LSEC, y en las células de Kupffer en el hígado, y el LSEC es el principal sitio de eliminación de pequeños complejos inmunes (Ganesan, L. P. et al., 2012,supra).
En algunas realizaciones, los anticuerpos aquí descritos comprenden una fracción Fc para unirse a FcYRIIb, en particular una región Fc tal como, por ejemplo, anticuerpos de tipo IgG. Además, es posible diseñar la fracción Fc para mejorar la unión a F<cy>RIIB introduciendo las mutaciones S267E y L328F que se describen Chu, S. Y. et al. (Molecular Immunology 45:3926-33 (2008)). Así, puede mejorarse el aclaramiento de los complejos inmunes (Chu, S., et al., Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts (2014)). En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente descripción comprenden una fracción Fc modificada con las mutaciones S267E y L328F, en particular como se describe en Chu, S. Y. et al. (2008,supra).
En las células B, el FcyRIIB parece funcionar para suprimir la producción de inmunoglobulinas y el cambio de isotipo, por ejemplo la clase IgE. En los macrófagos, se cree que FcyRIIB inhibe la fagocitosis mediada a través de FcyRIIA. En los eosinófilos y mastocitos, la forma b puede ayudar a suprimir la activación de estas células mediante la unión de IgE a su receptor independiente.
En cuanto a la unión a FcyRI, la modificación en la IgG nativa de al menos uno de los residuos E233-G236, P238, D265, N297, A327 y P329 reduce la unión a FcyRI. Los residuos de IgG2 en las posiciones 233-236, sustituidos en las posiciones correspondientes de IgG1 e IgG4, reducen la unión de IgG1 e IgG4 a FcyRI en 103 veces y suprimen la respuesta de los monocitos humanos a los glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos (Armour, K. L., et al., Eur. J. Immunol. 29:2613-2624 (1999)).
En cuanto a la unión de FcyRII, se encuentra una unión reducida para FcyRIIA, por ejemplo para la mutación de IgG de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 y K414.
En cuanto a la unión de F<cy>RIII, se encuentra una reducción de la unión a F<cy>RIIIA, por ejemplo para la mutación de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 y D376.
El mapeo de los sitios de unión en la IgG1 humana para los receptores Fc, los sitios de mutación mencionados y los métodos para medir la unión a F<cy>RI y F<cy>RIIA se describen en Shields, R. L., et al. (J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)).
En referencia a la unión a FcyRII, dos regiones del Fc nativo de IgG parecen estar implicadas en las interacciones entre FcyRII e IgG, a saber (i) el sitio bisagra inferior de IgG Fc, en particular los residuos de aminoácidos L, L, G y G (234 - 237, numeración UE) y (ii) la región adyacente del dominio CH2 de IgG Fc, en particular un bucle y hebras en el dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra inferior, por ejemplo en una región de P331 (Wines, B.D., et al., J. Immunol. 164:5313 - 8 (2000)). Además, el F<cy>RI parece unirse al mismo sitio en el IgG Fc, mientras que el FcRn y la proteína A se unen a un sitio diferente en el IgG Fc, que parece estar en la interfaz CH2-CH3 (Wines, B.D., et al., 2000,supra).
También se contemplan mutaciones que aumentan la afinidad de unión de una fracción de Fc de la presente descripción a un receptor F<cy>(es decir a uno o más) (por ejemplo en comparación con una fracción de Fc de referencia o un anticuerpo que no comprende la mutación). Véase, por ejemplo, Delillo y Ravetch, Cell 161(5):1035-45 (2015) y Ahmed et al., J. Struc. Biol. 194(1):78 (2016), que describen mutaciones y técnicas. En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, una proteína de unión puede comprender una fracción Fc que comprende una mutación seleccionada entre G236A; S239D; A330L e I332E; o una combinación que las comprenda, por ejemplo S239D/I332E, S239D/A330L/I332E, G236A/S239D/I332E, G236A/A330L/I332E y G236A/S239D/A330L/I332E.
En ciertas realizaciones, la fracción Fc puede comprender o consistir en al menos una porción de una fracción Fc que participa en la unión a FcRn. En ciertas realizaciones, la fracción de Fc comprende una o más modificaciones de aminoácidos que mejoran la afinidad de unión a FcRn y, en algunas realizaciones, amplían así la vida mediain vivode una molécula que comprende la fracción de Fc (por ejemplo en comparación con una fracción de Fc de referencia o un anticuerpo que no comprende la(s) modificación(es)). En ciertas realizaciones, la fracción Fc comprende o se deriva de una IgG Fc y una mutación que prolonga la semivida comprende una o más de las siguientes: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I; Q311I; D376V; T307A; y E380A (numeración UE). En ciertas realizaciones, una mutación que prolonga la semivida comprende M428L/N434S. En ciertas realizaciones, una mutación que prolonga la semivida comprende M252Y/S254T/T256E. En ciertas realizaciones, una mutación que prolonga la semivida comprende T250Q/M428L. En ciertas realizaciones, una mutación que prolonga la semivida comprende P257I/Q311I. En ciertas realizaciones, una mutación que prolonga la semivida comprende P257I/N434H. En ciertas realizaciones, una mutación que prolonga la semivida comprende D376V/N434H. En ciertas realizaciones, una mutación que prolonga la semivida comprende T307A/E380A/N434A.
En realizaciones particulares, una proteína de unión incluye una fracción Fc que comprende las mutaciones de sustitución M428L/N434S y G236A/A330L/I332E. En ciertas realizaciones, un anticuerpo incluye una fracción Fc que comprende las mutaciones de sustitución M428L/N434S y G236A/S239D/A330L/I332E.
En realizaciones particulares, una proteína de unión incluye una fracción Fc que comprende las mutaciones de sustitución G236A/A330L/I332E. En ciertas realizaciones, un anticuerpo incluye una fracción Fc que comprende las mutaciones de sustitución G236A/S239D/A330L/I332E.
Alternativa o adicionalmente, la fracción Fc de una proteína de unión de la descripción puede comprender al menos una porción conocida en la técnica que se requiere para la unión de la proteína A; y/o la fracción Fc de un anticuerpo de la descripción comprende al menos la porción de una molécula Fc conocida en la técnica que se requiere para la unión de la proteína G. En algunas realizaciones, una función que se mantiene comprende la eliminación de HBsAg y VHBg. En consecuencia, en ciertas realizaciones, una molécula Fc comprende al menos una porción conocida en la técnica que se requiere para la unión de FcyR. Como se ha descrito anteriormente, una fracción Fc puede comprender al menos (i) el sitio de bisagra inferior de la IgG Fc nativa, en particular los residuos aminoácidos L, L, G y G (234 - 237, numeración UE) y (ii) la región adyacente del dominio CH2 de la IgG Fc nativa, en particular un bucle y hebras en el dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra inferior, por ejemplo en una región de P331, por ejemplo una región de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos consecutivos del dominio CH2 superior de la IgG Fc nativa alrededor de P331, por ejemplo entre los aminoácidos 320 y 340 (numeración UE) de la IgG Fc nativa.
En algunas realizaciones, una proteína de unión según la presente descripción comprende una región Fc. Tal como se usa aquí, el término "región Fc" se refiere a la porción de una inmunoglobulina formada por dos o más moléculas Fc de cadenas pesadas de anticuerpos. Por ejemplo, una región Fc puede ser monomérica o de "cadena única" (es decir, una región scFc). Las regiones Fc de cadena única están compuestas por moléculas Fc unidas dentro de una única cadena polipeptídica (por ejemplo codificada en una única secuencia de ácido nucleico contigua). En la WO 2008/143954 A2 se describen regiones scFc ilustrativas. La región Fc puede ser o comprender una región Fc dimérica. Una "región Fc dimérica" o "dcFc" se refiere al dímero formado por las moléculas Fc de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina separadas. La región Fc dimérica puede ser un homodímero de dos moléculas Fc idénticas (por ejemplo una región Fc de una inmunoglobulina natural) o un heterodímero de dos moléculas Fc no idénticas (por ejemplo un monómero Fc de la región Fc dimérica comprende al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo sustitución, supresión, inserción o modificación química) que no está presente en el otro monómero Fc o un monómero Fc puede estar truncado en comparación con el otro).
Las moléculas Fc descritas pueden comprender secuencias o regiones Fc de la misma o diferente clase y/o subclase. Por ejemplo, las moléculas Fc pueden derivarse de una inmunoglobulina (por ejemplo una inmunoglobulina humana) de una subclase IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, o de cualquier combinación de las mismas. En ciertas realizaciones, los restos de la región Fc son de la misma clase y subclase. Sin embargo, la región Fc (o una o más fracciones Fc de una región Fc) también puede ser quimérica, pudiendo comprender una región Fc quimérica fracciones Fc derivadas de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, al menos dos de las fracciones Fc de una región Fc dimérica o de cadena única pueden ser de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulinas. En ciertas realizaciones, una región Fc dimérica puede comprender secuencias de dos o más isotipos o subclases diferentes; por ejemplo, un cuerpo SEED ("strand-exchange engineered domains") (véase Davis, et al., Protein Eng. Des. Sel. 23(4):195 (2010)).
Adicional o alternativamente, las regiones Fc quiméricas pueden comprender una o más fracciones Fc quiméricas. Por ejemplo, la región o fracción Fc quimérica puede comprender una o más porciones derivadas de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3) mientras que el resto de la región o fracción Fc es de una subclase diferente. Por ejemplo, una región o fracción Fc de un polipéptido Fc puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG4) y una región bisagra de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG3). Por ejemplo, la región o fracción Fc puede comprender un dominio bisagra y/o CH2 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG4) y un dominio CH3 de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3). Por ejemplo, la región Fc quimérica puede comprender una fracción Fc (por ejemplo una fracción Fc completa) de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG4) y una fracción Fc de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3). Por ejemplo, la región o fracción Fc puede comprender un dominio CH2 de una inmunoglobulina IgG4 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina IgG1. Por ejemplo, la región o fracción Fc puede comprender un dominio CH1 y un dominio CH2 de una molécula IgG4 y un dominio CH3 de una molécula IgG1. Por ejemplo, la región o fracción Fc puede comprender una porción de un dominio CH2 de una subclase particular de anticuerpos, por ejemplo las posiciones 292-340 de un dominio CH2. Por ejemplo, una región o fracción Fc puede comprender aminoácidos en las posiciones 292-340 de CH2 derivados de una fracción IgG4 y el resto de CH2 derivados de una fracción IgG1 (alternativamente 292-340 de CH2 pueden ser derivados de una fracción IgG1 y el resto de CH2 derivados de una fracción IgG4).
Además, una región o fracción Fc puede (adicional o alternativamente) comprender una región bisagra quimérica. Por ejemplo, la bisagra quimérica puede derivarse, por ejemplo en parte, de una molécula IgG1, IgG2 o IgG4 (por ejemplo una secuencia de bisagra media superior e inferior) y, en parte, de una molécula IgG3 (por ejemplo una secuencia de bisagra media). En otro ejemplo, una región o fracción Fc puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula IgG1 y, en parte, de una molécula IgG4. En otro ejemplo, la bisagra quimérica puede comprender los dominios bisagra superior e inferior de una molécula IgG4 y un dominio bisagra central de una molécula IgG1. Tal bisagra quimérica puede hacerse, por ejemplo, introduciendo una sustitución de prolina (Ser228Pro) nomenclatura UE en la posición 228 del dominio bisagra media de una región bisagra de IgG4. En algunas otras realizaciones, la bisagra quimérica puede comprender aminoácidos en las posiciones 233-236 UE que son de un anticuerpo IgG2 y/o la mutación Ser228Pro, donde los aminoácidos restantes de la bisagra son de un anticuerpo IgG4 (por ejemplo una bisagra quimérica de secuencia ESKYGPPCPPAPPVAGP (SEQ ID NO:105)). En el documento US 2005/0163783 A1 se describen otras bisagras quiméricas que pueden usarse en la fracción Fc de un anticuerpo según la presente descripción.
En algunas realizaciones, una fracción Fc o región Fc comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana (por ejemplo de una región Fc o fracción Fc de una molécula IgG humana). Sin embargo, los polipéptidos pueden comprender uno o más aminoácidos de otra especie de mamífero. Por ejemplo, puede incluirse en los polipéptidos en cuestión una fracción Fc de primate o un sitio de unión de primate. Alternativamente, uno o más aminoácidos murinos pueden estar presentes en la fracción Fc o en la región Fc.
c. Anticuerpos
El anticuerpo anti-VHB una variante de ingeniería genética de HBC34, tal como se establece en las reivindicaciones independientes anexas. El HBC34 es un anticuerpo humano contra HBsAg con alta actividad neutralizante. El HBC34 se une al bucle antigénico de HBsAg con alta afinidad (en el rango de pM), reconoce los 10 genotipos del VHB y 18 mutantes y se une a los SVP esféricos con baja estequiometría. La actividad de HBC34, medida en diagnóstico con un inmunoensayo, es de 5.000 UI/mg. Como comparación, la actividad de HBIG es de ~ 1 UI/mg.
Tal como se indica aquí, los términos "un anticuerpo HBC34" y "anticuerpos HBC" pueden incluir el anticuerpo HBC34 de tipo silvestre o una variante modificada genéticamente del mismo (por ejemplo HBC34 y las variantes de HBC34 descritas en la Tabla 3), a menos que se indique lo contrario.
La Tabla 3 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR, las regiones variables de cadena pesada (VH) y las regiones variables de cadena ligera (VL) de HBC34 y de variantes del mismo modificadas genéticamente ("HBC34v7", HBC34v23, "HBC34v31", "HBC34v32", "HBC34v33", "HBC34v34" y "HBC34v35"), así como de "HBC24". También se muestran las secuencias de aminoácidos de longitud completa de la cadena pesada (HC) y de la cadena ligera (LC) de anticuerpos de ejemplo de la presente descripción.
Tabla 3. Secuencias de los anticuer os HBC34 HBC24
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción es una variante no natural de un anticuerpo HBC34 "HBC34v35". Otros ejemplos de variantes no naturales de HBC34 incluyen, por ejemplo, "HBC34v7", “HBC34v23”, "HBC34v31", "HBC34v32”, "HBC34v33" y "HBC34v34."
El anticuerpo anti-VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes anexas comprende secuencias de aminoácidos como se establecen en la Tabla 3. En ciertas realizaciones, el anticuerpo según la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con una secuencia VH, una secuencia VL, una secuencia HC y/o una secuencia LC como se muestra en la Tabla 3. En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, un anticuerpo puede comprender una secuencia VH, VL, HC y/o LC como se muestra en la Tabla 3.
El anticuerpo de la presente descripción comprende: (i) secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 según las SEQ ID NO:44, 45 o 46 y 47, respectivamente; y (ii) secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 según las SEQ ID NO:48, 49 o 50 y 51 o 52, respectivamente.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, C son según las SEQ ID NO.:44, 45 y 47, respectivamente. En algunas realizaciones, C son según las SEQ ID NO.:44, 46 y 47, respectivamente. En algunas realizaciones, CDRL3 son según las SEQ ID NO.:48, 49 respectivamente. En algunas realizaciones, RL3 son según las SEQ ID NO.:48, 49 respectivamente. En algunas realizaciones, RL3 son según las SEQ ID NO.:48, 50 respectivamente. En algunas realizaciones, RL3 son según las SEQ ID NO.:48, 50 respectivamente.
Se entenderá que un anticuerpo de la presente descripción puede comprender cualquier combinación de las secuencias de aminoácidos CDRH1, Cd Rh 2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 según las SEQ ID NO:44-52.
En realizaciones particulares, un anticuerpo de la presente descripción comprende: las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 según las SEQ ID NO:44, 45 y 47, respectivamente, y secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 según las SEQ ID NO:48, 49 y 51, respectivamente. En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende: las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 según las SEQ iD NO.:44, 45 y 47, respectivamente, y secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 según las SEQ ID NO:48, 49 y 52, respectivamente.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende: (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un
95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:55-69; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53 o 54.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende:
(a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO.:55-63; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende:
(a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:55-57 o 64-69; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende:
(i) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ
ID NO:55, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(ii) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ
ID NO:55, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(iii) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ
ID NO:56, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(iv) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ
ID NO:56, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(v) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:57, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(vi) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:57, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(vii) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:58, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(viii) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:59, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(ix) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:60, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(x) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:61, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(xi) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:62, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(xii) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:63, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53;
(xiii) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:64, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(xiv) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:65, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(xv) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:66, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(xvi) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:67, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(xvii) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:68, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54;
(xviii) (a) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:69, y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende:
(a) una cadena ligera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:73, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO.:70-72 y 97; o
(a) una cadena ligera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:74, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:70-72 y 97; o
(a) una cadena ligera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:83-95, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO.:70-72, 97 y 98.
En realizaciones particulares, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:73, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:70.
En realizaciones particulares, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:73, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:71.
En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:73, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:72.
En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:73, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:97.
En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:74, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:70.
En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:74, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:71.
En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:74, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:72.
En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente descripción comprende (a) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO.:74, y (b) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:97.
d. Composiciones farmacéuticas
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la terapia combinada se proporciona como una composición farmacéutica que incluye el anticuerpo anti-VHB y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, una composición puede incluir un anticuerpo anti-VHB donde el anticuerpo puede constituir al menos el 50% en peso (por ejemplo 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de la proteína total de la composición. En tal composición, el anticuerpo puede estar en forma purificada.
Las composiciones farmacéuticas del anticuerpo anti-VHB pueden incluir un antimicrobiano, especialmente si se envasan en un formato multi dosis. Pueden incluir un detergente, por ejemplo un Tween (polisorbato), como Tween 80. Cuando están presentes, los detergentes suelen estarlo en niveles bajos, por ejemplo menos del 0,01%. Las composiciones también pueden incluir sales de sodio (por ejemplo cloruro de sodio) para la tonicidad. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende NaCl a una concentración de 10±2 mg/ml.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo sacarosa o trehalosa), por ejemplo en torno a 15-30 mg/ml (por ejemplo 25 mg/ml), especialmente si van a ser liofilizadas o si incluyen un material que ha sido reconstituido a partir de material liofilizado. El pH de una composición para liofilización puede ajustarse entre 5 y 8 o entre 5,5 y 7 o alrededor de 6,1 antes de la liofilización.
Una composición de anticuerpos de la presente descripción también puede comprender uno o más agentes inmunorreguladores. En algunas realizaciones, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen un adyuvante.
Los métodos para preparar una composición farmacéutica del anticuerpo anti-VHB pueden incluir los pasos: (i) preparar el anticuerpo; y (ii) mezclar el anticuerpo purificado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
IV. Métodos de tratamiento con la terapia combinada
Las referencias a las terapias de combinación y métodos de tratamiento aquí descritos deben interpretarse como referencias a la composición para su uso en dichas terapias de combinación y métodos de tratamiento, tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas.
Tal como se usa aqií, un "sujeto" es un animal, tal como un mamífero, incluyendo cualquier mamífero que pueda infectarse con VHB, por ejemplo un primate (como un humano un primate no humano, por ejemplo un mono o un chimpancé) o un animal que se considere un modelo clínico aceptable de infección por VHB, un modelo de ratón con HBV-AAV (véase, por ejemplo, Yang et al., Cell and Mol Immunol 11:71 (2014)) o el modelo de ratón transgénico HBV 1.3xfs (Guidotti, et al., J. Virol. 69:6158 (1995))). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una infección por el virus de la hepatitis B (VHB). En otras realizaciones, el sujeto tiene tanto una infección por el virus de la hepatitis B (VHB) como una infección por el virus de la hepatitis D (HDV). En algunas otras realizaciones, el sujeto es un humano, como un ser humano que tiene una infección por VHB, especialmente una infección por el virus de la hepatitis B crónica (VHBC).
Tal y como se usan aquí, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a un resultado beneficioso o deseado que incluye el alivio o la mejora de uno o más signos o síntomas asociados con la expresión genética no deseada del VHB o la replicación del VHB no deseada, por ejemplo la presencia de ADNccc de VHB en suero o en el hígado, la presencia de ADN de VHB en suero, la presencia de antígeno de VHB en suero o en el hígado, por ejemplo HBsAg o HBeAg, ALT elevada, AST elevada (el rango normal se considera típicamente entre 10 y 34 U/L), la ausencia o bajo nivel de anticuerpos anti-VHB; una lesión hepática; cirrosis; hepatitis delta; hepatitis B aguda; hepatitis B aguda fulminante; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática terminal; carcinoma hepatocelular; síndrome similar a la enfermedad del suero; anorexia; náuseas; vómitos, fiebre baja; mialgias; fatiga; trastornos de la agudeza gustativa y de las sensaciones olfativas (aversión a los alimentos y a los cigarrillos); o dolor en el cuadrante superior derecho y epigástrico (intermitente, de leve a moderado); encefalopatía hepática; somnolencia; trastornos del patrón de sueño; confusión mental; coma; ascitis; hemorragia gastrointestinal; coagulopatía; ictericia; hepatomegalia (hígado ligeramente agrandado y blando); esplenomegalia; eritema palmar; nevos en forma de araña; desgaste muscular; angiomas en forma de araña; vasculitis; hemorragia por varices; edema periférico; ginecomastia; atrofia testicular; venas colaterales abdominales (caput medusa); niveles de ALT superiores a los de AST; niveles elevados de gamma-glutamil-transpeptidasa (GGT) (el rango normal se considera típicamente entre 8 y 65 U/L) y de fosfatasa alcalina (ALP) (el rango normal se considera típicamente entre 44 y 147 UI/L (unidades internacionales por litro), no más de 3 veces el ULN); niveles ligeramente bajos de albúmina; niveles elevados de hierro sérico; leucopenia (es decir, granulocitopenia); linfocitosis; aumento de la velocidad de sedimentación globular (VSG); disminución de la supervivencia de los glóbulos rojos; hemólisis; trombocitopenia; prolongación de la relación internacional normalizada (INR); presencia en suero o en el hígado de HBsAg, HBeAg, anticuerpos del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc), inmunoglobulina M (IgM), anticuerpos de superficie de la hepatitis B (anti-HBs), anticuerpos e de la hepatitis B (anti-HBe) o ADN de VHB; aumento de los niveles de bilirrubina; hiperglobulinemia, presencia de anticuerpos no específicos de tejido, como anticuerpos anti-músculo liso (ASMA) o anticuerpos antinucleares (ANA) (10-20%); la presencia de anticuerpos específicos de tejido, como anticuerpos contra la glándula tiroidea (10-20%); niveles elevados de factor reumatoide (FR); recuentos bajos de plaquetas y glóbulos blancos; lobular, con cambios hepatocelulares degenerativos y regenerativos y la inflamación que los acompaña; y necrosis predominantemente centrilobular, ya sea detectable o indetectable. El riesgo de desarrollar, por ejemplo, fibrosis hepática, se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o más factores de riesgo de fibrosis hepática, por ejemplo infección crónica por hepatitis B, no desarrolla fibrosis hepática o desarrolla fibrosis hepática con menor gravedad en relación con una población que tiene los mismos factores de riesgo y no recibe el tratamiento aquí descrito. "Tratamiento" también puede significar la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada en ausencia de tratamiento.
Tal y como se usan aquí, los términos "prevenir" o "prevención" se refieren a la imposibilidad de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección o a la reducción del desarrollo de un signo o síntoma asociado a tal enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo en una cantidad clínicamente relevante) o a la exhibición de signos o síntomas retrasados (por ejemplo en días, semanas, meses o años). La prevención puede requerir la administración de más de una dosis.
En algunas realizaciones, el tratamiento de la infección por VHB resulta en una "curación funcional" de la hepatitis B. Tal como se usa aquí, la curación funcional se entiende como la eliminación del HBsAg circulante y puede ir acompañada de la conversión a un estado en el que los anticuerpos contra HBsAg sean detectables mediante un ensayo clínicamente relevante. Por ejemplo, los anticuerpos detectables pueden incluir una señal superior a 10 mIU/ml medida mediante un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscente (CMIA) o cualquier otro inmunoensayo. La cura funcional no requiere la eliminación de todas las formas replicativas del VHB (por ejemplo el ADNccc del hígado). La seroconversión anti-HBs se produce de forma espontánea en aproximadamente el 0,2-1% de los pacientes infectados crónicamente al año. Sin embargo, incluso después de la seroconversión anti-HBs, suele observarse una persistencia de bajo nivel del VHB durante décadas, lo que indica que se produce una curación funcional más que completa. Sin estar ligado a un mecanismo concreto, el sistema inmunitario puede ser capaz de mantener el VHB bajo control en condiciones en las que se ha alcanzado una cura funcional. Una cura funcional permite interrumpir cualquier tratamiento para la infección por VHB. Sin embargo, se entiende que una "cura funcional" de la infección por VHB puede no ser suficiente para prevenir o tratar enfermedades o afecciones derivadas de la infección por VHB, por ejemplo fibrosis hepática, HCC o cirrosis. En algunas realizaciones específicas, una "cura funcional" puede referirse a una reducción sostenida del HBsAg en suero, como <1 UI/ml, durante al menos 3 meses, al menos 6 meses o al menos un año tras el inicio de un régimen de tratamiento o la finalización de un régimen de tratamiento.
Tal y como se usa aquí, el término "enfermedad asociada al virus de la hepatitis B" o "enfermedad asociada al VHB" es una enfermedad o trastorno causado por la infección o replicación del VHB o asociado a ella. El término "enfermedad asociada al VHB" incluye una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción de la expresión o replicación génica del VHB. Ejemplos de enfermedades asociadas a VHB incluyen, por ejemplo, infección por el virus de la hepatitis D, hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B aguda fulminante; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática terminal; y carcinoma hepatocelular.
En algunas realizaciones, una enfermedad asociada al VHB es la infección por el virus de la hepatitis D. El virus de la hepatitis D o virus de la hepatitis delta (HDV) es un patógeno humano. Sin embargo, el virus es defectuoso y depende de las funciones auxiliares obligatorias proporcionadas por el virus de la hepatitis B (VHB) para su transmisión; de hecho, el HDV requiere una infección asociada o preexistente por VHB para ser infeccioso y desarrollarse, en particular, la envoltura viral que contiene el antígeno de superficie de la hepatitis B. El HDV puede provocar formas graves de enfermedad hepática aguda y crónica en asociación con el VHB. La infección por hepatitis D o hepatitis delta es altamente endémica en varios países africanos, la región amazónica y Oriente Medio, mientras que su prevalencia es baja en los países industrializados, excepto en el Mediterráneo.
La transmisión del HDV puede producirse a través de la infección simultánea con VHB (coinfección) o superpuesta a la hepatitis B crónica o al estado de portador de la hepatitis B (sobreinfección). Tanto la superinfección como la coinfección con el HDV suelen dar lugar a complicaciones más graves en comparación con la infección por el VHB únicamente. Estas complicaciones incluyen una mayor probabilidad de experimentar insuficiencia hepática en las infecciones agudas y una rápida progresión hacia la cirrosis hepática, con una mayor probabilidad de desarrollar cáncer de hígado en las infecciones crónicas. En combinación con el virus de la hepatitis B, la hepatitis D tiene la mayor tasa de mortalidad de todas las infecciones por hepatitis, con un 20%.
En algunas realizaciones, una enfermedad asociada al VHB es la hepatitis B aguda. La hepatitis B aguda incluye la inflamación del hígado que dura menos de seis meses. Los síntomas típicos de la hepatitis B aguda son fatiga, anorexia, náuseas y vómitos. A menudo se observan valores de aminotransferasa muy elevados (>1.000 U/L) e hiperbilirrubinemia. Los casos graves de hepatitis B aguda pueden evolucionar rápidamente hacia una insuficiencia hepática aguda, marcada por una mala función sintética hepática. Esto suele definirse como un tiempo de protrombina (TP) de 16 segundos o una relación internacional normalizada (INR) de 1.5 en ausencia de enfermedad hepática previa. La hepatitis B aguda puede evolucionar hacia una hepatitis B crónica.
En algunas realizaciones, una enfermedad asociada al VHB es la hepatitis crónica. La hepatitis B crónica (CHB) incluye la inflamación del hígado que dura más de seis meses. Los sujetos que padecen CHB son positivos al HBsAg y tienen una viremia alta (>104 copias de ADN-VHB / ml de sangre) o baja (<103 copias de ADN-VHB / ml de sangre). En ciertas realizaciones, los sujetos han estado infectados por VHB durante al menos cinco años. En ciertas realizaciones, los sujetos han estado infectados por VHB durante al menos diez años. En ciertas realizaciones, los sujetos se infectaron con VHB al nacer. Los sujetos con hepatitis B crónica pueden ser inmunotolerantes o tener una infección crónica inactiva sin ninguna evidencia de enfermedad activa y también son asintomáticos. Los pacientes con hepatitis crónica activa, especialmente durante el estado replicativo, pueden presentar síntomas similares a los de la hepatitis aguda. Los sujetos con hepatitis B crónica pueden tener una infección crónica activa acompañada de una enfermedad hepática necroinflamatoria, tener un aumento del recambio de hepatocitos en ausencia de necroinflamación detectable o tener una infección crónica inactiva sin ninguna evidencia de enfermedad activa y también son asintomáticos. La persistencia de la infección por VHB en los sujetos con HBC es el resultado del<a>D<n>del VHBccc. En algunas realizaciones, un sujeto que padece CHB es HBeAg positivo. En otras, el sujeto con HBeAg es negativo. Los sujetos que padecen CHB tienen un nivel de ADN del VHB en suero inferior a 105 y una elevación persistente de las transaminasas, por ejemplo ALT, AST y gammaglutamil-transferasa. Un sujeto con CHB puede tener una puntuación de biopsia hepática inferior a 4 (por ejemplo, una puntuación de necroinflamación).
En algunas realizaciones, una enfermedad asociada al VHB es la hepatitis B fulminante aguda. Un sujeto que tiene hepatitis B fulminante aguda tiene síntomas de hepatitis aguda y los síntomas adicionales de confusión o coma (debido a la incapacidad del hígado para desintoxicar sustancias químicas) y hematomas o hemorragias (debido a la falta de factores de coagulación sanguínea).
Los sujetos que padecen una infección por VHB, por ejemplo HBC, pueden desarrollar fibrosis hepática. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una enfermedad asociada al VHB es la fibrosis hepática. La fibrosis hepática, o cirrosis, se define histológicamente como un proceso hepático difuso caracterizado por fibrosis (exceso de tejido conectivo fibroso) y la conversión de la arquitectura hepática normal en nódulos estructuralmente anormales.
Los sujetos que padecen una infección por VHB, por ejemplo HBC, pueden desarrollar una enfermedad hepática terminal. En consecuencia, en algunas realizaciones, una enfermedad asociada al VHB es una enfermedad hepática terminal. Por ejemplo, la fibrosis hepática puede progresar hasta un punto en el que el organismo ya no puede compensar, por ejemplo la reducción de la función hepática, como resultado de la fibrosis hepática (es decir, el hígado descompensado), y dar lugar a, por ejemplo, síntomas mentales y neurológicos e insuficiencia hepática.
Los sujetos que padecen una infección por VHB, por ejemplo CHB, pueden desarrollar un carcinoma hepatocelular (HCC), también denominado hepatoma maligno. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una enfermedad asociada al VHB es el HCC. El h Cc se desarrolla comúnmente en sujetos que tienen CHB y puede ser fibrolaminar, pseudoglandular (adenoide), pleomórfico (de células gigantes) o de células claras.
Un "trastorno asociado al HDV" o un "trastorno asociado al virus de la hepatitis D" es una enfermedad o trastorno asociado a la expresión de un HDV. Algunos ejemplos de trastornos asociados al HDV son la infección por el virus de la hepatitis B, la hepatitis B aguda, la hepatitis D aguda y fulminante, la hepatitis D crónica, la fibrosis hepática, la enfermedad hepática terminal y el carcinoma hepatocelular.
"Cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa aquí, pretende incluir la cantidad de un agente de ARNi o de un anticuerpo anti-VHB que, cuando se administra a un paciente para tratar a un sujeto que tiene una infección por VHB o una enfermedad asociada al VHB, es suficiente para desarrollar el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo disminuyendo o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de la misma). La "cantidad terapéuticamente eficaz" puede variar en función del agente de ARNi y/o del anticuerpo anti-VHB, de cómo se administren, de la enfermedad y su gravedad y de los antecedentes, la edad, el peso, los antecedentes familiares, la composición genética, el estadio de los procesos patológicos mediados por la expresión génica del VHB, los tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del paciente a tratar. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede requerir la administración de más de una dosis.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" también incluye una cantidad de un agente de ARNi o de un anticuerpo anti-VHB que produce algún efecto deseado con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. Los agentes terapéuticos (por ejemplo agentes de ARNi, anticuerpos anti-VHB) usados en los métodos de la presente descripción pueden administrarse en una cantidad suficiente para producir una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a tal tratamiento.
El término "muestra", tal y como se usa aquí, incluye una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina y saliva. Las muestras de tejido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras pueden derivarse de órganos particulares, partes de órganos o de fluidos o células dentro de esos órganos. En ciertas realizaciones, las muestras pueden derivarse del hígado (por ejemplo el hígado entero o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células del hígado, por ejemplo hepatocitos). En ciertas realizaciones, una "muestra derivada de un sujeto" se refiere a la sangre o al plasma o suero obtenido de la sangre extraída del sujeto. En otras realizaciones, una "muestra derivada de un sujeto" se refiere a tejido hepático (o subcomponentes del mismo) o tejido sanguíneo (o subcomponentes del mismo, por ejemplo suero) derivado del sujeto.
En algunas realizaciones de los presentes métodos para tratar la infección crónica por VHB de la presente descripción en un sujeto que lo necesita comprenden: (i) administrar al sujeto un agente que reduce la carga antigénica de VHB; y (ii) administrar al sujeto un anticuerpo anti-VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. El agente que reduce la carga antigénica del VHB se administra antes del anticuerpo anti-VHB. En ciertas realizaciones, la administración del agente que reduce la carga antigénica del VHB antes del anticuerpo anti-VHB hace que la carga viral se reduzca cuando se administra el anticuerpo anti-VHB. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB de la terapia combinada es menor que una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB administrada cuando el agente que reduce la carga antigénica del VHB no se ha administrado al sujeto (por ejemplo cuando el anticuerpo anti-VHB se administra solo como monoterapia). En algunas realizaciones, el agente que reduce la carga antigénica del VHB es un ARNsi que inhibe la expresión de un transcripto del VHB.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el método de tratar una infección crónica por VHB en un sujeto que lo necesita comprende: administrar al sujeto un agente que reduce la carga antigénica del VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas; y administrar al sujeto un anticuerpo anti-VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas; y comprende además medir la cantidad de HBsAg presente en una muestra de sangre del sujeto antes y después de administrar el agente que reduce la carga antigénica del VHB, donde una disminución de HBsAg indica una expresión reducida del al menos un gen del VHB.
La presente descripción proporciona un agente anti-VHB para su uso en el tratamiento de una infección crónica por VHB en un sujeto, y al sujeto se le ha administrado previamente un agente que reduce la carga antigénica del VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. En otras realizaciones, la expresión de al menos un gen de VHB se reduce tras la administración del agente que reduce la carga antigénica de VHB y el anticuerpo anti-VHB se administra al sujeto cuando se reduce la expresión del al menos un gen de VHB.
En algunas realizaciones de la presente descripción los métodos para tratar la infección crónica por VHB o una enfermedad asociada a VHB en un sujeto que lo necesita comprenden: (i) administrar al sujeto un inhibidor de la expresión génica de VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas; y (ii) administrar al sujeto un anticuerpo anti-VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. El inhibidor de la expresión génica de VHB se administra antes del anticuerpo contra el<v>H<b>. En ciertas realizaciones, la administración del inhibidor de la expresión génica de VHB antes del anticuerpo anti-VHB hace que la carga viral se reduzca cuando se administra el anticuerpo anti-VHB. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo anti-VHB de la terapia combinada es menor que una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB administrada cuando no se ha administrado el inhibidor de la expresión génica de VHB al sujeto (por ejemplo cuando el anticuerpo anti-VHB se administra solo como monoterapia).
En ciertas realizaciones, la expresión de al menos un gen de VHB se reduce después de administrar el inhibidor de la expresión génica de VHB y el anticuerpo anti-VHB se administra al sujeto cuando se reduce la expresión del al menos un gen de VHB. En realizaciones particulares, el al menos un gen de VHB es el gen X de VHB y/o HBsAg.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el método para tratar una infección crónica por VHB en un sujeto que lo necesita comprende: administrar al sujeto un inhibidor de la expresión génica de VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas; y administrar al sujeto un anticuerpo anti-VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas; y comprende además medir la cantidad de HBsAg presente en una muestra de sangre del sujeto antes y después de administrar el inhibidor de la expresión del VHB, donde una disminución de HBsAg indica una expresión reducida del al menos un gen de VHB.
La presente descripción proporciona un anticuerpo anti-VHB para su uso en el tratamiento de una infección crónica por VHB en un sujeto y al sujeto se le ha administrado previamente un inhibidor de la expresión génica tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. En otras realizaciones, la expresión de al menos un gen de VHB se reduce tras la administración del inhibidor de la expresión génica de VHB y el anticuerpo anti-VHB se administra al sujeto cuando se reduce la expresión del al menos un gen de VHB.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la expresión génica de VHB se administra en una dosis única, dos dosis, tres dosis, cuatro dosis o cinco dosis, seis dosis, siete dosis u ocho dosis. La dosis o las dosis pueden administrarse, por ejemplo, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, dos veces por semana, una vez por semana, semanas alternas, cada cuatro semanas o una vez al mes.
En ciertas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-VHB comprende administrar el anticuerpo anti-VHB dos veces por semana, una vez por semana, cada dos semanas, semanas alternas o una vez al mes.
En ciertas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-VHB comprende administrar al menos dos dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB. En ciertas realizaciones adicionales, las al menos dos dosis se administran dos veces por semana, una vez por semana, cada dos semanas, semanas alternas o una vez al mes.
En ciertas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-VHB comienza al menos una semana después de la administración del inhibidor de la expresión génica de VHB. En ciertas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-VHB comienza 2 semanas después de la administración del inhibidor de la expresión génica de VHB. En ciertas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-VHB comienza 8 semanas después de la administración del inhibidor de la expresión génica de VHB.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB y el inhibidor de la expresión génica de VHB se administran en cada caso vía subcutánea.
En las realizaciones particulares de los métodos, composiciones para su uso o usos en la fabricación, el anticuerpo anti-VHB puede reconocer los genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J de VHB.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso, el anticuerpo anti-VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas puede ser un anticuerpo humano; un anticuerpo monoclonal; o un anticuerpo biespecífico, con una primera especificidad para HBsAg y una segunda especificidad que estimula un efector inmunitario (por ejemplo una segunda especificidad que estimula la citotoxicidad o un efecto vacunal). En algunas otras realizaciones de las composiciones para su uso anteriores aquí descritas, el anticuerpo anti-VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas es un anticuerpo monoclonal.
En realizaciones particulares de las composiciones anteriores para su uso, el anticuerpo anti-VHB puede ser HBC34 o una variante no natural de HBC34 tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB comprende las CDR con las secuencias de aminoácidos (i) según las SEQ ID NO:44, 45, 47-49 y 51; o (ii) según las SEQ ID NO:44, 45, 47-49 y 52. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB comprende las CDR con las secuencias de aminoácidos según las SEQ ID NO:44, 45, 47, 48, 49 y 51. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB comprende las CDR con las secuencias de aminoácidos según las SEQ ID NO:44, 45, 47, 48, 49 y 52. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB comprende: (1) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de conformidad con cualquiera de las SEQ ID NO.:55-63; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:53: o (2) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:55-57 y 64-69; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:54.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB comprende: (1) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:55-69; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:53: o (2) (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:55-69; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:54.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO:59; y (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO:53.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO:58; y (b) una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO:53.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una cadena ligera que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:73 y (b) una cadena pesada que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:70-72 y 97.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una cadena ligera que es al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:74 y (b) una cadena pesada que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:70-72 y 97.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una cadena ligera que es al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO.:83-95 y (b) una cadena pesada que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:70-72, 97 y 98.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera según la SEQ ID NO.:73 y (b) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada según la SEQ ID NO:70.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera según la<s>E<q>ID NO:73 y (b) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada según la SEQ ID NO:71.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso, el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera según SEQ ID NO:74 y (b) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada según SEQ ID NO:70.
En algunas otras realizaciones de las composiciones anteriores para su uso, el anticuerpo anti-VHB comprende las CDR con las secuencias de aminoácidos según las SEQ ID n O:77-82. En ciertas realizaciones de los métodos, composiciones para su uso o usos en la fabricación anteriores, el anticuerpo anti-VHB comprende (a) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO:76; y (b) una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO:75.
En ciertas realizaciones de las composiciones para su uso anteriores, el anticuerpo anti-VHB comprende (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:76 y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO:75.
En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB es menor que una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB administrada cuando el inhibidor de la expresión génica de VHB no se ha administrado al sujeto. Por ejemplo, la terapia combinada puede reducir la dosis eficaz del anticuerpo anti-VHB en comparación con la administración del anticuerpo anti-VHB solo.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB se administra en al menos dos dosis separadas. En realizaciones particulares, las al menos dos dosis se administran dos veces por semana, una vez por semana, cada dos semanas, semanas alternas o una vez al mes.
En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano y se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB, donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso anteriores, el inhibidor es un agente de ARNi tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas que inhibe la expresión de un transcripto de VHB. En algunas realizaciones, la inhibición de la expresión de un transcripto de VHB se mide por rtPCR. En algunas realizaciones, la inhibición de la expresión de un transcripto de VHB se mide mediante la reducción de los niveles de proteína medida por ELISA.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso anteriores, al menos una hebra del agente de ARNi puede comprender un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o al menos 2 nucleótidos.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso anteriores, la región de doble hebra del agente de ARNi puede tener 23-27 pares de nucleótidos de longitud, 19-21 pares de nucleótidos de longitud o 21-23 pares de nucleótidos de longitud.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso anteriores, cada hebra del agente de ARNi puede ser de 19-30 nucleótidos.
El agente de ARNi es un ARNsi. En realizaciones particulares, el ARNsi inhibe la expresión de un transcripto de VHB que codifica una proteína HBsAg, una proteína HBcAg y una proteína HBx, o una proteína ADN polimerasa de VHB. En ciertas realizaciones, el ARNsi se une a al menos 15 nucleótidos contiguos de una diana codificada por un Gen P, los nucleótidos 2309-3182 y 1-1625 de NC_003977.2; un gen S (que codifica las proteínas L, M y S), los nucleótidos 2850-3182 y 1-837 de NC_003977.2; HBx, nucleótidos 1376-1840 de NC_003977.2; o gen C, nucleótidos 1816-2454 de NC_003977.2.
En realizaciones particulares, el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un enlazador monovalente, un enlazador ramificado bivalente o un enlazador ramificado trivalente. Específicamente, el derivado de GalNAc unido a través de un enlazador es o comprende:
En realizaciones particulares, el ARNsi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema (es decir, el derivado GalNAc unido a través de un enlazador es):
donde X es O o S.
El agente de ARNi es un ARNsi tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas, donde al menos un nucleótido del ARNsi es un nucleótido modificado que comprende un desoxinucleótido, un nucleótido 3'-terminal de desoxitimina (dT), un nucleótido modificado 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluor, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido conformacionalmente restringido, un nucleótido etílico restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, un nucleótido modificado con 2'-C-alilo, un nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato, un nucleótido con base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un 1,5-anhidrohexitol modificado, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato, un ácido nucleico adenosin-glicol o un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato. En ciertas realizaciones, el ARNsi comprende una modificación del esqueleto fosfato, una modificación de 2' ribosa, una modificación de 5' trifosfato o una modificación de conjugación de GalNAc. En ciertas realizaciones, la modificación del esqueleto fosfato comprende un enlace fosforotioato. En ciertas realizaciones, la modificación 2' ribosa comprende una sustitución fluorada u -O-metilada.
El agente de ARNi es un ARNsi con una hebra sentido que comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3' (SEQ ID NO:7) y una hebra antisentido que comprende 5'- usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO:8),
donde a, c, g y u son 2'-O-metiladenosin-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosin-3'-fosfato y 2'-O-metiluridin-3'-fosfato, respectivamente;
Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoroadenosin-3'-fosfato, 2'-fluorocitidin-3'-fosfato, 2'-fluoroguanosin-3'-fosfato y 2'-fluorouridin-3'-fosfato, respectivamente;
(Agn) es un ácido nucleico adenosin-glicol (GNA);
s es un enlace fosforotioato; y
L96 es N-[tris(GalNAc-alquil)amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol.
En realizaciones particulares de las composiciones para su uso anteriores, el sujeto es un humano y se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de<a>R<ní>o ARNsi, donde la cantidad eficaz de ARNi o ARNsi es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg.
En algunas realizaciones de las composiciones para su uso, el ARNsi se administra al sujeto dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, dos veces por semana, una vez por semana, cada dos semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes. En algunas realizaciones, el ARNsi se administra al sujeto cada cuatro semanas.
En ciertas realizaciones, los métodos incluyen la administración de dos inhibidores de la expresión génicos de VHB con un anticuerpo anti-VHB. Los dos inhibidores de la expresión génica de VHB pueden ser dos ARNsi, yal como dos ARNsi dirigidos a diferentes genes del VHB. Los dos genes diferentes de VHB pueden ser, por ejemplo, HBsAg y VHB X. Los dos inhibidores de la expresión génica de VHB pueden administrarse simultáneamente. En ciertas realizaciones, se administran dos ARNsi dirigidos cada uno a un gen de VHB y el primer ARNsi tiene una hebra antisentido que comprende la SEQ ID NO:8 y el segundo ARNsi comprende un ARNsi que tiene una hebra sentido que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 2850-3182 de la SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, se administran dos ARNsi dirigidos cada uno a un gen del VHB y el primer ARNsi tiene una hebra antisentido que comprende la SEQ ID NO:8 y el segundo ARNsi tiene una hebra sentido que comprende la SEQ ID NO: 107 o la SEQ ID NO:109. En ciertas realizaciones, el primer ARNsi tiene una hebra sentido que comprende la SEC. ID NO:7 y el segundo ARNsi tiene una hebra sentido que comprende la SEQID NO:106 o la SEQ ID NO:108.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VHB y el inhibidor de la expresión génica del VHB presentan un efecto terapéutico sinérgico. El término "sinergia" se usa para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. Así, cuando el efecto combinado de dos o más agentes da lugar a una "inhibición sinérgica" de una actividad o proceso, se pretende que la inhibición de la actividad o proceso sea mayor que la suma de los efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. El término "efecto terapéutico sinérgico" se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias en el que el efecto terapéutico (medido por cualquiera de los parámetros) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con las respectivas terapias individuales.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi dirigido a un ARNm del VHB se administra a un sujeto que tiene una infección por VHB de manera que la expresión de uno o más genes del VHB, los niveles de ADNccc del VHB, los niveles de antígeno de VHB, los niveles de carga viral de VHB, ALT y/o AST, por ejemplo en una célula, tejido, sangre o fluido del sujeto, se reduce al menos en un 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi dirigido a un ARNm del VHB se administra a un sujeto que tiene una infección por VHB, y/o una enfermedad asociada a VHB, e inhibe la expresión génica del VHB en al menos aproximadamente un 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o cerca del 100%, es decir, por debajo del nivel de detección del ensayo.
En algunas realizaciones, la terapia combinada según la presente descripción comprende administrar un análogo de nucleót(s)ido como tercer componente. Tal como se usa aquí, el término "análogo de nucleót(s)ido" (o "inhibidor de la polimerasa" o "inhibidor de la transcriptasa inversa") es un inhibidor de la replicación de ADN que es estructuralmente similar a un nucleótido o nucleósido y que inhibe específicamente la replicación del ADNccc del VHB y no inhibe significativamente la replicación del ADN del huésped (por ejemplo humano). Tales inhibidores incluyen tenofovir disoproxil fumarato (TDF), tenofovir alafenamida (TAF), lamivudina, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudina, AGX-1009, emtricitabina (FTC), clevudina, ritonavir, dipivoxil, lobucavir, famvir, N-acetilcisteína (NAC), PC1323, teradigm-VHB, timosina-alfa, ganciclovir, besifovir (ANA-380/LB-80380) y tenofvir-exaliades (TLX/CMX157). En ciertas realizaciones, el análogo de nucelót(s)ido es entecavir (ETV). Los análogos de nucelót(s)ido están disponibles en el mercado de diversas fuentes y se usan en los métodos aquí proporcionados según la indicación de su etiqueta (por ejemplo típicamente administrado vía oral a una dosis específica) o según lo determine un profesional experto en el tratamiento de VHB.
El anticuerpo anti-VHB o el inhibidor de la expresión génica del VHB pueden estar presentes en la misma composición farmacéutica que el tercer componente activo o el anticuerpo anti-VHB, el inhibidor de la expresión génica del VHB y el tercer componente activo están presentes en tres composiciones farmacéuticas diferentes. Tales composiciones farmacéuticas diferentes pueden administrarse combinadas/simultáneamente o en momentos separados o en lugares separados (por ejemplo en partes separadas del cuerpo).
V. Kits para la terapia combinada contra VHB
Se proporcionan aquí kits que incluyen componentes de la terapia contra el VHB tal como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. En algunas realizaciones, el kit incluye uno o más anticuerpos anti-VHB, uno o más inhibidores de la expresión génica del VHB y, opcionalmente, un tercer componente de la terapia combinada contra VHB (por ejemplo un análogo de nucelót(s)ido). Los kits pueden incluir además instrucciones para preparar y/o administrar los componentes de la terapia combinada contra el VHB.
Ejemplos
Ejemplo 1: la terapia combinada con un anticuerpo y un ARNsi dirigido al VHB disminuye los marcadores de infección por el VHB en ratones AAV-VHB
Para determinar si una terapia combinada de ARNsi y anticuerpos puede ser eficaz en el tratamiento de las infecciones por VHB, se administró a ratones C57BL/6 infectados por AAV/VHB uno de catorce tratamientos diferentes: (1) un ARNsi específico de VHB (VHB02, con una hebra antisentido de SEQ ID NO:8); (2)-(5) un anticuerpo contra VHB (una versión quimérica para ratones del anticuerpo HBC34v7, HBC34-v7-mu-IgG2a) en una de cuatro dosis; (6-7) ARNsi de VHB02 y el anticuerpo HBC34-v7-mu-IgG2a, en una de dos dosis de anticuerpos; (8-11) ARNsi VHB02, el anticuerpo HBC34-v7-mu-IgG2a y entecavir (ETV), en una de cuatro dosis de anticuerpos; (12) un ARNsi de control y un anticuerpo de control; (13) sólo entecavir; o (14) sólo solución salina (véase la Tabla 4).
Tabla 4. Niveles de tratamiento dosis
El VHB02 es un oligonucleótido de doble hebra sintetizado químicamente y unido covalentemente a un ligando que contiene tres residuos GalNAc. Todos los nucleósidos están modificados con 2'-OMe o 2'-F y un nucleósido de la hebra antisentido se ha sustituido por (S)-1-(2,3- dihidroxipropil)adenosina (Agn). Los nucleósidos de la hebra sentido y antisentido están unidos mediante enlaces fosfodiéster 3'-5' o enlaces fosforotioato 3'-5', que forman el esqueleto azúcar-fosfato del oligonucleótido.
El HBC34 es un anticuerpo monoclonal altamente neutralizante contra el antígeno de superficie de VHB (PreS1, PreS2 y S). El anticuerpo HBC34 usado en este experimento era un HBC34v7 totalmente murinizado, a excepción de la parte del fragmento Fab que se une al antígeno de superficie de VHB. El HBC34v7 humano tiene la secuencia VH como se establece en la<s>E<q>ID NO:53 y una secuencia VL como se establece en la SEQ ID NO:56. La versión quimérica de ratón de las secuencias HBC34v7 usadas en el anticuerpo HBC34-v7-mu-IgG2a para este experimento tenía las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y de cadena ligera que se establecen en las SEQ ID NO:99 y 100, respectivamente.
Se usó un ARNsi dirigido al gen de la transtiretina humana como ARNsi de control, ya que no se espera que cause una disminución de los marcadores de infección por VHB en suero.
El anticuerpo monoclonal (mAb) de control usado en este ejemplo era un anticuerpo específico para el virus sincitial respiratorio y no se espera que cause una disminución de los marcadores de infección por VHB en suero.
Ratones (cepa C57BL/6) fueron inoculados con la siguiente cantidad de rAAV8-1.3VHB cepa ayw, tipo D: 1,0X1011 genomas virales por ratón en un volumen de 200 |jl mediante inyección en la vena de la cola. Cuatro semanas después de la inoculación viral, se inició el tratamiento con los compuestos de ensayo.
El esquema de dosificación se muestra en la Figura 1. El entecavir se administró vía oral una vez al día. El ARNsi específico de VHB se administró vía subcutánea una vez al inicio del estudio y el anticuerpo anti-VHB se administró vía intraperitoneal dos veces por semana durante las semanas tres y cuatro del estudio. Un subconjunto de ratones fue sacrificado en la cuarta semana y el otro subconjunto fue sacrificado en la sexta semana del estudio.
Dos veces por semana se midió la carga viral, el HBsAg y el anticuerpo HBC34 libre en muestras de suero. También se midieron HBeAg sérico, alanina transferasa (ALT) sérica, HBcAg hepático, HBsAg hepático, ADN total de VHB en el hígado (mediante qPCR) y los anticuerpos anti-VHB séricos. Se analizaron los linfocitos hepáticos, los esplenocitos y los ganglios linfáticos (portal/celíacos frente a inguinales) para determinar la proporción de células IFNg+CD4+ específicas de VHB y de células IFNg+CD8+.
Los valores medios de HBsAg para los grupos de tratamiento se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Niveles de HBsAga en suero de ratón tras el tratamiento con un ARNsi específico de VHB, un anticuer o anti-VHB /o entecavir ETV o con controles
Las figuras 2A y 2B muestran la carga viral medida por el número de copias de ADN del VHB y las figuras 3A y 3B muestran los niveles de HBsAg en suero. Las Figuras 2A y 3A muestran, respectivamente, la carga viral y los niveles de HBsAg cuando se administraron solos el ARNsi VHB02 o el anticuerpo HBC34 (a 15 mg/kg). El ARNsi VHB02 redujo el ADN del VHB y el HBsAg en suero en ~0,5-log-i0 y 1-log-iü, respectivamente, en relación con el control salino. El anticuerpo HBC34 por sí solo no tuvo ningún efecto sobre el ADN del VHB y redujo el HBsAg sérico en <1-log-i0 en relación con el control salino. Las figuras 2B y 3B demuestran que el tratamiento con el ARNsi VHB02 y el anticuerpo HBC34 (a 15 mg/kg) redujo la carga viral y los niveles de HBsAg en ~3-log-i0, en relación con el control salino. La reducción del ADN del v Hb y del HBsAg en suero fue significativamente mayor cuando el ARNsi del VHB02 y el anticuerpo HBC34 se usaron en combinación en relación con el tratamiento con cualquiera de las moléculas por separado y el efecto combinado superó la suma de los efectos de las monoterapias. La terapia combinada también redujo la carga viral y los niveles de HbsAg más que el tratamiento con entecavir solo. Los efectos de la combinación de ARNsi de VHB02 y el anticuerpo HBC34 se observaron independientemente de que se administrara también entecavir. Estos resultados demuestran que el ARNsi VHB02 y el anticuerpo HBC34 tienen el potencial de actuar de forma sinérgica en la reducción de la carga viral y el HBsAg y este efecto es independiente del tratamiento con entecavir.
La Figura 4 muestra los niveles de anticuerpos libres contra el HBC34 medidos entre 14 y 42 días después del inicio del estudio en el Día 1 (Día 1 = administración de ARNsi a los grupos de tratamiento seleccionados). En comparación con el tratamiento con HBC34 solo, el tratamiento con el ARNsi VHB02 y la combinación de anticuerpos HBC34 dio lugar a niveles iniciales de anticuerpos libres mucho más altos, que se mantuvieron durante más de 28 días, independientemente de si el tratamiento incluía entecavir. Los resultados mostrados en la Figura 4, junto con la carga viral y los niveles séricos de HBsAg, indican que los efectos del tratamiento dependen de la cantidad de anticuerpo HBC34 libre circulante y que dosis más bajas del anticuerpo pueden ser eficaces a medida que la carga de HBsAg disminuye. Por ejemplo, una terapia combinada puede permitir tratamientos eficaces con: menos dosis de anticuerpo, dosis más bajas de anticuerpo, y/o vías de administración menos invasivas (por ejemplo, subcutáneas en lugar de intravenosas), basándose al menos en parte en la reducción de la carga de HBsAg antes del tratamiento con anticuerpos.
En resumen, este estudio demuestra que la administración de un ARNsi dirigido al VHB y, a continuación, la administración de un anticuerpo dirigido a VHB disminuye eficazmente el ADN del VHB y el HBsAg en suero. Además, los componentes individuales parecen interactuar de forma sinérgica, de modo que el efecto de esta terapia combinada es mayor que el de cada componente por separado y mayor que el que cabría esperar si los efectos fueran meramente aditivos. Por último, los resultados sugieren que la administración del ARNsi reduce el HBsAg sérico, permitiendo que el anticuerpo sea más eficaz.
Ejemplo 2: Terapia combinada con uno de dos anticuerpos anti-VHB y un ARNsi dirigido a VHB
Para determinar si una terapia combinada de ARNsi y anticuerpos usando un ARNsi y el anticuerpo anti-VHB HBC24 es eficaz para tratar las infecciones por VHB, se administró a ratones C57BL/6 infectados por AAV/VHB uno de once tratamientos diferentes: (1) un ARNsi específico de VHB (VHB02, con una hebra antisentido de SEQ ID NO:8; véase la descripción en el Ejemplo 1); (2)-(3) un anticuerpo contra VHB (un HBC24 totalmente murinizado), en una de dos dosis; (4)-(5) el ARNsi del VHB02 en una dosis y el HBC24 totalmente murinizado en una de dos dosis; (6-9) el ARNsi VHB02 en una de las dos dosis y un anticuerpo anti-VHB totalmente murinizado HBC34 (HBC34-v35-mu-IgG2a), en una de tres dosis de anticuerpos; (10) un ARNsi de control y un anticuerpo de control; o (11) sólo PBS, administrado vía intraperitoneal (véase la Tabla 6).
T l . Niv l r mi n i r l m l 2
Los anticuerpos HBC24 y HBC34 usados en este experimento están totalmente murinizados con la excepción de la parte del fragmento Fab que se une al antígeno de superficie de VHB. El HBC24 humano tiene una secuencia de aminoácidos VH como se establece en la SEQ ID NO:75 y una secuencia de aminoácidos VL como se establece en la SEQ ID NO:76. La versión murinizada de las secuencias del HBC24 usadas en el anticuerpo para este experimento tenía cadenas pesadas y ligeras que comprendían las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO:103 y 104, respectivamente. El anticuerpo HBC34 era una variante murinizada de HBC34v35, HBC34-v35-mu-IgG2a. El HBC34v35 humano tiene una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO:70 y una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO:73. La versión murinizada de las secuencias de HBC34v35 usadas en el anticuerpo HBC34-v35-mu-IgG2a para este experimento tenía cadenas pesadas y ligeras que comprendían las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO:101 y 102, respectivamente.
El ARNsi de control se dirige al gen de la transtiretina humana y no se espera que cause una disminución de los marcadores de infección por VHB en suero.
El anticuerpo monoclonal (mAb) de control era un anticuerpo específico para el virus sincitial respiratorio, que no se espera que cause una disminución de los marcadores de infección por VHB en suero.
Los tratamientos se administraron a un ratón WuXi inmunocomprometido con VHB. Este modelo murino se genera mediante la transducción de hepatocitos en ratones inmunocompetentes con un virus adenoasociado que contiene el genoma del VHB. Con este modelo, la producción de proteínas del VHB está bajo el control de promotores endógenos del VHB y los ratones desarrollan respuestas celulares y humorales de células T específicas del VHB. Sin embargo, no se produce infección por VHB, no se produce ADNccc, la replicación es transitoria y la respuesta inmunitaria se ve obstaculizada por la interferencia del vector.
Los ratones (cepa C57BL/6) fueron inoculados con rAAV8-1.3VHB cepa ayw, tipo D, mediante la inyección en la vena de la cola de un volumen de 200 pl que contenía 1,0X1011 genomas virales por ratón.
Cada grupo de tratamiento incluía cinco ratones. El ARNsi específico del VHB se administró vía subcutánea una vez al inicio del estudio y los anticuerpos anti-VHB se administraron vía intraperitoneal dos veces por semana, durante las semanas dos y tres del estudio. Los ratones fueron sacrificados en la sexta semana del estudio.
Se recolectaron muestras de suero periódicamente a lo largo del estudio y se midieron la carga viral, el HBsAg y el anticuerpo HBC34 libre. También se realizaron mediciones de HBeAg en suero, alanina transferasa (ALT) en suero, HBcAg en hígado, HBsAg en hígado, ADN total del VHB en hígado (mediante qPCR) y anticuerpos antiVHB en suero. Se analizaron los linfocitos hepáticos, los esplenocitos y los ganglios linfáticos (portal/celíacos frente a inguinales) para determinar la proporción de células IFNg+CD4+ específicas del VHB y de células IFNg+CD8+.
Los resultados del experimento se muestran en las Figuras 5A y 5B (concentración de ADN del VHB en suero), las Figuras 6A y 6B (concentración de HBsAg en suero) y las Figuras 7A y 7B (concentración de HBeAg en suero). La concentración sérica de ADN del VHB, la concentración de HBsAg y la concentración de HBeAg fueron menores para los ratones tratados con VHB02 y uno de los anticuerpos anti-VHB en relación con los ratones tratados con el ARNsi solo o con los controles. Este efecto se observó tanto para los anticuerpos HBC34 como para los HBC24. Además, el efecto fue mayor con dosis más altas de VHB02 y, cuando se usaron dosis más altas de VHB02, se consiguió una reducción del HBsAg con dosis más bajas de anticuerpos. Estos resultados proporcionan más pruebas de que el tratamiento combinado con VHB02 y un anticuerpo monoclonal dirigido al VHB reduce el HBsAg y el HBeAg más que la monoterapia con VHB02. Estos resultados también indican que dosis más altas de ARNsi antes de la administración del anticuerpo pueden proporcionar una disminución similar del HBsAg a dosis más bajas de anticuerpo.
Ejemplo 3: Eliminación sérica de HBsAg e inhibición de la entrada del virus en un modelo de ratón
Se usó un ratón inmunodeficiente con hepatocitos humanos trasplantados para probar la eficacia de una terapia combinada con un ARNsi específico de VHB y un anticuerpo anti-VHB para eliminar HBsAg. El modelo<p>XB-Mouse® (PhoenixBio, Japón) usa el ratón uPA/SciD para generar ratones con >70% de repoblación del hígado de ratón con hepatocitos humanos (Ohshita H y Tateno C, Methods Mol Biol. 1506:91-100, (2017)). A diferencia del modelo AAV-VHB, el ADNccc se establece y puede producirse la propagación intrahepática del VHB.
Se trasplantaron hepatocitos humanos primarios a ratones SCID a los que se les había destruido previamente los hepatocitos de ratón mediante enzimas. Los ratones eran deficientes en células T y B. Este modelo es útil para estudiar la infección por el VHB, incluyendo la entrada, la propagación, la regulación del ADNccc, las respuestas inmunitarias intrínsecas del hepatocito y la integración viral en el genoma del huésped. Este modelo también puede usarse para estudiar el efecto del IFNa humano en la infección. Sin embargo, este modelo no incluye la inducción de una respuesta inmunitaria adaptativa. Los ratones fueron inoculados mediante una inyección en la vena de la cola con el genotipo C del VHB a razón de 1,0X107 genomas virales por ratón. Los tratamientos comenzaron ocho semanas después de la infección.
A los ratones infectados por el VHB (n=4 por grupo de tratamiento) se les administró uno de siete tratamientos diferentes: (1) sólo PBS; (2-4) un anticuerpo anti-VHB (un anticuerpo HBC34v35 totalmente murinizado, HBC34-v35-mu-IgG2a), en una de tres dosis, administrado vía intraperitoneal dos veces por semana durante las semanas dos y tres; o (5-7) un ARNsi específico del VHB (VHB02, con una hebra antisentido de SEQ ID NO:8; véase la descripción en el Ejemplo 1) administrado vía subcutánea una vez al comienzo del estudio y HBC34v35 totalmente murinizado, en una de tres dosis de anticuerpos, administrado vía intraperitoneal dos veces por semana durante las semanas dos y tres (véase la Tabla 7). Los ratones fueron sacrificados en la semana 6. El diseño del estudio también se muestra en la Figura 8.
Tabla 7. Niveles de tratamiento dosis
El anticuerpo HBC34 usado en este experimento, HBC34v35, estaba totalmente murinizado con la excepción de la parte del fragmento Fab que se une al antígeno de superficie de VHB. El HBC34v35 humano tiene una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO:70 y una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO:73. La versión murinizada de las secuencias de HBC34v35 usadas en el anticuerpo HBC34-v35-mu-IgG2a para este experimento tenía cadenas pesadas y ligeras que comprendían las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO:101 y 102, respectivamente.
Se recolectaron muestras de suero periódicamente a lo largo del estudio y se midieron la carga viral, el HBsAg y el anticuerpo HBC34 libre. También se midieron el HBeAg sérico, la alanina transferasa (ALT) sérica, el HBcAg hepático, el HBsAg hepático, el ADN total del VHB en el hígado (mediante qPCR) y los anticuerpos anti-VHB séricos. Se analizaron los linfocitos hepáticos, los esplenocitos y los ganglios linfáticos (portal/celíacos frente a inguinales) para determinar la proporción de células IFNg+CD4+ específicas del VHB y de células IFNg+CD8+.
La administración de la combinación de ARNsi y anticuerpos contra el VHB redujo la concentración sérica de ADN del VHB (Figura 9) y la concentración sérica de HBsAg (Figura 10) en relación con la administración del anticuerpo a la misma dosis. Se observaron tendencias similares para la concentración sérica de HBeAg (Figura 11) y la concentración sérica de HBcrAg (Figura 12). Además, en este sistema modelo, el anticuerpo también funciona como inhibidor de la entrada del virus en los hepatocitos; la concentración de ADN del VHB en suero (Figura 9) y la concentración de HBsAg en suero (Figura 10) también fueron menores cuando se administró el anticuerpo HBC34 como monoterapia (es decir, no en combinación con el ARNsi) a 15 mg/kg.
Este estudio proporciona apoyo experimental en un modelo de infección auténtico de que el ARNsi VHB02 y un anticuerpo<h>B<c>34, cuando se administran en combinación, disminuyen el ADN del VHB y los niveles de HBsAg en mayor medida que la monoterapia con HBC34.
Ejemplo 4: Evaluación clínica de una terapia combinada de ARNsi y anticuerpos para tratar la infección crónica por VHB
Se lleva a cabo un estudio clínico de fase 2 de una terapia combinada de ARNsi y anticuerpos para evaluar la eficacia de la terapia combinada en pacientes humanos con infección crónica por VHB. La tabla 8 muestra los regímenes de tratamiento para el estudio. El estudio puede incluir cohortes adicionales para probar los efectos de terapias adicionales en la terapia de combinación (por ejemplo, nueve cohortes, si se prueban dos terapias adicionales). Cada grupo/cohorte incluye quince pacientes.
T l . Niv l r mi n i r l n líni
La Figura 13 muestra un programa de tratamiento diseñado para el estudio de fase 2. El estudio incluye veinticuatro semanas de tratamiento y veinticuatro semanas de seguimiento. Todos los pacientes son no cirróticos y están suprimidos por NUC (tratados con un análogo de nucleót(s)ido) al entrar en el estudio. Todas las cohortes de pacientes pueden recibir un tratamiento con NUC a lo largo del estudio (por ejemplo tenofivir o entecavir administrados vía oral diariamente). El estudio comienza con todas las cohortes que reciben un tratamiento de introducción de ocho semanas con el ARNsi VHB02. Las dosis de VHB02 pueden ser, por ejemplo, dos dosis de 400 mg administradas por vía subcutánea, cada cuatro semanas. Sin embargo, la dosis adecuada puede determinarse mediante un ensayo de monoterapia previo al ensayo de fase 2. Tras ocho semanas de estudio, todas las cohortes continúan el tratamiento con VHB02; las cohortes 2, 4 y 6 comienzan el tratamiento con una dosis baja de un anticuerpo HBC34 (HBC34v35); las cohortes 3, 5 y 7 comienzan el tratamiento con una dosis más alta de anticuerpo HBC34; y la cohorte 1 no recibe el tratamiento con anticuerpos HBC34. La dosis baja de HBC34v35 puede ser, por ejemplo, 0.5 gramos administrados vía intravenosa, cada dos semanas; y la dosis más alta puede ser, por ejemplo, 2 gramos administrados vía intravenosa, cada dos semanas. Las dosis adecuadas pueden verificarse con un ensayo de monoterapia antes del ensayo de fase 2. Durante la duodécima semana del estudio, las cohortes 1-3 pueden recibir una terapéutica adicional, una vez por semana. Además, algunas cohortes (por ejemplo, las cohortes 6 y 7) pueden recibir otra terapia. Después de 24 semanas de tratamiento, los pacientes son controlados y evaluados para determinar si se ha logrado una cura funcional, indicada por la pérdida de HBsAg sérico detectable y/o la seroconversión anti-HBs.

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende un anticuerpo anti-VHB para su uso en el tratamiento de una infección crónica por VHB en un sujeto, donde a) el anticuerpo anti-VHB comprende (i) secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de acuerdo con las SEQ ID NO:44, 45 o 46 y 47, respectivamente; y (ii) secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de acuerdo con las SEQ ID NO:48, 49 o 50 y 52 o 51, respectivamente; y b) al sujeto le ha sido administrado previamente un inhibidor de la expression génica o un agente que reduce la carga antigénica de VHB, donde el inhibidor de la expression génica de VHB o el agente que reduce la carga antigénica de VHB es un ARNsi que inhibe la expresión de un transcrpto de VHB, teniendo el ARNsi una hebra sentido que comprende 5'gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO:7) y una hebra antisentido que comprende 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO:8), donde: (i) a, c, g y u son 2'-O-metiladenosin-3'-fosfato, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosin-3'-fosfato y 2'-O-metiluridin-3'-fosfato, respectivamente; (ii) Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoroadenosin-3'-fosfato, 2'-fluorocitidin-3'-fosfato, 2'-fluoroguanosin-3'-fosfato y 2'-fluorouridin-3'-fosfato, respectivamente; (iii) (Agn) es un ácido nucleico adenosin-glicol (GNA); (iv) s es un enlace fosforotioato; y (v) L96 es N-[tris(GalNAc-alquil)amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol. la composición comprende un y al sujeto se le ha administrado previamente un agente que reduce la carga antigénica del VHB.
  2. 2. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde la expresión de al menos un gen de VHB se reduce tras la administración del inhibidor de la expresión génica de VHB o del agente que reduce la carga antigénica de VHB y donde el anticuerpo anti-VHB se administra al sujeto cuando se reduce la expresión del al menos un gen del VHB.
  3. 3. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde (a) una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB es inferior a una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB suministrada cuando no se ha administrado el inhibidor de la expresión génica de VHB o el agente que reduce la carga antigénica de VHB o (b) la administración del anticuerpo anti-VHB comienza al menos una semana después de la administración del inhibidor de la expresión génica de VHB o del agente que reduce la carga antigénica de VHB.
  4. 4. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la administración del anticuerpo anti-VHB comprende administrar al menos dos dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB.
  5. 5. La composición para su uso según la reivindicación 4, donde las al menos dos dosis se administran dos veces a la semana, una vez a la semana, semanas alternas, cada dos semanas o una vez al mes.
  6. 6. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo anti-VHB se administra subcutáneamente.
  7. 7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo anti-VHB comprende: i. Las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2yCDRH3 según las SEQ ID NO:44, 45y47 respectivamente; y ii. Las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2yCDRL3 según las SEQ ID NO:48, 49y52 respectivamente.
  8. 8. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo anti-VHB comprende: i. Las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2yCDRH3 según las SEQ ID NO:44,y47 respectivamente; y ii. Las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2yCDRL3 según las SEQ ID NO:48, 49y51 respectivamente.
  9. 9. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:55-69; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:53 o (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:55-69; y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:54.
  10. 10. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) un dominio variable de cadena ligera (VL) con la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:59 y (b) un dominio variable de cadena pesada (VH) con la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:53.
  11. 11. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una cadena ligera que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:73; y (b) una cadena pesada que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:70-72 y 97; o (a) una cadena ligera que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:74; y (b) una cadena pesada que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:70-72 y 97; o (a) una cadena ligera que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en las SEQ ID NO:83-95; y (b) una cadena pesada que es al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO:70-72 y 98.
  12. 12. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo anti-VHB comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera según la SEQ ID NO:73; y (b) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada según la SEQ ID NO:70; o (a) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera según la SEQ ID NO:73; y (b) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada según la SEQ ID NO:71.
  13. 13. La composición de la reivindicación 12, donde el anticuerpo anti-VHB comprende (a) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera según la SEQ ID NO:73 y (b) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada según la SEQ ID NO:71.
  14. 14. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto es un humano y se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VHB, siendo la cantidad terapéuticamente eficaz de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.
  15. 15. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ARNsi está
  16. 16. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde (a) el sujeto es un humano y se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de ARNsi al sujeto, y donde la cantidad terapéuticamente eficaz de ARNsi es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg; o (b) el ARNsi se administra al sujeto dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, dos veces a la semana, una vez a la semana, en semanas alternas, cada cuatro semanas o una vez al mes.
  17. 17. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al sujeto también se le administra un análogo de la nucelót(s)ido.
  18. 18. Un kit que comprende: (1) una composición farmacéutica que comprende un agente de ARNi dirigido a un ARNm codificado por un gen del VHB y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el agente de ARNi es un ARNsi que tiene una hebra sentido que comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO:7) y una hebra antisentido que comprende 5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO:8), donde: (i) a, c, g y u son 2'-O-metiladenosin-3'fosfato, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfato, 2'-O-metilguanosin-3'-fosfato y 2'-O-metiluridin-3'-fosfato, respectivamente; (ii) Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoroadenosin-3'-fosfato, 2'-fluorocitidin-3'-fosfato, 2'-fluoroguanosin-3'-fosfato y 2'-fluorouridin-3'-fosfato, respectivamente; (iii) (Agn) es un ácido nucleico adenosin-glicol (GNA); (iv) s es un enlace fosforotioato; y (v) L96 es N-[tris(GalNAc-alquil)amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol; y (2) una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VHB y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el anticuerpo anti-VHB comprende (i) una secuencia de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 según las SEQ ID<n>O:44, 45 o 46 y 47, respectivamente; y (ii) una secuencia de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 según las SEQ ID NO:48, 49 o 50 y 52 o 51, respectivamente.
  19. 19. El kit según la reivindicación 18, donde el anticuerpo anti-VHB comprende un anticuerpo tal como se establece en cualquiera de las reivindicaciones 7-13, opcionalmente donde el ARNsi es como se establece en la reivindicación 15.
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