JP2023123449A - Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）感染を有する対象を処置する方法 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）感染を有する対象を処置する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＨＢＶ感染を有する患者を処置する方法を提供する。【解決手段】ＨＢＶ感染を有する患者に、ａ)少なとも３つのＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；ｂ)第一ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第一ＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質ベースのワクチン；およびｃ)第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチン、を連続的に投与することを含む方法とする。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１７年４月１８日出願の米国仮出願６２／４８６,６１８、２０１７年９月１日出願の米国仮出願６２／５５３,３５８、２０１８の３月２３日出願の米国仮出願６２／６４６,９７８および２０１８年４月１１日出願の米国仮出願６２／６５５,８６２に基づく優先権を主張する。前記仮出願の各々の全内容を、引用により本明細書に包含させる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提供し、その全体を引用により包含させる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年４月１２日に作成し、121301-07220_SL.txtなる名称であり、サイズは４２９,８４１バイトである。
発明の背景
Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)は、肝細胞壊死、炎症を引き起こし、硬変および肝細胞癌(ＨＣＣ)の発症の主要リスク因子である、肝臓に感染するエンベロープＤＮＡウイルスである。世界保健機関(ＷＨＯ)は、世界中で、主に低～中所得国で２億４０００万の慢性ＨＢＶ感染個体があり、年間約６５０,０００名がＨＢＶ感染の合併症により死亡すると推定している。有効なＨＢＶワクチンは利用可能であり、新生児への誕生時のワクチン接種の努力が、ＨＢＶ感染の発生率および有病率の減少に効果を示しているが、このようなプログラムは、ここ数年死亡率で実証できる効果はあがっていない(WHO Guidelines for prevention, care and treatment of persons with chronic Hepatitis B Infection, 2015 at apps.who.int/iris/bitstream/10665/154590/1/9789241549059_eng.pdf?ua=1&ua=1)。
ＨＢＶ感染の疾患負荷を効果的に軽減する、ＨＢＶ処置のための多数の治療剤が開発されているが、肝細胞核に存在し、ウイルス複製およびウイルスＲＮＡの転写の鋳型となる、共有結合閉環状ＤＮＡ(ｃｃｃＤＮＡ)を含むウイルスの全復製型を完全に排除できないため、一般に治癒しない。ヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログは、安全性および有効性のために一般に慢性ＨＢＶ感染の処置のゴールドスタンダードと考えられており、ＨＢＶ複製抑制に効果的であるが、ｃｃｃＤＮＡを排除せず、ウイルスタンパク質発現を阻止せず、慢性的に投与しなければならず、耐性獲得をもたらし得る。さらに、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤での処置は、肝細胞癌(ＨＣＣ)発症リスクを十分に軽減しない(処置後においても、５～７年で約７％)。インターフェロンベースの治療は、セロコンバージョンをもたらし得て、患者の約１０～１５％が治癒して処置終了を可能とするが、該薬剤は重篤な副作用があり、長期保存には冷蔵しなければならず、ＨＢＶ感染が最も蔓延している諸国での使用には望ましくない。
慢性ＨＢＶの処置は、ＨＢＶの免疫応答を回避しまたは抑制する能力によりさらに複雑となり、感染の持続化をもたらす。ＨＢＶタンパク質は、免疫阻害性を有し、ＨＢＶ感染対象の循環ＨＢＶタンパク質の圧倒的大部分をなす、Ｂ型肝炎ｓ抗原(ＨＢｓＡｇ)が含まれる。さらに、Ｂ型肝炎ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)の除去(セロコンバージョンによる)または血清ウイルス血症における減少は、ＨＢＶ感染処置中止の持続的管理の開始と相関せず、ＨＢＶ感染における血液からの血清ＨＢｓＡｇの除去(およびセロコンバージョン)は、ＨＢＶ感染処置中止の管理に至る、抗ウイルス応答の十分認識された予後指標である。しかしながら、これは、免疫療法を受けている患者のほんの一部でしか見られない。それ故に、稀ではあるが、ＨＢＶ感染の抑制または排除に十分に強固な免疫応答を患者に負荷し、本疾患の少なくとも機能的治癒をもたらすことが可能である。
発明の概要
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染の処置に使用するためのＲＮＡｉ剤およびＨＢＶワクチンならびに少なくとも一つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤および治療ワクチン接種を含む組み合わせ治療または処置レジメンを含む、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染、例えば、慢性ＨＢＶ感染を有する対象を処置する方法を提供する。
従って、ある態様において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染の処置に使用するためのＲＮＡｉ剤およびＨＢＶワクチンおよびＢ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染、例えば、慢性ＨＢＶ感染を有する対象を処置する方法を提供する。方法は、ＨＢＶ感染を有する対象に、少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；およびＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現構築物を含む核酸ベースのワクチンであって、該構築物が該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードするワクチンを投与する、例えば、連続的に投与し、それにより対象を処置するレジメンを含む。
他の態様において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染、例えば、慢性ＨＢＶ感染を有する対象を処置するためのレジメンを提供する。レジメンは、少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；およびＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現構築物を含む核酸ベースのワクチンであって、該構築物が該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードするワクチンの使用を含む。
ある実施態様において、ＨＢｃＡｇタンパク質またはその免疫原性フラグメントは、タンパク質ベースのワクチンに存在するＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントとエピトープを共有するおよび／またはＨＢｓＡｇタンパク質またはその免疫原性フラグメントは、タンパク質ベースのワクチンに存在するＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントとエピトープを共有する。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。
ある実施態様において、核酸ベースのワクチンは、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇをコードする発現構築物を含む。
ある実施態様において、ＨＢＶをコードするＲＮＡｉ剤は、対象に少なくとも２回投与する。
ある実施態様において、対象に投与されるＨＢＶをコードするＲＮＡｉ剤は、対象の血清のＨＢｓＡｇを、少なくとも０.５log 10IU/ml減少させる。ある実施態様において、対象で、タンパク質ベースのワクチンの初回量投与前の血清におけるＨＢｓＡｇが少なくとも０.５log 10IU/ml減少する。ある実施態様において、対象で、タンパク質ベースのワクチンの初回量投与前の血清におけるＨＢｓＡｇが少なくとも１log 10IU/ml減少する。ある実施態様において、対象で、ワクチン投与前の血清において２log 10IU/ml以下のＨＢｓＡｇを有する。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、対象に週１回以下で投与される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、対象に４週に１回以下で投与される。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤を、０.０１mg／kg～１０mg／kg；または０.５mg／kg～５０mg／kg；または１０mg／kg～３０mg／kgの用量で対象に投与する。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、０.５mg／kg、１mg／kg、１.５mg／kg、３mg／kg、５mg／kg、１０mg／kgおよび３０mg／kgから選択される用量で対象に投与される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の１用量は対象に約週１回；約２週に１回；約３週に１回；約４週に１回投与される；またはＲＮＡｉ剤の１用量は対象に週１回以下で投与される；またはＲＮＡｉ剤の１用量は対象に４週に１回以下で投与される。
ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、ＨＢｓＡｇの少なくとも一つの決定基およびＨＢｃＡｇの少なくとも一つの決定基のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチンは、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇの少なくとも一つの決定基の少なくとも一つの決定基を含むアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＨＢｓＡｇの決定基は、配列番号２２のアミノ酸１２４～１４７と少なくとも９０％同一の配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｓＡｇの決定基は、配列番号２３のアミノ酸９９～１６８と少なくとも９０％同一の配列を含む。
ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４のアミノ酸８０を含む配列を含む。ある実施態様において、配列番号２４のアミノ酸８０を含む配列は、少なくとも配列番号２４のアミノ酸７０～９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４のアミノ酸１３８を含む配列を含む。ある実施態様において、配列番号１４のアミノ酸８０を含む配列は、少なくとも配列番号２４のアミノ酸１２８～１４３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００連続アミノ酸と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４のアミノ酸１８～１４３と少なくとも９０％同一の配列を含む。
ある実施態様において、対象に投与するタンパク質ベースのワクチンは、０.１μg～１.０mg用量のＨＢｃＡｇおよび０.１μg～１.０mg用量のＨＢｓＡｇを含む。ある実施態様において、１用量のタンパク質ベースのワクチンは対象に約週１回；約２週に１回；約３週に１回；約４週に１回投与される；または１用量のタンパク質ベースのワクチンは、対象に週１回以下で投与される；または１用量のタンパク質ベースのワクチンは、対象に４週に１回以下で投与される。
ある実施態様において、ＨＢｃＡｇタンパク質およびＨＢｓＡｇタンパク質は、単一製剤で存在する。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇタンパク質およびＨＢｓＡｇタンパク質は、単一製剤で存在しない。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンはアジュバントを含む。ある実施態様において、アジュバントは、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を刺激する。ある実施態様において、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ；短、平滑断端５’－三リン酸ｄｓＲＮＡ(３ｐＲＮＡ)、Ｒｉｇ－Ｉリガンド、ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、ＩＬ－１２、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ(登録商標)、ＩＣ３１(登録商標)またはＲｉｇ－Ｉリガンドから選択される。ある実施態様において、アジュバントは、ポリＩ：Ｃアジュバント、ＣｐＧアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＰＣＥＰアジュバントから選択される。
ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、対象に少なくとも２回投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、対象に週２回以下投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した日以降に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与したのと同じ日に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後１か月以内に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後２か月以内に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後３か月以内に対象に投与する。
ある実施態様において、本発明の方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルを、対象で少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定する。
ある実施態様において、本発明の方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に血清ＨＢｅＡｇレベルを決定することを含むすなわち、血清ＨＢｅＡｇレベルを、対象で少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定する。
ある実施態様において、本発明の方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルおよび血清ＨＢｅＡｇレベルを、対象で少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定する。
ある実施態様において、核酸ベースのワクチンは、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ両者をコードする少なくとも一つの発現ベクター構築物を含む。ある実施態様において、発現構築物は、単一プロモーターからのＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ発現を促進する。他の実施態様において、発現構築物は、別々のプロモーターからのＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇの発現を促進する。
ある実施態様において、少なくとも一つのプロモーターは、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＰＨ５プロモーターおよびＨ１プロモーターから選択される。ある実施態様において、発現構築物はウイルスベクターを含む。ある実施態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター；レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；乳頭腫ウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；ポックスウイルスベクター、オルソポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ(ＭＶＡ)ベクター、トリポックスベクター、カナリアポックスベクター、鶏痘ベクター、アデノウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルスベクターから選択される。ある実施態様において、ウイルスベクターはＭＶＡベクターである。
ある実施態様において、対象に投与される核酸ベースのワクチンは、組織培養感染量(ＴＣＩＤ５０)が１０６～１０１０ ＴＣＩＤ５０；または１０６～１０９ ＴＣＩＤ５０；または１０６～１０８ ＴＣＩＤ５０で含まれる。
ある実施態様において、核酸ベースのベクターは、最終用量のタンパク質ベースのワクチンが対象に投与された後２週間以降に対象に投与される。
ある実施態様において、方法は、さらに、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルを、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に対象で決定する。ある実施態様において、核酸ベースのワクチンを、対象に少なくとも１用量のタンパク質ベースのワクチンを投与した後の少なくとも０.５log 10の血清ＨＢｓＡｇの減少後、対象に投与する。本レジメンのある実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンを対象に投与する。
ある実施態様において、方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に血清ＨＢｅＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｅＡｇレベルを、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に対象で決定する。ある実施態様において、核酸ベースのワクチンを、少なくとも１用量のタンパク質ベースのワクチンを対象に投与した後の少なくとも０.５log 10の血清ＨＢｅＡｇの減少後、対象に投与する。本レジメンのある実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンを対象に投与する。
ある実施態様において、方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルおよび血清ＨＢｅＡｇレベルを、対象において少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に決定する。ある実施態様において、核酸ベースのワクチンを、少なくとも１用量のタンパク質ベースのワクチンを対象に投与した後の少なくとも０.５log 10の血清ＨＢｓＡｇおよび血清ＨＢｅＡｇのさらなる減少後、対象に投与する。本レジメンのある実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンを対象に投与する。
ある実施態様において、方法は、さらに、少なくともＨＢＶを標的とするｉＲＮＡの投与前に対象にヌクレオチ(シ)ドアナログを投与することを含む。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログは、レジメン全体にわたって投与される。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログは、テノホビル ジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド(ＴＡＦ)、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファおよびガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)およびテノフォビル－エクサリエード(tenofovir-exaliades)(ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７)から選択される。
ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与前に３０００IU／ml未満の血清ＨＢｓＡｇを有する。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与前に４０００IU／ml未満の血清ＨＢｓＡｇを有する。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与前に５０００IU／ml未満の血清ＨＢｓＡｇを有する。
ある実施態様において、対象で、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、少なくとも２ログ１０スケールのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象で、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、少なくとも１ログ１０スケールのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、少なくとも２ログ１０スケールのＨＢｓＡｇレベルの減少および少なくとも１ログ１０スケールのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。
ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、５００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、２００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、１００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。
ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、５００IU／ml以下へのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、２００IU／ml以下へのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、１００IU／ml以下へのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。
ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、５００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、２００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、１００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルの減少がある。
ある実施態様において、対象における血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのレベルは、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なとも３か月、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する。ある実施態様において、対象における血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのレベルは、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なくとも６か月、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する。
ある実施態様において、対象における血清ＨＢｓＡｇは、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なくとも６か月、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する。
ある実施態様において、方法は、さらに対象に免疫刺激剤を投与することを含む。ある実施態様において、免疫刺激剤は、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ａ)、インターフェロンａｌｆａ－２ｂ、ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ｂ、インターフェロンラムダ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９)アゴニスト、ウイルス侵入阻害剤、Myrcludex、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、ＲＥＰ ９ＡＣ、カプシド阻害剤、Ｂａｙ４１－４１０９、ＮＶＲ－１２２１、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＩＨＶＲ－２５)、ウイルスカプシド、ＭＶＡカプシド、免疫チェックポイント制御因子、ＣＴＬＡ－４阻害剤、イピリムマブ、ＰＤ－１阻害剤、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＢＧＢ－Ａ３１７抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブおよびアフィマー生物学的製剤からなる群から選択される。
本レジメンのある実施態様において、対象はヒトである。
本レジメンのある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶの４転写物を標的とする。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、付属表ＡのｉＲＮＡから選択される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、付属表Ａの表２～１１のいずれかの薬剤のいずれかから選択される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド２０６～２２８、２０７～２２９、２１０～２３２、２１２～２３４、２１４～２３６、２１５～２３７、２１６～２３８、２２６～２４８、２４５～２６７、２５０～２７２、２５２～２７４、２５３～２７５、２５４～２７６、２５６～２７８、２５８～２８０、２６３～２８５、３７０～３９２、３７３～３９５、３７５～３９７、４０１～４２３、４０５～４２７、４１０～４３２、４１１～４３３、４２２～４４４、４２４～４４６、４２５～４４７、４２６～４４８、７３１～７５３、７３４～７５６、１１７４～１１９６、１２５０～１２７２、１２５５～１２７７、１２５６～１２７８、１５４５～１５６７、１５４７～１５６９、１５５１～１５７１、１５７７～１５９７、１５７９～１５９７、１５８０～１５９８、１８０６～１８２５、１８１２～１８３１、１８１４～１８３６、１８２９～１８５１、１８３１～１８５３、１８５７～１８７９、１８６４～１８８６、２２５９～２２８１、２２９８～２３２０または２８２８～２８５０の少なくとも１５連続ヌクレオチドを標的とする。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド１５７９～１５９７または１８１２～１８３１の少なくとも１５連続ヌクレオチドを標的とする。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド１５７９～１５９７または１８１２～１８３１を標的とする。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、UGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)またはAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、UGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)またはAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、UGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)またはAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、GUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)またはCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、GUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)またはCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、GUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)またはCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はUGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、センス鎖はGUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はUGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、センス鎖はGUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はUGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)のヌクレオチド配列を含み、センス鎖はGUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖はCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖はCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)のヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖はCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)のヌクレオチド配列を含む。
本レジメンのある実施態様において、該センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび該アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり、ここで、該センス鎖は、３’末端で結合するリガンドにコンジュゲートする。ある実施態様において、リガンドは、単価リンカー、二価分岐リンカーまたは三価分岐リンカーを介して結合した１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。ある実施態様において、該修飾ヌクレオチドの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン(ｄＴ)ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、ヌクレオチド含有非天然塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１,５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、メチルホスホネート基含有ヌクレオチド、５’－ホスフェート含有ヌクレオチドおよび５’－ホスフェート模倣体含有ヌクレオチドからなる群から選択される。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対長；１７～２３ヌクレオチド対長；１７～２５ヌクレオチド対長；２３～２７ヌクレオチド対長；１９～２１ヌクレオチド対長；２１～２３ヌクレオチド対長である。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１５～３０ヌクレオチド有する。
ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１９～３０ヌクレオチド有する。
ある実施態様において、リガンドは
であり、ＲＮＡｉ剤は所望により下記模式図に示すとおりリガンドにコンジュゲートする。
〔式中、ＸはＯまたはＳである。〕。
ある実施態様において、センス鎖はヌクレオチド配列５’－gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca－３’(配列番号２９)を含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’－usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu－３’(配列番号３０)を含む；またはセンス鎖はヌクレオチド配列５’－csasccauGfcAfAfCfuuuuucaccu－３’(配列番号３１)を含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’－asGfsgugAfaAfAfaguuGfcAfuggugsusu－３’(配列番号３２)を含み、ここで、ａ、ｃおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；ａｓ、ｃｓ、ｇｓおよびｕｓはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスホロチオエートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエートであり；Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；そしてＧｆｓは２’－フルオログアノシン－３’－ホスホロチオエートである。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤はＡＤ－６６８１０またはＡＤ－６６８１６である。
ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、ＨＢＶの少なくとも４、５、６、７、８、９または１０遺伝子型に存在するエピトープを含む。
ある実施態様において、核酸ベースのワクチンは、ＨＢＶの少なくとも４、５、６、７、８、９または１０遺伝子型に存在するエピトープを含む。
本発明は、さらにここに提供する方法に基づくＢ型肝炎ウイルス感染を有する対象の処置のためのここに提供するＲＮＡｉ剤およびワクチンの使用を提供する。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤およびＨＢＶワクチンは、ＨＢＶ感染を有する対象の処置用医薬の製造に使用される。
本発明は、さらにここに提供するＲＮＡｉ剤およびワクチンおよびＢ型肝炎ウイルス感染を有する対象の処置へのその使用に関する処置レジメンを提供する指示を含む、キットを提供する。
本発明を、次の詳細な記載および図面によりさらに説明する。
図１は、約３.２kb二本鎖ＨＢＶゲノムの構造の模式図である。ＨＢＶゲノムの複製はＲＮＡ中間体を経て生じ、約３.５kb、２.４kb、２.１kbおよび０.７kbの４つの重複ウイルス転写物(停止部位は矢印で示す)および３つの読み枠にわたり翻訳される７ウイルスタンパク質(ｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２、Ｓ、Ｐ、Ｘ、ｐｒｅ－ＣおよびＣ)をコードする共通３’末端を産生する。
図２Ａ～２Ｅは、トランスジェニックマウスモデルでのｓｉＲＮＡによるＨＢＶの抑制を示すグラフである。単一皮下３mg／kgまたは９mg／kg用量の対照ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ(ＨＢＶを標的としないｓｉＲＮＡ)、ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウス(ｎ＝６／群)の血清における(２Ａ)ＨＢｓＡｇ、(２Ｂ)ＨＢｅＡｇおよび(２Ｃ)ＨＢＶ－ＤＮＡのレベル。ＲＴ－ｑＰＣＲおよびグリセルアルデヒド３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)の発現に対して正規化により決定した肝臓ライセートからの(２Ｄ)総ＨＢＶ ＲＮＡおよび(２Ｅ)３.５kb ＨＢＶ転写物のレベル。
図３は、ＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスのＨＢＶに対する治療ワクチンの投与前のヌクレオシド阻害剤、エンテカビル、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ、対照ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ、ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０での前処置の効果をアッセイする実験の投与レジメンを示す模式図である。
図４Ａ～４Ｃは、図３に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの血清における(４Ａ)ＨＢｓＡｇ、(４Ｂ)ＨＢｅＡｇおよび(４Ｃ)ＨＢＶ－ＤＮＡのレベルを示すグラフである。
図５Ａ～５Ｆは、図３に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスにおけるペプチド(５Ａ)ＨＢｓ(Ｓ２０８)、(５Ｂ)ＨＢｃ(Ｃ９３)および(５Ｃ)ＭＶＡ(Ｂ８Ｒ)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答を示すグラフである。図５Ｄ～５Ｆは、死亡免疫細胞の不十分な排除に適応させるために実施した図５Ａ～５Ｃと同じデータの再分析であり、ペプチド(５Ｄ)ＨＢｓ(Ｓ２０８)、(５Ｅ)ＨＢｃ(Ｃ９３)および(５Ｆ) ＭＶＡ(Ｂ８Ｒ)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答を示す。
図６Ａ～６Ｃは、図３に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの肝細胞におけるＨＢＶ ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを示す。図６Ａは総ＨＢＶ ＲＮＡを示す。図６Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより決定したＧＡＰＤＨに対するＨＢＶ３.５kb転写物を示す。図６Ｃは、免疫組織化学染色により検出した肝臓切片mm２あたりのＨＢｃＡｇ陽性細胞数を示す。
図７は、ＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの、ＨＢＶに対する治療ワクチンの投与前の対照ｓｉＲＮＡまたはＡＤ－６６８１６での前処置の効果をアッセイする実験の投与レジメンの模式図である。
図８Ａ～８Ｃは、図７に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの血清の(８Ａ)ＨＢｓＡｇ、(８Ｂ)ＨＢｅＡｇおよび(８Ｃ)ＨＢＶ－ＤＮＡレベルを示すグラフである。
図９Ａ～９Ｄは、図７に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスのペプチド(９Ａ)ＨＢｓ(Ｓ２０８)、(９Ｂ)ＨＢｃ(Ｃ９３)、(９Ｃ)ＨＢｃ(Ｃｐｏｏｌ)および(９Ｄ)ＭＶＡ(Ｂ８Ｒ)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答を示すグラフである。
図１０Ａ～１０Ｃは、図７に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの肝細胞におけるＨＢＶ ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを示す。図１０Ａは総ＨＢＶ ＲＮＡを示す。図１０Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより決定したＧＡＰＤＨに対するＨＢＶ３.５kb転写物を示す。図１０Ｃは、免疫組織化学染色により検出した肝臓切片mm２あたりのＨＢｃＡｇ陽性細胞数を示す。
図１１Ａおよび１１Ｂは、図７に示す投与レジメンでの６週間レジメン後の最初のワクチン投与後７週目の個々のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの血清における(１１Ａ)ＨＢｓＡｇおよび(１１Ｂ)ＨＢｅＡｇのレベルを示すグラフである。図１１Ｃおよび１１Ｄは、図７に示す投与レジメンでの６週間レジメン後の最初のワクチン投与後７週目の個々のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスのＨＢｓ(Ｓ２０８)に対する(１１Ｃ)抗ＨＢｓ抗体応答および(１１Ｄ)肝臓のＴ細胞免疫応答を示すグラフである。
図１２は、ＨＢＶをコードするＡＡＶベクターで感染させたマウスの、ＨＢＶに対する治療ワクチンの投与前の、対照ｓｉＲＮＡまたはＡＤ－６６８１６での前処置の効果をアッセイする実験の投与レジメンを示す模式図である。
図１３Ａ～１３Ｇは、図１２に示す投与レジメンに基づく。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＨＢＶ－ＡＡＶマウスの血清における(１３Ａ)ＨＢｓＡｇおよび(１３Ｂ)ＨＢｅＡｇのレベルを示すグラフである(差し込み図１３Ｃは、グラフ１３Ｂにおける後の時点の分解部分である)。図１３Ｄは、２２週目の血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルを示す。図１３Ｄおよび１３Ｅは、２２週目の(１３Ｄ)総ＨＢＶ ＤＮＡおよび(１３Ｅ)ＡＡＶ－ＤＮＡの肝細胞あたりのコピー数を示す。図１３Ｆおよび１３Ｇは、(１３Ｆ)ＧＡＰＤＨ ＲＮＡに対するＨＢＶ３.５ ＲＮＡおよび(１３Ｇ)ＧＡＰＤＨ ＲＮＡに対する総ＨＢＶ ＲＮＡの肝臓での相対的発現を示す。
図１４Ａ～１４Ｃは、図１２に示す投与レジメンに基づく(１４Ａ)実験の間中の抗ＨＢｓ抗体応答および(１４Ｂ)実験１１６日目の抗ＨＢｅ抗体応答を示すグラフである。図１４Ｃは、グラフ１４Ｂの後の時点の分解部分である。
図１５Ａおよび１５Ｂは、図１２に示す投与レジメンに基づく実験の間の動物の(１５Ａ)ＡＬＴレベルおよび(１５Ｂ)体重を示す。
正式な配列表を本明細書と共に提供し、これは本明細書の一部を形成する。
ｓｉＲＮＡターゲティングのための例示的標的配列およびｉＲＮＡ剤を提供する付属表Ａを本明細書と共に提供し、これは本明細書の一部を形成する。
発明の詳細な記載
本発明は、ＨＢＶ感染の処置における１以上のＨＢＶ遺伝子(オープンリーディングフレーム／転写物)のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)介在切断を起こすｉＲＮＡ剤および１以上のＨＢＶタンパク質に対する免疫応答を刺激するＢ型肝炎ワクチンの使用の処置レジメンおよび方法を提供する。処置レジメンおよび方法は、好ましくは、一定期間内に機能的治癒を提供する。
次の詳細な記載は、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含む組成物の製造および使用方法ならびにＨＢＶ遺伝子の発現阻害または減少により利益を受ける疾患および障害を有する対象を処置するための組成物、使用および方法を開示する。
Ｉ. 定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語をまず定義する。さらに、パラメータの値または値の範囲が記載されているとき、記載される値の中間の値および範囲も本発明の一部であることが意図されることは理解すべきである。
単数表現は、ここでは、文法的対象物の１または１を超える(すなわち、少なくとも１)をいう。例として、「要素」は、１つの要素または１を超える要素、例えば、複数の要素を意味する。
用語「含む」は、ここでは、用語「含むが、限定されない」を意味するために使用し、両者は相互交換可能に使用される。
用語「または」は、文脈から明らかに他意が示されない限り、用語「および／または」を意味するために使用し、両者は相互交換可能に使用される。
用語「約」は、当分野で許容される典型的範囲内を意味するためにここで使用する。例えば、「約」は、平均からの２標準偏差内として理解され得る。ある実施態様において、「約」は±１０％を意味する。ある実施態様において、「約」は±５％を意味する。約が一連の数字または範囲の前にあるとき、「約」は、該一連のまたは範囲内の数字の各々を修飾し得ると理解される。
数字または一連の数字の前の用語「少なくとも」は、用語「少なくとも」に隣接した数字および、文脈から明らかである、論理的に包含される全てのその後の数字または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子のヌクレオチド数は整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドが指示される性質を有することを意味する。少なくともが一連の数字または範囲の前にあるならば、「少なくとも」は、該一連のまたは範囲内の数字の各々を修飾し得ると理解される。
ここで使用する「以下」または「未満」は、その用語に隣接する値および、文脈から当然の、論理的なそれより低い値または整数から０までと理解される。例えば、「２以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１または０ヌクレオチドオーバーハングを有する。「以下」が一連の数字または範囲の後ろにあるとき、「以下」は、該一連のまたは範囲内の数字の各々を修飾し得ると理解される。ここで使用する範囲は、上限および下限両者を含む。
配列と転写物または他の配列上のその指定位置の間に矛盾があるならば、本明細書で引用するヌクレオチド配列が優先する。
本発明の種々の実施態様を、当業者が適切とする限り、組み合わせ得る。
ここで使用する「Ｂ型肝炎ウイルス」は用語「ＨＢＶ」と相互交換可能に使用し、ヘパドナウイルス科に属する周知の非細胞変性、肝指向性ＤＮＡウイルスをいう。
ＨＢＶゲノムは、重複読み枠を有する一部二本鎖の、環状ＤＮＡである(例えば、図１参照)。
ＨＢＶゲノムによりコードされる、サイズに基づき４つの転写物(ここでは、「遺伝子」または「オープンリーディングフレーム」と称し得る)がある。これらは、Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳと呼ばれるオープンリーディングフレームを含む。コアタンパク質は、遺伝子Ｃ(ＨＢｃＡｇ)によりコードされる。Ｂ型肝炎ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)は、プレ－コア(ｐｒｅ－Ｃ)タンパク質のタンパク質分解プロセシングにより産生される。ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子Ｐによりコードされる。遺伝子Ｓは、表面抗原(ＨＢｓＡｇ)をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、一つの長いオープンリーディングフレームであり、それは３つのフレーム内「開始」(ＡＴＧ)コドンを含み、ｐｒｅ－Ｓ１＋ｐｒｅ－Ｓ２＋Ｓ、ｐｒｅ－Ｓ２＋ＳまたはＳの大型、中型および小型Ｓ抗原と呼ばれる３つのサイズが異なるポリペプチドをもたらす。表面抗原は、ＨＢＶのエンベロープの装飾に加えて、またウイルス成分粒子の一部であり、これは、ビリオン粒子と比較して大過剰で産生され、免疫寛容および抗ＨＢｓＡｇ抗体隔離に役割を有し、それにより感染性粒子を免疫検出から回避させる。遺伝子Ｘによりコードされる非構造的タンパク質の機能は、十分には理解されていないが、転写トランス活性化および複製に役割を有し、肝臓癌の発症と関連する。例示的タンパク質配列は、添付の配列表に提供される(例えば、配列番号１、３、１６および２０参照)。
ＨＢＶは、ウイルスゲノムの核への侵入、脱外被および輸送を含む多段階が関与する、複製過程で逆転写酵素を利用する数ＤＮＡウイルスの一つである。最初は、ＨＢＶゲノムの複製は、ＲＮＡ中間体の産生を含み、次いでこれが逆転写されて、ＤＮＡウイルスゲノムを産生する。
細胞がＨＢＶに感染すると、ウイルスゲノム弛緩環状ＤＮＡ(ｒｃＤＮＡ)が細胞核に輸送され、エピソーム共有結合閉環状ＤＮＡ(ｃｃｃＤＮＡ)に変換され、これはウイルスｍＲＮＡの転写鋳型として働く。転写および核搬出後、細胞質ウイルスプレゲノムＲＮＡ(ｐｇＲＮＡ)はＨＢＶポリメラーゼおよびカプシドタンパク質と組合されて、ヌクレオカプシドを形成し、その中で、ポリメラーゼ触媒逆転写がマイナス鎖ＤＮＡを生じ、これがその後プラス鎖ＤＮＡにコピーされて、子孫ｒｃＤＮＡゲノムを形成する。次いで、成熟ヌクレオカプシドはウイルスエンベロープタンパク質に包被されて、ビリオン粒子として放出されるかまたは核まで往復して細胞内ｃｃｃＤＮＡ増幅経路によりｃｃｃＤＮＡリザーバーを増幅する。ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶ複製サイクルの必須成分であり、感染の確立およびウイルス持続性を担う。
ＨＢＶ感染は、二つの異なる粒子の産生に至る：１)ＨＢｃＡｇが集合したウイルスカプシドを含み、ＨＢＶ表面抗原を有する脂質膜からなるエンベロープで覆われる感染性ＨＢＶウイルス自体(またはデーン粒子)および２)非感染性である小型または中型形態のＢ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇを含むウイルス成分粒子(またはＳＶＰ)。産生された各ウイルス粒子である、１０,０００を超えるＳＶＰが血中に放出される。そして、ＳＶＰ(およびそれらが担持するＨＢｓＡｇタンパク質)は、血中のウイルスタンパク質の圧倒的大部分を占める。ＨＢＶ感染細胞は、ＨＢＶｅ－抗原(ＨＢｅＡｇ)と称されるプレ－コアタンパク質の可溶性タンパク分解産物も分泌する。
Ａ～Ｈと命名されるＨＢＶの８遺伝子型は決定されており、二つのさらなる遺伝子型ＩおよびＪが提案されており、各々異なる地理的分布を有する。ウイルスは非細胞変性的であり、ウイルス特異的細胞性免疫が、肝疾患が６か月で解消するＨＢＶ急性感染またはしばしば進行性肝傷害を伴う慢性ＨＢＶ感染への暴露の転帰への主決定因子である。
用語「ＨＢＶ」は、ＨＢＶの遺伝子型(Ａ～Ｊ)の何れも含む。ＨＢＶゲノムの対照配列の完全コード配列は、例えば、GenBank Accession Nos. GI:21326584(配列番号１)およびGI:3582357(配列番号３)にみることができる。アンチセンス配列は、それぞれ配列番号２および４に提供される。Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳタンパク質のアミノ酸配列は、例えばNCBI Accession numbers YP_009173857.1(Ｃタンパク質); YP_009173867.1およびBAA32912.1(Ｘタンパク質); YP_009173866.1およびBAA32913.1(Ｐタンパク質);およびYP_009173869.1, YP_009173870.1, YP_009173871.1およびBAA32914.1(Ｓタンパク質)(配列番号５～１３)にみることができる。ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、株ａｙｗからのタンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号１４～１７に提供される。ＨＢＶ遺伝子型Ａ、株ａｄｗからのタンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号１８～２１に提供される。
ＨＢＶｍＲＮＡ配列のさらなる例は、一般に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProtおよびOMIMから容易に入手可能である。The International Repository for Hepatitis B Virus Strain Dataは、http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.phpでアクセスし得る。
ここで使用する用語「ＨＢＶ」はまた、ＨＢＶゲノムの天然に存在するＤＮＡ配列多様性、すなわち、遺伝子型Ａ～Ｊおよびそのバリアントもいう。
ここで使用する「エピトープ」はまた「抗原決定基」または「決定基」とも称され、免疫系、特に抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞により認識されるタンパク質抗原の部分と理解される。エピトープは、立体構造エピトープおよび直線状エピトープを含む。タンパク質は、十分な長さまたはサイズのアミノ酸配列ならびに抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞により認識される抗原性を共有するとき、エピトープである。ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、一般に約８～１１アミノ酸長のペプチドであり、一方ＭＨＣクラスII分子は、約１３～１７アミノ酸長の長いペプチドを提示する。立体構造エピトープは一般に非連続的であり、長いアミノ酸配列に及ぶ。
ここで使用する用語「ヌクレオチ(シ)ドアナログ」または「逆転写酵素阻害剤」は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに構造的に類似するＤＮＡ複製の阻害剤であり、特にＨＢＶｃｃｃＤＮＡの複製を阻害し、宿主(例えば、ヒト)ＤＮＡの複製を顕著に阻害しない。このような阻害剤は、テノホビル ジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド(ＴＡＦ)、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファ、ガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)およびテノホビル－エクサリエード(ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７)を含む。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログはエンテカビル(ＥＴＶ)である。ヌクレオチ(シ)ドアナログは、多数の供給源から商業的に入手可能であり、ラベルの指示(例えば、一般に特定用量で経口投与)に従いまたはＨＢＶ処置において技術を有する実施者により決定されたとおりここに提供する方法で使用される。
ここで使用する「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＨＢＶ転写物の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分である。ある実施態様において、配列の標的部分は、ＨＢＶ転写物の転写中に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近くのｉＲＮＡ依存性切断の基質として働くのに少なくとも十分長い。ある実施態様において、標的配列はＨＢＶ転写物のタンパク質コード領域内である。
標的配列は、約９～３６ヌクレオチド長、例えば、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は約１５～３０ヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２ヌクレオチド長であり得る。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。
ここで使用する用語「配列を含む鎖」は、標準ヌクレオチド命名法を使用して引用される配列により説明されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドをいう。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」は、各々一般にそれぞれ塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを含むヌクレオチドをいう。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」はまた、下にさらに詳述する修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も記述し得ることは理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の部分に置換することが、そのような置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性を実質的に変更することなく実施できることを十分に承知している。例えば、限定しないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。従って、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドを、本発明で注目するｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドに置換し得る。他の例において、オリゴヌクレオチドのどこかのアデニンおよびシトシンを、それぞれグアニンおよびウラシルで置換し、標的ｍＲＮＡ内にＧ－Ｕゆらぎ塩基対形成を形成し得る。このような置換部分を含む配列は、本発明で注目する組成物および方法に適する。
ここで使用する「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ｓｉＲＮＡ剤」などは、好ましくはＨＢＶの全血清型にわたり保存されるＨＢＶゲノムの領域を標的とし、好ましくは、１を超えるＨＢＶ転写物の発現阻害により、ＨＢＶライフサイクルの全段階、例えば、複製、集合、ウイルスの分泌およびウイルス抗原の分泌を阻害するよう設計される、二本鎖ＲＮＡである。特に、ＨＢＶゲノムの転写がポリシストロニック、重複ＲＮＡをもたらすため、本発明において使用する単一ＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤は、好ましくはＨＢＶ転写物の大部分または全ての発現に著しい阻害をもたらす。全ＨＢＶ転写物は、少なくとも部分的に重複し、同じポリアデニル化シグナルを共有する。それ故に、全てのウイルス転写物は、同一３'末端を有し、それ故に、Ｘ遺伝子を標的とする本発明のＲＮＡｉ剤は、全ウイルス転写物を標的とし、Ｘ遺伝子発現だけでなく、プレゲノムＲＮＡ(ｐｇＲＮＡ)を含む全ての他のウイルス転写物の発現も阻害するはずである。さらに、本発明のＲＮＡｉ剤は、ｐｇＲＮＡ、ＨＢＶ構造的遺伝子、ポリメラーゼおよびＨＢＶＸ遺伝子を標的とすることにより、ＨＢＶウイルス複製を阻害するよう設計されている。さらに、免疫寛容に役割を有するＳＶＰおよび他のウイルスタンパク質のサイレンシングに介在するよう設計されており、それにより対象の免疫系がＨＢＶ感染を制御し、排除する免疫応答が搭載されるように、ウイルス抗原の存在を検出し、応答することを可能とする。理論に拘束されることを意図しないが、これらのＲＮＡｉ剤における前記性質および特定の標的部位および／または特定の修飾の組み合わせまたは下位の組み合わせは、本発明のＲＮＡｉ剤の有効性、安定性、安全性、効力および耐久性の改善に寄与すると考えられる。このような薬剤は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１、ＷＯ２０１２／０２４１７０、ＷＯ２０１７／０２７３５０およびＷＯ２０１３／００３５２０に開示されており、それらの内容を引用により本明細書に包含させる。ＲＮＡｉ剤の例示的標的部位および例示的ＲＮＡｉ剤は、本明細書の一部を構成する、ここに添付する付属表Ａに提供される。用語ＲＮＡｉ剤は、さらに、肝臓特異的プロモーター下、人工ｍｉ(ｃｒｏ)ＲＮＡへのｓｈＲＮＡ送達のためのｓｈＲＮＡ、例えば、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)８ベクターを含み；所望によりオフターゲット遺伝子制御を抑えるためのｓｈＲＮセンス鎖に対する共送達デコイ(“ＴｕＤ」)がMichler et al., 2016 (EMBO Mol. Med., 8:1082-1098)に記載され、引用により本明細書に包含させる。
ｉＲＮＡ剤の各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであり得るが、ここに詳述するとおり、各または両鎖は、１以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含み得る。さらに、本明細書で使用する限り、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでよく；ＲＮＡｉ剤は、複数ヌクレオチドに相当な修飾を含み得る。
ここで使用する用語「修飾ヌクレオチド」は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合および／または修飾核酸塩基を有する、ヌクレオチドをいう。それ故に、用語修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に、例えば、官能基または原子の、置換、付加または除去を含む。本発明薬剤での使用に適する修飾は、ここに開示するまたは当分野で知られる全てのタイプの修飾を含む。任意のこのような修飾は、ｓｉＲＮＡタイプ分子で使用される限り、本明細書および特許請求の範囲の目的のために、「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
ここで使用する「治療ＨＢＶワクチン」などは、１以上のＨＢＶタンパク質に対する免疫応答、好ましくはエフェクターＴ細胞誘発応答を誘発する、ペプチドワクチン、ベクターベースのワクチンを含むＤＮＡワクチンまたは細胞ベースのワクチンであり得る。好ましくは、ワクチンは、複数のＨＢＶ血清型、好ましくは全ＨＢＶ血清型と交差反応する多エピトープワクチンである。多数の治療ＨＢＶワクチンが当分野で知られ、全臨床および臨床開発の種々の段階にある。タンパク質ベースのワクチンは、Ｂ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)およびコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ワクチンを含む(例えば、Li et al., 2015, Vaccine. 33:4247-4254、引用により本明細書に包含)。例示的ＤＮＡワクチンは、HB-110(Genexine, Kim et al., 2008. Exp Mol Med. 40: 669-676.)、pDPSC18(PowderMed)、INO-1800(Inovio Pharmaceuticals)、HB02 VAC-AND(ANRS)およびCVI-HBV-002(CHA Vaccine Institute Co., Ltd.)を含む。例示的タンパク質ベースのワクチンはTheravax/DV-601(Dynavax Technologies Corp.)、εPA-44(Chongqing Jiachen Biotechnology Ltd.)およびABX 203(ABIVAX S.A.)を含む。例示的細胞ベースのワクチンはHPDCs-T immune therapy(Sun Yat-Sen University)を含む。組み合わせワクチンおよび製品も知られ、HepTcellTM(ＦＰ－０２.２ワクチン(ペプチド)＋ＩＣ３１(登録商標)アジュバント(組み合わせペプチド－オリゴヌクレオチドアジュバント)(米国特許公開２０１３／０３３０３８２、２０１２／０２７６１３８、および２０１５／０２１６９６７、これら各々の全内容を、引用により本明細書に包含させる))；ＧＳ－４７７４(Gilead、融合タンパク質Ｓ、コアＸワクチン＋Ｔａｒｍｏｇｅｎ Ｔ細胞免疫刺激剤)、ｐＳＧ２.ＨＢｓ／ＭＶＡ.ＨＢｓ(タンパク質プライム／ウイルスベクターブースト、Oxxon Therapeutics)およびタンパク質プライム／改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａベクターブースト(ＭＶＡ発現ベクターのＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質＋ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ、Backes et al., 2016, Vaccine. 34:923-32およびＷＯ２０１７１２１７９１、両者は引用により本明細書に包含させる)。
ここで使用する用語「アジュバント」は、長期保護免疫を誘発するために共投与される、抗原に対する免疫応答を促進(例えば、増強、加速または延長)する薬剤と理解される。実質的な免疫応答は、アジュバント自体を指向しない。アジュバントは、病原体成分、粒子アジュバントおよび組み合わせアジュバント(例えば、www.niaid.nih.gov/research/vaccine-adjuvants-types参照)を含むが、これらに限定されない。病原体成分(例えば、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ；短、平滑断端５’－三リン酸ｄｓＲＮＡ(３ｐＲＮＡ)ＲＩＧ－１リガンドおよびエマルジョン、例えばポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))は、自然免疫細胞内または表面上の種々の受容体を標的とすることにより、ワクチンに対する早期非特異的または自然免疫応答の誘発を助け得る。自然免疫系は、適応免疫応答に影響し、これはワクチンが標的とする病原体に対する長期持続性保護を提供する。粒子アジュバント(例えば、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２)は、免疫系を刺激でき、また免疫細胞への抗原送達を増強し得る、極めて小さな粒子を形成する。組み合わせアジュバント(例えば、ＡＳ０２、ＡＳ０３およびＡＳ０４(全てＧＳＫ)；ＭＦ５９(Novartis)；ISCOMATRIX(登録商標)(CSL Limited)；およびＩＣ３１(登録商標)(Altimmune)は、複数の保護的免疫応答を誘発する。単独で使用したとき中程度の効果を有するアジュバントは、共使用したとき、より強力な免疫応答を誘発し得る。
本発明の好ましい実施態様において、本発明で使用するアジュバントは、液性および細胞性免疫応答を促進する。このために、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２ヘルパーＴ細胞応答は、抗体による中和応答ならびにエフェクター細胞による毒性Ｔ細胞応答を支持するために望まれる。好ましくは、アジュバントはバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を提供する。ある実施態様において、アジュバントは、ポリＩ：Ｃアジュバント、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト(ｃ－ジ－ＡＭＰアジュバント、ｃ－ジ－ＧＭＰアジュバントまたはｃ－ジ－ＣＭＰアジュバント)、ISCOMATRIX(登録商標)アジュバント、ＰＣＥＰアジュバントおよびＲｉｇ－Ｉ－リガンドアジュバントの１以上である。ある実施態様において、アジュバントはポリＩ：Ｃアジュバント、ＣｐＧアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＰＣＥＰアジュバントである。ある実施態様において、アジュバントはミョウバンではない。
ここで使用する「免疫刺激剤」は、抗原と無関係に投与しても、しなくてもよい免疫応答を刺激する薬剤である。免疫刺激剤は、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ｂ、インターフェロンラムダ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９)アゴニスト、ウイルス侵入阻害剤(例えば、Myrcludex)、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド(例えば、ＲＥＰ ９ＡＣ)、カプシド阻害剤(例えば、Ｂａｙ４１－４１０９およびＮＶＲ－１２２１)、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤(例えば、ＩＨＶＲ－２５)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、免疫刺激剤はウイルスカプシド、所望により空ウイルスカプシド、例えば、ＭＶＡカプシドを含み得る。
免疫刺激剤はまた免疫チェックポイント制御因子も含み得る。免疫チェックポイント制御因子は、刺激性または阻害性であり得る。ここで使用する免疫チェックポイント制御因子は免疫応答を増強する。免疫チェックポイント制御因子は、ＣＴＬＡ－４阻害剤、例えばイピリムマブ、ＰＤ－１阻害剤、例えばニボルマブ、ペムブロリズマブおよびＢＧＢ－Ａ３１７抗体を含むが、これらに限定されない。ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アフィマー(affimer)バイオ治療剤に加えて、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブを含む。
ここで使用する「対象」は、霊長類(例えばヒト、非ヒト霊長類、例えば、サルおよびチンパンジー)、非霊長類(例えば、マウスモデルまたはＨＢＶで感染させ得る他の動物モデル)を含む、哺乳動物などの動物である。ある実施態様において、対象は、ＨＢＶ遺伝子発現または複製の減少により利益を受ける疾患、障害または状態を処置されているまたは評価されているヒトなどのヒトである。ある実施態様において、対象は慢性Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染を有する。ある実施態様において、対象は慢性Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染およびＤ型肝炎ウイルス(ＨＤＶ)感染の両方を有する。
ここで使用する用語「処置する」または「処置」は、血清ＨＢＶ ＤＮＡまたは肝臓ＨＢＶｃｃｃ ＤＮＡの存在血清または肝臓ＨＢＶ抗原の存在、例えば、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇを含むが、これらに限定されない、ＨＢＶ感染を有する対象における徴候または症状の１以上の軽減を含むが、これらに限定されない、有益なまたは所望の結果をいう。ＨＢＶ感染の診断基準は、当分野で周知である。「処置」はまた、処置非存在下での余命と比較した生存延長またはＨＣＣ発症のリスク低減も意味し得る。
ある実施態様において、ＨＢＶ関連疾患は慢性Ｂ型肝炎(ＣＨＢ)である。ある実施態様において、対象は、ＨＢＶに少なくとも５年感染している。ある実施態様において、対象はＨＢＶに少なくとも１０年感染している。ある実施態様において、対象は、出生時ＨＢＶに感染している。慢性Ｂ型肝炎疾患を有する対象は免疫寛容であり、壊死性炎症性肝疾患を伴う活動性慢性感染を有し、検出可能な壊死性炎症非存在下で肝細胞代謝回転が増加しまたは活動性疾患の証拠が全くなく、非活動性慢性感染を有し、また無症候性であり得る。慢性Ｂ型肝炎疾患を有する対象はＨＢｓＡｇ陽性であり、高ウイルス血症(≧１０４ ＨＢＶ－ＤＮＡコピー数／ml血液)または低ウイルス血症(＜１０３ ＨＢＶ－ＤＮＡコピー数／ml血液)を有する。慢性活動性肝炎を有する患者は、特に高複製状態の間、急性肝炎に類似する症状を有し得る。ＣＨＢ対象におけるＨＢＶ感染の残留性は、ｃｃｃＨＢＶ ＤＮＡ残留性をもたらす。ある実施態様において、ＣＨＢを有する対象はＨＢｅＡｇ陽性である。他の実施態様において、ＣＨＢを有する対象はＨＢｅＡｇ陰性である。
好ましい実施態様において、ＨＢＶ感染処置は、Ｂ型肝炎の「機能的治癒」をもたらす。ここで使用する用語「機能的治癒」は、循環ＨＢｓＡｇの排除と理解され、好ましくは臨床的に適切なアッセイを使用してＨＢｓＡｇ抗体が検出不可能となる状態への転換を伴う。例えば、検出不可能な抗体は、化学発光微粒子免疫アッセイ(ＣＭＩＡ)または任意の他の免疫アッセイで測定して、１０mIU／mlより低いシグナルを含み得て、抗ＨＢｓセロコンバージョンとも称し得る。機能的治癒は、ＨＢＶの全復製型の排除を必要としない(例えば、肝臓からのｃｃｃＤＮＡ)。抗ＨＢｓセロコンバージョンは、慢性感染患者あたり年間約０.２～１％で自然に生ずる。しかしながら、抗ＨＢｓセロコンバージョン後でも、ＨＢＶの低レベルの残留が数十年観察され、完全治癒ではなく、機能的治癒が生じていることを示す。メカニズムに拘束されないが、免疫系がＨＢＶを監視し続ける得るようにしておくことが提案される。機能的治癒は、ＨＢＶ感染のあらゆる処置の中断を可能とする。しかしながら、ＨＢＶ感染の「機能的治癒」は、ＨＢＶ感染、例えば、肝線維症、ＨＣＣ、硬変に起因する疾患または状態の予防または処置には不十分であり得る。
対象におけるＨＢＶ遺伝子発現もしくはＨＢＶ複製のレベルまたは疾患マーカーまたは症状の文脈での用語「低減」は、該レベルの統計学的に有意な減少をいう。減少は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上であり得る。ＨＢＶ感染のモニタリングにおいて、ｌｏｇ１０スケールが、抗原血症(例えば、血清のＨＢｓＡｇレベル)またはウイルス血症(血清のＨＢＶ ＤＮＡレベル)のレベルの記載のために一般に使用される。１ log 10減少は９０％減少(１０％残存)、２ log 10減少は９９％減少(１％残存)などと理解される。ある実施態様において、疾患マーカーは、検出レベル未満まで低減される。
ある実施態様において、疾患マーカーの発現が正常化され、すなわち、このような障害がない個体についての正常範囲内であるとして許容されるレベルまで減少し、例えば、ＡＬＴまたはＡＳＴなどの疾患マーカーのレベルが、このような障害がない個体についての正常範囲内であるとして許容されるレベルまで減少する。疾患関連レベルが正常レベルから上昇したとき、変化を、正常範囲上限(ＵＬＮ)から計算する。疾患関連レベルが正常レベルから低下したとき、変化を正常範囲下限(ＬＬＮ)から計算する。低下は、対象の値と正常値の変化のパーセント差である。例えば、正常ＡＳＴレベルは、１０～４０単位／リットルと報告され得る。処置前、対象のＡＳＴレベルが２００単位／リットル(すなわち、ＵＬＮの５倍、正常範囲上限を１６０単位／リットル超えるｌ)であり、処置後、対象のＡＳＴレベルが１２０単位／リットル(すなわち、ＵＬＮの３倍、正常範囲上限を８０単位／リットル超える)であるならば、上昇ＡＳＴは、正常に向かって５０％(８０／１６０)減少した。
ここで使用する用語「阻害」は、「減少」、「サイレンシング」、「下方制御」、「抑制」および他の類似用語と相互交換可能に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。好ましくは、阻害は統計学的に有意なまたは臨床的に顕著な阻害である。
用語「ＨＢＶ遺伝子の発現阻害」は、１以上のＨＢＶウイルスタンパク質(例えば、例えば、ｐｒｅＳ１／２－Ｓ、ｐｒｅＳ、Ｓ、Ｐ、Ｘ、ｐｒｅＣおよびＣ)をコードするあらゆるＨＢＶ転写物(例えば、３.５kb、２.４kb、２.１kbまたは０.７kb転写物)ならびにＨＢＶ遺伝子のバリアントまたは変異体のノックダウンをいうことを意図する。
「ＨＢＶ遺伝子の発現阻害」は、ＨＢＶ遺伝子または転写物の任意の顕著なレベルの阻害、例えば、ＨＢＶ遺伝子Ｓ、Ｐ、ＸまたはＣまたはこれらの任意の組み合わせ、例えば、Ｓ、ＰおよびＣの発現の少なくとも部分的抑制を含む。ＨＢＶ遺伝子の発現は、ＨＢＶ遺伝子発現と関連する任意の可変値、例えば、ＨＢＶｍＲＮＡレベル、ＨＢＶタンパク質レベルおよび／またはＨＢＶｃｃｃＤＮＡレベルのレベルまたはレベル変化に基づき、評価し得る。このレベルは、例えば、対象由来のサンプルを含む、個々の細胞または細胞群で評価でき、例えば、レベルを血清でモニターし得る。
本発明の方法のある実施態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはアッセイでの検出レベル未満まで阻害される。好ましい実施態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現阻害は、遺伝子発現レベルの臨床的に適切な阻害、例えば、ＨＢＶタンパク質に対するワクチンへの有効な免疫応答を可能にするのに十分な阻害をもたらす。
ＨＢＶ遺伝子の発現阻害は、ＨＢＶ遺伝子が転写され、ＨＢＶ遺伝子の発現が阻害されるように処置されている(例えば、細胞または細胞集団と本発明のＲＮＡｉ剤との接触によりまたは本発明のＲＮＡｉ剤の、該細胞が存在するまたは存在した対象への投与により)最初の細胞または細胞群(このような細胞は、例えば、対象由来のサンプルに存在し得る)により発現されるＲＮＡの量の、最初の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第二の細胞または細胞群(対照細胞)と比較した減少により顕在化され得る。好ましい実施態様において、阻害は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１(その内容を全体として引用により本明細書に包含させる)の実施例２に提供されるｒｔＰＣＲ方法で評価し、インビトロアッセイを、１０nM濃度で二本鎖を有する適切に適合した細胞株で行い、処置細胞を、対照細胞のｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして、次の式を使用して表す。
あるいは、ＨＢＶ遺伝子の発現阻害を、例えば、ここに記載する、ＨＢＶ遺伝子発現と機能的に関連するパラメータの減少の点で評価し得る。ＨＢＶ遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム編集によりＨＢＶ遺伝子を発現する任意の細胞で、当分野で知られる任意のアッセイにより決定し得る。
ＨＢＶタンパク質の発現阻害は、細胞または細胞群により発現されるＨＢＶタンパク質レベル(例えば、対象由来のサンプルで発現されるタンパク質レベル)の減少により顕在化し得る。上記のとおり、ｍＲＮＡ抑制の評価について、処置細胞または細胞群のタンパク質発現レベル阻害を、対照細胞または細胞群または血清のタンパク質レベルのパーセンテージとして表し得る。
ＨＢＶ遺伝子の発現阻害の評価に使用し得る対照細胞または細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触させていない細胞または細胞群を含む。例えば、対照細胞または細胞群は、ＲＮＡｉ剤で対象を処置する前の個々の対象(例えば、ヒトまたは動物対象)に由来し得る。別の実施態様において、レベルを適切な対照サンプル、例えば、既知集団対照サンプルと比較し得る。
細胞または細胞群により発現されるＨＢＶ ＲＮＡレベルまたは循環ＨＢＶ ＲＮＡレベルを、ｍＲＮＡ発現を評価するための当分野で知られる任意の方法を使用して、好ましくはＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１の実施例２またはここに提供する実施例１に提供するｒｔＰＣＲ方法を使用して、決定し得る。ある実施態様において、サンプルのＨＢＶ遺伝子の発現(例えば、総ＨＢＶ ＲＮＡ、ＨＢＶ転写物、例えば、ＨＢＶ３.５kb転写物)レベルを、転写ポリヌクレオチドまたはその一部、例えば、ＨＢＶ遺伝子のＲＮＡの検出により特定する。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B; Biogenesis)、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット(Qiagen(登録商標))またはＰＡＸ遺伝子(PreAnalytix, Switzerland)の使用を含む、ＲＮＡ抽出技法を使用して、細胞から抽出し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的アッセイ形式は、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ(Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035)、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析を含む。循環ＨＢＶｍＲＮＡは、内容全体を引用により本明細書に包含させる、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１７７９０６に記載の方法を使用して、検出し得る。
ある実施態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現レベルは、核酸プローブを使用して決定する。ここで使用する用語「プローブ」は、特定のＨＢＶ遺伝子に選択的に結合することができるあらゆる分子をいう。プローブは、当業者により合成できまたは適切な生物学的調製物に由来し得る。プローブは、標識されるように特に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子を含むが、これらに限定されない。
単離ＲＮＡを、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用でき、これは、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)分析およびプローブアレイを含むが、これらに限定されない。ｍＲＮＡレベルを決定する一つの方法は、単離ｍＲＮＡと、ＨＢＶｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子(プローブ)の接触を含む。ある実施態様において、ｍＲＮＡを固体表面に固定化し、例えば単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上に流すことにより、プローブと接触させ、該ゲルからのｍＲＮＡを、ニトロセルロースなどの膜に移すことを含む。別の実施態様において、プローブを固体表面に固定し、例えば、Affymetrix(登録商標)遺伝子チップアレイで、ｍＲＮＡを、プローブと接触させる。当業者は、ＨＢＶ ｍＲＮＡレベル決定に使用するために既知ｍＲＮＡ検出方法を容易に適合できる。
サンプルにおけるＨＢＶ遺伝子の発現レベルを決定する別の方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ(Mullis、１９８７、米国特許４,６８３,２０２に示す実験的実施態様)、リガーゼ連鎖反応(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自立型配列複製(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Ｑ－ベータレプリカーゼ(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製(Lizardi et al.、米国特許５,８５４,０３３)または任意の他の核酸増幅方法による、例えばサンプルのｍＲＮＡの、核酸増幅または逆転写酵素(ｃＤＮＡ調製のため)、続く当業者に周知の技法を使用する増幅分子の検出の過程を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。本発明の具体的態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現レベルは、例えば、ここに提供する方法を使用する、定量的蛍光性ＲＴ－ＰＣＲ(すなわち、TaqManTM System)により決定する。
ＨＢＶ ＲＮＡの発現レベルを、膜ブロット(例えばノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析で使用する)またはマイクロウェル、試験管、ゲル、ビーズまたは繊維(または結合核酸を含むあらゆる固体支持体)を使用してモニターし得る。米国特許５,７７０,７２２、５,８７４,２１９、５,７４４,３０５、５,６７７,１９５および５,４４５,９３４参照(これら各々の内容全体を引用により本明細書に包含する)。ＨＢＶ発現レベル決定はまた溶液での核酸プローブの使用も含み得る。
好ましい実施態様において、ＲＮＡ発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を使用して評価する。これらの方法の使用は、本明細書の実施例に記載し、例示される。
ＨＢＶタンパク質発現レベルは、タンパク質レベル測定について当分野で知られる任意の方法を使用して、決定し得る。このような方法は、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、超拡散クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、吸収スペクトロスコピー、比色分析アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法(単または二重)、免疫電気泳動、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡｓ)、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどを含む。
ある実施態様において、本発明の方法の有効性を、ＨＢＶ感染の症状の軽減の検出またはモニタリングによりモニターし得る。症状は、当分野で知られる任意の方法を使用して評価され得る。
ここで使用する用語「Ｂ型肝炎ウイルス関連疾患」または「ＨＢＶ関連疾患」は、ＨＢＶ感染または複製が原因のまたはそれと関連する疾患または障害である。用語「ＨＢＶ関連疾患」は、ＨＢＶ遺伝子発現または複製の減少により利益を受ける疾患、障害または状態を含む。ＨＢＶ関連疾患の非限定的例は、例えば、Ｄ型肝炎ウイルス感染；肝炎デルタ；慢性Ｂ型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；クリオグロブリン血症；肝細胞癌を含む。
ここで使用する用語「サンプル」は、対象から単離されたまたはそこから調製された液体、細胞または組織の収集物ならびに対象内に存在する液体、細胞または組織を含む。生物学的液体の例は、血液、血清、血漿、免疫細胞、リンパ、尿、唾液などを含む。組織サンプルは、組織、臓器または局在性領域からのサンプルを含み得る。例えば、サンプルは、特定の臓器、臓器の一部もしくは液体またはこれら臓器内の液体もしくは細胞であり得る。ある実施態様において、サンプルは、肝臓(例えば、肝臓全体または肝臓のある区域または肝臓内の特定タイプの細胞、例えば、肝細胞、常在性肝臓免疫細胞)由来であり得る。好ましい実施態様において、「対象由来のサンプル」は、対象から採血した血液またはそれ由来の血漿、血清もしくは選択細胞プール(例えば、免疫細胞集団)をいう。さらなる実施態様において、「対象由来のサンプル」は、対象から得た肝臓組織(またはその小成分)をいう。
ここで使用する「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をいうことは理解される。ある実施態様において、ＤＮＡ配列はＲＮＡ配列から逆転写され得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡは、コード配列を標的とする。
用語「適当な制御配列」などは、ここで、コード配列の上流(５’非コード配列)、途中または下流(３’非コード配列)に位置するヌクレオチド配列をいい、これは、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を与える。制御配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を含み得る。
ここで使用する「プロモーター」は、コード配列または機能的にＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列をいう。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体を天然遺伝子に由来してよく、または天然で見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなってよくまたは合成ＤＮＡセグメントを含んでよい。プロモーターは、特定の細胞型のまたは発育の種々の段階でのまたは異なる微小環境条件に応答したコード配列の発現を選択するように選択され得る。ある実施態様において、プロモーターは、肝臓で活性なプロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーターである。多くのプロモーター配列が当分野で知られ、特定の状況での適切なプロモーター配列の選択は、当業者の能力の範囲内である。
用語「操作可能に結合」は、一方の機能が他方に影響するような、単一核酸フラグメント上への複数核酸配列の結合をいう。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与え得るならば、該コード配列と操作可能に結合する(すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある)。
ここで使用する用語「発現」は、本主題のテクノロジーの核酸フラグメントに由来する、センス(ｍＲＮＡ)またはアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ剤(例えば、ｓｈＲＮＡ)の転写および安定な蓄積をいう。「過発現」は、正常または非形質転換生物での産生レベルを超える、トランスジェニックまたは組み換え生物での遺伝子産物の産生をいう。
ここで使用する「発現ベクター」または「発現構築物」は、プロモーター制御下でのコード配列発現を可能にするために、コード配列がプロモーター配列に操作可能に結合した核酸をいう。発現ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含むが、これらに限定されない。発現ベクターを細胞に送達する方法は当分野で知られる。
II. 本発明の処置方法
本発明は、ＨＢＶ感染の処置における、ＨＢＶ遺伝子の発現を減少させるための薬剤、例えば、１以上のＨＢＶ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)介在切断を起こすｉＲＮＡ剤および１以上のＨＢＶタンパク質に対する免疫応答を刺激するＢ型肝炎ワクチンの連続的使用のための処置レジメンおよび方法を提供する。処置レジメンおよび方法は、好ましくは一定期間内にＨＢＶの機能的治癒を提供する。
ここに提供する処置レジメンおよび方法は、ＨＢＶ感染のための、処置および好ましくは機能的治癒を提供する複数治療剤の順序付けられた投与を含む。本方法で使用される薬剤は当分野で知られる。しかしながら、薬剤は、単独では、大部分の患者でＨＢＶ疾患負荷の一貫したかつ永続的な減少ができず、例えば、ＨＢｓＡｇレベルの２ log 10、好ましくは１log 10IU/mlまたは検出レベル未満への減少ができない。ＨＢＶ疾患負荷の顕著な減少、例えば、ＨＢｓＡｇレベルの２ log 10、好ましくは１log 10IU/mlまたは検出レベル未満への減少は、相当数の対象で、治療剤投与を中断する機会を提供し、ＨＢＶの機能的治癒を提供する。メカニズムに拘束されないが、ＨＢＶを標的とするｉＲＮＡ剤の投与を含むここに提供する処置レジメンおよび方法は、対象で、複数用量の治療ワクチン投与により誘発される有効な免疫応答を可能とするために十分な強度および期間、ＨＢＶ抗原および核酸を実質的に減少させることが提案される。ここに提供するレジメンおよび方法は、安定して、相当数の対象、好ましくは対象の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％または７０％で疾患負荷の実質的減少および機能的治癒を提供する。
ＨＢＶ感染のトランスジェニックマウスモデルであるＨＢＶ１.３ｘｆｓを使用して、ここに提供する組み合わせ治療を評価した。一次試験は、二つの異なる化学修飾ＧａｌＮＡｃ－ＨＢＶを標的とするｉＲＮＡ剤(ＡＤ－６６８１６およびＡＤ－６６８１０)の、血清におけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇタンパク質およびＨＢＶ ＤＮＡのレベルを、３mg／kgまたは９mg／kgの単独皮下用量で、少なくとも２１日間阻害する有効性を評価するために使用し、類似の有効性であった。非ＨＢＶｉＲＮＡ対照で顕著なノックダウンは観察されなかった(図２参照)。この結果に基づき、３mg／kgの低用量を、組み合わせ治療試験に選択した。
第一の組み合わせ治療治験において(図３参照)、マウスを６処置レジメンの一つで前処置した(ｎ＝６／群)：
(１)前処置無し；
(２)０週目の初日から開始して、試験を通してエンテカビル１μg／ml水溶液；
(３)対照ｉＲＮＡ剤の０週目、４週目、８週目および１２週目の初日の３mg／kg用量；
(４)ＨＢＶをコードするｓｈＲＮＡをコードする発現ベクター(ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ)の０週目の初日の１回用量(Michler et al., 2016)；または
(５－６)ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０(総称的に、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ)の０週目、４週目、８週目および１２週目の初日の３mg／kg用量。
１２週目および１４週目の初日に、３１.９μg 合成ホスホロチオエート化ＣｐＧＯＤＮ １６６８ (ＣｐＧ)および２５μg ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチル－フェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ)でアジュバントされた組み換え発現酵母ＨＢｓＡｇ(１５μg)および大腸菌発現ＨＢｃＡｇ(１５μg)の混合物を、タンパク質プライムワクチン接種として、全マウスに皮下投与した(Backes, 2016)。
１６週目の初日、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇを発現する改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ(各ウイルス５×１０７粒子)の混合物を、ブーストワクチン接種として、全マウスに投与した(Backes, 2016)。
血液サンプルを０週目、２週目、４週目、８週目、１２週目、１６週目および１７週目の初日に得て、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡのレベルについてアッセイした。群１、２および３(偽、エンテカビル、対照ｉＲＮＡ剤)のマウスで観察されたＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルの結果は類似した(図４Ａおよび４Ｂ)。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ単独で、血清におけるＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡの有意な減少を起こした。３用量プライム－ブーストワクチン接種スキームは、全群でのＨＢｓＡｇのさらなる減少と、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡおよびＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ群の一部動物でのＨＢｓＡｇレベルの検出レベル未満への減少をもたらした。しかしながら、ワクチン処置は、いずれの群でもＨＢｅＡｇレベルを減少させなかった。ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、エンテカビル単独で定量限界未満まで減少せず、３用量プライム－ブーストワクチンの効果は検出されなかった(図４Ｃ)。偽処置およびＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡでの処置はすべてＨＢＶ ＤＮＡレベルを減少させ、ＨＢＶ－ＤＮＡレベルは全群でプライム－ブーストワクチンによりさらに減少した。これらのデータは、ＲＮＡｉが、ウイルス抗原減少においてヌクレオチ(シ)ドアナログ治療より優れることを示す。また、ＲＮＡｉとその後のワクチン接種の組み合わせは、いずれかの薬剤単独より、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡレベルに大きな効果を有する。
実験最終日(１７週目初日)、マウスを屠殺し、肝臓を採取した。肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、Backes, 2016に提供される方法を使用して、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＭＶＡウイルス粒子の応答について評価した。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで処置したマウスは、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対してＣＤ８＋免疫応答を産生できた(図５Ａおよび５Ｂ)。偽、エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡ群で、ＨＢＶ抗原に対する顕著な免疫応答は観察されなかった。しかしながら、ＭＶＡウイルスに対する類似の免疫応答が、前処置またはウイルス抗原レベルと無関係に全動物で観察され(図５Ｃ)、ワクチン接種が全動物で等しくよく働いていることを示し、有効な免疫系の存在を示す。図５Ａ～Ｃに示すデータは、最初の分析中の死亡免疫細胞の不十分な排除に適応させるために実施した再分析であった。２回目の分析で得たデータ(図５Ｄ～Ｆに示す)もまた、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処理したマウスのみが、治療ワクチン接種後にＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を産生できるが、ＭＶＡ特異的応答は前処置に影響されなかったことを示す。２回目の分析の分散の減少は、死亡細胞のより厳密な排除による。これらのデータは、ＲＮＡｉ処置が、ヌクレオシドアナログでの現在の標準処置とは対照的に、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞免疫を回復でき、治療ワクチン接種後ＨＢＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発できることを示す。
血清は、ＨＢＶ抗原に対する抗体免疫応答についても評価した。ワクチンは、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ前処置を受けていた動物においてのみＴ細胞免疫応答を誘発できたが、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対する抗体応答は、１７週目までの評価した時点で、前処置にかかわらず全群にわたり類似した。ＨＢｅＡｇ抗体応答は検出されなかった。これらのデータは、高ＨＢＶ抗原負荷が、Ｂ細胞応答ではなく、主にＨＢＶ特異的Ｔ細胞を阻害することを示す。
肝臓もＲＴ－ｑＰＣＲおよび肝臓ＧＡＰＤＨ転写物に対する正規化によりＨＢＶ転写物の存在について評価した。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで処置したマウスは、ＨＢＶ転写物レベルの有意な減少を示した(図６Ａおよび６Ｂ)。偽およびエンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡ群で有意差は観察されなかった。肝臓切片を、肝臓での抗ウイルス効果を評価するために、コア抗原の発現について免疫組織化学染色により分析した(図６Ｃ)。ワクチン接種前に前処置しなかった動物において、平均で、８３肝細胞／mm２のＨＢｃ細胞質発現があった。この数字は、エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡで前処置した動物と有意には違わなかった。しかしながら、細胞質ＨＢｃＡｇ陽性細胞の数は、ＡＡＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ ｓｉＲＮＡ前処置動物で有意に減少した。これらのデータは、組み合わせＲＮＡｉ／ワクチン接種治療が、血清の抗原だけでなく、肝臓のウイルス抗原発現も抑制することを示す。
ＨＢＶワクチンレジメンに対する免疫応答の増強についてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用するＨＢＶ抗原の発現抑制が効果的である示されたため、ＨＢＶ抗原抑制の期間が、ＨＢＶ免疫応答増強に効果を有するか否かを決定する試験を設計した。ＨＢＶ１.３ｘｆｓマウスモデルを使用して、マウスを、８週間、６週間または３週間ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６６８１６で対照ｓｉＲＮＡで８週間、３mg／kg／用量皮下投与、続いて、ＰＣＥＰ＋ＣＰＧではなく、１０μg ｃ－ジ－ＡＭＰをアジュバントとして使用する以外、上記プライム－ブーストワクチン投与レジメンに従い、処置した(８および３群についてｎ＝６、６週群についてｎ＝６)(図７参照)。
ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡ各々のレベルの有意な減少が、ＡＤ－６６８１６の最初の投与後観察された(図８Ａ～８Ｃ)。ＨＢｓＡｇのさらに有意な減少がワクチンブーストで処置後観察され、８週間前処置群で観察された最大減少はアッセイでの検出レベル未満であり、全処置動物でＨＢｓＡｇレベルの５ log 10を超える減少を示した。免疫化は、ＨＢＶ ＤＮＡのわずかなさらなる減少(＜０.５ log 10)をもたらし、ＨＢｅＡｇレベルのさらなる減少はなかった。これらのデータは、治療ワクチン接種の有効性がワクチン接種開始前の抗原抑制の期間と相関することを示す。ＨＢＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の再構成は数週間かかり、６週間または好ましくは８週間前処置が、３週間前処置よりも大きなＨＢｓＡｇノックダウンをもたらす。
同様に、肝臓でのＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対するＴ細胞応答はＨＢＶ抗原ノックダウンの期間と相談し、ＨＢＶ抗原抑制の期間が長いほど、Ｔ細胞応答は大きくなる(図９Ａ～９Ｃ)。ＭＶＡウイルス抗原に対する類似する応答が、前処置と無関係に全群にわたり観察された(図９Ｄ)。抗体応答は、全群にわたり類似した。
肝臓もＲＴ－ｑＰＣＲおよび肝臓ＧＡＰＤＨ転写物に対する正規化によりＨＢＶ転写物の存在について評価した。長い前処置期間は、ＨＢＶ ＲＮＡノックダウンのレベルが高くなる傾向にあった(図１０Ａおよび１０Ｂ)。
肝臓切片を、肝臓での処置の抗ウイルス効果を評価するために、ＨＢｃＡｇの細胞質発現について免疫組織化学染色により分析した(図１０Ｃ)。ワクチン接種前に対照ｓｉＲＮＡで前処置した動物において、平均で、１７２肝細胞／mm２がＨＢｃの細胞質発現を示した。ワクチン接種前のＨＢＶ抑制期間が長いほど、細胞質ＨＢｃＡｇ陽性肝細胞の減少が徐々に増え、８週間前処置群で平均１２細胞質ＨＢｃＡｇ陽性肝細胞／mm２であった。これらのデータは、ワクチン接種前の長い抗原抑制で観察されるＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加が、肝臓のＨＢＶ抗原発現減少に至ることを示す。応答の耐久性を評価するために、血液サンプルを、６週間のＡＤ－６６８１６ ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処置したマウス(ｎ＝６)でブーストワクチン接種の投与後２週目および３週目に採取した。６匹のマウス中３匹で、ＨＢｓＡｇレベルはアッセイでの検出レベル未満への低下が続いた(図１１Ａおよび１１Ｂ)。特に、ワクチン接種開始時に最高ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルを有していた３匹の動物(２、４および５)は、ワクチン接種後抗原力価の減少を示さず、実験終了に向かって、抗原力価がリバウンドした。対照的に、ワクチン接種開始時に最低抗原力価を有していた３匹の動物(１、３および６)は、ＨＢｓＡｇが検出限界未満までさらなる減少を示した。これらのデータは、ここに提供する処置レジメンを使用して機能的治癒が可能であることを示す。これらのデータはまた、ワクチン接種開始時の抗原レベルが、治療ワクチン接種に対する応答に影響し得ることも示唆する。最後に、メカニズムに拘束されないが、これらのデータは、治療ワクチン接種後の抗原レベル減少が、少なくとも一部、ＣＤ８＋Ｔ細胞により介在されることを示唆する。これらのデータは、ＨＢＶ ＤＮＡ複製単独の阻害ではなく、循環ＨＢＶ抗原(例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ)のノックダウンが、ＨＢＶ治療ワクチン、例えば、プライムブースト治療ワクチン接種レジメンに対する免疫応答を増強することを示す。すなわち、免疫応答は、免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答であるため、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤単独ではなく、ｓｉＲＮＡとの前処置で増強できる。
必要なノックダウン強度および期間は、例えば、対象の疾患負荷レベルによる。循環抗原のレベルが高いほど、免疫応答増強のために必要なＨＢＶ抗原ノックダウンの強度および期間は大きくなる。血清におけるＨＢｓＡｇのノックダウンは、治療ワクチンで処置前の対象のレベルから少なくとも０.５ log 10(IU／ml)、好ましくは１ log 10(IU／ml)、１.５ log 10(IU／ml)、２ log 10(IU／ml)またはそれ以上である。ある実施態様において、血清ＨＢｓＡｇレベルは、ワクチン投与前の２.５ log 10(IU／ml)、２ log 10(IU／ml)、１.５ log 10(IU／ml)以下である。
さらに、ここで示されるとおり、ＨＢＶ抗原ノックダウンの期間が長いほど、より強固な免疫応答となる傾向がある。それ故に、少なくとも４週間、６週間または８週間の期間の十分に低いレベルまでの血清ＨＢｓＡｇのノックダウンが、ワクチン投与前に好ましい。
第二の一連の実験を、アデノ随伴ウイルス感染系を使用する後天的ＨＢＶ感染のマウスモデルにおける組み合わせｓｉＲＮＡ／ワクチン接種処置レジメンの試験のために設計した。これらの試験について、野生型Ｃ５７／Ｂｌ６マウス(９週齢)に、遺伝子型Ｄの１.２倍過剰な長さのＨＢＶゲノムを担持するアデノ随伴ウイルス血清型８(ＡＡＶ８)(ＡＡＶ－ＨＢＶ１.２)を、ｉ.ｖ.で２×１０１０ゲノム相当量注射した(例えば、Yang, et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71参照)。ＡＡＶ形質導入(－２８日目)４週間後から開始して、動物を０日目、２９日目および５７日目に対照ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ ｓｉＲＮＡ(ＨＢＶＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０)の３用量で処置し、続いて買各群の半分の動物を５７日目および７０日目にＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇおよび１０μg ｃ－ジ－ＡＭＰでのプライムタンパク質ワクチン接種および８４日目にＭＶＡ－ＨＢｓおよびＭＶＡ－ＨＢｃでのブーストからなるワクチンレジメンで処置した。処置レジメンを図１２に示す。
ＡＡＶ－ＨＢＶ１.２形質導入後、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ値は、ＨＢＶトランスジェニックマウス(ＨＢＶｘｆｓ)で見られるレベルと同等レベルまで上がった(例えば、図１３Ａおよび１３Ｂ参照)。ＨＢＶ ｓｉＲＮＡで処置したマウスは、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルが約５００IU／ml未満であるような、ＨＢｓＡｇレベルの約２ log 10スケールのおよびＨＢｅＡｇレベルの１ log 10スケールを超える平均減少を示し、一方対照ｓｉＲＮＡは抗原レベルに効果はなかった。ワクチンレジメンを受けなかったＨＢＶ ｓｉＲＮＡの一方で処置された動物は、ｓｉＲＮＡの最後の適用後抗原レベルのゆっくりしたリバウンドを示した。抗原血症は１８週間後にベースラインレベルに戻った。ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよびワクチンレジメンの組み合わせ処置は、実験の間、検出限界未満へのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇが減少する、耐久性応答をもたらした。ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルの減少はＭＶＡブースト投与前に観察されタンパク質ワクチン接種が治癒に十分であり得ることを示唆する。血清および肝臓ＨＢＶ ＤＮＡおよびＲＮＡ両者は、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよびワクチンレジメンの組み合わせ処置後有意に減少した(図１３Ｄ～１３Ｈ)。これは、ＲＮＡｉ介在抑制が抗原発現を強く減少できるが、ワクチンレジメンでの処置は応答の耐久性を延長することを示す。
対照ｓｉＲＮＡを受けた動物のワクチンレジメン単独は、一過性の抗原レベルの減少を生じ、これは実験の終わりに向けてリバウンドした。対照的に、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよびワクチン接種を受けた全動物で、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルは、ワクチン接種開始後検出限界未満まで低下した。抗原レベルは、最後のｓｉＲＮＡ適用少なくとも２２週間後測定した時点まで、全て大部分検出不可能であった(図１３Ａおよび１３Ｂ)。ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ前処置動物の抗原血症の耐久性喪失は、対照ｓｉＲＮＡ前処置動物でリバウンドした抗原と対照的であり、さらに免疫制御が、ワクチン接種前に低い抗原力価を有した動物でのみ達成されたことを示す。
抗原血症消失と一致して、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンで処置した動物は、高力価の抗ＨＢｓ抗体を発生させ、全ワクチン接種動物で抗ＨＢｓおよび抗ＨＢｅセロコンバージョンをもたらした(図１４)。ｓｉＲＮＡ前処置動物は、１０倍高く、より一貫した抗ＨＢｓ力価を発生させ、完全にかつ永続的に、血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇを浄化できた。興味深いことに、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ処置後ワクチン接種した３／１２マウスは、１５～２２週目に抗ＨＢｅレベルの一過性の低下を示し、ＨＢｅＡｇの低レベル再発をもたらし(図１３Ｃ)、これも同様に制御された。対照ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物で抗ＨＢｓ抗体も測定されたが、レベルは低かった。さらに、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物のみが抗ＨＢｅ抗体を生じた。併せて、機能的治癒はｓｉＲＮＡ処置レジメンまたは治療ワクチン接種レジメン単独では達成されなかった。しかしながら、抗原血症消失ならびに抗ＨＢｓおよび抗ＨＢｅ抗体発生は、組み合わせＨＢＶ ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンが機能的治癒を達成できることを示す。
実験を通して、動物のＡＬＴおよび体重をモニターした。抗原血症消失は、ワクチン接種レジメンと共にＨＢＶ ｓｉＲＮＡを受けた処置群で見られるＡＬＴ活性のわずかな増加と一致した(図１５Ａ)。これらの群は、組み合わせＨＢＶ ｓｉＲＮＡ－ワクチンレジメンを受けなった全ての他の処置群と比較して、有意なしかし、中程度の(両者とも反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＞０.０５以下；ワクチン接種開始後の時点のみ比較)増加を示した。メカニズムに拘束されないが、組み合わせＨＢＶ ｓｉＲＮＡ－ワクチンレジメンにより誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＨＢＶ発現肝細胞を殺し、ＡＬＴを上昇させることが示唆される。
動物の体重を実験を通して測定し、処置の耐容性をモニターした。ｓｉＲＮＡ処置と無関係に、実験を通して一定の増加を示した。ワクチン接種した動物は、ワクチン接種後にわずかな一過性の体重減少(約５％)を示したが、９日以内に正常レベルまで回復し、その後対照群と同等に体重が増加した(図１５Ｂ)。併せて、ＡＬＴ活性および体重データ両者とも、ｓｉＲＮＡのみ、ワクチンのみならびに組み合わせｓｉＲＮＡ／ワクチンレジメンを含む全実験処置が十分に耐容性であることを示す。
血清のＨＢｓＡｇレベルノックダウンのためのｓｉＲＮＡの投与数およびタイミングは、例えば、使用する特定の薬剤による。ここでの方法で使用され、例えば、付属表ＡおよびＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１(その内容を全体として引用により本明細書に包含させる)に提供される例示的ＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡの期間および効力によって、単回用量のｓｉＲＮＡが、治療ワクチン投与前に必要なノックダウンのレベルおよび期間の提供に十分であり得る。図４に示すとおり、単回用量のＡＡＶベクターコード化ｓｈＲＮＡは、ＨＢＶ抗原およびＨＢＶ ＤＮＡの耐久性ノックダウン提供に十分であった。当業者は、ＨＢＶ疾患状態を、例えば、血中ＨＢｓＡｇレベルの測定によりモニターし、特定の対象に適するｓｉＲＮＡおよびワクチン投与のタイミングおよびレベルを決定できる。
多数の治療ＨＢＶワクチンが当分野で知られ、ここに記載されている。好ましい実施態様において、ここで使用するプロトコールのようなプライム－ブーストワクチン接種プロトコールが好ましい。しかしながら、ここに提供するＨＢＶ抗原ノックダウン方法は、単独で投与したときに不十分であることが知られているものを含み、当分野で知られる他の治療ＨＢＶワクチンと組み合わせて、使用できる。ワクチン接種は、タンパク質または核酸形態の少なくとも２用量の抗原を含む。ある実施態様において、ワクチン接種は、３用量のタンパク質ベースのワクチンを含む。好ましい実施態様において、方法は、異種性ワクチン投与、すなわち、少なくとも一つのタンパク質ベースのワクチン用量および少なくとも一つの核酸ベースのワクチン用量を含む。ワクチンおよび投与レジメンの例示的実施態様は、例えば、内容を全体として引用により本明細書に包含させる、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１７／１２１７９１に提供される。
ここに提供する方法はＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチンの使用を含み、ここで、構築物は該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードする。それ故に、核酸ベースのワクチンも、タンパク質ベースのワクチンも、完全長タンパク質を提供する必要がないことは明確に理解される。核酸ベースのワクチンおよびタンパク質ベースのワクチンは、ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇに存在する少なくとも一つの共有エピトープを提供する必要があり、完全長タンパク質が提供される必要はない。上記のとおり、エピトープは比較的短い、一般に約８～１１アミノ酸長ペプチドであるＭＨＣクラスＩ分子であってよく、一方、ＭＨＣクラスII分子は、約１３～１７アミノ酸長ペプチドで長く存在し、立体構造エピトープは長い。しかしながら、タンパク質抗原および複数エピトープをコードするタンパク質抗原のためのコード配列が好ましいことは理解される。さらに、タンパク質ベースのワクチンに存在するおよび核酸ベースのワクチンによりコード化される抗原は、同一であっても、同一でなくてもよいことは理解される。抗原は免疫原性に関して選択されるべきであることも明らかである。このような抗原は、当分野で周知である。
ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンの投与順は、ここに提供する方法で例示する順番と比較して逆である。すなわち、核酸ベースのワクチンをまず投与し、タンパク質ベースのワクチンを２番目に投与する。ある実施態様において、計３用量のワクチンが投与され、２用量の核酸ベースのワクチンに続いて、単一１用量のタンパク質ベースのワクチンである。別の実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンの後に、２用量のタンパク質ベースのワクチンである。他の実施態様において、１用量の各ワクチンが投与される。
好ましい実施態様において、プライム－ブーストワクチン接種方法は、タンパク質抗原とアジュバントの共使用を含む。本方法で使用するための適切なアジュバントは、抗原に対する細胞ベースの応答を促進する。アジュバントは、好ましくはバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を提供する。
ここに提供するｓｉＲＮＡ＋ワクチン方法を、ＨＢＶ処置の標準治療であるヌクレオチ(シ)ド阻害剤の投与と組み合わせて使用し得る。ある実施態様において、対象を、ｓｉＲＮＡ＋ワクチン処置レジメンでの処置前にヌクレオチ(シ)ド阻害剤で処置する。ある実施態様において、対象を、ｓｉＲＮＡ＋ワクチン処置レジメンでの処置の間、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤で処置する。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤を、ＨＢＶにより標的とされる核酸治療(例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド)投与前に、ＨＢＶ感染と関連する先在炎症を低減するために投与する。
ある実施態様において、対象を、ＨＢＶ処置に使用される他剤で前処置または同時処置し得る。このような薬剤は、免疫刺激剤(例えば、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－α２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体７(ＴＬＲ７)アゴニスト)、ウイルス侵入阻害剤(例えば、Myrcludex)、ＨｂｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド(例えば、ＲＥＰ ９ＡＣ)、カプシド阻害剤(例えば、Ｂａｙ４１－４１０９およびＮＶＲ－１２２１)、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤(例えば、ＩＨＶＲ－２５)、Ｒｉｇ－Ｉリガンドまたは免疫チェックポイント制御因子を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、免疫刺激剤はＲｉｇ－Ｉリガンドまたは免疫チェックポイント制御因子である。機能的治癒は、少なくとも３か月、好ましくは６か月の５０IU／ml未満へのＨＢｓＡｇ減少またはＨＢｓＡｇへの検出可能な抗体応答の持続期間を含む。好ましい実施態様において、機能的治癒は、少なくとも３か月、好ましくは６か月の５０IU／ml未満のＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇに対する検出可能な抗体応答の持続期間を含む。
Ａ. 本発明の方法において使用するＲＮＡｉ剤
本発明は、少なくとも一つのＨＢＶ転写物および好ましくは３または４ＨＢＶ転写物(オープンリーディングフレーム、ここでは遺伝子と称することもある)の発現を阻害する、ｉＲＮＡの使用を含む。ＨＢＶゲノムの高度に凝縮された構造のため、３または４ＨＢＶ転写物の発現を阻害する単一ｉＲＮＡの設計が可能である(図１参照)。単純化のために、ここでは、「ＨＢＶ転写物」と称する。好ましい実施態様は、１を超えるＨＢＶ転写物(またはオープンリーディングフレーム)、好ましくは少なとも３つのＨＢＶ転写物(またはオープンリーディングフレーム)の阻害を含むことは明らかである。さらに、８つのＨＢＶ遺伝子型および２つの提案されたさらなる遺伝子型があり、それらがさらに公開配列からの変異を含み得ることは理解される。それ故に、あるｉＲＮＡ剤は、特定の遺伝子型およびＨＢＶに感染した対象に基づき、異なる数の遺伝子を阻害し得る。
ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤は、ＨＢＶ感染を有する対象における細胞のＨＢＶ転写物の発現阻害またはレベルの減少のための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)分子を含む。ｄｓＲＮＡは、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含み、これは、ＨＢＶ転写物の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。相補性領域は、約３０ヌクレオチド以下長(例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチド長以下)を有する。ＨＢＶ遺伝子を発現する細胞との接触により、ｉＲＮＡは、少なくとも１、好ましくは３または４ＨＢＶ遺伝子の発現を選択的に阻害する。好ましい実施態様において、発現の阻害は、実施例に提供する、適切な細胞株でのｑＰＣＲ方法により決定する。活性のインビトロ評価のために、パーセント阻害を、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１の実施例２に提供される方法を使用して、１０nM 二本鎖最終濃度の単一用量で決定する。インビボ試験について、処置後のレベルを、例えば、適切な歴史的対照と比較するかまたは、例えば、ベースライン値が対象について利用可能でないときプールした集団サンプル対照と比較して、減少レベルを決定することができる。適切な対照は、当業者により注意深く選択されるべきである。
ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用されるであろう条件下で、相補的であり、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に実質的に相補性および一般に完全に相補性である、相補性領域を含む。標的配列は、ＨＢＶ遺伝子の発現中、形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。複数ＨＢＶ遺伝子型が知られているため、ｉＲＮＡ剤は、好ましくはできるだけ多くの遺伝子型にわたり、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するように設計される。１以上のＨＢＶ遺伝子型に完全に相補性のｓｉＲＮＡは、全遺伝子型に完全に相補性ではないことが理解される。他の鎖(センス鎖)は、適当な条件下で合わさったとき、２鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補性である領域を含む。本明細書の他の箇所に記載し、当分野で知ら得るとおり、ｄｓＲＮＡの相補性配列も、別々のオリゴヌクレオチドにあるのとは異なり、単一核酸分子の自己相補性領域として含まれ得る。
一般に、二本鎖構造は、１５～３０塩基対長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対長である。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。
同様に、標的配列に対する相補性領域は、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２ヌクレオチド長である。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。
ある実施態様において、ｄｓＲＮＡは約１５～２０ヌクレオチド長または約２５～３０ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質として働くのに十分長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質として働き得ることは当分野で周知である。当業者にはまた認識されるとおり、切断の標的とされるＲＮＡの領域は、最もしばしば大型のＲＮＡ分子、多くはｍＲＮＡ分子の一部である。適切であれば、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、切断のためにＲＮＡｉ指向される基質となり得る十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である(すなわち、ＲＩＳＣ経路を経る切断)。
二本鎖領域、例えば、約９～３６塩基対、例えば、約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対の二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能的部分であることも当業者は認識する。それ故に、ある実施態様において、切断について所望のＲＮＡを標的とする、例えば、１５～３０塩基対の機能的二本鎖に処理される程度において、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。それ故に、当業者は、ある実施態様において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識する。他の実施態様において、ｄｓＲＮＡは天然に存在するｍｉＲＮＡではない。他の実施態様において、ＨＢＶ遺伝子発現の標的に有用なｉＲＮＡ剤は、大型ｄｓＲＮＡの切断により、標的細胞で産生されない。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を経る所望の標的ＲＮＡの特定の分解を可能にする任意の長さでよく、約９～３６塩基対長、例えば、約１５～３０塩基対長、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６塩基対長、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対長の範囲であり得る。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。
二本鎖構造を形成する２つの鎖は、一つの大型ＲＮＡ分子の異なる部分であってよく、または別々のＲＮＡ分子であってよい。２つの鎖が一つの大型分子の一部であり、それ故に二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間のヌクレオチドの中断されていない鎖で連結されているならば、連結ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも一つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施態様において、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。
ある実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、テトラループを含む。ｄｓＲＮＡの文脈で、ここで使用する「テトラループ」は、隣接するワトソン－クリックハイブリダイズヌクレオチドの安定性に寄与する、安定な二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ(一本鎖領域)をいう。理論に拘束されないが、テトラループは、相互作用の積み重ねにより隣接ワトソン－クリック塩基対を安定化し得る。さらに、テトラループ内の４ヌクレオチド間の相互作用は、非ワトソン－クリック塩基対形成、積み重ね相互作用、水素結合および接触相互作用を含むが、これらに限定されない(Cheong et al., Nature 1990 Aug 16;346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul 12;253(5016): 191-4)。テトラループは、４つの無作為塩基からなる単純モデルループ配列から予測されるより、高い、隣接二本鎖の融点(Ｔｍ)増加に寄与する。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対長の二本鎖を含むヘアピンで、１０mM ＮａＨＰＯ４中、少なくとも５５℃の融点を付与し得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含み得る。ＲＮＡテトラループの例は、テトラループのＵＮＣＧファミリー(例えば、ＵＵＣＧ)、テトラループのＧＮＲＡファミリー(例えば、ＧＡＡＡ)およびＣＵＵＧテトラループを含む。(Woese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8467-71 ; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov l l;19(21):5901-5)。ＤＮＡテトラループの例は、テトラループのｄ(ＧＮＮＡ)ファミリー(例えば、ｄ(ＧＴＴＡ))、テトラループのｄ(ＧＮＲＡ)ファミリー、テトラループのｄ(ＧＮＡＢ)ファミリー、テトラループのｄ(ＣＮＮＧ)ファミリー、テトラループのｄ(ＴＮＣＧ)ファミリーｏｆｓ(例えば、ｄ(ＴＴＣＧ))を含む(Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002; Shinji et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu vol.78th; no.2; page.731 (2000))。
本発明のある実施態様において、例えば、内容を引用により全体として本明細書に包含させる米国特許公開２０１１／０２８８１４７に記載のような、テトラループおよび修飾ヌクレオチド含有ｄｓＮＡが意図される。あるこのような実施態様において、本発明のｄｓＮＡは、第一鎖および第二鎖を有し、ここで、該第一鎖および第二鎖は、１９～２５ヌクレオチド長の二本鎖領域を形成し、第一鎖は、第一鎖－第二鎖二本鎖領域を超えて伸びる３’領域を含み、テトラループを含み、ｄｓＮＡは、第一鎖の３’末端と第二鎖の５’末端の間に中断を含む。
所望により、中断は、テトラループ含有二本鎖核酸(ｄｓＮＡ)の突出ダイサー切断部位に位置する。任意の他の本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるとおり、本発明のテトラループ含有二本鎖は、例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、逆位塩基、ＧａｌＮＡｃ部分などを含む、ここに開示するまたは当分野で他に知られるあらゆる範囲の修飾を含んでよい。一般に、テトラループ含有ｄｓＮＡの両鎖の全ヌクレオチドは、テトラループ含有ｄｓＮＡが、脂質ナノ粒子または送達過程中ｄｓＮＡを分解から保護するある他の送達方法を使用して送達されるつもりならば、化学修飾される。しかしながら、ある実施態様において、１以上のヌクレオチドは修飾されない。
ｄｓＲＮＡの実質的に相補性の２鎖が別々のＲＮＡ分子に含まれるとき、これらの分子は、必要はないが、共有結合により接続され得る。２鎖が、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間の中断されていないヌクレオチドの鎖以外の手段で共有結合により接続されるならば、連結構造は「リンカー」と称する。これらＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖のヌクレオチドから、二本鎖に存在するあらゆるオーバーハングを減じたものである。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは１以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
ここに記載するｄｓＲＮＡは、さらに１以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３または４ヌクレオチドを含む。少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端対応物に対して、予想外に優れた阻害性質を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含む、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含むまたはこれからなることができる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはこれらの任意の組み合わせにあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖の５’末端、３’末端または両端にあり得る。ある実施態様において、長い、伸長したオーバーハングが可能である。
ｄｓＲＮＡは、当分野で知られる標準方法により合成され得る。本発明のｉＲＮＡ化合物は、２段階手順を使用して製造し得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖を別々に製造する。次いで、成分鎖をアニールする。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖を、液相または固相有機合成または両者を使用して製造し得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡ化合物は、細胞に送達された発現ベクターから産生される。
ある態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列および抗センス配列を含む。センス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択される。
ある実施態様において、センス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択される。この態様において、２配列の一方は、２配列の他方と相補性であり、配列の一方は、ＨＢＶ遺伝子の発現により産生されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補性である。従って、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、１つのオリゴヌクレオチドは、付属表Ａの表のいずれかにセンス鎖として記載され、第二オリゴヌクレオチドは、付属表Ａの表のいずれかにセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補性の配列は、別々のオリゴヌクレオチドに含まれる。他の実施態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補性の配列は、単一オリゴヌクレオチドに含まれる。
付属表Ａの表の配列のいくつかは、修飾またはコンジュゲート配列として記載されるが、本発明のｉＲＮＡ、例えば、本発明のｄｓＲＮＡのＲＮＡは、非修飾、非コンジュゲートまたはそこに記載されているのと異なって修飾またはコンジュゲートされている、付属表Ａの表に示す配列のいずれかを含み得る。さらなる標的部位は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１、ＷＯ２０１２／０２４１７０、ＷＯ２０１７／０２７３５０およびＷＯ２０１３／００３５２０；およびMichler, 2016に提供され、これらの各々の内容を全体として引用により本明細書に包含させる。
約２０～２３塩基対、例えば、２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉誘発に特に効果的であるとして支持されていることは、当業者は十分に知っている(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888)。しかしながら、他者は、短いまたは長いＲＮＡ二本鎖構造も効果的であることを発見している(Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226)。上記実施態様において、付属表Ａの表のいずれかに提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、ここに記載するｄｓＲＮＡは、最小２１ヌクレオチド長の少なくとも一つの鎖を含む。付属表Ａの表のいずれかの配列の一つから一端または両端の数ヌクレオチドのみを減じた短い二本鎖が、上記ｄｓＲＮＡと同様に効果的であり得ることは、合理的に予測される。従って、付属表Ａの表のいずれかの配列の一つに由来し、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害する能力が、完全配列を含むｄｓＲＮＡと５％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％阻害まで異ならない少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡ。
ここに記載するｉＲＮＡは、例えば、ＨＢＶ遺伝子型の配列多様性のため、標的配列または１以上のＨＢＶ標的配列に対する１以上のミスマッチを含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｉＲＮＡは、３以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含むならば、ミスマッチ領域が相補性領域の中心に存在しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含むならば、ミスマッチが相補性領域の５’または３’末端から最後の５ヌクレオチド以内に制限されるのが好ましい。例えば、２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤について、ＨＢＶ遺伝子の領域に相補性である鎖は、一般に中心１３ヌクレオチド内に何らミスマッチを含まない。ここに記載する方法または当分野で知られる方法を、標的配列に対するミスマッチを含むｉＲＮＡが、ＨＢＶ遺伝子の発現阻害に効果的であるか否かの決定に使用できる。ＨＢＶ遺伝子の発現阻害におけるミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性の考察は、特にＨＢＶ遺伝子における特定の相補性領域が、種々の遺伝子型で多型配列変種を有することが知られているとき、重要である。
ｉ. 本発明の方法で使用するための修飾ｉＲＮＡ
ある実施態様において、本発明で使用するｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは非修飾であり、例えば、発現ベクターから産生されたとき、例えば、当分野で知られ、ここに記載する化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。他の実施態様において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するために、化学修飾される。本発明のある実施態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全ては修飾される。本発明の他の実施態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全ては修飾される。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」本発明のｉＲＮＡは、大部分、しかし完全にではなく、修飾され、５、４、３、２または１を超えない非修飾ヌクレオチドを含み得る。
本発明で注目する核酸は、引用により本明細書に包含させる、“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のもののような、当分野で十分確立されている方法により合成または修飾され得る。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾(リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合)または３’末端修飾(コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など)；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基または拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対形成する塩基での置換、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)またはコンジュゲート塩基；糖修飾(例えば、２’位または４’位)または糖の置換；またはホスホジエステル結合の修飾または置換を含む主鎖修飾を含む。ここに記載する実施態様で有用なｉＲＮＡ化合物の具体例は、修飾主鎖を含むまたは天然ヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡを含むが、これらに限定されない。修飾主鎖を有するＲＮＡは、とりわけ、主鎖にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的でおよび当分野で時に言及されるとおり、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有しない修飾ＲＮＡも、オリゴヌクレオシドとして見なされ得る。ある実施態様において、修飾ｉＲＮＡは、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミド酸およびアミノアルキルホスホロアミド酸を含むホスホロアミド酸、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび正常３’－５’結合を有するボラノホスフェート、その２’－５’結合アナログおよびヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に結合している逆位極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も包含される。
上記リン含有結合の製造を教示する代表的米国特許は、米国特許３,６８７,８０８；４,４６９,８６３；４,４７６,３０１；５,０２３,２４３；５,１７７,１９５；５,１８８,８９７；５,２６４,４２３；５,２７６,０１９；５,２７８,３０２；５,２８６,７１７；５,３２１,１３１；５,３９９,６７６；５,４０５,９３９；５,４５３,４９６；５,４５５,２３３；５,４６６,６７７；５,４７６,９２５；５,５１９,１２６；５,５３６,８２１；５,５４１,３１６；５,５５０,１１１；５,５６３,２５３；５,５７１,７９９；５,５８７,３６１；５,６２５,０５０；６,０２８,１８８；６,１２４,４４５；６,１６０,１０９；６,１６９,１７０；６,１７２,２０９；６、２３９,２６５；６,２７７,６０３；６,３２６,１９９；６,３４６,６１４；６,４４４,４２３；６,５３１,５９０；６,５３４,６３９；６,６０８,０３５；６,６８３,１６７；６,８５８,７１５；６,８６７,２９４；６,８７８,８０５；７,０１５,３１５；７,０４１,８１６；７,２７３,９３３；７,３２１,０２９；および米国特許ＲＥ３９４６４を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
リン原子を中に含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間結合により形成される、主鎖を含む。これらは、モルホリノ結合(一部ヌクレオシドの糖部分から形成)；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を含むその他を含む。
上記オリゴヌクレオシドの製造を教示する代表的米国特許は、米国特許５,０３４,５０６；５,１６６,３１５；５,１８５,４４４；５,２１４,１３４；５,２１６,１４１；５,２３５,０３３；５,６４,５６２；５,２６４,５６４；５,４０５,９３８；５,４３４,２５７；５,４６６,６７７；５,４７０,９６７；５,４８９,６７７；５,５４１,３０７；５,５６１,２２５；５,５９６,０８６；５,６０２,２４０；５,６０８,０４６；５,６１０,２８９；５,６１８,７０４；５,６２３,０７０；５,６６３,３１２；５,６３３,３６０；５,６７７,４３７；および５,６７７,４３９を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
他の実施態様において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合両者、すなわち、主鎖が新しい基で置換される、適当なＲＮＡ模倣体がｉＲＮＡでの使用のために意図される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション性質を有することが示されているＲＮＡ模倣体である、一つのこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は維持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の製造を教示する代表的米国特許は、米国特許５,５３９,０８２；５,７１４,３３１；および５,７１９,２６２を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。本発明のｉＲＮＡにおける使用に適するさらなるＰＮＡ化合物は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載される。
本発明で注目されるある実施態様は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオシド、特に上記米国特許５,４８９,６７７のヘテロ原子主鎖－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ(ＣＨ３)－Ｏ－ＣＨ２－[メチレン(メチルイミノ)またはＭＭＩ主鎖として知られる]、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ(ＣＨ３)－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ(ＣＨ３)－Ｎ(ＣＨ３)－ＣＨ２－および－Ｎ(ＣＨ３)－ＣＨ２－ＣＨ２－[ここで、天然ホスホジエステル主鎖は－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－として表される]および上記米国特許５,６０２,２４０のアミド主鎖を有するＲＮＡを含む。ある実施態様において、ここで注目するＲＮＡは、上記米国特許５,０３４,５０６のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた１以上の置換糖部分を含み得る。ここで注目するｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位に次の一つを含み得る：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル(ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る)。例示的な適当な修飾は、Ｏ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２).ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２およびＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３)]２を含み、ここで、ｎおよびｍは１～約１０である。他の実施態様において、ｄｓＲＮＡは、２’位に次の一つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態性質を改善する基またはｉＲＮＡの薬力学性質を改善する基および類似の性質を有する他の置換基。ある実施態様において、修飾は、２’メトキシエトキシ(２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－(２－メトキシエチル)または２’－ＭＯＥとしても知られる)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。他の例示的修飾は、下記例に記載する２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても既知の、Ｏ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ(当分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる)、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ(ＣＨ２)２を含む。
他の修飾は、２’－メトキシ(２’－ＯＣＨ３)、２’－アミノプロポキシ(２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)および２’－フルオロ(２’－Ｆ)を含む。類似の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’結合ｄｓＲＮＡの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にも行い得る。ｉＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾糖構造の製造を教示する代表的米国特許は、米国特許４,９８１,９５７；５,１１８,８００；５,３１９,０８０；５,３５９,０４４；５,３９３,８７８；５,４４６,１３７；５,４６６,７８６；５,５１４,７８５；５,５１９,１３４；５,５６７,８１１；５,５７６,４２７；５,５９１,７２２；５,５９７,９０９；５,６１０,３００；５,６２７,０５３；５,６３９,８７３；５,６４６,２６５；５,６５８,８７３；５,６７０,６３３；および５,７００,９２０を含むが、これらに限定されず、これらの一部は、本願と所有者が共通し、前記の各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、核酸塩基(しばしば当分野では単に「塩基」と称される)修飾または置換を含む。ここで使用する「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン(Ａ)およびグアニン(Ｇ)およびピリミジン塩基チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)およびウラシル(Ｕ)を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えばデオキシ－チミン(ｄＴ)、５－メチルシトシン(５－ｍｅ－Ｃ)、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル(シュードウラシル)、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンおよび３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含む。さらに核酸塩基は、米国特許３,６８７,８０８に記載のもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に記載のもの；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に記載のもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に記載のものおよびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993に記載のものを含む。これらの核酸塩基の一部は、本発明で注目されるオリゴマー化合物の結合親和性に特に有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む０－６置換プリンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０.６～１.２℃だけ上昇させることが示されており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わさったとき、例示的塩基置換である。
上記修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の一部の製造を教示する代表的米国特許は、上記米国特許３,６８７,８０８、４,８４５,２０５；５,１３０,３０；５,１３４,０６６；５,１７５,２７３；５,３６７,０６６；５,４３２,２７２；５,４５７,１８７；５,４５９,２５５；５,４８４,９０８；５,５０２,１７７；５,５２５,７１１；５,５５２,５４０；５,５８７,４６９；５,５９４,１２１、５,５９６,０９１；５,６１４,６１７；５,６８１,９４１；５,７５０,６９２；６,０１５,８８６；６,１４７,２００；６,１６６,１９７；６,２２２,０２５；６,２３５,８８７；６,３８０,３６８；６,５２８,６４０；６,６３９,０６２；６,６１７,４３８；７,０４５,６１０；７,４２７,６７２；および７,４９５,０８８を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
ｉＲＮＡのＲＮＡは、１以上のロックド核酸(ＬＮＡ)を含むように修飾されてもよい。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を連結する余分の橋を含む修飾リボース部分を有する、ヌクレオチドである。この構造は、効果的に３’エンド配座構造のリボースを「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清におけるｓｉＲＮＡ安定性を増強し、オフターゲット効果を低減することが示されている(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。
ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ(アンロックド核酸)ヌクレオチドである１以上の単量体を含む。ＵＮＡは、糖の結合のいずれかが除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する、アンロックド非環式核酸である。一例において、ＵＮＡはまたＣ１’－Ｃ４’間の結合(すなわちＣ１’炭素とＣ４’炭素間の共有結合性炭素－酸素－炭素結合)が除去されている単量体も含む。他の例において、糖のＣ２’－Ｃ３’結合(すなわちＣ２’炭素とＣ３’炭素間の共有結合性炭素－炭素結合)が除去されている(引用により本明細書に包含させるNuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039参照)。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた１以上の二環式糖部分を含むようにも修飾され得る。「二環式糖」は、２原子の架橋による、フラノシル環修飾である。「二環式ヌクレオシド」(「ＢＮＡ」)は、糖環の２炭素原子を連結する橋を含み、それにより二環式環系を形成する、糖部分を有するヌクレオシドである。ある実施態様において、橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続する。それ故に、ある実施態様において、本発明の薬剤は１以上のロックド核酸(ＬＮＡ)を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を連結する余分の橋を含む修飾リボース部分を有する、ヌクレオチドである。換言すると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、効果的に３’エンド配座構造のリボースを「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清におけるｓｉＲＮＡ安定性を増強し、オフターゲット効果を低減することが示されている(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。本発明のポリヌクレオチドで使用するための二環式ヌクレオシドの例は、４’および２’リボシル環原子の間に橋を含むヌクレオシドを含むが、これに限定されない。ある実施態様において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’と２’の橋を含む、１以上の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’と２’が架橋された二環式ヌクレオシドの例は、４’－(ＣＨ２)－Ｏ－２’(ＬＮＡ)；４’－(ＣＨ２)－Ｓ－２’；４’－(ＣＨ２)２－Ｏ－２’(ＥＮＡ)；４’－ＣＨ(ＣＨ３)－Ｏ－２’(別名「拘束エチル」または「ｃＥｔ」)および４’－ＣＨ(ＣＨ２ＯＣＨ３)－Ｏ－２’(およびそのアナログ；、例えば、米国特許７,３９９,８４５参照)；４’－Ｃ(ＣＨ３)(ＣＨ３)－Ｏ－２’(およびそのアナログ；例えば、米国特許８,２７８,２８３参照)；４’－ＣＨ２－Ｎ(ＯＣＨ３)－２’(およびそのアナログ；例えば、米国特許８,２７８,４２５参照)；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ(ＣＨ３)－２’(例えば、ＵＳ２００４０１７１５７０参照)；４’－ＣＨ２－Ｎ(Ｒ)－Ｏ－２’(ここで、ＲはＨ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたは保護基である)(例えば、米国特許７,４２７,６７２参照)；４’－ＣＨ２－Ｃ(Ｈ)(ＣＨ３)－２’(例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134参照)；および４’－ＣＨ２－Ｃ(＝ＣＨ２)－２’(およびそのアナログ；、例えば、米国特許８,２７８,４２６参照)を含むが、これらに限定されない。前記の各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
ロックド核酸ヌクレオチドの製造を教示するさらなる代表的米国特許および米国特許公開は、次のものを含むが、これらに限定されない：米国特許６,２６８,４９０；６,５２５,１９１；６,６７０,４６１；６,７７０,７４８；６,７９４,４９９；６,９９８,４８４；７,０５３,２０７；７,０３４,１３３；７,０８４,１２５；７,３９９,８４５；７,４２７,６７２；７,５６９,６８６；７,７４１,４５７；８,０２２,１９３；８,０３０,４６７；８,２７８,４２５；８,２７８,４２６；８,２７８,２８３；ＵＳ２００８００３９６１８；およびＵＳ２００９００１２２８１、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む、１以上の立体化学糖配置を有する前記二環式ヌクレオシドの何れも製造できる(ＷＯ９９／１４２２６参照)。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１以上の拘束エチルヌクレオチドを含むようにも修飾し得る。ここで使用する「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ(ＣＨ３)－Ｏ－２’橋を含む二環式糖部分を含む、ロックド核酸である。ある実施態様において、拘束エチルヌクレオチドは、ここで「Ｓ－ｃＥｔ」と称する、Ｓ立体構造である。
本発明のｉＲＮＡはまた以上の「配座固定ヌクレオチド」(「ＣＲＮ」)も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素とＣ４’炭素またはリボースのＣ３炭素とＣ５’炭素を連結するリンカーを有するヌクレオチドアナログである。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体構造にロックし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、少ないリボース環パッカリングとなるように、安定性および親和性のために最適位置に酸素を配置するのに十分な長さである。
上記ＣＲＮの製造を教示する代表的刊行物は、ＵＳ２０１３０１９０３８３およびＷＯ２０１３０３６８６８を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
ＲＮＡ分子の末端への安定化の可能性のある修飾は、Ｎ－(アセチルアミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ)、Ｎ－(カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６)、Ｎ－(アセチル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ)、チミジン－２’－０－デオキシチミジン(エーテル)、Ｎ－(アミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ)、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆位塩基ｄＴ(ｉｄＴ)およびその他を含み得る。この修飾の開示は、ＷＯ２０１１００５８６１にみることができる。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾は、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖における５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体を含む。適当なホスフェート模倣体は、例えばＵＳ２０１２０１５７５１１に開示され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。
ある特定の実施態様において、本発明の方法において使用するＲＮＡｉ剤は、付属表Ａの表の何れかに列記された薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤はさらにリガンドを含み得る。
ii. リガンドにコンジュゲートしたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの他の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上のリガンド、部分またはコンジュゲートのＲＮＡへの化学連結である。このような部分は、脂質部分、例えば、コレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、ポリアミンまたはａポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-97３)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、リガンドは、取り込まれているｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティングまたは寿命を変える。好ましい実施態様において、リガンドは、例えば、該リガンドがない種と比較して、選択標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、体内の細胞もしくは臓器区画、組織、臓器または領域への親和性増強を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸の二本鎖対形成に参加しない。
リガンドは、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミンまたはヒアルロン酸)；または脂質などの天然に存在する物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの組み換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリリシン(ＰＬＬ)、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル－マレイン無水物コポリマー、Ｎ－(２－ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２－エチルアクリル酸)、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンなどのポリアミノ酸を含む。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはアルファヘリカルペプチドを含む。
リガンドはまた、腎細胞などの特定の細胞型に結合する、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体も含み得る。ターゲティング基はまた、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、単価または多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体でもあり得る。ある実施態様において、リガンドは単価または多価ガラクトースを含む。ある実施態様において、リガンドはコレステロールを含む。
リガンドの他の例は、色素、挿入剤(例えばアクリジン)、架橋剤(例えばソラレン、マイトマイシンＣ)、ポルフィリン(ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えばＥＤＴＡ)、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１,３－ビス－Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３－(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディペプチド、Ｔａｔペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ(例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ)、ＭＰＥＧ、[ＭＰＥＧ]２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体)、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰを含む。
リガンドは、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに特定の親和性を有する分子または抗体、抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含み得る。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、単価または多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースなどの非ペプチド種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクティベーターまたはＮＦ－κＢのアクティベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の微小管、微小線維または中間径フィラメントの破壊による、例えば、細胞の細胞骨格の破壊により、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増加できる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。
ある実施態様において、ここに記載するｉＲＮＡに結合するリガンドは、薬物動態モジュレーター(ＰＫモジュレーター)として働く。ＰＫモジュレーターは、脂溶性物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどを含む。例示的ＰＫモジュレーターは、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどを含むが、これらに限定されない。多数のホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも血清タンパク質に結合することが知られ、故に、主鎖に複数のホスホロチオエート結合を含む短オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして本発明に受け入れられる(例えばＰＫ調節リガンドとして)。さらに、血清成分(例えば血清タンパク質)に結合するアプタマーも、ここに記載する実施態様においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンド－コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの連結分子の結合に由来するもののような、ペンダント反応性官能基を担持するオリゴヌクレオチドの使用により合成され得る(下記)。この反応性オリゴヌクレオチドは、直接市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを担持する合成されたリガンドまたは結合する連結部分を有するリガンドと反応させ得る。
本発明のコンジュゲートで使用するオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知技法により、好都合にかつ日常的に製造され得る。このような合成用装置は、例えば、Applied Biosystems(Foster City, Calif.)を含むいくつかのベンダーから販売されている。当分野で知られる該合成の任意の他の手段は、これに加えてまたはこれに代えて用いられ得る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを製造する類似技法の使用も知られる。
本発明のリガンド－コンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび配列特異的な連結オリゴヌクレオチドを担持するリガンド－分子において、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準的ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体または、連結部分をすでに担持するヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに担持するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－コンジュゲート前駆体または非ヌクレオシドリガンド担持構成要素を利用して、適当なＤＮＡ合成装置で組み立て得る。
連結部分をすでに担持するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用するとき、配列特異的な連結ヌクレオシドの合成を、一般に完了し、次いでリガンド分子を連結部分と反応させて、リガンド－コンジュゲートオリゴヌクレオチドを形成する。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドを、市販され、オリゴヌクレオチド合成に一般に使用される標準的ホスホラミダイトおよび非標準的ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲート由来のホスホラミダイトを使用して自動化合成装置により合成する。
１. 脂質コンジュゲート
ある実施態様において、リガンドまたはコンジュゲートは脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、体内の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能とする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む、肝臓であり得る。ＨＳＡと結合できる他の分子もリガンドとして使用し得る。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増加させる、(ｂ)標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送を増加させるまたは(ｃ)血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合の調節に使用し得ることができる。
脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの標的組織への結合阻害、例えば、制御に使用し得る。例えば、ＨＳＡへの結合が強いほど、脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的化する可能性が低く、それ故に体内から除去される可能性が低い。脂質または脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡへの結合が弱いほど、コンジュゲートを腎臓に向けるのに使用し得る。
好ましい実施態様において、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分布されるように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかしながら、親和性が、ＨＳＡ－リガンド結合が可逆性であり得ないほど強くないのが好ましい。
他の好ましい実施態様において、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分布しないように、ＨＳＡに弱く結合するかまたは全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分をまた、脂質ベースのリガンドの代わりにまたはそれに加えて使用し得る。
他の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞により取り込まれる、部分、例えば、ビタミンである。例えば、悪性または非悪性型の望まれない細胞増殖により特徴づけられる障害、例えば、癌細胞の処置に特に有用である。例示的ビタミンはビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。他の例示的ビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは肝細胞などの標的細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素を含む。また包含されるのは、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)である。
２. 細胞透過剤
他の態様において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリカル細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は両親媒性である。例示的薬剤は、ｔａｔまたはアンティナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドであるならば、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード－ペプチド結合およびＤ－アミノ酸の使用を含み、修飾され得る。ヘリカル薬剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有する、好ましくはアルファ－ヘリカル剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(ここでは、オリゴペプチド模倣体とも称する)は、天然ペプチドに類似する規定三次元構造に折りたたまれ得る、分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチドおよびペプチド模倣体の結合は、細胞認識および吸収増強によるなど、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響し得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド(例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。他の例において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列(ＭＴＳ)を含み得る。例示的疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号３３)を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦアナログ(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番号３４))も、ターゲティング部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を超えるペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む、大極性分子を担持し得る「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質(GRKKRRQRRRPPQ(配列番号３５)およびショウジョウバエアンテナペディタンパク質(RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号３６)からの配列が、送達ペプチドとして機能し得ることが判明している。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレーライブラリーまたはone-bead-one-compound(ＯＢＯＣ)組み合わせライブラリーから同定されたペプチドなど、ＤＮＡの無作為配列によりコード化され得る(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991)。細胞ターゲティング目的のために取り込まれた単量体単位を経てｄｓＲＮＡ剤に繋がれたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸(ＲＧＤ)－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の範囲の長さでり得る。ペプチド部分は、安定性増加または立体構造性質指向のために構造的修飾を有し得る。下記構造的修飾の何れも利用し得る。
本発明の組成物および方法で使用し得るＲＧＤペプチドは、直線状または環状であってよく、特定の組織へのターゲティングを促進するために、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化されていてよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的とする。
「細胞浸透ペプチド」は、細胞、例えば、細菌または真菌細胞などの微生物細胞またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過できる。微生物細胞透過ペプチドは、例えば、α－ヘリカル直線状ペプチド(例えば、ＬＬ－３７またはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン)または1個または２個の支配アミノ酸のみを含むペプチド(例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン)であり得る。Ａ細胞浸透ペプチドはまた、核局在化シグナル(ＮＬＳ)を含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大Ｔ抗原のＮＬＳ由来のＭＰＧなどの二連両親媒性ペプチドであり得る(Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003)。
３. 炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法のある実施態様において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、さらに炭水化物を含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、ここに記載する、インビボ治療使用に適する核酸および組成物のインビボ送達に有利である。ここで使用する「炭水化物」は、少なくとも６炭素原子(直線状、分岐または環状であり得る)と各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子の１以上の単糖単位からなる炭水化物自体である化合物；または一部として少なくとも６炭素原子(直線状、分岐または環状であり得る)と各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子の１以上の単糖単位からなる炭水化物部分を有する、化合物をいう。代表的炭水化物は、糖(単、二、三および約４、５、６、７、８または９単糖単位を含むオリゴ糖)ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖を含む。特定の単糖は、Ｃ５以上(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)の糖を含む；二および三糖は、２または３単糖単位(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)を有する糖を含む。
ある実施態様において、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは単糖である。他の実施態様において、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは、次のものからなる群から選択される。
ある実施態様において、単糖は、
などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
ここに記載する実施態様で使用するための他の代表的炭水化物コンジュゲートは、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドならば、他方は水素であるときの
を含むが、これにら限定されない。
本発明のある実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、単価リンカーを経て本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。ある実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを経て本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを経て本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。
ある実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した１個のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。他の実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数(例えば、２、３、４、５または６)のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々独立して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに、複数の単価リンカーを経て結合する。
ある実施態様において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間の中断されていないヌクレオチドの鎖により接続される一つの大型分子の一部であるとき、ヘアピンループ内の各不対ヌクレオチドは、独立して単価リンカーを経て結合するＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。ヘアピンループは、二本鎖の一方の鎖における伸長オーバーハングによっても形成され得る。
ある実施態様において、炭水化物コンジュゲートは、さらに、ＰＫモジュレーターまたは細胞浸透ペプチドなどの、しかし、これに限定されない、上記の１以上の付加的リガンドを含み得る。
本発明での使用に適するさらなる炭水化物コンジュゲートは、ＷＯ２０１４１７９６２０およびＷＯ２０１４１７９６２７に記載のものを含み、これら各々の内容全体を引用により本明細書に包含する。
４. リンカー
ある実施態様において、ここに記載するコンジュゲートまたはリガンドは、切断可能または非切断可能であり得る種々のリンカーにより、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。
用語「リンカー」または「連結基」は、化合物の二つの部分を接続する、例えば、化合物の二つの部分を共有結合する、有機部分を意味する。リンカーは、一般に直接結合または酸素または硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ(Ｏ)、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位または、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール(１以上のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ２、Ｎ(Ｒ８)、Ｃ(Ｏ)、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロ環式で中断または停止していてよく、ここで、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である)を含むが、これらに限定されない原子鎖を含む。ある実施態様において、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６または８～１６原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定であるが、標的細胞に侵入したら、リンカーが共に保持している２部分を放出するように切断するものである。好ましい実施態様において、切断可能連結基は、標的細胞でまたは第一引用条件下(これは、例えば、細胞内状態を模倣または代表するよう選択され得る)で、対象の血液または第二引用条件下(これは、例えば、血液または血清で見られる状態を模倣または代表するよう選択され得る)より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍またはそれ以上または少なくとも約１００倍速く切断される。
切断可能連結基は、切断因子、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解分子の存在に感受性である。一般に、切断因子は、血清または血液中より細胞内で優勢であるかまたは高いレベルまたは活性である。このような分解因子の例は、例えば、酸化的または還元的酵素または、細胞に存在する、酸化還元切断可能連結基を還元により分解できる、メルカプタンなどの還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を作り得る薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；酸一般、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)およびホスファターゼとして作用することにより、酸切断可能連結基を加水分解または分解できる酵素を含む、特定の基質に選択的なまたは基質選択性がない酸化還元剤を含む。
ジスルフィド結合などの切断可能結合基はｐＨに感受性であり得る。ヒト血清のｐＨは７.４であり、一方平均細胞内ｐＨは、約７.１～７.３とわずかに低い。エンドソームは、より酸性のｐＨであり、５.５～６.０範囲であり、リソソームは、約５.０のさらに酸性ｐＨを有する。あるリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによりカチオン性脂質をリガンドから細胞または細胞の所望の区画内に放出する。
リンカーは、特定の酵素により切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに取り込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞による。例えば、肝臓ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを経てカチオン性脂質に結合し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、それ故にリンカーは、エステラーゼリッチではない細胞型より肝細胞で効率的に切断される。エステラーゼに富む他の細胞型は、肺、腎臓皮質および精巣の細胞を含む。
ペプチド結合を含むリンカーを、ターゲティング細胞型が、肝細胞および滑膜細胞などペプチダーゼに富むとき、使用し得る。
一般に、候補切断可能連結基の適性は、分解剤(または条件)が候補連結基を切断する能力の試験により評価し得る。候補切断可能連結基を、血液中でまたは他の非標的組織と接触したとき、切断に抵抗する能力について試験するのも望ましいことがある。それ故に、第一条件と第二条件の間(ここで、第一は、標的細胞における切断を示すように選択され、第二は他の組織または生物学的液体、例えば、血液または血清における切断を示すように選択される)の切断の相対的感受性を決定し得る。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器または組織培養または動物全体で実施し得る。無細胞または培養条件下で初期評価を行い、さらに動物全体で評価して確認することが有用であり得る。好ましい実施態様において、有用な候補化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞(または細胞内条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)で少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く開裂される。
ａ. 酸化還元切断可能連結基
ある実施態様において、切断可能連結基は、酸化または還元により切断される、酸化還元切断可能連結基である。還元的に切断可能連結基の例は、ジスルフィド連結基(－Ｓ－Ｓ－)である。切断可能連結基の候補が適当な「還元的切断可能連結基」であるかまたは例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤での使用に適するかを決定するために、ここに記載する方法を実施し得る。例えば、候補を、細胞、例えば、標的細胞で観察される切断速度を模倣する、当分野で知られる反応材を使用して、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)または他の還元剤とインキュベーションして評価し得る。候補をまた、血液または血清条件を模倣するよう選択された条件でも評価し得る。一つの態様では、候補化合物は、血液で最大約１０％切断される。他の実施態様において、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞(または細胞内条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)で少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く切断される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するよう選択した条件下で、標準的酵素反応速度論アッセイを使用し、細胞外媒体を模倣するよう選択した条件と比較して決定し得る。
ｂ. ホスフェートベースの切断可能連結基
他の実施態様において、切断可能リンカーは、ホスフェートベースの切断可能連結基を含む。ホスフェートベースの切断可能連結基は、ホスフェート基を分解または加水分解する薬剤により切断される。細胞内のホスフェート基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェートベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＲｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｓ－である。好ましい実施態様は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＨ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｓ－である。好ましい実施態様は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－である。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。
ｃ. 酸切断可能連結基
他の実施態様において、切断可能リンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される、連結基である。好ましい実施態様において酸切断可能連結基は、約６.５以下(例えば、約６.０、５.７５、５.５、５.２５、５.０以下)のｐＨの酸性環境でまたは一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ小器官が、酸切断可能連結基のための切断環境を提供する。酸切断可能連結基の例は、アミノ酸のヒドラゾン、エステルおよびエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能群は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ(Ｏ)Ｏまたは－ＯＣ(Ｏ)を有し得る。好ましい実施態様は、エステル(アルコキシ基)の酸素に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基であるときである。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。
ｄ. エステルベースの連結基
他の実施態様において、切断可能リンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能連結基の例は、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ(Ｏ)Ｏ－または－ＯＣ(Ｏ)－を有する。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。
ｅ. ペプチドベースの切断基
さらに他の実施態様において、切断可能リンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを産生するように、アミノ酸間に形成されたペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能群は、アミド基(－Ｃ(Ｏ)ＮＨ－)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を産生するように、アミノ酸間で形成された特別なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にペプチドおよびタンパク質を産生するアミノ酸間で形成されたペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ(Ｏ)ＮＨＣＨＲＢＣ(Ｏ)－を有し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接アミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。
ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを経て炭水化物にコンジュゲートする。本発明の組成物および方法のリンカーとコンジュゲートしたｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例は、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであり、他方が水素であるときの、次のものを含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物および方法のある実施態様において、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して結合した１以上の「ＧａｌＮＡｃ」(Ｎ－アセチルガラクトサミン)誘導体を含む。
ある実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、式(XXXII)～(XXXV)のいずれかに示す構造の基から選択される二価または三価分岐リンカーにコンジュゲートする。
〔式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、各場合独立して、０～２０を表し、ここで、反復単位は同一でも異なってもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各場合独立して、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ(Ｏ)、ＮＨＣ(Ｏ)、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各場合独立して、非存在、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ２、Ｎ(ＲＮ)、Ｃ(Ｒ’)＝Ｃ(Ｒ’’)、Ｃ≡ＣまたはＣ(Ｏ)の１以上で中断または終了してよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各場合独立して、非存在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ(Ｏ)Ｏ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＮＨＣＨ(Ｒａ)Ｃ(Ｏ)、－Ｃ(Ｏ)－ＣＨ(Ｒａ)－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち、各場合、各々独立して、単糖(例えばＧａｌＮＡｃ)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり；そしてＲａはＨまたはアミノ酸側鎖である。〕
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現阻害のためのＲＮＡｉ剤で使用するのに特に有用であり、例えば、式(XXXV)
〔式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５ＣはＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。〕
である。
適当な二価および三価分岐リンカー群コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体の適当な例は、式II、VII、XI、ＸおよびXIIIとして上記の構造を含むが、これらに限定されない。
ＲＮＡコンジュゲートの製造を教示する代表的米国特許は、米国特許４,８２８,９７９；４,９４８,８８２；５,２１８,１０５；５,５２５,４６５；５,５４１,３１３；５,５４５,７３０；５,５５２,５３８；５,５７８,７１７、５,５８０,７３１；５,５９１,５８４；５,１０９,１２４；５,１１８,８０２；５,１３８,０４５；５,４１４,０７７；５,４８６,６０３；５,５１２,４３９；５,５７８,７１８；５,６０８,０４６；４,５８７,０４４；４,６０５,７３５；４,６６７,０２５；４,７６２,７７９；４,７８９,７３７；４,８２４,９４１；４,８３５,２６３；４,８７６,３３５；４,９０４,５８２；４,９５８,０１３；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,２４５,０２２；５,２５４,４６９；５,２５８,５０６；５,２６２,５３６；５,２７２,２５０；５,２９２,８７３；５,３１７,０９８；５,３７１,２４１、５,３９１,７２３；５,４１６,２０３、５,４５１,４６３；５,５１０,４７５；５,５１２,６６７；５,５１４,７８５；５,５６５,５５２；５,５６７,８１０；５,５７４,１４２；５,５８５,４８１；５,５８７,３７１；５,５９５,７２６；５,５９７,６９６；５,５９９,９２３；５,５９９,９２８および５,６８８,９４１；６,２９４,６６４；６,３２０,０１７；６,５７６,７５２；６,７８３,９３１；６,９００,２９７；７,０３７,６４６；８,１０６,０２２を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
ある化合物の全位置が均一に修飾される必要はなく、実際１を超える前記修飾を、ｉＲＮＡ内の単一化合物または単一ヌクレオシドに取り込み得る。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
本発明の状況における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、各々少なくとも一つの単量体単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからなる、２以上の化学的に異なる領域を含む、ｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、一般にｉＲＮＡにヌクレアーゼ分解に対する抵抗性増加、細胞取り込み増加または標的核酸に対する結合親和性増加を付与するように、ＲＮＡが修飾されている、少なくとも一つの領域を含む。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断ができる酵素の基質として役立ち得る。例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。それ故に、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果として、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡを使用したとき、短いｉＲＮＡで同等な結果がしばしば得られ得る。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動および、必要であれば、当分野で知られる関連核酸ハイブリダイゼーション技法により日常的に検出できる。
ある場合、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基で修飾され得る。多数の非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するためにｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施する方法は、科学文献から入手可能である。このような非リガンド部分は、脂質部分、例えばコレステロール(Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)を含む。このようなＲＮＡコンジュゲートを教示する代表的米国特許は、上に記載する。典型的コンジュゲーションプロトコールは、配列の一か所以上にアミノリンカーを担持するＲＮＡの合成を含む。次いで、アミノ基を、適切なカップリングまたは活性化剤を使用して、コンジュゲートする分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、固体支持体になお結合しているＲＮＡで、またはＲＮＡの切断後溶液相で実施し得る。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製は、一般に純粋コンジュゲートを提供する。
iii. 本発明のｉＲＮＡの送達
本発明のｉＲＮＡの細胞、例えば、ＨＢＶに感染したヒト対象などの対象内の細胞への送達は、多数の種々の方法により達成され得る。送達は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物の対象への投与により、直接的にも実施され得る。あるいは、インビボ送達を、ｉＲＮＡをコードし、発現を指示する１以上のベクターの投与により、間接的にも実施し得る。これらの選択肢を、さらに下に記載する。
一般に、核酸分子(インビトロまたはインビボ)を送達するあらゆる方法を、本発明のｉＲＮＡでの使用のために適応し得る(例えば、引用により全体として本明細書に包含させるAkhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144およびＷＯ９４０２５９５参照)。インビボ送達について、ｉＲＮＡ分子の送達のために考慮すべき因子は、例えば、送達分子の生物学的安定性、不特定の効果の予防および標的組織への送達分子の蓄積である。疾患処置のためのｉＲＮＡの全身投与するためには、ＲＮＡを修飾するか、または薬物送達系を使用して送達される；両方法は、インビボでのエンドおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの速やかな分解を阻止する。ＲＮＡの修飾または医薬担体の使用も、標的組織へのｉＲＮＡ組成物のターゲティングを可能とし、望ましくないオフターゲット効果を回避し得る。ｉＲＮＡ分子を、細胞取り込みを増強し、分解を阻止するために、コレステロールなどの親油性基への化学コンジュゲーションにより修飾し得る。別の実施態様において、ｉＲＮＡを、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性送達系などの薬物送達系を使用して送達し得る。正荷電カチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子(負荷電)の結合を促進し、負に荷電した細胞膜での相互作用を増強して、細胞によるｉＲＮＡの効率的取り込みを可能とする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーはｉＲＮＡに結合するかまたは小胞もしくはミセルの形成を誘発することができる(例えば、Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116参照)。小胞またはミセルの形成は、全身投与されたとき、ｉＲＮＡの分解をさらに阻止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体の製造および投与の方法は、十分に当業者の能力の範囲内である(例えば、引用により全体として本明細書に包含させる、Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205参照)。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達系のいくつかの非限定的例は、ＤＯＴＡＰ(Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra)、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子」(Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114)、カルジオリピン(Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091)、ポリエチレンイミン(Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659)、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ(ＲＧＤ)ペプチド(Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487)およびポリアミドアミン(Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)を含む。ある実施態様において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、引用により全体として本明細書に包含させる、米国特許７,４２７,６０５にみることができる。ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤を、ｐＨ依存性エンドソーム脱出を促進するために、両親媒性ペプチドと投与し得る(例えば、引用により本明細書に包含させる、Bartz et al., 2011. Biochem. J. 435:475-87参照)。
１. 本発明で使用するためのベクターコード化ｉＲＮＡ
ＨＢＶ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入した転写単位から発現させ得る(例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al.、ＷＯ００／２２１１３、ＷＯ００／２２１１４および米国特許６,０５４,２９９参照)。ＨＢＶを標的とするｓｈＲＮＡの発現のための例示的発現ベクターはMichler et al., 2016に提供され、これは、(ｉ)肝臓特異的プロモーター下に人工マイ(クロ)ＲＮＡ内に包埋されたｓｈＲＮＡ；(ii)過剰ＲＮＡｉトリガーでの飽和が毒性となり得る律速細胞因子である共発現アルゴノート－２；または(iii)オフターゲット遺伝子制御を抑えるためのｓｈＲＮセンス鎖に対する共送達デコイ(「ＴｕＤ」)を含む、送達のためのアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)８ベクターを開示する。細胞培養試験で使用されたｓｈＲＮＡ ｓｈＨＢＶ４～７を発現するプラスミドは、Grimm et al, 2006(Nature 441: 537 - 541)により先に報告された、Ｈ１プロモーター、続くオリゴヌクレオチド挿入のための２つのＢｂｓＩ部位およびＲＳＶプロモーターを含む、自己相補性ＡＡＶベクタープラスミドへの各ｓｈＲＮＡコード化オリゴヌクレオチドの直接挿入によりクローン化された。このような構築物も、発現ベクターのために適切にサイズ調製されるならば、ワクチン抗原の発現にも使用し得る。
発現は、使用する特定の構築物および標的組織または細胞型により、一過性(数日～数週間)または持続性(数週間から数か月またはそれ以上)であり得る。これらの導入遺伝子は、直線状構築物、環状プラスミドまたは、統合もしくは非統合ベクターであり得るウイルスベクターとして導入できる。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミドとして遺伝性であることを可能にするようにも、構築され得る(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292)。
ｉＲＮＡの個々の鎖または複数の鎖は、発現ベクターでプロモーターから転写される。２つの別々の鎖が、例えば、ｄｓＲＮＡの産生のために、発現されるとき、２つの別々の発現ベクターは、標的細胞に共導入され得る(例えば、トランスフェクションまたは感染による)。あるいは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖を、両者が同じ発現プラスミドに位置する、プロモーターにより転写させ得る。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが幹およびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列により連結された、逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現させ得る。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞と、好ましくは脊椎動物細胞と適合性の発現ベクターを使用して、ここに記載するｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生できる。真核生物細胞発現ベクターは、当分野で周知であり、多数の商業的供給源から入手可能である。一般に、このようなベクターは、所望の核酸セグメントの挿入のための簡便な制限部位を含んで提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、皮下、静脈内または筋肉内投与によるなど全身性であり得る。このようなベクターはまた、核酸ベースのワクチンからのウイルス抗原発現にも使用し得る。
ここに開示する方法および組成物で利用され得るウイルスベクター系は、(ａ)アデノウイルスベクター；(ｂ)レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれに限定されないレトロウイルスベクター；(ｃ)アデノ随伴ウイルスベクター；(ｄ)単純ヘルペスウイルスベクター；(ｅ)ＳＶ ４０ベクター；(ｆ)ポリオーマウイルスベクター；(ｇ)乳頭腫ウイルスベクター；(ｈ)ピコルナウイルスベクター；(ｉ)オルソポックス、例えば、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａベクターを含むワクシニアウイルスベクターまたはトリポックス、例えばカナリアポックスまたは鶏痘などのポックスウイルスベクター；および(ｊ)ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスを含むが、これらに限定されない。複製欠損ウイルスもまた有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに取り込まれるようになるか、または取り込まれない。構築物は、所望により、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物を、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターに取り込み得る。ｉＲＮＡまたはＨＢＶ抗原の組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクターおよび構築物について考慮される他の態様を、さらに下に記載する。
このような構築物およびベクターは、発現ベクターのために適切にサイズ調製されるならば、ワクチン抗原の発現にも使用し得る。このような制限は、当業者には十分理解される。
Ｂ. 本発明の方法で使用するための治療ＨＢＶワクチン
本発明のレジメンおよび方法で使用する治療ＨＢＶワクチンは、１以上のＨＢＶタンパク質に対して、免疫応答、好ましくはエフェクターＴ細胞誘発応答を誘発する、ペプチドワクチン、ベクターベースのワクチンを含むＤＮＡワクチンまたは細胞ベースのワクチンである。好ましくは、ワクチンは、複数のＨＢＶ血清型、好ましくは全ＨＢＶ血清型と交差反応する多エピトープワクチンである。
治療ワクチンは、既に確立された病原体感染を認識し、制御または排除するように患者の免疫系を活性化するために設計される。これは、侵入病原体の迅速な抗体介在中和を促進するように設計される、予防ワクチン接種と異なる。肝炎、ヘルペスまたは乳頭腫ウイルスなどの持続性ウイルスの制御および排除は、多特異的および多機能的エフェクターＴ細胞応答を必要とする。これらのＴ細胞応答は、理想的には連続して発現されるウイルス抗原に指向し、病原体を抑制し続ける。治療ワクチンは、多数の慢性感染について開発中である。Ｂ型肝炎ウイルス感染は、慢性Ｂ型肝炎の自然免疫介在回復およびウイルスの排除が、ごく稀に観察されているため、治療ワクチン接種による処置の候補である。
強固なＴ細胞応答が、ＨＢＶ治癒の達成に必要であると考えられる。ＨＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＨＢＶ感染が回復した患者で容易に検出可能であるが、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞は稀であり、慢性Ｂ型肝炎ではおそらく大量の循環ウイルスＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇにより、機能的に損傷されている。Ｔ細胞は、細胞毒性活性によりＨＢＶ感染細胞を排除するが、非細胞溶解性様式でＨＢＶ遺伝子の発現および複製も制御する。
慢性Ｂ型肝炎の免疫寛容を克服する目的で、エフェクターＴ細胞応答を誘発するためのＤＮＡもしくはペプチドワクチンまたはベクターもしくは細胞ベースのワクチンを使用する、前臨床モデルで、種々のアプローチが試験されている。十分に異なるＨＢＶ遺伝子型および最も頻繁なＨＬＡ型をカバーする多エピトープ治療ワクチン候補が開発されている。適切なペプチド提示は示されているが、免疫原性は限定的であり、この経過は臨床では反映されなかった。非包括的一覧を下の表に示す。
既存の予防ワクチンは、慢性感染患者のＨＢＶ特異的免疫を回復するために提供されているが、機能的治癒の提供には失敗している。これらのウイルス成分粒子ベースのワクチンは、慢性ヘパドナウイルス感染の動物モデルでＨＢＶ複製を減少できたが、慢性Ｂ型肝炎の患者では成功していない。ミョウバンをアジュバントとする、抗原－抗体(ＨＢｓＡｇ－ＨＢＩＧ)免疫原性複合体治療ワクチン候補は、最初は、二重盲験式、ブラセボ対照、フェーズIIｂ臨床試験で有望な結果を示したが、４５０名の患者を含むフェーズIII臨床試験は期待外れであった。これは、ミョウバンベースのアジュバントを用いるウイルス成分粒子ワクチンが予防ワクチンとして設計され、優先的に抗体を誘発するが、治療有効性に必要である細胞毒性Ｔ細胞応答は誘発しないとの事実による可能性が高い。
あるいは、ＨＢＶエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞を誘発するよう設計されたが、成功は限定的であった。ＤＮＡベースのワクチンが抗体応答をほとんど誘発しないため、ＨＢｅＡｇまたはＨＢｓＡｇセロコンバージョンの達成に失敗する。ＨＢＶエンベロープタンパク質をコードするＨＢＶｐｒｅＳ／Ｓ領域を包含する、別のＤＮＡプライム、ポックスウイルス－ブーストワクチンはチンパンジーで有望な結果を示したが、また臨床フェーズIIａ治験で失敗し、慢性ＨＢＶ保菌者で持続性Ｔ細胞応答もウイルス血症減少も誘発しなかった。Ｔ細胞補助または十分広い、多特異的免疫応答の誘発に失敗している可能性がある。
当分野で知られるあらゆるワクチンが、ここに提供する方法およびレジメンに使用され得る。好ましい実施態様は、実施例に提供され、かつＰＣＴ公開ＷＯ２０１７／１２１７９１(その内容を全体として引用により本明細書に包含させる)に提供される、２回投与するタンパク質抗原および１回投与する核酸ワクチンのプライム－ブーストワクチン接種スキームを含む。上記のとおり、ワクチンにおけるタンパク質抗原の配列および核酸ベースのワクチンによりコード化されるアミノ酸配列は必ずしも同一ではない。それらは、これらワクチンの連続的投与が所望のプライム－ブースト効果を有するように、単に少なくとも一つのエピトープ、好ましくは複数エピトープを共有しなければならない。さらに、ここに記載するとおり、好ましい実施態様において、ここに提供する処置レジメンは、複数の、全てではないにしても、ＨＢＶ血清型にわたり効果的な処置レジメンを提供する。それ故に、対象に送達される抗原は、対象に感染しているＨＢＶウイルスにより発現される抗原と同一の抗原配列を有さなくてよい。
決定基として知られる、ＨＢＶ抗原のある部分が、ＨＢＶへの感染の最初の免疫応答の間に産生される抗体の主標的であることは知られる。例えば、ＨＢｓＡｇは、２２６アミノ酸遺伝子(配列番号８または２２)の主要親水性領域(ＭＨＲ、アミノ酸１００～１６９)内のアミノ酸１２４～１４７に位置する「1個の」決定基エピトープを有する。この「１個の」決定基は、急性Ｂ型肝炎の最初の免疫応答の間の抗ＨＢｓ抗体の主標的の一つである。ある実施態様において、ＨＢｓＡｇの免疫原性フラグメントは、完全長タンパク質と比較して小さなエンベロープタンパク質(配列番号２３)のアミノ酸位置に対応する、少なくともアミノ酸９９～１６８を含む(例えば、Lada et al., J. Virol.(2006) 80:2968-2975参照；この内容を全体として引用により本明細書に包含させる)。
同様に、決定基は、ＨＢｃＡｇで同定されている(例えば、Salfeld et al., J. Virol. (1989) 63:798-808参照; この内容を全体として引用により本明細書に包含させる)。完全長コアタンパク質は、１８３アミノ酸長であり、集合ドメイン(アミノ酸１～１４９)および核酸結合ドメイン(アミノ酸１５０～１８３)からなる。３つの異なる主要決定基が特徴づけられている。集合コア(ＨＢｃ)および直線状ＨＢｅ関連決定基(ＨＢｅｌ)のＨＢｃ抗原性を担う単一立体構造決定基は、いずれもアミノ酸８０付近の重複親水性配列にマッピングされた；第二ＨＢｅ決定基(ＨＢｅ２)は、アミノ酸１３８の近傍の位置に割り当てられたが、その抗原性のために、アミノ酸１０～１４０の伸張配列の分子内関与が必要であることが判明した。一般に、このような免疫原性フラグメントは、完全長コアタンパク質と比較して、配列番号２４に示す配列位置に対応して、少なくともアミノ酸１８～１４３を含む。類似配列が配列番号１０で同定され得る。
好ましい実施態様において、ワクチンは、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇの少なくとも一つの決定基を含むアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列をコードする。特に、ある実施態様において、ＨＢｓＡｇを標的とするワクチンは、少なくともＨＢｓＡｇのアミノ酸１２７～１４７のアミノ酸配列を含み、例えば、小エンベロープタンパク質(配列番号２３)のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸９９～１６８を含む。ある実施態様において、親水性配列を標的とするワクチンは、少なくともＨＢｃＡｇのアミノ酸８０付近またはアミノ酸８０またはアミノ酸１３８を含む配列番号４３の少なくともアミノ酸１３８付近のアミノ酸配列、例えば、少なくとも４０アミノ酸部分、少なくとも５０アミノ酸部分、少なくとも６０アミノ酸部分、少なくとも７０アミノ酸部分、少なくとも８０アミノ酸部分、少なくとも９０アミノ酸部分または少なくとも１００アミノ酸部分またはそのコード配列を含む。好ましい実施態様において、ＨＢｃＡｇを標的とする抗原の抗原アミノ配列は、配列番号２４のアミノ酸８０または１３８に対して少なくとも２０アミノ酸Ｎ末端およびＣ末端を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇを標的とするワクチンは、少なくともＨＢｓＡｇのアミノ酸１０～１４０または１８～１４３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチンは、配列番号２２、２３または２４の何れか１以上のアミノ酸配列全体を含むかまたはアミノ酸配列全体をコードする。
異なるアミノ酸配列をコードする、異なる核酸配列を有するＨＢＶの複数血清型があることは理解される。それ故に、タンパク質ベースのワクチンのアミノ酸配列または核酸ベースのワクチンによりコード化されるアミノ酸配列は、配列番号で提供される配列と１００％同一ではないかもしれない。本発明のある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンのアミノ酸配列または核酸ベースのワクチンによりコード化されるアミノ酸配列は、配列番号２２、２３または２４の一部と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一または少なくとも９８％同一である。さらなる例示的ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇアミノ酸配列は、配列表に提供される。上記配列におけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇ決定基に対応する適切な配列を同定するためのアラインメント方法は当分野で知られる。
ワクチンは、好ましくはＭＶＡウイルスを、１０４～１０９組織培養感染量(ＴＣＩＤ)５０／mlの濃度範囲、好ましくは１０５～５×１０８ ＴＣＩＤ５０／mlの濃度範囲、より好ましくは１０６～１０８ ＴＣＩＤ５０／mlの濃度範囲、最も好ましくは１０７～１０８ ＴＣＩＤ５０／mlの濃度範囲で含む。
ヒトのための好ましいワクチン接種用量は１０６～１０９ ＴＣＩＤ５０を含み、最も好ましくは１０６ ＴＣＩＤ５０または１０７ ＴＣＩＤ５０または１０８ ＴＣＩＤ５０の用量である。
本発明の好ましい方法は、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチン両者の投与を含む。しかしながら、他の方法は、タンパク質抗原のみの投与を含む。あまり好ましくない実施態様は、抗原コード化核酸のみの投与を含む。
ｉ. アジュバント
ここで使用する「アジュバント」は、は、長期保護免疫を誘発するために共に投与される、抗原に対する免疫応答を促進(例えば、増強、加速または延長)する薬剤と理解される。実質的な免疫応答は、アジュバント自体には指向されない。アジュバントは、病原体成分、粒子アジュバントおよび組み合わせアジュバント(www.niaid.nih.gov/research/vaccine-adjuvants-types参照)を含むが、これらに限定されない。病原体成分(例えば、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ＣｐＧ ＤＮＡ、エマルジョン、例えばポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))は、自然免疫細胞内または表面上の種々の受容体を標的とすることにより、ワクチンに対する早期非特異的または自然免疫応答の誘発を助け得る。自然免疫系は、適応免疫応答に影響し、これはワクチンが標的とする病原体に対する長期持続性保護を提供する。粒子アジュバント(例えば、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２)は、免疫系を刺激でき、また免疫細胞への抗原送達を増強し得る、極めて小さな粒子を形成する。組み合わせアジュバント(例えば、ＡＳ０２、ＡＳ０３およびＡＳ０４(ＧＳＫ)；ＭＦ５９(Novartis)；およびＩＣ３１(登録商標)(Altimmune)は、複数の保護的免疫応答を誘発する。単独で使用したとき中程度の効果を有するアジュバントは、に使用したとき、より強力な免疫応答を誘発し得る。ある実施態様において、好ましいアジュバントは、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ、ポリＩＣＬＣ、ＣｐＧ、ISCOMATRIX(登録商標)、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４またはＲＩＧ－Ｉリガンド、例えば、５’ ３Ｐ－ＲＮＡを含む。ある実施態様において、ＨＢＶ抗原を発現する核酸を伴うまたは伴わないウイルスカプシドをアジュバントとして使用し得る。例えば、ＭＶＡ－のみまたはＤＮＡプライム、ＭＶＡブーストまたはアデノウイルスベクタープライム－ＭＶＡブーストなどのＴ細胞を優先的に刺激するワクチンを、本発明の方法で使用し得る。
本発明の好ましい実施態様において、本発明で使用するアジュバントは、上記のとおり液性および細胞免疫応答を促進する。ある実施態様において、アジュバントは、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を提供する。
ii. 非アジュバント免疫刺激剤および付加的薬剤
本発明の方法は、さらにＨＢＶ処置または免疫応答刺激に使用される付加的薬剤の投与を含む。このような薬剤は、免疫刺激剤(例えば、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－α２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９)アゴニスト)、ウイルス侵入阻害剤(例えば、Myrcludex)、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド(例えば、ＲＥＰ ９ＡＣ)、カプシド阻害剤(例えば、Ｂａｙ４１－４１０９およびＮＶＲ－１２２１)、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤(例えば、ＩＨＶＲ－２５)、Ｒｉｇ－Ｉ－リガンド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＨＢＶに対する抗体ベースの免疫療法(ＨＢＶに対する単、二または三特異的抗体)または免疫チェックポイント制御因子を含み得る。このような薬剤は当分野で知られる。
Ｃ. 本発明の方法で使用するためのヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログ
ヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログは、一般に安全かつ安価と考えられるため、ＨＢＶ感染の標準治療として考えられる。しかしながら、ヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログはＨＢＶ感染を治癒できず、耐性の発生を引き起こし得て、無期限に服用する必要がある。ヌクレオチドアナログおよびヌクレオシドアナログは、テノホビル ジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファ、ガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)およびテノホビル－Exalidex(ＴＸＬ／ＣＭＸ１５７)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログは、エンテカビル(ＥＴＶ)またはテノフォビルまたはその誘導体である。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログはラミブジンではない。ヌクレオチ(シ)ドアナログは、多数の供給源から商業的に入手可能であり、ラベルの指示(例えば、一般に特定用量で経口投与)に従いまたはＨＢＶ処置において技術を有する実施者により決定されたとおりここに提供する方法で使用される。
III. ＨＢＶを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、少なくとも一つのＨＢＶ転写物および好ましくは３または４ＨＢＶ転写物の切断を促進する、ｉＲＮＡの使用を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ここに提供する本発明の方法で、少なくとも一つのＨＢＶ転写物、好ましくは３または４ＨＢＶ転写物の切断を促進するように、同様に使用され得る。ＨＢＶを標的とする例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許公開２０１３／００３５３６６、２０１２／０２０７７０９および２００４／０１２７４４６に提供され、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
上に提供するｓｉＲＮＡの送達のためのコンジュゲート、リンカーおよび製剤を、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療剤の製剤および対象への送達に使用し得ることは、当業者に理解される。
IV. 本発明の医薬組成物
本発明はまた本発明で使用するための、ｉＲＮＡまたはワクチンを含む医薬組成物および製剤も含む。承認された治療剤は、製剤され、その添付文書に示される経路により投与されることは理解される。
ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するｉＲＮＡまたはワクチンおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。ｉＲＮＡまたはワクチンを含む医薬組成物は、ＨＢＶ感染を有する対象の処置に有用である。このような医薬組成物は、例えば、皮下(ＳＣ)、筋肉内(ＩＭ)または静脈内(ＩＶ)送達による、非経腸送達による、例えば、全身投与のための、送達方式に基づき、製剤される。
本発明で使用する医薬ＲＮＡｉ組成物を、少なくとも一つのＨＢＶ転写物のレベルを顕著に減少させるのに十分な投与量で投与する。一般に、本発明のｉＲＮＡの適当な用量は、１日あたり約０.００１～約２００.０ミリグラム／レシピエントのキログラム体重の範囲、一般に約１～５０mg／キログラム体重／日の範囲である。一般に、本発明のｉＲＮＡの適当な用量は、約０.１mg／kg～約５.０mg／kg、好ましくは約０.３mg／kgおよび約３.０mg／kgの範囲である。反復投与レジメンは、定期的な、例えば、隔週または年１回の治療量のｉＲＮＡの投与を含む。ある実施態様において、ｉＲＮＡを、約月１回から約四半期に１回(すなわち、約３か月に１回)投与する。好ましい実施態様において、ＲＮＡｉ剤は皮下投与される。
ワクチンの製剤および投与は、投与するワクチンの性質による。タンパク質プライム－発現ベクターブーストワクチン接種戦略で、タンパク質ベースのプライミングワクチンを約２週間、３週間または４週間離れて投与し、第二のタンパク質ベースのワクチン用量を投与後、約２週間、３週間または４週間後発現ベクターワクチンブーストを投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンの第一および第二用量の間に、約２週間ある。ある実施態様において、第二用量のタンパク質ベースのワクチンとＤＮＡ発現ベクターワクチンブーストの間に約２週間ある。ある実施態様において、プライムおよびブーストワクチン接種は、筋肉内、皮内または皮下から独立して選択される経路により投与される。
本発明で使用する医薬核酸ベースのワクチンを、プライム剤またはブースト剤として、免疫応答の促進に十分な用量で投与し得る。投与する核酸ベースのワクチンの量は、例えば、ワクチンのデザインによる。ここに提供するレジメンが既存の核酸ベースのワクチンの使用を含み得るため、治療有効性および安全性に基づく適切な投与量は、使用する特定の薬剤に基づかなければならない。
本発明で使用するための医薬タンパク質ベースのワクチンは、プライム剤またはブースト剤として、免疫応答の促進に十分な投与量で投与し得る。投与するタンパク質ベースのワクチンの量は、例えば、使用するアジュバントによる。タンパク質ベースのワクチンは、例えば、約５～１００mg／kg／用量、約１０～５０mg／kg／用量または約２０～４０mg／kg／用量で投与し得る。ここに提供するレジメンが既存のタンパク質ベースのワクチンの使用を含み得るため、治療有効性および安全性に基づく適切な投与量に関する知識は、使用する特定の薬剤に基づくべきである。
初期処置レジメン後、処置剤を、低頻度ベースで投与し得る。好ましい実施態様において、ここに提供する処置レジメンおよび方法は、レジメン完了後または診断基準が機能的治癒、例えば、好ましくは、ここに提供する方法での検出レベル未満までのＨＢｓＡｇレベル減少およびＨＢｓＡｇに対する検出可能な免疫応答を示した後、処置中止を可能とする、機能的治癒をもたらす。
当業者は、ある因子が、疾患または障害の重症度、先の処置、対象の一般的健康状態または年齢および存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない、対象の効果的処置に必要な投与量およびタイミングに影響し得ることを認識する。さらに、治療有効量の組成物での対象の処置は、単一処置または一連の処置を含み得る。本発明方法およびレジメンで使用する個々の治療剤の効果的投与量およびインビボ半減期の推定は、本明細書の他の箇所に記載され、当分野で知られる、慣用法を使用してまたは適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づき、行い得る。
Ａ. 膜性分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用するためのｉＲＮＡは、膜性分子集合体、例えば、リポソームまたはミセルでの送達のために製剤し得る。ここで使用する用語「リポソーム」は、少なくとも一つの二重層、例えば、１個の二重層または複数の二重層に配置された両親媒性脂質からなる小胞をいう。リポソームは、親油性物質および水性内部から形成された膜を有する、単層および多層小胞を含む。水性部分はｉＲＮＡ組成物を含む。親油性物質は、水性内部を、一般にｉＲＮＡ組成物を含まないが、いくつかの例では含んでもよい水性外面から分離する。リポソームは、活性成分の作用部位への移送および送達に有用である。リポソーム膜が生物学的膜と構造的に類似しているため、リポソームを組織に適用したとき、リポソーム二重層は、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の混合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む、内部水性内容物は、細胞に送達され、そこで、ｉＲＮＡは標的ＲＮＡと特異的に結合でき、ｉＲＮＡに介在できる。ある場合、リポソームはまた例えば、特定の細胞型にｉＲＮＡを指向させるようにも特に標的化される。
ｉＲＮＡ剤を含むリポソームは、多様な方法で製造し得る。一例において、リポソームの脂質成分を、脂質成分とミセルが形成されるように、界面活性剤に溶解する。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的界面活性剤は、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸およびラウロイルザルコシンを含む。次いで、ｉＲＮＡ剤製剤を、脂質成分を含むミセルに加える。脂質のカチオン性基がｉＲＮＡ剤と相互作用し、ｉＲＮＡ剤周囲に凝縮して、リポソームを形成する。凝集後、界面活性剤を、例えば、透析により除去して、ｉＲＮＡ剤のリポソーム製剤を得る。
必要であれば、凝集を助ける担体化合物を凝集反応中に、例えば、制御された添加により、加え得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー(例えば、スペルミンまたはスペルミジン)。ｐＨも凝集を支持するよう調節できる。
送達媒体の構造的成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を取り込む安定なポリヌクレオチド送達媒体を製造する方法は、例えば、ＷＯ９６３７１９４にさらに記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。リポソーム形成はまた、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987；米国特許４,８９７,３５５；米国特許５,１７１,６７８; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983;およびFukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984に記載の例示的方法の１以上の態様も含み得る。送達媒体としての使用に適するサイズの脂質凝集体を製造する一般に使用される技法は、超音波処理および凍結融解＋押し出しを含む(例えば、Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986参照)。一貫して小さく(５０～２００nm)、比較的均一な凝集体が望まれるとき、微小流動化が使用され得る(Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984)。これらの方法は、ｉＲＮＡ剤製剤のリポソームへの充填に容易に適合される。
リポソームは、二つの広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、正荷電リポソームであり、負荷電核酸分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正荷電核酸／リポソーム複合体は負荷電細胞表面と結合し、エンドソームに内在化する。エンドソーム内の酸性ｐＨのために、リポソームは破裂し、内容物を細胞質に放出する(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985)。
ｐＨ感受性または負荷電したリポソームは、その複合体ではなく、核酸を捕捉する。核酸および脂質両者の電荷が類似するため、複合体形成ではなく、反発が起こる。それにもかかわらず、一部核酸は、これらリポソームの水性内部の中に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする遺伝子の、培養細胞単層への送達に使用されている。外来遺伝子の発現は、標的細胞で検出されている(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)。
リポソーム組成物の一つの主要なタイプは、天然由来ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合型リポソームは、主にジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン(ＰＣ)、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣから形成される。他のタイプは、リン脂質またはホスファチジルコリンまたはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロおよびインビボでリポソームを細胞に導入する他の方法の例は、米国特許５,２８３,１８５および５,１７１,６７８；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993;およびStrauss EMBO J. 11:417, 1992を含む。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系も、皮膚への薬物送達への有用性について試験されている。NovasomeTM Ｉ(ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)およびNovasomeTM II(ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤は、マウス皮膚の真皮へのシクロスポリンＡの送達に使用された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、シクロスポリンＡの皮膚の種々の層への沈着の促進に効果的であったことを示した(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466)。
リポソームはまた「立体的に安定化された」リポソームも含み、この用語は、ここで使用する限り、リポソームに取り込まれたとき、特殊化脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命を延長させる、１以上の特殊化脂質を含むリポソームをいう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が(Ａ)モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１以上の糖脂質を含むまたは(Ｂ)ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分などの１以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、当分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの延長された循環半減期は、網内系(ＲＥＳ)の細胞への取り込み減少に由来すると考えられる(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。
１以上の糖脂質を含む種々のリポソームは当分野で知られる。Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告している。これらの発見は、Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 6949)により拡大された。米国特許４,８３７,０２８およびＷＯ８８／０４９２４(両方ともAllen et al.)は、(１)スフィンゴミエリンおよび(２)ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示する。米国特許５,５４３,１５２は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１,２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７１３４９９(Lim et al.)に開示される。
カチオン性リポソームは、細胞膜に融合されることができるとの利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜に効率的には融合され得ないが、インビボでマクロファージにより取り込まれ、ｉＲＮＡ剤のマクロファージへの送達に使用され得る。
リポソームのさらなる利点は、天然リン脂質から得たリポソームは生体適合性および生分解性であり；リポソームは広範囲の水および脂質可溶性薬物を取り込むことができ；リポソームは内部区画に封入されたｉＲＮＡ剤を代謝および分解から保護できることである(Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245)。リポソーム製剤製造における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズおよび水性体積である。
正荷電合成カチオン性脂質、Ｎ－[１－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル]－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＴＭＡ)を、組織培養細胞の細胞膜の負荷電脂質と融合し、ｉＲＮＡ剤の送達をもたらし得る脂質－核酸複合体を形成するように、核酸と自然に相互作用する、小リポソームの形成のために使用できる(ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用についての記載に関して、例えば、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987および米国特許４,８９７,３５５参照)。
ＤＯＴＭＡアナログ、１,２－ビス(オレオイルオキシ)－３－(トリメチルアンモニア)プロパン(ＤＯＴＡＰ)を、リン脂質と組み合わせで使用して、ＤＮＡ複合小胞を形成し得る。リポフェクチンTM(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)は、自然に負荷電ポリヌクレオチドと相互作用して、複合体を形成する正荷電ＤＯＴＭＡリポソームを含む生存組織培養細胞への高度にアニオン性の核酸の送達に有効な薬剤である。十分な正荷電リポソームが使用されたとき、得られた複合体の正味電荷も正である。この方法で調製された正荷電複合体は、自然に負荷電細胞表面と結合し、原形質膜と融合し、機能的核酸を、例えば、組織培養細胞に、効率的に送達する。他の商業的に入手可能なカチオン性脂質、１,２－ビス(オレオイルオキシ)－３,３－(トリメチルアンモニア)プロパン(「ＤＯＴＡＰ」)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)は、オレオイル部分がエーテル結合ではなく、エステルで連結されている点で、ＤＯＴＭＡと異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物は、例えば、２タイプの脂質の一つにコンジュゲートしているカルボキシスペルミンを含む、多様な部分にコンジュゲートしているものおよび５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド(「ＤＯＧＳ」)(TransfectamTM、Promega, Madison, Wisconsin)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド(「ＤＰＰＥＳ」)(例えば、米国特許５,１７１,６７８参照)などの化合物を含む。
他のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤されている、脂質のコレステロールでの誘導体化(「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」)を含む(Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991)。ポリリシンのＤＯＰＥへのコンジュゲーションにより製造されるリポポリリシンは、血清存在下でのトランスフェクションに効果的であることが報告されている(Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991)。ある細胞株について、コンジュゲートカチオン性脂質を含むこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の商業的に入手可能なカチオン性脂質製品は、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ(Vical, La Jolla, California)およびリポフェクタミン(ＤＯＳＰＡ)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)を含む。オリゴヌクレオチド送達に適する他のカチオン性脂質は、ＷＯ９８／３９３５９およびＷＯ９６／３７１９４に記載される。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適する。リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を提供する。このような利点は、薬物の高全身吸収と関連する副作用の減少、所望の標的への投与薬物の蓄積増加および皮膚にｉＲＮＡ剤を投与する能力である。いくつかの実践では、リポソームはｉＲＮＡ剤の上皮細胞への送達およびまた皮膚組織、例えば、皮膚へのｉＲＮＡ剤の浸透増強のために使用される。例えば、リポソームは局所的に適用できる。リポソームとして製剤された薬物の皮膚への局所送達は、実証されている(例えば、Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987参照)。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に製造できる。このような変形能は、リポソームが、該リポソームの平均半径より小さい細孔を通って浸透することを可能とし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能リポソームの１種である。トランスファーソームは、標準的リポソーム組成への端面アクティベーター、通常界面活性剤の添加により製造され得る。ｉＲＮＡ剤を含むトランスファーソームは、皮膚のケラチン生成細胞にｉＲＮＡ剤を送達するために、感染により、例えば、皮下に送達され得る。無傷の哺乳動物皮膚を通過するためには、脂質小胞は、各々が直径５０nm未満である一連の微細孔を、適当な経皮勾配の影響下に、通過しなければならない。さらに、脂質性質のため、これらのトランスファーソームは、自己最適化(例えば、皮膚の細孔の形に適応)、かつ自己修復可能であり、しばしばその標的に断片化せずに到達でき、しばしば自己負荷可能であり得る。
本発明に受け入れられる他の製剤は、ＷＯ２００８０４２９７３に記載される。
界面活性剤は、エマルジョン(マイクロエマルジョンを含む)およびリポソームなどの製剤に広く適用される。天然および合成起源の多くのタイプの界面活性剤の性質を分類および順位付けする最も一般的方法は、親水性／親油性バランス(ＨＬＢ)である。親水性基(「頭部」としても知られる)の性質は、製剤で使用される種々の界面活性剤の分類のための最も有用な手段を提供する(Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。
界面活性剤分子がイオン化されていないならば、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に広く適用され、広範囲のｐＨ値にわたり使用可能である。一般にそのＨＬＢ値範囲は、構造によって２～約１８である。非イオン性界面活性剤は、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルを含む。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこの群に入る。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤群で最もポピュラーな一群である。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散したとき負電荷を有するならば、界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、カルボキシレート、例えば石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸エステル、例えば、アルキル硫酸エステルおよびエトキシル化アルキル硫酸エステル、スルホネート、例えば、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネートおよびホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキル硫酸エステルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散したとき正電荷を有するならば、界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンを含む。４級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が正または負電荷を有する能力を有するならば、界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびフォスファチドを含む。
医薬品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、レビューされている(Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。
本発明の方法で使用するｉＲＮＡは、ミセル製剤としても提供され得る。「ミセル」は、ここでは、両親媒性分子が、分子の疎水性部分全部が内向きであり、親水性部分を周囲の水相と接触させるように球状構造に配置された、特定のタイプの分子集合体をいう。環境が疎水性であるならば、逆配置が存在する。
Ｂ. 脂質粒子
本発明のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えば、ＬＮＰまたは他の核酸－脂質粒子に完全に封入され得る。適切なプロモーター制御下に、ウイルス抗原に関するコード配列を含む発現ベクターまたはＲＮＡを送達のための脂質粒子に製剤できる。
ここで使用する用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸－脂質粒子をいう。ＬＮＰは、一般にカチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子凝集を阻止する脂質(例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート)を含む。ＬＮＰは、静脈内(ｉ.ｖ.)注射後に長い循環寿命を示し、遠位部位(例えば、投与部位と物理的に離れた部位)に蓄積されるため、全身適用に、高度に有用なである。ＬＮＰは、ＷＯ０００３６８３に示す封入された縮合剤－核酸複合体を含む、「ｐＳＰＬＰ」を含む。本発明の粒子は、一般に平均直径約５０nm～約１５０nm、より一般に約６０nm～約１３０nm、より一般に約７０nm～約１１０nm、最も一般に約７０nm～約９０nmを有し、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子に存在するとき、水溶液でヌクレアーゼでの分解に抵抗性である。核酸－脂質粒子およびその製造方法は、例えば、米国特許５,９７６,５６７；５,９８１,５０１；６,５３４,４８４；６,５８６,４１０；および６,８１５,４３２；ＵＳ２０１００３２４１２０およびＷＯ９６４０９６４に開示される。
ある実施態様において、脂質対薬物比(質量／質量比)(例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比)は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１または約６：１～約９：１の範囲である。上記範囲の中間も、本発明の一部であると考えられる。
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ,Ｎ－ジオレイル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＤＡＣ)、Ｎ,Ｎ－ジステアリル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムブロマイド(ＤＤＡＢ)、Ｎ－(Ｉ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＴＡＰ)、Ｎ－(Ｉ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＴＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシ)プロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｅｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(Ｄｌｉｎ－ＤＡＣ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン(ＤＬｉｎ－ＭＡ)、１,２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤａＰ)、１,２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ)、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩(ＤＬｉｎ－ＴＭＡ.Ｃｌ)、１,２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩(ＤＬｉｎ－ＴＡＰ.Ｃｌ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－(Ｎ－メチルピペラジノ)プロパン(ＤＬｉｎ－ＭＰｚ)または３－(Ｎ,Ｎ－ジリノレイルアミノ)－１,２－プロパンジオール(ＤＬｉｎＡＰ)、３－(Ｎ,Ｎ－ジオレイルアミノ)－１,２－プロパンジオール(ＤＯＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキソ－３－(２－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ)エトキシプロパン(ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)またはそのアナログ、(３ａＲ,５ｓ,６ａＳ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,２－ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエニル)テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ[ｄ][１,３]ジオキソール－５－アミン(ＡＬＮ１００)、(６Ｚ,９Ｚ,２８Ｚ,３１Ｚ)－ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル４－(ジメチルアミノ)ブタノエート(ＭＣ３)、１,１’－(２－(４－(２－((２－(ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン－１－イル)エチルアザンジイル)ジドデカン－２－オール(Ｔｅｃｈ Ｇ１)またはこれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子に存在する全脂質の約２０mol％～約５０mol％または約４０mol％を構成し得る。他の実施態様において、化合物２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソランを、脂質－ｓｉＲＮナノ粒子の製造に使用し得る。
ある実施態様において、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、６３.０±２０nmの粒子径および０.０２７ ｓｉＲＮＡ／脂質比で、４０％２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソラン：１０％ＤＳＰＣ：４０％コレステロール：１０％ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ(モルパーセント)を含む。
イオン化可能／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジオレイルホスファチジルグリセロール(ＤＯＰＧ)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(ＤＰＰＧ)、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン４－(Ｎ－マレイミドメチル)－シクロヘキサン－１－カルボキシレート(ＤＯＰＥ－ｍａｌ)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン(ＤＳＰＥ)、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＳＯＰＥ)、コレステロールまたはこれらの混合物を含むが、これらに限定されないアニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれるならば、粒子に存在する全脂質の約５mol％～約９０mol％、約１０mol％または約５８mol％であり得る。
粒子の凝集を阻止するコンジュゲート脂質は、例えば、限定しないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール(ＤＡＧ)、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル(ＤＡＡ)、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド(Ｃｅｒ)またはこれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)－脂質であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル(Ｃｉ２)、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル(Ｃｉ４)、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル(Ｃｉ６)またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル(Ｃ]８)であり得る。粒子の凝集を阻止するコンジュゲート脂質は、粒子に存在する全脂質の０mol％～約２０mol％または約２mol％であり得る。
ある実施態様において、核酸－脂質粒子は、さらに、コレステロールを、粒子に存在する全脂質の、例えば、約１０mol％～約６０mol％または約４８mol％で含む。
ある実施態様において、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ(ＭＷ １４８７)(引用により本明細書に包含させるＵＳ２００９００２３６７３参照)、コレステロール(Sigma-Aldrich)およびＰＥＧ－セラミドＣ１６(Avanti Polar Lipids)を、脂質－ｄｓＲＮナノ粒子(すなわち、ＬＮＰ０１粒子)の製造に使用できる。エタノール中の各々の原液を次のとおり製造する：ＮＤ９８、１３３mg／ml；コレステロール、２５mg／ml、ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００mg／ml。次いで、ＮＤ９８、コレステロールおよびＰＥＧ－セラミドＣ１６原液を、例えば、４２：４８：１０モル濃度比で合わせる。合わせた脂質溶液を、最終エタノール濃度が約３５～４５％であり、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００mMであるように、水性ｄｓＲＮＡ(例えば、酢酸ナトリウムｐＨ５中)と混合する。脂質－ｄｓＲＮナノ粒子は、一般に混合により自然に形成される。所望の粒子径分布によって、得られたナノ粒子混合物を、例えば、Lipex Extruder(Northern Lipids, Inc)などのサーモバレル押し出し機を使用して、ポリカーボネート膜(例えば、１００nmカットオフ)を通して押し出し得る。ある例では、押し出し工程を省き得る。エタノール除去および同時の緩衝液交換を、例えば、透析またはタンジェンシャルフロー濾過により達成し得る。緩衝液を、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６.９、約ｐＨ７.０、約ｐＨ７.１、約ｐＨ７.２、約ｐＨ７.３または約ｐＨ７.４の、例えば、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)と交換し得る。
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２００８０４２９７３に記載される。
さらなる例示的脂質－ｄｓＲＮＡ製剤を、表１に示す。
ＸＴＣ含有製剤はＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０８８５３７に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。
ＭＣ３含有製剤は、例えば、米国公開２０１０／０３２４１２０に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。
ＡＬＮＹ－１００含有製剤はＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０５４４０６に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。
Ｃ１２－２００含有製剤はＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／１２９７０９に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。
経口投与のための組成物および製剤は散剤または顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁液剤もしくは溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニタブレット剤を含む。濃厚剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましいことがあり得る。ある実施態様において、経口製剤は、本発明で注目されるｄｓＲＮＡを浸透増強剤界面活性剤およびキレート剤の１以上と共に投与するものである。適当な界面活性剤は、脂肪酸またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸またはその塩を含む。適当な胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸(ＣＤＣＡ)およびウルソデオキシケノデオキシコール酸(ＵＤＣＡ)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ－２４,２５－ジヒドロ－フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートを含む。適当な脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるその塩(例えば、ナトリウム)を含む。ある実施態様において、浸透増強剤の組み合わせ、例えば、脂肪酸／塩と胆汁酸／塩の組み合わせが使用される。一つの例示的組み合わせは、ラウリン酸ナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。さらに浸透増強剤は、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルを含む。本発明で注目されるｄｓＲＮＡを、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態でまたはマイクロもしくはナノ粒子を形成するために複合体化させて、経口送達し得る。ＤｓＲＮＡ複合体化剤は、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン(pollulans)、セルロースおよびデンプンを含む。適当な複合体化剤は、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ(ＴＤＡＥ)、ポリアミノスチレン(例えば、ｐ－アミノ)、ポリ(メチルシアノアクリレート)、ポリ(エチルシアノアクリレート)、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソヘキシルシアノアクリレート)、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(Ｄ,Ｌ－乳酸)、ポリ(ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸(ＰＬＧＡ)、アルギネートおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびその製造は、米国特許６,８８７,９０６および６,７４７,０１４およびＵＳ２００３００２７７８０に詳述され、その各々を引用により本明細書に包含させる。
本発明の医薬組成物は、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない多様な成分から産生され得る。特に好ましいのは、肝臓癌などの肝障害を処置するとき、肝臓を標的とする製剤である。
簡便には単位投与量形態で提供され得る本発明の医薬製剤は、医薬業界で周知の慣用技法により製造できる。このような技法は、活性成分と医薬担体または添加物を合わせる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分と液体担体または微粉化固体担体または両者を均一におよび密接に合わせ、次いで、必要であれば、製品を形作ることにより、製造する。
Ｖ. 本発明の方法の使用
本発明は、種々の方法および処置レジメンを記載する。本方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤およびワクチンの使用として提供され得ることは理解される。すなわち、本発明は、Ｂ型肝炎感染を有する対象を処置する方法において使用するための、
ａ) 少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；
ｂ) ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；および
ｃ) ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチン(ここで、構築物は該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードする)；(それにより対象を処置する)；
を提供する。
使用は、ここに提供する全てのバリエーションおよび例示的ＲＮＡｉ剤、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンを含む。
VI. 本発明の方法を実施するためのキット
本発明は、Ｂ型肝炎感染を有する対象の処置のための種々の方法、処置レジメンおよび薬剤の使用を記載する。本発明の方法の実施のための薬剤は、ここに提供する開示に基づき製造され得ることは理解される。このようなキットは、
ａ) 少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；
ｂ) ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；
ｃ) ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチン(ここで、構築物は該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードする)；(それにより対象を処置する)；および
ｄ) Ｂ型肝炎感染を有する対象を処置する方法において使用するための指示
を含む。
使用は、ここに提供する全てのバリエーションおよび例示的ＲＮＡｉ剤、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンを含む。キットの構成要素を、例えば、箱に一緒にし得る。ある実施態様において、本発の構成要素は、例えば、異なる保存必須要件のために、別々に提供されるが、例えば、使用のための添付文書に基づき、共に使用するために提供される。
本発明を、次の実施例によりさらに説明するが、これを限定的と解釈してはならない。本明細書ならびに図面、付属表Ａおよび配列表を通して引用した全ての引用文献、特許および特許出願公開は、引用により本明細書に包含させる。
実施例１. 材料および方法
例示的ｉＲＮＡ
例示的ｉＲＮＡ標的部位ならびに非修飾および修飾ｓｉＲＮＡ配列を、付属表Ａの表に提供する。
下記実験に使用した化学修飾ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ二本鎖は、次の配列を有する。


修飾核酸配列のヌクレオチド単量体の略語は、付属表Ａの表１に提供される。
ＡＤ－６６８１０の標的部位はGTGTGCACTTCGCTTCACA(配列番号３９)であり、これはＮＣ＿００３９７７.１(配列番号１)のヌクレオチド１５７９～１５９７である。
ＡＤ－６６８１６の標的部位はCACCATGCAACTTTTTCACCT(配列番号４０)であり、これはＮＣ＿００３９７７.１(配列番号１)のヌクレオチド１８１２～１８３２である。
ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡの細胞培養評価
ｈＮＴＣＰ発現ＨｅｐＧ２細胞を、デュプリケートで感染させた(１００感染効率(ＭＯＩ))ＨＢＶ粒子／細胞(サブタイプａｙｗ))。感染後４日目、細胞をトリプシン処理し、多ウェルプレートに再播種し、対照またはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６６８１０(上記表に示す化学修飾ならびにそれぞれ配列番号３７および３０に示すセンスおよびアンチセンス配列を有する)またはＡＤ－６６８１６(上記表に示す化学修飾ならびにそれぞれ配列番号３８および３２に示すセンスおよびアンチセンス配列を有する)でトランスフェクトし、各々、リポフェクタミン(登録商標)ＲＮＡｉＭａｘを使用して１００nM、１０nMまたは１nMを送達した。上清を再播種後３日目、６日目、１０日目、１３日目および１７日目に採取し、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇレベルを、非トランスフェクト対照に対して決定した。ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルを、Abbott Architect免疫アッセイ分析装置(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)で測定する化学発光微粒子免疫測定法(ＣＭＩＡ)を使用して、決定した。
マウス、ｓｉＲＮＡ投与およびワクチン接種
ＨＢＶ－トランスジェニックマウス(系統ＨＢＶ１.３ｘｆｓ(ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ))は、施設ガイドラインに従う特定の病原体フリー条件下で社内飼育由来であった。
ｓｉＲＮＡ投与について、図面および下記実施例に示すとおりマウスに、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ発現のために、３mg／kgまたは９mg／kg用量の対照ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ(修飾ＡＤ－６６８１０または修飾ＡＤ－６６８１６)を皮下投与するか；または１×１０１１ ＡＡＶ粒子を尾静脈注射により静脈内投与した。
タンパク質ワクチン接種について、マウスを、５０μｌ ＰＢＳ中３１.９１μgの合成ホスホロチオエート化ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８および２５μg ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチル－フェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ)と混合した組み換え酵母ＨＢｓＡｇおよび大腸菌ＨＢｃＡｇ(APP Latvijas Biomedicinas, Riga, Latvia)で皮下的に免疫化した。
組み換えＭＶＡは、先に記載のとおり、相同組み換えおよび宿主範囲選択により産生した(Staib et al., 2003. Biotechniques. 34:694-700)。ＨＢｃＡｇ全体(遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ)およびＨＢｓＡｇオープンリーディングフレーム(遺伝子型Ａ、サブタイプａｙｗまたはａｄｗ)を、ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲ－ＰＨ５またはｐIIIΔＨＲ－Ｐ７.５にクローン化し、それによりＨＢＶタンパク質を早期／後期ワクシニアウイルス特異的プロモーターＰＨ５(ＨＢｃＡｇ ａｙｗ／ＨＢｓＡｇ ａｙｗ／ＨＢｓＡｇ ａｄｗ)またはＰ７.５(ＨＢｓＡｇ ａｙｗ)の制御下においた。各ウイルスの構築後、遺伝子発現、挿入ＤＮＡの配列およびウイルス純度を確認した。ワクチン製剤産生のために、ＭＶＡをＣＥＦで通常どおり繁殖させ、スクロースを通す超遠心分離により精製し、１mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９.０で再構成し、標準的法に従い力価測定した(Staib et al., 2004. Methods Mol Biol. 269:77-100)。ＭＶＡワクチン接種について、マウスに５００μｌ ＰＢＳ中各組み換えＭＶＡ１×１０８感染単位で腹腔内にワクチン接種した。
特定の投与レジメンを下の実施例および図３、７および１２に提供する。
血清学的分析
ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの血清レベルを、Abbott Architect免疫アッセイ分析装置(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)で測定する化学発光微粒子免疫測定法(ＣＭＩＡ)を使用する、１：３３希釈で決定し；抗ＨＢｓレベルを１：１００希釈で決定した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による血清ＨＢＶ力価の定量および血清中のＨＢＶ ＤＮＡレベル決定を、Untergasser et al., 2006(Hepatology. 43:539-47)に記載のとおり実施した。ＨＢＶ ＤＮＡの量を、処置前ＤＮＡレベルに対して正規化した。
抗ＨＢｃ抗体のレベルを、ＢＥＰIIIプラットフォームでのEnzgnost抗ＨＢｃモノクローナル試験(Both Siemens Healthcare, Eschborn, Germany)を使用して、１：２０希釈で決定した。サンプルの測定値が直線範囲を超えたならば、適宜、高いまたは低い希釈を使用した。
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による血清ＨＢＶ力価の定量および血清中のＨＢＶ ＤＮＡレベル決定を、Untergasser et al., 2006(Hepatology. 43:539-47)に記載のとおり実施した。ＨＢＶ ＤＮＡの量を、処置前ＤＮＡレベルに対して正規化した。
ＡＬＴ活性を、レフロトロンＧＰＴ／ＡＬＴ試験(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を使用して、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中１：４希釈で採血日に測定した。
リンパ球刺激アッセイ
肝臓関連リンパ球(ＬＡＬ)をStross et al., 2012(Hepatology 56:873-83)に記載のとおり単離し、１mg／ml ブレフェルジンＡ(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)存在下、１２時間、Ｈ２－ｋｂ－またはＨ－２Ｄｂ－制限ペプチド(Backes, 2016参照)で刺激した。細胞をエチジウムモノアジドブロマイド(Invitrogen(登録商標), Karlsruhe, Germany)で生存／死染色し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２－Ｆｃ－Ｂｌｏｃｋ(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)でブロックした。表面マーカーをＰＢ－コンジュゲート抗ＣＤ８－アルファおよびＰＥ－コンジュゲート抗ＣＤ４(eBiosciences, Eching, Germany)で染色した。細胞内サイトカイン染色(ＩＣＳ)を、製造業者の推奨に従いCytofix/Cytopermキット(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)を使用して、ＦＩＴＣ抗ＩＦＮ－ガンマ(ＸＭＧ１.２)、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＴＮＦ－アルファおよびＡＰＣ抗ＩＬ－２(eBiosciences, Ech-ing, Germany)で実施した。同じデータを２回分析し、２回目は、死亡細胞をより厳密に排除した。
ＨＢｃ発現肝細胞の免疫組織化学染色
肝臓を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。肝臓を薄切りし(２μm)、切片を一次抗体としてウサギ抗ＨＢｃＡｇ(Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA; #RP 017; １：５０希釈；１００℃で３０分間、ＥＤＴＡで回収)およびホースラディッシュペルオキシド結合二次抗体で染色した。Ventana緩衝液でのインキュベーションおよび染色を、ＮＥＸＥＳ免疫組織化学ロボット(Ventana Instruments)でIVIEW DAB Detection Kit(Ventana Instruments)またはBond MAX(Leica Biosystems)で実施した。分析について、スライドをＳＣＮ ４００スライドスキャナーを使用してスキャンし、陽性細胞を、統合Tissue AI softwareを使用して計数した(両者ともLeica Biosystems)。
肝臓ライセートからのＨＢＶ転写物
肝臓ライセートからのＨＢＶ ＲＮＡの分析について、ＲＮＡをRNeasy mini kit(Qiagen)を用いて３０mg 肝臓組織から抽出し、ｃＤＮＡをSuperscript III kit(Thermo Fisher Scientific)で合成した。ＨＢＶ転写物を、３.５kb転写物のみに特異的なプライマー(フォワードプライマー５’－ＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣ－３’(配列番号４１)；リバースプライマー５’－ＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ－３’(配列番号４２))または全ＨＢＶ転写物の共通３'末端に結合するプライマー(フォワードプライマー５’－ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣ－３’(配列番号４３)；リバースプライマー５’－ＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧ－３’(配列番号４４))で増幅させた(変性：９５℃で５分；増幅：９５℃で３秒、６０℃で３０秒(４０サイクル))(Yan et al., 2012)。結果を、マウスＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した(フォワードプライマー５’－ＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＣ－３’(配列番号４５)；リバースプライマー５’－ＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＴ－３’(配列番号４６))(変性：９５℃で５分；増幅：９５℃で１５秒、６０℃で１０秒、７２℃で２５秒(４５サイクル))。全ＰＣＲ反応を、LightCycler 480(Roche Diagnostics)で実施した。
ＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデル
ＡＡＶマウスモデルについて、野生型Ｃ５７／Ｂｌ６マウス(９週齢；６動物／処置群)に、遺伝子型Ｄの１.２倍過剰な長さのＨＢＶゲノムを担持する、アデノ随伴ウイルス血清型８(ＡＡＶ８)(ＡＡＶ－ＨＢＶ１.２)の２×１０１０ゲノム等量(ｇｅｑ)をｉ.ｖ.注射した(－２８日目)(例えば、Yang, et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71参照)。ＡＡＶ形質導入４週間から開始して(０日目)、動物を対照ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ ｓｉＲＮＡ(ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０)の３回の注射(３mg／kg ｂｗ、ｎ＝１２／群)で処置した(０日目、２９日目および５７日目)。各ｓｉＲＮＡ処置群を２群(ｎ＝６／群)に分け、５７日目および７０日目に組み換えＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ(各１５μg)および１０μg ｃ－ジ－ＡＭＰを投与し、８４日目にＭＶＡ－ＨＢｓおよびＭＶＡ－ＨＢｃ(各５×１０７ｇｅｑ)でブーストからなるワクチンレジメンで処置しないか、または処置した。処置レジメンを示す模式図を図１２に提供する。
実施例２ － ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞培養におけるＨＢＶ－ｓｉＲＮＡの評価およびＨＢＶｘｆｓマウスにおける用量検定実験
抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡを、上記のとおり、修飾ＡＤ－６６８１０または修飾ＡＤ－６６８１６ ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの一つの１nM、１０nMまたは１００nMで処置したＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を使用するインビトロ感染モデルで、ＨＢＶ抗原およびＤＮＡの効率的ノックダウンについて評価した。上清をｓｉＲＮＡ処置後３日目、６日目、１０日目、１３日目および１７日目に採取し、非トランスフェクト対照と比較して、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇレベルについてアッセイした。両ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡは、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇ両者の発現を効果的にノックダウンし、最高レベルのノックダウンは１３日目および１７日目に観察された。対照ｓｉＲＮＡで顕著なノックダウンは観察されなかった。これらのデータは、ＡＤ－６６８１０またはＡＤ－６６８１６ ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡが、ＨＢＶ感染のインビトロ系で持続性様式でＨＢＶ抗原発現のノックダウンに効果的であることを示す。
次いで、ＨＢＶおよび対照ｓｉＲＮＡを慢性Ｂ型肝炎のＨＢＶｘｆｓトランスジェニックモデルで試験した。ＨＢＶｘｆｓマウスは、肝臓特異的プロモーターの制御下に発現する、統合ＨＢＶゲノムを含む。約１０週齢で、マウスに３mg／kgまたは９mg／kg用量のＡＤ－６６８１０またはＡＤ－６６８１６ ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの一つ(ｎ＝６／群)を投与した。血液サンプルをｓｉＲＮＡ処置後６日目、１３日目および２１日目に採取し、血清を調製した。血清のＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡレベル(図２Ａ～２Ｃ)は、上記のとおり決定した。さらに、ＲＮＡを肝臓から単離し、総ＨＢＶ ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kB転写物レベルをYan, 2012の方法を使用して検出し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した(図２Ｄおよび２Ｅ)。
両用量のＨＢＶ－ｓｉＲＮＡの両者は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ発現を効果的にノックダウンし、対照レベルと比較して血清のＨＢＶ ＤＮＡレベルを減少させることが示された(図２Ａ～２Ｃ参照)。さらに、ＧＡＰＤＨ ＤＮＡに対する総肝臓ＨＢＶ ＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ ＲＮＡレベルに対する３.５kb ＨＢＶ ＲＮＡは、対照レベルと比較して、両用量のｔｈｅ ＨＢＶ ｓｉＲＮＡで強度に減少した(図２Ｄおよび２Ｅ)。Ｂこれらの結果に基づき、３mg／kg用量をさらなる実験での使用のために選択した。
実施例３ － ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおける治療ワクチン投与前のヌクレオチ(シ)ドアナログに対するｓｉＲＮＡでの抗原負荷の減少比較
ＨＢＶｘｆｓマウスモデルでＨＢＶを標的とするｓｉＲＮＡがＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの発現を効果的にノックダウンし、血清のＨＢＶ ＤＮＡレベルを減少できることが証明されたため、プライム－ブーストレジメンを使用する治療ワクチン投与前のヌクレオシドアナログエンテカビルまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡでのマウスの処置の効果を試験した。処置スキームを図３に示す。
マウスを、プライム－ブーストレジメンを使用するワクチン接種前に６処置レジメンの一つで前処置した(ｎ＝６／群)：
(１)前処置無し；
(２)０週目の処置にから開始して、試験を通してエンテカビル１μg／ml水溶液(Luetgehetmann et al., 2011, Gastroenterology.140:2074-83に提供される計算に基づき約４mg／日の予想用量)；
(３)対照ｉＲＮＡ剤の０週目、４週目、８週目および１２週目の初日の３mg／kg用量；
(４)ＨＢＶをコードするｓｈＲＮＡをコードする発現ベクター(ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ)の０週目の初日の１回用量(Michler et al., 2016)；または
(５－６)０週目、４週目、８週目および１２週目の初日に３mg／kg用量の修飾ＡＤ－６６８１６または修飾ＡＤ－８６６１０(総称的にＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ)。
１２週目および１４週目の初日に、３１.９μg 合成ホスホロチオエート化ＣｐＧＯＤＮ １６６８ (ＣｐＧ)および２５μg ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチル－フェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ)でアジュバントされた組み換え発現酵母ＨＢｓＡｇ(１５μg)および大腸菌発現ＨＢｃＡｇ(１５μg)の混合物を、タンパク質－プライムワクチン接種(Backes, 2016)として全マウスに皮下投与した。
１６週目の初日、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇを発現する改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａの混合物(各ウイルス５×１０７粒子)を、ブーストワクチン接種として、全マウスに投与した(Backes, 2016)。
血液サンプルを０週目、２週目、４週目、８週目、１２週目、１６週目および１７週目の初日に得て、それから調製した血清サンプルでＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡのレベルについてアッセイした。結果を図４に示す。
群１、２および３(偽、エンテカビル、対照ｉＲＮＡ剤)のマウスのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルは類似した。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ(ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－８６６１０)単独で、血清におけるＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡの有意な減少を起こした(図４Ａ～４Ｃ)。３用量プライム－ブーストワクチン接種スキームは、全群でのＨＢｓＡｇのさらなる減少と、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡおよびＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ群の一部動物でのＨＢｓＡｇレベルの検出レベル未満への減少をもたらした。しかしながら、ワクチン処置は、いずれの群でもＨＢｅＡｇレベルを減少させなかった。メカニズムに拘束されないが、ＨＢｓＡｇは減少して、ＨＢｅＡｇしないのは、ｅ抗原ではなく、Ｃタンパク質のタンパク質分解プロセシングにより産生される、ｓ抗原に対するワクチンにより誘発された免疫応答によりもたらされることが提販される(下記図５参照)。
ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、エンテカビル単独で定量限界未満まで減少せず、３用量プライム－ブーストワクチンの効果は検出されなかった(図４Ｃ)。偽処置およびＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡでの処置はすべてＨＢＶ ＤＮＡレベルを減少させ、ＨＢＶ－ＤＮＡレベルは全群でプライム－ブーストワクチンによりさらに減少した。この実験で、偽処置および対照ｓｉＲＮＡがＨＢＶ ＤＮＡレベルを減少させた理由は不明であった。他の実験では対照ｓｉＲＮＡでの処置に応答したＨＢＶ ＤＮＡの減少は観察されなかった(例えば、図２Ｃおよび８Ｃ参照)。これらのデータは、ＲＮＡｉが、ウイルス抗原減少においてヌクレオチ(シ)ドアナログ治療より優れることを示す。また、ＲＮＡｉおよびその後のワクチン接種は、いずれかの薬剤単独を超える、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡレベルに対する組み合わせた効果を有する。
実験最終日(１７週目の初日)、マウスを屠殺し、肝臓を採取した。肝臓関連リンパ球を肝臓から単離し、ペプチド刺激後、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を細胞内サイトカイン染色により測定した。特に、肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、Backes, 2016に提供される方法を使用して、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＭＶＡウイルス粒子の応答について評価した。データを、図５Ａ～５Ｃに提供する最初の分析では死亡免疫細胞の排除が不十分であったため、死亡免疫細胞の排除のために二つの異なる閾値を使用して２回分析した。２回目の分析を図５Ｄ～５Ｆに示す。２回目の分析は１回目の分析の結果を確認する。
ワクチン接種前にＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処置したマウスは、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を産生でき(図５Ａ、５Ｂ、５Ｄおよび５Ｅ)、細胞毒性Ｔ細胞が、ＨＢＶ抗原レベルがワクチン接種前に十分であるとき、ＨＢＶ感染を排除できることを示す。偽、エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡ群でＨＢＶ抗原に対する顕著なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答は観察されなかった。前処置またはウイルス抗原レベルと無関係の、全動物におけるＭＶＡウイルスに対する顕著なかつ類似のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答は、ワクチン接種が全動物で等しく良好に働いており、ＨＢＶ抗原レベルにより影響されないことを示し、それによりコンピテント免疫系の存在を示す(図５Ｃおよび５Ｆ)。偽処置動物と他の何れの群の間でも抗体産生の有意差は観察されず、高ＨＢＶ抗原レベルがＴ細胞耐容性を誘発し得ることを示す。
これらのデータは、ＲＮＡｉ処置が、ヌクレオシドアナログでの現在の標準処置とは対照的に、治療ワクチン接種後に、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞免疫を肝臓で回復でき、ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発できることを示す。強固なＣＤ８＋エフェクターＴ細胞応答は、ウイルス排除および機能的治癒と結び付けられている(例えば、Thimme et al., 2003. J. Virol. 77:68-76, and Backes et al., 2016. Vaccine. 34:923-932参照)。
ＲＮＡも肝臓から単離し、総ＨＢＶ ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kB転写物レベルをYan, 2012の方法を使用して検出し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。マウスのワクチン投与前のＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｈＲＮＡでの処置は、偽処置対照と比較して、ＨＢＶ総ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kb転写物の有意な減少をもたらした(図６Ａおよび６Ｂ)。偽処置対照と比較して、ワクチン接種前にエンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡで処置したマウスで、ＨＢＶ総ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kb転写物の有意な変化は観察されなかった。これらのデータは、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ両者が、対照およびエンテカビル群とは対照的に、ＨＢＶ転写物レベルの減少に成功したことを示す。
さらに、肝臓におけるＨＢＶ抗原発現を、肝臓切片のＨＢｃについて免疫組織化学染色し、mm２あたりのＨＢｃ陽性細胞を計測することにより分析した(図６Ｃ)。エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡではなく、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡで前処置した動物群のみが、ワクチン接種後、ＨＢｃ発現減少を示した。
実験を通して、体重およびＡＬＴレベルをモニターした。偽処置対照と比較して、処置群の何れでも有意な差は観察されなかった。
実施例４ － ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおける免疫化に応答したＨＢＶ抗原ノックダウンの有効期間の評価
ＨＢＶワクチンレジメンに対する免疫応答の増強についてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用するＨＢＶ抗原の発現抑制が効果的である示されたため、ＨＢＶ抗原抑制の時間の長さが、ＨＢＶ免疫応答の増強に効果を有するか否かを決定する試験を設計した。処置スキームを図７に示す。
ＨＢＶ１.３ｘｆｓマウスモデルを使用して、マウスを、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６６８１６(修飾)を８週間、６週間または３週間または対照ｓｉＲＮＡを８週間、３mg／kg／用量を皮下投与して処置した。ＰＣＥＰ＋ＣＰＧではなくｃ－ジ－ＡＭＰをタンパク質投与でのアジュバントとして使用する以外、ｓｉＲＮＡ投与は上記プライム－ブーストワクチンレジメンの投与に従った(ｎ＝６／群)。それ故に、８週群のマウス(ｎ＝６)は３用量のｓｉＲＮＡを受け、３回目の用量をワクチン投与１日目に投与した。６週群のマウス(ｎ＝１２)は２用量のｓｉＲＮＡを受け、２回目の用量をワクチン投与１日目の２週間前に投与した。最後に、３週群のマウス(ｎ＝６)は１用量のｓｉＲＮＡを受け、該用量をワクチン投与１日目の３週間前に投与した。
血液サンプルを、－８週目、－６週目、－４週目、－２週目、０週目、２週目、４週目および６週目の初日、０週目の初日の最初の用量のワクチン投与前(負の数)および後に採取した。上記のとおり、血清を調製し、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡレベルを評価した。
各ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡの有意な減少が、ＡＤ－６６８１６の最初の投与後観察された(図８Ａ～８Ｃ)。ＨＢｓＡｇのさらに有意な減少が、ワクチンブーストでの処置後に観察され、８週間前処置群で観察された最大減少はアッセイでの検出レベル未満であり、全処置動物でＨＢｓＡｇレベルの５ log 10を超える減少を示した。免疫化は、ｓｉＲＮＡ処置により有意に減少していた、ＨＢＶ ＤＮＡのわずかなさらなる減少(＜０.５ log 10)をもたらした。ワクチン接種レジメンに応答したＨＢｅＡｇレベルのさらなる減少は観察されなかった。
これらのデータは、治療ワクチン接種の有効性がワクチン接種開始前の抗原抑制の期間と相関することを示す。ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の再構成は数週間かかり、３週間前処置より６週間、または好ましくは８週間前処置する。
実験最終日、免疫化開始後６週目の初日、マウスを屠殺し、各群６マウスから肝臓を採取した。上記のとおり肝臓関連リンパ球を単離し、リンパ球刺激アッセイを実施した。特に、肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、Backes, 2016に提供される方法を使用して、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＭＶＡウイルス粒子の応答について評価した。肝臓でのＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対するＴ細胞応答は、ＨＢＶ抗原ノックダウンの期間と相関し、ＨＢＶ抗原での高い免疫応答レベルが観察される期間が長いと、Ｔ細胞応答が大きくなる傾向にあった(図９Ａ～９Ｃ参照)。ＭＶＡウイルス抗原に対する類似する応答が、前処置と無関係に全群にわたり観察され、ワクチン接種が全動物で等しく良好に働いており、ＨＢＶ抗原レベルにより影響されないことを示し、コンピテント免疫系の存在を示す(図９Ｄ)。対照ｓｉＲＮＡ処置動物と他の何れの群の間にも、抗体産生の有意な差は観察されなかった。これは、ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の再構成がすぐに起こらず、動物が、３週間のみと比較して、少なくとも６週間または８週間ＨＢＶ抗原力価が低下していたならば、治療ワクチン接種後強い応答が見られることを示す。Ｔ細胞応答と対照的に、Ｂ細胞免疫がＨＢＶ抗原力価により顕著に影響されないと考えられるとの先の知見をさらに確認する。
ＲＮＡも肝臓から単離し、総ＨＢＶ ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kB転写物レベルをYan, 2012の方法を使用して検出し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。マウスのワクチン投与前のＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６６８１６での処置は、対照ｓｉＲＮＡ処置対照と比較して、肝臓ライセートのＨＢＶ総ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kb転写物の有意な減少をもたらした(図１０Ａおよび１０Ｂ)。さらに、肝臓のＨＢＶ抗原発現を、免疫組織化学染色およびmm２あたりのＨＢｃ陽性細胞の計数により分析した(図１０Ｃ)。ＨＢＶ特異的ＣＤ８応答の観察された増加と、ｓｉＲＮＡ前処置の期間延長に相関して、ＨＢｃ発現細胞数の減少が肝臓で観察された。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が肝臓での抗原発現を阻止しなかったことを示す。
応答の耐久性を評価するために、血液サンプルを、６週間処置レジメンを使用するＡＤ－６６８１６ ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処置したマウスでブーストワクチン接種の投与後２週目および３週目に採取した(図１１Ａ～１１Ｄ)。６匹のマウス中３匹で、ＨＢｓＡｇレベルはアッセイでの検出レベル未満への低下が続いた(図１１Ａ)。実験中、ＨＢｅＡｇレベルの類似する減少は観察されなかった(図１１Ｂ)。これらのデータは、ここに提供するｓｉＲＮＡ－ワクチン接種組み合わせ治療による最大効果が、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の裁量評価の終了時点として選択した、ＭＶＡワクチン接種後１週間を超えて持続したことを示す。投与レジメンの６週間レジメン後の最初にワクチン投与後７週目の抗ＨＢｓ抗体応答(図１１Ｃ)およびＨＢｓ(Ｓ２０８)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答(図１１Ｄ)。抗体応答は、動物間で変化した。
これらのデータは、ここに提供する処置レジメンを使用して機能的治癒が可能であることを示す。さらに、これらのデータは、少なくとも短期間の実験内で、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ負荷が低いほど、ＨＢ抗原の免疫排除および免疫応答を増強するレベルは大きく成り得ることを示す。
実験を通して、体重およびＡＬＴレベルをモニターした。偽処置対照と比較して、処置群の何れでも有意な差は観察されなかった。
実施例５ － ＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデルにおける免疫化に対する応答のＨＢＶ抗原ノックダウンの有効期間評価
トランスジェニックマウスモデルにおけるｓｉＲＮＡ－ワクチン組み合わせ処置レジメンの有効性が証明されたため、ＡＡＶ－ＨＢＶ感染マウスモデルを使用して、後天的感染モデルにおける処置レジメンの有効性を試験した(例えば、Yang, et al. (2014) Cell Mol Immunol 11:71参照)。このマウスモデルは、複製可能ＨＢＶゲノムを担持する組み換えアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)で感染後、持続性ＨＢＶウイルス血症を示す。
ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルとＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデルの間に多数の差がある。ＨＢＶトランスジェニックマウスは、本質的に生まれたときからＨＢＶ抗原を発現できるのに対し、ＡＡＶ－ＨＢＶモデルは、マウスの生存中の後の時点でＨＢＶゲノムの導入を可能とする。これは、免疫寛容に対する効果を有し得る。さらに、ＨＢＶトランスジェニックマウスは、体内の全細胞に導入遺伝子を担持し、「漏出性」肝臓外発現の可能性を提供する。ＡＡＶ８血清型は肝臓の外の細胞に感染できるが、強い肝臓指向性を有する。さらに、トランスジェニックマウスでＨＢＶ感染を排除することは不可能である。トランスジェニックＨＢＶ発現肝細胞が殺されたとき、新しいＨＢＶ発現細胞に置き換わる。感染モデルにおいて、感染細胞が殺されたならば、新たな分裂細胞は、細胞分裂時点では感染していない。
９週齢Ｃ５７／Ｂｌ６マウスをＡＡＶ－ＨＢＶ(－２８日目)で感染させた。次いで、マウスを対照ｓｉＲＮＡの一つまたは２つのＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ、修飾ＡＤ－６６８１６または修飾ＡＤ－６６８１０の一つで、３mg／kgを、０日目、２９日目および５７日目(すなわち、０週間、４週間、８週間)に皮下投与して処置した(ｎ＝１２／群)。各ｓｉＲＮＡ処置群を２群に分けた(ｎ＝６／群)。１群をＨＢＶワクチンプロトコール(タンパク質プライムを５７日目および７０日目ならびにＭＶＡブーストを８４日目、すなわち、それぞれ８週目、１０週目および１２週目)で処置し、１群はしなかった。投与レジメンを示す模式図を図１２に提供する。マウスを、血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓ抗体、体重およびＡＬＴについて実験を通してモニターした。抗ＨＢｅ抗体レベルも定期的に試験した。
図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡＡＶ－ＨＢＶウイルスで形質導入２週間以内のトランスジェニックマウスに見られるのと同等の、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベル増加を示す。対照ｓｉＲＮＡのみで処置したマウスは、ＨＢＶを、慢性感染ヒト(ＨＢｓＡｇレベル約２,０００IU／ml、ＨＢＶウイルス血症１０６－１０７IU／ml)と同等のレベルで８か月を超えて複製した。ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６６８１６およびＡＤ－６６８１０は、ＨＢｓＡｇをそれぞれ２および２.５ log 10減少させ、ＨＢｅＡｇを≧１ log 10減少させた。効果は、ｓｉＲＮＡ処置停止後少なくとも４週間持続し、その後、抗原血症がゆっくりリバウンドし、１８週後にベースラインレベルとなった(図１３Ａおよび１３Ｂ)。
肝臓内ＨＢＶ ＤＮＡ(図１３Ｄ)およびＡＡＶ ＤＮＡ(図１３Ｅ)レベルを、上記のとおりｑＰＣＲにより２２週目に決定した。ＧＡＰＤＨ ＲＮＡに対するＨＢＶ３.５ ＲＮＡ(図１３Ｆ)およびＧＡＰＤＨ ＲＮＡに対する総ＨＢＶ ＲＮＡ(図１３Ｇ)の肝臓における相対的発現をｒｔＰＣＲを使用して決定した。合わせたｓｉＲＮＡ－ワクチンプロトコールで処置したマウスは、２２週目時点で未処置対照またはｓｉＲＮＡまたはワクチン処置単独と比較して、総ＨＢＶ ＤＮＡおよびＡＡＶ ＤＮＡの有意な減少を示した(図１３Ｄおよび１３Ｅ)。特に、総ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、組み合わせ処置の結果として、細胞あたり１コピー未満まで減少した(図１３Ｄ)。合わせたｓｉＲＮＡ－ワクチンプロトコールで処置したマウスはまた、他の全処置レジメンと比較して、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡ発現に対して相対的なＨＢＶ３.５kb ＲＮＡ発現レベルの有意な減少を示した(図１３Ｆ)。ＧＡＰＤＨ ＲＮＡに対する総ＨＢＶ ＲＮＡ発現の有意な減少は、ワクチンまたはｓｉＲＮＡ単独での処置と比較して観察された(図１３Ｇ)。これらのデータは、ｓｉＲＮＡ単独またはＨＢＶに対する治療ワクチンの短期の投与がＨＢＶ感染の持続的な抑制に不十分であることを示唆する。ＨＢＶ発現のｓｉＲＮＡノックダウン後のＨＢＶの免疫介在制御は、持続性であった。最後のｓｉＲＮＡ投与２２週目に、ｓｉＲＮＡの効果は、ワクチン接種なしでＨＢＶ ｓｉＲＮＡのみを受けた群で見られるとおり、漸減した。ｓｉＲＮＡ－ワクチンプロトコールで処置したマウスは、ｓｉＲＮＡ投与終了後長期にＨＢＶ ＤＮＡおよびＲＮＡ抑制を維持した。
免疫応答は、ｓｉＲＮＡ単独処置下のこれらの完全に免疫適格性のマウスで観察されなかったが、ワクチン処置は、全ワクチン接種動物で抗ＨＢｓセロコンバージョンをもたらした(図１４Ａおよび１４Ｂ)。しかしながら、ｓｉＲＮＡ前処置動物は、１０倍高く、より一定した抗ＨＢｓ力価をもたらし、完全かつ持続性に血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇを排除できた。対照的に、抗ＨＢｅセロコンバージョンは、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡで前処置した動物でのみ観察された。興味深いことに、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ処置後ワクチン接種した１２匹のマウス中３匹が、抗ＨＢｅのレベル減少と同時発生するＨＢｅＡｇの一過性再発を１５～２２週目に示した(図１３Ｃ)。メカニズムに拘束されないが、ＨＢｅＡｇ再発は、ワクチンによる記憶免疫応答誘発により制御されたと提案される。併せて、ｓｉＲＮＡと異種性プライム－ブーストワクチンの組み合わせによるＨＢＶ抗原発現の抑制は、ＨＢＶ抗原に対する免疫寛容の破壊に十分である。連続的治療は、持続性ＨＢＶ感染のマウスモデルで顕著な肝臓損傷なしに長期機能的治癒を達成した。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンで処置した動物が高力価の抗ＨＢｓ抗体および抗ＨＢｅ抗体を生じたことを示す。抗ＨＢｓ抗体レベルは、最後のワクチン投与後も増加し続けた。対照ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物で抗ＨＢｓ抗体も測定されたが、レベルは有意に低かった。さらに、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物のみ抗ＨＢｅ抗体を生じ、抗ＨＢｅセロコンバージョンを達成した。ｓｉＲＮＡおよびワクチンを使用する組み合わせ治療は、十分に耐容性であるように見えた。全マウスは等しく体重が増加し、軽度なＡＬＴ上昇のみ(正常上限の＜２倍)観察された(図１５Ａおよび１５Ｂ)。抗原血症喪失は、ワクチン接種レジメンと共にＨＢＶ ｓｉＲＮＡを受けた処置群で見られるＡＬＴ活性のわずかな増加と一致した(図１５Ａ)。これらの群は、組み合わせＨＢＶ ｓｉＲＮＡ－ワクチンレジメンを受けたかった他の全処置群と比較して、有意な、しかし軽度の増加を示した(両者とも反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＞０.０５以下；ワクチン接種開始後の時点のみ比較)。ｓｉＲＮＡ処置と無関係に、全動物は、実験を通して体重が一定に増加した。ワクチン接種した動物は、ワクチン接種後にわずかな一過性の体重減少(約５％)を示したが、９日以内に正常レベルまでリバウンドし、その後対照群と同等に体重増加した(図１５Ｂ)。
メカニズムに拘束されないが、ここに提供するデータは、高レベルのＨＢＶ抗原発現が常に循環ＨＢｓＡｇとして検出され、ＨＢｅＡｇがＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を阻止することを強く示唆し、これは、慢性Ｂ型肝炎の将来的な免疫療法に大きな影響を有する。慢性Ｂ型肝炎の２種の異なるマウスモデルを使用して、ＨＢＶ特異的免疫調節が、ＲＮＡｉベースの治療を使用する肝細胞のＨＢＶタンパク質発現抑制により復帰し得ることが提案される。このようなＲＮＡｉによるＨＢＶ抗原の減少は、標準治療ヌクレオ(チ)シドアナログとは対照的に、ＨＢＶ感染の制御に必要な強いＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の治療ワクチン接種による誘発を可能とする。
付属表Ａ
等価物
当業者は、ここに記載する特定の実施態様および方法の多くの等価物を、認識するかまたは日常的な程度を超えない実験を使用して、確認できる。このような等価物は次の特許請求の範囲の範囲に包含されることを意図する。

Claims (112)

  1. Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染の処置に使用するためのＲＮＡｉ剤ならびにタンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンを含むＨＢＶワクチンまたはＨＢＶ感染を有する対象を処置する方法であって、ＨＢＶ感染を有する対象に
    ａ)少なとも３つのＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；
    ｂ)第一ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第一ＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質ベースのワクチン；および
    ｃ)第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチン
    を連続的に投与することを含み、
    ここで、第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの少なくとも一つと少なくとも一つのエピトープを共有し；それにより対象を処置する、方法。
  2. ＲＮＡｉ剤が少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の使用または方法。
  3. 核酸ベースのワクチンが第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントをコードする発現ベクター構築物を含む、請求項１または２に記載の使用または方法。
  4. 少なくとも２用量のＲＮＡｉ剤が対象に投与される、請求項１～３の何れかに記載の使用または方法。
  5. ＲＮＡｉ剤が、対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが少なくとも０.５log 10IU/ml減少するように対象に投与される、請求項１～４の何れかに記載の使用または方法。
  6. 対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に少なくとも０.５log 10IU/ml減少する、請求項１～５の何れかに記載の使用または方法。
  7. 対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に少なくとも１log 10IU/ml減少する、請求項１～６の何れかに記載の使用または方法。
  8. 対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に少なくとも２log 10IU/ml減少する、請求項１～７の何れかに記載の使用または方法。
  9. 対象の血清のＨＢｅＡｇレベルが、最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に少なくとも１log 10IU/ml減少する、請求項１～８の何れかに記載の使用または方法。
  10. 最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に、対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが少なくとも２log 10IU/ml減少し、対象の血清のＨＢｅＡｇレベルが少なくとも１log 10IU/ml減少する、請求項１～９の何れかに記載の使用または方法。
  11. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に５００IU／ml以下の血清ＨＢｓＡｇレベルを有する、請求項１～１０の何れかに記載の使用または方法。
  12. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に２００IU／ml以下の血清ＨＢｓＡｇレベルを有する、請求項１～１０の何れかに記載の使用または方法。
  13. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に１００IU／ml以下の血清ＨＢｓＡｇレベルを有する、請求項１～１０の何れかに記載の使用または方法。
  14. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に５００IU／ml以下の血清ＨＢｅＡｇレベルを有する、請求項１～１３の何れかに記載の使用または方法。
  15. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前にＨＢｅＡｇレベル～２００IU／ml以下の血清ＨＢｅＡｇレベルを有する、請求項１～１３の何れかに記載の使用または方法。
  16. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前にＨＢｅＡｇレベル～１００IU／ml以下の血清ＨＢｅＡｇレベルを有する、請求項１～１３の何れかに記載の使用または方法。
  17. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に５００IU／ml以下の血清ＨＢｅＡｇレベルおよび５００IU／ml以下の血清ＨＢｓＡｇレベルを有する、請求項１～１６の何れかに記載の使用または方法。
  18. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に２００IU／ml以下の血清ＨＢｅＡｇレベルおよび２００IU／ml以下の血清ＨＢｓＡｇレベルを有する、請求項１～１６の何れかに記載の使用または方法。
  19. 対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前に１００IU／ml以下の血清ＨＢｅＡｇレベルおよび１００IU／ml以下の血清ＨＢｓＡｇレベルを有する、請求項１～１６の何れかに記載の使用または方法。
  20. ＲＮＡｉ剤の１用量が、対象に週１回以下で投与される、請求項１～１９の何れかに記載の使用または方法。
  21. ＲＮＡｉ剤の１用量が、対象に４週に１回以下で投与される、請求項１～１９の何れかに記載の使用または方法。
  22. ＲＮＡｉ剤が、０.０１mg／kg～１０mg／kg；または０.５mg／kg～５０mg／kg；または１０mg／kg～３０mg／kgの用量で対象に投与される、請求項１～２１の何れかに記載の使用または方法。
  23. ＲＮＡｉ剤が、対象に０.５mg／kg、１mg／kg、１.５mg／kg、３mg／kg、５mg／kg、１０mg／kgおよび３０mg／kgからなる群から選択される用量で投与される、請求項１～２１の何れかに記載の使用または方法。
  24. 第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｃＡｇ決定基を含み、第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｓＡｇ決定基を含む、請求項１～２３の何れかに記載の使用または方法。
  25. 第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｃＡｇ決定基を含み、第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｓＡｇ決定基を含む、請求項１～２４の何れかに記載の使用または方法。
  26. 第一および／または第二ＨＢｓＡｇ決定基が配列番号２２のアミノ酸１２４～１４７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２４または２５に記載の使用または方法。
  27. 第一および／または第二ＨＢｓＡｇ決定基が配列番号２３のアミノ酸９９～１６８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２４または２５に記載の使用または方法。
  28. 第一および／または第二ＨＢｃＡｇ決定基が配列番号２４のアミノ酸残基８０を含むアミノ酸配列を含む、請求項２４または２５に記載の使用または方法。
  29. 配列番号２４のアミノ酸８０を含む配列が少なくとも配列番号２４のアミノ酸７０～９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の使用または方法。
  30. 第一および／または第二ＨＢｃＡｇ決定基が配列番号２４のアミノ酸残基１３８を含むアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の使用または方法。
  31. 配列番号１４のアミノ酸８０を含む配列が少なくとも配列番号２４のアミノ酸１２８～１４３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の使用または方法。
  32. 第一および／または第二ＨＢｃＡｇ決定基が、配列番号２４の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００連続アミノ酸と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２８または３１の何れかに記載の使用または方法。
  33. ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４のアミノ酸１８～１４３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２５に記載の使用または方法。
  34. 対象に投与するタンパク質ベースのワクチンの１用量が約０.１μg～約１.０mgの第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび約０.１μg～約１.０mgの用量の第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含む、請求項１～３３の何れかに記載の使用または方法。
  35. 第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが単一タンパク質ベースのワクチン製剤に存在する、請求項１～３４の何れかに記載の使用または方法。
  36. タンパク質ベースのワクチンがさらにアジュバントを含む、請求項１～３５の何れかに記載の使用または方法。
  37. アジュバントがバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を刺激する、請求項３６に記載の使用または方法。
  38. アジュバントがモノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ；短、平滑断端５’－三リン酸ｄｓＲＮＡ(３ｐＲＮＡ)Ｒｉｇ－Ｉリガンド、ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、ＩＬ－１２、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ISCOMATRIX(登録商標)、ＩＣ３１(登録商標)またはＲｉｇ－Ｉリガンドからなる群から選択される、請求項３６に記載の使用または方法。
  39. アジュバントがポリＩ：Ｃアジュバント、ＣｐＧアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＰＣＥＰアジュバントからなる群から選択される、請求項３６に記載の使用または方法。
  40. １用量のタンパク質ベースのワクチンが、対象に少なくとも２回投与される、請求項１～３９の何れかに記載の使用または方法。
  41. １用量のタンパク質ベースのワクチンが、対象に２週毎に１回以下で投与される、請求項４０に記載の使用または方法。
  42. １用量のタンパク質ベースのワクチンが、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した日以降に対象に投与される、請求項１～４１の何れかに記載の使用または方法。
  43. １用量のタンパク質ベースのワクチンが、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量投与と同日に対象に投与する、請求項４２に記載の使用または方法。
  44. １用量のタンパク質ベースのワクチンが、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量投与後１か月以内に対象に投与する、請求項１～４２の何れかに記載の使用または方法。
  45. １用量のタンパク質ベースのワクチンが、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量投与後３か月以内に対象に投与する、請求項１～４２の何れかに記載の使用または方法。
  46. 対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定される、請求項１～４５の何れかに記載の使用または方法。
  47. 対象の血清のＨＢｅＡｇレベルが、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定される、請求項１～４５の何れかに記載の使用または方法。
  48. 対象の血清のＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルが、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定される、請求項１～４５の何れかに記載の使用または方法。
  49. 核酸ベースのワクチンが、第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントをコードする少なくとも一つの発現ベクター構築物を含む、請求項１～４５の何れかに記載の使用または方法。
  50. 少なくとも一つの発現構築物が、第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの発現を促進するプロモーターを含む、請求項４９に記載の使用または方法。
  51. 少なくとも一つの発現構築物が、第一および第二プロモーターを含み、第一プロモーターは第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの発現を促進し、第二プロモーターは第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの発現を促進する、請求項４９に記載の使用または方法。
  52. 少なくとも一つのプロモーターが、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＰＨ５プロモーターおよびＨ１プロモーターからなる群から選択される、請求項５０または５１に記載の使用または方法。
  53. 発現構築物が、ウイルスベクターを含む、請求項１～５２の何れかに記載の使用または方法。
  54. ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター；レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；乳頭腫ウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；ポックスウイルスベクター、オルソポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ(ＭＶＡ)ベクター、トリポックスベクター、カナリアポックスベクター、鶏痘ベクターおよびエプスタイン・バーウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５３に記載の使用または方法。
  55. ウイルスベクターが、ＭＶＡベクターである、請求項５３に記載の使用または方法。
  56. 対象に投与される核酸ベースのワクチンの１用量が、１０６～１０１０ 組織培養感染量(ＴＣＩＤ５０)；または１０６～１０９ ＴＣＩＤ５０；または１０６～１０８ ＴＣＩＤ５０のＴＣＩＤ５０を含む、請求項１～５５の何れかに記載の使用または方法。
  57. 核酸ベースのワクチンの１用量が、タンパク質ベースのワクチンの最終用量が対象に投与された後２週間以降に対象に投与される、請求項１～５６の何れかに記載の使用または方法。
  58. 少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤投与後の対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、核酸ベースのワクチンの１用量の投与前に決定される、請求項１～５７の何れかに記載の使用または方法。
  59. 第１用量の核酸ベースのワクチンが、対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが少なくとも１用量のタンパク質ベースのワクチン投与後少なくとも０.５log 10IU/mlまでさらに減少したときに対象に投与される、請求項１～５８の何れかに記載の使用または方法。
  60. 単回用量の核酸ベースのワクチンを対象に投与する、請求項１～５９の何れかに記載の使用または方法。
  61. ヌクレオチ(シ)ドアナログを対象に投与することをさらに含む、請求項１～６０の何れかに記載の使用または方法。
  62. 少なくとも１用量のヌクレオチ(シ)ドアナログが対象へのＲＮＡｉ剤の投与前に対象に投与されるか；または複数用量のヌクレオチ(シ)ドアナログが対象に投与される、請求項６１に記載の使用または方法。
  63. ヌクレオチ(シ)ドアナログがテノホビル ジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド(ＴＡＦ)、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファおよびガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)およびテノホビル－エクサリエード(ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７)からなる群から選択される、請求項６１または６２に記載の使用または方法。
  64. 対象における血清ＨＢｓＡｇレベルが、ＲＮＡｉ剤投与前に３０００IU／ml未満、４０００IU／ml未満または５０００IU／ml未満である、請求項１～６３の何れかに記載の使用または方法。
  65. 対象における血清ＨＢｓＡｇレベルが、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なくとも６か月、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する、請求項１～６４の何れかに記載の使用または方法。
  66. 対象における血清ＨＢｅＡｇレベルが、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なくとも６か月間、臨床アッセイを使用する検出レベル未満に減少している、請求項１～６４の何れかに記載の使用または方法。
  67. 対象における血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルが、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なくとも６か月間、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少している、請求項１～６４の何れかに記載の使用または方法。
  68. 免疫刺激剤を対象に投与することさらに含む、請求項１～６７の何れかに記載の使用または方法。
  69. 免疫刺激剤が、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ｂ、インターフェロンラムダ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９)アゴニスト、ウイルス侵入阻害剤、Myrcludex、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、ＲＥＰ ９ＡＣ、カプシド阻害剤、Ｂａｙ４１－４１０９、ＮＶＲ－１２２１、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＩＨＶＲ－２５)、ウイルスカプシド、ＭＶＡカプシド、免疫チェックポイント制御因子、ＣＴＬＡ－４阻害剤、イピリムマブ、ＰＤ－１阻害剤、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＢＧＢ－Ａ３１７抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブおよびアフィマー生物学的製剤からなる群から選択される、請求項６８に記載の使用または方法。
  70. 対象がヒトである、請求項１～６９の何れかに記載の使用または方法。
  71. ＲＮＡｉ剤が、４つのＨＢＶ転写物の発現を阻害する、請求項１～７０の何れかに記載の使用または方法。
  72. ＲＮＡｉ剤が、少なとも３つのＨＢＶ転写物の発現を阻害する、請求項１～７０の何れかに記載の使用または方法。
  73. ＲＮＡｉ剤が、付属書Ａの何れかにおけるＲＮＡｉ剤から選択される、請求項１～７２の何れかに記載の使用または方法。
  74. ＲＮＡｉ剤が、付属表Ａの表２～１１の何れかにおけるＲＮＡｉ剤から選択される、請求項７３に記載の使用または方法。
  75. ＲＮＡｉ剤が、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド１５７９～１５９７、２０６～２２８、２０７～２２９、２１０～２３２、２１２～２３４、２１４～２３６、２１５～２３７、２１６～２３８、２２６～２４８、２４５～２６７、２５０～２７２、２５２～２７４、２５３～２７５、２５４～２７６、２５６～２７８、２５８～２８０、２６３～２８５、３７０～３９２、３７３～３９５、３７５～３９７、４０１～４２３、４０５～４２７、４１０～４３２、４１１～４３３、４２２～４４４、４２４～４４６、４２５～４４７、４２６～４４８、７３１～７５３、７３４～７５６、１１７４～１１９６、１２５０～１２７２、１２５５～１２７７、１２５６～１２７８、１５４５～１５６７、１５４７～１５６９、１５５１～１５７１、１５７７～１５９７、１５８０～１５９８、１８０６～１８２５、１８１２～１８３１、１８１４～１８３６、１８２９～１８５１、１８３１～１８５３、１８５７～１８７９、１８６４～１８８６、２２５９～２２８１、２２９８～２３２０または２８２８～２８５０の少なくとも１５連続ヌクレオチドを標的とする、請求項１～７４の何れかに記載の使用または方法。
  76. ＲＮＡｉ剤が、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド１５７９～１５９７または１８１２～１８３１の少なくとも１５連続ヌクレオチドを標的とする、請求項１～７５の何れかに記載の使用または方法。
  77. ＲＮＡｉ剤が、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド１５７９～１５９７または１８１２～１８３１を標的とする、請求項１～７５の何れかに記載の使用または方法。
  78. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－UGUGAAGCGAAGUGCACACUU－３’(配列番号２５)または５’－AGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU－３’(配列番号２６)のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項７５に記載の使用または方法。
  79. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－UGUGAAGCGAAGUGCACACUU－３’(配列番号２５)または５’－AGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU－３’(配列番号２６)のヌクレオチド配列の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む、請求項７５に記載の使用または方法。
  80. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－UGUGAAGCGAAGUGCACACUU－３’(配列番号２５)または５’－AGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU－３’(配列番号２６)のヌクレオチド配列を含む、請求項７５に記載の使用または方法。
  81. ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、５’－GUGUGCACUUCGCUUCACA－３’(配列番号２７)または５’－CACCAUGCAACUUUUUCACCU－３’(配列番号２８)のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項７５～８０の何れかに記載の使用または方法。
  82. ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、５’－GUGUGCACUUCGCUUCACA－３’(配列番号２７)または５’－CACCAUGCAACUUUUUCACCU－３’(配列番号２８)のヌクレオチド配列の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む、請求項７５～８０の何れかに記載の使用または方法。
  83. ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が、５’－GUGUGCACUUCGCUUCACA－３’(配列番号２７)または５’－CACCAUGCAACUUUUUCACCU－３’(配列番号２８)のヌクレオチド配列を含む、請求項７５～８０の何れかに記載の使用または方法。
  84. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－UGUGAAGCGAAGUGCACACUU－３’(配列番号２５)のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖が５’－GUGUGCACUUCGCUUCACA－３’(配列番号２７)のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項７５～７７の何れかに記載の使用または方法。
  85. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－UGUGAAGCGAAGUGCACACUU－３’(配列番号２５)のヌクレオチド配列の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、センス鎖が５’－GUGUGCACUUCGCUUCACA－３’(配列番号２７)のヌクレオチド配列の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む、請求項７５～７７の何れかに記載の使用または方法。
  86. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－UGUGAAGCGAAGUGCACACUU－３’(配列番号２５)のヌクレオチド配列を含み、センス鎖が５’－GUGUGCACUUCGCUUCACA－３’(配列番号２７)のヌクレオチド配列を含む、請求項７５～７７の何れかに記載の使用または方法。
  87. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－AGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU－３’(配列番号２６)のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が５’－CACCAUGCAACUUUUUCACCU－３’(配列番号２８)のヌクレオチド配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項７５～７７の何れかに記載の使用または方法。
  88. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－AGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU－３’(配列番号２６)のヌクレオチド配列の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が５’－CACCAUGCAACUUUUUCACCU－３’(配列番号２８)のヌクレオチド配列の少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む、請求項７５～７７の何れかに記載の使用または方法。
  89. ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、５’－AGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU－３’(配列番号２６)のヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖が５’－CACCAUGCAACUUUUUCACCU－３’(配列番号２８)のヌクレオチド配列を含む、請求項７５～７７の何れかに記載の使用または方法。
  90. 該センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび該アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
    ここで、該センス鎖が、３’末端で結合するリガンドにコンジュゲートする、請求項１～８９の何れかに記載の使用または方法。
  91. リガンドが、単価リンカー、二価分岐リンカーまたは三価分岐リンカーを介して結合した１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項９０に記載の使用または方法。
  92. 該修飾ヌクレオチドの少なくとも一つがデオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン(ｄＴ)ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、ヌクレオチド含有非天然塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１,５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、メチルホスホネート基含有ヌクレオチド、５’－ホスフェート含有ヌクレオチドおよび５’－ホスフェート模倣体含有ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項９１に記載の使用または方法。
  93. ＲＮＡｉ剤の少なくとも一つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  94. ＲＮＡｉ剤の少なくとも一つの鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  95. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対長である、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  96. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対長である、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  97. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１７～２５ヌクレオチド対長である、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  98. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、２３～２７ヌクレオチド対長である、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  99. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１９～２１ヌクレオチド対長である、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  100. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、２１～２３ヌクレオチド対長である、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  101. ＲＮＡｉ剤の各鎖が、１５～３０ヌクレオチド有する、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  102. ＲＮＡｉ剤の各鎖が、１９～３０ヌクレオチド有する、請求項１～９２の何れかに記載の使用または方法。
  103. リガンドが、
    である、請求項９０に記載の使用または方法。
  104. ＲＮＡｉ剤が、下記模式図
    〔式中、ＸはＯまたはＳである。〕
    に示すとおりリガンドにコンジュゲートする、請求項９０に記載の使用または方法。
  105. ＲＮＡｉ剤が、ＡＤ－６６８１０またはＡＤ－６６８１６である、請求項１～７５の何れかに記載の使用または方法。
  106. 第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント、および／または第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが、ＨＢＶの少なくとも４つの遺伝子型に存在する少なくとも一つの決定基を含む、請求項１～１０５の何れかに記載の使用または方法。
  107. 第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント、および／または第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが、ＨＢＶの少なくとも６つの遺伝子型に存在する少なくとも一つの決定基を含む、請求項１～１０５の何れかに記載の使用または方法。
  108. 第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント、および／または第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが、ＨＢＶの少なくとも７つの遺伝子型に存在する少なくとも一つの決定基を含む、請求項１～１０５の何れかに記載の使用または方法。
  109. 第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント、および／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントがＨＢＶの少なくとも４つの遺伝子型に存在する少なくとも一つの決定基を含む、請求項１～１０８の何れかに記載の使用または方法。
  110. 第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント、および／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントがＨＢＶの少なくとも６つの遺伝子型に存在する少なくとも一つの決定基を含む、請求項１～１０８の何れかに記載の使用または方法。
  111. 第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント、および／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントがＨＢＶの少なくとも７つの遺伝子型に存在する少なくとも一つの決定基を含む、請求項１～１０８の何れかに記載の使用または方法。
  112. ＨＢＶ感染を有する対象を処置するためのキットであって
    ａ)少なとも３つのＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；
    ｂ)第一ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第一ＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質ベースのワクチン；および
    ｃ)第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチンであって、
    ここで、第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの少なくとも一つと少なくとも一つのエピトープを共有するワクチン；および
    ｄ)請求項１～１１１の何れかに記載の使用または方法に従い使用するための指示
    を含む、キット。
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