JP2022515778A - 併用ｈｂｖ療法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、併用療法を使用してＨＢＶ感染を処置するための方法、ならびに使用のための関連するキットおよび組成物を提供する。併用療法の成分は、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤またはＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤と、抗ＨＢＶ抗体とを含む。

Description

配列表に関する陳述
本出願と関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、９３０４８５．４０１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１１１ＫＢであり、２０１９年１２月１７日に作成されたものであり、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
世界で４億人が慢性ＨＢＶ感染（ＣＨＢ）を有し、したがって、慢性肝炎、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌（ＨＣＣ）などの重篤な肝疾患を発症するリスクが高く、毎年、推定６００，０００人が死亡する。ＣＨＢを有する患者の長期的研究は、肝硬変を発症する５年累積発生率は、８～２０％の範囲であり、肝代償不全の５年累積発生率は、約２０％である。世界におけるＨＣＣの発生率は増大しており、現在、世界のがん関連死の死因第３位である（El-Serag H.B., and Rudolph K.L., Gastroenterology 132:2557-76 (2007)）。
ＨＢＶは、脂質エンベロープと、ウイルスＤＮＡゲノムおよびＤＮＡポリメラーゼを包含する２０面体ヌクレオカプシドとを有するＤＮＡウイルスである。ＨＢＶカプシドは、ＲＮＡプレゲノム複製複合体のパッケージング中に感染細胞の細胞質ゾル中で形成され、ＨＢｃＡｇとしても知られるコアタンパク質と、その切断変異体であるＨＢｅＡｇとから構成される。ウイルスＤＮＡが新しい細胞への進入時にカプシドから解離する時、それは、ＨＢＶ処置後に肝細胞中に残存し得、感染を再活性化する可能性を有する、共有的に閉鎖された環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変換され得る。脂質エンベロープは、同じオープンリーディングフレームによってコードされるが、異なる開始コドンを使用する３つの別々のタンパク質、Ｓ-ＨＢｓＡｇ（スモール抗原）、Ｍ-ＨＢｓＡｇ（ミドル抗原）、およびＬ-ＨＢｓＡｇ（ラージ抗原）を指す、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含む。ＨＢｓＡｇは、現在利用可能なＢ型肝炎ワクチン中に存在する抗原である。ＨＢＶはまた、腫瘍抑制因子ｐ５３を阻害し、細胞周期進行を促進し、反応性酸素種の産生を増加させるタンパク質ＨＢｘをコードする。
ビリオンの産生に加えて、ＨＢＶはまた、ＨＢＶビリオンの脂質エンベロープを含むが、複製能力がなく、典型的には、ヌクレオカプシドを欠くサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の産生を引き起こす。ＳＶＰは、複製能力を有するビリオンよりも最大で３～４ｌｏｇ過剰に産生され得る。ＳＶＰ上に存在する高レベルのＨＢｓＡｇは、免疫系が慢性Ｂ型肝炎中にＨＢＶ感染を消失させることができないことに寄与するおそらく重要な因子である、ＨＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞応答を疲弊させ得る（Chisari, F.V., et al., Pathologie Biologie 58:258-66 (2010)）。
ＣＨＢ感染の自然の進化は、４つの連続的な段階を含む：（１）高レベルのウイルス複製および最小限の肝臓炎症と関連する、初期の「免疫寛容」段階；（２）有意な肝炎症および血清アミノトランスフェラーゼの上昇と関連する免疫反応段階；一部の患者に関しては、（３）抗ＨＢｅへの血清変換；検出不可能な、または低レベルのウイルス血症（ＰＣＲに基づくアッセイにより２０００ＩＵ／ｍｌ未満）；および肝炎症の消散と関連する「非複製」または「不活性」段階に進行する；一部の個体については、（４）ウイルスの再活性化。ＨＢＶ感染の再活性化は、ＨＢｅＡｇ陰性慢性Ｂ型肝炎として知られる、ＨＢｅＡｇの産生を防止するが、ウイルス複製を阻害しない特定のウイルス突然変異の出現と関連し得る。ＨＢｅＡｇ陰性慢性Ｂ型肝炎（抗ＨＢｅ陽性またはプレコア突然変異肝炎としても知られる）は、流動的な血清ＨＢＶ ＤＮＡおよび血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）レベル、ならびに進行性肝疾患を特徴とする。
ＨＢＶのための現在利用可能な処置の主な目標は、ＨＢＶ複製を永続的に抑制し、肝疾患を改善することである。臨床的に重要な短期的目標は、ＨＢｅＡｇ血清変換の達成、血清ＡＬＴおよびＡＳＴの正常化、肝臓炎症の消散、ならびに肝代償不全の防止を含む。ＨＢＶ処置の究極的な長期的目標は、肝硬変および肝臓がんの発症を防止するための持続的免疫応答を達成し、したがって、生存を延長させることである。現在利用可能なＨＢＶ処置は、感染した肝細胞の核におけるｃｃｃＨＢＶ ＤＮＡの持続性のため、ウイルスを完全に消失させない。しかしながら、血清ＨＢｓＡｇの処置により誘導される消失は、慢性ＨＢＶ感染の終結のマーカーであり、最良の長期的転帰と関連している。
３つの主要なＨＢＶタンパク質（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、およびＨＢｃＡｇ）は全て免疫阻害特性を有するが、ＨＢｓＡｇが、ＨＢＶに感染した対象の循環中のＨＢＶタンパク質の圧倒的多数を占める。さらに、ＨＢｅＡｇの除去（血清変換による）または血清ウイルス血症の低減はＨＢＶ感染除去処置の持続的制御の発生と相関しないが、ＨＢＶ感染における血液からの血清ＨＢｓＡｇの除去（および血清変換）は、ＨＢＶ感染除去処置の制御（しかし、これは免疫療法を受けている少数の患者においてのみ起こる）をもたらすであろう処置に対する抗ウイルス応答のよく認識された予後的指標である。したがって、ＨＢｓＡｇの除去は、ＨＢＶ感染を有する対象における免疫機能のウイルス阻害を克服するための重要な戦略であり得る。
ＨＢＶのための処置の現在の標準的な方法は、インターフェロンまたはサイモシンα１に基づく免疫療法およびＨＢＶポリメラーゼの阻害によるウイルス産生の抑制を含む。ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤は、ウイルス産生の低減において有効であるが、ＨＢｓＡｇの急速な低下には効果が小さいか、効果がないか、または限られた数の患者において長期的な処置と共にＨＢｓＡｇをゆっくりと低下させることができる（テノホビルジソプロキシルフマル酸塩と同様である）。インターフェロンに基づく免疫療法は、小さいパーセンテージの処置対象においてのみであるが、ウイルス産生と、血液からのＨＢｓＡｇの早期除去との両方の低減を達成することができる。血液中でのＨＢｓＡｇの一般的に許容される役割は、抗ＨＢｓＡｇ抗体を隔離し、感染性ウイルス粒子に免疫検出を回避させることであり、これがおそらく、ＨＢＶ感染が慢性状態のままである理由の１つである。さらに、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、およびＨＢｃＡｇは全て免疫阻害特性を有し、ＨＢＶのための現在利用可能な処置のいずれかの投与後の患者の血液中のこれらのウイルスタンパク質の持続性は、おそらく、患者によるそのＨＢＶ感染の免疫学的制御の達成を防止するのに有意な影響を有する。
現在利用可能な処置はいずれも、大きい割合の患者においてＨＢＶの免疫学的制御を回復させない。したがって、大部分の患者においてウイルス複製を阻害する、ならびに免疫学的制御を回復させることができる、ＨＢＶ感染に対する有効な処置の必要性が依然として存在する。
一部の実施形態では、本開示は、対象における慢性ＨＢＶ感染の処置における使用のためのＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を提供し、対象はその後、抗ＨＢＶ抗体を投与される。
本開示はまた、対象における慢性ＨＢＶ感染の処置における使用のためのＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤も提供し、対象はその後、抗ＨＢＶ抗体を投与される。
本開示はまた、（ａ）組成物が、抗ＨＢＶ抗体を含み、対象が遺伝子発現の阻害剤を以前に投与されている；または（ｂ）組成物が、抗ＨＢＶ抗体を含み、対象がＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤と以前に投与されている、対象における慢性ＨＢＶ感染の処置における使用のための組成物を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、慢性ＨＢＶ感染の処置のための医薬の製造における、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤および抗ＨＢＶ抗体の使用を提供する。本開示はまた、慢性ＨＢＶ感染の処置のための医薬の製造における、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤および抗ＨＢＶ抗体の使用も提供する。
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染を処置する方法であって、対象に、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を投与すること；および対象に、抗ＨＢＶ抗体を投与することを含む、方法を提供する。本開示はまた、それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染を処置する方法であって、対象に、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与すること；および対象に、抗ＨＢＶ抗体を投与することを含む、方法も提供する。
本明細書に記載の一部の方法、使用のための組成物、または使用では、抗ＨＢＶ抗体は、ＨＢＣ３４またはＨＢＣ３４の非天然変異体である。
本明細書に記載の一部の方法、使用のための組成物、または使用では、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤またはＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、ＲＮＡｉ剤（例えば、ＨＢＶ０２などのｓｉＲＮＡ）である。
本開示はまた、一部の実施形態では、必要に応じて、本明細書に記載の方法を実施するための使用説明書と共に、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤および抗ＨＢＶ抗体を含むキットも提供する。
図１は、実施例１（Ｅｘａｍｐｅ １）に記載されるようなマウスＨＢＶモデル（ＡＡＶ-ＨＢＶモデル）における併用療法研究の投薬スケジュールを描写する。エンテカビルを１日１回経口的に投与した。ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡを研究の開始に皮下に１回投与し、研究の３～４週目の間に、マウス-キメラ抗ＨＢＶ抗体を週２回腹腔内に投与した。マウスのサブセットを４週目に屠殺し、他のサブセットを研究の６週目に屠殺した。 図２Ａは、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ（四角、実線）；マウス-キメラＨＢＣ３４抗体（ＨＢＣ３４ｖ７、１５ｍｇ／ｋｇ）（丸、実線）；または生理食塩水（三角、実線）を用いて処置したマウスの、ＨＢＶ ＤＮＡコピー数として測定される、マウス血清試料中のＨＢＶウイルス量についてアッセイした結果を描写する。 図２Ｂは、対照ｓｉＲＮＡおよび対照抗体（四角、破線）；エンテカビル単独（「ＥＴＶ」、菱形、破線）；ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびマウス-キメラＨＢＣ３４ｖ７抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）（丸、破線）；またはＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、ＨＢＣ３４ｖ７抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）、およびエンテカビル（三角、実線）を用いて処置したマウスの、ＨＢＶ ＤＮＡコピー数として測定される、マウス血清試料中のＨＢＶウイルス量についてアッセイした結果を描写する。 図３Ａは、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ（四角、実線）；１５ｍｇ／ｋｇのマウス-キメラＨＢＣ３４ｖ７抗体（丸、実線）；または生理食塩水（三角、実線）を用いた処置後のマウス血清から測定されたＨＢｓＡｇレベルを描写する。 図３Ｂは、対照ｓｉＲＮＡおよび対照抗体（四角、破線）；エンテカビル単独（「ＥＴＶ」、菱形、破線）；ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびマウス-キメラＨＢＣ３４ｖ７抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）（丸、破線）；またはＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、マウス-キメラＨＢＣ３４ｖ７抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）、およびエンテカビル（三角、破線）を用いた処置後のマウス血清から測定されたＨＢｓＡｇレベルを描写する。 図４は、ｓｉＲＮＡ投与後１４～４２日目の間のマウス血清から測定された遊離抗体のレベルを描写する。以下の処置群が描写される：マウス-キメラＨＢＣ３４ｖ７抗体単独（丸）；ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、マウス-キメラＨＢＣ３４ｖ７抗体、およびエンテカビル（四角）；ならびにＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびマウス-キメラＨＢＣ３４ｖ７抗体（三角）。 図５Ａは、ｓｉＲＮＡ、抗体、および／または対照処置後の、ＨＢＶ ＤＮＡコピー数として測定される、マウス血清試料中のＨＢＶウイルス量についてアッセイした結果を描写する。-２８日目にマウスにＡＡＶ／ＨＢＶウイルスを注射した。０日目にＡＡＶ／ＨＢＶ感染Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１１の異なる処置の１つを投与した：腹腔内に投与される、（１）ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＢＶ０２、配列番号８のアンチセンス鎖を有する、実施例１における説明を参照）；（２）～（３）２つの用量の１つでの抗ＨＢＶ抗体（完全マウス化ＨＢＣ２４）；（４）～（５）１つの用量でのＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、および２つの用量の１つでの完全マウス化ＨＢＣ２４；（６～９）２つの用量の１つでのＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、および３つの抗体用量の１つでの完全マウス化抗ＨＢＶ抗体ＨＢＣ３４（ＨＢＣ３４ｖ３５）；（１０）対照ｓｉＲＮＡおよび対照抗体；または（１１）ＰＢＳのみ。結果を処置１～５、１０、および１１について示す。 図５Ｂは、ｓｉＲＮＡ、抗体、および／または対照処置後の、ＨＢＶ ＤＮＡコピー数として測定される、マウス血清試料中のＨＢＶウイルス量についてアッセイした結果を描写する。-２８日目にマウスにＡＡＶ／ＨＢＶウイルスを注射した。０日目にＡＡＶ／ＨＢＶ感染Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１１の異なる処置の１つを投与した：腹腔内に投与される、（１）ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＢＶ０２、配列番号８のアンチセンス鎖を有する、実施例１における説明を参照）；（２）～（３）２つの用量の１つでの抗ＨＢＶ抗体（完全マウス化ＨＢＣ２４）；（４）～（５）１つの用量でのＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、および２つの用量の１つでの完全マウス化ＨＢＣ２４；（６～９）２つの用量の１つでのＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、および３つの抗体用量の１つでの完全マウス化抗ＨＢＶ抗体ＨＢＣ３４（ＨＢＣ３４ｖ３５）；（１０）対照ｓｉＲＮＡおよび対照抗体；または（１１）ＰＢＳのみ。結果を処置１および６～１１について示す。 図６Ａは、図５Ａについて上記されるような、ｓｉＲＮＡ、抗体、および／または対照処置後のマウス血清から測定されたＨＢｓＡｇレベルを描写する。 図６Ｂは、図５Ｂについて上記されるような、ｓｉＲＮＡ、抗体、および／または対照処置後のマウス血清から測定されたＨＢｓＡｇレベルを描写する。 図７Ａは、図５Ａについて上記されるような、ｓｉＲＮＡ、抗体、および／または対照処置後のマウス血清から測定されたＨＢｅＡｇレベルを描写する。 図７Ｂは、図５Ｂについて上記されるような、ｓｉＲＮＡ、抗体、および／または対照処置後のマウス血清から測定されたＨＢｅＡｇレベルを描写する。 図８は、抗ＨＢＶ抗体およびＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡを用いた処置後のマウスモデルにおけるＨＢｓＡＧの血清クリアランスおよびウイルス侵入阻害を評価するための投薬スケジュールを含む、実施例３に記載の研究のための実験の設計を示す。初代ヒト肝細胞を移植したＡＡＶ／ＨＢＶ感染ＳＣＩＤマウス（ｎ＝４マウス／処置群）に７つの異なる処置の１つを投与した：（１）ＰＢＳのみ；（２～４）２～３週目の間に週２回腹腔内に投与される、３つの用量の１つでの抗ＨＢＶ抗体（完全マウス化ＨＢＣ３４ｖ３５）；または（５～７）研究の始めに皮下に１回投与されるＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＢＶ０２、配列番号８のアンチセンス鎖を有する、実施例１における説明を参照）、および２～３週目の間に週２回腹腔内に投与される、３つの抗体用量の１つでの完全マウス化ＨＢＣ３４ｖ３５。マウスを６週目に屠殺した。 図９は、ＰＢＳ（対照）；ＨＢＣ３４ｖ３５抗体；またはＨＢＶ３４ｖ３５抗体およびＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡを用いた処置後の初代ヒト肝細胞を移植したＳＣＩＤマウスにおけるマウス中の血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。 図１０は、ＰＢＳ（対照）；ＨＢＣ３４ｖ３５抗体；またはＨＢＶ３４ｖ３５抗体およびＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡを用いた処置後の初代ヒト肝細胞を移植したＳＣＩＤマウスにおけるマウス中の血清ＨＢｓＡｇ濃度を示す。 図１１は、ＰＢＳ（対照）；ＨＢＣ３４ｖ３５抗体；またはＨＢＶ３４ｖ３５抗体およびＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡを用いた処置後の初代ヒト肝細胞を移植したＳＣＩＤマウスにおけるマウス中の血清ＨＢｅＡｇ濃度を示す。 図１２は、ＰＢＳ（対照）；ＨＢＣ３４ｖ３５抗体；またはＨＢＶ３４ｖ３５抗体およびＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡを用いた処置後の初代ヒト肝細胞を移植したＳＣＩＤマウスにおけるマウス中の血清ＨＢｃｒＡｇ濃度を示す。 図１３は、ＨＢＶの処置におけるｓｉＲＮＡ-抗体併用療法の有効性を評価するためのフェーズ２研究のために設計された処置スケジュールを描写する。
本開示は、ＨＢＶタンパク質発現の阻害剤および抗ＨＢＶ抗体を用いたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置における使用のための方法および組成物、ならびに関連するキットを提供する。併用療法を使用して、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を処置することができる。
一部の実施形態では、方法は、（ｉ）対象に、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与すること；および（ｉｉ）対象に、抗ＨＢＶ抗体を投与することによって、それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染を処置することを含む 。特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与した後に低下し、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が低下する場合、抗ＨＢＶ抗体が対象に投与される。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、ＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤である。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶのＸ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害するｓｉＲＮＡ（本明細書では「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」とも称される）である。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪを認識する；および／またはヒト抗体である。特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、ＨＢＣ３４野生型抗体、ＨＢＣ３４抗体の非天然変異体、および／またはＨＢＣ２４抗体から選択される。
本明細書に記載の一部の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤と、抗ＨＢＶ抗体とは、相乗的に働いて、ウイルス量および循環ＨＢｓＡｇを低減させる。この併用療法は、慢性ＨＢＶのための機能的治癒を提供し、抗体誘導性毒性の可能性の低減をもたらす、より低用量の抗体の投与を可能にし得る。
Ｉ．用語集
以下のセクションは、ＨＢＶタンパク質発現の阻害剤；抗ＨＢＶ抗体；抗ＨＢＶ抗体と組み合わせてＨＢＶタンパク質発現の阻害剤を使用して対象を処置する方法；および併用療法と関連するキットを含む、ＨＢＶ併用療法の詳細な説明を提供する。本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することが、その理解に役立ち得る。さらなる定義は、本開示を通して説明される。
本明細書において、用語「約」は、別途指摘しない限り、示される範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
用語「含む（comprise）」は、特許請求の範囲に記載される記述された特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、それが１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分、またはその群の存在または付加を除外しないことを意味する。用語「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲を、特定された材料またはステップおよび特許請求された発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないものに限定する。
本明細書で使用される用語「ａ」および「ａｎ」は、「１つまたは複数」の列挙される成分を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方、またはその任意の組合せを意味すると理解されるべきであり、「および／または」と同義的に使用してもよい。本明細書で使用される場合、用語「含む（include）」および「有する（have）」は同義的に使用され、その用語およびその変形は非限定的と解釈されることが意図される。
単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないものであってもよい。必要に応じて、単語「実質的に」を、本明細書に提供される定義から省略してもよい。
本明細書で使用される用語「疾患」は、全て、正常な機能を損なう、典型的には、兆候および症状を区別することによって明らかになる、ならびにヒトまたは動物の寿命または生活の質の低下を引き起こす、ヒトもしくは動物の身体またはその部分の１つの異常な状態を反映するという点で、用語「障害」および「状態」（医学的状態など）と一般に同義であり、互換的に使用されることが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」ならびにこれらの用語の変化形は、それぞれ、通常のペプチド結合によって、または例えば、アイソステリックペプチドの場合など、改変されたペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２個のアミノ酸を含む、分子、特に、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、または融合タンパク質を含むタンパク質を指す。例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、通常のペプチド結合によって互いに連結された、遺伝子コードによって定義された２０種のアミノ酸から選択されるアミノ酸から構成されていてもよい（「古典的」ポリペプチド）。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、Ｌアミノ酸および／またはＤアミノ酸から構成されていてもよい。特に、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」はまた、非ペプチド構造エレメントを含有するペプチドアナログであって、そのペプチドが、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣する、またはそれに拮抗することができる、ペプチドアナログと定義される「ペプチド模倣物質」も含む。ペプチド模倣物質は、酵素的に切断可能なペプチド結合などの古典的なペプチド特性を欠く。特に、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、これらのアミノ酸に加えて遺伝子コードによって定義される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよいか、またはそれは遺伝子コードによって定義される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されていてもよい。特に、本開示の文脈におけるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は同様に、翻訳後成熟プロセスなどの天然のプロセスによって、または当業者には周知の化学的プロセスによって改変されたアミノ酸から構成されていてもよい。そのような改変は、文献中で完全に詳述されている。これらの改変は、ポリペプチド中のどこにでも：ペプチド骨格中、アミノ酸鎖中、またはカルボキシもしくはアミノ末端にでも出現してもよい。特に、ペプチドまたはポリペプチドはユビキチン化の後に分枝していてもよく、または分枝を有する、もしくは有しない環状であってもよい。この型の改変は、当業者には周知の天然または合成の翻訳後プロセスの結果であってもよい。特に、本開示の文脈における用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はまた、改変されたペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質も含む。例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質改変は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有的固定化、脂質もしくは脂質誘導体の共有的固定化、ホスファチジルイノシトールの共有的固定化、共有的もしくは非共有的架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ＰＥＧ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化（seneloylation）、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸付加、またはユビキチン化を含んでもよい。そのような改変は、文献中で完全に詳述されている（Proteins Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York (1993)；Post-translational Covalent Modifications of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)；Seifter, et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182:626-46 (1990)；およびRattan, et al., Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992)）。したがって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、例えば、リポペプチド、リポタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質などを含む。
本明細書で使用される場合、「（ポリ）ペプチド」は、上で説明されたようなペプチド結合によって連結されたアミノ酸単量体の単鎖を含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、１つまたは複数の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の（ポリ）ペプチド、すなわち、上で説明されたペプチド結合によって連結されたアミノ酸単量体の１つまたは複数の鎖を含む。特定の実施形態では、本開示によるタンパク質は、１、２、３または４つのポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、用語「組換え」（例えば、組換え抗体、組換えタンパク質、組換え核酸など）は、組換え手段によって調製、発現、創出、または単離され、天然には存在しない任意の分子（抗体、タンパク質、核酸、ｓｉＲＮＡなど）を指す。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよい。特定の実施形態では、核酸分子は、二本鎖ＲＮＡである。
本明細書で使用される場合、用語「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」は、互換的に使用され、全てのそのような名称は、子孫を含む。したがって、単語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代対象細胞および移行の回数に関係なく、それに由来する培養物を含む。また、意図的な、または不注意な突然変異のため、全ての子孫がＤＮＡ含量において正確に同一でなくてもよいことが理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する変異体の子孫が含まれる。異なる名称が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
本明細書で使用される場合、用語「配列変異体」とは、配列表に列挙される配列、すなわち、配列番号１～配列番号１０４のいずれかである参照配列と比較して１つまたは複数の変更を有する任意の配列を指す。したがって、用語「配列変異体」は、ヌクレオチド配列変異体およびアミノ酸配列変異体を含む。ヌクレオチド配列の文脈における配列変異体については、参照配列もヌクレオチド配列であるが、アミノ酸配列の文脈における配列変異体については、参照配列もアミノ酸配列である。本明細書で使用される場合、「配列変異体」は、参照配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。配列同一性は通常、別途特定されない限り、参照配列（すなわち、本出願で引用される配列）の完全長に関して算出される。本明細書で言及される場合、同一性パーセンテージを、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって特定されたデフォルトパラメーター［Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス；ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１］を使用するＢＬＡＳＴを使用して決定することができる。核酸（ヌクレオチド）配列の文脈における「配列変異体」は、参照配列中の１つもしくは複数のヌクレオチドが欠失、もしくは置換されているか、または１つもしくは複数のヌクレオチドが参照ヌクレオチド配列の配列中に挿入されている、変更された配列を有する。ヌクレオチドは、本明細書では標準的な１文字の名称（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）によって記載される。遺伝子コードの縮重性のため、ヌクレオチド配列の「配列変異体」は、それぞれの参照アミノ酸配列、すなわち、アミノ酸「配列変異体」中に変化をもたらしても、もたらさなくてもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列変異体は、アミノ酸配列変異体をもたらさない変異体である（すなわち、サイレント突然変異）。しかしながら、「非サイレント」突然変異をもたらすヌクレオチド配列変異体も範囲内にあり、特に、そのようなヌクレオチド配列変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をもたらす。アミノ酸配列の文脈における「配列変異体」は、１つまたは複数のアミノ酸が、参照アミノ酸配列と比較して欠失、置換または挿入されている変更された配列を有する。変更の結果として、そのような配列変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、参照配列の１００アミノ酸あたり、１０個以下の変更、すなわち、欠失、挿入、または置換の任意の組合せを有する変異体配列は、参照配列と「少なくとも９０％同一」である。
非保存的アミノ酸置換を有することが可能であるが、ある特定の実施形態では、置換は保存的アミノ酸置換であり、置換されるアミノ酸は、参照配列中の対応するアミノ酸と類似する構造的または化学的特性を有する。例として、保存的アミノ酸置換は、１つの脂肪族または疎水性アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの、別のものとの置換；１つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンの、別のものとの置換；１つの酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の、別のものとの置換；１つのアミド含有残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンの、別のものとの置き換え；１つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンの、別のものとの置き換え；１つの塩基性残基、例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジンの、別のものとの置き換え；ならびに１つの小さいアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、およびグリシンの、別のものとの置き換えを含む。
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から、１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例としては、リポーター分子または酵素のアミノ酸配列のＮまたはＣ末端への融合が挙げられる。
別途記述しない限り、配列変異体における変更は、それぞれの参照配列の機能、例えば、本発明の場合、それぞれ、ＨＢＶの感染を十分に中和する、またはＨＢＶタンパク質発現を低下させる、抗ＨＢＶ抗体またはＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の配列の機能を無効化しない。そのような機能を無効化することなく、それぞれ、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させることができる決定における指針を、当技術分野で周知のコンピュータープログラムを使用することによって見出すことができる。
本明細書で使用される場合、指定の核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質「に由来する」核酸配列またはアミノ酸配列とは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の起源を指す。一部の実施形態では、特定の配列に由来する核酸配列またはアミノ酸配列は、それが由来するその配列またはその一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、それによって、「本質的に同一」は、上で定義された配列変異体を含む。ある特定の実施形態では、特定のペプチドまたはタンパク質に由来する核酸配列またはアミノ酸配列は、特定のペプチドまたはタンパク質中の対応するドメインに由来する。それにより、「対応する」とは、特に、同じ機能を指す。例えば、「細胞外ドメイン」は、別の「細胞外ドメイン」（別のタンパク質の）に対応するか、または「膜貫通ドメイン」は、別の「膜貫通ドメイン」（別のタンパク質の）に対応する。ペプチド、タンパク質、および核酸の「対応する」部分は、したがって、当業者には同定可能である。同様に、他の配列「に由来する」配列は通常、配列中にその起源を有すると当業者には同定可能である。
一部の実施形態では、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に由来する核酸配列またはアミノ酸配列は、出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（それが由来する）と同一であってもよい。しかしながら、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に由来する核酸配列またはアミノ酸配列はまた、出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（それが由来する）と比較して１つまたは複数の突然変異を有してもよく、特に、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に由来する核酸配列またはアミノ酸配列は、出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（それが由来する）の上記の機能的配列変異体であってもよい。例えば、ペプチド／タンパク質では、１つもしくは複数のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基で置換してもよく、または１つもしくは複数のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失が存在してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「突然変異」は、参照配列、例えば、対応するゲノム配列と比較した、核酸配列および／またはアミノ酸配列中の変化に関する。例えば、ゲノム配列と比較した突然変異は、例えば、（天然に存在する）体細胞突然変異、自然発生的突然変異、例えば、酵素、化学物質、もしくは放射線によって誘導される誘導性突然変異、または部位特異的突然変異誘発（核酸配列および／またはアミノ酸配列中に特異的かつ意図的な変化を作製するための分子生物学的方法）によって得られる突然変異であってもよい。したがって、用語「突然変異」または「突然変異させること」は、例えば、核酸配列またはアミノ酸配列中で、突然変異を物理的に作製することも含むと理解されるべきである。突然変異は、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失、および挿入ならびにいくつかの連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の反転を含む。アミノ酸配列中の突然変異を達成するために、突然変異を、前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中に導入して、（組換え）突然変異ポリペプチドを発現させることができる。例えば、部位特異的突然変異誘発により、１つのアミノ酸をコードする核酸分子のコドンを変更して、異なるアミノ酸をコードするコドンを得ることによって、または例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列を知ることにより、および核酸分子の１つまたは複数のヌクレオチドを突然変異させる必要なくポリペプチドの変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の合成を設計することにより、配列変異体を合成することによって、突然変異を達成することができる。
本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、タンパク質産物のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子を指すことが意図される。コード配列の境界は一般に、通常、ＡＴＧ開始コドンから始まるオープンリーディングフレームによって決定される。
本明細書で使用される場合、用語「発現」とは、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などのポリペプチドの産生に関与する任意のステップを指す。
一部の態様では、本開示は、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤の使用に関する。本明細書で使用される場合、「ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤」は、ＨＢＶ遺伝子が転写され、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤で処理されている第１の細胞または細胞群から単離することができるか、またはその中で検出することができ、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、ＨＢＶ遺伝子の発現が阻害されるような、ＨＢＶ ｍＲＮＡの量の低減によって示される、ＨＢＶ遺伝子の発現の少なくとも部分的な低減をもたらす任意の薬剤である。一部の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。ＨＢＶ遺伝子発現を、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。別途記述しない限り、本明細書で使用される「ＨＢＶ遺伝子発現」は、ｒｔＰＣＲを使用して、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）もしくは免疫組織化学を使用してタンパク質発現を測定することによって決定される。
一部の態様では、本開示は、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤の使用に関する。本明細書で使用される場合、「ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤」とは、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、その薬剤で処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、そのように処理されている第１の細胞または細胞群から単離するか、またはその中で検出することができるＨＢＶ抗原の量の低減をもたらす任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤は、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。抗原量を、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。別途記述しない限り、本明細書で使用される「ＨＢＶ抗原量」は、ＥＬＩＳＡを使用して抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）の量を測定することによって決定される。
本開示は、抗ＨＢＶ抗体を含む、ＨＢＶを処置するための併用療法を提供する。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原ループ領域に結合し、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染を中和する。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、抗体の特有の性質が保持される限り、限定されるものではないが、全抗体、抗体断片、抗原結合断片、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、および遺伝子操作された抗体（変異体または突然変異抗体）などの様々な形態の抗体を包含する。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体および／またはモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、組換えヒトモノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合、用語「抗原結合断片」、「断片」および「抗体断片」は、抗体の抗原結合活性を保持する併用療法の抗体の任意の断片を指すように互換的に使用される。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖが挙げられる。さらに、本明細書で使用される用語「抗体」は、抗体と、その抗原結合断片との両方を含む。
本明細書で使用される場合、「中和抗体」は、宿主における感染を開始させる、および／または永続させる病原体の能力を中和する、すなわち、防止する、阻害する、低減させる、妨げる、またはそれと干渉することができるものである。用語「中和抗体」および「中和する抗体」または「中和する複数の抗体」は、本明細書では互換的に使用される。これらの抗体を、診断手段としての能動的ワクチン接種と関連して、適切な製剤化時に予防剤もしくは治療剤として、または本明細書に記載の生産手段として、単独で、または組み合わせて使用することができる。
ヒト抗体は、技術水準において周知である（van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. C, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-74 (2001)）。免疫化時に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーまたは選択したヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）中でヒト抗体を産生させることもできる。そのような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-55 (1993)；Jakobovits, A., et al., Nature 362:255-258 (1993)；Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7:3340 (1993)を参照されたい）。ヒト抗体を、ファージディスプレイライブラリー中で産生させることもできる（Hoogenboom, H. R., and Winter, G., Mol. Biol. 227:381-88 (1992)；Marks, J. D., et al., Mol Biol. 222:581-97 (1991)）。Cole, et al. およびBoerner, et al.の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner, P., et al., Immunol. 147:86-95 (1991)）。一部の実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、Traggiai, E., et al. (Nat Med. 10(8):871-5 (2004))に記載されたような改良されたＥＢＶ-Ｂ細胞不死化を使用することによって調製される。本明細書で使用される用語「ヒト抗体」はまた、例えば、本明細書に記載の特性を生成するために可変領域において改変されたそのような抗体も含む。
併用療法の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわち、κ、γ、またはμ重鎖）のものであってよいが、ある特定の実施形態では、抗体はＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであってもよい。特定の実施形態では、抗体はＩｇＧ１である。併用療法の抗体は、κまたはλ軽鎖を有してもよい。ＩｇＧ型のＨＢｓＡｇ特異的抗体は、有利には、肝細胞中へのＦｃＲＮ-ＩｇＧ受容体を介するＩｇＧの抗原非依存的取込みに基づいて、感染細胞からのＨＢＶおよびＨＢｓＡｇの放出を遮断することもできる。したがって、ＩｇＧ型のＨＢｓＡｇ特異的抗体は、細胞内で結合し、それによって、ＨＢＶビリオンおよびＨＢｓＡｇの放出を遮断することができる。
本明細書で使用される場合、用語「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）およびフレームワーク領域（「ＦＲ」）を含み、抗体の抗原への結合に直接関与する抗体軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）の一部（典型的には、成熟抗体重鎖または軽鎖の約１０５～１２０アミノ末端アミノ酸）を意味する。用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、抗原特異性および／または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非連続的配列を指すことが当技術分野で公知である。一般に、免疫グロブリン結合タンパク質のそれぞれの可変領域中には、３つのＣＤＲが存在する；例えば、抗体については、ＶＨおよびＶＬ領域は一般に、６つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３；ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）を含む。免疫グロブリン配列を、同等の残基位置に注釈を付け、Ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＮＡＲＣＩ）ソフトウェアツール（Bioinformatics 15:298-300 (2016)）を使用して異なる分子を比較することができる番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、ＥＵ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）およびＡｈｏ）に整列させることができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）、またはその両方の全部または部分を含んでもよいことが理解されるであろう。例えば、完全長インタクトＩｇＧ抗体単量体は、典型的には、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＬ、およびＣＬを含む。
ある特定の実施形態では、本開示による、併用療法の抗ＨＢＶ抗体、またはその抗原結合断片は、精製抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである。したがって、併用療法の抗体は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、組換え抗体、および／または精製抗体であってもよい。本開示はまた、抗体の断片、特に、抗体の抗原結合活性を保持する断片も提供する。そのような断片としては、限定されるものではないが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖが挙げられる。一部の場所では、本開示は、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体および／または誘導体を明示的に指してもよいが、本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「併用療法の抗体」は、全てのカテゴリーの抗体、すなわち、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体、および誘導体を含む。
ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化を含む方法により、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断により、抗体の断片を、抗体から取得することができる。あるいは、重鎖または軽鎖の配列の部分のクローニングおよび発現によって、抗体の断片を取得することができる。本開示はまた、本開示の抗体の重鎖および軽鎖に由来する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も包含する。例えば、本開示は、本開示の抗体に由来するＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖または軽鎖単量体および二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、ならびに単鎖抗体、例えば、重鎖および軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによって結合された単鎖Ｆｖも含まれる。
本開示の抗体断片は、一価または多価相互作用を与えてもよく、上記の様々な構造中に含まれていてもよい。例えば、ｓｃＦｖ分子を合成して、三価の「トリアボディ」または四価の「テトラボディ」を作出することができる。ｓｃＦｖ分子は、二価ミニボディをもたらすＦｃ領域のドメインを含んでもよい。さらに、抗体／抗体断片の配列は、配列が本明細書に記載のエピトープを標的とし、多特異性分子の他の領域が他の標的に結合する多特異性分子の成分であってもよい。例示的な多特異性分子としては、限定されるものではないが、二特異性Ｆａｂ２、三特異性Ｆａｂ３、二特異性ｓｃＦｖ、およびダイアボディが挙げられる（Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 9:1126-36 (2005)）。
本開示による抗体を、精製された形態で提供することができる。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、例えば、９０％未満（重量で）、通常は６０％未満、より通常は５０％未満の組成物が他のポリペプチドから構成される。
本開示の抗体および抗原結合断片は、実施形態では、多特異性（例えば、二特異性、三特異性、四特異性など）であってよく、本明細書に開示されるように、任意の多特異性形式で提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、二特異性または三特異性抗体などの多特異性抗体である。二特異性抗体のための形式は、例えば、二特異性形式およびそれを作製する方法が参照により本明細書に組み込まれる、Spiess, et al. (Mol. Immunol. 67(2):95 (2015))、およびBrinkmann and Kontermann (mAbs 9(2):182-212 (2017))に開示されており、例えば、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、ＤＡＲＴ、ノブイントゥーホール（ＫＩＨ）アセンブリ、ｓｃＦｖ-ＣＨ３-ＫＩＨアセンブリ、ＫＩＨ共通軽鎖抗体、ＴａｎｄＡｂ、トリプルボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、Ｆａｂ-ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ-ＣＨ-ＣＬ-ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２-ｓｃＦｖ２、四価ＨＣａｂ、イントラボディ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）（２イン１または４イン１）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ-ＩｇＧ、チャージペア、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤボディ、トリオマブ、ＬＵＺ-Ｙアセンブリ、Ｆｃａｂ、κλボディ、直交Ｆａｂ、ＤＶＤ-ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）-ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ-（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）-ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ-（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）-Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）-Ｖ、Ｖ（Ｈ）-ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）-Ｖ、Ｖ（Ｌ）-ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ-ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ-ＩｇＧ、ＩｇＧ-２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４-Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、およびＤＶＩ-ＩｇＧ（４イン１）が挙げられる。二特異性または多特異性抗体は、本開示のＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ特異的結合ドメインと共に、本開示の別のそのような結合ドメイン、またはＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶに特異的に結合する（例えば、同じか、もしくは異なるエピトープで）異なる結合ドメインと共に、または異なる抗原に特異的に結合する結合ドメインを含んでもよい。
本明細書で使用される用語「ワクチン」は、典型的には、少なくとも１つの抗原または免疫原を提供する予防または治療材料であると理解される。抗原または免疫原は、ワクチン接種にとって好適である任意の材料に由来してもよい。例えば、抗原または免疫原は、細菌もしくはウイルス粒子などの病原体、または腫瘍もしくはがん性組織に由来してもよい。抗原または免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答を提供する。特に、「抗原」または「免疫原」とは、典型的には、免疫系（例えば、適応免疫系）によって認識され、例えば、適応免疫応答の部分として抗体および／または抗原特異的Ｔ細胞の形成によって抗原特異的免疫応答を誘発することができる物質を指す。典型的には、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチドまたはタンパク質であってよいか、またはそれを含んでもよい。
用量は、体重との関連で表されることが多い。したがって、［ｇ、ｍｇ、または他の単位］／ｋｇ（またはｇ、ｍｇなど）として表される用量は通常、用語「体重」が明示的に記載されていない場合であっても、「体重１ｋｇ（またはｇ、ｍｇなど）あたり」の［ｇ、ｍｇ、または他の単位］を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶ」と互換的に使用される「Ｂ型肝炎ウイルス」は、ヘパドナウイルス科に属する周知の非細胞変性の肝臓指向性ＤＮＡウイルスを指す。ＨＢＶゲノムは、４つの重複する読み枠（本明細書では「遺伝子」、「オープンリーディングフレーム」または「転写物」と呼んでもよい）：Ｃ、Ｘ、Ｐ、およびＳを有する部分的に二本鎖の、環状ＤＮＡである。コアタンパク質は、遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によってコードされる。Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、プレコア（プレ-Ｃ）タンパク質のタンパク質分解プロセッシングによって産生される。ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子Ｐによってコードされる。遺伝子Ｓは、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、ラージ、ミドル、およびスモールＳ抗原と呼ばれる３つの異なるサイズのポリペプチド、プレ-Ｓ１＋プレ-Ｓ２＋Ｓ、プレ-Ｓ２＋Ｓ、またはＳをもたらす、インフレームの３個の「開始」（ＡＴＧ）コドンを含有する１つの長いオープンリーディングフレームである。ＨＢＶのエンベロープの装飾に加えて、表面抗原は、ビリオン粒子と比較して大過剰に産生されるサブウイルス粒子の部分でもあり、免疫寛容および抗ＨＢｓＡｇ抗体の隔離において役割を果たし、それによって、感染性粒子に免疫検出を回避させる。遺伝子Ｘによってコードされる非構造タンパク質の機能は、完全には理解されていないが、それは、転写トランス活性化および複製において役割を果たし、肝臓がんの発症と関連している。Ａ～Ｈと指定される、ＨＢＶの８つの遺伝子型が決定されており、それぞれ異なる地理的分布を有する２つのさらなる遺伝子型ＩおよびＪが提唱されている。用語「ＨＢＶ」は、ＨＢＶの遺伝子型のいずれか（Ａ～Ｊ）を含む。ＨＢＶゲノムの参照配列の完全なコード配列を、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２１３２６５８４およびＧＩ：３５８２３５７に見出すことができる。Ｃ、Ｘ、Ｐ、およびＳタンパク質のアミノ酸配列を、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＹＰ＿００９１７３８５７．１（Ｃタンパク質）；ＹＰ＿００９１７３８６７．１およびＢＡＡ３２９１２．１（Ｘタンパク質）；ＹＰ＿００９１７３８６６．１およびＢＡＡ３２９１３．１（Ｐタンパク質）；ならびにＹＰ＿００９１７３８６９．１、ＹＰ＿００９１７３８７０．１、ＹＰ＿００９１７３８７１．１、およびＢＡＡ３２９１４．１（Ｓタンパク質）に見出すことができる。ＨＢＶ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公共的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＯＭＩＭを使用して容易に入手可能である。Ｂ型肝炎ウイルス株データに関する国際リポジトリに、http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.phpでアクセスすることができる。本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶ」はまた、ＨＢＶゲノムの天然に存在するＤＮＡ配列変異、すなわち、遺伝子型Ａ～Ｊおよびその変異体を指す。
ＩＩ．ＨＢＶタンパク質発現の阻害剤および送達システム
本開示は、ＨＢＶを処置するための併用療法における使用のためのＨＢＶタンパク質発現の阻害剤を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、ＲＮＡｉ剤である。本明細書で使用される用語「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡｉ剤」とは、その用語が本明細書に定義される通り、ＲＮＡを含有し、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路によってＲＮＡ転写物の標的化された切断を媒介する薬剤を指す。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶ遺伝子の発現の阻害をもたらす。
一態様では、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を指令する一本鎖ＲＮＡを含む。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、植物および無脊椎動物細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、 Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼ（Sharp, et al., Genes Dev. 15:485 (2001)）によってｓｉＲＮＡに切断される。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基の３’突出部を有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセッシングする（Bernstein, et al., Nature 409:363 (2001)）。次いで、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、そこで、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖に標的認識を誘導させる（Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001)）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時に、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼは標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Elbashir, et al, Genes Dev. 15:188 (2001)）。したがって、一態様では、本明細書に記載の技術は、標的遺伝子のサイレンシングを行うためにＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡに関する。
用語「サイレンシングする」、「～の発現を阻害する」、「～の発現を下方調節する」、「～の発現を抑制する」などは、それらがＨＢＶ遺伝子を指す限りにおいて、本明細書では、ＨＢＶ遺伝子が転写され、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤で処理された第１の細胞または細胞群から単離するか、またはその中で検出することができ、そのように処理されていない第１の細胞または細胞群（対照細胞）と実質的に同一の第２の細胞または細胞群と比較して、ＨＢＶ遺伝子の発現が阻害されるＨＢＶ ｍＲＮＡの量の低減によって示されるように、ＨＢＶ遺伝子の発現の少なくとも部分的な低減を指す。阻害の程度を、例えば、対照細胞中でのｍＲＮＡ発現の程度-処理された細胞中でのｍＲＮＡ発現の程度との差異として測定することができる。あるいは、阻害の程度を、ＨＢＶ遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、ＨＢＶ遺伝子によってコードされるタンパク質の量、またはある特定の表現型、例えば、ＨＢＶ感染、ＨＢＶタンパク質発現などのＨＢＶ感染表現型（Ｂ型肝炎表面抗原、ＨＢｓＡｇなど）、またはＨＢＶ遺伝子発現を反映する細胞遺伝子発現の変化（例えば、Ｓｍｃ５／６の発現および局在化）を示す細胞数の低減を単位として与えることができる。阻害の程度を、ＨＢＶ ＲＮＡ発現を反映するリポーター遺伝子を発現するように操作された細胞を使用して測定することもできる。原理的には、ＨＢＶ遺伝子サイレンシングを、ＨＢＶ遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、ＨＢＶ感染細胞またはＨＢＶ遺伝子を発現するように操作された細胞中で、任意の適切なアッセイによって決定することができる。
細胞もしくは細胞群によって発現されるＨＢＶ ＲＮＡのレベル、または循環ＨＢＶ ＲＮＡのレベルを、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７７３２１Ａ１の実施例２および米国特許出願番号ＵＳ２０１７／０３４９９００Ａ１に提供されたｒｔＰＣＲ法などの、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定することができ、それらの方法は参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、試料中のＨＢＶ遺伝子の発現（例えば、総ＨＢＶ ＲＮＡ、ＨＢＶ転写物、例えば、ＨＢＶ ３．５ｋｂ転写物）のレベルは、転写されるポリヌクレオチド、またはその一部、例えば、ＨＢＶ遺伝子のＲＮＡを検出することによって決定される。例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））、またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することを含む、ＲＮＡ抽出技術を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを使用する典型的なアッセイ形式としては、核ラン-オンアッセイ、ＲＴ-ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035）、ノーザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ＨＢＶ ｍＲＮＡを、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１７７９０６Ａ１および米国特許出願番号ＵＳ２０１４／０２７５２１１Ａ１に記載された方法を使用して検出することができ、それらの方法は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＨＢＶ遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。配列の標的部分は、その部分で、またはその近くでＲＮＡｉにより指令される切断のための基質として働くのに少なくとも十分な長さであろう。例えば、標的配列は、一般に、９～３６ヌクレオチド長、例えば、その間の全ての下位範囲を含む、１５～３０ヌクレオチド長であろう。非限定例として、標的配列は、１５～３０ヌクレオチド、１５～２６ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１５～２２ヌクレオチド、１５～２１ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、１５～１９ヌクレオチド、１５～１８ヌクレオチド、１５～１７ヌクレオチド、１８～３０ヌクレオチド、１８～２６ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、１８～２１ヌクレオチド、１８～２０ヌクレオチド、１９～３０ヌクレオチド、１９～２６ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、１９～２２ヌクレオチド、１９～２１ヌクレオチド、１９～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、２０～２５ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド、２０～２３ヌクレオチド、２０～２２ヌクレオチド、２０～２１ヌクレオチド、２１～３０ヌクレオチド、２１～２６ヌクレオチド、２１～２５ヌクレオチド、２１～２４ヌクレオチド、２１～２３ヌクレオチド、または２１～２２ヌクレオチドであってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「配列を含む鎖」とは、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、また、別途指摘しない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合の用語「相補的」とは、当業者によって理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であってよく、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間、次いで、洗浄を含んでもよい。生物の内部で遭遇し得る生理的に関連する条件などの他の条件も適用できる。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用による２つの配列の相補性の試験にとって最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
ＲＮＡｉ剤内、例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対形成を含む。そのような配列を、本明細書では互いに関して「完全に相補的」と称してもよい。しかしながら、本明細書において第１の配列が、第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であってもよいか、またはそれらは、その最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の阻害と最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二重鎖のためのハイブリダイゼーション時に、１つもしくは複数であるが、一般的には、５、４、３もしくは２つ以下のミスマッチした塩基対を形成することができる。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に、１つまたは複数の一本鎖突出部を形成するように設計される場合、そのような突出部は、相補性の決定に関してミスマッチと見なされるべきではない。例えば、２１ヌクレオチド長のある１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む場合、本明細書に記載の目的のために依然として「完全に相補的」と称することができる。
本明細書で使用される場合、「相補」配列は、ハイブリダイズするその能力に関して上記要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対ならびに／または非天然および改変ヌクレオチドから形成される塩基対を含むか、またはそれから全体として形成されていてもよい。そのような非ワトソン・クリック塩基対としては、限定されるものではないが、Ｇ：Ｕ ＷｏｂｂｌｅまたはＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対が挙げられる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、その使用の文脈から理解されるように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間でマッチする塩基に関して使用することができる。
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも部分と「実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＨＢＶタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＨＢＶ ｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的である場合、ＨＢＶ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
ａ．ｓｉＲＮＡ
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ｓｉＲＮＡを含む。本明細書で使用される場合、用語「ｓｉＲＮＡ」とは、標的ＲＮＡに関して「センス」および「アンチセンス」の向きと称される、２つの逆平行の、実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を有するＲＮＡ分子または分子の複合体を含むＲＮＡｉを指す。二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路によって所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さのものであってよいが、典型的には、９～３６塩基対の長さの範囲で、例えば、１５～３０塩基対の長さであろう。９～３６塩基対の二重鎖を考慮すると、二重鎖は、この範囲内の任意の長さ、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６および限定されるものではないが、１５～３０塩基対、１５～２６塩基対、１５～２３塩基対、１５～２２塩基対、１５～２１塩基対、１５～２０塩基対、１５～１９塩基対、１５～１８塩基対、１５～１７塩基対、１８～３０塩基対、１８～２６塩基対、１８～２３塩基対、１８～２２塩基対、１８～２１塩基対、１８～２０塩基対、１９～３０塩基対、１９～２６塩基対、１９～２３塩基対、１９～２２塩基対、１９～２１塩基対、１９～２０塩基対、２０～３０塩基対、２０～２６塩基対、２０～２５塩基対、２０～２４塩基対、２０～２３塩基対、２０～２２塩基対、２０～２１塩基対、２１～３０塩基対、２１～２６塩基対、２１～２５塩基対、２１～２４塩基対、２１～２３塩基対、および２１～２２塩基対を含む、それらの間の任意の下位範囲であってもよい。Ｄｉｃｅｒおよび同様の酵素によるプロセッシングによって細胞中で生成されるｓｉＲＮＡは一般に、１９～２２塩基対の長さの範囲にある。用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」はまた、上記のｓｉＲＮＡを指すように本明細書では同義的に使用される。
ｓｉＲＮＡの二重鎖領域の一方の鎖は、標的ＲＮＡの領域と実質的に相補的である配列を含む。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、少なくとも１つの自己相補領域を有する単一のＲＮＡ分子に由来してもよいか、または２つ以上の別々のＲＮＡ分子から形成させることができる。二重鎖領域が単一分子の２つの鎖から形成される場合、その分子は、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成する対応する他方法鎖の５’末端との間にヌクレオチドの一本鎖によって隔てられた二重鎖領域（本明細書では「ヘアピンループ」と称される）を有してもよい。ヘアピンループは、少なくとも１つの非対ヌクレオチドを含んでもよい；一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個以上の非対ヌクレオチドを含んでもよい。ｓｉＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が別々のＲＮＡ分子によって含まれる場合、これらの分子は、必要ではないが、共有的に接続されていてもよい。２つの鎖がヘアピンループ以外の手段によって共有的に接続される場合、接続構造は、「リンカー」と称される。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列と実質的に相補的である領域を含む、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｓｉＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される場合、用語「相補性領域」とは、配列、例えば、本明細書で定義される標的配列と実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的ではない場合、ミスマッチは、分子の内部または末端領域中にあってもよい。
一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域中に、例えば、５’および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
本明細書で使用される場合、用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」とは、その用語が本明細書に定義されるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むＲＮＡｉの鎖を指す。
別の態様では、薬剤は、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡ分子は、標的と相補的な１５～３０ヌクレオチドを有してもよい。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子は、本明細書に開示されるアンチセンス配列の１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個以上の連続するヌクレオチドの配列を有してもよい。
当業者であれば、用語「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」が、自然に発現されるか、または見出されるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の１つまたは複数のリボヌクレオチド／リボヌクレオシドアナログまたは誘導体を含むＲＮＡのアナログおよび誘導体も包含することを認識するであろう。厳密に言うと、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基とリボース糖とを含み、「リボヌクレオチド」は、１、２または３つのリン酸部分を含むリボヌクレオシドである。しかしながら、用語「リボヌクレオシド」と「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、等価であると考えてよい。ＲＮＡを、例えば、以下でより詳細に説明されるように、核酸塩基構造において、またはリボース-リン酸骨格構造において改変することができる。しかしながら、リボヌクレオシドアナログまたは誘導体を含むｓｉＲＮＡ分子は、二重鎖を形成する能力を保持する。非限定例として、ＲＮＡ分子はまた、限定されるものではないが、２’-Ｏ-メチル改変ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’-デオキシ-２’-フルオロ改変ヌクレオシド、２’-アミノ改変ヌクレオシド、２’-アルキル改変ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホロアミデート、または非天然塩基を含むヌクレオシドなどの少なくとも１つの改変リボヌクレオシド、またはその任意の組合せを含んでもよい。あるいは、ＲＮＡ分子は、少なくとも２個の改変リボヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個以上で、最大で全長のｓｉＲＮＡ分子を含んでもよい。改変は、ＲＮＡ分子中のそのような複数の改変リボヌクレオシドのそれぞれについて同じである必要はない。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物における使用について企図される改変ＲＮＡは、必要とされる二重鎖構造を形成する能力を有し、ＲＩＳＣ経路による標的ＲＮＡの特異的分解を許容する、または媒介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
一部の実施形態では、改変リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含む。例えば、ＲＮＡｉ剤は、例えば、デオキシヌクレオシド突出部などの１つもしくは複数のデオキシヌクレオシド、またはｓｉＲＮＡの二本鎖部分内の１つもしくは複数のデオキシヌクレオシドを含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される用語「ＲＮＡｉ剤」は、完全にＤＮＡ分子を含まない。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド突出部」とは、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｓｉＲＮＡの二重鎖構造から突出する少なくとも１つの非対ヌクレオチドを指す。例えば、ｓｉＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長する、またはその逆である場合、ヌクレオチド突出部が存在する。ｓｉＲＮＡは、少なくとも１個のヌクレオチドの突出部を含んでもよい；あるいは、突出部は、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド、またはそれより多いヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド突出部は、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含む、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含むか、またはそれからなってもよい。突出部は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその任意の組合せの上にあってもよい。さらに、突出部のヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖の５’末端、３’末端、または両末端上に存在してもよい。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０個のヌクレオチドの突出部を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０個のヌクレオチドの突出部を有する。一部の他の実施形態では、突出部中の１つまたは複数のヌクレオチドは、ヌクレオシド三リン酸で置き換えられる。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１～４個、一般的には、１または２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチド突出部を有する。少なくとも１個のヌクレオチドの突出部を有するｓｉＲＮＡは、その平滑末端の対応物と比較して予想外に優れた阻害特性を有し得る。
ｓｉＲＮＡを参照して本明細書で使用される場合の用語「平滑」または「平滑末端」とは、ｓｉＲＮＡの所与の末端に非対ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが存在しない、すなわち、ヌクレオチド突出部がないことを意味する。ｓｉＲＮＡの一方または両方の末端は、平滑であってもよい。ｓｉＲＮＡの両末端が平滑である場合、ｓｉＲＮＡは「平滑末端」と言われる。「平滑末端」ｓｉＲＮＡは、両末端で平滑である、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチド突出部を有しないｓｉＲＮＡである。ほとんどの場合、そのような分子は、その全長にわたって二本鎖であろう。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の併用療法は、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害する１つまたは複数のＲＮＡｉ剤を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、哺乳動物、例えば、ＨＢＶに感染したヒトにおいてＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するための短い干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）分子を含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、ＨＢＶ遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性領域は、３０ヌクレオチド長以下、一般的には、１９～２４ヌクレオチド長であり、ｓｉＲＮＡは、ＨＢＶ遺伝子を発現する細胞との接触時に、例えば、ＰＣＲもしくは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づく方法、またはウェスタンブロットなどのタンパク質に基づく方法によってアッセイされた場合、ＨＢＶ遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する。ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代培養細胞または対象由来の生体試料中などの、細胞培養物中でのＨＢＶ遺伝子の発現またはＨＢＶ遺伝子発現の代用としての細胞遺伝子（例えば、Ｓｍｃ５／６）の発現を、ｂＤＮＡもしくはＴａｑＭａｎアッセイなどによりＨＢＶ ｍＲＮＡレベルを測定することによって、または例えば、ウェスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などによりタンパク質レベルを測定することによってアッセイすることができる。
ｓｉＲＮＡは、相補的であり、ｓｉＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する２つのＲＮＡ鎖を含む。ｓｉＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列と実質的に相補的である、一般的には、完全に相補的である相補性領域を含む。標的配列は、ＨＢＶ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来してもよい。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖と相補的である領域を含み、好適な条件下で組み合わせた場合、２つの鎖がハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する。一般的には、二重鎖構造は、１５～３０塩基対、より一般的には、１８～２５塩基対、さらにより一般的には、１９～２４塩基対、最も一般的には、１９～２１塩基対の長さである。同様に、標的配列に対する相補性領域は、１５～３０ヌクレオチド、より一般的には、１８～２５ヌクレオチド、さらにより一般的には、１９～２４ヌクレオチド、最も一般的には、１９～２１ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１５～２０ヌクレオチドの長さであり、他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２５～３０ヌクレオチドの長さである。当業者であれば認識できるように、切断のために標的化されたＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子、大抵は、ｍＲＮＡ分子の部分であろう。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉによる切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路による切断）のための基質であるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。９塩基対ほどの短さの二重鎖を有するｓｉＲＮＡは、一部の環境下では、ＲＮＡｉによるＲＮＡ切断を媒介する。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであろう。ある特定の実施形態では、標的は、１５～３０ヌクレオチドの長さである。
また、当業者であれば、二重鎖領域が、ｓｉＲＮＡの主な機能的部分、例えば、９～３６、例えば、１５～３０塩基対の二重鎖領域であることを認識するであろう。したがって、一部の実施形態では、切断のための望ましいＲＮＡを標的とする、例えば、１５～３０塩基対の機能的二重鎖にプロセッシングされるようになる程度で、３０塩基対より大きい二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｓｉＲＮＡである。したがって、当業者であれば、一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡがｓｉＲＮＡであることを認識するであろう。一部の他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡではない。一部の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子の発現を標的化するのに有用なＲＮＡｉ剤は、より大きい二本鎖ＲＮＡの切断によって標的細胞中で生成されない。
本明細書に記載のｓｉＲＮＡを、当技術分野で公知の標準的な方法によって、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているものなどの自動化ＤＮＡ合成装置の使用によって合成することができる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶ ｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害するｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００３９７７．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２１３２６５８４）（配列番号１）に記載のＨＢＶゲノムによってコードされるｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害するｓｉＲＮＡを含む。ＨＢＶゲノムの転写は、ポリシストロン性の重複ＲＮＡをもたらし、したがって、一部の実施形態では、単一のＨＢＶ遺伝子を標的とする併用療法のｓｉＲＮＡは、ＨＢＶ転写物の多く、または全部の発現の有意な阻害をもたらし得る。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的は、Ｐ遺伝子、ＮＣ＿００３９７７．１のヌクレオチド２３０９～３１８２および１～１６２５；Ｓ遺伝子（Ｌ、Ｍ、およびＳタンパク質をコードする）、ＮＣ＿００３９７７のヌクレオチド２８５０～３１８２および１～８３７；Ｘタンパク質、ＮＣ＿００３９７７のヌクレオチド１３７６～１８４０；および／またはＣ遺伝子、ＮＣ＿００３９７７のヌクレオチド１８１６～２４５４によってコードされるｍＲＮＡであってもよい。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＨＢＶのＸ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤またはｓｉＲＮＡは、ＮＣ＿００３９７７．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２１３２６５８４）（配列番号１）のヌクレオチド１５７９～１５９７に対応する、配列ＧＴＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣ（配列番号２）を含むＨＢＶゲノムの一部によってコードされるｍＲＮＡを標的とする。
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、５’-ＧＵＧＵＧＣＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＡＣＡ-３’（配列番号３）を含むセンス鎖と、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）を含むアンチセンス鎖とを有する。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、センス鎖が、配列番号３、または配列番号３と４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４、または配列番号４と４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡを含む。
一態様では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センスおよびアンチセンス配列を含み、それにより、センス配列は配列番号３を含み、対応するアンチセンス配列は配列番号４を含む。この態様では、２つの配列のうちの一方は、２つの配列の他方と相補的であり、一方の配列は、ＨＢＶ遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。そのため、この態様では、ｓｉＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチドが、センス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドが、センス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される、２つのオリゴヌクレオチドを含むであろう。本明細書の他の箇所に記載され、当技術分野で公知のように、ｓｉＲＮＡの相補配列を、別々のオリゴヌクレオチド上にあるのとは反対に、単一の核酸分子の自己相補領域として含有させることもできる。
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、５’-ＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵＵＵＵＡ-３’（配列番号１０６）を含むセンス鎖と、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）を含むアンチセンス鎖とを有する。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、センス鎖が、配列番号１０６、または配列番号１０６と４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み、アンチセンス鎖が、配列番号１０７、または配列番号１０７と４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡを含む。
一態様では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センスおよびアンチセンス配列を含み、それにより、センス配列は配列番号１０６を含み、対応するアンチセンス配列は配列番号１０７を含む。この態様では、２つの配列のうちの一方は、２つの配列の他方と相補的であり、一方の配列は、ＨＢＶ遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。そのため、この態様では、ｓｉＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチドが、センス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドが、センス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される、２つのオリゴヌクレオチドを含むであろう。本明細書の他の箇所に記載され、当技術分野で公知のように、ｓｉＲＮＡの相補配列を、別々のオリゴヌクレオチド上にあるのとは反対に、単一の核酸分子の自己相補領域として含有させることもできる。
当業者であれば、２０～２３塩基対であるが、具体的には、２１塩基対の二重鎖構造を有するｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効であるとして支持されていることをよくわかっている（Elbashir, et al., EMBO 20:6877-88 (2001)）。しかしながら、他者は、より短い、またはより長いＲＮＡ二重鎖構造が同様に有効であり得ることを見出した。上記の実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡは、最小で２１ヌクレオチドの長さの少なくとも１つの鎖を含んでもよい。一部の実施形態では、一方または両方の末端に、配列番号３、配列番号４、配列番号１０６、または配列番号１０７の配列の１つ-わずか数個のヌクレオチドを有するより短い二重鎖は、上記のｓｉＲＮＡと比較して同様に有効である。したがって、配列番号３および配列番号４の一方または両方に由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続するヌクレオチドの部分配列を有し、完全な配列を含むｓｉＲＮＡと、５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下の阻害によってＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するその能力において異なるｓｉＲＮＡが、本明細書に記載の技術に従って企図される。また、本開示の中で、配列番号１０６および配列番号１０７の一方または両方に由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続するヌクレオチドの部分配列を有し、完全な配列を含むｓｉＲＮＡと、５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下の阻害によってＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するその能力において異なるｓｉＲＮＡが、本明細書に記載の技術に従って企図される。
さらに、本明細書で提供されるｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介性切断を受けやすいＨＢＶ遺伝子転写物中の部位を同定する。そのため、本明細書に記載の技術は、そのような配列の１つの中を標的とするＲＮＡｉ剤をさらに特徴とする。本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉがその特定の部位内のどこでも転写物の切断を促進する場合、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とすると言われる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶ遺伝子中の選択された配列と連続する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に結合した、配列番号３および配列番号４の配列の一方または両方に由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶ遺伝子中の選択された配列と連続する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に結合した、配列番号１０６および配列番号１０７の配列の一方または両方に由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。
標的配列は一般に、１５～３０ヌクレオチドの長さであるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を方向付けるためのこの範囲での特定の配列の好適性の広い変動がある。本明細書に記載される様々なソフトウェアパッケージおよび指針は、任意の所与の遺伝子標的のための最適な標的配列の同定のための助言を提供するが、所与のサイズ（非限定例として、２１ヌクレオチド）の「ウィンドウ」または「マスク」が、標的配列として働き得るサイズ範囲の配列を同定するために、標的ＲＮＡ配列上に文字通り、または比喩的に（例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏなど）配置される経験的手法を採ってもよい。最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に次第に配列「ウィンドウ」を動かすことによって、可能な配列の完全なセットが選択された任意の所与の標的サイズについて同定されるまで、次の潜在的な標的配列を同定することができる。最適に機能する配列を同定するための、同定された配列の体系的合成および試験（本明細書に記載の、または当技術分野で公知のアッセイを使用する）と結合した、このプロセスは、ＲＮＡｉ剤を用いて標的化した場合、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定することができる。同等の、またはより良好な阻害特性を有する配列を同定するために、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に次第に「ウィンドウを歩くこと」によって、阻害効率のさらなる最適化を達成することができることが企図される。
さらに、同定されたいずれかの配列、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号１０６、または配列番号１０７について、ヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長い、またはより短い配列を生成すること、およびこれらの配列と、その点から標的ＲＮＡをより長い、またはより短いサイズのウィンドウを上または下に歩くことによって生成された配列とを試験することによって、さらなる最適化を達成することができることが企図される。再度、この手法と、当技術分野で公知の、または本明細書に記載の阻害アッセイにおけるこれらの標的配列に基づくＲＮＡｉ剤の有効性に関する試験を用いた新しい候補標的の生成とのカップリングは、阻害の効率のさらなる改善をもたらすことができる。さらに、そのような最適化された配列を、例えば、発現阻害剤としての分子をさらに最適化するための、本明細書に記載の、もしくは当技術分野で公知の改変ヌクレオチドの導入、突出部における付加もしくは変化、または当技術分野で公知の、および／もしくは本明細書で考察される他の改変（例えば、血清安定性または循環半減期の増大、熱安定性の増大、膜貫通送達の増強、特定の位置または細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増大、エンドソームからの放出の増大など）によって調整することができる。
本明細書に記載のＲＮＡｉ剤は、標的配列に対する１つまたは複数のミスマッチを含有してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤は、３つ以下のミスマッチを含有する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの領域は、相補性領域の中心には位置しない。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチド以内に限定される。例えば、ＨＢＶ遺伝子の領域と相補的である２３ヌクレオチドのＲＮＡｉ剤のＲＮＡ鎖については、ＲＮＡ鎖は、中央の１３ヌクレオチド以内にミスマッチを含有し得ない。本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を使用して、標的配列に対するミスマッチを含有するＲＮＡｉ剤が、ＨＢＶ遺伝子の発現の阻害において有効であるかどうかを決定することができる。特に、ＨＢＶ遺伝子中の特定の相補性領域が多型性配列変異を有することが知られる場合、ＨＢＶ遺伝子の発現の阻害におけるミスマッチを有するＲＮＡｉ剤の有効性の考慮が重要である。
ｂ．化学的に改変されたＲＮＡｉ剤
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｓｉＲＮＡのＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に改変される。本明細書に記載の技術で取り上げられる核酸を、Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L., et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のものなどの、当技術分野でよく確立された方法によって合成および／または改変することができ、それらの方法は参照により本明細書に組み込まれる。
改変は、例えば、（ａ）末端改変、例えば、５’末端改変（リン酸化、コンジュゲーション、逆結合など）、３’末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、（ｂ）塩基改変、例えば、安定化塩基、脱安定化塩基、またはパートナーの拡大レパートリーと塩基対を形成する塩基との置き換え、塩基（脱塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲート化塩基の除去、（ｃ）糖改変（例えば、２’位置もしくは４’位置での）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の改変または置き換えを含む、骨格改変を含む。本明細書に記載の実施形態において有用なＲＮＡ化合物の特定例としては、限定されるものではないが、改変骨格を含有する、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられる。改変骨格を有するＲＮＡとしては、とりわけ、骨格中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的のために、また、当技術分野で時に参照されるように、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有しない改変ＲＮＡを、オリゴヌクレオシドであると考えることもできる。特定の実施形態では、改変ＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有するであろう。
所与の化合物中の全ての位置について均一に改変されている必要はなく、事実、１つを超える上記改変を、単一の化合物中に、またはさらにはＲＮＡｉ剤内の単一のヌクレオシドにおいて組み込むことができる。本明細書に記載の技術はまた、キメラ化合物であるＲＮＡｉ剤化合物も含む。本開示の文脈における「キメラ」ＲＮＡｉ剤化合物または「キメラ」は、それぞれ、少なくとも１個の単量体単位、すなわち、ｓｉＲＮＡ化合物の場合、ヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有する、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤化合物である。これらのＲＮＡｉ剤は、典型的には、ＲＮＡが、ＲＮＡｉ剤に、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を提供するように改変された少なくとも１つの領域を含有する。ＲＮＡｉ剤のさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素のための基質として働くことができる。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のＲＮＡｉ剤阻害の効率を大きく増強させる。結果として、キメラｓｉＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｓｉＲＮＡと比較して、より短いＲＮＡｉ剤を用いて同等の結果を得ることができることが多い。ＲＮＡ標的の切断を、ゲル電気泳動および、必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出することができる。
改変ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’-５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’-５’連結されたアナログ、およびヌクレオシド単位の隣接する対が３’-５’から５’-３’に、または２’-５’から５’-２’に連結された逆転した極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９５号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３１６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，６２５，０５０号；第６，０２８，１８８号；第６，１２４，４４５号；第６，１６０，１０９号；第６，１６９，１７０号；第６，１７２，２０９号；第６，２３９，２６５号；第６，２７７，６０３号；第６，３２６，１９９号；第６，３４６，６１４号；第６，４４４，４２３号；第６，５３１，５９０号；第６，５３４，６３９号；第６，６０８，０３５号；第６，６８３，１６７号；第６，８５８，７１５号；第６，８６７，２９４号；第６，８７８，８０５号；第７，０１５，３１５号；第７，０４１，８１６号；第７，２７３，９３３号；第７，３２１，０２９号；および米国特許第ＲＥ３９，４６４号が挙げられる；これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
リン原子を中に含まない改変ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらのものとしては、モルホリノ結合（一部ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他のものを有するものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号が挙げられる；これらはそれぞれ、そのような調製方法と関連する教示について参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、好適なＲＮＡ模倣物質は、ヌクレオチド単位の、糖と、ヌクレオシド間結合との両方、すなわち、骨格が新しい基で置き換えられた、ＲＮＡｉ剤における使用について企図される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣物質は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号が挙げられる；これらはそれぞれ、そのような調製方法と関連する教示について参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示を、例えば、Nielsen, et al. (Science, 254:1497- 1500 (1991))に見出すことができる。
本明細書に記載の技術で取り上げられる一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡならびにヘテロ原子骨格、特に、米国特許第５，４８９，６７７号の-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｏ-ＣＨ２-［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、および-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-ＣＨ２-［天然のホスホジエステル骨格は-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-で表される］、および米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げられるＲＮＡは、米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
改変ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換された糖部分を含有してもよい。本明細書で取り上げられるＲＮＡｉ剤、例えば、ｓｉＲＮＡは、２’位に、以下： ＯＨ；Ｆ；Ｏ-、Ｓ-、もしくはＮ-アルキル；Ｏ-、Ｓ-、もしくはＮ-アルケニル；Ｏ-、Ｓ-もしくはＮ-アルキニル；またはＯ-アルキル-Ｏ-アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい）の１つを含んでもよい。例示的な好適な改変としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは、１～約１０である）が挙げられる。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２’位に以下：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリルまたはＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、リポーター基、挿入剤、ＲＮＡｉ剤の薬物動態特性を改善するための基、またはＲＮＡｉ剤の薬力学特性を改善するための基、および類似する特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。一部の実施形態では、改変は、２’-メトキシエトキシ（２’-Ｏ-（２-メトキシエチル）または２’-ＭＯＥとしても知られる、２’-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Martin, et al., Helv. Chim. Acta 78:486-504 (1995)）、すなわち、アルコキシ-アルコキシ基を含む。別の例示的な改変は、２’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’-ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’-ジメチルアミノエトキシエトキシ（２＊-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチルまたは２＊-ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２＊-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の例示的な改変は、２’-メトキシ（２’-ＯＣＨ３）、２’-アミノプロポキシ（２-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’-フルオロ（２’-Ｆ）を含む。同様の改変を、ＲＮＡｉ剤のＲＮＡ上の他の位置で、特に、３’末端ヌクレオチド上の、または２’-５’連結されたｓｉＲＮＡ中の糖の３’位で、および５’末端ヌクレオチドの５’位で作製してもよい。ＲＮＡｉ剤は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物質を有してもよい。
そのような改変された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号が挙げられる；これらはそれぞれ、そのような調製方法に関する教示について参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡｉ剤はまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）改変または置換を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「非改変」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）と、ピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）とを含む。改変塩基としては、５-メチルシトシン（５-ｍｅ-Ｃ）、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２-プロピルおよび他のアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミンおよび２-チオシトシン、５-ハロウラシルおよびシトシン、５-プロピニルウラシルおよびシトシン、６-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５-ウラシル（プソイドウラシル）、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチルおよび他の５置換ウラシルおよびシトシン、７-メチルグアニンおよび７-メチルアデニン、８-アザグアニンおよび８-アザアデニン、７-デアザグアニンおよび７-デアザアデニン、ならびに３-デアザグアニンおよび３-デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine (Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, (2008))に開示されたもの；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering (pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons (1990))に開示されたもの、Englisch et al. (Angewandte Chemie, International Edition, 30, 613 (1991))によって開示されたもの、およびSanghvi, Y S. (Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press (1993))によって開示されたものが挙げられる。ある特定のこれらの核酸塩基は、本明細書に記載の技術において取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらのものは、５-置換ピリミジン、６-アザピリミジンならびに２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシルおよび５-プロピニルシトシンを含む、Ｎ-２、Ｎ-６およびＯ-６置換プリンを含む。５-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃で増加させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, pp. 276-278 (1993)）、さらにより具体的には、２’-Ｏ-メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合、例示的な塩基置換である。
ある特定の上記の改変核酸塩基ならびに他の改変核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；第５，７５０，６９２号；第６，０１５，８８６号；第６，１４７，２００号；第６，１６６，１９７号；第６，２２２，０２５号；第６，２３５，８８７号；第６，３８０，３６８号；第６，５２８，６４０号；第６，６３９，０６２号；第６，６１７，４３８号；第７，０４５，６１０号；第７，４２７，６７２号；および第７，４９５，０８８号が挙げられる；これらはそれぞれ、そのような調製方法に関する教示について参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡｉ剤のＲＮＡを、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように改変することもできる。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素とを接続する追加架橋を含む改変リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、３’-エンド構造コンフォメーションにリボースを効率的に「ロックする」。ロックド核酸のｓｉＲＮＡへの付加は、血清中でのｓｉＲＮＡの安定性を増加させること、およびオフターゲット効果を低減させることが示されている（Elmen, J., et al., Nucleic Acids Research 33(l):439-47 (2005)；Mook, O.R., et al., Mol Cane Ther 6(3):833-43 (2007)；Grunweller, A., et al, Nucleic Acids Research 31(12):3185-93 (2003)）。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、以下：米国特許第６，２６８，４９０号；第６，６７０，４６１号；第６，７９４，４９９号；第６，９９８，４８４号；第７，０５３，２０７号；第７，０８４，１２５号；および第７，３９９，８４５号が挙げられる；これらはそれぞれ、そのような調製方法に関する教示について参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、併用療法は、１つまたは複数のアデノシン-グリコール核酸（「ＧＮＡ」）を含むように改変されたｓｉＲＮＡを含む。アデノシン-ＧＮＡの記載を、例えば、Zhang, et al. (JACS 127(12):4174-75 (2005))に見出すことができる。
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡｉが、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡである、方法および関連する組成物を提供する。本明細書で使用される改変核酸配列中でのヌクレオチド単量体に関する省略形を、表１に提供する。
表1：改変核酸配列表示において使用されるヌクレオチド単量体の省略形。別途指摘しない限り、これらの単量体は、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、5'-3'-ホスホジエステル結合によって相互に連結されていることが理解されるであろう。
Figure 2022515778000002

Figure 2022515778000003

一部の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、５’-ｇｓｕｓｇｕＧｆｃＡｆＣｆＵｆｕｃｇｃｕｕｃａｃａＬ９６-３’（配列番号５）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＧｆｓｕｇａＡｆｇＣｆＧｆａａｇｕＧｆｃＡｆｃａｃｓｕｓｕ-３’（配列番号６）を含むアンチセンス鎖とを有する、ｓｉＲＮＡを含む。
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、５’-ｇｓｕｓｇｕＧｆｃＡｆＣｆＵｆｕｃｇｃｕｕｃａｃａＬ９６-３’（配列番号７）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＧｆｓｕｇａ（Ａｇｎ）ｇＣｆＧｆａａｇｕＧｆｃＡｆｃａｃｓｕｓｕ-３’（配列番号８）を含むアンチセンス鎖とを有する。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、センス鎖が、配列番号５もしくは配列番号７、またはそれぞれ、配列番号５もしくは配列番号７と４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡを含む。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンス鎖が、配列番号６もしくは配列番号８、またはそれぞれ、配列番号６もしくは配列番号８と４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、５’-ｇｓｇｓｕｇｇａＣｆｕＵｆＣｆＵｆｃｕｃａＡｆＵｆｕｕｕａＬ９６-３’（配列番号１０８）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＡｆｓａａａＵｆｕＧｆＡｆｇａｇａＡｆｇＵｆｃｃａｃｃｓａｓｃ-３’（配列番号１０９）を含むアンチセンス鎖とを有する、ｓｉＲＮＡを含む。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、センス鎖が、配列番号１０８、または配列番号１０８と４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡを含む。
ｃ．リガンドにコンジュゲートしたＲＮＡｉ剤
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つまたは複数のリガンド、部分、またはコンジュゲートを、ＲＮＡに化学的に連結することを含む改変を含む。そのような部分としては、限定されるものではないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Letsinger, et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA 86:6553-56 (1989)）、コール酸（Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Let. 4:1053-60 (1994)）、チオエーテル、例えば、ベリル-Ｓ-トリチルチオール（Manoharan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:306-9 (1992)；Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Let. 3:2765-70 (1993)）、チオコレステロール（Oberhauser, et al., Nucl. Acids Res. 20:533-38 (1992)）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras, et al., EMBO J 10:1111-18 (1991); Kabanov, et al., FEBS Lett. 259:327-30 (1990); Svinarchuk, et al., Biochimie 75:49-54 (1993)）、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム１，２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロ-３-ホスホネート（Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651-54 (1995); Shea, et al., Nucl. Acids Res. 18:3777-83 (1990)）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan, et al., Nucleosides & Nucleotides 14:969- 73 (1995)）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651-54 (1995)）、パルミチル部分（Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta 1264:229-37 (1995)）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:923-37 (1996)）が挙げられる。
一部の実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたＲＮＡｉ剤の分布、標的化、または寿命を変更させる。一部の実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞、または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞もしくは臓器コンパートメント、組織、臓器、または身体の領域に対する親和性の増強を提供する。そのような実施形態では、リガンドは、二重鎖核酸における二重鎖対形成に参画するであろう。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、もしくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質などの天然に存在する物質を含んでもよい。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの、組換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ-アスパラギン酸、ポリＬ-グルタミン酸、スチレン-無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ-ラクチド-コ-グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、Ｎ-（２-ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２-エチルアクリル酸）、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣物質ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポリフィリン、ポリアミンの第４級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、肝臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含んでもよい。ターゲティング基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ-アセチル-ガラクトサミン、Ｎ-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣物質であってもよい。リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３-ビス-０-（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、０３-（オレオイル）リソコール酸、０３-（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ-４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、およびＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コ-リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であってもよい。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ-アセチル-ガラクトサミン、Ｎ-アセチル-グルコサミン多価マンノース、および多価フコースなどの、非ペプチド種を含んでもよい。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ-ＫＢの活性化因子であってもよい。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間フィラメントを破壊することによって、ＲＮＡｉ剤の細胞中への取込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であってもよい。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド（japlakinolide）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであってもよい。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、肝臓細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、Ｂビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサル、または肝臓細胞などの標的細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤に結合したリガンドは、薬物動態（ＰＫ）モジュレーターとして作用する。本明細書で使用される場合、「ＰＫモジュレーター」とは、薬物動態モジュレーターを指す。ＰＫモジュレーターとしては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リソコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む、短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫモジュレーティングリガンドとして）本明細書に記載の技術に適している。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載の実施形態におけるＰＫモジュレーティングリガンドとしての使用にとって好適である。
（ｉ）脂質コンジュゲート。一部の実施形態では、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質に基づく分子である。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増加させることができる、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜へのターゲティングもしくは輸送を増加させることができる、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用することができる。そのような脂質または脂質に基づく分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合してもよい。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートを、標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織に分布させる。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む、肝臓であってもよい。ＨＳＡに結合することができる他の分子を、リガンドとして使用することもできる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。
脂質に基づくリガンドを使用して、コンジュゲートの標的組織への結合を阻害する、例えば、制御することができる。例えば、ＨＳＡにより強力に結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓に標的化される可能性が低く、したがって、体内から消失する可能性が低い。ＨＳＡにあまり強力に結合しない脂質または脂質に基づくリガンドを使用して、コンジュゲートを腎臓に標的化することができる。
一部の実施形態では、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに結合する。脂質に基づくリガンドは、コンジュゲートが非腎臓組織に分布するような十分な親和性でＨＳＡに結合してもよい。ある特定の実施形態では、ＨＳＡ-リガンド結合は、可逆性である。
一部の他の実施形態では、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合せず、コンジュゲートは腎臓に分布するであろう。腎臓細胞に標的化する他の部分を、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用することもできる。
（ｉｉ）細胞透過性ペプチドおよび薬剤。別の態様では、リガンドは、らせん状細胞透過剤などの、細胞透過性薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、それを改変してもよく、ペプチド模倣物質、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド結合、およびＤ-アミノ酸の使用を含む。一部の実施形態では、らせん状薬剤は、アルファヘリックス剤である。ある特定の実施形態では、らせん状薬剤は、親油性および疎油性相を有する。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌もしくは真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、アルファヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ-３７もしくはセロピンＰＩ）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、ａ-ディフェンシン、β-ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、または１つもしくは２つの重要なアミノ酸だけを含有するペプチド（例えば、ＰＲ-３９もしくはインドリシジン）であってもよい。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣物質であってもよい。ペプチド模倣物質（本明細書ではオリゴペプチド模倣物質とも称される）は、天然ペプチドと類似する規定の三次元構造にフォールディングすることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣物質の、ＲＮＡｉ剤への結合は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、ＲＮＡｉの薬物動態分布に影響し得る。ペプチドまたはペプチド模倣物質部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であってもよい。
ペプチドまたはペプチド模倣物質は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐもしくはＰｈｅからなる）であってもよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであってもよい。別の代替手段として、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含んでもよい。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号９）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦアナログ（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１０））もまたターゲティング部分であってもよい。ペプチド部分は、細胞膜を横断してペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きい極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであってもよい。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１））およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫ（配列番号１２））に由来する配列は、送達ペプチドとして機能できることが見出された。ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Lam, et al., Nature 354:82-84 (1991)）から同定されたペプチドなどの、ペプチドまたはペプチド模倣物質を、ＤＮＡの無作為配列によってコードさせることができる。
細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでもよい。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ-１ ｇｐ４１と、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとの融合ペプチドドメインに由来する、ＭＰＧなどの二部分両親媒性ペプチドであってもよい（Simeoni, et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-24 (2003)）。
（ｉｉｉ）炭水化物コンジュゲート。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤オリゴヌクレオチドは、炭水化物コンジュゲートをさらに含む。炭水化物コンジュゲートは、核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達にとって有利であってよく、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの治療的使用にとって好適な組成物であってよい。本明細書で使用される場合、「炭水化物」とは、それ自体、それぞれの炭素原子に酸素、窒素、もしくは硫黄原子が結合した少なくとも６個の炭素原子を有する１つもしくは複数の単糖単位から構成される炭水化物（直鎖状、分枝状、もしくは環状であってもよい）；またはそれぞれの炭素原子に酸素、窒素、もしくは硫黄原子が結合した、少なくとも６個の炭素原子をそれぞれ有する１つもしくは複数の単糖単位から構成される炭水化物部分（直鎖状、分枝状、もしくは環状であってもよい）をその一部として有する化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖（約４～９個の単糖単位を含有する、単糖、二糖、三糖、およびオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖ガムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５およびそれより上（一部の実施形態では、Ｃ５～Ｃ８）の糖が挙げられる；二糖および三糖としては、２つまたは３つの単糖単位（一部の実施形態では、Ｃ５～Ｃ８）を有する糖が挙げられる。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、
Figure 2022515778000004
Figure 2022515778000005
Figure 2022515778000006
Figure 2022515778000007
Figure 2022515778000008
Figure 2022515778000009
 からなる群から選択される。
本明細書に記載の実施形態における使用のための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、限定されるものではないが、
Figure 2022515778000010
 （式ＸＸＩＩ）（式中、ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）
が挙げられる。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、限定されるものではないが、ＰＫモジュレーター、エンドソーム溶解リガンド、または細胞透過性ペプチドなどの別のリガンドをさらに含む。
（ｉｖ）リンカー。一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートを、切断性または非切断性であってもよい様々なリンカーを用いてＲＮＡｉ剤オリゴヌクレオチドに結合することができる。
用語「リンカー」または「連結基」とは、化合物の２つの部分を接続する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または限定されるものではないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、およびアルキニルヘテロアリールなどの原子の鎖（式中、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または置換もしくは非置換複素環によって中断もしくは終結していてもよく、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族、または置換脂肪族である）を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、１～２４個の原子、４～２４個の原子、６～１８個の原子、８～１８個の原子、または８～１６個の原子である。
切断性連結基は、細胞の外部で十分に安定であるが、標的細胞への進入時に切断されて、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出するものである。ある特定の実施形態では、切断性連結基は、対象の血液中、または第２の参考条件下（例えば、血液もしくは血清中に見出される条件を模倣するか、もしくは代表するように選択することができる）よりも、標的細胞中、または第１の参考条件下（例えば、細胞内条件を模倣するか、もしくは代表するように選択することができる）で少なくとも１０倍、または少なくとも１００倍速く切断される。
切断性連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元能力、または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般的には、切断剤は、血清または血液中よりも、高頻度であるか、または高レベルで見出されるか、または細胞の内部で活性である。そのような分解剤の例としては、特定の基質について選択されるか、または例えば、酸化もしくは還元酵素を含む基質特異性を有しない酸化還元剤または還元によって酸化還元切断性連結基を分解することができる、細胞中に存在する、メルカプタンなどの還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を創出することができる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することによって酸切断性連結基を加水分解もしくは分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であってもよい）、およびホスファターゼが挙げられる。ジスルフィド結合などの切断性連結基は、ｐＨの影響を受けやすくてもよい。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、細胞内の平均ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲で、より酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０でさらにより酸性のｐＨを有する。一部のリンカーは、特定のｐＨで切断される切断性連結基を有し、それにより、リガンドから、細胞の内部へ、または細胞の所望のコンパートメント中にカチオン性脂質を放出するであろう。
リンカーは、特定の酵素によって切断され得る切断性連結基を含んでもよい。リンカー中に組み込まれた切断性連結基の型は、標的化される細胞に依存してもよい。例えば、肝臓標的化リガンドを、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝臓細胞は、エステラーゼに富み、したがって、リンカーは、エステラーゼに富まない細胞型よりも肝臓細胞中でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富む他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
肝臓細胞および滑膜細胞などの、ペプチダーゼに富む細胞型を標的化する場合、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。
一般に、候補切断性連結基の好適性を、候補連結基を切断する分解剤（または条件）の能力を試験することによって評価することができる。血液中での、または他の非標的組織と接触する場合に切断に抵抗する能力について、候補切断性連結基を試験することも望ましい。したがって、当業者であれば、第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件が他の組織または生物学的流体、例えば、血液もしくは血清中での切断を示すように選択される、第１の条件と第２の条件との間の切断に対する相対的感受性を決定することができる。評価を、無細胞系、細胞、細胞培養物、臓器もしくは組織培養物、または全動物中で実行することができる。無細胞条件または培養条件において初期評価を行い、全動物におけるさらなる評価によって確認することが有用であり得る。ある特定の実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）で少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍または少なくとも１００倍速く切断される。
１つのクラスの切断性連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断性連結基である。還元的切断性連結基の例は、ジスルフィド連結基（-Ｓ-Ｓ-）である。候補切断性連結基が好適な「還元的切断性連結基」であるか、または例えば、特定のＲＮＡｉ部分および特定のターゲティング剤と共に使用するのに好適であるかどうかを決定するために、当業者であれば、本明細書に記載の方法に目を向けることができる。例えば、細胞、例えば、標的細胞中で観察される切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用した、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、または他の還元剤とのインキュベーションによって、候補を評価することができる。また、候補を、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。一部の実施形態では、候補化合物は、血液中で最大でも１０％切断される。ある特定の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）で少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍または少なくとも１００倍速く分解される。候補化合物の切断の速度を、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で、また、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して、標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定することができる。
リン酸に基づく切断性連結基は、リン酸基を分解する、または加水分解する薬剤によって切断される。細胞中でリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸に基づく連結基の例は、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）-Ｓ-である。ある特定の実施形態では、リン酸に基づく連結基は、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｈ）-Ｓ-、および-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｈ）-Ｓ-から選択される。特定の実施形態では、リン酸連結基は、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｏ-である。これらの候補を、上記のものと類似する方法を使用して評価することができる。
酸切断性連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。一部の実施形態では、酸切断性連結基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）のｐＨの酸性環境で、または一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞中で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨのオルガネラは、酸切断性連結基のための切断環境を提供することができる。酸切断性連結基の例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断性基は、一般式-Ｃ＝Ｎ-、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または-ＯＣ（Ｏ）を有してもよい。一部の実施形態では、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合した炭素は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ-ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補を、上記のものと類似する方法を使用して評価することができる。
エステルに基づく切断性連結基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルに基づく切断性連結基の例としては、限定されるものではないが、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断性連結基は、一般式-Ｃ（Ｏ）Ｏ-、または-ＯＣ（Ｏ）-を有する。これらの候補を、上記のものと類似する方法を使用して評価することができる。
ペプチドに基づく切断性連結基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドに基づく切断性連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを得るためにアミノ酸の間で形成されるペプチド結合である。ペプチドに基づく切断性基は、アミド基（-Ｃ（Ｏ）ＮＨ-）を含まない。アミド基を、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキネレン（alkynelene）の間で形成させることができる。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を得るためにアミノ酸の間で形成される特殊な型のアミド結合である。ペプチドに基づく切断性基は、一般的には、ペプチドおよびタンパク質を得るアミノ酸の間で形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドに基づく切断性連結基は、一般式-ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）-（式中、ＲＡおよびＲＢは、２個の隣接するアミノ酸のＲ基である）を有する。これらの候補を、上記のものと類似する方法を使用して評価することができる。
リンカーを有する代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、限定されるものではないが、
Figure 2022515778000011
Figure 2022515778000012
Figure 2022515778000013
 （式中、ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）
が挙げられる。
組成物および方法のある特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価分枝状リンカーを介して結合した１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ-アセチルガラクトサミン）誘導体である。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下の構造：
Figure 2022515778000014
 （式中、ＸはＯまたはＳである）
に示されるＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、以下の構造：
Figure 2022515778000015
 （式中、ＸはＯまたはＳである）
に示されるリンカーを介してセンス鎖の３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、併用療法は、式（ＸＸＸＩ）～（ＸＸＸＩＶ）：
Figure 2022515778000016
Figure 2022515778000017
 （式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ出現する毎に独立に０～２０を表し、反復単位は同じか、または異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、およびＴ５Ｃは、それぞれ出現する毎に、それぞれ独立に、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、およびＱ５Ｃは、それぞれ出現する毎に、独立に、存在しないか、アルキレン、または置換アルキレンであり、式中、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうちの１つまたは複数によって中断されるか、または終結してもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、およびＲ５Ｃは、それぞれ出現する毎に、それぞれ独立に、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ-、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ-Ｏ、
Figure 2022515778000018
Figure 2022515778000019
 またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃはリガンド；すなわち、それぞれ出現する毎に、それぞれ独立に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかに示される構造の群から選択される二価または三価分枝状リンカーにコンジュゲートされたｓｉＲＮＡを含む。三価コンジュゲート化ＧａｌＮＡｃ誘導体は、式（ＸＸＸＩＶ）：
Figure 2022515778000020
 （式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）のものなどの、標的遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
好適な二価および三価分枝状リンカー基コンジュゲート化ＧａｌＮＡｃ誘導体の例としては、限定されるものではないが、式Ｉ、ＶＩ、Ｘ、ＩＸ、およびＸＩＩとして上記された構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号；第６，２９４，６６４号；第６，３２０，０１７号；第６，５７６，７５２号；第６，７８３，９３１号；第６，９００，２９７号；および第７，０３７，６４６号が挙げられる；これらはそれぞれ、そのような調製方法に関する教示について参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の例では、ＲＮＡｉ剤のＲＮＡを、非リガンド基によって改変することができる。いくつかの非リガンド分子が、ＲＮＡｉ剤の活性、細胞分布または細胞取込みを増強するためにＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実施するための手順は、特定の文献中で入手可能である。そのような非リガンド部分は、脂質部分、例えば、コレステロール（Kubo, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 365(1):54-61 (2007)；Letsinger, et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA 86:6553 (1989)）、コール酸（Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 4:1053 (1994)）、チオエーテル、例えば、ヘキシル-Ｓ-トリチルチオール（Manoharan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:306 (1992)；Manoharan, et al., Biorg. Med. Chem. Let. 3:2765 (1993)）、チオコレステロール（Oberhauser, et al., Nucl. Acids Res. 20:533 (1992)）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras, et al., EMBO J 10:111(1991); Kabanov, et al., FEBS Lett. 259:327(1990); Svinarchuk, et al., Biochimie 75:49 (1993)）、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム１，２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-ｒａｃ-グリセロ-３-Ｈ-ホスホネート（Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651 (1995); Shea, et al., Nucl. Acids Res. 18:3777 (1990)）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan, et al., Nucleosides & Nucleotides 14:969 (1995)）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan, et al., Tetrahedron Lett. 36:3651 (1195)）、パルミチル部分（Mishra, et al., Biochim. Biophys. Acta 1264:229 (1995)）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（Crooke, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:923 (1996)）を含んでいた。
典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを担持するＲＮＡの合成を含む。次いで、アミノ基を、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用してコンジュゲートされる分子と反応させる。コンジュゲーション反応を、固相支持体に依然として結合したＲＮＡを用いて、または溶液相中でのＲＮＡの切断後に実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、典型的には、純粋なコンジュゲートが得られる。
ｄ．ＲＮＡｉ剤の送達
ＲＮＡｉ剤に言及する場合の「細胞中に導入すること」は、当業者であれば理解できるように、細胞中への取込み、または吸収を容易にすること、または行うことを意味する。
ＲＮＡｉ剤の吸収または取込みは、助けを借りない拡散性もしくは能動的な細胞プロセスを介して、または補助剤もしくはデバイスによって起こってもよい。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に限定されない；ＲＮＡｉ剤を、生きている生物の一部である、「細胞中に導入する」こともできる。そのような例では、細胞中への導入は、生物への送達を含むであろう。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達のために、ＲＮＡｉ剤を、組織部位に注入するか、または全身投与することができる。また、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達は、米国特許第５，０３２，４０１号および第５，６０７，６７７号ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号に記載されたものなどのベータ-グルカン送達システムによるものであってもよく、これらの文献はそのような送達システムに関する教示について参照により本明細書に組み込まれる。細胞中へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの導入は、電気穿孔およびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法を含む。さらなる手法は、本明細書の以下に記載されるか、または当技術分野で公知である。
それを必要とする対象へのＲＮＡｉ剤の送達を、いくつかの異なる方法で達成することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの送達を、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｓｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施することができる。あるいは、送達を、ＲＮＡｉ剤をコードし、その発現を指令する１つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施することができる。これらの選択肢は、以下でさらに考察される。
一般に、核酸分子を送達する任意の方法を、ＲＮＡｉ剤と共に使用するために適合させることができる（例えば、そのような送達方法に関する教示について参照により本明細書に組み込まれる、Akhtar S. and Julian RL., Trends Cell. Biol. 2(5):139-44 (1992)およびＷＯ９４／０２５９５を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡｉ剤の送達の成功において特に重要である３つの因子：（ａ）送達される分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の防止、および（３）標的組織中での送達される分子の蓄積。ＲＮＡｉ剤の非特異的効果を、局部投与によって、例えば、組織（非限定例として、腫瘍）への直接注射もしくは埋込み、または調製物の局所投与によって最小化することができる。処置部位への局部投与は、薬剤の局部濃度を最大化し、そうでなければ薬剤によって悪影響を及ぼされ得るか、または薬剤を分解し得る全身組織への薬剤の曝露を制限し、より低い総用量のＲＮＡｉ剤の投与を可能にする。いくつかの研究が、ＲＮＡｉ剤を局部投与する場合に遺伝子産物のノックダウンの成功を示した。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注射（Tolentino, M.J., et al., Retina 24:132-38 (2004)）およびマウスにおける網膜下注射（Reich, S.J., et al., Mol. Vis. 9:210-16 (2003)）によるＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡの眼内送達は両方とも、加齢黄斑変性の実験モデルにおいて新血管形成を防止することが示された。さらに、マウスにおけるｓｉＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低減させ（Pille, J., et al., Mol. Ther. 11:267-74 (2005)）、腫瘍担持マウスの生存を延長させることができる（Kim, W.J., et al., Mol. Ther. 14:343-50 (2006)；Li, S., et al., Mol. Ther. 15:515-23 (2007)）。ＲＮＡ干渉はまた、直接注射によるＣＮＳへの局部送達（Dorn, G., et al., Nucleic Acids 32:e49 (2004)；Tan, P.H., et al., Gene Ther. 12:59-66 (2005)；Makimura, H., et al., BMC Neurosci. 3:18 (2002)；Shishkina, G.T., et al., Neuroscience 129:521-28 (2004)；Thakker, E.R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-75 (2004)；Akaneya,Y., et al., J. Neurophysiol. 93:594- 602 (2005)）および鼻内投与による肺への局部送達（Howard, K.A., et al., Mol. Ther. 14:476-84 (2006)；Zhang, X., et al., J. Biol. Chem. 279:10677-84 (2004)；Bitko, V., et al., Nat. Med. 11:50-55 (2005)）に関して成功を示した。疾患の処置のためにＲＮＡｉ剤を全身投与するために、ＲＮＡを改変するか、またはあるいは、薬物送達システムを使用して送達することができる；両方法とも、ｉｎ ｖｉｖｏでエンドおよびエキソヌクレアーゼによるｓｉＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の改変は、標的組織へのＲＮＡｉ剤組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。細胞取込みを増強し、分解を防止するために、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによってＲＮＡｉ剤を改変することができる。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされたＡｐｏＢに対するＲＮＡｉ剤を、マウスに全身注射し、肝臓と空腸との両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをもたらした（Soutschek, J., et al., Nature 432:173-78 (2004)）。一部の他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤を、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用して送達することができる。正に荷電したカチオン性送達システムは、典型的には、ＲＮＡｉ剤（負に荷電している）の結合を容易にし、負に荷電した細胞膜での相互作用を増強して、細胞によるＲＮＡｉ剤の効率的な取込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーを、ＲＮＡｉに結合するか、またはＲＮＡｉ剤を包含する小胞もしくはミセル（例えば、Kim, S,H., et al., Journal of Controlled Release 129(2):107-16 (2008)を参照されたい）を形成するように誘導することができる。小胞またはミセルの形成はさらに、全身投与した場合にＲＮＡｉ剤の分解を防止する。カチオン性ＲＮＡｉ剤複合体の作製および投与のための方法は、十分に当業者の能力の範囲内にある（例えば、Sorensen, D.R., et al., J. Mol. Biol 327:761-66 (2003)；Verma, U.N., et al., Clin. Cancer Res. 9:1291-1300 (2003)；Arnold, A.S. et al., J. Hypertens. 25:197-205 (2007)を参照されたい；これらの方法は参照により本明細書に組み込まれる）。ＲＮＡｉ剤の全身送達にとって有用な薬物送達システムの一部の非限定例としては、ＤＯＴＡＰ（Sorensen, D.R., et al. (2003), supra；Verma, U.N., et al., (2003), supra）、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子」（Zimmermann, T.S., et al., Nature 441:111-14 (2006)）、カルジオリピン（Chien, P.Y., et al., Cancer Gene Ther. 12:321-28 (2005); Pal, A., et al., Int J. Oncol. 26: 1087-91 (2005)）、ポリエチレンイミン（Bonnet, M.E., et al., Pharm. Res. 25(12):2972-82；Aigner, A., J. Biomed. Biotechnol. 2006(4):71659 (2006)）、Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Liu, S., Mol. Pharm. 3:472-487 (2006)）、およびポリアミドアミン（Tomalia, D.A., et al., Biochem. Soc. Trans. 35:61-7 (2007)；Yoo, H., et al., Pharm. Res. 16:1799-1804 (1999)）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＡＬＰ」とは、安定な核酸-脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤が転写されるプラスミドなどの核酸を含む低減した水性内部を被覆する脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２４００９３号および第２００７／０１３５３７２号、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０８２８１７に記載されている。これらの出願は、ＳＮＡＬＰに関する教示について参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、全身投与のためにシクロデキストリンとの複合体を形成する。ＲＮＡｉおよびシクロデキストリンの投与のための方法およびそれらの医薬組成物を、そのような組成物および方法に関する教示について参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６０５号に見出すことができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉをコードする遺伝子は、発現ベクターにコードされ、それから発現される。ベクターの例およびＲＮＡｉの送達におけるその使用は、米国特許出願公開第２０１７／０３４９９００Ａ１号に記載されており、それらの例は参照により本明細書に組み込まれる。
ｅ．ＲＮＡｉ剤の医薬組成物および製剤
一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する医薬組成物が本明細書で提供される。ＲＮＡｉ剤を含有する医薬組成物は、対象におけるＨＢＶ感染を処置するため、またはＨＢＶウイルス量を低減させるための併用療法において有用である。そのような医薬組成物は、送達の様式に基づいて製剤化される。例えば、組成物を、非経口送達による、例えば、静脈内（ＩＶ）送達による全身投与のために、または例えば、連続ポンプ輸注などによる脳への輸注による脳実質への直接送達のために製剤化することができる。
「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」は、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または１つもしくは複数の核酸を動物に送達するための任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であってよく、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と混合する場合、所望の嵩、稠度などをもたらすために、計画された投与様式を考慮して選択される。典型的な薬学的に許容される担体または賦形剤としては、限定されるものではないが、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド性二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない非経口投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用して、本開示の組成物を製剤化するために使用することもできる。好適な薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与のための製剤は、滅菌および非滅菌水性溶液、アルコールなどの一般的な溶媒中の非水性溶液、または液体もしくは固体油基剤中の核酸の溶液を含んでもよい。溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤を含有してもよい。核酸と有害に反応しない非経口投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤を含有する医薬組成物は、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与される。一般に、ＲＮＡｉ剤の好適な用量は、１日あたり、レシピエントの体重１キログラムあたり、０．００１～２００．０ミリグラムの範囲にあり、より典型的には、１日あたり、体重１キログラムあたり１～５０ｍｇの範囲にあるであろう。例えば、ｓｉＲＮＡを、単一用量あたり、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。医薬組成物を、１日１回投与するか、またはＲＮＡｉ剤を、１日を通して適切な間隔で、もしくはさらには、連続輸注もしくは制御放出製剤による送達を使用して、２、３以上の下位用量として投与することができる。その場合、それぞれの下位用量中に含有されるＲＮＡｉ剤は、合計１日投薬量を達成するために、それに応じてより少なくする必要がある。投薬単位を、数日にわたる送達のために、例えば、数日間にわたるＲＮＡｉの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、混合してもよい。持続放出製剤は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載の技術の薬剤と共に使用することができるなど、特定の部位での薬剤の送達にとって特に有用である。この実施形態では、投薬単位は、対応する複数の１日用量を含有する。
ＨＢＶ遺伝子の発現レベルに対する単一用量の効果は、その後の用量が３、４、もしくは５日以下の間隔で、または１、２、３、もしくは４週以下の間隔で投与されるような、長期にわたるものであってよい。
当業者であれば、限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の一般的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患などの、ある特定の因子が、対象を有効に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物を用いた対象の処置は、単回処置または一連の処置を含んでもよい。本明細書に記載の技術によって包含される個々のＲＮＡｉ剤に関する有効な投薬量およびｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の推定を、従来の方法を使用する、または本明細書の他の箇所に記載されるような適切な動物モデルを使用するｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて行うことができる。
マウスモデルはＨＢＶ感染の研究のために利用可能であり、そのようなモデルを、ＲＮＡｉのｉｎ ｖｉｖｏ試験のために、ならびにＨＢＶ遺伝子発現の低減において有効である用量を決定するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物および製剤の投与は、局所（例えば、経皮パッチによる）、経肺（例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または通気による）；気管内；鼻内；表皮および経皮；経口；または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内注射もしくは輸注；皮下投与（例えば、埋込みデバイスによる）；または頭蓋内投与（例えば、実質内、髄腔内、もしくは脳室内投与による）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＨＢＶを処置するための併用療法において使用されるＲＮＡｉ剤は、皮下的に送達される。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤を、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織を標的とする様式で送達することができる。
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐剤、スプレー、液体、および粉末を含んでもよい。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤などが必要であるか、または望ましくてもよい。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本明細書に記載の技術において取り上げられるＲＮＡｉが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤などの局所送達剤との混合物中にあるものを含む。好適な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイル（distearoly）ホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。ＲＮＡｉ剤をリポソーム内に封入するか、またはそれと複合体を形成して、特に、カチオン性リポソームにすることができる。あるいは、ＲＮＡｉ剤を、脂質、特に、カチオン性脂質に複合体化することができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１-モノカプレート、１-ドデシルアザシクロヘプタン-２-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容される塩が挙げられる。局所製剤の例は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されており、これはそのような局所製剤に関する教示について参照により本明細書に組み込まれる。
リポソームなどの小胞を、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤を送達するための製剤中で使用することができる；そのような製剤は、特異性および作用持続期間などの望ましい特性を有してもよい。本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」は、球状の二重層または複数の二重層の中に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層または多層小胞である。水性部分は、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有してもよい。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することはできないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれ得る。リポソーム製剤の調製における重要な考慮は、脂質表面電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水性体積である。
一部の実施形態では、リポソーム送達は、以下の有利な特性：非常に変形しやすく、皮膚中の微細な小孔を通過することができること；生体適合性および生分解性；広範囲の水溶性および脂溶性薬物を組み込む能力；代謝および分解から、その内部区画中の封入された薬物を保護する能力（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245 (1998)）；局所送達のための、投与される薬物の高い全身吸収と関連する副作用の低減、所望の標的での投与される薬物の蓄積の増加、および親水性と疎水性の両方の様々な薬物を皮膚に投与する能力；ならびに高分子量の核酸、鎮痛剤、抗体、およびホルモンを含む薬剤を皮膚に送達する能力を有してもよい。
リポソームは、２つの広いクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電した核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム中に内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨのため、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質中に放出する（Wang, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.147, 980-985 (1987)）。
ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、核酸との複合体よりもむしろ核酸を捕捉する。ＤＮＡと脂質とは両方とも同様に荷電しているため、複合体形成よりもむしろ反発が起こる。それにもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、培養物中の細胞単層に核酸を送達するために使用されてきた（例えば、Zhou, et al., Journal of Controlled Release 19, 269-74 (1992)）。
一部の実施形態では、リポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどの、ホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。一部の実施形態では、リポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成させることができる。アニオン性リポソーム組成物はジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成させることができるが、アニオン性融合原性リポソームはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成させることができる。さらに他の実施形態では、リポソーム組成物は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
一部の実施形態では、リポソーム薬物製剤は、皮膚に局所的に送達される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の併用療法において使用されるＲＮＡｉ剤は、脂質製剤中に完全に捕捉され、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸-脂質粒子を形成する。本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＡＬＰ」とは、ＳＰＬＰを含む、安定な核酸-脂質粒子を指す。本明細書で使用される場合、用語「ＳＰＬＰ」とは、脂質小胞内に捕捉されたプラスミドＤＮＡを含む核酸-脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ-脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命の延長を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用のために使用することができる。ＳＰＬＰは、国際特許出願公開番号ＷＯ００／０３６８３に記載の捕捉された凝縮剤-核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。本明細書に記載の技術の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には、約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性的である。さらに、一部の実施形態では、核酸-脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水性溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。核酸-脂質粒子および関連する調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；第５，９８１，５０１号；第６，５３４，４８４号；第６，５８６，４１０号；第６，８１５，４３２号；および国際特許出願公開番号ＷＯ９６／４０９６４に開示されている。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、リポソームまたは他の脂質製剤により送達され、脂質の薬物に対する比（質量／質量比）（例えば、脂質のｓｉＲＮＡに対する比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲にある。
ＩＩＩ．抗ＨＢＶ抗体
本開示は、ＨＢＶを処置するための併用療法における使用のための抗ＨＢＶ抗体を提供する。
ａ．ＨＢＶタンパク質に結合する抗体
一部の実施形態では、併用療法の抗ＨＢＶ抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合する。Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープは、３つの「ＨＢＶエンベロープタンパク質」（「ＨＢｓＡｇ」、「Ｂ型肝炎表面抗原」としても知られる）：Ｓタンパク質（「スモール」については、Ｓ-ＨＢｓＡｇとも称される）、Ｍタンパク質（「ミドル」については、Ｍ-ＨＢｓＡｇとも称される）、およびＬタンパク質（「ラージ」については、Ｌ-ＨＢｓＡｇとも称される）を含有する。Ｓ-ＨＢｓＡｇ、Ｍ-ＨＢｓＡｇ、およびＬ-ＨＢｓＡｇは、Ｓタンパク質（Ｓ-ＨＢｓＡｇ）に対応し、ウイルスアセンブリおよび感染力に関与する、同じＣ末端部（２２６アミノ酸の「Ｓドメイン」とも称される）を共有する。Ｓ-ＨＢｓＡｇ、Ｍ-ＨＢｓＡｇ、およびＬ-ＨＢｓＡｇは、小胞体（ＥＲ）中で合成され、集合し、ゴルジ装置を介して粒子として分泌される。Ｓドメインは、４つの予測された膜貫通（ＴＭ）ドメインを含み、それによって、ＳドメインのＮ末端とＣ末端は両方とも、内腔に露出される。膜貫通ドメインＴＭ１およびＴＭ２は両方とも、ＥＲ膜への翻訳同時的タンパク質組込みにとって必要であり、膜貫通ドメインＴＭ３およびＴＭ４はＳドメインのＣ末端１／３に位置する。ＨＢｓＡｇの「抗原性ループ領域」は、ＨＢｓＡｇのＳドメインの予測されたＴＭ３およびＴＭ４膜貫通ドメインの間に位置し、それによって、抗原性ループ領域は、Ｓドメインのアミノ酸１０１～１７２を含む（Salisse J., and Sureau C. Journal of Virology 83:9321 -8 (2009)）。感染力の重要な決定因子は、ＨＢＶエンベロープタンパク質の抗原性ループ領域に存在する。特に、ＨＢｓＡｇの１１９～１２５の残基は、ＨＢＶの感染力にとって必要とされる最も重要な配列であると証明されている、ＣＸＸＣモチーフを含有する（Jaoude, G.A., and Sureau, C., Journal of Virology 79:10460-6 (2005)）。
本明細書で使用される場合、ＨＢｓＡｇのＳドメインは、配列番号１３（以下に示される）
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI
（配列番号１３；アミノ酸１０１～１７２は下線付きで示される）
に記載のアミノ酸配列またはその天然もしくは人工配列変異体を指す。
例えば、「Ｓドメインのアミノ酸１０１～１７２」という表現は、配列番号１３に記載のポリペプチドの１０１～１７２位に由来するアミノ酸残基を指す。しかしながら、当業者であれば、突然変異または変異（限定されるものではないが、置換、欠失および／または付加、例えば、異なる遺伝子型のＨＢｓＡｇまたは本明細書に記載の異なるＨＢｓＡｇ突然変異体を含む）が、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列中に天然に存在してもよいか、またはその生物学的特性に影響することなく、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列中に人工的に導入してもよいことを理解するであろう。したがって、用語「ＨＢｓＡｇのＳドメイン」は、例えば、配列番号１３に記載のポリペプチドおよびその天然または人工の突然変異体を含む、全てのそのようなポリペプチドを含む。さらに、ＨＢｓＡｇのＳドメインの配列断片が本明細書に記載される場合（例えば、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１０１～１７２またはアミノ酸１２０～１３０）、それらは配列番号１３の対応する配列断片だけでなく、その天然または人工の突然変異体の対応する配列断片も含む。例えば、「ＨＢｓＡｇのＳドメインの１０１～１７２位に由来するアミノ酸残基」という表現は、配列番号１３の１０１～１７２位に由来するアミノ酸残基およびその突然変異体（天然または人工の突然変異体）の対応する断片を含む。
本明細書で使用される場合、「対応する配列断片」または「対応する断片」という表現は、配列が最適化されたアラインメントにかけられる場合、すなわち、配列が最も高い同一性パーセンテージを得るように整列される場合、配列の同等の位置に位置する断片を指す。Ｍタンパク質（Ｍ-ＨＢｓＡｇ）は、「プレ-Ｓ２」と呼ばれる５５アミノ酸のＮ末端ドメインによって伸長したＳタンパク質に対応する。Ｌタンパク質（Ｌ-ＨＢｓＡｇ）は、「プレ-Ｓ１」（遺伝子型Ｄ）と呼ばれる１０８アミノ酸のＮ末端ドメインによって伸長したＭタンパク質に対応する。Ｌタンパク質のプレ-Ｓ１およびプレ-Ｓ２ドメインは、ウイルスアセンブリにおいて重要な役割を果たす、ウイルス粒子の内面（ＥＲの細胞質側）に、または標的細胞との相互作用にとって利用可能であり、ウイルス感染力にとって必要な、外面（ＥＲの内腔側）に存在してもよい。さらに、ＨＢＶ表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）は、ビリオンエンベロープ中に取り込まれるだけでなく、ＥＲ-ゴルジ中間コンパートメント膜から自発的に出芽して、分泌によって細胞から放出される空の「サブウイルス粒子」（ＳＶＰ）を形成する。
３つ全てのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ-ＨＢｓＡｇ、Ｍ-ＨＢｓＡｇ、およびＬ-ＨＢｓＡｇはＳドメインを含むため、３つ全てのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ-ＨＢｓＡｇ、Ｍ-ＨＢｓＡｇ、およびＬ-ＨＢｓＡｇもまた「抗原性ループ領域」を含む。したがって、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合する抗体またはその抗原結合断片は、３つ全てのＨＢＶエンベロープタンパク質：Ｓ-ＨＢｓＡｇ、Ｍ-ＨＢｓＡｇ、およびＬ-ＨＢｓＡｇに結合する。
さらに、一部の実施形態では、併用療法の抗ＨＢＶ抗体、またはその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染を中和する。換言すれば、抗体、またはその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎ウイルスのウイルス感染力を低減させることができる。
実験室でウイルス感染力（または「中和」）を試験し、定量するために、当業者であれば、様々な標準的な「中和アッセイ」を知っている。中和アッセイのために、動物ウイルスを、典型的には細胞および／または細胞系中で増殖させる。本開示の文脈では、中和アッセイのために、培養細胞を、試験しようとする抗体の存在下（または非存在下）で固定量のＨＢＶと共にインキュベートすることができる。リードアウトとして、細胞培養上清中に分泌されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルを使用する、および／またはＨＢｃＡｇ染色を評価することができる。ＨＢＶ中和アッセイの一実施形態では、培養細胞、例えば、ＨｅｐａＲＧ細胞、特に、分化したＨｅｐａＲＧ細胞を、例えば、３７℃で１６時間にわたって、試験しようとする抗体の存在下または非存在下で固定量のＨＢＶと共にインキュベートする。インキュベーションを、培地（例えば、４％ＰＥＧ８０００を補充したもの）中で実施することができる。インキュベーション後、細胞を洗浄し、さらに培養してもよい。ウイルス感染力を測定するために、例えば、培養後７日目から１１日目までに培養上清中に分泌されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。さらに、ＨＢｃＡｇ染色を、免疫蛍光アッセイにおいて評価することができる。
一部の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、高い中和効力を有する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の５０％の中和にとって必要とされる本開示の抗体の濃度は、例えば、約１０ｐｇ／ｍｌまたはそれ以下である。ある特定の実施形態では、ＨＢＶの５０％の中和にとって必要とされる本開示の抗体の濃度は、約５ｐｇ／ｍｌ、約１ｐｇ／ｍｌ、または約７５０ｎｇ／ｍｌである。ある特定の実施形態では、ＨＢＶの５０％の中和にとって必要とされる本開示の抗体の濃度は、５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以下、例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、または約５０ｎｇ／ｍｌもしくはそれ以下である。これは、ＨＢＶの５０％の中和にとっては、低濃度の抗体が必要であるに過ぎないことを意味する。特異性および効力を、当業者には公知の標準的なアッセイを使用して測定することができる。
一部の実施形態では、併用療法の成分としての抗ＨＢＶ抗体は、Ｂ型肝炎の防止および／または処置において有用である。
一部の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶのクリアランスを促進する。特に、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢＶと、Ｂ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子（ＳＶＰ）との両方のクリアランスを促進することができる。ＨＢｓＡｇまたはサブウイルス粒子のクリアランスを、例えば、Ｂ型肝炎患者由来の、例えば、血液試料中のＨＢｓＡｇのレベルを測定することによって評価することができる。同様に、ＨＢＶのクリアランスを、例えば、Ｂ型肝炎患者由来の、例えば、血液試料中のＨＢＶのレベルを測定することによって評価することができる。
感染性粒子（ＨＢＶ）に加えて、ＨＢＶに感染した患者の血清中には、典型的には、比較的小さい球状の形態のＨＢＶエンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ）と、可変性の長さのフィラメントとから専ら構成される過剰（典型的には、１，０００～１００，０００倍）の空のサブウイルス粒子（ＳＶＰ）が存在する。サブウイルス粒子は、ＨＢＶの細胞内ウイルス複製および遺伝子発現を強く増強することが示された（Bruns, M., et al., J Virol 72(2):1462-8 (1998)）。感染力はウイルスの数だけでなく、ＳＶＰの数にも依存するため、これもまたＨＢＶを含有する血清の感染力の文脈において重要である（Bruns, M., et al., J Virol 72(2):1462-8 (1998)）。さらに、過剰のサブウイルス粒子は中和抗体を吸収することによってデコイとして働き、したがって、感染のクリアランスを遅延させることができる。典型的には、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）喪失の達成は、したがって、処置の理想的な終点および慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を治癒させるための最も近い転帰であると考えられる。したがって、一部の実施形態では、ＨＢｓＡｇのクリアランス、特に、Ｂ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子およびＨＢＶのクリアランスを促進する、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、特に、慢性Ｂ型肝炎の文脈において、Ｂ型肝炎の処置の改善を可能にする。それによって、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、少ない抗体がデコイとして作用するＳＶＰによって吸収されるため、ＨＢＶを強力に中和することができる。さらに、ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子のクリアランスを促進し、血清中のＨＢＶの感染力を低下させる。
ＨＢＶは、ゲノム配列に従って、多くの遺伝子型に区別される。今まで、ＨＢＶゲノムの８種の周知の遺伝子型（Ａ～Ｈ）が定義されている。さらに、２つの新しい遺伝子型、ＩおよびＪも同定されている（Sunbul, M., World J Gastroenterol 20(18):5427-34 (2014)）。この遺伝子型は、疾患の進行に影響することが知られており、抗ウイルス処置に応答する遺伝子型間の差異が決定されている。例えば、遺伝子型Ａは、慢性化への傾向を有するが、ウイルス突然変異は遺伝子型Ｃにおいてよく引き起こされる。慢性化と突然変異頻度は両方とも、遺伝子型Ｄに共通する。さらに、ＨＢＶの遺伝子型は、世界中に示差的に分布している（Sunbul, M., 2014, supra）。ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪのうちの少なくとも６種、少なくとも８種、または１０種全部に結合する。ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種に結合する。異なる遺伝子型のＨＢｓＡｇの例としては、以下のもの：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２２０３（ＨＢＶ-Ｄ、ａｙｗ３）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ８９９７９２．１（ＨＢＶ-Ｄ、ａｄｗ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＭ２８２９８６（ＨＢＶ-Ａ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ２３６７８（ＨＢＶ-Ｂ１ Ｊａｐａｎ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１１７７５８（ＨＢＶ-Ｃ１ Ｃａｍｂｏｄｉａ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ２０５１９２（ＨＢＶ-Ｅ Ｇｈａｎａ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６９７９８（ＨＢＶ-Ｆ４、Ｂｒａｚｉｌ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１６０５０１（ＨＢＶ-Ｇ ＵＳＡ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０９０４５４（ＨＢＶ-Ｈ Ｎｉｃａｒａｇｕａ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２４１４０９（ＨＢＶ-Ｉ Ｖｉｅｔｎａｍ）、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ４８６０１２（ＨＢＶ-Ｊ Ｂｏｒｎｅｏ）が挙げられる。異なる遺伝子型のＨＢｓＡｇのＳドメインの抗原性ループ領域のアミノ酸配列を、表２に示す（配列番号１４～４２）。
表2：種々のHBV遺伝子型に由来する抗原性ループ配列
Figure 2022515778000021

Figure 2022515778000022

Figure 2022515778000023

ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、抗原性ループ領域中に突然変異を有するＨＢｓＡｇ突然変異体：ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５Ｒ、およびＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８種に結合する。これらの突然変異体は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ｄ（配列番号４３）のＳドメインに基づく天然に存在する突然変異体、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ８９９７９２（突然変異したアミノ酸残基は名称中に示される）である。
MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI（配列番号４３）（抗原性ループ領域、すなわち、アミノ酸１０１～１７２は下線付きで示される）。
ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、抗原性ループ領域中に突然変異を有する感染性ＨＢｓＡｇ突然変異体：ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５Ｒ、およびＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａのうちの少なくとも１２種、少なくとも１５種、または１８種全部に結合する。
ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～１３３、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、またはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３０から選択される。注目すべきは、アミノ酸の位置（例えば、１１５～１３３、１２０～１３３、１２０～１３０）は、３つ全部のＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ-ＨＢｓＡｇ、Ｍ-ＨＢｓＡｇ、およびＬ-ＨＢｓＡｇ中に存在する、上記のＨＢｓＡｇのＳドメインを指す。
特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域中のエピトープに結合し、それにより、エピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸位置１１５～１３３、アミノ酸位置１２０～１３３、またはアミノ酸位置１２０～１３０から選択される位置に位置する１つまたは複数のアミノ酸によって形成される。
エピトープの文脈で本明細書で使用される用語「～によって形成される」とは、本開示の抗体、またはその抗原結合断片が結合するエピトープが、線状（連続）または立体的（不連続）であってよいことを意味する。線状または連続エピトープは、アミノ酸のその線状配列、または一次構造による抗体によって認識されるエピトープである。対照的に、立体的エピトープは、特定の三次元形状およびタンパク質構造を有する。したがって、エピトープが線状エピトープであり、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸位置１１５～１３３、またはアミノ酸位置１２０～１３３から選択される位置に位置する１個より多いアミノ酸を含む場合、エピトープによって含まれるアミノ酸は、一次構造の隣接する位置（すなわち、アミノ酸配列中の連続するアミノ酸）に位置してもよい。対照的に、立体的エピトープ（３Ｄ構造）の場合、アミノ酸配列は典型的には、エピトープとして３Ｄ構造を形成し、したがって、エピトープを形成するアミノ酸（またはエピトープ「によって含まれる」アミノ酸）は、一次構造の隣接位置に位置しても、しなくてもよい（すなわち、アミノ酸配列中の連続するアミノ酸であっても、なくてもよい）。ある特定の実施形態では、本開示の抗体、またはその抗原結合断片が結合するエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸位置１１５～１３３、アミノ酸位置１２０～１３３、またはアミノ酸位置１２０～１３０から選択されるアミノ酸によってのみ形成される。特定の実施形態では、本開示の抗体、またはその抗原結合断片が結合するエピトープを形成するには、１１５～１３３位、１２０～１３３位、または１２０～１３０位の外側に位置する（さらなる）アミノ酸は必要ない。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体、またはその抗原結合断片が結合するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域中のエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸位置１１５～１３３、アミノ酸位置１２０～１３３、またはアミノ酸位置１２０～１３０から選択される位置に位置する２個以上のアミノ酸によって形成される。ある特定の実施形態では、本開示の抗体、またはその抗原結合断片が結合するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域中のエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸位置１１５～１３３、アミノ酸位置１２０～１３３、およびアミノ酸位置１２０～１３０から選択される位置に位置する３個以上のアミノ酸によって形成される。一部の実施形態では、本開示の抗体、またはその抗原結合断片が結合するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域中のエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸位置１１５～１３３、アミノ酸位置１２０～１３３、またはアミノ酸位置１２０～１３０から選択される位置に位置する４個以上のアミノ酸によって形成される。そのため、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～１３３、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、またはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３０から選択されるＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域のうちの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸に結合してもよい。特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、またはアミノ酸１２０～１３０から選択され、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸は、隣接位置に位置する（すなわち、アミノ酸配列／一次構造中の連続するアミノ酸である）。
ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合断片が結合するエピトープは、立体的エピトープである。したがって、本開示による抗体、またはその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合してもよく、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、またはアミノ酸１２０～１３０から選択され、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個のアミノ酸は、（一次構造の）隣接位置に位置しない。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＨＢｓＡｇに対する第１の特異性、および免疫エフェクター細胞を刺激する（例えば、ＣＤ３タンパク質細胞外部分などのＴ細胞表面タンパク質を標的とすることによる）第２の特異性を有する二特異性抗体である。第２の特異性は、例えば、細胞傷害効果またはワクチン効果を引き起こし得る。
ｂ．Ｆｃ部分
一部の実施形態では、結合性タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合性断片）はＦｃ部分を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒト起源、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４に由来してもよい。特有の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ部分を含み得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ部分」という用語は、パパイン切断部位（例えば、重鎖定常領域の第１の残基を１１４であるとして、天然のＩｇＧ中の残基２１６）のすぐ上流のヒンジ領域において開始し、かつ免疫グロブリン重鎖のＣ末端で終了する免疫グロブリン重鎖の部分を含むかまたはそれに由来する配列を指す。よって、Ｆｃ部分は、完全なＦｃ部分またはその部分（例えば、ドメイン）であってもよい。ある特定の実施形態では、完全なＦｃ部分は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン（例えば、ＥＵアミノ酸位置２１６～４４６）を含む。追加のリシン残基（Ｋ）が場合によりＦｃ部分の最もＣ末端に存在するが、これは多くの場合に成熟抗体から切断される。Ｆｃ部分内のアミノ酸位置は、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされてきた（例えば、Kabat, et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 and 1987を参照）。Ｆｃ部分のアミノ酸位置はまた、ＩＭＧＴナンバリングシステム（Ｃ-ドメインのための独特のナンバリングおよびエクソンナンバリングを含む）ならびにＫａｂａｔのナンバリングシステムにしたがってナンバリングされ得る。
一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジ（例えば、上、中、および／もしくは下ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異体、部分、もしくは断片の少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメインを含む。さらなる実施形態では、Ｆｃ部分は完全なＦｃ部分である。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの例示的なＦｃ部分のアミノ酸配列は配列番号９６において提供される。Ｆｃ部分はまた、天然に存在するＦｃ部分と比べて１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含んでもよい。例えば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、もしくはＣＨ３ドメイン、またはその部分の少なくとも１つは欠失していてもよい。例えば、Ｆｃ部分は、（ｉ）ＣＨ２ドメイン（もしくはその部分）に融合したヒンジドメイン（もしくはその部分）、（ｉｉ）ＣＨ３ドメイン（もしくはその部分）に融合したヒンジドメイン（もしくはその部分）、（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメイン（もしくはその部分）に融合したＣＨ２ドメイン（もしくはその部分）、（ｉｖ）ヒンジドメイン（もしくはその部分）、（ｖ）ＣＨ２ドメイン（もしくはその部分）、または（ｖｉ）ＣＨ３ドメインもしくはその部分を含むかまたはからなるものであってもよい。
本開示のＦｃ部分は、天然に存在するＦｃ部分によって付与される少なくとも１つの望ましい機能を保持（または増強）しながら、天然に存在する免疫グロブリン分子の完全なＦｃ部分からアミノ酸配列において変動するように改変されてもよい。そのような機能としては、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体半減期のモジュレーション（例えば、ＦｃＲｎへの結合による）、ＡＤＣＣ機能、プロテインＡ結合、プロテインＧ結合、および補体結合が挙げられる。そのような機能と関わる天然に存在するＦｃ部分の部分は、当技術分野で記載されている。
例えば、補体カスケードを活性化させるために、免疫グロブリン分子が抗原標的に取り付けられた場合に、Ｃ１ｑタンパク質複合体は、少なくとも２分子のＩｇＧ１または１分子のＩｇＭに結合し得る（Ward, E. S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 277-94 (1995)）。アミノ 酸残基３１８～３３７を含む重鎖領域は補体固定に関与する（Burton, D. R., Mol. Immunol. 22:161-206 (1985)）。Duncan, A. R., and Winter, G. (Nature 332:738-40 (1988))は、部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２はＣ１ｑに対する結合性部位を形成することを報告した。Ｃ１ｑの結合におけるＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２残基の役割は、補体媒介性溶解を阻害するこれらの残基を含有する短い合成ペプチドの能力によって確認された。
例えば、ＦｃＲ結合は、造血細胞を含む細胞上の特殊化した細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）とのＦｃ部分（抗体のＦｃ部分）の相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる抗体でコーティングされた病原体の除去、ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、対応する抗体でコーティングされた赤血球および様々な他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することを示した（Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49:511-24 (1991)）。ＦｃＲは、免疫グロブリンクラスに対するそれらの特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体のためのＦｃ受容体はＦｃγＲ、ＩｇＥのためのＦｃ受容体はＦｃεＲ、ＩｇＡのためのＦｃ受容体はＦｃαＲなどと称され、新生児Ｆｃ受容体はＦｃＲｎと称される。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ravetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel, P. J., et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995);およびGessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76:231-48 (1998)に記載されている。
天然のＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃドメインによる受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害性、および炎症性メディエーターの放出を含む多様なエフェクター機能の他に、免疫複合体クリアランスおよび抗体産生の調節のトリガーとなる。受容体（例えば、ＦｃγＲ）の架橋を提供するＦｃ部分が本明細書において想定される。ヒトにおいて、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴付けられている：（ｉ）高い親和性で単量体ＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球、および好酸球上に発現される、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、（ｉｉ）中～低い親和性で複合体化ＩｇＧに結合し、広く、特に白血球上に発現され、抗体媒介性免疫における中心的プレーヤーであると考えられており、免疫系において異なる機能を行うが、ＩｇＧ-Ｆｃに対して類似した低い親和性で結合するＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣに分けることができ、これらの受容体のエクトドメインが高度に相同的である、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびに（ｉｉｉ）中～低い親和性でＩｇＧに結合し、２つの形態：ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、および一部の単球およびＴ細胞上に見出されており、かつＡＤＣＣを媒介すると考えられているＦｃγＲＩＩＩＡ、および好中球上に高発現されるＦｃγＲＩＩＩＢにおいて見出されている、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）。
ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上に見出され、殺傷プロセスを活性化できるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ上ならびに肥満細胞および好酸球上に見出される。全てのＦｃγＲＩＩＢの７５％が肝臓中に見出されることが示されている（Ganesan, L. P., et al., Journal of Immunology 189:4981-8 (2012)）。ＦｃγＲＩＩＢは、ＬＳＥＣと呼ばれる肝臓洞様内皮上、および肝臓中のクッパー細胞中に豊富に発現され、ＬＳＥＣは小免疫複合体クリアランスの主要な部位である（Ganesan, L. P. et al., 2012、上掲）。
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体およびその抗原結合性断片は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合のためのＦｃ部分、特にＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ型抗体などを含む。さらに、Chu, S. Y. et al. (Molecular Immunology 45:3926-33 (2008))に記載されるように、突然変異Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを導入することによってＦｃ部分を操作してＦｃγＲＩＩＢ結合を増強することができる。それにより、免疫複合体のクリアランスは増強され得る（Chu, S., et al., Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts (2014)）。一部の実施形態では、本開示の抗体、またはその抗原結合性断片は、特にChu, S. Y. et al. (2008、上掲)に記載されるような、突然変異Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを有する操作されたＦｃ部分を含む。
Ｂ細胞上で、ＦｃγＲＩＩＢは、さらなる免疫グロブリン産生、および、例えばＩｇＥクラスへの、アイソタイプスイッチを抑制するように機能するようである。マクロファージ上で、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを通じて媒介されるようなファゴサイトーシスを阻害すると考えられている。好酸球および肥満細胞上で、ｂ型は、その別々の受容体へのＩｇＥ結合を通じてこれらの細胞の活性化を抑制するのを助けることがある。
ＦｃγＲＩ結合に関して、天然のＩｇＧにおけるＥ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、およびＰ３２９の少なくとも１つの改変は、ＦｃγＲＩへの結合を低減させる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４において対応する位置に置換された位置２３３～２３６におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへのＩｇＧ１およびＩｇＧ４の結合を１０３倍低減させ、抗体感作赤血球細胞に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K. L., et al., Eur. J. Immunol. 29:2613-2624 (1999)）。
ＦｃγＲＩＩ結合に関して、ＦｃγＲＩＩＡに対する低減した結合が、例えば、Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、およびＫ４１４の少なくとも１つのＩｇＧ突然変異について見出される。
ＦｃγＲＩＩＩ結合に関して、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する低減した結合が、例えば、Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、およびＤ３７６の少なくとも１つの突然変異について見出される。
Ｆｃ受容体についてのヒトＩｇＧ１上の結合性部位のマッピング、上記の突然変異部位、ならびにＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Shields, R. L., et al. (J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))に記載されている。
ＦｃγＲＩＩへの結合に関して、天然のＩｇＧ Ｆｃの２つの領域がＦｃγＲＩＩおよびＩｇＧの間の相互作用に関与するようであり、該領域はすなわち、（ｉ）ＩｇＧ Ｆｃの下ヒンジ部位、特に、アミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、およびＧ（２３４～２３７、ＥＵナンバリング）、ならびに（ｉｉ）ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接する領域、特に、ループおよび下ヒンジ領域に隣接する上ＣＨ２ドメイン中の鎖、例えばＰ３３１の領域中のものである（Wines, B.D., et al., J. Immunol. 164:5313 - 8 (2000)）。さらに、ＦｃγＲＩはＩｇＧ Ｆｃ上の同じ部位に結合するようであり、その一方、ＦｃＲｎおよびプロテインＡはＩｇＧ Ｆｃ上の異なる部位に結合し、該異なる部位は、ＣＨ２-ＣＨ３インターフェースにあるようである（Wines, B.D., et al., 2000,上掲）。
（１つまたは複数の）Ｆｃγ受容体に対する本開示のＦｃ部分の結合親和性を増加させる（例えば、参照Ｆｃ部分または突然変異を含まない抗体と比較して）突然変異もまた想定される。例えば、Delillo and Ravetch, Cell 161(5):1035-45 (2015)およびAhmed et al., J. Struc. Biol. 194(1):78 (2016)を参照。これらの文献のＦｃ突然変異および技術は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される任意の実施形態では、結合性タンパク質は、Ｇ２３６Ａ；Ｓ２３９Ｄ；Ａ３３０Ｌ；およびＩ３３２Ｅ；またはそれを含む組合せ；例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；およびＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅから選択される突然変異を含むＦｃ部分を含み得る。
ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎへの結合に関与するＦｃ部分の少なくとも部分を含むかまたはからなるものであってもよい。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎに対する結合親和性を向上させ、かつ一部の実施形態では、それによりＦｃ部分を含む分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させる（例えば、参照Ｆｃ部分または改変を含まない抗体と比較して）１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分はＩｇＧ Ｆｃを含むかまたはそれに由来し、半減期延長性突然変異は、Ｍ４２８Ｌ；Ｎ４３４Ｓ；Ｎ４３４Ｈ；Ｎ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｓ；Ｍ２５２Ｙ；Ｓ２５４Ｔ；Ｔ２５６Ｅ；Ｔ２５０Ｑ；Ｐ２５７Ｉ；Ｑ３１１Ｉ；Ｄ３７６Ｖ；Ｔ３０７Ａ；およびＥ３８０Ａ（ＥＵナンバリング）のいずれか１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、半減期延長性突然変異はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。ある特定の実施形態では、半減期延長性突然変異はＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含む。ある特定の実施形態では、半減期延長性突然変異はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌを含む。ある特定の実施形態では、半減期延長性突然変異はＰ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉを含む。ある特定の実施形態では、半減期延長性突然変異はＰ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈを含む。ある特定の実施形態では、半減期延長性突然変異はＤ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈを含む。ある特定の実施形態では、半減期延長性突然変異はＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａを含む。
特定の実施形態では、結合性タンパク質は、置換突然変異：Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳおよびＧ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含むＦｃ部分を含む。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、置換突然変異：Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳおよびＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含むＦｃ部分を含む。
特定の実施形態では、結合性タンパク質は、置換突然変異：Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含むＦｃ部分を含む。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、置換突然変異：Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含むＦｃ部分を含む。
代替的または追加的に、本開示の結合性タンパク質のＦｃ部分は、プロテインＡ結合のために要求される当技術分野で公知の少なくとも一部分を含むことができ、かつ／または本開示の抗体のＦｃ部分は、プロテインＧ結合のために要求される当技術分野で公知のＦｃ分子の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、保持される機能はＨＢｓＡｇおよびＨＢＶｇのクリアランスを含む。よって、ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、ＦｃγＲ結合のために要求される当技術分野で公知の少なくとも一部分を含む。上記に概説したように、Ｆｃ部分はそのため、少なくとも（ｉ）天然のＩｇＧ Ｆｃの下ヒンジ部位、特に、アミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、およびＧ（２３４～２３７、ＥＵナンバリング）、ならびに（ｉｉ）天然のＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接する領域、特に、ループおよび下ヒンジ領域に隣接する上ＣＨ２ドメイン中の鎖、例えば、Ｐ３３１の領域、例えば、Ｐ３３１の辺りの天然のＩｇＧ Ｆｃの上ＣＨ２ドメイン中の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続するアミノ酸の領域、例えば、天然のＩｇＧ Ｆｃのアミノ酸３２０～３４０（ＥＵナンバリング）の領域中のものを含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示による結合性タンパク質はＦｃ領域を含む。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖の２つまたはそれより多くのＦｃ部分によって形成される免疫グロブリンの部分を指す。例えば、Ｆｃ領域は単量体または「単鎖」Ｆｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）であってもよい。単鎖Ｆｃ領域は、単一のポリペプチド鎖内で連結した（例えば、単一の連続する核酸配列中にコードされる）Ｆｃ部分を含む。例示的なｓｃＦｃ領域はＷＯ ２００８／１４３９５４ Ａ２に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｃ領域は二量体Ｆｃ領域であるかまたはそれを含み得る。「二量体Ｆｃ領域」または「ｄｃＦｃ」は、２つの別々の免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分によって形成される二量体を指す。二量体Ｆｃ領域は、２つの同一のＦｃ部分（例えば、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域）のホモ二量体または２つの非同一のＦｃ部分のヘテロ二量体（例えば、二量体Ｆｃ領域の１つのＦｃ単量体は、他のＦｃ単量体中に存在しない少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入、もしくは化学的改変）を含み、もしくは１つのＦｃ単量体は他方と比較して切断されていてもよい）であってもよい。
本開示のＦｃ部分は、同じまたは異なるクラスおよび／またはサブクラスのＦｃ配列または領域を含んでもよい。例えば、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）、またはこれらの任意の組合せに由来してもよい。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域のＦｃ部分は同じクラスおよびサブクラスのものである。しかしながら、Ｆｃ領域（またはＦｃ領域の１つもしくは複数のＦｃ部分）はまたキメラであってもよく、それにより、キメラＦｃ領域は、異なる免疫グロブリンクラスおよび／またはサブクラスに由来するＦｃ部分を含んでもよい。例えば、二量体または単鎖Ｆｃ領域のＦｃ部分の少なくとも２つは、異なる免疫グロブリンクラスおよび／またはサブクラスからのものであってもよい。ある特定の実施形態では、二量体Ｆｃ領域は、２つまたはそれより多くの異なるアイソタイプまたはサブクラスからの配列、例えば、ＳＥＥＤボディ（「鎖交換操作ドメイン」）（Davis, et al., Protein Eng. Des. Sel. 23(4):195 (2010)を参照）を含み得る。
追加的または代替的に、キメラＦｃ領域は、１つまたは複数のキメラＦｃ部分を含んでもよい。例えば、キメラＦｃ領域または部分は、Ｆｃ領域または部分の残余が異なるサブクラスのものでありながら第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来する１つまたは複数の部分を含んでもよい。例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域または部分は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインならびに第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンからのヒンジ領域を含んでもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するヒンジおよび／またはＣＨ２ドメインならびに第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンからのＣＨ３ドメインを含んでもよい。例えば、キメラＦｃ領域は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンからのＦｃ部分（例えば、完全なＦｃ部分）および第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンからのＦｃ部分を含んでもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４免疫グロブリンからのＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１免疫グロブリンからのＣＨ３ドメインを含んでもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４分子からのＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインならびにＩｇＧ１分子からのＣＨ３ドメインを含んでもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、抗体の特定のサブクラスからのＣＨ２ドメインの部分、例えば、ＣＨ２ドメインのＥＵ位置２９２～３４０を含んでもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４部分に由来するＣＨ２の位置２９２～３４０におけるアミノ酸およびＩｇＧ１部分に由来するＣＨ２の残余を含んでもよい（代替的に、ＣＨ２の２９２～３４０はＩｇＧ１部分に由来し、ＣＨ２の残余はＩｇＧ４部分に由来してもよい）。
さらに、Ｆｃ領域または部分は、（追加的または代替的に）例えばキメラヒンジ領域を含んでもよい。例えば、キメラヒンジは、例えば、部分的に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４分子（例えば、上および下中央ヒンジ配列）に由来し、かつ部分的に、ＩｇＧ３分子（例えば、中央ヒンジ配列）に由来してもよい。別の例では、Ｆｃ領域または部分は、部分的に、ＩｇＧ１分子に由来し、かつ部分的に、ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含んでもよい。別の例では、キメラヒンジは、ＩｇＧ４分子からの上および下ヒンジドメインならびにＩｇＧ１分子からの中央ヒンジドメインを含んでもよい。そのようなキメラヒンジは、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域の中央ヒンジドメイン中のＥＵ位置２２８においてプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）を導入することによって作製されてもよい。一部の他の実施形態では、キメラヒンジは、ＩｇＧ２抗体からのＥＵ位置２３３～２３６におけるアミノ酸および／またはＳｅr２２８Ｐｒｏ突然変異を含むことができ、ヒンジの残りのアミノ酸はＩｇＧ４抗体からのもの［例えば、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰ（配列番号１０５）のキメラヒンジ］である。本開示による抗体のＦｃ部分において使用されてもよいさらなるキメラヒンジは、ＵＳ ２００５／０１６３７８３ Ａ１に記載されている。
一部の実施形態では、Ｆｃ部分またはＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するアミノ酸配列（例えば、ヒトＩｇＧ分子からのＦｃ領域またはＦｃ部分に由来するアミノ酸配列）を含むかまたはからなる。しかしながら、ポリペプチドは、別の哺乳動物種からの１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよい。例えば、霊長動物Ｆｃ部分または霊長動物結合性部位が対象ポリペプチド中に含まれてもよい。代替的に、１つまたは複数のマウスアミノ酸がＦｃ部分中またはＦｃ領域中に存在してもよい。
ｃ．ＨＢＣ３４およびＨＢＣ２４抗体
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、ＨＢＣ３４もしくはその操作された変異体、またはＨＢＣ２４もしくはその操作された変異体である。ＨＢＣ３４およびＨＢＣ２４は、高い中和活性を有するＨＢｓＡｇに対するヒト抗体である。ＨＢＣ３４は、高い親和性（ｐＭの範囲内）でＨＢｓＡｇの抗原性ループに結合し、１０個のＨＢＶ遺伝子型および１８個の突然変異体の全てを認識し、かつ低い化学量論で球状ＳＶＰに結合する。イムノアッセイを用いて診断的に測定されるＨＢＣ３４の活性は５０００ＩＵ／ｍｇである。比較として、ＨＢＩＧの活性は約１ＩＵ／ｍｇである。
本明細書において言及される場合、「ＨＢＣ３４抗体」および「ＨＢＣ抗体」という用語は、他に記載されなければ、野生型ＨＢＣ３４抗体またはその操作された変異体（例えば、表３に記載のＨＢＣ３４およびＨＢＣ３４変異体）を含み得る。
表３は、ＨＢＣ３４ならびにその操作された変異体（「ＨＢＣ３４ｖ７」、ＨＢＣ３４ｖ２３」、「ＨＢＣ３４ｖ３１」、「ＨＢＣ３４ｖ３２」、「ＨＢＣ３４ｖ３３」、「ＨＢＣ３４ｖ３４」、および「ＨＢＣ３４ｖ３５」）の他に、「ＨＢＣ２４」のもののＣＤＲ、重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す。本開示の例示的な抗体の全長重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列もまた示される。
表3. HBC34およびHBC24抗体の配列
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ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＨＢＣ３４、またはＨＢＣ３４抗体の非天然変異体である。ＨＢＣ３４の非天然変異体の例としては、例えば、「ＨＢＣ３４ｖ７」、ＨＢＣ３４ｖ２３」、「ＨＢＣ３４ｖ３１」、「ＨＢＣ３４ｖ３２」、「ＨＢＣ３４ｖ３３」、「ＨＢＣ３４ｖ３４」、および「ＨＢＣ３４ｖ３５」が挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、表３に記載の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本開示による抗体、またはその抗原結合性断片は、表３に示されるようなＣＤＲ配列、ＶＨ配列、ＶＬ配列、ＨＣ配列、および／またはＬＣ配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本開示の任意の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、表３に記載のＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、および／またはＬＣ配列を含み得る。
一部の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ｉ）それぞれ、配列番号４４、４５または４６、および４７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列；ならびに（ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、４９または５０、および５１または５２に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
よって、一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、および４７に記載のものである。一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号４４、４６、および４７に記載のものである。一部の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号４８、４９、および５１に記載のものである。一部の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号４８、４９、および５２に記載のものである。一部の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号４８、５０、および５１に記載のものである。一部の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号４８、５０、および５２に記載のものである。
本開示の抗体または抗原結合性断片は、配列番号４４～５２に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列の任意の組合せを含み得ることが理解されるであろう。
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号４４、４５、および４７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列；ならびにそれぞれ、配列番号４８、４９、および５１に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号４４、４５、および４７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列；ならびにそれぞれ、配列番号４８、４９、および５２に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号５５～６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５３または５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、
（ａ）配列番号５５～６３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、
（ａ）配列番号５５～５７または６４～６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、
（ｉ）（ａ）配列番号５５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉ）（ａ）配列番号５５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号５６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｖ）（ａ）配列番号５７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｖｉ）（ａ）配列番号５７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号５８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号５９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｘ）（ａ）配列番号６０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘ）（ａ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘｉ）（ａ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号６３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号６５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘｖ）（ａ）配列番号６６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号６７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号６８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号６９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は；
（ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはからなる軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはからなる重鎖、または
（ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはからなる軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはからなる重鎖、または
（ａ）配列番号８３～９５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはからなる軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２、９７、および９８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはからなる重鎖
を含む。
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号７１に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号９７に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
さらに他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
さらに他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号７１に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
さらに他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
さらに他の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる軽鎖、および（ｂ）配列番号９７に記載のアミノ酸配列を含むかまたはからなる重鎖を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、それぞれ、配列番号７７～８２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７６に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列；および（ｂ）配列番号７５に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、（ａ）配列番号７６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号７５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
ｄ．医薬組成物
一部の実施形態では、併用療法の抗体またはその抗原結合性断片は、抗ＨＢＶ抗体を含み、かつ薬学的に許容される担体を含んでもよい、医薬組成物として提供される。一部の実施形態では、組成物は、抗ＨＢＶ抗体を含んでもよく、抗体は、組成物中の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより多く）を構成してもよい。そのような組成物において、抗体は、精製された形態であってもよい。
抗ＨＢＶ抗体の医薬組成物は、特に複数回用量フォーマットにパッケージ化される場合、抗微生物剤を含んでもよい。それらは、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０を含んでもよい。界面活性剤が存在する場合、それは典型的には低いレベル、例えば、０．０１％未満で存在する。組成物はまた、張度のためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度でＮａＣｌを含む。
さらに、医薬組成物は、特に、凍結乾燥される場合、または凍結乾燥された材料から再構成された材料を含む場合、例えば約１５～３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）の、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースもしくはトレハロース）を含んでもよい。凍結乾燥用の組成物のｐＨは、凍結乾燥前に５～８、または５．５～７、または約６．１に調整されてもよい。
本開示の抗体組成物はまた、１つまたは複数の免疫調節剤を含んでもよい。一部の実施形態では、免疫調節剤の１つまたは複数はアジュバントを含む。
抗ＨＢＶ抗体の医薬組成物を調製する方法は、（ｉ）抗体を調製する工程、および（ｉｉ）精製された抗体を１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合する工程を含んでもよい。
ＩＶ．併用療法を使用する処置方法
一部の実施形態では、本開示は、ＨＢＶ感染またはＢ型肝炎ウイルス関連疾患を処置するための方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「対象」は、ＨＢＶに感染し得る任意の哺乳動物、例えば、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、もしくはチンパンジーなど）、またはＨＢＶ感染の許容される臨床モデルと考えられる動物、ＨＢＶ-ＡＡＶマウスモデル（例えば、Yang, et al., Cell and Mol Immunol 11:71 (2014)を参照されたい）もしくはＨＢＶ１．３ｘｆｓトランスジェニックマウスモデル（Guidotti, et al., J. Virol. 69:6158 (1995)）を含む哺乳動物などの動物である。 一部の実施形態では、対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を有する。一部の他の実施形態では、対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染と、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染との両方を有する。一部の他の実施形態では、対象は、ＨＢＶ感染、特に、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＣＨＢＶ）感染を有する人間などのヒトである。
本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」とは、限定されるものではないが、望ましくないＨＢＶ遺伝子発現またはＨＢＶ複製と関連する１つまたは複数の兆候または症状、例えば、血清または肝臓ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの存在、血清ＨＢＶ ＤＮＡの存在、血清または肝臓ＨＢＶ抗原、例えば、ＨＢｓＡｇもしくはＨＢｅＡｇの存在、ＡＬＴの上昇、ＡＳＴの上昇（正常範囲は、典型的には、約１０～３４Ｕ／Ｌと考えられる）、抗ＨＢＶ抗体の非存在または低レベルの抗ＨＢＶ抗体；肝臓傷害；肝硬変；デルタ肝炎；急性Ｂ型肝炎；急性劇症Ｂ型肝炎；慢性Ｂ型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；肝細胞癌；血清病様症候群；食欲不振；悪心；嘔吐、軽度発熱；筋肉痛；倦怠感；味覚鋭敏および嗅覚の障害（食品およびタバコに対する嫌悪）；または右上腹部痛および上腹部痛（間欠性、軽度から中等度）；肝性脳症；眠気；睡眠パターンの乱れ；精神錯乱；昏睡；腹水；消化管出血；凝血障害；黄疸；肝腫大（軽度拡大、柔らかい肝臓）；脾腫；手掌紅斑；クモ状母斑；筋消耗；クモ状血管腫；血管炎；静脈瘤出血；末梢浮腫；女性化乳房；精巣萎縮；腹部側副静脈（メズサの頭）；ＡＳＴレベルより高いＡＬＴレベル；ガンマ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）（正常範囲は、典型的には、約８～６５Ｕ／Ｌと考えられる）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベル（正常範囲は、典型的には、ＵＬＮの３倍を超えない、約４４～１４７ＩＵ／Ｌ（１リットルあたりの国際単位）と考えられる）の上昇；わずかに低いアルブミンレベル；血清鉄レベルの上昇；白血球減少症（すなわち、顆粒球減少症）；リンパ球増加症；赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の増大；赤血球生存の短縮；溶血；血小板減少症；国際標準化比（ＩＮＲ）の延長；血清または肝臓ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、Ｂ型肝炎コア抗体（抗ＨＢｃ）免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の存在；Ｂ型肝炎表面抗体（抗ＨＢｓ）、Ｂ型肝炎ｅ抗体（抗ＨＢｅ）、またはＨＢＶ ＤＮＡ；ビリルビンレベルの上昇；高グロブリン血症；抗平滑筋抗体（ＡＳＭＡ）または抗核抗体（ＡＮＡ）などの組織非特異的抗体の存在（１０～２０％）；甲状腺に対する抗体などの組織特異的抗体の存在（１０～２０％）；リウマチ因子（ＲＦ）レベルの上昇；低い血小板数および白血球数；変性性および再生性肝細胞変化と、付随する炎症を伴う小葉；ならびに検出可能であろうと、検出不可能であろうと、主に小葉中心性の壊死の軽減または改善を含む、有益な、または望ましい結果を指す。例えば、肝線維症を発症する可能性は、例えば、肝線維症の１つまたは複数の危険因子、例えば、慢性Ｂ型肝炎感染を有する個体が、同じ危険因子を有し、本明細書に記載の処置を受けていない集団と比較して、肝線維症を発症できないか、または低い重症度の肝線維症を発症する場合、低減される。「処置」はまた、処置の非存在下での予想される生存と比較して生存の延長を意味してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「防止すること」または「防止」とは、疾患、障害、もしくは状態の発症の失敗、またはそのような疾患、障害、もしくは状態と関連する兆候もしくは症状の発達の低減（例えば、臨床的に関連する量による）、または兆候の遅延もしくは症状の遅延の呈示（例えば、日、週、月、もしくは年による）を指す。防止は、１つより多い用量の投与を必要としてもよい。
一部の実施形態では、ＨＢＶ感染の処置は、Ｂ型肝炎の「機能的治癒」をもたらす。本明細書で使用される場合、機能的治癒は、循環ＨＢｓＡｇのクリアランスと理解され、ＨＢｓＡｇ抗体が臨床的に関連するアッセイを使用して検出可能になる状態への変換を伴ってもよい。例えば、検出可能な抗体は、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）または任意の他のイムノアッセイによって測定された場合に１０ｍＩＵ／ｍｌより高いシグナルを含んでもよい。機能的治癒は、全ての複製形態のＨＢＶ（例えば、肝臓に由来するｃｃｃＤＮＡ）のクリアランスを必要としない。抗ＨＢｓ血清変換は、１年あたり約０．２～１％の慢性感染患者において自然に生じる。しかしながら、抗ＨＢｓ血清変換後であっても、ＨＢＶの低レベルの持続性が数十年にわたって観察されることが多く、完全な治癒よりもむしろ機能的治癒が起こることを示している。特定の機構に束縛されないが、免疫系は、機能的治癒が達成された条件下でＨＢＶを抑制することができるかもしれない。機能的治癒は、ＨＢＶ感染の任意の処置の中止を可能にする。しかしながら、ＨＢＶ感染のための「機能的治癒」は、ＨＢＶ感染の結果生じる疾患または状態、例えば、肝線維症、ＨＣＣ、または肝硬変を防止または処置するのに十分なものでなくてもよいと理解される。一部の特定の実施形態では、「機能的治癒」は、処置レジメンの開始または処置レジメンの完了後、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年にわたって、１ＩＵ／ｍＬ未満などの血清ＨＢｓＡｇの持続的低下を指してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「Ｂ型肝炎ウイルス関連疾患」または「ＨＢＶ関連疾患」は、ＨＢＶ感染または複製によって引き起こされる、またはそれと関連する疾患または障害である。用語「ＨＢＶ関連疾患」は、ＨＢＶ遺伝子発現または複製の低減から利益を得るであろう疾患、障害または状態を含む。ＨＢＶ関連疾患の非限定例としては、例えば、Ｄ型肝炎ウイルス感染、デルタ肝炎、急性Ｂ型肝炎；急性劇症Ｂ型肝炎；慢性Ｂ型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；および肝細胞癌が挙げられる。
一部の実施形態では、ＨＢＶ関連疾患は、Ｄ型肝炎ウイルス感染である。Ｄ型肝炎ウイルスまたはデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）は、ヒト病原体である。しかしながら、このウイルスは欠陥があり、伝染のためにＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によってもたらされる必須のヘルパー機能に依存する；実際、ＨＤＶは、感染性になり、繁栄するために、関連する、または元々存在するＨＢＶ感染、特に、Ｂ型肝炎の表面抗原を含有するウイルスエンベロープを必要とする。ＨＤＶは、ＨＢＶと関連する重篤な急性および慢性形態の肝疾患をもたらし得る。Ｄ型肝炎感染またはデルタ肝炎は、いくつかのアフリカ諸国、アマゾン地域、および中東で高度に風土性であるが、その流行は地中海を除く工業国においては少ない。
ＨＤＶの伝染は、ＨＢＶによる同時的感染（同時感染）によって、または慢性Ｂ型肝炎もしくはＢ型肝炎キャリア状態に併発して（重複感染）起こり得る。ＨＤＶとの重複感染と同時感染は両方とも、典型的には、ＨＢＶ単独による感染と比較して、より重篤な合併症をもたらす。これらの合併症は、急性感染において肝不全および肝硬変への急速な進行を経験するより高い可能性と共に、慢性感染において肝臓がんを発症する機会の増加を含む。Ｂ型肝炎ウイルスと共に、Ｄ型肝炎は、２０％で、全ての肝炎感染のうち最も高い致死率を有する。
一部の実施形態では、ＨＢＶ関連疾患は、急性Ｂ型肝炎である。急性Ｂ型肝炎は、６ヶ月未満続く肝臓の炎症を含む。急性Ｂ型肝炎の典型的な症状は、疲労、食欲不振、悪心、および嘔吐である。非常に高いアミノトランスフェラーゼ値（１０００Ｕ／Ｌを超える）および高ビリルビン血症が観察されることが多い。急性Ｂ型肝炎の重症例では、弱い肝臓合成機能を特徴とする急性肝不全に急速に進行し得る。これは、以前の肝疾患の非存在下で、１６秒のプロトロンビン時間（ＰＴ）または１．５の国際標準化比（ＩＮＲ）と定義されることが多い。急性Ｂ型肝炎は、慢性Ｂ型肝炎に発展し得る。
一部の実施形態では、ＨＢＶ関連疾患は、慢性肝炎である。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）は、６ヶ月を超えて続く肝臓の炎症を含む。ＣＨＢを有する対象は、ＨＢｓＡｇ陽性であり、高ウイルス血（血液１ｍｌあたり１０４以上のＨＢＶ-ＤＮＡコピー）または低ウイルス血（血液１ｍｌあたり１０３未満のＨＢＶ-ＤＮＡコピー）を有する。ある特定の実施形態では、対象は、少なくとも５年間にわたってＨＢＶに感染している。ある特定の実施形態では、対象は、少なくとも１０年間にわたってＨＢＶに感染している。ある特定の実施形態では、対象は、誕生時にＨＢＶに感染した。慢性Ｂ型肝炎疾患を有する対象は、免疫寛容であってよいか、または活動性疾患の証拠がない不活性慢性感染を有してもよく、彼らは無症候性でもある。特に、複製状態の間に、慢性活動性肝炎を有する患者は、急性肝炎のものと類似する症状を有し得る。慢性Ｂ型肝炎疾患を有する対象は、壊死性炎症性肝疾患を伴う活動性慢性感染を有し得、検出可能な壊死性炎症の非存在下で肝細胞代謝回転の増加を有し得、または活動性疾患の証拠がない不活性慢性感染を有し得、彼らは無症候性でもある。ＣＨＢ対象におけるＨＢＶ感染の持続性は、ｃｃｃＨＢＶ ＤＮＡの結果である。一部の実施形態では、ＣＨＢを有する対象は、ＨＢｅＡｇ陽性である。一部の他の実施形態では、ＣＨＢを有する対象は、ＨＢｅＡｇ陰性である。ＣＨＢを有する対象は、１０５未満の血清ＨＢＶ ＤＮＡレベルを有し、トランスアミナーゼ、例えば、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびガンマ-グルタミルトランスフェラーゼの持続的上昇を示す。ＣＨＢを有する対象は、４未満の肝臓生検スコア（例えば、壊死性炎症スコア）を有してもよい。
一部の実施形態では、ＨＢＶ関連疾患は、急性劇症Ｂ型肝炎である。急性劇症Ｂ型肝炎を有する対象は、急性肝炎の症状ならびに錯乱または昏睡（肝臓が化学物質を解毒することができないため）および打撲傷または出血（血液凝固因子の欠如のため）のさらなる症状を有する。
ＨＢＶ感染、例えば、ＣＨＢを有する対象は、肝線維症を発症し得る。したがって、一部の実施形態では、ＨＢＶ関連疾患は、肝線維症である。肝線維症、または肝硬変は、線維症（過剰の線維性結合組織）および正常な肝臓構造の構造的に異常な結節への変換を特徴とする広範性肝臓プロセスとして組織学的に定義される。
ＨＢＶ感染、例えば、ＣＨＢを有する対象は、末期肝疾患を発症し得る。したがって、一部の実施形態では、ＨＢＶ関連疾患は、末期肝疾患である。例えば、肝線維症は、身体が肝線維症の結果として、例えば、肝機能の低下を補うことが最早できない点（すなわち、非代償性肝臓）まで進行し、例えば、精神および神経症状ならびに肝不全をもたらし得る。
ＨＢＶ感染、例えば、ＣＨＢを有する対象は、悪性ヘパトーマとも呼ばれる、肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症し得る。したがって、一部の実施形態では、ＨＢＶ関連疾患は、ＨＣＣである。ＨＣＣは一般に、ＣＨＢを有する対象において生じ、線維層性、偽腺性（アデノイド）、多形性（巨細胞）、または明細胞であってもよい。
「ＨＤＶ関連障害」または「Ｄ型肝炎ウイルス関連障害」は、ＨＤＶの発現と関連する疾患または障害である。例示的なＨＤＶ関連障害としては、Ｂ型肝炎ウイルス感染、急性Ｂ型肝炎、急性Ｄ型肝炎；急性劇症Ｄ型肝炎；慢性Ｄ型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；および肝細胞癌が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患を有する対象を処置するために患者に投与した場合、疾患の処置を行う（例えば、存在する疾患または疾患の１つもしくは複数の症状を軽減する、または維持することによる）のに十分であるＲＮＡｉ剤または抗ＨＢＶ抗体の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤および／または抗ＨＢＶ抗体、それらを投与する方法、疾患およびその重症度、ならびに履歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、ＨＢＶ遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの段階、もし存在する場合、以前の処置または同時に行う処置の種類、ならびに処置しようとする患者の他の個々の特徴に応じて変化してもよい。治療有効量は、１つより多い用量の投与を必要としてもよい。
「治療有効量」はまた、任意の処置に適用できる合理的な利益／危険比でいくらかの望ましい効果をもたらすＲＮＡｉ剤または抗ＨＢＶ抗体の量を含む。本開示の方法において使用される治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤、抗ＨＢＶ抗体）を、そのような処置に適用できる合理的な利益／危険比をもたらすのに十分な量で投与することができる。
本明細書で使用される場合、用語「試料」は、対象から単離される同様の流体、細胞、または組織の収集物、ならびに対象内に存在する流体、細胞、または組織を含む。生物学的流体の例としては、血液、血清、および漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、臓器または局部領域に由来する試料を含んでもよい。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の部分、またはこれらの臓器内の流体もしくは細胞に由来してもよい。ある特定の実施形態では、試料は、肝臓（例えば、全肝臓または肝臓のある特定のセグメントまたは例えば、肝細胞などの、肝臓中のある特定の型の細胞）に由来してもよい。ある特定の実施形態では、「対象に由来する試料」とは、血液、または対象から採取された血液から得られる血漿もしくは血清を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来する試料」とは、対象に由来する肝臓組織（もしくはその下位成分）または血液組織（もしくはその下位成分、例えば、血清）を指す。
本開示の一部の実施形態は、それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患を処置する方法であって、（ｉ）ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を対象に投与すること；および（ｉｉ）抗ＨＢＶ抗体を対象に投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤は、抗ＨＢＶ抗体の前に投与される。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体の前にＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を投与することは、抗ＨＢＶ抗体が投与される場合にウイルス量の低減を引き起こす。ある特定の実施形態では、併用療法の抗ＨＢＶ抗体の治療有効量は、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤が対象に投与されていない場合（例えば、抗ＨＢＶ抗体が単剤療法として単独で投与される場合）に送達される抗ＨＢＶ抗体の治療有効量よりも少ない。一部の実施形態では、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤は、ＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。
ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患を処置する方法であって、対象に、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を投与すること；および対象に、抗ＨＢＶ抗体を投与すること；およびさらに、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を投与する前後に対象由来の血液試料中に存在するＨＢｓＡｇの量を測定することを含み、ＨＢｓＡｇの減少が、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現の低下を示す、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患の処置における使用のためのＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤であって、対象が抗ＨＢＶ抗体をその後投与される、薬剤を提供する。ある特定の他の実施形態では、本開示は、対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患の処置における使用のための抗ＨＢＶ抗体を提供し、対象はＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を以前に投与されている。さらなる実施形態では、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現は、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤の投与後に低下し、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が低下する場合、抗ＨＢＶ抗体が対象に投与される。
ある特定の実施形態では、本開示は、慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患の処置のための医薬の製造におけるＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤および／または抗ＨＢＶ抗体の使用を提供する。
本開示の一部の実施形態は、それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患を処置する方法であって、（ｉ）ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を対象に投与すること；および（ｉｉ）抗ＨＢＶ抗体を対象に投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、抗ＨＢＶ抗体の前に投与される。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体の前にＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与することは、抗ＨＢＶ抗体が投与される場合にウイルス量の低減を引き起こす。ある特定の実施形態では、併用療法の抗ＨＢＶ抗体の治療有効量は、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤が対象に投与されていない場合（例えば、抗ＨＢＶ抗体が単剤療法として単独で投与される場合）に送達される抗ＨＢＶ抗体の治療有効量よりも少ない。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現は、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与した後に低下し、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が低下する場合、抗ＨＢＶ抗体が対象に投与される。特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶ Ｘ遺伝子および／またはＨＢｓＡｇである。
ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患を処置する方法であって、対象に、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与すること；および対象に、抗ＨＢＶ抗体を投与すること；およびさらに、ＨＢＶ発現の阻害剤を投与する前後に対象由来の血液試料中に存在するＨＢｓＡｇの量を測定することを含み、ＨＢｓＡｇの減少が、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現の低下を示す、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患の処置における使用のためのＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤であって、対象が抗ＨＢＶ抗体をその後投与される、阻害剤を提供する。ある特定の他の実施形態では、本開示は、対象における慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患の処置における使用のための抗ＨＢＶ抗体を提供し、対象は遺伝子発現の阻害剤を以前に投与されている。さらなる実施形態では、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現は、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与した後に低下し、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が低下する場合、抗ＨＢＶ抗体が対象に投与される。
ある特定の実施形態では、本開示は、慢性ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連疾患の処置のための医薬の製造におけるＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤および／または抗ＨＢＶ抗体の使用を提供する。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用のいずれかにおいて、方法および組成物は慢性ＨＢＶ感染を処置するために使用することができる。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、単一用量、２つの用量、３つの用量、４つの用量、または５つの用量で投与される。ある特定の実施形態では、少なくとも第１の用量のＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、抗ＨＢＶ抗体を投与する前に投与される。
ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、単一用量、２つの用量、３つの用量、４つの用量、または５つの用量、６つの用量、７つの用量、または８つの用量で投与される。１つまたは複数の用量を、例えば、１日２回、１日１回、２日毎に、３日毎に、週２回、週１回、隔週で、４週毎に、または月１回投与してもよい。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体を投与することは、抗ＨＢＶ抗体を週２回、週１回、隔週で、２週毎に、または月１回投与することを含む。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体を投与することは、少なくとも２つの用量の治療有効量の抗ＨＢＶ抗体を投与することを含む。ある特定のさらなる実施形態では、少なくとも２つの用量は、週２回、週１回、隔週で、２週毎に、または月１回投与される。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体を投与することは、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与した少なくとも１週間後に開始する。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体を投与することは、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与した２週間後に開始する。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体を投与することは、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与した８週間後に開始する。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体と、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤とは、それぞれ皮下投与される。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪを認識することができる。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、ヒト抗体；モノクローナル抗体；またはＨＢｓＡｇに対する第１の特異性および免疫エフェクターを刺激する第２の特異性（例えば、細胞傷害性もしくはワクチン効果を刺激する第２の特異性）を有する二特異性抗体であってもよい。本明細書に開示される上記方法、使用のための組成物、または製造における使用のある特定の他の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、モノクローナル抗体である。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、本明細書に開示されるようなＨＢＣ３４またはＨＢＣ３４の非天然変異体であってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ｉ）配列番号４４、４５、４７～４９、および５１；または（ｉｉ）配列番号４４、４５、４７～４９、および５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、配列番号４４、４５、４７、４８、４９、および５１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、配列番号４４、４５、４７、４８、４９、および５２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（１）（ａ）配列番号５５～６３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または（２）（ａ）配列番号５５～５７および６４～６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（１）（ａ）配列番号５５～６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または（２）（ａ）配列番号５５～６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号５９に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列；および（ｂ）配列番号５３に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号５８に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列；および（ｂ）配列番号５３に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。
方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖を含む。
方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖を含む。
方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号８３～９５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２、９７および９８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖を含む。
方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号７３に記載の軽鎖アミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７０に記載の重鎖アミノ酸配列を含む。
方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号７３に記載の軽鎖アミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７１に記載の重鎖アミノ酸配列を含む。
方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号７４に記載の軽鎖アミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７０に記載の重鎖アミノ酸配列を含む。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用のある特定の他の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、配列番号７７～８２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。上記方法、使用のための組成物、または製造における使用のある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号７６に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列；および（ｂ）配列番号７５に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用のある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、（ａ）配列番号７６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および（ｂ）配列番号７５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体の治療有効量は、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤が対象に投与されていない場合に送達される抗ＨＢＶ抗体の治療有効量よりも少ない。例えば、併用療法は、抗ＨＢＶ抗体のみの投与と比較して、抗ＨＢＶ抗体の有効用量を低下させることができる。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体は、少なくとも２つの別々の用量で投与される。特定の実施形態では、少なくとも２つの用量は、週２回、週１回、隔週で、２週毎に、または月１回投与される。
ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、抗ＨＢＶ抗体の治療有効量が投与される；治療有効量は約３ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇである。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、阻害剤は、ＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤である。一部の実施形態では、ＨＢＶ転写物の発現の阻害は、ｒｔＰＣＲによって測定される。一部の実施形態では、ＨＢＶ転写物の発現の阻害は、ＥＬＩＳＡによって測定されるタンパク質レベルの低下によって測定される。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖が配列番号１のヌクレオチド１５７９～１５９７と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖が配列番号１のヌクレオチド１５７９～１５９７を含む、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖は、少なくとも１ヌクレオチドまたは少なくとも２ヌクレオチドの３’突出部を含んでもよい。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さ；１７～２３ヌクレオチド対の長さ；１７～２５ヌクレオチド対の長さ；２３～２７ヌクレオチド対の長さ；１９～２１ヌクレオチド対の長さ；または２１～２３ヌクレオチド対の長さであってもよい。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖は、１５～３０ヌクレオチドまたは１９～３０ヌクレオチドであってもよい。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ｓｉＲＮＡである。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＨＢｓＡｇタンパク質、ＨＢｃＡｇタンパク質、およびＨＢｘタンパク質、またはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼタンパク質をコードするＨＢＶ転写物の発現を阻害する。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、Ｐ遺伝子、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド２３０９～３１８２および１～１６２５；Ｓ遺伝子（Ｌ、Ｍ、およびＳタンパク質をコードする）、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド２８５０～３１８２および１～８３７；ＨＢｘ、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド１３７６～１８４０；またはＣ遺伝子、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド１８１６～２４５４によってコードされる標的の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに結合する。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤はｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）のヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドまたは１９個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）のヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、５’-ＧＵＧＵＧＣＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＡＣＡ-３’（配列番号３）のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、５’-ＧＵＧＵＧＣＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＡＣＡ-３’（配列番号３）のヌクレオチド配列からなる。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤はｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）のヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドまたは１９個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）のヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、５’-ＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵＵＵＵＡ-３’（配列番号１０６）のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、５’-ＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵＵＵＵＡ-３’（配列番号１０６）のヌクレオチド配列からなる。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ｓｉＲＮＡであり、前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは改変ヌクレオチドであり、前記センス鎖は、３’末端で結合したリガンドにコンジュゲートされる。特定の実施形態では、リガンドは、一価リンカー、二価分枝状リンカー、または三価分枝状リンカーを介して結合した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。ある特定の実施形態では、リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃ誘導体は、
Figure 2022515778000050
 であるか、またはそれを含む。
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下の概略図：
Figure 2022515778000051
 （式中、ＸはＯまたはＳである）
に示されるリガンドにコンジュゲートされる（すなわち、リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃ誘導体）。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤はｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、デオキシ-ヌクレオチド、３’末端デオキシ-チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’-Ｏ-メチル改変ヌクレオチド、２’-フルオロ改変ヌクレオチド、２’-デオキシ改変ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、コンフォメーション限定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’-アミノ改変ヌクレオチド、２’-Ｏ-アリル改変ヌクレオチド、２’-Ｃ-アルキル改変ヌクレオチド、２’-ヒドロキシル改変ヌクレオチド、２’-メトキシエチル改変ヌクレオチド、２’-Ｏ-アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン改変ヌクレオチド、１，５-アンヒドロヘキシトール改変ヌクレオチド、シクロヘキセニル改変ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’-リン酸を含むヌクレオチド、アデノシン-グリコール核酸、または５’-リン酸模倣体を含むヌクレオチドを含む改変ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、リン酸骨格改変、２’リボース改変、５’三リン酸改変、またはＧａｌＮＡｃコンジュゲーション改変を含む。ある特定の実施形態では、リン酸骨格改変は、ホスホロチオエート結合を含む。ある特定の実施形態では、２’リボース改変は、フルオロまたは-Ｏ-メチル置換を含む。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’-ｇｓｕｓｇｕＧｆｃＡｆＣｆＵｆｕｃｇｃｕｕｃａｃａＬ９６-３’（配列番号５）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＧｆｓｕｇａＡｆｇＣｆＧｆａａｇｕＧｆｃＡｆｃａｃｓｕｓｕ-３’（配列番号６）を含むアンチセンス鎖と
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは、それぞれ、２’-Ｏ-メチルアデノシン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルシチジン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルグアノシン-３’-リン酸、および２’-Ｏ-メチルウリジン-３’-リン酸であり；
Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’-フルオロアデノシン-３’-リン酸、２’-フルオロシチジン-３’-リン酸、２’-フルオログアノシン-３’-リン酸、および２’-フルオロウリジン-３’-リン酸であり；
ｓは、ホスホロチオエート結合であり；
Ｌ９６は、Ｎ-［トリス（ＧａｌＮＡｃ-アルキル）-アミノデカノイル）］-４-ヒドロキシプロリノールである）
を有するｓｉＲＮＡである。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’-ｇｓｕｓｇｕＧｆｃＡｆＣｆＵｆｕｃｇｃｕｕｃａｃａＬ９６-３’（配列番号７）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＧｆｓｕｇａ（Ａｇｎ）ｇＣｆＧｆａａｇｕＧｆｃＡｆｃａｃｓｕｓｕ-３’（配列番号８）を含むアンチセンス鎖と
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは、それぞれ、２’-Ｏ-メチルアデノシン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルシチジン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルグアノシン-３’-リン酸、および２’-Ｏ-メチルウリジン-３’-リン酸であり；
Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’-フルオロアデノシン-３’-リン酸、２’-フルオロシチジン-３’-リン酸、２’-フルオログアノシン-３’-リン酸、および２’-フルオロウリジン-３’-リン酸であり；
（Ａｇｎ）は、アデノシン-グリコール核酸（ＧＮＡ）であり；
ｓは、ホスホロチオエート結合であり；
Ｌ９６は、Ｎ-［トリス（ＧａｌＮＡｃ-アルキル）-アミノデカノイル）］-４-ヒドロキシプロリノールである）
を有するｓｉＲＮＡである。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５’-ｇｓｇｓｕｇｇａＣｆｕＵｆＣｆＵｆｃｕｃａＡｆＵｆｕｕｕａＬ９６-３’（配列番号１０８）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＡｆｓａａａＵｆｕＧｆＡｆｇａｇａＡｆｇＵｆｃｃａｃｃｓａｓｃ-３’（配列番号１０９）を含むアンチセンス鎖と
（式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは、それぞれ、２’-Ｏ-メチルアデノシン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルシチジン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルグアノシン-３’-リン酸、および２’-Ｏ-メチルウリジン-３’-リン酸であり；
Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’-フルオロアデノシン-３’-リン酸、２’-フルオロシチジン-３’-リン酸、２’-フルオログアノシン-３’-リン酸、および２’-フルオロウリジン-３’-リン酸であり；
ｓは、ホスホロチオエート結合であり；
Ｌ９６は、Ｎ-［トリス（ＧａｌＮＡｃ-アルキル）-アミノデカノイル）］-４-ヒドロキシプロリノールである）
を有するｓｉＲＮＡである。
上記方法、使用のための組成物、または製造における使用の特定の実施形態では、対象はヒトであり、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡの治療有効量は対象に投与され；ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡの有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇである。
本明細書に開示される方法、使用のための組成物、または使用の一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１日２回、１日１回、２日毎に、３日毎に、週２回、週１回、隔週で、４週毎に、または月１回、対象に投与される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、４週毎に対象に投与される。
ある特定の実施形態では、方法は、ＨＢＶ遺伝子発現の２つの阻害剤と共に、抗ＨＢＶ抗体を投与することを含む。ＨＢＶ遺伝子発現の２つの阻害剤は、異なるＨＢＶ遺伝子を標的とする２つのｓｉＲＮＡなどの２つのｓｉＲＮＡであってもよい。２つの異なるＨＢＶ遺伝子は、例えば、ＨＢｓＡｇ、およびＨＢＶＸであってもよい。ＨＢＶ遺伝子発現の２つの阻害剤を、同時に投与してもよい。ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子をそれぞれ指向する２つのｓｉＲＮＡが投与され、第１のｓｉＲＮＡは、配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含むアンチセンス鎖を有する；および第２のｓｉＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド２８５０～３１８２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子をそれぞれ指向する２つのｓｉＲＮＡが投与され、第１のｓｉＲＮＡは、配列番号１０７または配列番号１０９を含むアンチセンス鎖を有する；および第２のｓｉＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド２８５０～３１８２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子をそれぞれ指向する２つのｓｉＲＮＡが投与され、第１のｓｉＲＮＡは、配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含むアンチセンス鎖を有する；および第２のｓｉＲＮＡは、配列番号１０７または配列番号１０９を含むアンチセンス鎖を有する。ある特定の実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、配列番号３、配列番号５、または配列番号７を含むセンス鎖を有する；および第２のｓｉＲＮＡは、配列番号１０６または配列番号１０８を含むセンス鎖を有する。
ある特定の実施形態では、抗ＨＢＶ抗体と、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤とは、相乗的治療効果を示す。用語「相乗効果」は、それぞれ個々の活性薬剤の個々の効果の合計よりも大きい、２つ以上の活性薬剤の組み合わせた効果を記述するために使用される。したがって、２つ以上の薬剤の組み合わせた効果が活性またはプロセスの「相乗的阻害」をもたらす場合、活性またはプロセスの阻害は、それぞれ個々の活性薬剤の阻害効果の合計よりも大きいことが意図される。用語「相乗的治療効果」とは、治療効果（いくつかのパラメーターのうちのいずれかによって測定される）が、それぞれ個々の療法について観察される個々の治療効果の合計よりも大きい、２つ以上の療法の組合せについて観察される治療効果を指す。
一部の実施形態では、ＨＢＶ ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ剤は、例えば、対象の細胞、組織、血液、または流体中の、１つまたは複数のＨＢＶ遺伝子の発現、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡレベル、ＨＢＶ抗原レベル、ＨＢＶウイルス量レベル、ＡＬＴ、および／またはＡＳＴが、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上低減するように、ＨＢＶ感染、および／またはＨＢＶ関連疾患を有する対象に投与される。
一部の実施形態では、ＨＢＶ ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶ感染、および／またはＨＢＶ関連疾患を有する対象に投与され、ＨＢＶ遺伝子発現を、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または約１００％、すなわち、アッセイの検出レベルより下に阻害する。
一部の実施形態では、本開示による併用療法は、第３の成分としてヌクレオチ（シ）ドアナログを投与することを含む。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチ（シ）ドアナログ」（または「ポリメラーゼ阻害剤」または「逆転写酵素阻害剤」）は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドと構造的に類似し、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの複製を特異的に阻害し、宿主（例えば、ヒト）ＤＮＡの複製を有意に阻害しない、ＤＮＡ複製の阻害剤である。そのような阻害剤としては、テノホビルジソプロキシルフマレート（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＴＡＦ）、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン、ＡＧＸ-１００９、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、Ｎ-アセチル-システイン（ＮＡＣ）、ＰＣ１３２３、テラダイム-ＨＢＶ、サイモシン-アルファ、ガンシクロビル、ベシホビル（ＡＮＡ-３８０／ＬＢ-８０３８０）、およびテノホビル-エキサリアド（ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７）が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチ（シ）ドアナログは、エンテカビル（ＥＴＶ）である。ヌクレオチ（シ）ドアナログは、いくつかの供給源から市販されており、ＨＢＶの処置において、そのラベル表示に従って本明細書に提供される方法（例えば、典型的には、特定の用量で経口投与される）において、または当業者によって決定されるように使用される。
抗ＨＢＶ抗体またはＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤は、第３の活性成分として同じ医薬組成物中に存在してもよいか、または抗ＨＢＶ抗体、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤、および第３の活性成分は、３つの異なる医薬組成物中に存在する。そのような異なる医薬組成物を、組み合わせて／同時に、または別々の時間に、または別々の位置（例えば、身体の別々の部分）に投与することができる。
Ｖ．ＨＢＶ併用療法のためのキット
ＨＢＶ療法の成分を含むキットが本明細書で提供される。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の抗ＨＢＶ抗体、ＨＢＶ遺伝子発現の１つまたは複数の阻害剤、および必要に応じて、ＨＢＶ併用療法の第３の成分（例えば、ヌクレオチ（シ）ドアナログ）を含む。キットは、ＨＢＶ併用療法の成分を調製する、および／または投与するための使用説明書をさらに含んでもよい。
抗体およびＨＢＶ標的化ＳＩＲＮＡを用いる併用療法はＡＡＶ-ＨＢＶマウスにおいてＨＢＶ感染のマーカーを減少させる
ｓｉＲＮＡ-抗体併用療法がＨＢＶ感染の処置において有効であり得るかどうかを決定するために、ＡＡＶ／ＨＢＶ感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１４の異なる処置の１つを投与した：（１）ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＢＶ０２、配列番号８のアンチセンス鎖を有する）；（２）～（５）４つの用量の１つでの抗ＨＢＶ抗体（ＨＢＣ３４抗体ＨＢＣ３４ｖ７のマウスキメラバージョン、ＨＢＣ３４-ｖ７-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ）；（６～７）２つの抗体用量の１つでのＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびＨＢＣ３４-ｖ７-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ抗体；（８～１１）４つの抗体用量の１つでの、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、ＨＢＣ３４-ｖ７-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ抗体、およびエンテカビル（ＥＴＶ）；（１２）対照ｓｉＲＮＡおよび対照抗体；（１３）エンテカビルのみ；または（１４）生理食塩水のみ（表４を参照）。
表4.処置レベルおよび投薬量
Figure 2022515778000052

ＨＢＶ０２は、３つのＧａｌＮＡｃ残基を含有するリガンドに共有結合的に連結した化学的に合成された二本鎖オリゴヌクレオチドである。全てのヌクレオシドは２’-ＯＭｅまたは２’-Ｆ改変されており、アンチセンス鎖の１つのヌクレオシドは（Ｓ）-１-（２，３-ジヒドロキシプロピル）アデノシン（Ａｇｎ）で置き換えられている。センスおよびアンチセンス鎖のヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの糖-リン酸骨格を形成する３’-５’ホスホジエステル結合または３’-５’ホスホロチオエート結合を通じて接続されている。
ＨＢＣ３４は、ＨＢＶ表面抗原（ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、およびＳ）に対する高度に中和性のモノクローナル抗体である。この実験において使用されたＨＢＣ３４抗体は、ＨＢＶ表面抗原に結合するＦａｂ断片の部分を例外として、完全マウス化ＨＢＣ３４ｖ７であった。ヒトＨＢＣ３４ｖ７は、配列番号５３に記載のＶＨ配列および配列番号５６に記載のＶＬ配列を有する。この実験のためのＨＢＣ３４-ｖ７-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ抗体において使用されたＨＢＣ３４ｖ７配列のマウスキメラバージョンは、それぞれ配列番号９９および１００に記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有していた。
ヒトトランスサイレチン遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡは、血清中の感染のＨＢＶマーカーにおける減少（ｄｅｓｃｒｅａｓｅ）を引き起こすとは予期されないので、これを対照ｓｉＲＮＡとして使用した。
この実施例において使用された対照モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、呼吸器合胞体ウイルスに特異的な抗体であり、血清中の感染のＨＢＶマーカーにおける減少を引き起こすとは予期されない。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統）に以下の量のｒＡＡＶ８-１．３ＨＢＶ株ａｙｗ、Ｄ型：２００μｌの容量中１．０Ｘ１０１１個のウイルスゲノム／マウスを尾静脈注射を介して接種した。ウイルス接種の４週後、試験化合物を用いる処置を開始した。
投薬スケジュールを図１に示す。エンテカビルを１日１回経口的に投与した。ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡを研究の開始に皮下に１回投与し、研究の３～４週目の間に、抗ＨＢＶ抗体を週２回腹腔内に投与した。マウスのサブセットを４週目に屠殺し、他のサブセットを研究の６週目に屠殺した。
週２回、ウイルス量、ＨＢｓＡｇ、および遊離ＨＢＣ３４抗体を血清試料から測定した。血清ＨＢｅＡｇ、血清アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、肝臓ＨＢｃＡｇ、肝臓ＨＢｓＡｇ、肝臓中の総ＨＢＶ ＤＮＡ（ｑＰＣＲによる）、および血清抗ＨＢＶ抗体についても測定した。肝臓リンパ球、脾臓細胞、およびリンパ節（門脈／腹腔対鼠径部）をアッセイしてＨＢＶ特異的ＩＦＮｇ＋ＣＤ４＋細胞およびＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋細胞の割合を決定した。
処置群についての平均ＨＢｓＡｇ値を表５に示す。
表5. HBV特異的siRNA、抗HBV抗体、および/もしくはエンテカビル(ETV)を用いたか、または対照を用いた処置後のマウス血清からのHBsAgレベルa。
Figure 2022515778000053
 a平均log[HBsAg含有量(IU/ml)](標準誤差)
図２Ａおよび図２Ｂは、ＨＢＶ ＤＮＡコピー数によって測定されるウイルス量を示し、図３Ａおよび図３Ｂは血清ＨＢｓＡｇレベルを示す。図２Ａおよび図３Ａは、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡまたはＨＢＣ３４抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ単独で投与した場合のウイルス量およびＨＢｓＡｇレベルをそれぞれ示す。ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡは、生理食塩水対照と比べて血清ＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇをそれぞれ約０．５-ｌｏｇ１０および１-ｌｏｇ１０低減させた。ＨＢＣ３４抗体は単独でＨＢＶ ＤＮＡに対して効果を有さず、生理食塩水対照と比べて血清ＨＢｓＡｇを＜１-ｌｏｇ１０低減させた。図２Ｂおよび図３Ｂは、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびＨＢＣ３４抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）の両方を用いる処置は生理食塩水対照と比べてウイルス量およびＨＢｓＡｇレベルを約３-ｌｏｇ１０低減させたことを実証する。血清ＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇの低減は、いずれかの分子を個々に用いた処置と比べてＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびＨＢＣ３４抗体を組み合わせて使用した場合に有意により強く、組合せ効果は単剤療法の効果の和を上回った。併用療法はまた、エンテカビルを単独で用いた処置より大きくウイルス量およびＨｂｓＡｇレベルを低減させた。ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびＨＢＣ３４抗体の組合せの効果は、エンテカビルも投与したかどうかにかかわらず観察された。これらの結果は、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびＨＢＣ３４抗体は、ウイルス量およびＨＢｓＡｇの低減において相乗的に作用する潜在能力を有し、この効果はエンテカビル処置とは独立していることを実証する。
図４は、１日目［１日目＝選択された（ｓｅｌｅｃｔ）処置群へのｓｉＲＮＡ投与］における研究の開始後１４日～４２日の間に測定された遊離ＨＢＣ３４抗体レベルを描写する。ＨＢＣ３４を単独で用いた処置と比べて、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびＨＢＣ３４抗体の組合せを用いた処置は、はるかにより高い初期遊離抗体レベルを結果としてもたらし、これは処置がエンテカビルを含むかどうかにかかわらず２８日より長く維持された。図４に示される結果は、ウイルス量および血清ＨＢｓＡｇレベルと合わせて、処置の効果は遊離循環性ＨＢＣ３４抗体の量に依存すること、および、用量がより低くなるにつれて、ＨＢｓＡｇ量が減少するので抗体は有効になり得ることを示す。例えば、併用療法は、少なくとも部分的には抗体処置の前のＨＢｓＡｇ量の低減に基づいて、抗体のより少ない回数の用量、抗体のより低い用量、および／またはより低い侵襲性の投与経路（例えば、静脈内の代わりに皮下）を用いる有効な処置を可能とし得る。
要約すると、この研究は、ＨＢＶを標的化するｓｉＲＮＡの投与および次にＨＢＶを標的化する抗体の投与は、血清ＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇを有効に減少させることを実証する。さらに、個々の成分は相乗的に相互作用するようであり、そのため、この併用療法の効果は単独での各成分についてよりも大きく、かつ単に相加的である場合に予期される効果よりも大きい。最後に、結果は、ｓｉＲＮＡの投与は血清ＨＢｓＡｇを低減させて、抗体をより有効なものとすることを示唆する。
２つの抗ＨＢＶ抗体の１つおよびＨＢＶ標的化ＳＩＲＮＡを用いる併用療法
ｓｉＲＮＡおよび抗ＨＢＶ抗体ＨＢＣ２４を使用するｓｉＲＮＡ-抗体併用療法がＨＢＶ感染の処置において有効かどうかを決定するために、ＡＡＶ／ＨＢＶ感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１１の異なる処置の１つを投与した：腹腔内に投与される、（１）ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＢＶ０２、配列番号８のアンチセンス鎖を有する、実施例１における説明を参照）；（２）～（３）２つの用量の１つでの抗ＨＢＶ抗体（完全マウス化ＨＢＣ２４）；（４）～（５）１つの用量でのＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、および２つの用量の１つでの完全マウス化ＨＢＣ２４；（６～９）２つの用量の１つでのＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡ、および３つの抗体用量の１つでの完全マウス化抗ＨＢＶ抗体ＨＢＣ３４（ＨＢＣ３４-ｖ３５-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ）；（１０）対照ｓｉＲＮＡおよび対照抗体；または（１１）ＰＢＳのみ（表６を参照）。
表6.実施例2についての処置レベルおよび投薬量
Figure 2022515778000054

この実験において使用されたＨＢＣ２４およびＨＢＣ３４抗体は、ＨＢＶ表面抗原に結合するＦａｂ断片の部分を例外として、完全マウス化されたものである。ヒトＨＢＣ２４は、配列番号７５に記載のＶＨアミノ酸配列および配列番号７６に記載のＶＬアミノ酸配列を有する。この実験のための抗体において使用されたＨＢＣ２４配列のマウス化バージョンは、それぞれ配列番号１０３および１０４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有していた。ＨＢＣ３４抗体は、マウス化ＨＢＣ３４ｖ３５変異体、ＨＢＣ３４-ｖ３５-ｍｕ-ＩｇＧ２ａであった。ヒトＨＢＣ３４ｖ３５は、配列番号７０に記載の重鎖アミノ酸配列および配列番号７３に記載の軽鎖アミノ酸配列を有する。この実験のためのＨＢＣ３４-ｖ３５-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ抗体において使用されたＨＢＣ３４ｖ３５配列のマウス化バージョンは、それぞれ配列番号１０１および１０２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有していた。
対照ｓｉＲＮＡはヒトトランスサイレチン遺伝子を標的化し、血清中の感染のＨＢＶマーカーにおける減少を引き起こすとは予期されない。
対照モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、呼吸器合胞体ウイルスに特異的な抗体であり、血清中の感染のＨＢＶマーカーにおける減少を引き起こすとは予期されない。
処置をＷｕＸｉ免疫不全ＨＢＶマウスに投与した。このマウスモデルは、ＨＢＶゲノムを含有するアデノ随伴ウイルスを免疫適格マウス中の肝細胞に形質導入することによって生成される。このモデルを使用すると、ＨＢＶタンパク質産生は内因性ＨＢＶプロモーターの制御下となり、マウスはＨＢＶ特異的細胞および液性Ｔ細胞応答を発生させる。しかしながら、ＨＢＶ感染は起こらず、ｃｃｃＤＮＡは産生されず、複製は一過性であり、免疫応答はベクター駆動性の干渉によって妨げられる。
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統）に１．０Ｘ１０１１個のウイルスゲノム／マウスを含有する２００μｌの容量を尾静脈注射することによってｒＡＡＶ８-１．３ＨＢＶ株ａｙｗ、Ｄ型を接種した。
各処置群は５匹のマウスを含んだ。ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡを研究の開始に皮下に１回投与し、研究の２～３週目の間に抗ＨＢＶ抗体を週２回腹腔内に投与した。マウスを研究の６週目に屠殺した。
研究の全体を通じて血清試料を定期的に収集し、ウイルス量、ＨＢｓＡｇ、および遊離ＨＢＣ３４抗体を測定した。血清ＨＢｅＡｇ、血清アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、肝臓ＨＢｃＡｇ、肝臓ＨＢｓＡｇ、肝臓中の総ＨＢＶ ＤＮＡ（ｑＰＣＲによる）、および血清抗ＨＢＶ抗体についても測定した。肝臓リンパ球、脾臓細胞、およびリンパ節（門脈／腹腔対鼠径部）をアッセイしてＨＢＶ特異的ＩＦＮｇ＋ＣＤ４＋細胞およびＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋細胞の割合を決定した。
実験の結果を図５Ａおよび図５Ｂ（血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度）、図６Ａおよび図６Ｂ（血清ＨＢｓＡｇ濃度）、ならびに図７Ａおよび図７Ｂ（血清ＨＢｅＡｇ濃度）に示す。血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度、ＨＢｓＡｇ濃度、およびＨＢｅＡｇ濃度は、ｓｉＲＮＡを単独でまたは対照を用いて処置したマウスと比べてＨＢＶ０２および抗ＨＢＶ抗体の１つを用いて処置したマウスについてより低かった。この効果はＨＢＣ３４およびＨＢＣ２４抗体の両方について観察された。追加的に、効果はＨＢＶ０２のより高い用量においてより大きく、より高い用量のＨＢＶ０２を使用した場合、ＨＢｓＡｇの低減はより低い抗体用量において達成された。これらの結果は、ＨＢＶ０２およびＨＢＶを標的化するモノクローナル抗体を使用する併用処置は、ＨＢＶ０２単剤療法より大きくＨＢｓＡｇ、およびＨＢｅＡｇを低減させることのさらなる証拠を提供する。これらの結果はまた、抗体の投与の前のｓｉＲＮＡのより高い用量は、抗体のより低い用量においてＨＢｓＡｇの類似した減少を提供し得ることを示す。
マウスモデルにおけるＨＢＳＡＧの血清クリアランスおよびウイルス侵入阻害
ヒト肝細胞を移植した免疫不全マウスを使用して、ＨＢｓＡｇのクリアランスにおけるＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡおよび抗ＨＢＶ抗体を用いる併用療法の有効性を試験した。ＰＸＢ-Ｍｏｕｓｅ（登録商標）モデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ、Ｊａｐａｎ）は、ヒト肝細胞によるマウス肝臓の≧７０％の再増殖を伴うマウスを生成するためにｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスを使用する（Ohshita H and Tateno C, Methods Mol Biol. 1506:91-100, (2017)）。ＡＡＶ-ＨＢＶモデルとは異なり、ｃｃｃＤＮＡが確立され、ＨＢＶの肝内拡大が起こり得る。
マウス肝細胞を以前に酵素的に（ｅｎｚａｍａｔｉｃａｌｌｙ）破壊したＳＣＩＤマウスに初代ヒト肝細胞を移植した。マウスはＴおよびＢ細胞欠損であった。このモデルは、侵入、拡大、ｃｃｃＤＮＡ調節、肝細胞内因性免疫応答、および宿主ゲノムへのウイルス組込みを含むＨＢＶ感染の研究のために有用である。このモデルはまた、感染に対するヒトＩＦＮａの効果を研究するために使用され得る。しかしながら、このモデルは適応免疫応答の誘導を含まない。１．０Ｘ１０７個のウイルスゲノム／マウスにおいてＨＢＶ遺伝子型Ｃを尾静脈注射を介してマウスに接種した。処置は感染の８週後に開始した。
ＨＢＶ感染マウス（ｎ＝４／処置群）に７つの異なる処置の１つを投与した：（１）ＰＢＳのみ；（２～４）２～３週目の間に週２回腹腔内に投与される、３つの用量の１つでの抗ＨＢＶ抗体（完全マウス化ＨＢＣ３４ｖ３５抗体、ＨＢＣ３４-ｖ３５-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ）；または（５～７）研究の始めに皮下に１回投与されるＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＢＶ０２、配列番号８のアンチセンス鎖を有する、実施例１における説明を参照）、および２～３週目の間に週２回腹腔内に投与される、３つの抗体用量の１つでの完全マウス化ＨＢＣ３４ｖ３５（表７を参照）。マウスを６週目に屠殺した。研究の設計は図８にも示される。
表7.処置レベルおよび投薬量
Figure 2022515778000055

この実験において使用されたＨＢＣ３４抗体、ＨＢＣ３４ｖ３５は、ＨＢＶ表面抗原に結合するＦａｂ断片の部分を例外として、完全マウス化されたものであった。ヒトＨＢＣ３４ｖ３５は、配列番号７０に記載の重鎖アミノ酸配列および配列番号７３に記載の軽鎖アミノ酸配列を有する。この実験のためのＨＢＣ３４-ｖ３５-ｍｕ-ＩｇＧ２ａ抗体において使用されたＨＢＣ３４ｖ３５配列のマウス化バージョンは、それぞれ配列番号１０１および１０２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有していた。
研究の全体を通じて血清試料を定期的に収集し、ウイルス量、ＨＢｓＡｇ、および遊離ＨＢＣ３４抗体を測定した。血清ＨＢｅＡｇ、血清アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、肝臓ＨＢｃＡｇ、肝臓ＨＢｓＡｇ、肝臓中の総ＨＢＶ ＤＮＡ（ｑＰＣＲによる）、および血清抗ＨＢＶ抗体についても測定した。肝臓リンパ球、脾臓細胞、およびリンパ節（門脈／腹腔対鼠径部）をアッセイしてＨＢＶ特異的ＩＦＮｇ＋ＣＤ４＋細胞およびＩＦＮｇ＋ＣＤ８＋細胞の割合を決定した。
ｓｉＲＮＡおよび抗ＨＢＶ抗体の組合せの投与は、同じ用量での抗体の投与と比べて血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度（図９）および血清ＨＢｓＡｇ濃度（図１０）を低減させた。類似した傾向が血清ＨＢｅＡｇ濃度（図１１）および血清ＨＢｃｒＡｇ濃度（図１２）について観察された。追加的に、このモデル系において、抗体はまた、肝細胞へのウイルス侵入の阻害剤として機能し、ＨＢＣ３４抗体を１５ｍｇ／ｋｇにおいて単剤療法として（すなわち、ｓｉＲＮＡと組み合わせずに）投与した場合に血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度（図９）および血清ＨＢｓＡｇ濃度（図１０）もまたより低かった。
この研究は、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡおよびＨＢＣ３４抗体は、組合せで投与された場合に、ＨＢＣ３４単剤療法よりも大きい程度までＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇレベルを減少させることの正統的な感染モデルにおける実験的サポートを提供する。
慢性ＨＢＶ感染を処置するためのＳＩＲＮＡ-抗体併用療法の臨床評価
ｓｉＲＮＡ-抗体併用療法のフェーズ２臨床研究を実行して、慢性ＨＢＶ感染を有するヒト患者における併用療法の有効性を評価する。表８は研究用の処置レジメンを示す。研究は、併用療法に対する追加の治療の効果を試験するための追加のコホートを含んでもよい（例えば、２つの追加の治療が試験される場合、９つのコホート）。各群／コホートは１５人の患者を含む。
表8.臨床試験用の処置レベルおよび投薬量
Figure 2022515778000056

図１３は、フェーズ２研究のために設計された処置スケジュールを示す。研究は、２４週の処置、および２４週のフォローアップを含む。全ての患者は研究へのエントリー時に非硬化性かつＮＵＣ抑制［ヌクレオチ（シ）ドアナログを用いて処置］されている。全ての患者コホートは、研究の全体を通じてＮＵＣ療法［例えば、テノホビル（ｔｅｎｏｆｉｖｉｒ）またはエンテカビルの１日毎の経口投与］を受けてもよい。研究は、ＨＢＶ０２ ｓｉＲＮＡを用いる８週のリードイン処置を全てのコホートが受けることで開始する。ＨＢＶ０２の用量は、例えば、４週毎に皮下に投与される２用量の４００ｍｇであってもよい。しかしながら、適切な用量は、フェーズ２試験の前の単剤療法試験によって決定され得る。８週の研究後に、全てのコホートはＨＢＶ０２を用いる処置を継続し、コホート２、４、および６は低用量のＨＢＣ３４抗体（ＨＢＣ３４ｖ３５）を用いる処置を開始し、コホート３、５、および７はより高い用量のＨＢＣ３４抗体を用いる処置を開始し、コホート１はＨＢＣ３４抗体処置を受けない。低用量のＨＢＣ３４ｖ３５は、例えば、２週毎に静脈内に投与される０．５グラムであってもよく、より高い用量は、例えば、２週毎に静脈内に投与される２グラムであってもよい。適切な用量は、フェーズ２試験の前の単剤療法試験によって検証され得る。研究の１２週目の間に、コホート１～３は週１回の追加の治療を受けてもよい。追加的に、一部のコホート（例えば、コホート６および７）はさらに別の治療を受けてもよい。２４週の処置後に患者をモニターおよび評価して、検出可能な血清ＨＢｓＡｇの喪失および／または抗ＨＢｓセロコンバージョンによって示される機能的な治癒が達成されたかどうかを決定する。
特有の実施形態を例証および記載してきたが、上記の様々な実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を提供できること、ならびに本発明の精神および範囲から離れることなく様々な変更が為され得ることが容易に認められる。
２０１８年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，８９６号を含む、本明細書において参照されるか、または出願データシートにおいて列記される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、他に記載されなければ、参照により全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要な場合、いっそうさらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いるように改変され得る。
上記の詳細な説明に照らしてこれらおよび他の変更が実施形態に対して為され得る。一般に、以下の請求項において、使用される用語は、本明細書および請求項において開示される特有の実施形態に請求項を限定するものと解釈されるべきではなく、そのような請求項によって権利を与えられる均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。よって、請求項は本開示により限定されない。

Claims (89)

  1. 対象における慢性ＨＢＶ感染の処置における使用のためのＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤であって、対象がその後、抗ＨＢＶ抗体を投与される、阻害剤。
  2. 対象における慢性ＨＢＶ感染の処置における使用のためのＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤であって、対象がその後、抗ＨＢＶ抗体を投与される、薬剤。
  3. 対象における慢性ＨＢＶ感染の処置における使用のための組成物であって、抗ＨＢＶ抗体を含み、対象が遺伝子発現の阻害剤を以前に投与されている、組成物。
  4. 対象における慢性ＨＢＶ感染の処置における使用のための組成物であって、抗ＨＢＶ抗体を含み、対象がＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を以前に投与されている、組成物。
  5. 少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤またはＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤の投与後に低減し、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が低減した場合、抗ＨＢＶ抗体が対象に投与される、請求項２または請求項３に記載の使用のための組成物。
  6. 慢性ＨＢＶ感染の処置のための医薬の製造における、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤および抗ＨＢＶ抗体の使用。
  7. 慢性ＨＢＶ感染の処置のための医薬の製造における、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤および抗ＨＢＶ抗体の使用。
  8. それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染を処置する方法であって、
    対象に、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を投与すること；および
    対象に、抗ＨＢＶ抗体を投与すること
    を含む、方法。
  9. それを必要とする対象における慢性ＨＢＶ感染を処置する方法であって、
    対象に、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与すること；および
    対象に、抗ＨＢＶ抗体を投与することを含む、方法。
  10. 少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が、ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤またはＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤を投与した後に低減し、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現が低減した場合、抗ＨＢＶ抗体が対象に投与される、請求項８または請求項９に記載の方法。
  11. ＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤またはＨＢＶ発現の阻害剤を投与する前後の対象由来の血液試料中に存在するＨＢｓＡｇの量を測定することをさらに含み、ＨＢｓＡｇの減少が、少なくとも１つのＨＢＶ遺伝子の発現の低減を示す、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 抗ＨＢＶ抗体の治療有効量が、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤またはＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤が対象に投与されていない場合に送達される抗ＨＢＶ抗体の治療有効量よりも少ない、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  13. 抗ＨＢＶ抗体を投与することが、少なくとも２つの用量の治療有効量の抗ＨＢＶ抗体を投与することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  14. 少なくとも２つの用量が、週２回、週１回、隔週で、２週毎に、または月１回投与される、請求項１３に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  15. 抗ＨＢＶ抗体を投与することが、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤またはＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を投与する少なくとも１週間後に開始する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  16. 抗ＨＢＶ抗体を投与することが、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤またはＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤を投与する８週間後に開始する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  17. 抗ＨＢＶ抗体が皮下投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  18. 抗ＨＢＶ抗体が、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪを認識する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  19. 抗ＨＢＶ抗体がヒト抗体である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  20. 抗体が、ＨＢＣ３４またはＨＢＣ３４の非天然変異体である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  21. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ｉ）それぞれ、配列番号４４、４５または４６、および４７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列；ならびに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、４９または５０、および５２または５１に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  22. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ｉ）それぞれ、配列番号４４、４５、および４７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列；ならびに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、４９、および５２に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列
    を含む、請求項２１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  23. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ｉ）それぞれ、配列番号４４、４５、および４７に記載のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列；ならびに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号４８、４９、および５１に記載のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列
    を含む、請求項２１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  24. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号５５～６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、または
    （ａ）配列番号５５～６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；および（ｂ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  25. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号５９に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列；および（ｂ）配列番号５３に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  26. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号５６または配列番号５８に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列；および（ｂ）配列番号５３に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  27. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖；または
    （ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖；または
    （ａ）配列番号８３～９５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２、９７、および９８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  28. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号７３に記載の軽鎖アミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７０に記載の重鎖アミノ酸配列；または
    （ａ）配列番号７３に記載の軽鎖アミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７１に記載の重鎖アミノ酸配列
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  29. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号７４に記載の軽鎖アミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７０に記載の重鎖アミノ酸配列
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  30. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号７３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖；または
    （ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である軽鎖、ならびに（ｂ）配列番号７０～７２および９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％同一である重鎖
    を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  31. 抗ＨＢＶ抗体が、
    （ａ）配列番号７７～８２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；または
    （ｂ）（ｉ）配列番号７６に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列；および（ｉｉ）配列番号７５に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列
    を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  32. 抗ＨＢＶ抗体がモノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  33. 抗ＨＢＶ抗体が、ＨＢｓＡｇに対する第１の特異性、および免疫エフェクターを刺激する第２の特異性を有する二特異性抗体である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  34. 第２の特異性が、細胞傷害性またはワクチン効果を刺激する、請求項３３に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  35. 対象がヒトであり、治療有効量の抗ＨＢＶ抗体が投与され、治療有効量が、約３ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  36. ＨＢＶ遺伝子発現の阻害剤またはＨＢＶ抗原量を低減させる薬剤が、ＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  37. ＨＢＶ転写物の発現の阻害が、ｒｔＰＣＲによって測定される、請求項３６に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  38. ＨＢＶ転写物の発現の阻害が、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定されるタンパク質レベルの低下によって測定される、請求項３６に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  39. ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖が配列番号１のヌクレオチド１５７９～１５９７と３個以下のヌクレオチドで異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  40. ＲＮＡｉ剤が、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖が配列番号１のヌクレオチド１５７９～１５９７を含む、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  41. ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出部を含む、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  42. ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’突出部を含む、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  43. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  44. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  45. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１７～２５ヌクレオチド対の長さである、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  46. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、２３～２７ヌクレオチド対の長さである、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  47. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、１９～２１ヌクレオチド対の長さである、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  48. ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  49. ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖が、１５～３０ヌクレオチドを有する、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  50. ＲＮＡｉ剤のそれぞれの鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  51. ＲＮＡｉ剤が、ｓｉＲＮＡである、請求項３６～５０のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  52. ｓｉＲＮＡが、ＨＢｓＡｇタンパク質、ＨＢｃＡｇタンパク質、およびＨＢｘタンパク質をコードするＨＢＶ転写物、またはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼタンパク質の発現を阻害する、請求項５１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  53. ｓｉＲＮＡが、Ｐ遺伝子、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド２３０９～３１８２および１～１６２５；Ｓ遺伝子（Ｌ、Ｍ、およびＳタンパク質をコードする）、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド２８５０～３１８２および１～８３７；ＨＢｘ、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド１３７６～１８４０；またはＣ遺伝子、ＮＣ＿００３９７７．２のヌクレオチド１８１６～２４５４によってコードされる標的の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに結合する、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  54. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）のヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  55. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）のヌクレオチド配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  56. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）のヌクレオチド配列を含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  57. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ-３’（配列番号４）のヌクレオチド配列からなる、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  58. ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、５’-ＧＵＧＵＧＣＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＡＣＡ-３’（配列番号３）のヌクレオチド配列を含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  59. ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、５’-ＧＵＧＵＧＣＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＡＣＡ-３’（配列番号３）のヌクレオチド配列からなる、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  60. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）のヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  61. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）のヌクレオチド配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  62. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）のヌクレオチド配列を含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  63. ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、５’-ＵＡＡＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＡＧＵＣＣＡＣＣＡＣ-３’（配列番号１０７）のヌクレオチド配列からなる、請求項５１または請求項５２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  64. ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、５’-ＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵＵＵＵＡ-３’（配列番号１０６）のヌクレオチド配列を含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  65. ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、５’-ＧＧＵＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＡＡＵＵＵＵＡ-３’（配列番号１０６）のヌクレオチド配列からなる、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  66. 前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全部および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全部が改変ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖が３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされる、請求項５１～６５のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  67. リガンドが、一価リンカー、二価分枝状リンカー、または三価分枝状リンカーを介して結合した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項６６に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  68. リガンドが、
    Figure 2022515778000057
     である、請求項６６または６７に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  69. ｓｉＲＮＡが、以下の構造：
    Figure 2022515778000058
     （式中、ＸはＯまたはＳである）
    に示されるリガンドにコンジュゲートされる、請求項６８に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  70. ｓｉＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドが、デオキシ-ヌクレオチド、３’末端デオキシ-チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’-Ｏ-メチル改変ヌクレオチド、２’-フルオロ改変ヌクレオチド、２’-デオキシ改変ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、コンフォメーション限定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’-アミノ改変ヌクレオチド、２’-Ｏ-アリル改変ヌクレオチド、２’-Ｃ-アルキル改変ヌクレオチド、２’-ヒドロキシル改変ヌクレオチド、２’-メトキシエチル改変ヌクレオチド、２’-Ｏ-アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン改変ヌクレオチド、１，５-アンヒドロヘキシトール改変ヌクレオチド、シクロヘキセニル改変ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’-リン酸を含むヌクレオチド、アデノシン-グリコール核酸、または５’-リン酸模倣体を含むヌクレオチドを含む改変ヌクレオチドである、請求項５１～６９のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  71. ｓｉＲＮＡが、リン酸骨格改変、２’リボース改変、５’三リン酸改変、またはＧａｌＮＡｃコンジュゲーション改変を含む、請求項５１～７０のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  72. リン酸骨格改変が、ホスホロチオエート結合を含む、請求項７１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  73. ２’リボース改変が、フルオロまたは-Ｏ-メチル置換を含む、請求項７１または請求項７２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  74. ｓｉＲＮＡが、５’-ｇｓｕｓｇｕＧｆｃＡｆＣｆＵｆｕｃｇｃｕｕｃａｃａＬ９６-３’（配列番号５）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＧｆｓｕｇａＡｆｇＣｆＧｆａａｇｕＧｆｃＡｆｃａｃｓｕｓｕ-３’（配列番号６）を含むアンチセンス鎖とを含み、
    式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕが、それぞれ、２’-Ｏ-メチルアデノシン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルシチジン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルグアノシン-３’-リン酸、および２’-Ｏ-メチルウリジン-３’-リン酸であり；
    Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆが、それぞれ、２’-フルオロアデノシン-３’-リン酸、２’-フルオロシチジン-３’-リン酸、２’-フルオログアノシン-３’-リン酸、および２’-フルオロウリジン-３’-リン酸であり；
    ｓが、ホスホロチオエート結合であり；
    Ｌ９６が、Ｎ-［トリス（ＧａｌＮＡｃ-アルキル）-アミノデカノイル）］-４-ヒドロキシプロリノールである、請求項５１～５９および６６～７３のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  75. ｓｉＲＮＡが、５’-ｇｓｕｓｇｕＧｆｃＡｆＣｆＵｆｕｃｇｃｕｕｃａｃａＬ９６-３’（配列番号７）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＧｆｓｕｇａ（Ａｇｎ）ｇＣｆＧｆａａｇｕＧｆｃＡｆｃａｃｓｕｓｕ-３’（配列番号８）を含むアンチセンス鎖とを含み、
    式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕが、それぞれ、２’-Ｏ-メチルアデノシン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルシチジン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルグアノシン-３’-リン酸、および２’-Ｏ-メチルウリジン-３’-リン酸であり；
    Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆが、それぞれ、２’-フルオロアデノシン-３’-リン酸、２’-フルオロシチジン-３’-リン酸、２’-フルオログアノシン-３’-リン酸、および２’-フルオロウリジン-３’-リン酸であり；
    （Ａｇｎ）が、アデノシン-グリコール核酸（ＧＮＡ）であり；
    ｓが、ホスホロチオエート結合であり；
    Ｌ９６が、Ｎ-［トリス（ＧａｌＮＡｃ-アルキル）-アミノデカノイル）］-４-ヒドロキシプロリノールである、請求項５１～５９および６６～７３のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  76. ｓｉＲＮＡが、５’-ｇｓｇｓｕｇｇａＣｆｕＵｆＣｆＵｆｃｕｃａＡｆＵｆｕｕｕａＬ９６-３’（配列番号１０８）を含むセンス鎖と、５’-ｕｓＡｆｓａａａＵｆｕＧｆＡｆｇａｇａＡｆｇＵｆｃｃａｃｃｓａｓｃ-３’（配列番号１０９）を含むアンチセンス鎖とを含み、
    式中、ａ、ｃ、ｇ、およびｕが、それぞれ、２’-Ｏ-メチルアデノシン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルシチジン-３’-リン酸、２’-Ｏ-メチルグアノシン-３’-リン酸、および２’-Ｏ-メチルウリジン-３’-リン酸であり；
    Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆが、それぞれ、２’-フルオロアデノシン-３’-リン酸、２’-フルオロシチジン-３’-リン酸、２’-フルオログアノシン-３’-リン酸、および２’-フルオロウリジン-３’-リン酸であり；
    ｓが、ホスホロチオエート結合であり；
    Ｌ９６が、Ｎ-［トリス（ＧａｌＮＡｃ-アルキル）-アミノデカノイル）］-４-ヒドロキシプロリノールである、請求項５１～５３および６０～７３のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  77. 対象がヒトであり、治療有効量のＲＮＡｉ剤またはｓｉＲＮＡが対象に投与され、ＲＮＡｉ剤またはｓｉＲＮＡの有効量が、約１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇである、請求項３６～７６のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  78. ＲＮＡｉ剤またはｓｉＲＮＡが、対象に１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、週２回、週１回、隔週で、４週毎、または月１回投与される、請求項３６～７７のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  79. ＲＮＡｉ剤またはｓｉＲＮＡが、対象に４週毎に投与される、請求項３６～７７のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  80. ＨＢＶ遺伝子をそれぞれ指向する２つのｓｉＲＮＡが投与され、第１のｓｉＲＮＡが配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含むアンチセンス鎖を有し、第２のｓｉＲＮＡが配列番号１のヌクレオチド２８５０～３１８２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを含む、請求項５１～７９のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  81. ＨＢＶ遺伝子を指向する２つのｓｉＲＮＡが投与され、２つのｓｉＲＮＡが、ＨＢＶ Ｘ遺伝子を指向するｓｉＲＮＡおよびＨＢＶ Ｓ遺伝子を指向するｓｉＲＮＡを含む、請求項５１～７９のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  82. ＨＢＶ遺伝子をそれぞれ指向する２つのｓｉＲＮＡが投与され、第１のｓｉＲＮＡが配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含むアンチセンス鎖を有し、第２のｓｉＲＮＡが配列番号１０７または配列番号１０９を含むアンチセンス鎖を有する、請求項５１～７９のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  83. 第１のｓｉＲＮＡが配列番号３、配列番号５、または配列番号７を含むセンス鎖を有し、第２のｓｉＲＮＡが配列番号１０６または配列番号１０８を含むセンス鎖を有する、請求項８２に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  84. ２つのｓｉＲＮＡが、同時に投与される、請求項８０～８３のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  85. ヌクレオチ（シ）ドアナログを対象に投与することをさらに含むか、または対象がヌクレオチ（シ）ドアナログも投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  86. ヌクレオチ（シ）ドアナログが、テノホビルジソプロキシルフマレート（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＴＡＦ）、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル（ＥＴＶ）、テルビブジン、ＡＧＸ-１００９、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、Ｎ-アセチル-システイン（ＮＡＣ）、ＰＣ１３２３、テラダイム-ＨＢＶ、サイモシン-アルファ、およびガンシクロビル、ベシホビル（ＡＮＡ-３８０／ＬＢ-８０３８０）、またはテノホビル-エキサリアド（ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７）である、請求項８５に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
  87. ＨＢＶ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ剤と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物；および
    抗ＨＢＶ抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物
    を含むキット。
  88. ＲＮＡｉ剤が、請求項５１～７６のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む、請求項６９に記載のキット。
  89. 抗ＨＢＶ抗体が、請求項１８～３４のいずれか一項に記載の抗体を含む、請求項８７または請求項８８に記載のキット。
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