DE3851889T2

DE3851889T2 - Nukleosid-derivate.

Info

Publication number: DE3851889T2
Application number: DE3851889T
Authority: DE
Inventors: Jim Haralambidis
Original assignee: Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine
Current assignee: Florey Institute of Neuroscience and Mental Health
Priority date: 1987-06-24
Filing date: 1988-06-24
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2008-06-25
Also published as: AU598946B2; US5552540A; EP0366685A4; AU1990988A; JP2828642B2; ATE113059T1; EP0366685A1; CA1340032C; DE3851889D1; JPH02504144A; NZ225176A; EP0366685B1; WO1988010264A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleosidderivate, Verfahren zu ihrer Synthese und Verfahren zur Synthese und zum Sequenzieren von Polynukleotiden unter Verwendung solcher Nukleosidderivate.
(MAN BEACHTE: Die hierin angeführten Quellenverweise sind am Ende der Beschreibung zusammengefaßt).
DNA, synthetische Oligonukleotide und mit identifizierbaren Markern markierte DNA, werden heute in der Molekularbiologie in vielfältiger Weise eingesetzt.
Radioaktive Marker, z. B. ³²P und ³&sup5;S, wurden fast ausschließlich in molekularbiologischen Verfahren verwendet. Radioaktive Marker weisen jedoch den Nachteil auf, daß ihre Halbwertszeit relativ kurz ist (die Halbwertszeit von ³²P ist beispielsweise 14 Tage) und daß die während dieses Zerfalls ausgestrahlte ionisierende Strahlung die Zellkomponenten wie Protein, Lipide und Nukleinsäuren beschädigen kann, was zum Zelltod oder zur Umwandlung von Zellen in maligne Formen führen kann.
Es wurde vorgeschlagen, Nukleotide oder Oligonukleotide mit nicht-radioaktiven Markern wie Fluorphoren, kolloidalen Verbindungen und Enzymen zu markieren.
In einer vorgeschlagenen Vorgangsweise wurden Oligonukleotide hergestellt, die eine reaktive Aminogruppe am 5'-Ende enthielten. Fluorophore oder andere nicht-radioaktive Marker wurden dann an die Aminogruppe angehängt, um ein Oligonukleotid zu bilden, in das ein nachweisbarer Marker eingebaut ist. Eine solche Vorgangsweise weist den Nachteil auf, daß nur ein einziger nachweisbarer Marker in die Oligonukleotidkette über ihr 5'-Ende eingeführt werden kann.
In einer weiteren Vorgangsweise ²&supmin;&sup5; wurden C-5-substituierte Deoxyuridinverbindungen hergestellt, die am entfernten Ende des C-5-Substituenten eine Aminogruppe aufweisen. Solche Verbindungen können mit einem nachweisbaren Marker markiert und in eine Oligonukleotidkette eingebaut werden, wodurch ein Oligonukleotid an mehreren Stellen markiert werden kann. Die Herstellung dieser Verbindungen ist schwierig und umfaßt Reaktionen unter Verwendung hochgiftiger Quecksilberderivate.
EP-A-0 251 786, die unter Art. 54(3) EPÜ fällt, offenbart Alkinylaminonukleotide und markierte Derivate. Diese Derivate sind vor allem als Kettenabbrecher beim DNA- Sequenzieren gedacht. Demzufolge sind die meisten der beschriebenen Verbindungen Derivate von Didesoxynukleotiden.
Daher besteht ein Bedarf an Nukleosidderivaten, die bei der Herstellung von nicht isotopenmarkierten Polynukleosiden verwendet und die einfach und sicher hergestellt werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleosidderivat der Formel (I):
bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, daß:
Y H oder OH oder eine geschützte Hydroxygruppe ist;
X H, eine Phosphonatgruppe oder eine Phosphoramiditgruppe der Formel
ist, worin R¹ und R² gleich oder voneinander verschieden sind und aus Alkyl und substituiertem Alkyl ausgewählt sind, das verzweigt oder unverzweigt sein kann; und Q eine Phosphatschutzgruppe ist;
Z H, eine Phosphat- oder Triphosphatgruppe oder eine Hydroxyschutzgruppe ist;
X' eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-Alkylengruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann;
R eine Aminoschutzgruppe oder ein Fluorophor oder ein anderer nicht-radioaktiver nachweisbarer Marker ist; oder die Gruppe Y'NHA, worin Y' eine Alkyl(C&sub1;&submin;&sub4;&sub0; carbonylgruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann, und A eine Aminoschutzgruppe oder Fluorophor oder ein anderer nicht-radioaktiver nachweisbarer Marker ist;
mit der Maßgabe, daß, wenn X' CH&sub2; und R -COCF&sub3; ist
(i) Z nicht H ist, wenn X H ist und Y H ist;
(ii) Z nicht Dimethoxytrityl ist, wenn X
und Y H ist; und
(iii) Z nicht Dimethoxytrityl ist, wenn X
ist und Y-O-Tetrahydropyranyl ist.
Der Einfachheit halber zeigt Fig. 1, die eine bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung darstellt, auch das in der vorliegenden Beschreibung für die C-5-substituierten Nukleoside verwendete Numerierungssystem.
Es wurde gefunden, daß C-5-substituiertes Uridin und Desoxyuridin mit einer primären aliphatischen Aminogruppe, die an einem nicht-radioaktiven Marker angehängt ist oder zum Anhängen daran fähig ist, unter milden Bedingungen unter Verwendung einer Palladium-katalysierten C-C-Bindungs-Bildungsreaktion zwischen einem Aminoalkin und 5-Ioduridin oder 5-Ioddesoxyuridin-Derivaten leicht hergestellt werden kann.
R¹ und R² können jeweils von 1 bis 30 C-Atome enthalten. Vorzugsweise sind R¹ und R² beide Isopropylgruppen. Wenn R¹ und/oder R² substituiertes Alkyl sind, ist die Beschaffenheit der Substituenten nicht entscheidend, soferne die Substituenten nicht die erwünschten Eigenschaften der Verbindung beeinträchtigen oder andere schädliche Wirkungen ausüben. Beispielsweise können die Substituenten aus Phenyl-, Benzyl- und Acylgruppen ausgewählt sein.
Q kann jede beliebige Phosphatschutzgruppe sein, z. B. Methyl-, Phenyl-, substituierte Phenyl-, Benzyl- oder Cyanoäthylgruppen. Beispielsweise kann Phenyl mit Halogen-, Hydroxy- oder Nitrogruppen substituiert sein.
Jede beliebige Hydroxyschutzgruppe, z. B. die von Greene &sup6; beschriebenen, kann verwendet werden. Beispielsweise können Hydroxyschutzgruppen aus Acyl ausgewählt sein, z. B. substituiertes oder unsubstituiertes Alkanoyl (z. B. Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl, Bromacetyl, Dichloracetyl, Trifluoracetyl), substituiertes oder unsubstituiertes Aroyl (Benzoyl, Toluyl, Xyloyl, Nitrobenzoyl, Brombenzoyl, Salicyloyl), Arylalkyl (z. B. Benzyl), Methyl, Methoxy, Methylthiomethyl, 2- Methoxyäthoxymethyl, bis(2-Chloräthoxy)methyl, Tetrahydropyranyl, Tetrahydrothiopyranyl, 4-Methoxytetrahydropyranyl, 4-Methoxytetrahydrothiopyranyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothiofuranyl, 1-Äthoxyäthyl, 1-Methyl-1-methoxyäthyl, 2- (phenylselenyl)äthyl, t-Butyl, Allyl, Benzyl, o-Nitrobenzyl, Triphenylmethyl, α- Naphthyldiphenylmethyl, p-Methoxyphenyldiphenylmethyl, 9-(9-Phenyl-10-oxo)anthryl (Tritylone), Dimethoxytrityl oder -pixyl, Trimethylsilyl, Isopropyldimethylsilyl, t- Butyldimethylsilyl, t-Butyl-diphenylsilyl, Tribenzylsilyl, Triisopropylsilyl.
Jede beliebige Aminoschutzgruppe, z. B. die durch Greene &sup6; beschriebenen, kann verwendet werden. Beispielsweise können Aminoschutzgruppen aus Acyl, insbesondere organischem Acyl, beispielsweise substituiertem oder unsubstituiertem aliphatischen Kohlenwasserstoffoxycarbonyl ausgewählt sein, z. B.
Alkoxycarbonyl (z. B. Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Butoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, 5-Pentoxycarbonyl), Haloalkoxycarbonyl (z. B. Chlormethoxycarbonyl, Tribromäthoxycarbonyl, Trichloräthoxycarbonyl),
einem Alkan- oder -arensulfonylalkoxycarbonyl (z. B. 2-(Mesyl)äthoxycarbonyl, 2-(p- Toluolsulfonyl)-äthoxycarbonyl),
einem Alkylthio- oder Arylthioalkoxycarbonyl (z. B. 2-(Äthylthio)äthoxycarbonyl, 2-(p- Tolylthio)äthoxy-carbonyl), substituiertem oder unsubstituiertem Alkanoyl, z. B. Halo(nieder)alkanoyl (z. B. Formyl, Trifluoracetyl),
einem monozyklischen oder verschmolzen-zyklischen alizyklischen Oxycarbonyl (z. B. Cyclohexyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl),
substituiertem oder unsubstituiertem Alkenyloxycarbonyl (z. B. Allyloxycarbonyl),
substituiertem oder unsubstituiertem Alkinyloxycarbonyl (z. B. 1,1- Dimethylpropargyloxycarbonyl),
substituiertem oder unsubstituiertem Aryloxycarbonyl (z. B. Phenoxycarbonyl, p Methylphenoxycarbonyl),
substituiertem oder unsubstituiertem Aralkoxycarbonyl (z. B. Benzyloxycarbonyl, p- Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl, p-(p-Methoxyphenylazo)benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, α- Naphthylmethoxycarbonyl, p-Biphenylisopropoxycarbonyl, Fluorenymethoxycarbonyl),
substituiertem oder unsubstituiertem Arensulfonyl (z. B. Benzolsulfonyl, p- Toluolsulfonyl),
substituiertem oder unsubstituiertem Dialkylphosphoryl (z. B. Dimethylphosphoryl),
substituiertem oder unsubstituiertem Diaralkylphosphoryl (z. B. O,O- Dibenzylphosphoryl),
substituiertem oder unsubstituiertem Aryloxyalkanoyl (z. B. Phenoxyacetyl, p- Chlorphenoxyacetyl, 2-Nitrophenoxyacetyl, 2-Methyl-2-(2-nitro-phenoxy)propionyl),
substituiertem oder unsubstituiertem Aryl wie Phenyl, Tolyl;
substituiertem oder unsubstituiertem Aralkyl wie Benzyl, Diphenylmethyl, Trityl oder Nitrobenzyl.
Der Ausdruck "Fluorophor" bezieht sich auf eine Gruppe, die selbst fähig zur Fluoreszenz ist oder die einer anderen Gruppe Fluoreszenz verleiht. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck "Fluorophor" bezieht sich auf einen Fluorophorvorläufer, der eine oder mehrere fluoreszenzunterdrückende Gruppen enthält, der aber zur Fluoreszenz fähig ist, sobald diese Gruppen entfernt sind. (Beispielsweise ist Diisobutyryl 6-carboxyfluorescein nicht fluoreszierend. Die Behandlung mit Ammoniak entfernt die Diisobutyrylgruppen, um fluoreszierendes 6- Carboxyfluorescein zu ergeben). Beispiele von Fluorophoren oder Fluorophorvorläufern:
Fluorescein-5-isothiocyanat, Acyl (beispielsweise: Diisobutyryl, Acetyl oder Dipivaloyl)- 5-und/oder 6-Carboxy-fluoresceinpentafluorphenylester, 6-(Diaryl-5 und/oder 6- Carbonylfluorescein)amino-hexansäurepentafluorphenylester, Texas Red (Markennamen von Molecular Probes, Inc.), Tetramethylrhodamin-5- (und 6) isothiocyanat (nachstehend als Rhodamin bezeichnet), Eosin-5-isothiocyanat, Erythrosin- 5- isothiocyanat, 4-Chlor-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, 4-Fluor-7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol, 3-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)methylaminopropionitril, 6-(7-Nitrobenz-2- oxa-1,3-diazol-yl)-aminohexansäure, Succinimidyl 12-(N-Methyl-N-(7-nitrobenz-2-oxa- 1,3-diazo-4-yl)aminododecanoat, 7-Diäthylamino-3-(4'-Isothiocyanatophenyl)-4- methylcumarin (CP), 7-Hydroxycumarin-4-Essigsäure, 7-Dimethylaminocumarin-4- Essigsäure, Succinimidyl 7-dimethylaminocumarin-4-acetat, 7-Methoxycumarin-4- Essigsäure, 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2-2'-Disulfonsäure (SITS), 9- Chloracridin, Succinimidyl 3-(9-Carbazol)-Propionat, Succinimidyl 1-Pyrenbutyrat, Succinimidyl 1-Pyrenennonanoat, p-Nitrophenyl 1-Pyrenbutyrat, 9-Anthracenpropionsäure, Succinimidylanthracen-9-propionat, 2-Anthracensulfonylchlorid.
Vorzugsweise weisen die Fluorophore oder fluorogenen Substanzen die folgenden spektroskopischen Eigenschaften auf:
(i) ein Anregungsmaximum, das einer der stärksten Emissionslinien der kommerziell verwendeten Hochdruck-Quecksilberdampflampen entspricht;
(ii) ein Emissionsmaximum im sichtbaren Teil des Spektrums.
Zu nicht-radioaktiven nachweisbaren Markern gehören Einheiten, die direkt durch ihre physikalischen Eigenschaften nachgewiesen werden können, z. B. elektronendichte Materialien, die unter einem Mikroskop nachgewiesen werden können; oder Einheiten, die indirekt durch ihre chemischen oder biochemischen Eigenschaften nachgewiesen werden können, z. B. durch Reaktion des nachweisbaren Markers mit einem oder mehreren geeigneten Substraten zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals, z. B. Farbe. Beispiele nicht-radioaktiver nachweisbarer Marker, die direkt nachgewiesen werden können, sind kolloidale Verbindungen, z. B. kolloidales Gold und Silber und Ferritin. Beispiele nicht-radioaktiver nachweisbarer Marker, die indirekt nachgewiesen werden können, sind Biotin, Avidin und Enzyme wie β-Galactosidase, Urease, Peroxidase und alkalische Phosphatase.
X' ist vorzugsweise CH&sub2;
R ist vorzugsweise CO(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub1;&sub5; A und bevorzugter CO(CH&sub2;)&sub5;A.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel (I) weisen die folgenden Substituenten auf: Triphosphat
worin die Gruppe A wie oben definiert ist und sich DMTr auf Dimethoxytrityl bezieht und D eine Hydroxyschutzgruppe ist.
Die Verbindungen der Formel (I')
sind dadurch gekennzeichnet, daß
Y H oder OH oder eine geschützte Hydroxygruppe ist;
X H, eine Phosphonatgruppe oder eine Phosphoramiditgruppe der Formel
ist, worin R¹ und R² gleich oder voneinander verschieden sind und aus Alkyl und substituiertem Alkyl ausgewählt sind, das verzweigt oder unverzweigt sein kann; und Q eine Phosphatschutzgruppe ist;
Z H, eine Phosphat- oder eine Triphosphatgruppe oder eine Hydroxyschutzgruppe ist;
eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub5; Alkylgruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann;
R eine Aminoschutzgruppe oder ein Fluorophor oder ein anderer nicht-radioaktiver nachweisbarer Marker ist; oder die Gruppe Y'NHA, worin Y' eine Alkyl (C&sub1;&submin;&sub4;&sub0;) carbonylgruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann, und A eine Aminoschutzgruppe oder ein Fluorphor oder ein anderer nicht-radioaktiver nachweisbarer Marker ist, und
können durch Umsetzen eines 5-ioduridins oder 5-Ioddesoxyuridins der Formel:
worin Y und Z wie weiter oben definiert sind und X eine Hydroxyschutzgruppe ist,
mit einem Aminoalkin der Formel H-C CX'NI-R, worin X' und R wie weiter oben definiert sind, in Gegenwart eines Palladiumkatalysators hergestellt werden;
mit der Maßgabe, daß, im Falle im Aminoalkin X' CH&sub2; und R COCF&sub3; ist, in der Verbindung der Formel II nicht alle aus Z, X und Y H sind.
Genauer gesagt können Verbindungen der Formel (I) gemäß der folgenden Schritte hergestellt werden:
(A) Umsetzen einer Verbindung der Formel (I'):
worin B und B' Hydroxyschutzgruppen sind, die gleich oder verschieden voneinander sein können und Y wie oben definiert ist;
mit H-C C-X'NR, worin X' und R wie oben definiert sind, in Gegenwart von (Ph&sub3;P)&sub2; PdCl&sub2; und Cul, bei Raumtemperatur zur Bildung von:
(B) Entfernen der Schutzgruppen B und B' aus Verbindungen der Formel (2') zur Bildung von:
Verbindungen der Formel (3') können gemäß der Erfindung durch weitere Reaktionen in andere Verbindungen umgewandelt werden.
(C) Verbindung (3') kann mit einer Verbindung der Formel B''A', worin B'' eine Schutzgruppe ist, z. B. jedes beliebige Derivat der Tritylgruppe, und A' eine ausscheidende Gruppe ist, zur Bildung von:
umgesetzt werden.
(D) Verbindung (4) kann mit einer Verbindung der Formel XR', worin R' eine ausscheidende Gruppe ist und X wie oben definiert ist, zur Bildung von:
umgesetzt werden.
(E) Verbindung (5') kann beispielsweise mit einer Säure oder Base, je nachdem ob die Schutzgruppe B'' säuren- oder basenlabil ist, umgesetzt werden, um die Entfernung der Gruppe B'' zu bewirken, und danach mit POCl&sub3; in der Gegenwart von Triäthylphosphat zur Bildung von:
umgesetzt werden.
(F) Verbindung (6') kann zuerst mit Carbonyldiimidazol und dann mit Tris(tetrabutylammonium)pyrophosphat oder Tributylammoniumpyrophosphat zur Bildung von:
umgesetzt werden.
Verbindung (7'), die einer bevorzugten Klasse von Verbindungen der Erfindung angehört, kann aufgrund ihrer 5'-Triphosphatgruppe durch Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder Zellulosechromatographie gereinigt werden.
Jede herkömmliche ausscheidende Gruppe R' kann in der obigen Reaktion (D) verwendet werden. Beispiele solcher Gruppen sind Cl, Br, I, p-Nitrophenyloxy, Pentafluorphenyloxy und Diisopropylamino. B'' kann das gleiche wie B und B' oder unterschiedlich davon sein. B'' kann unter Verwendung von Standardverfahren, die auf dem Gebiet an sich bekannt sind, am 5'Hydroxyl eingeführt werden.
Die Kettenlänge des C-5 Substituenten von Verbindungen der Formel (2), worin R eine Aminoschutzgruppe wie BOC ist, kann durch Säurebehandlung zur Entfernung der Gruppe R und anschließende Reaktion mit einem aktiven Ester des Typs
worin R eine Aminoschutzgruppe ist, n von 1 bis 50 ist und E eine gute ausscheidende Gruppe ist (auf dem Gebiet an sich bekannt), z. B. Nitrophenyloxy oder Pentafluorphenyloxy, in Gegenwart von (1,8-Diazacyclo(4.4.0)undec-7-en) DBU zur Bildung von:
vergrößert werden.
Dieses Verfahren kann beliebig oft durchgeführt werden, um die Kettenlänge des Kohlenstoff 5-Substituenten zu vergrößern.
Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß in Verbindungen der Formel (I), worin die Gruppen R oder A eine Aminoschutzgruppe sind, z. B. BOC, die Schutzgruppe unter geeigneten Bedingungen entfernt werden kann, und daß ein Fluorophor oder ein anderer nicht-radioaktiver Marker mit der freien Aminogruppe umgesetzt werden kann, um dadurch ein Nukleosidderivat zu erzeugen, das mit einem Fluorophor oder einen anderen nicht-radioaktiven Marker markiert wird.
Polynukleotide können unter Verwendung von Verbindungen der Formel (I) hergestellt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Polynukleotid bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine oder mehrere Nukleotideinheiten der Formel (III):
enthält, worin X', Y und R wie oben definiert sind.
Die Nukleotideinheit (III) stellt eine Verbindung der Formel (I) dar, die in eine Polynukleotidkette eingebaut ist.
Verbindungen der Formel (I) können in cDNA, synthetische Oligonukleotide und RNA unter Verwendung von Standardverfahren eingebaut werden 7,8-12
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotids bereitgestellt, worin einzelne Nukleotide oder Nukleotidgruppen der Reihe nach an einer wachsenden Nukleotidkette angehängt werden, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der Nukleotide ein Nukleosidderivat der oben definierten Formel (I) ist.
Genauer gesagt können Polynukleotide, die ein oder mehrere Nukleotidderivate der Formel (III) enthalten, durch gemeinsame Umsetzung:
a) eines ersten Polynukleotids;
(b) eines zweiten Polynukleotids, das an einen Abschnitt des ersten Polynukleotids hybridisiert;
(c) eines oder mehrerer Nukleotidtriphosphate;
(d) einer DNA-Polymerase oder RNA-Polymerase
gebildet werden, wodurch das Polynukleotid vom 3'-Ende des zweiten Polynukleotids her synthetisiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der Nukleotidtriphosphate ein Nukleosidderivat der Formel (I) ist, worin Z Triphosphat und X Wasserstoff ist.
Polynukleotide, die eines oder mehrere Nukleosidderivate enthalten, können auch gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt durch sequentielles Aneinanderkoppeln von Nukleotiden über ihre jeweiligen 5'- und 3'-Enden hergestellt werden, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der Nukleotide ein Nukleosidderivat der Formel (I) ist, worin X aus Phosphonat oder einer Gruppe der Formel
ausgewählt ist, worin R¹, R² und Q wie oben definiert sind.
Verbindungen der Formel (I) können in synthetische Oligonukleotide unter Verwendung herkömmlicher Phosphotriesterchemie¹&sup9; eingebaut werden.
Zum Einbau in RNA weisen die Verbindungen der Formel (I) eine 5'-Triphosphatgruppe und Hydroxylgruppen an den 3'- und 2'-Positionen auf.
An mehreren Stellen markierte Polynukleotide können gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt hergestellt werden. Die Auswirkung des Mehrfachmarkierens ist vorteilhaft, da das Ablesesignal im Vergleich zu jenem verstärkt wird, das durch Polynukleotide erzeugt wird, die an einer einzigen Position markiert sind.
Wenn Nukleosidderivate der Formel (I) keinen Fluorophor oder keinen nichtradioaktiven Marker vor dem Einbau in ein Polynukleotid enthalten, kann ein nachweisbarer Marker nachher in das gebildete Polynukleotid eingebaut werden. Beispielsweise kann dies durch Entfernen einer Schutzgruppe, welche die aliphatische Aminogruppe auf dem C-5-Substituenten maskiert, und durch anschließendes Umsetzen der so erzeugten Aminogruppen mit einem Fluorophor wie Fluoroscein-5-isothiocyanat durchgeführt werden.
Nukleoside, welche nicht-fluoreszierende Fluorophoranaloge (Fluorophorvorläufer) enthalten, können bei der Herstellung von Polynukleotiden verwendet werden. Die Verwendung von Fluorophorvorläufern verhindert die Möglichkeit des Fluorophorausbleichens während der für die Herstellung von Polynukleotiden erforderlichen chemischen Vorgänge. Unter geeigneten Bedingungen (z. B. bei einer Ammoniakbehandlung) können fluoreszenzhemmende Gruppen auf einem Fluorophorvorläufer entfernt werden, wodurch der Fluorophorvorläufer in eine fluoreszierende Form umgewandelt wird. Als Beispiel ist ein Reaktionsschema für die Herstellung eines Nukleosidderivats der Formel (I) in Fig. 2 dargestellt, das ein nichtfluoreszierendes Analog von Fluorescein enthält. Die resultierende Verbindung B von Fig. 2 weist die folgende Formel auf:
Verbindung B fluoresziert bei Entfernung der iso-Butyylgruppen im Anschluß an die Ammoniakbehandlung. Verbindung B kann in der Oligonukleotidsynthese (in einer geschützten 5', 3' Phosphoramiditform) oder der cDNA-Synthese (in einer 5'Triphosphatform) verwendet werden. Ein Uridinanalog der Verbindung B kann bei der RNA-Synthese mit T7-Polymerase ¹¹ oder SP6-Polymerase ¹² verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich für molekularbiologische Techniken, die normalerweise die Verwendung von isotopenmarkierten Sonden vorsehen. Solche Techniken umfassen DNA- und RNA-Hybridisierungen, z. B. Dot Blots, Southern Blots, Hybridisierungshistochemie, Northern Blots und Plaquehybridisierungen.
Die Nukleosidderivate der Formel (I) oder Polydesoxynukleotide, in die solche Nukleosidderivate eingebaut sind, können in DNA-Sequenzierreaktionen verwendet werden.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA vorgesehen, das folgende Schritte umfaßt:
(a) das Bereitstellen einer ersten Reaktionsmischung, die umfaßt:
(i) ein Polydesoxynukleotid;
(ii) einen Polydesoxynukleotidprimer, der zum Hybridisieren an einen Teil des Polydesoxynukleotids (i) fähig ist;
(iii) dATP, dGTP, dCTP, dTTP;
(iv) ddATP;
(v) eine DNA-Polymerase oder das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase;
(b) das Bereitstellen einer zweiten Reaktionsmischung, die abgesehen davon, daß ddATP durch ddGTP ersetzt ist, mit der ersten Reaktionsmischung gleich ist;
(c) das Bereitstellen einer dritten Reaktionsmischung, die abgesehen davon, daß ddATP durch ddCTP ersetzt ist, mit der ersten Reaktionsmischung gleich ist;
(d) das Bereitstellen einer vierten Reaktionsmischung, die abgesehen davon, daß ddATP durch ddTTP ersetzt ist, mit der ersten Reaktionsmischung gleich ist;
(e) das getrennte Inkubieren der Reaktionsmischungen, um in jedem Fall den Polydesoxynukleotidprimer von seinem 3'-Ende her zu verlängern, um Polydesoxynukleotide mit unterschiedlichen Längen herzustellen, wobei die Anzahl an Nukleotiden in jedem dadurch neu synthetisierten Polynukleotid durch Einbau eines Didesoxynukleotids in die wachsende Kette bestimmt wird;
(f) das Fraktionieren der Reaktionsmischungen (a) bis (d) durch Hindurchschicken durch eine Gelmatrix;
dadurch gekennzeichnet, daß:
der Polydesoxynukleotidprimer (ii) ein Polydesoxynukleotid ist, das eine oder mehrere Polynukleotideinheiten der Formel (III) enthält, wie dies weiter oben beschrieben ist, worin R und A ein Fluorophor oder ein anderer nicht-radioaktiver nachweisbarer Marker ist und/oder jede genannte Reaktionsmischung ein Nukleosidderivat der Formel (I) enthält, worin Z Triphosphat, X Wasserstoff und R oder A ein Fluorophor oder ein anderer nachweisbarer Marker ist, wodurch der Fluorophor oder der andere nichtradioaktive Marker in jedes neu synthetisierte Polydesoxynukleotid eingebaut wird;
und dadurch, daß die relativen Positionen der neu synthetisierten, auf der Gelmatrix getrennten Polydesoxynukleotide durch das Bestimmen des Fluorophors oder des anderen nicht-radioaktiven nachweisbaren Markers identifiziert werden, der vom neu synthetisierten Polydesoxynukleotid getragen wird, so daß es möglich wird, die DNA- Sequenz des ersten Polynukleotids zu klären.
Die neu synthetisierten Polynukleotide von obigem Schritt (e) können beispielsweise durch Fluoreszenz bestimmt werden, die durch Bestrahlung mit einer Lichtquelle, z. B. Laser, induziert wird.
Jede der obigen Reaktionsmischungen (a) bis (d) kann einen verschiedenen Fluorophor mit unterschiedlichen Emissionsmaxima oder einen verschiedenen n icht-radioaktiven Marker enthalten. Das heißt, der Oligonukleotidprimer (ii) und/oder das Nukleosidderivat der Formel (I) in jeder der Reaktionsmischungen (a) bis (d) enthält Gruppen R oder A mit unterschiedlichen Emissionsmaxima.
Es folgt eine rein beispielhafte Beschreibung mehrerer erfindungsgemäßer Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigelegten Figuren, worin:
Fig. 1 das Numerierungssystem für C-5 substituierte Nukleoside darstellt, das in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird;
Fig. 2 die Herstellung eines Fluoresceinderivats darstellt;
Fig. 2A die Herstellung von erfindungsgemäßen Nukleosidderivaten zeigt, die eine eingebaute modifizierte nicht-fluoreszierende Fluorescein-Gruppe aufweisen;
Fig. 3 die Herstellung des geschützten Aminoalkinnukleosids 2 darstellt;
Fig. 4 die Herstellung des Nukleosidphosphoramidits 7 mit kurzem C-5-Arm darstellt;
Fig. 5 die Herstellung des Nukleosidphosphoramidats 11 mit langem C-5-Arm darstellt;
Fig. 6 die Dot-Blot-Hybridisierungsassays mit den fluoreszierend markierten Kallikreinoligonukleotiden mit kurzem C-5-Arm an Mäuse-Speicheldrüsen-mRNA darstellt. Die Sonden wurden ³²P endmarkiert und hybridisiert, wie dies weiter unten beschrieben ist. A, normale Sonde, sehr strenge Bedingungen, 4-stündiges Ausgesetztsein; B, einfach markierte Sonde; mittlere Strenge, 4-stündiges Ausgesetztsein; C, normale Sonde, hohe Strenge, 16-stündiges Ausgesetztsein; D, mehrfach markierte Sonde, niedrige Strenge, 16-stündiges Ausgesetztsein; E, mehrfach markierte Sonde, niedrigste Strenge, 16-stündiges Ausgesetztsein;
Fig. 7 die Dot-Blot-Hybridisierungsassays mit der fluoreszierend markierten Kallikreinsonde mit langem C-5-Arm darstellt. Die Sonden wurden ³²P endmarkiert und unter Bedingungen hoher Strenge hybridisiert. Die Zeiträume des Ausgesetztseins betrugen für die Autoradiographen 4 Stunden A, normale Sonde; B, einfach markierte Sonde; c, mehrfach markierte Sonde; und
Fig. 8 die Dot-Blot-Hybridisierungsassays mit den ³²P endmarkierten, einfach fluoreszierend markierten Kallikreinsonden an drei unterschiedliche RNA-Spezies darstellt. Die Hybridisierungen erfolgten unter Bedingungen mittlerer Strenge, und die Zeit des Ausgesetztseins betrug für die Autoradiographen 16 Stunden A, Sonde mit kurzem C-5-Arm; B, Sonde mit langem C-5-Arm.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

5-Ioddesoxyuridin und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) stammten von Sigma Chemical Company. ¹H NMR-Spektren wurden entweder auf einem JEOL FX90Q bei 90 MHz, einem JEOL FX100 bei 100 MHz oder einem BRUKER 300 bei 300 MHz bestimmt. ¹³C NMR-Spektren wurden entweder auf einem JEOL FX90Q bei 22,5 MHz, einem JEOL FX100 bei 25 MHz oder einem BRUKER 300 bei 75 MHz bestimmt. Multiplizitäten wurden dort, wo sie beobachtet wurden, durch das Einzelfrequenz-off-resonance- Verfahren (SFOR) im Falle von JEOL FX90Q oder FX100 und auf dem BRUKER 300 unter Verwendung der DEPT-Impulssequenz gemessen. Das in der NMR-Analyse verwendete Nukleosid-Numerierungssystem ist im Falle des Vorgängernukleosids in Fig. 1 dargestellt. ³¹P NMR-Spektren erhielt man mit einem BRUKER 300 bei 121 MHz und durch Messen feldabwärts von 85% H&sub3;PO&sub4; als äußerer Standard, wobei die Feldabwärtswerte positiv waren. Die Mikroanalysen wurden durch den Australian Microanalytical Service, Melbourne, bestimmt. Pyridin wurde über Kaliumhydroxid destilliert und über 5A Molekularsieben gelagert. Acetonitril und Methanol wurden über 3A Molekularsieben getrocknet. Triäthylamin wurde über Kalziumhydrid destilliert und unter Argon gelagert. Das in den Phosphoramiditsynthesen verwendete Dichlormethan wurde über 5A-Molekularsieben getrocknet. Tetrazol wurde bei 0,05 nmHg bei 110ºC sublimiert. Diisopropylamin wurde über Kalziumhydrid destilliert und über 3A Molekularsieben gelagert. Es erfolgte eine Dünnschichtchromatographie (tlc) auf Merck analytischen Silikagelplatten (Merck Nr. 5735) unter Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme: S1, CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (90 : 10 v/v), S2, CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (98 : 2 v/v) oder S3, CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc/Et&sub3;N (45 : 45 : 10 v/v). Die Schmelzpunkte wurden in Kapillaren mit offenen Enden auf einer elektrothermalen Schmelzpunktvorrichtung bestimmt.

BEISPIEL 1: Synthese von Nukleosidanalogen

3',5'-Di-o-p-toluyl-5-ioddesoxyuridin (1): Die Titelverbindung wurde durch eine Modifizierung des Verfahrens nach Robins et al 18 unter Verwendung von 5-Ioddesoxyuridin anstelle von Desoxyuridin in einer Ausbeute von 92%, Schmelzpunkt 205-206ºC (lit ¹&sup4; 195-196) hergestellt.
¹³C NMR (CDCl&sub3;, 25 MHz) δ 21.7 (CH&sub3;), 38.7 (C-2'), 64.1 (C-5'), 69.0 (C-5), 74.9 (C-3'), 83.4 (C-1'), 85.8 (C-4'), 126.1, 126.4 (tol C-1), 129.3, 129.5, 129.8 (tol C-2, C-3, C-5 und C-6), 143.6 (C-6), 144.6 (tol C-4) 149.2 (C-2), 159.7 (C-4), 166.0 (tol C-0).
3-tert-Butyloxycarbonylamidopropin:
Zu 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden 2,75 g (50 mmol) 3-Aminopropin und danach 10,92 g (50 mmol) di-tert-Butylpyrokarbonat hinzugefügt. Nach 3-stündigem Rühren wurde die Reaktionsmischung zu Sirup verdampft und bei -20ºC gehalten, um zu kristallisieren. Das Produkt wird ausgefiltert, mit Hexan gewaschen und getrocknet, um 5,34 g (69%), Schmelzpunkt 42-44ºC (lit ¹³ Schmelzpunkt 43ºC) zu ergeben. ¹H NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz) δ 1,46 (9H, s, CH&sub3;), 2,21(1H, t, J-2,6 Hz, C=CH), 3,91(2H, dd, J=2,6 Hz und 3,5 Hz, CH&sub2;) 4,68 (1H, br s, NH). ¹³ C NMR (CDCl&sub3;, 22,5 MHz) δ 28,4 (CH&sub3;), 30,6 (CH&sub2;), 71,2 (C-1), 80,1 ( (CH&sub3;)&sub3;), 80,2 (C-2), 155,3 (C=0).
5-(3-tert-Butyloxycarbonylamidoprop-1-inyl)-3',5'-di-o-p-toluyldesox-yuridin (2):
Zu 500 ml desoxygeniertem Äthylacetat wurden 5,90 g (10 mmol) 3',5'-di-o-p-Toluyl-5- ioddesoxyuridin (1) und anschließend 3,10 g (20 mmol) N-BOC-3-Aminopropin, 150 mg (Ph&sub3;P)&sub2;PdCl&sub2;, 150 mg Cul und 6,7 ml Triäthylamin (50 mmol) hinzugefügt. Die resultierende Suspension wurde bei Raumtemperatur gerührt, und an die Reaktion schloß sich tlc (S2) an.
Nach 90 Stunden war das Ausgangsmaterial verschwunden. Weitere 200 ml Äthylacetat wurden danach hinzugefügt und die resultierende Mischung mit 5% Dinatrium EDTA/H&sub2;O (2 · 300 ml), H&sub2;O (300 ml) und Salzlösung (300 ml) gewaschen. Danach wurde sie getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), das Lösungsmittel verdampft und der Rest in 15 ml Lösungsmittel S3 erneut aufgelöst und durch Flash-Chromatograhpie¹³ unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels, Ausbeute 5,08 g (84%) gereinigt. Eine Probe wurde aus CHCl&sub3;/MeOH 1 : 5 umkristallisiert, um 2: Schmelzpunkt 169,5-170,5ºC zu ergeben. (UV(MeOH) λmax 290 (sh), 283,237 nm (&epsi; 11800, 12400, 39800), λmin 263 nm (&epsi; 5900). ¹H NMR (CDCl&sub3;, 90 MHz) 8 1,44 (9H, s, C(CH&sub3;)&sub3;), 2,42 (6H, s, tol CH&sub3;), 2,7 (2H, m, H&sub2;'), 3,97 (2H, d, J=5,1 Hz, Hg), 4,6-4,7 (4H, m, H&sub4;', H&sub5;' und BOC NH), 5,6 (1H, m, H&sub3;), 6,4(1H, m, H&sub1;'), 7,26 (4H, d, J=8,1Hz, tol H&sub3; und H&sub6;), 9,16 (1H, m, H&sub3;), 6,4 (1H, m, H&sub1;'), 7,26 (4H, d, J-8,1 Hz, tol H&sub3; und H&sub6;), 9,16 (1H, s, Ring NH). ¹³C NMR (CDCl&sub3;, 22,5 MHz) δ 21,7 (q, tol CH&sub3;), 28,4 (q, (CH&sub3;)&sub3;), 31,4 (t, C-9), 38,6 (t-C- 2'), 64,1 (t, C-5'), 73,8 (s, C-8), 74,9 (d, C-3'), 80,0 (s, (CH&sub3;)&sub3;, 83,4 (d, C-1'), 86,1 (d, C- 4'), 90,3 (s, C_7), 100,2 (s, C-5), 126,4 und 126,6 (2s, tol C-1), 129,3-129,9 (4s, tol C- 2, C-3, C-5 und C-6), 141,9 (d, C-6), 144,5 (s, tol C-4), 149,2 (s, C-2), 155,3 (s, BOC C=O), 161,7 (s, C-4), 166,04 und 166,15 (2s tol C=0). Analyse für C&sub3;&sub3;H&sub3;&sub5;O&sub9;N&sub3;: Berechnet: C, 64,17; H, 5,71; N, 6,80. Gefunden: C, 63,94: H, 5,52; N, 6,55.
5-(3-tert-Butyloxycarbonylamidoprop-1-inyl)-5'-0-dimethoxytrityldeso-xyuridin (5):
Einer gerührten Suspension von 304 mg (2,2 mmol) von trockenem K&sub2;CO&sub3; in 5 ml trockenem Methanol wurden 617 mg (1 mmol) 2 hinzugefügt. Nach 1,5 h wurde die Reaktionsmischung, abgefiltert das Filtrat mit Dowex 50-X8 (H&spplus;) neutralisiert, das Harz abgefiltert, und das Filtrat zur Trockene eingedampft, um 4 zu ergeben. Das Produkt wurde durch gemeinsame Verdampfung mit trockenem Pyridin (3 · 5 ml) vollständig getrocknet und in 5 ml trockenem Pyridin erneut aufgelöst. 406 mg (1,2 mmol) 4,4'- Dimethoxytritylchlorid wurde hinzugefügt und die Mischung 4 h lang bei Raumtemperatur gerührt; danach wurde die Reaktion durch tlc (S1) als vollständig beurteilt. 2 ml MeOH wurden hinzugefügt, die Lösung weitere 10 Min. lang gerührt, verdampft, in 30 ml Dichlormethan erneut aufgelöst und mit 100/0 NaHCO&sub3;/H&sub2;O (30 ml), Salzlösung (30 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde wieder verdampft und das Produkt erneut in 5 ml CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst und durch Flash- Chromatographie gereinigt, wobei zunächst mit 300 ml 2% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; und dann mit 100/0 MeOH, CH&sub2;Cl&sub2; eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockene eingedampft, um 468 mg (68% von 2) von 5 zu ergeben. UV(MeOH) λmax 294 (sh), 283, 231 nm (&epsi; 6100, 6800, 21500), λmin 257 nm (2500). ¹H NMR (CDCl&sub3;, 100 MHz) δ 1,39 (9H, s, BOC CH&sub3;), 2,4 (2H, m, H&sub2;'), 3,38 (2H, m, H&sub5;'), 3,78 (8H, s, OCH&sub3; plus H&sub9;), 4,1(1H, m, H&sub4;'), 4,6 (3H, m, H&sub3;'+ BOC NH), 6,32 (1H, t, H&sub1;'), 6,80, 6,89 (4H, d, J=9,0 Hz, meta CH von PhOCH&sub3;), 7,2-7,5 (9H, m, einschließlich eines Dubletts bei 7,29, 7,34 (1=9,0 Hz) von ortho cH von PhOCH&sub3; und Ph), 8,11(1H, s, H6). Analyse für C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub1;O&sub9;N&sub3;: Berechnet C, 66,75; H, 6,04; N, 6,15. Gefunden: C, 66,89; H, 5,82; N, 6,00.
Das Nukleosid 4 wurde auch durch Flash-Chromatographie (20% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; als Eluens) der Rohreaktionsmischung aus der Schutzgruppenentfernungsreaktion nach dem Abfiltern des Kaliumkarbonats gereinigt. Dies ergab 4, ¹H NMR (d&sub6;-DMSO, 100 MHz) δ 1,39 (9H, s, CH&sub3;), 2,1 (2H, m, H&sub2;'), 3,35 (6H, s, 2 Methanolmoleküle in der Probe vorhanden), 3,6 (2H, m, H&sub5;'), 3,8 (1 H, m, H&sub4;'), 3,93 (2H, d, J = 5,9 Hz, H&sub9;), 4,2 (1 H, m, H&sub3;'), 5,10 (1H,t, J=5 Hz, 5'-OH), 2,25(1H, d, J=4 Hz, 3'-OH), 6,11(1H, t, J=6,6 Hz, H&sub1;'), 8,14 (1H, s, Ring NH); UV (MeOH) λmax 290, 231 nm (&epsi; 12900, 18200), λmin 254 nm (&epsi; 4200), bei 260 nm, &epsi; = 5800 M&supmin;¹.
5-(3-tert-Butyloxycarbonylamidoprop-1-inyl)-5'-0-di-methoxytrityl-3'--N,N- diisopropylaminomethoxyphosphinyl-desoxyuridin (7):
Zu einem Argon-gespülten 25 ml Rundbodenkolben wurde eine Lösung von 243 mg (0,5 mmol) 5 in 5 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; eingebracht. Danach wurden 17,5 mg (0,25 mmol) Tetrazol und 25 ul (0,25 mmol) trockenes Diisopropylamin hinzugefügt. Die Lösung wurde gerührt, bis sich das Tetrazol auflöste 300 ul (1,1 mmol) bis(Diisopropylamino)methoxyphosphin 17 6 wurde dann hinzugefügt, und nach der Reaktion erfolgte tlc (S3). Nach 5 Stunden wurde die Reaktionsmischung mit 10% NaHCO&sub3;/H&sub2;O (2 · 15 ml) und Salzlösung (2 · 25 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde verdampft, um 392 mg (93% Rohausbeute) 7 zu ergeben. Das ³¹P NMR Spektrum dieses Materials zeigte einen Hauptpeak aus einem Dublett bei 150,19 und 150,45 ppm und kleineren Peaks bei 4,23 und 10,41 ppm. Diese Nebenprodukte stellen keine Beeinträchtigung der Kupplungsreaktion dar.
Ein Teil dieses Materials wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (S3). ¹H NMR (CD&sub3;CN, 100 MHz) δ 1,13 (12 H, 2d, J=6,5Hz, CH(CH&sub3;)&sub2;), 1,38 (9H, s, BOC CH&sub3;), 2,4 (2H, m, H&sub2;'), 3,2-3,5 (5H, m enthaltend 2d (J=13,3Hz, PCH&sub3;) und H&sub5;'), 3,5 (2H, m, CH(CH&sub3;)&sub2;), 3,7-3,8 (8H, m enthaltend ein starkes Singulett bei 3,77 (Trityl OCH&sub3;) und H&sub9;), 4,1(1H, m, H&sub4;'), 4,6 (1H, m, H&sub3;'), 6,1(1H, dt, H&sub1;'), 6-8-7,5 (13H, m, Trityl CH), 7,90 und 7,91(1 H, 2s, H&sub6;).
5-(3-Aminoprop-1-inyl)-3,5'-di-O-p-toluyldesoxyuridin, Trifluoracetatsalz (8):
Zu 20 ml 95% CF&sub3;CO&sub2;H/H&sub2;O (TFA/H&sub2;O) wurden 3,09 g (5 mmol) 2 hinzugefügt. Nach zehnminütigem Rühren wurde das Lösungsmittel zur Trockene abgedampft. 10 ml Äthylacetat wurden hinzugefügt, es wurde erneut verdampft, das Produkt kristallisiert, gefiltert und getrocknet, um 2,56g (81%) 8, Schmelzpunkt 120ºC (zers) zu ergeben.
UV(MeOH) λmax 290(sh), 282, 236 nm (&epsi; 11900, 12400, 41200), λmin 263 nm (&epsi; 9000). ¹H NMR (90 MHz, d&sub6;-DMSO) δ 2.39 (6H, s, CH&sub3;, 2.5-2.6 (m, Lösungsmittel plus H&sub2;'), 3.7 (m, H&sub2;O Verunreinigung in Lösungsmittel plus H&sub9;), 4.6 (3H, m, H&sub4;' und H&sub5;'), 5.6 (1H, m, H&sub3;), 6.24 (1H, t. H&sub1;'), 7.34 (4H, 2d, J=8.1 HZ, tol H&sub2; and H&sub6;), 7.90 (4H, 2d, J=8.1 Hz, tol H&sub3; und H&sub5;), 8.07 (1H, s, H&sub6;), 8.3 (3H, bs, NH&sub3;&spplus;), 11.80 (1H. s, ring NH). ¹³C NMR (75 MHz, d&sub6;-DMSO) δ 21.2 (CH&sub3;), 29.0 (C-9), 36.4 (C=2'), 64.2 (C-5'), 74.4 (C-3'), 78.5 (C-8), 81.5 (C=1'), 85.2 (C-7), 85.7 (C=4'), 97.6 (C-5), 126.4 (tol C-1), 129.3. 129.5 (tol C-2,C-3, C-5 and C-6), 143.9 (C-6), 144.8 (tol C-4), 149.3 (C-2), 161.3 (C-4), 165.2 (carboxyl), 165.6 (tol C=0).
Analyse für C&sub3;&sub0;H&sub2;&sub8;O&sub9;N&sub3;F&sub3;: Berechnet C, 57,05; H, 4,47; N, 6,65; F, 902. Gefunden C, 57,12; H, 4,75; N, 6,42; F, 9,1.
6-tert-Butyloxycarbonylamidohexansäure:
Zu 13,12 g (100 mmol) 6-Aminohexansäure in 400 ml Dioxan bei 0ºC wurden 100 ml 1 M NaOH und 24,01 g (110 mmol) di-tert-Butylpyrokarbonat hinzugefügt. Die resultierende Suspension wurde bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt; nach Ablauf dieser Zeit ergab sich ein negativer Ninhydrin-Test. Das Volumen wurde dann unter Druck auf 100 ml reduziert, die Mischung auf 0ºC abgekühlt mit Äthylacetat abgedeckt und mit 1 M KHSO&sub4; auf einen pH-Wert von 2-3 angesäuert. Das Produkt wurde mit Äthylacetat (3 · 150 ml) extrahiert, die organische Phase mit H&sub2;O gewaschen (2 · 300 ml), getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem dicken Sirup eingedampft. Dieser wurde aus Äthylacetat/Hexan umkristallisiert, um 20,40 g (88%), Schmelzpunkt 39-41ºC (lit¹&sup4; Schmelzpunkt 39,5ºC) zu ergeben.
p-Nitrophenyl 6-tert-butyloxycarbonylamidohexanoat (9):
Zu einer Lösung von 2,31 g (10 mmol) 6-tert-Butyloxycarbonylamidohexansäure und 1,62 g (12 mmol) p-Nitrophenol in 30 ml EtOAc bei 0ºC wurden tropfenweise 2,06 g (10 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Diese Lösung wurde bei 0ºC 0,5 Stunden lang und dann bei Raumtemperatur 3,5 Stunden lang gerührt, zur Entfernung von Dicyclohexyl-Harnstoff gefiltert, zur Trockene eingedampft und das Produkt aus 95% 1% Essigsäure enthaltenden EtOH umkristallisiert, um 3,35 g (95%) 9, Schmelzpunkt 119-120ºC (lit¹&sup4; Schmelzpunkt 116,5ºC) zu ergeben.
5-[N-(6-tert-Butyloxycarbonylamidohexanoyl)-3-amino-prop-1-inyl]-3',-5'-di-o-p- toluoyldesoxyuridin (10):
Zu einer Lösung von 1,89 g (3 mmol) 8 in 30 ml trockenem DMF wurden 443 ul DBU (3 mmol) und 1,16 g (3,3 mmol) 9 hinzugefügt. Nach einstündigem Rühren wurde die Mischung unter Vakuum eingedampft, der Rückstand in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 400 ml Äthylacetat erneut aufgelöst, mit H&sub2;O (2 · 300 ml) und Salzlösung (300 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene eingedampft. Der Feststoff wurde aus Methanol umkristallisiert, um 1,76 g (80%) 10, Schmelzpunkt 192-194ºC zu ergeben.
UV(MeOH) λmax 290 (sh), 282, 237 mm (&epsi; 13800, 14400, 43000), λmin 262 nm (&epsi; 10300). ¹H NMR (CDCl&sub3;, 100 MHz) δ 1.4-1.9 (15H, m mit s bei 1.43 (BOC CH&sub3;) und H&sub3;'', H&sub4;'' and H&sub5;''), 2.16 (2H. 5, J=7.5 Hz, H&sub2;''), 2.42 (6H, s, tol CH&sub3;), 2.75 (2H, m, H&sub2;'), 3.1 (2H, m, H&sub6;''), 4.04 (2H, d, J=5.0 Hz, H&sub9;), 4.5.4.8 (4H, m, H&sub4;', H&sub5;' und BOC NH), 5.6 (1H, m, H&sub3;'), 6.31 (1H, dd, H&sub1;'), 7.27 (4H, d, J=8.2 Hz, tol H&sub3; und H&sub5;), 7.84 (1H, s, H&sub6;), 7.91 und 7.93 (4H, 2d, J=8.2 Hz. tol H&sub1; und H&sub6;), 9.0 (1H, br s, ring NH), ¹³C NMR (CDCl&sub2;, 75 MHz) δ 21.7 (tol CH&sub3;), 25.2 (C-4''), 26.4 (C-3''), 28.4 (BOC CH&sub3;), 29.7 (C-5''), 30.0 (C-9), 36.1 (C-2''), 38.6 (C-2'), 40.4 (C-6''), 64.2 (C-5'), 74.0 (C-8), 74.8 (C-3'), 79.8 ( (CH&sub3;)&sub3;), 83.4 (C-1'), 86.0 (C-4'), 89.9 (C-7), 100.0 (C-5), 126.2. 126.4 (tol C-1), 129.3. 129.5, 129.6 und 129.8 (tol cH), 142. 1 (C-6), 144.8 (tol C-4), 149.1 (C-2), 156.1 (BOC C-0), 161.9 (C-4), 166.0, 166.2 (tol C-0), 172.3 (C-1).
Analyse für C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub6;O&sub1;&sub0;N&sub4;: Berechnet: C, 64,10; H, 6,34; N, 7,67. Gefunden: C, 64,34; H, 6,32; N, 7,51.
5-[N-(6-tert-Butyloxycarbonylamidohexanoyl)-3-amino-prop-1-inyl]-5'--O- dimethoxytrityldesoxyuridin (12):
Die Titelverbindung wurde aus 10 unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie zur Herstellung von 5 aus 2 hergestellt. Ausbeute 1,20 g (75% aus 10). UV(MeOH) λmax 293 (sh) 283, 233 nm (s 8500, 9000, 24500), λmin 257 n m (&epsi; 2900). Das 1 H NMR Spektrum dieser Verbindung war ein Gemisch jener Resonanzen, die sich aus dem Desoxyribosenanteil von 5 und dem heterozyklischen Basenanteil von 10 ergeben.
¹³C NMR (CDCl&sub3;, 75 MHz) δ 25.1 (C-4''), 26.4 (C-3''), 28.4 (C( H&sub3;)&sub3;, 29.7 (C-5''), 30.0 (C-9), 35.9 (C-2''), 40.4 (C-6'), 41.7 (C-2'), 55.3 (OCH&sub3;), 63.6 (C-5'), 72.2 (C-3'), 74.1 (C-8), 79.2 ( (CH&sub3;)&sub3;), 86.0 (C-4'), 86.8 (C-1'). 87.0 (Trityl zentral C), 89.7 (C-7), 99.5 (C=5), 113.4 (Methoxyphenyl C-3 und C-5), 127.0, 127.9 und 128.1 (phenyl CH), 130.0 (Methozyphenyl C-2 und C-6), 135.6 (Methoxyphenyl C-1), 143.1 (C-6), 144.6 (Phenyl C-1). 149.4 (C-2). 156.0 (BOC C=0), 158.6 (Methoxyphenyl (C-4), 162.5 (C-4), 172.7 (C-1'').
Analyse für C&sub4;&sub4;H&sub5;&sub2;O&sub1;&sub0;M&sub4;: Berechnet C, 66,32; H, 6,58; N, 702. Gefunden: C, 65,94; H, 6,52; N. 6,70.
5-[N-(6-tert-Butyloxycarbonylamidohexanoyl)-3-aminoprop-1 -inyl]-5'-O-dimethoxytrityl- 3'-N,N-diisopropyl-aminomethoxyphosphinyldesoxyuridin (11):
Die Herstellung von 11 war ähnlich wie jene von 7, mit der Ausnahme, daß die Reaktion 4 Stunden lang ablaufen gelassen und weitere 30 ml CH&sub2;Cl&sub2; vor den Wäschen der Reaktionsmischung hinzugefügt wurde. Die gewaschene und getrocknete Lösung wurde unter Vakuum zu Trockene eingedampft, um 903 mg (94% Rohausbeute) 11 zu ergeben. ³¹P NMR dieses Materials zeigte einen großen Peak bei 149,86 ppm, wobei kleinere Peaks bei 7,35, 13,06 und 18,25 ppm zu beobachten waren.

BEISPIEL 2

Koppeln der Phosphoramidite 7 und 11 an das 5'-Hydroxyl eines Oligonukleotids:
Die Verfahren zum Anhängen der modifizierten Nukleosidphosphoramidite an das 5'- Ende eines vollständig geschützten, an einen festen Träger gebundenen Oligonukleotids waren herkömmlich 20 Das vollständig geschützte, harzgebundene Oligonukleotid wurde auf dem Applied Biosystems 380A DNA-Synthetisierer in einem 1 pmol Maßstab synthetisiert. Der feste Träger wurde dann zu einer manuellen Reaktionszelle transportiert. Diese Zelle ähnelte einer Miniatur-Chromatographiesäule, sie wies einen Durchmesser von 1 cm auf und war 3 cm lang. Sie war mit einem B14 Schnellpaßdeckel und einer gesinterten Glasscheibe mittlerer Porosität mit einem
Dreiweg-Teflonhahn am Boden versehen. Nach der Detritylierung (3%
Dichloressigsäure/CH&sub2;Cl&sub2;) wurde das Harz gründlich mit trockenem CH&sub3;CN gewaschen und unter Argon gelassen. 10 umol des Phosphoramidits und 40 umol Tetrazol sowie anschließend 1 ml trockenes CH&sub3;CN wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden 15 Minuten lang gerüttelt, entleert, und die Phosphittriester wurden mit 0,1 M Jodlösung in herkömmlicher Weise oxidiert. Ein Tritylassay erfolgte an einer kleinen Probe, um das Reaktionsausmaß zu quantifizieren. Nach der Entfernung der Methylschutzgruppen auf Phosphat (Thiophenoxidion, 2 h) wurde das Harz mit 90% TFA/Äthandithiol 5 min lang behandelt, abgetropft, gründlich mit CH&sub3;CN mit einer Gesamtmenge von 20 ml bei 20% Et&sub3;NiCH&sub2;Cl&sub2; und dann wieder mit CH&sub3;CN gewaschen und getrocknet. Das Oligonukleotid wurde dann mit 35% wässerigem NH&sub3; (4 ml) vom Träger abgespalten und die resultierende Lösung über Nacht bei 55ºC stehengelassen, um die Basenschutzgruppen zu entfernen. Die Verdampfung zur Trockene ergab das Produkt, das in H&sub2;O (3 ml) wiederaufgelöst wurde.
Die Oligonukleotide wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Das Produkt war das sich am langsamsten bewegende Hauptband, das um etwa 1-2 Nukleotide langsamer lief als die nicht derivatisierten Oligonukleotide. Typischerweise wurden etwa 150 ul der Oligonukleotidlösung auf einem 10%, 1,5 mm dicken, 20 cm langen Polyacrylamidgel (25 ul + 5 ul Formamid pro 1 cm · 1 cm Napf) gereinigt. Die Bänder wurden durch UV-Schattieren unter Verwendung einer Fluoreszenz-tlc- Silikagelfolie als Hintergrund sichtbar gemacht. Die Produktbänder wurden ausgeschnitten, in H&sub2;O eluiert, dialysiert, lyophilisiert und in 150 ul H&sub2;O erneut aufgelöst.

BEISPIEL 3

Herstellung von Oligonukleotiden. die innere modifizierte Nukleotide enthalten:
Die Nukleotidphosphoramidite 7 und 11 wurden auf dem Applied Biosystems DNA- Synthetisierer verwendet, um Oligonukleotide herzustellen, deren Thymidinreste durch das eine oder andere der modifizierten Nukleoside ersetzt waren. Die Phosphoramidite wurden mit trockenem Acetonitril entweder auf 0,1 M (für 7) oder 0,15 M (für 11) gebracht. Die Synthesen erfolgten in einem Maßstab von 0,2 umol. Die wiederholten Kopplungsausbeuten betrugen 99-100%. Nach dem Kettenaufbau wurde der feste Träger zu einer manuellen Reaktionszelle transportiert und dann von der Schutzgruppe befreit und vom festen Träger abgespalten, wie im Falle der Oligonukleotide, die das einzige 5' modifizierte Nukleosid enthielten. Das Endprodukt wurde erneut in 2 ml H&sub2;O aufgelöst.

BEISPIEL 4

Farbstoffkonjugation an das Aminooligonukleotid:
Die folgende Verfahrensweise wurde zur Konjugation von FITC an das gereinigte Oligonukleotid verwendet, das ein einziges modifiziertes Nukleosid am 5'-Ende enthielt. Einer Lösung von 2 mg (5 umol) FITC in 20 ul DMF wurden 180 ul 0,1 M K&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 9,0, und danach 100 ul (etwa 30 nmol) der Aminooligonukleotidlösung hinzugefügt. Die Mischung wurde über Nacht im Dunkeln gehalten und dann auf eine 10 ml Sephadex G-25-Säule (mittel) in 0,1 M Ammoniumacetat, pH-Wert 9,0, aufgebracht. 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt, und das fluoreszierende Material (durch Bestrahlen mit einer UV-Lampe nachgewiesen), das im ausgeschlossenen Volumen eluierte, wurde gesammelt. Es wurde gefriergetrocknet, erneut in einem 200 ul 0,1 M Ammoniumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 9,0 aufgelöst und auf eine andere ähnliche Sephadex G-25 Säule aufgebracht. Die fluoreszierenden Fraktionen wurden wie oben gesammelt und das dekadische Absorptionsvermögen bei 260 und 495 nm bestimmt. Aus diesem Verhältnis wurde die Anzahl an Fluoresceinresten pro Oligonukleotidmolekül unter Verwendung von &epsi;&sub2;&sub6;&sub0; für die modifizierten KPIB und HCAL (siehe Ergebnisabschnitt der Nukleotidsequenzen dieser Oligonukleotide) von jeweils 3,2 · 10&sup5; und 4,4 · 10 M&supmin;¹ und &epsi;&sub4;&sub9;&sub5; für Fluorescein von 7 · 1& M&supmin;¹ bestimmt. Das Produkt wurde anschließend lyophilisiert und zweimal aus H&sub2;O relyophilisiert.
Für die Konjugation von TITC an das Oligonukleotid mit mehrfachen inneren Aminogruppen verwendete man einen viel größeren Überschuß an FITC. Einer Lösung von 26 mg (63 umol) FITC in 100 ul DMF wurden 100 ul 1 ,0 M K&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 9,0, und danach 100 ul (etwa 10 nmol) des Aminooligonukleotids hinzugefügt. Dieses ließ man über Nacht im Dunkeln reagieren. Es wurde wie im vorigen Fall gereinigt und die Fluoresceinbeladung bestimmt, wobei &epsi;&sub2;&sub6;&sub0; für die modifizierten KPIB und HCAL von jeweils 3,1 · 10&sup5; und 4,3 · 10&sup5; M&supmin;¹ verwendet wurde und das dekadische Absorptionsvermögen von Fluorescein bei 260 nm unter Verwendung von &epsi;&sub2;&sub6;&sub0; für Fluorescein von 2 · 10&sup4; M&supmin;¹ berücksichtigt wurde.

BEISPIEL 5

Hybridisierung mit FITC-markierten Oligonukleotiden:
RNA-Dot Blots mit polyadenylierter RNA aus Mäusespeicheldrüsen wurden wie oben hergestellt 15 Die RNA-Menge nahm um einen Faktor 3 bei jedem nacheinanderfolgenden Dot ab, wobei sie einen Anfangswert von 1 ug aufwies. Die Nitrozellulosefilter wurden 4 Stunden lang bei 42ºC in einer Lösung aus 5 s SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,5, 0,02% Rinder-Serumalbumin, Fraktion V, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 30 ug/ml denaturierter Kalbsbries-DNA und 50% Formamid prähybridisiert. Die Hybridisierungen erfolgten unter vier unterschiedlichen Bedingungsgruppen: hohe Strenge, Hybridisierung bei 40ºC über einen Zeitraum von 24 Stunden, und Auswaschen mit 2x SSC bei Raumtemperatur; mittlere Strenge, wie oben, nur Hybridisieren bei Raumtemperatur; niedere Strenge, wie oben, doch die Hybridisierungsmischung enthielt 10% Formamid anstelle von 50%; niederste Strenge, Prähybridisieren bei 4ºC, Hybridisieren bei 4ºC ohne vorhandenes Formamid über 5 Tage und Waschen bei Raumtemperatur mit 2xSSC.

ERGEBNISSE

Herstellung von C-5 substituierten Nukleotiden:
Die zur Herstellung der substituierten Desoxyuridine angewendete Vorgangsweise ist in Fig. 3 dargestellt. 3',5'di-O-p-p-Toluyl-5-ioddesoxyuridin (1), hergestellt aus im Handel erhältlichem 5-Ioddesoxyuridin, wurde mit N-BOC-3-Aminopropin in Gegenwart katalytischer Mengen von bis(Triphenylphosphin)palladiumchlorid und Kupfer(1)iodid kondensiert. Robins und Barr berichteten über dieses Koppeln von terminalen Alkinen mit 5-Ioduracilen und 5-Ioddesoxyuridinen unter Verwendung von Alkinen mit Alkyl-, Äther- oder Estersubstituenten ¹&sup8;. Die Reaktionen erfolgten in Triäthylamin als Lösungsmittel bei 50ºC. Es wurde eine Vielzahl Bedingungen untersucht, um die Ausbeute an Produkt 2 zu maximieren und die Ausbeute des hauptsächlichen Nebenprodukts, eines Fluoreszenznukleosids, zu minimieren, das analog zur Arbeit von Robbins und Barr, wahrscheinlich Struktur 3 aufweist. Die Bedingungen, die die besten Ausbeuten von 2 ergaben, sahen die Verwendung von Äthylacetat als Lösungsmittel mit einem fünffachen Molüberschuß von Triäthylamin gegenüber 1 und das Durchführen der Reaktion bei Raumtemperatur vor. Dies ergab eine Ausbeute von 84%. Die Struktur des Produkts wurde durch ¹H und 13C NMR-Spektroskopie bestätigt. Dieses Produkt ist eine Schlüsselverbindung, aus der man eine Anzahl anderer Derivate erhalten kann.
Das Phosphoramidit 7 wurde durch ein dreistufiges, in Fig. 3 dargestelltes Verfahren aus 3 hergestellt. Die 3',5'-Esterschutzgruppen von 2 wurden unter Verwendung von Kaliumkarbonat/Methanol entfernt, und das resultierende Produkt 4 wurde mit Dimethoxytritylchlorid in Pyridin behandelt, um 5 zu ergeben. Das UV-Spektrum von 4 lieferte auch Beweise für die Struktur des Nukleosids. Das Absorptionsmaximum der heterozyklischen Base verschob sich von 265 nm in Thymidin auf 290 nm im Nukleosid 4, wobei auch die Intensität gleichzeitig zunahm. Diese Verschiebung im Absorptionsmaximum kann man in allen synthetisierten Derivaten beobachten, welche dieses Chromophor enthalten.
Die Behandlung des 5'-tritylierten Nukleosids 5 mit einem zweifachen Überschuß des bis(Dialkylamino)phosphins 6 unter katalytischen Bedingungen ergab das Phosphoramidit 7. Dieses Verfahren der Phosphoramiditherstellung ähnelt dem durch Caruthers et al ¹&sup0; beschriebenen zur Herstellung von Phosphoramiditen in situ.

BEISPIEL 6

Herstellung von Nukleosiden mit einem längeren Linkerarm an C-5:
Obwohl man, wie dies weiter unten in der vorliegenden Beschreibung geschildert ist, 7 zum Einbau von inneren primären aliphatischen Aminogruppen in ein Oligonukleotid verwenden kann, vermutete man von Anfang an, daß die kurze Länge des Linkerarms zwischen der heterozyklischen Base und der Anhängstelle des Markers (der Endaminogruppe) die Hybridisierungseigenschaften der Oligonukleotide beeinflussen könnte. Dies würde besonders zutreffen, wenn fluoreszierende Gruppen angehängt würden, da diese zumeist große, ebene Moleküle sind. Es wurde daher eine Strategie entwickelt, um einen langen Linkerarm in C-5 einzubauen. Dies ist in Fig. 5 dargestellt. Die Aminogruppe der Schlüsselverbindung 2 wurde mit 95% TFA/H&sub2;O von der Schutzgruppe befreit, um 8 in hoher Ausbeute zu ergeben. Dieses wurde dann mit dem p-Nitrophenylester 9 in Gegenwart eines Äquivalents 1,8-Diazabicyclo-(5,4,0)undec-7- en (DBU) umgesetzt, um das Addukt 10 in hoher Ausbeute zu ergeben. Dieses Produkt wurde in ähnlicher Weise wie bei 2 zu Phosphoramidit 11 umgewandelt.

BEISPIEL 7

Einbau von modifizierten Nukleosiden am 5'-Ende von Oligonukleotiden:
Anfänglich wurden Phosphoramidite 7 und 11 durch ihr händisches Koppeln an das 5'- Ende eines vorgebildeten Oligonukleotids geprüft. Somit wurde das 30mer GGGCTTCACAACATCTGTGATGTCAGCAGG auf einem automatischen Applied Biosystems 380A DNA-Synthetisierer zusammengesetzt und voll geschützt auf dem Harz gelassen. Diese Sequenz ist komplementär zu einer Region der Kallikrein-mRNA, die allen Kallikreinen 15 gemein ist; sie wird hier als KPIB bezeichnet. Das Harz wurde zu einer manuellen Reaktionszelle transportiert. Nach der Detritylierung des letzten Nukleosids wurde entweder 7 oder 11 in Gegenwart von Tetrazol gekoppelt. Die Kopplungen waren im wesentlichen quantitativ, wie durch den Tritylversuch geprüft wurde. Nach der Entfernung der Phosphatschutzgruppen mit Thiophenoxidion wurde das Harz 5 Minuten lang mit 90% TFA:10% Äthandiol behandelt, um die BOC- Schutzgruppe zu entfernen. Die Gegenwart von Äthandiol schützte das Oligonukleotid vor Abbau. Triäthylamin diente dazu, die neu gebildete Aminogruppe und die sekundären Phosphate zu neutralisieren; anschließend wurde das Oligonukleotid in herkömmlicher Weise behandelt, um es vom Harz abzuspalten und die Basenschutzgruppen zu entfernen. Die Oligonukleotide wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt, wobei die modifizierten Oligonukleotide um ein bis zwei Nukleotide langsamer liefen als man es von den normalen kürzeren Sequenzen im Produkt erwarten könnte.

BEISPIEL 8

Koppeln von Fluorophoren an die Aminooligonukleotide.
Die zur Befestigung der aminreaktiven Fluorophore an Aminooligonukleotide angewendete Vorgangsweise ist im Grunde genommen die gleiche wie jene, die zum Anhängen solcher Moleküle an die &epsi;-Aminogrnppen von Lysinresten in Proteinen in großem Umfang verwendet wurde ¹&sup7;. Die Verfahrensweise umfaßt das Umsetzen des Aminooligonukleotids mit dem reaktiven Fluorophor bei einem pH-Wert von 9, so daß ein beträchtlicher Anteil der aliphatischen Aminogruppen nicht protoniert wird. Smith et al. wendeten eine ähnliche Verfahrensweise beim Koppeln von Fluorophoren an 5'- Aminothymidin-enthaltende Oligonukleotide an 1 Die Markierungreaktions-Mischung wird dann zweimal durch eine Sephadex G-25 Säule hindurchgeschickt, um den überschüssigen nicht umgesetzten Farbstoff vom Oligonukleotid zu trennen. Der Markierungsgrad wird danach durch das Messen der Absorption des Produkts bei 260 nm und bei 495 nm bestimmt. Wenn die Oligonukleotide das Nukleotid von 7 (kurzer C-5-Arm) am 5'-Ende enthielten, markierte eine einzige Reaktion unter Verwendung eines 150-fachen Molüberschusses von FITC 20% der Kallikrein- Oligonukleotidmoleküle und ein Drittel der Kalzitonin-Moleküle. Eine zweite FITC- Kopplungsreaktion auf dem gleichen Material erhöhte den Markierungsgrad auf 67 bzw. 83%. Dieses markierte Material wurde auch mit [γ³²P]ATP 5'-endmarkiert und der Elektrophorese unterworfen. Es wies ein einziges radioaktives Band an der erwarteten Position auf (Daten nicht dargestellt).
Die Oligonukleotide, welche mehrere innere primäre aliphatische Aminogruppen und somit mehrere potentielle Stellen für den Markereinbau enthielten, wurden auch der FITC-Kopplungsreaktion unterworfen. Zunächst werden die den kurzen C-5-Arm enthaltenden Oligonukleotide markiert. Die Kallikreinsonde, die sieben potentielle Stellen für den Markereinbau enthielt, wies ein einziges Fluorescein pro Oligonukleotidmolkeül auf, wenn die gleiche Markierungsreaktion wie oben angewendet wurde. Die Kalzitoninsonde, die neun potentielle Stellen enthielt, wies 1,5 Moleküle Marker auf. Wenn die Verfahrensweise dahingehend geändert wurde, daß man einen viel größeren, nämlich einen 900-fachen, FITC-Überschuß verwendete, erhöhte sich die Einbaumenge auf 4,1 für KPIB und 7,2 für HCAL. Diese Zahlen wurden unter Berücksichtigung des dekadischen Absorptionsvermögens von Fluorescein bei 260 nm errechnet, da diese deutlich ansteigt, wenn eine Anzahl an Fluorophoren am Oligonukleotidmolekül angehängt wird. Das Wiederholen der Reaktion hatte keine entscheidende Auswirkung auf den Markierungsgrad. Als in einer Versuchsreaktion normale KPIB einer Markierungsreaktion mit dem großen Überschuß von FITC unterworfen wurde, stellte sich heraus, daß ein Hintergrund-Markierungswert von 1 in 110 Nukleotiden erzielt wurde. Demgegenüber stehen 15 pro 110 Nukleotiden bei den entsprechenden Aminooligonukleotiden.
Wenn das Kallikreinoligonukleotid, welches das Nukleotid von 11 (langer C-5-Arm) am 5'-Ende enthielt, mit einem 900-fachen FlTC-Überschuß markiert wurde, ergab eine einfache Reaktion den völligen Einbau des Markers. Das fluoreszierende Produkt wurde auch am 5'-Ende radioaktiv markiert, und bei Gelelektrophorese ergab sich ein einfaches Band an der erwarteten Position (Daten nicht dargestellt).
Wenn die Oligonukleotide, welche die mehrfachen inneren, den langen C-5-Arm tragenden Nukleotidsubstitutionen enthielten, der gleichen FITC-Kopplungsreaktion wie oben (großer FITC-Überschuß) unterworfen wurden, betrug der Einbauwert für KPIB 2,7 und 5,2 für HCAL. Die mehrfach markierten Sonden wurden auch mit (γ-³²P)ATP 5'- endmarkiert. Die Reinigung der Produktmischung aus der Reaktion auf Sephadex G-25 ergab einen radioaktiven Peak mit hohem Molekulargewicht; bei der Gelelektrophorese konnte man jedoch kein radioaktives Band beobachten.

BEISPIEL 9

Hybridisierung mit den markierten Oligonukleotiden:
Die Kallikreinoligonukleotide wurden auf ihre Fähigkeit getestet, mit Mäusespeicheldrüsen-poly(A)&spplus;-mRNA zu hybridisieren, die reich an Kallikrein-Botschaft ist ¹&sup5; Poly(A)&spplus;-mRNA wurde auf Nitrozellulosefiltern aufgedottet, mit verschiedenen Konzentrationen von 1 ug/pro Dot abwärts. Die fluoreszierenden Oligonukleotide wurden dann in herkömmlicher Weise am 5'-Ende ³²P-markiert und dazu verwendet, die Nitrozellulosefilter zu sondieren. Wenn die fluoreszierenden Oligonukleotide, welche den kurzen Linkerarm enthielten, bei hoher Strenge zur Sondierung der Nitrozellulosefilter verwendet wurden, konnte man kein Signal sehen. Herrschten jedoch Bedingungen mittlerer Strenge, ergab die 5'einfach markierte Sonde ein Signal, dessen Intensität jenem entsprach, das durch die normale nichtmodifizierte Sonde (Fig. 6) abgegeben wird, während die mehrfach markierte Sonde nach wie vor kein deutliches Signal aussendete. Beim Hybridisieren unter Bedingungen niedriger und niedrigster Strenge mit der mehrfach markierten Sonde war das Signal zehnmal bzw. dreimal weniger intensiv als jenes der normalen Sonde.
Diese Ergebnisse zeigen auch, daß es nicht eine kontaminierende kleine Menge einer normalen Sonde ist die Anlaß für das Hybridisierungssignal ist, sondern die fluoreszierend markierte Sonde selbst; ansonsten könnte man auch unter den strengeren Hybridisierungsbedingungen ein Signal sehen.
Als die den C-5-Arm enthaltenden fluoreszierenden Oligonukleotide hybridisiert wurden, hybridisierte die einfach markierte Sonde ebenso wie die normale Sonde unter den Bedingungen hoher Strenge (Fig. 7). Die mehrfach markierte Sonde ergab unter diesen gleichen Bedingungen ein Signal, das etwa dreimal schwächer war.
Die Spezifität der Hybridisierung der fluoreszierend markierten Oligonukleotide wurde ebenfalls untersucht. Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Hybridisierung unter Bedingungen mittlerer Strenge für die zwei einfach markierten Kallikreinoligonukleotide (kurze und lange Arme) mit Leber-mRNA und tRNA im Vergleich zur Speicheldrüsen-mRNA. Kein sichtbares Signal ist im Falle der Nukleinsäuren enthaltenden Nicht-Kallikrein-RNA festzustellen, was darauf hindeutet, daß die Hybridisierung für die Kallikrein-mRNA enthaltenden Spezien spezifisch ist.
QUELLENVERWEISE:
1. Sinith. L.M . . Fung. s . . Hunkapiller. N.W . . Hunkapiller, T.J., and Hood. L.E. (1985) Nucleic Acids Res. 13, 2439-2502.
2. Jablonski, E . . Moomaw. E.W . . Tullis. R.H. and Ruth. J.L. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 6115-6128.
3. Ruth. J.L. (1984) DNA 3, 123.
4. Ruth. J.L . . Norgan. C. and Pasko, A. (1985) DNA 4, 93.
5. Jablonski, E. and Ruth. J.L. (1986) DNA 5, 89.
6. Greene. T.W. (1981) Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc.
7. Sarone. A.D., Tang, J.-Y. and Caruthers. M.H. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 4051-4061
8. Rigby. P.J.W . . Dieckmann, N., Rhodes. C., and Berg, P. (1977) J. Mol. Biol. 113 : 237-251
9. Taylor, P.N . . Illmensee. R., and Summers, J. (1976) Biochim. Biophys. Acta 442 : 324=330
10. Caruthers, M.H . . Beaucage. S.L., Eheavitim, J.W . . Fisher, E.F., Goldman. R.A . . de Hasetu, P.L., Nanchecki, W., Nattkucci, N.D., Rosenthal, N.S., and Stabiusky, &. (1982) Cold Spring Harbor Sym. Quant. Bio. 47 : 411-418
11. Nelton, D.A . . Krieg, P.A . . Rebagliati. N.R . . Maniatis, T., Zinn, K., Green, N.R. (1984) Nuclelc Acids Res. 12 : 7035-7056
12. Lowary, P., Sainpson, J., Milligan, J . . Croebe, D. and Ohlenbeck, O.C. (1986) "Structure and Dynamics of RNA. NATO ASI Series 110" pp. 69-76. ed. van Knippeuberg, P.H. and Hilbers. C.W . . Plenum Press, New York
13. Still. W.C . . Kahn, M. and Mitra. A. (1978) J. Org. Chem. 43, 2923-2925.
14. Tesser, G.I . . Fischer- H. and Schwyzer, R. (1974) Helv. Chirn. Acta 57, 1718-1730.
15. van Leeuwen, S.J . . Evans. B.A., Tregear G.W. and Richards. R.I. (1986) J. Bio. Chem. 261, 5529-5535.
16. Zajac, J.D., Penschow. J . . Mason. T., Tregear, G.W., Coghlan. J.P. and Martin, T.J. (1986) J. Clin. End. Metab. 62, 1037-1043.
17. Nairn, R.C. Fluorescent protein tracing, 4th Ed . . Churchill Livingstone. Edingburgh, 1976.
18. Robins. N.J. and Barr, P.J. (1983) J. Org. Chern. 48, 1854-1862.
19. Sproat. S. and Bait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis (a practical approach), Bait, M.J. ed. pp. 83-116, IRL Press, Oxford
20. Penschow. J.D., Haralambidis. J . . Aldred, P., Treqear, G.W. and Coghlan. J.P. (1986) Methods in Enzymology 124, 534-548.

Claims

1. Nukleosidderivat der Formel (I):

dadurch gekennzeichnet, daß

Y H oder OH oder eine geschützte Hydroxygruppe ist;

X H, eine Phosphonatgruppe oder eine Phosphoramiditgruppe der Formel

ist, worin R¹ und R² gleich oder voneinander verschieden sind und aus Alkyl und substituiertem Alkyl ausgewählt ist, das verzweigt oder unverzweigt sein kann; und Q eine Phosphatschutzgruppe ist;

Z H, eine Phosphat- oder Triphosphatgruppe oder eine Hydroxyschutzgruppe ist;

X' eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-Alkylengruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann;

R eine Aminoschutzgruppe oder ein Fluorophor oder eine andere nicht-radioaktive nachweisbare Markierung ist; oder die Gruppe Y'NHA, worin Y' eine Alkyl(C&sub1;&submin;&sub4;&sub0;)carbonylgruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann, und A eine Aminoschutzgruppe oder ein Fluorophor oder eine andere nicht-radioaktive nachweisbare Markierung ist;

mit der Maßgabe, daß, wenn X' CH&sub2; ist und R CHOCF&sub3; ist

(i) Z nicht H ist, wenn X -H ist und Y -H ist;

(ii) Z nicht Dimethoxytrityl ist, wenn X

und Y -H ist; und

(iii) Z nicht Dimethoxytrityl ist, wenn

ist und Y -O-Tetrahydropyranyl ist.

2. Nukleosidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl R¹ als auch R² Isopropylgruppen sind.

3. Nukleosidderivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß X' Methylen ist und R CO(CH&sub2;)nNHA ist, worin A wie in Anspruch 1 definiert ist und n 1 bis 15 ist.

4. Nukleosidderivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß n 5 ist.

5. Nukleosidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß:

Y H oder OH oder eine geschützte Hydroxygruppe ist;

X

ist;

Z Dimethoxytrityl ist;

X' CH&sub2; ist; und

R CO(CH&sub2;)&sub5;NHA ist, worin A wie in Anspruch 1 definiert ist.

6. Nukleosidderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß:

Y H, OH oder eine geschützte Hydroxygruppe ist;

X H ist;

Z Triphosphat ist;

X' CH&sub2; ist; und

R CO(CH&sub2;)&sub5;NHA ist, worin A wie in Anspruch 1 definiert ist.

7. Nukleosidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Q aus Methyl-, Phenyl-, substituierten Phenyl-, Benzyl- und Cyanoäthylgruppen ausgewählt ist.

8. Nukleosidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-radioaktive nachweisbare Markierung aus Biotin, Avidin, kolloidalem Gold oder Silber und Ferritin ausgewählt ist.

9. Nukleosidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-radioaktive nachweisbare Markierung ein Enzym ist.

10. Nukleosidderivat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym β- Galaktosidase, Urease, Peroxidase oder alkalische Phosphatase ist.

11. Nukleosidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluorophor Fluorescein ist.

12. Nukleosidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluorophor ein Fluorophorvorläufer ist, der eine oder mehrere Gruppen enthält, die Fluoreszenz unterdrücken, aber zur Fluoreszenz fähig ist, sobald diese Gruppen entfernt sind.

13. Nukleosidderivat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Formel hat:

14. Verfahren zur Herstellung eines Nukleosidderivat der Formel (I')

dadurch gekennzeichnet, daß:

Y H oder OH oder eine geschützte Hydroxygruppe ist;

X H, eine Phosphatgruppe oder eine Phosphoramiditgruppe der Formel:

ist, worin R¹ und R² gleich oder voneinander verschieden sind und aus Alkyl und substituiertem Alkyl ausgewählt sind, das verzweigt oder unverzweigt sein kann; und Q eine Phosphatschutzgruppe ist;

Z H, eine Phosphat- oder Triphosphatgruppe oder eine Hydroxyschutzgruppe ist;

X' eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-Alkylgruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann;

R eine Aminoschutzgruppe oder ein Fluorophor oder eine andere nicht-radioaktive nachweisbare Markierung ist; oder die Gruppe Y'NHA, worin Y' ein Alkyl(C&sub1;&submin;&sub4;&sub0;carbonylgruppe ist, die verzweigt oder unverzweigt sein kann, und A eine Aminoschutzgruppe oder ein Fluorophor oder eine andere nicht-radioaktive nachweisbare Markierung ist;

dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

das Umsetzen eines 5-Joduridins oder 5-Joddesoxyuridins der Formel (II):

worin Y und Z die oben angeführte Bedeutung haben und X eine Hydroxyschutzgruppe ist,

mit einem Aminoalkin der Formel H-C CX'NHR, worin X' und R die in Anspruch 1 angeführte Bedeutung haben, in Gegenwart eines Palladiumkatalysators;

mit der Maßgabe, daß, im Falle ein Aminoalkin X' CH&sub2; und R COCF&sub3; ist, in der genannten Verbindung 11 nicht jedes von Z, X und Y H ist.

15. Polynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere Nukleotideinheiten der Formel (III)

aufweist, worin X', Y und R die in Anspruch 1 angeführte Bedeutung haben.

16. Verfahren zur Synthese eines Polynukleotids nach Anspruch 15, worin einzelne Nukleotide oder Nukleotidgruppen der Reihe nach an einer wachsenden Nukleotidkette angehängt werden, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der Nukleotide ein Nukleosidderivat der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, welches die gemeinsame Umsetzung

(a) eines ersten Polynukleotids;

(b) eines zweiten Polynukleotids, das an einen Abschnitt des ersten Polynukleotids hybridisiert;

(c) eines oder mehrerer Nukleotidtriphosphate;

(d) einer DNA-Polymerase oder RNA-Polymerase umfaßt;

wodurch das Polynukleotid vom 3'-Ende des genannten zweiten Polynukleotids synthetisiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der genannten Nukleotidtriphosphate ein Nukleosidderivat der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert ist, worin Z Triphosphat ist und X Wasserstoff ist.

18. Verfahren nach Anspruch 15, welches das sequentielle Aneinanderkoppeln von Nukleotiden über ihre jeweiligen 5'- und 3'-Enden umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der genannten Nukleotide ein Nukleosidderivat der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert ist, worin X aus Phophonat oder einer Gruppe der Formel

ausgewählt ist, worin R¹, R² und Q die in Anspruch 1 angeführte Bedeutung haben.

19. Verfahren zum Sequenzieren von DNA, welches folgende Schritte umfaßt:

(a) das Bereitstellen einer ersten Reaktionsmischung, die umfaßt:

(i) ein Polydesoxynukleotid;

(ii) einen Polydesoxynukleotidprimer, der zum Hybridiseren an einen Teil des Polydesoxynukleotids (i) fähig ist;

(iii) dATP, dGTP, dCTP, dTTP;

(iv) ddATP;

(v) eine DNA-Polymerase oder das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase;

(b) das Bereitstellen einer zweiten Reaktionsmischung, die abgesehen davon, daß

ddATP durch ddGTP ersetzt ist, mit der genannten ersten Reaktionsmischung gleich ist;

(c) das Bereitstellen einer dritten Reaktionsmischung, die abgesehen davon, daß ddATP durch ddCTP ersetzt ist, mit der genannten ersten Reaktionsmischung gleich ist;

(d) das Bereitstellen einer vierten Reaktionsmischung, die abgesehen davon, daß ddATP durch ddTTP ersetzt ist, mit der genannten ersten Reaktionsmischung gleich ist;

(e) das getrennte Inkubieren der genannten Reaktionsmischungen, um in jedem Fall den Polydesoxynukleotidprimer von seinem 3'-Ende her zu verlängern, um Polydesoxynukleotide mit unterschiedlichen Längen herzustellen, wobei die Anzahl an Nukleotiden in jedem dadurch neu synthetisierten Polynukleotid durch die Aufnahme eines Didesoxynukleotids in die wachsende Kette bestimmt wird;

(f) das Fraktionieren der Reaktionsmischungen (a) bis (d) durch Hindurchschicken durch eine Gelmatrix;

dadurch gekennzeichnet, daß:

der Polydesoxynukleotidprimer (ii) ein Polydesoxynukleotid wie in Anspruch 15 definiert ist, worin R oder A ein Fluorophor oder eine andere nicht-radioaktive nachweisbare Markierung ist und/oder jede genannte Reaktionsmischung ein Nukleosidderivat der Formel (I) enthält, wie in Anspruch 1 definiert, worin Z Triphosphat, X Wasserstoff und R oder A ein Fluorophor oder eine andere nichtradioaktive nachweisbare Markierung ist, wodurch das Fluorophor oder die andere nicht-radioaktive nachweisbare Markierung in jedes neu synthetisierte Polydesoxynukleotid eingebaut wird;

und dadurch, daß die relativen Positionen der neu synthetisierten, auf der Gelmatrix getrennten Polydesoxynukleotide durch das Bestimmen des Fluorophors oder der anderen nicht-radioaktiven nachweisbaren Markierung identifiziert werden, das/die vom neu synthetisierten Polydesoxynukleotid getragen wird, so daß es möglich wird, die DNA-Sequenz des ersten Polynukleotids zu klären.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin jedes neu synthetisierte Polydesoxynukleotid zumindest ein Fluorophor enthält, das durch Fluoreszenz bestimmt wird, die durch Bestrahlung mit einer Lichtquelle induziert wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß jede der Reaktionsmischungen (a) bis (d) ein verschiedenes Fluorophor mit anderen Emissionsmaxima oder eine verschiedene nicht-radioaktive nachweisbare Markierung enthält.