CN101801185A - 与控制可变剪接的核糖开关有关的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了与控制可变剪接的核糖开关有关的方法和组合物。

Description

与控制可变剪接的核糖开关有关的方法和组合物
相关申请的引用
本申请要求以2007年3月22日提交的美国临时申请No.60/919,433作为优先权基础。2007年3月22日提交的美国临时申请No.60/919,433的全部内容以援引的方式纳入本文。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在NIH授予的基金No.GM 068819的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本文公开的发明主要涉及基因表达领域，具体涉及基因表达调节领域。
背景技术
精确遗传控制是活体系统的一个基本特征，因为细胞必须通过改变基因表达模式来对多种生化信号和环境信号作出应答。大多数已知的遗传控制机制涉及到蛋白因子的使用，所述蛋白因子会感受到化学或物理刺激，然后通过与相关DNA或信使RNA序列选择性相互作用来调节基因表达。蛋白可采用复杂形状并行使使活体系统可准确地感受到它们的化学和物理环境的多种功能。对代谢物有应答的蛋白因子通常通过结合DNA以调节转录起始(如lac阻遏蛋白；Matthews，K.S.，and Nichols，J.C.，1998，Prog.Nucleic Acids Res.Mol.Biol.58，127-164)或通过结合RNA以控制转录终止(如PyrR蛋白；Switzer，R.L.，et al.，1999，Prog.Nucleic Acids Res.Mol.Biol.62，329-367)或翻译(如TRAP蛋白；Babitzke，P.，and Gollnick，P.，2001，J.Bacteriol.183，5795-5802)来发挥作用。蛋白因子通过多种机制如变构调节或翻译后修饰来应答于环境刺激，并擅长利用这些机制来作为高反应性遗传开关(如参见Ptashne，M.，and Gann，A.(2002).Genes and Signals.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
除了蛋白质因子广泛参与基因控制之外，还已知RNA也可在基因调节中有活跃的作用。最近的研究逐渐揭示出小的非编码RNA在选择性靶向和破坏mRNA从而导致基因表达的下调方面的重要作用(参见例如Hannon，GJ.2002，Nature 418，244-251和该文章的参考文献)。这种RNA干扰过程利用了短RNA通过Watson-Crick碱基互补而选择性识别目标mRNA靶标的能力，在该过程之后被结合的mRNA通过蛋白质的作用而被破坏。在这一系统中RNA为分子识别的理想媒介物，因为通过进化过程产生新的靶标特异性RNA因子要比产生具有新的高特异性RNA结合位点的蛋白质因子容易得多。
虽然蛋白质可以满足生物学对于酶、受体和结构功能的大部分需求，但是RNA也具有这些能力。例如，RNA具有足够的结构塑性，能形成多种具有很高的酶活力和精确的分子识别能力的核酶结构域(Cech&Golden，Building a catalytic active site using only RNA.In：TheRNA World R.F.Gesteland，T.R.Cech，J.F.Atkins，eds.，pp.321-350(1998)；Breaker，In vitro selection of catalyticpolynucleotides.Chem.Rev.97，371-390(1997))和受体结构域(Osborne&Ellington，Nucleic acid selection and the challengeof combinatorial chemistry.Chem.Rev.97，349-370(1997)；Hermann&Patel，Adaptive recognition by nucleic acid adapters.Science 287，820-825(2000))。此外，上述能力还可以组合产生可被效应物分子选择性调节的变构核酶(Soukup&Breaker，Engineeringprecision RNA molecular switches.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，3584-3589(1999)；Seetharaman et al.，Immobilized riboswitchesfor the analysis of complex chemical and biological mixtures.Nature Biotechnol.19，336-341(2001))。
可变剪接过程涉及mRNA前体上剪接位点的选择性使用。可变剪接使得可从单个基因产生多种蛋白，从而使得产生具有不同功能的蛋白。可变剪接事件可通过多种方式出现，包括外显子跳跃、相互排斥的外显子的使用以及5′和/或3′剪接位点的差异选择。对于许多基因来说(例如同源基因、癌基因、神经肽、细胞外基质蛋白和肌肉收缩蛋白)，可变剪接以发育或组织特异的方式调控。因此，可变剪接在基因表达中起到关键的作用。最近的研究已揭示出可变剪接在复杂生物体的表达策略中的重要性。
mRNA前体(mRNA precursor)(mRNA前体(pre-mRNA))的可变剪接在调控哺乳动物基因表达中起到重要作用。可变剪接的调节出现在多种谱系的细胞中，并且是大量基因的表达程序的一部分。最近，已经逐渐明确的是，可变剪接可控制蛋白同种形的产生，所述同种型有时具有完全不同的功能。在细胞转化方面具有不同性质且有时具有相对性质的癌基因和原癌基因蛋白同种型经由可变剪接产生。这类基因的实例见Makela，T.P.et al.1992，Science 256：373；Yen，J.et al.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：5077；Mumberg，D.et al.1991，Genes Dev.5：1212；Foulkes，N.S.andSassone-Corsi，P.1992，Cell 68：411。同时，可变剪接经常用于控制在程序性细胞死亡中涉及的蛋白的产生，所述蛋白例如Fas、Bcl-2、Bax和Ced-4(Jiang，Z.H.and Wu J.Y.，1999，Proc SocExp Biol Med 220：64)。mRNA前体的可变剪接可产生一种阻遏蛋白，而在不同条件下可从相同mRNA前体产生一种激活子(Black D.L.2000，Cell 103：367；Graveley，B.R.2001，Trends Genet.17：100)。本领域需要可以用于经核糖开关(riboswitch)调节可变剪接的方法和组合物。
发明内容
本文公开了一种可调节的基因表达构建体，所述构建体包含一个编码如下一种RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地连接于一个编码区的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的剪接，其中所述核糖开关和编码区是异源的。所述核糖开关可调节所述RNA的可变剪接。所述核糖开关可包含适体(aptamer)结构域和表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述RNA可进一步包含一个内含子，其中所述表达平台结构域在所述内含子中包含一个可变剪接点。所述RNA可进一步包含一个内含子，其中所述表达平台结构域在所述内含子的一端包含一个剪接点(即，5′剪接点或3′剪接点)。所述RNA可进一步包含一个内含子，其中所述表达平台结构域在所述内含子中包含分支位点。所述可变剪接点可在所述核糖开关被激活时具有活性。所述可变剪接点可在所述核糖开关未被激活时具有活性。所述核糖开关可由触发分子例如硫胺素焦磷酸(TPP)激活。所述核糖开关可以是一种TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活可变剪接。所述核糖开关可抑制可变剪接。所述核糖开关可改变RNA的剪接。所述RNA可具有分支结构(branched structure)。所述RNA可以是mRNA前体。控制剪接的适体区域可位于例如P4茎和P5茎。控制剪接的适体区域还可出现于例如环5。控制剪接的适体区域还可出现于例如茎P2。因此，表达平台结构域例如可与P4和P5序列、环5序列和/或P2序列相互作用。仅当触发分子未结合于上述适体结构域时，所述适体序列通常才可用于与所述表达平台结构域相互作用。例如，所述剪接位点和/或分支位点可位于相对于所述适体5′端-6至-24之间的位置。例如，所述剪接位点可接在序列GUA之后。
还公开了一种用于调节RNA剪接的方法，包括将包含核糖开关的构建体导入所述RNA，其中所述核糖开关能够调节RNA剪接。所述核糖开关可包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述核糖开关可在所述RNA的内含子内。所述核糖开关可由触发分子例如TPP激活。所述核糖开关可以是一种TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活可变剪接。所述核糖开关可抑制可变剪接。所述核糖开关可改变RNA的剪接。所述剪接可以非天然地发生。控制可变剪接的适体区域可出现于例如环5。控制可变剪接的适体区域可出现于例如茎P2。例如，所述剪接位点可位于相对于所述适体5′端-6至-24之间的位置。例如，所述剪接位点可在所述适体中的序列GUA之后。
还公开了一种抑制真菌生长的方法，所述方法包括：识别感染真菌的受试者；给与所述受试者有效量的抑制TPP-应答性核糖开关的化合物，从而抑制真菌生长。抑制真菌生长可包括真菌生物量减少10％或更多。
所公开的方法和组合物的其他优点一部分将在下文的描述中阐明，一部分可以从说明书中获知，或者可通过实施公开的方法和组合物而得知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求书中具体指明的要素和组合实现和获得。应当理解的是，上文的一般性描述和下文的具体描述都仅仅是示例性和解释性的，并不是对本发明要求保护范围的限制。
附图说明
附图包含于本说明书中并作为本说明书的一部分，附图阐述了所公开方法和组合物的一些实施方案，它与文字描述一起作为对所公开方法和组合物的原理的解释。
图1所示为三个粗糙脉孢菌(N.crassa)基因在5′内含子中携带TPP核糖开关。a，前体5′UTR(I-1)和NMT1 mRNA的可变剪接产物(I-2和I-3)。外显子和内含子分别为深灰色和无阴影/浅灰色矩形。示出了5′(GU)和3′(AG)剪接位点、推定的起始密码子(*)以及来自uORF和主NMT1 ORF的相应翻译产物。b和c，前体mRNAs的5′UTR以及它们的THI4和NCU01977.1的各剪接产物。d，对来自在不存在(-)或存在(+)30μM硫胺素条件下培养的粗糙脉孢菌mRNA 5′区的RT-PCR检测。THI4的带II-3a和II-3b表示保留(3a)或去除(3b)上游内含子的剪接形式II-3。标记DNA(M)以100个碱基对递增。
图2所示为NMT1 TPP核糖开关对可变剪接和基因的控制。a，在培养于无硫胺素的培养基中的粗糙脉孢菌培养物中添加30μM硫胺素(t＝0)之后，NMT1转录物剪接(RT-PCR产物)的变化。b，融合于萤光素酶(LUC)ORF上游的野生型(WT)或多种突变型NMT1核糖开关(M1至M10)的报告物构建体(SEQ ID NO：1和2)。c，上图：来自WT-LUC构建体(标准化RLU＝1)的相对光单位(RLU)与在不存在(实心圆)或存在(空心圆)30μM硫胺素条件下培养的多种突变型NMT1-LUC构建体之间的比较。值是3次独立的重复测定的平均值，标准差误差棒小于这些符号的直径。下图：对于每个转化体，对来自LUC融合物(上部分)和天然NMT1 RNA(下部分)的5′UTR进行的RT-PCR分析。详情在图1中描述。
图3所示为在未剪接的和可变剪接的mRNA中的短uORF可引起NMT1抑制。a，野生型和突变型构建体融合至LUC报告物以刺激未剪接的RNA(I-1R)和剪接的RNA(I-2R和I-3R)。b，(上图)培养基中不存在(-，实心柱)或存在(+，空心柱)30μM硫胺素时的LUC活性。表达相对于未添加硫胺素的野生型I-3R构建体的值标准化。值是3次独立的重复测定的平均值，并显示标准差误差棒。(下图)对于无(-)或有(+)硫胺素条件下培养的粗糙脉孢菌，对LUC融合物(上部分)和天然NMT1(下部分)转录物进行的RT-PCR分析。其他注释如在图2c的图注中描述。
图4所示为粗糙脉孢菌中TPP核糖开关介导的mRNA可变剪接的机制。a，在第二5′剪接位点附近TPP-诱导的结构调整。5′32P-标记的273NMT1 RNA(-78至195位核苷酸)的自发切割产物通过PAGE分离并定量，以显示结构中10μM TPP-介导的变化的定位。b，某些P4-P5核苷酸与TPP调节的第二5′剪接位点附近的核苷酸互补(SEQ ID NO：3-4)。c，核糖开关控制NMT1表达的机制，其中关键剪接决定子在适体不同的占位状态时被激活或者被抑制。
图5所示为3种细菌的和23种真菌的TPP核糖开关适体(SEQ ID NO：5-30)的序列比对结果。突出显示区对应于配对茎，所述配对茎由顶部的箭头图指示。
图6所示为来自粗糙脉孢菌的3种TPP核糖开关的前后序列。AUG代表主起始密码子；
Figure G2008800169099D00061
表示可变剪接起始密码子(不在主ORF中)；
Figure G2008800169099D00062
和
Figure G2008800169099D00063
表明5′剪接位点；且
Figure G2008800169099D00064
表明3′剪接位点。对于每个基因，加阴影的核苷酸标识内含子，内含子的加深阴影区域表示TPP适体(SEQ ID NO：31-33)。AG表示存在于数据库中的NCU01977.1的预测3′剪接位点，该位点基于测序剪接产物未被使用。UAG表示除非发生剪接否则将终止翻译的NCU01977.1中的终止密码子。
图7示出剪接中硫胺素依赖的变化需要TPP核糖开关。对来自培养于不存在(-)或存在(+)30μM硫胺素的基本培养基中的脉孢菌a，FREQUENCY(FRQ)和b，NMT1转录物的可变剪接5′区进行的RT-PCR分析。对每种mRNA进行2次重复描述。FRQ(a、b和c)的不同剪接形式——如以前报道——在硫胺素处理后相对于彼此之间无数目变化。使用引物5′-CATTGCAAAAACGGCATTGGA(SEQ ID NO：34)和5′-TGTGGGGACTTTTCATGATAC(SEQ ID NO：35)产生FRQ的RT-PCR产物。使用琼脂糖凝胶(2％)电泳分离产物。“M”表示包含以100个碱基对递增的DNA的分子大小标记物。DNA通过溴化乙锭染色和UV光照显示。
图8所示为TPP与NMT1 mRNA的结合。a，NMT1核糖开关适体(SEQID NO：36，代表115 NMT1适体)的序列、二级结构和TPP-诱导的调整。该模型改良自以前出现过的模型，以反映可用的原子分辨率的结构数据。构建体197 NMT1包括天然的P3茎(图9)，而该茎中第82位核苷酸在构建体115 NMT1中被删除。位点的结构调整通过对b中描述的115 NMT1的直读探测(in-line probing)确立。SEQ ID NO：36的核苷酸30、31、43、44、54、56、71和93呈现切割不变。SEQ ID NO：36的核苷酸13-16、22、27、49-53、55、63、65、69、77-81、86和87出现切割减少。SEQID NO：36的核苷酸62、64和88出现切割增加。b，115 NMT1的直读探测分析揭示TPP-诱导的RNA结构调整，其中位点1和2被用于定量分析c中的配体亲和力。泳道包括在无反应后(NR)、在以RNA酶T1部分消化后(T1)或者在以碱部分消化后(-OH)加样的前体RNA。进行U2G改变以有利于通过体外转录进行制备。c，该曲线描绘了标准化的RNA自发切割分数相对于b中描述位点1和2的TTP浓度对数变化。
图9所示为构建体197 NMT1的伸展P3茎的序列和直读探测结果。阴影的核苷酸代表在不存在和存在最多至1mM TPP(SEQ ID NO：37)下RNA中都发生自发分裂的位置。
图10示出了261 NMT1 RNA构建体的直读探测分析显示出在分支位点处的轻度结构改变。a，来自使用5′32P-标记261 NMT1 RNA(核苷酸11至270加另外的5′G以有利于体外转录)进行的直读探测测定法的自发RNA切割产物的PAGE分离。对带强度定量，以显示10μM TPP-介导的RNA结构改变的定位。另外的详情见图4和图8的图例。
图11所示为，在不存在TPP的情况下，273 NMT1野生型(WT)和M9 NMT1 RNA构建体的直读探测分析显示出在第二5′剪接位点处的差异。a，来自使用如所示的5′32P-标记的WT和M9 273 NMT1 RNA(核苷酸-78至195)进行的直读探测测定的自发RNA切割产物的PAGE分离。b，测定带的相对强度，以显示M9中由导入突变造成的相对于WT的结构改变。另外的详情见图8和图9的图例。注意到，M9的核苷酸-14、-13和-12呈现大量的自发切割，并且相对于WT构建体可以是非配对的，而WT构建体在不存在TPP的情况下仅核苷酸-13被预计是非配对的。
图12所示为第二5′剪接位点的侧翼区和来自多种真菌种的NMT1基因的TPP适体(SEQ ID NO：38-43和96-101)之间的可变碱基配对。a，来自粗糙脉孢菌的NMT1基因的图式表示。两个可变5′剪接位点、分支位点和3′剪接位点以相对于TPP适体和主ORF的位置示出。橙色阴影的核苷酸标识出在第二5’剪接位点侧翼的序列和所述适体中的同源区域之间可能的碱基配对。b-f，对于来自不同真菌种的NMT1基因，邻接适体和适体部分的推定5’剪接位点的周围区的互补序列。有可变碱基配对可能性的适体区域主要位于P4茎和P5茎的一侧，但在某些情形下还可扩展至环5和茎P2。推定的可变5’剪接位点位于相对于所述适体5’端-6和-24之间的位置。所标明的剪接位点的使用通过来自脉孢菌(见图1)和米曲霉(Aspergillus oryzae)(b，AB226284)的NMT1基因的转录数据确认。对于一些基因，在互补区中的共有序列“GUA”后出现了多个潜在5’剪接位点。
图13示出TPP核糖开关在粗糙脉孢菌NCU01977.1mRNA中的基因激活。在粗糙脉孢菌生长培养基中，在不存在或存在30μM硫胺素的条件下下的LUC活性(a)以及天然NCU01977.1和NMT1转录物的核糖开关区域的RT-PCR分析(b)。将粗糙脉孢菌以这样的构建体转化并在不存在硫胺素的条件下(-)过夜培养，即该构建体包含与LUC报告基因按阅读框融合的NCU01977.1包括起始密码子的5′部分。然后将真菌组织转移至无(0h)或有30μM硫胺素的新鲜培养基中，继续培养24h。在多个时间点从培养于不存在硫胺素(-)和添加硫胺素(+)后24h的培养物取样。LUC活性相对于t＝0h下的测量值标准化。对天然转录物进行RT-PCR分析。M表示以100bp递增的大小标记物，底部带代表100bp。在不加入硫胺素的情况下存在大量剪接产物III-2可表明，细胞在这些条件下会产生足够量的TPP，以最大程度地触发核糖开关-诱导的剪接。
图14示出了DNA引物的序列(SEQ ID NO：44-95)。
具体实施方式
通过参考对下文中包括的实施例和具体实施方案的具体描述，以及参考附图及其上下文的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。
信使RNA通常被认为是遗传信息的被动载体，它可在翻译过程中被蛋白调节因子或小RNA调节因子和核糖体作用。已发现某些mRNA带有天然适体结构域，并且特异性代谢物与这些RNA结构域的结合可导致基因表达的调节。天然核糖开关具有天然RNA通常不具有的两种特殊的功能。其一，mRNA元件可变为不同的结构状态，其中一种结构可作为其靶标代谢物的精确的结合袋。其二，由代谢物诱导的在结构状态之间的变构互变可导致通过几种不同机制之一的基因表达水平的改变。核糖开关通常可被划分为两个独立的结构域：一个选择性地结合靶标(适体结构域)，另一个影响基因控制(表达平台)。这两个结构域之间的动态相互作用导致对基因表达的依赖于代谢物的变构控制。
已识别了不同类别的核糖开关，这些不同类别的核糖开关表现出选择性地识别激活化合物(在本文中被称为触发分子)。例如，辅酶B12、甘氨酸、硫胺素焦磷酸(TPP)和黄素单核苷酸(FMN)激活存在于如下的基因中的核糖开关，所述基因编码这些化合物的代谢或转运途径中关键的酶。每一类核糖开关的适体结构域与高度保守的共有序列和结构相一致。因此，可使用序列同源性检索来识别相关的核糖开关结构域。已在细菌、古细菌和真核生物等多种生物中发现了核糖开关结构域。
已报道了在真细菌中可感受10种不同的代谢物的11种结构类的核糖开关(Mandal 2004；Winkler 2005；Breaker 2006；Fuchs 2006；Roth.A eubacterial riboswitch selective for the queuosineprecursor preQ1 contains an unusually small aptamer domain.Nat.Struct.Mol.Biol.(2007))，并且大量的其他类正在被表征。每种核糖开关的适体结构域可通过其甚至在亲缘关系远的生物之间仍保持高度保守的核苷酸序列(Rodionov 2002；Vitreschak 2002；Vitreschak 2003)和折叠结构(Nahvi 2004；Batey 2004；Serganov2004；Montange 2006；Thore 2006；Serganov 2006；Edwards 2006)进行区分。核糖开关通常包括一个对适体的代谢物结合应答时可调节基因表达的表达平台，但表达平台在序列、结构和控制机制上可广泛地不同。
适体异常的保守水平使得可使用生物信息学在不同生物中识别相似的核糖开关代表。现今，已经从所有3个生命域中识别了仅与TPP核糖开关适体共有序列一致的序列(Sudarsan 2003)。虽然从真菌(Sudarsan 2003；Galagan 2005)(图5)和植物预测的一些真核TPP适体已显示可结合TPP(Sudarsan 2003 Yamauchi)，但是代谢物结合通过何种机制控制基因表达是未知的。在真菌中，每个TPP适体均位于5′非翻译区(UTR)内含子或mRNA蛋白编码区中，这暗示mRNA剪接受代谢物结合的控制(Sudarsan 2003；Kubodera2003)。
A.核糖开关RNA的一般性结构
细菌核糖开关RNA是主要位于特定mRNA主编码区域的5’非翻译区(5’-UTR)的基因控制元件。结构性探查研究(下文将详述)发现核糖开关元件通常包括两个结构域：作为配体结合结构域的天然适体(T.Hermann，D.J.Patel，Science 2000，287，820；L.Gold，et al.，Annual Review of Biochemistry 1995，64，763)和与参与基因表达的RNA元件(例如Shine-Dalgarno(SD)元件；转录终止茎)相接的“表达平台”。上述结论是基于下述观察结果：体外合成的适体结构域在不存在表达平台的条件下与合适的配体相结合(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2、3和6)。此外，结构性探查研究表明，在独立检测的时候大多数核糖开关的适体结构域采用一种特定的二级和三级结构折叠，这基本上与存在完整的5’前导RNA时检测到的适体结构相同。这表明在许多情况下，适体结构域作为与独立于表达平台折叠的一个模块单元(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2、3和6)。
适体结构域的配体结合状态或未结合状态最终通过表达平台来反映，表达平台可以对基因表达产生影响。核糖开关作为一个模块元件的观点被以下事实进一步支持：适体结构域在多种生物之间是高度保守的(TPP核糖开关甚至在不同生物界之间都是保守的)(N.Sudarsan，et al.，RNA 2003，9，644)，而表达平台在序列、结构和控制附带开放阅读框表达的机制方面都有所变化。例如，配体结合到枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的tenA mRNA的TPP核糖开关上可导致转录终止(A.S.Mironov，et al.，cell 2002，111，747)。这种表达平台与大肠杆菌(E.coli)thiM mRNA的TPP核糖开关的表达平台在序列和结构上均不同，大肠杆菌thiMmRNA的TPP核糖开关与TPP结合时会通过SD阻断机制导致对翻译的抑制(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2)。这两种转录单位的TPP适体结构域很容易被识别，并且具有几乎相同的功能特征，但是基因控制机制和实现该机制的表达平台则相当不同。
核糖开关RNA的适体结构域通常长度为～70至170个核苷酸(美国专利申请公布文本No.2005-0053951的附图11)。这一结果有些出人意料，因为体外进化实验识别了多种结合小分子的适体，它们的长度相当短，并且结构复杂(T.Hermann，D.J.Patel，Science 2000，287，820；L.Gold，et al.，Annual Review of Biochemistry 1995，64，763；M.Famulok，Current Opinion in Structural Biology 1999，9，324)。虽然天然适体序列相对于人工适体在复杂性和信息含量上的显著增加的原因还需要进一步的确证，但是相信这种复杂性是形成具有高亲和力和高选择性功能的RNA受体所需要的。配体-核糖开关复合物的表观KD值从低纳摩尔量至低微摩尔量不等。还值得注意的是，当一些适体结构域与附带的表达平台相分离时，表现出比完整核糖开关更高的(～10至100倍)对靶配体的亲和力(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2)。可以推测，对由完整的核糖开关RNA所需的多种不同的RNA构象进行采样中有消耗能量，这一点通过配体亲和力的损失而反映出来。由于适体结构域必须作为分子开关，这可能提高了天然适体的功能性要求，这一点可能也有助于解释它们为什么有更复杂的结构。
B.TPP核糖开关
辅酶硫胺素焦磷酸(TPP)是维生素B1的活性形式，它是多种蛋白催化的反应中必需的参与者。来自所有3个生命域的生物(包括细菌、植物和真菌)使用感受TPP的核糖开关来控制负责输入或合成硫胺素及其磷酸化衍生物的基因，这就使得该类核糖开关成为分布最广的感受代谢物的RNA调节系统的成员。其结构显示一种折叠的RNA，其中一个亚结构域形成TPP的4-氨基-5-羟甲基-2-甲基嘧啶部分的嵌入袋，而另一个亚结构域形成这样的一个更宽袋，即该袋使用二价金属离子和水分子以使得桥式连接至所述配体的焦磷酸部分。这两个袋所处的位置可使其作为识别扩展构象的TPP的分子测量设备发挥功能。中央噻唑部分不被RNA识别，这可解释抗微生物化合物吡啶硫胺素焦磷酸为什么靶向该核糖开关并下调硫胺素代谢基因的表达。天然配体及其药物样类似物都可稳定由所述核糖开关控制的二级和三级结构元件，以调节mRNA编码蛋白的合成。此外，该结构可提供这样的认识，即折叠的RNA如何能形成与蛋白遗传因子形成的结合袋相当的精确结合袋。
在丝状真菌粗糙脉孢菌中检查了3种TPP核糖开关，发现通过控制mRNA剪接，一种TPP核糖开关激活基因表达，且另两种TPP核糖开关抑制基因表达。对于编码TTP代谢中涉及的蛋白的NMT1 mRNA前体，阐明了一种涉及核糖开关介导的碱基配对改变和可变剪接控制的详细机制(实施例1)。这些结果证明，真核细胞利用代谢物结合的RNA来调节对关键生物化学过程的控制重要的RNA剪接事件。TPP核糖开关还在美国专利申请公开文本No.US-2005-0053951中被详述，No.US-2005-0053951的全部内容以援引的方式纳入本文，还具体以援引的方式纳入它对TTP核糖开关结构、功能和用途的描述。被明确考虑的是，美国专利申请公开文本No.US-2005-0053951的任何主题和描述，特别是美国专利申请公开文本No.US-2005-0053951中对TTP核糖开关结构、功能和用途的任何描述均可以具体地被包括或者排除在本文公开的其他主题之外。
应理解，如不另外说明，公开的方法和组合物不限于特定合成方法、特定分析技术或具体试剂，因此可有所改变。还应理解本文所用的术语只是为了描述具体实施方案，而不意欲作出限制。
材料
本文公开了可用于所公开的方法和组合物、可与之联合使用、可用于其制备或作为其产品的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其他材料，应理解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、分组等时，虽然可能没有明确公开具体的这些化合物的各个体的和总体的组合以及排列的每一种，但每种都在本文中明确地考虑和描述。例如，如果公开和讨论了核糖开关或适体结构域并且讨论了对包括所述核糖开关或适体结构域的若干分子作出的若干修饰，那么除非特别作出相反的说明，否则每种核糖开关或适体结构域的组合和排列以及可能的修饰都会被具体考虑。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，还公开了一个组合分子的实例A-D，那么即使没有单独提到每种组合，每种组合也都被独立和综合地考虑了。因此，在此实例中，根据A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D的公开内容，A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F组合的每一个都被具体地考虑并应认为被公开。类似地，它们的任何子集或组合也被特别考虑和公开。因此，例如，根据A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D的公开内容，子集A-E、B-F和C-E被具体地考虑并应认为被公开。此概念适用于本申请所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法的步骤。因此，如果有多个可实施的其他步骤，应理解每个其他步骤都可与所公开方法的任何具体实施方案或实施方案组合一起实施，并且每个这种组合都被具体地考虑且应认为被公开。
A.核糖开关
核糖开关是作为待表达RNA分子的一部分并且与触发分子结合时会改变状态的表达控制元件。核糖开关一般可被分为两个独立结构域：一个选择性地与靶标结合(适体结构域)，而另一个影响基因控制(表达平台结构域)。这两个结构域之间的动态相互作用导致对基因表达的代谢物依赖的变构调控。公开了分离和重组的核糖开关、含有这种核糖开关的重组构建体、与这种核糖开关可操作地连接的异源序列以及包含这种核糖开关、核糖开关重组构建体和与异源序列可操作地连接的核糖开关的细胞和转基因生物体。例如，所述异源序列可为编码包含报告蛋白或肽在内的目的蛋白或肽的序列。优选的核糖开关是天然存在的核糖开关或衍生自于天然存在的核糖开关。例如，适体结构域可以是天然存在的核糖开关的适体结构域或衍生自于天然存在的核糖开关的适体结构域。所述核糖开关可以包括人工适体或者任选地排除人工适体。例如，人工适体包括经体外演化和/或体外选择设计或选择的适体。所述核糖开关可包含天然存在核糖开关的共有序列。多种核糖开关的共有序列记载于美国申请公开文本No.2005-0053951中，例如在图11中。
本文公开了一种可调节的基因表达构建体，所述构建体包含一个编码如下一种RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地连接于一个编码区的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的剪接，其中所述核糖开关和编码区是异源的。所述核糖开关可调节所述RNA的可变剪接。所述核糖开关可包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述RNA可进一步包含一个内含子，其中所述表达平台结构域在所述内含子中或者在所述内含子一端包含一个可变剪接点(即，5′剪接点或3′剪接点)。所述RNA可进一步包含一个内含子，其中所述表达平台结构域在所述内含子中包含分支位点。所述可变剪接点可在所述核糖开关被激活或未被激活时具有活性。所述核糖开关可由触发分子例如硫胺素焦磷酸(TPP)激活。所述核糖开关可以为TPP-应答性核糖开关。
所述核糖开关可改变RNA的剪接。例如，所述核糖开关的活化可允许或启动可变剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可变剪接；或者允许或启动剪接或主要剪接。再例如，失活的核糖开关或使所述核糖开关失活可允许或启动可变剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可变剪接；或者允许或启动剪接或主要剪接。通常，剪接调节的形式可通过所述核糖开关与剪接点的物理关系、可变剪接点和RNA分子的分支位点确定。例如，核糖开关的活化/失活一般涉及RNA中可变二级结构(例如碱基配对的茎)的形成和/或破坏，这种结构变化可用于阻碍或暴露功能性RNA序列。核糖开关的表达平台结构域一般包含这种功能性RNA序列。因此，例如，通过以以下方式在核糖开关的表达平台结构域中包含一个剪接点(spice junction)或一个分支位点，可以调节或影响所述RNA的剪接，所述方式即所述剪接点或分支位点在所述核糖开关被激活或失活时交替地被阻碍或被暴露，反之亦然。
核糖开关可激活或抑制剪接。“激活剪接”的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以使剪接发生。这可包括例如使任何剪接发生(例如相对于无剪接的单剪接)或者使可变剪接发生。与无核糖开关时发生的剪接事件的数目相比，这可使剪接增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或者更多。
“抑制剪接”的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以抑制剪接。这可包括例如阻止任何剪接发生或者减少剪接发生(例如无剪接和单剪接)，或者阻止或减少可变剪接的发生。与无核糖开关时发生的可变剪接事件的数目相比，这可使可变剪接减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
核糖开关可激活或抑制可变剪接。“激活可变剪接”的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以使可变剪接发生。与无核糖开关时发生的可变剪接事件的数目相比，这可使可变剪接增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或者更多。
“抑制可变剪接”的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以抑制可变剪接。与无核糖开关时发生的可变剪接事件的数目相比，这可使可变剪接减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
核糖开关可影响RNA编码的蛋白的表达。例如，对剪接或可变剪接的调节可影响待翻译RNA的能力、改变编码区或改变翻译起始或终止。例如，可变剪接可导致不存在于正常加工的转录物中的起始密码子或终止密码子(或二者)出现于加工的转录物中。再例如，可变剪接可导致从加工的转录物去除正常的起始密码子或终止密码子。一种用于核糖开关调节的剪接以调节RNA编码蛋白的表达的有效模式为，在RNA的5′非翻译区的内含子中导入一个核糖开关，并包括或利用所述内含子中的起始密码子，使得内含子中的所述起始密码子为所述可变剪接RNA中的第一起始密码子。另一种用于核糖开关调节的剪接以调节RNA编码蛋白的表达的有效模式为，在RNA的5′非翻译区的内含子中导入一个核糖开关，并包括或利用所述内含子中的短开放阅读框，使得所述阅读框首先出现在所述可变剪接RNA中。
RNA分子可具有分支结构。例如，在TPP核糖开关(实施例1)中，当TPP浓度低时，新转录的mRNA采用一种封闭第二5’剪接位点的结构，而是分支位点处于可剪接状态。从第一5’剪接位点剪接mRNA前体可的导致I-3型mRNA的产生及NMT1蛋白的表达。当TPP浓度高时，配体与TPP适体的结合可造成RNA折叠的变构改变，以增加所述第二5’剪接位点附近的结构柔性并且封闭所述分支位点附近的核苷酸。
控制剪接的适体区域可位于例如P4茎和P 5茎。控制可变剪接的适体区域还可出现于例如环5中及茎P2中。剪接位点可位于例如相对于适体的5’端-6至-24之间的位置。因此，例如，表达平台结构域可以与P4和P5序列、环5序列和/或P2序列相互作用。当触发分子未结合适体结构域的时候，这种适体序列通常可用于仅与表达平台结构域相互作用。所述剪接位点可接在序列GUA之后。实施例1详述了适体在核糖开关上的具体定位。
对于多种细菌核糖开关，代谢物结合可不涉及蛋白地改变位于适体下游的表达平台的折叠(Winkler et al.(2002)，Mironov et al.(2002)，Serganov et al.(2006))。为了在调节可变剪接的TPP核糖开关中评估这一点，进行试验以确定NMT1 TPP核糖开关的剪接调节是否是由于适体侧翼的不依赖于蛋白的结构调整。对NMT1 UTR构建体进行直读探测(Soukup&Breaker(1999))。有意思的是，添加TPP可造成分支位点的核苷酸的结构变得更为有序(图10)，并且在第二5’剪接位点产生更灵活的结构(图4a)。而且，已观察到适体P4和P5元件的12个核苷酸与第二5’剪接位点处大多数在不存在配体时在结构上退隐的核苷酸互补(图4b)。P4和P5元件是TPP焦磷酸部分的识别必需的，因此TPP结合和5’剪接位点封闭是互相排斥的(实施例1)。
所公开的核糖开关，包括其衍生形式和重组形式，通常可来自任何来源，包括天然存在的核糖开关和从头设计的核糖开关。任何这种核糖开关都可用于所公开方法或与之一起使用，条件是它们已被确定可调节可变剪接。然而，可定义不同类型的核糖开关，并且某些这类子类型可用于特殊方法或与之一起使用(一般如本文其他部分所述)。核糖开关类型包括例如天然存在的核糖开关、天然存在的核糖开关的衍生物和修饰形式、嵌合核糖开关和重组核糖开关。天然存在的核糖开关是具有天然存在的核糖开关序列的核糖开关。这种天然存在的核糖开关可以是天然存在的核糖开关即自然界中出现的核糖开关的分离或重组形式。即，所述核糖开关具有相同的一级结构但已被分离或在新的基因或核酸环境中被工程改造。嵌合核糖开关例如可由任何类别或类型或者特定类别或类型的核糖开关的一部分和相同类别或类型或者任何不同类别或类型的不同核糖开关的一部分构成；可由任何类别或类型或特定类别或类型的核糖开关的一部分和任何非核糖开关序列或组分构成。重组核糖开关是已被分离或在新的基因或核酸环境中被工程改造的核糖开关。
核糖开关可包含单个或多个适体结构域。包含多个适体结构域的核糖开关的适体结构域可表现出对触发分子的协同结合，也可不表现出对触发分子的协同结合(即所述适体不需表现协同结合)。对后一种情况，所述适体结构域可被称作独立结合物。含有多个适体的核糖开关可含有一个或多个表达平台结构域。例如，含有两个表现出对与其触发分子协同结合的适体结构域的核糖开关可连接至被所述两个适体结构域调控的单个表达平台结构域。含有多个适体的核糖开关可含有一个或多个通过接头连接的适体。当这种适体表现出与触发分子协同结合时，所述接头可为协同接头。
如果适体结构域具有介于x和x-1之间的希尔(Hill)系数n——其中x是用于分析协同结合的适体结构域数目(或所述适体结构域上结合位点的数目)，则它们可被认为表现出协同结合。因此，例如，如含有两个适体结构域的核糖开关(如甘氨酸应答性核糖开关)的希尔系数在2和1之间，则所述核糖开关可被认为表现出协同结合。应理解所用x值取决于进行协同结合分析的适体结构域的数目，而不一定是核糖开关中存在的适体结构域数目。这是合理的，因为核糖开关可含有多个适体结构域，但只有某些表现协同结合。
公开了含有异源适体结构域和表达平台结构域的嵌合核糖开关。即，嵌合核糖开关由一种来源的适体结构域和另一种来源的表达平台结构域构成。所述异源来源可来自例如不同的具体核糖开关、不同类型的核糖开关或不同类别的核糖开关。所述异源适体也可来自非核糖开关适体。所述异源表达平台也可来自非核糖开关来源。
经修饰的或衍生的核糖开关可使用体外选择和进化技术生产。通常，用于核糖开关的体外进化技术包括产生一系列变种核糖开关，其中核糖开关序列的一(几)部分发生改变而该核糖开关的其他部分保持不变。然后可对所述系列的变种核糖开关的激活、失活或阻断(或其他功能或结构标准)进行评估，符合目的标准的变种核糖开关被选用或进行进一步演化。对生成变种有用的基础核糖开关是本文公开的特定共有核糖开关(consensus riboswitch)。共有核糖开关可用于指出改变核糖开关的哪一(些)部分来进行体外选择和演化。
还公开了调节发生改变的被修饰核糖开关。核糖开关的调节可通过将一个适体结构域可操作地连接至所述核糖开关(其是一个嵌合核糖开关)的表达平台结构域而被改变。然后所述适体结构域可通过例如触发分子对所述适体结构域的作用来介导核糖开关的调节。适体结构域可以任何合适的方式与核糖开关的表达平台结构域可操作地连接，包括例如通过用新的适体结构域替换所述核糖开关正常或天然的适体结构域。通常，任何可激活、灭活或阻断适体结构域所来源的核糖开关的化合物或条件都可用于激活、灭活或阻断所述嵌合核糖开关。
还公开了失活的核糖开关。核糖开关可通过共价方式(通过例如使部分核糖开关交联或将化合物偶联到该核糖开关)改变所述核糖开关而被失活。通过这种方式的核糖开关失活是由于例如：防止核糖开关与触发分子结合的改变，防止核糖开关与触发分子结合时其状态发生变化的改变，或防止核糖开关在与触发分子结合时其表达平台结构域影响表达的改变。
还公开了生物传感器核糖开关。生物传感器核糖开关是在其关联触发分子(cognate trigger)存在的情况下产生可检测信号的工程改造的核糖开关。可用的生物传感器核糖开关可由阈水平或高于阈水平的触发分子触发。生物传感器核糖开关可被设计以在体内或体外应用。例如，可操作地连接至编码用作信号或参与产生信号的蛋白的报告RNA的生物传感器核糖开关，可通过对细胞或生物体进行工程改造使其包含编码所述核糖开关/报告RNA的核酸构建体从而在体内应用。体外应用生物传感器核糖开关的一个实例是包含构象依赖标签的核糖开关，所述标签的信号根据所述核糖开关的激活状态而变化。这种生物传感器核糖开关优选地使用取自或衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。生物传感器核糖开关可用于多种情况和平台。例如，生物传感器核糖开关可与固体支持物如盘、片、带和孔一起使用。
还公开了可识别新触发分子的经修饰的或衍生的核糖开关。识别新触发分子的新核糖开关和/或新适体可通过筛选得到、设计得到或从已知核糖开关衍生得到。这可通过例如以下的步骤实现：产生一系列核糖开关的适体变种，在目的化合物存在下评估所述变种核糖开关的激活情况，选择被激活的变种核糖开关(或者，例如被最大程度地或最具有选择性地激活的核糖开关)和重复这些步骤直到产生具有所需活性、特异性、活性和特异性的组合或其他性质的组合的变种核糖开关。
通常，通过设计或改变表达平台结构域中的被调控链使其与适体结构域的控制链互补，可使任何适体结构域适合与任何表达平台结构域一起使用。或者，可改变所述适体的序列和适体结构域的控制链，从而使所述控制链与表达平台中的具有重要功能的序列互补。
公开了包含异源核糖开关和编码区的RNA分子。即，这种RNA分子由来自一个来源的核糖开关和来自另一个来源的编码区构成。所述异源的源可来自例如，不同RNA分子、不同转录物、来自不同基因的RNA或转录物、来自不同细胞的RNA或转录物、来自不同生物体的RNA或转录物、来自不同物种的RNA或转录物、天然序列及人工或工程改造的序列、特定的核糖开关、不同类型的核糖开关或者不同类别的核糖开关。
本文公开的术语“编码区”是指编码氨基酸的核酸的任何区域。这可以包括包含密码子或密码子模板的核酸链，以及这种核酸链在双链的核酸分子情况下的互补序列。不是编码区的核酸区域可被称作非编码区。转录的信使RNA分子一般在5′端和3′端都包括非编码区。真核mRNA分子还可以包括内部非编码区，例如内含子。一些类型的RNA分子可不包括功能性编码区，例如tRNA和rRNA分子。
1.适体结构域
适体是可与特定化合物和特定类别的化合物选择性结合的核酸区段和结构。核糖开关具有在与触发分子结合时可导致该核糖开关的状态或结构发生改变的适体结构域。在功能性核糖开关中，当触发分子与适体结构域结合时，连接至所述适体结构域的表达平台结构域的状态或结构会发生改变。核糖开关的适体结构域可从任何来源获得，包括例如核糖开关的天然适体结构域，人工适体，经工程改造、选择、演化或衍生得到的适体或适体结构域。核糖开关中的适体的至少一部分通常可与相连的表达平台结构域的一部分例如通过形成茎结构发生相互作用。与触发分子结合时可形成或破坏这种茎结构。
多种天然核糖开关的共有适体结构域显示于美国申请公开文本No.2005-0053951的图11和本文他处。这些适体结构域(包括其中包含的所有直接变种)可用于核糖开关。共有序列和结构可明示序列和结构中的变异情况。明示的变异范围内的适体结构域在本文中称为直接变种。这些适体结构域可被修改以产生被修改的适体结构域或变种适体结构域。保守性修改包括使得碱基对中的核苷酸仍保持互补的碱基配对的核苷酸的任何改变。中度修改包括茎或环(其长度或长度范围被明示)的长度改变小于或等于明示长度范围的20％。在共有结构显示出特定长度的茎或环，或列出或示出长度范围的情况下，环和茎被认为是“明示的”。中度修改包括茎或环(其长度或长度范围未被明示)的长度改变小于或等于明示长度范围的40％。中度修改还包括适体结构域未明示部分的功能性变种。
公开的核糖开关的适体结构域也可作为适体用于任何其他目的和任何其他环境。例如，在结构变化会影响RNA的功能的情况下，适体可被用于控制核酶、其他分子开关和任何RNA分子。
2.表达平台结构域
表达平台结构域是核糖开关的一部分，其影响含有所述核糖开关的RNA分子的表达。表达平台结构域通常有至少一部分可与相连的适体结构域的一部分相互作用，如通过形成茎结构。与触发分子结合时可形成或破坏这种茎结构。通常情况下，所述茎结构要么就是表达调控结构，要么防止形成表达调控结构。表达调控结构是可允许、阻止、加强或抑制含有该结构的RNA分子的表达的结构。实例包括SD(Shine-Dalgarno)序列、起始密码子、转录终止子，以及稳定信号和加工信号，例如RNA剪接点和控制元件。对于剪接的调节，在表达平台结构域中将包括剪接点、可变剪接点和/或内含子的分支位点包括在内是有用的。这种平台表达结构域与核糖开关的适体结构域中的序列的相互作用可由所述表达平台结构域和所述适体结构域之间的互补序列介导。
B.触发分子
触发分子是可激活核糖开关的分子和化合物。这包括核糖开关的天然或正常的触发分子和其他可激活核糖开关的化合物。天然或正常触发分子是给定的天然核糖开关本来就有的触发分子，或者对于某些非天然核糖开关而言是这样的触发分子：该核糖开关针对该触发分子被设计或该核糖开关通过该触发分子被选择(正如在例如体外选择或体外进化技术中那样)。
C.化合物
还公开了可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物和含有这些化合物的组合物。核糖开关通过结合或去除触发分子来起到控制基因表达的作用。化合物可用于激活、灭活或阻断核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其他激活化合物)可用于激活核糖开关。触发分子以外的化合物通常可用于灭活或阻断核糖开关。核糖开关也可通过例如从所述核糖开关所在处除去触发分子而失活。核糖开关可通过例如与不激活该核糖开关的触发分子类似物结合而被阻断。
还公开了用于改变RNA分子或编码RNA分子的基因的表达的化合物，其中所述RNA分子包含核糖开关。这可通过使化合物与所述RNA分子接触来实现。核糖开关通过结合或去除触发分子来起到控制基因表达的作用。因此，将包含核糖开关的目的RNA分子置于激活、灭活或阻断所述核糖开关的条件下，可用于改变所述RNA的表达。表达可因例如转录被终止或核糖体与所述RNA的结合受到阻断而改变。与触发分子的结合可减少或阻止所述RNA分子的表达，或者可促进或增加所述RNA分子的表达，这取决于核糖开关的性质。还公开了用于调节RNA分子或编码RNA分子的基因的表达的化合物。还公开了通过激活、灭活或阻断核糖开关来调节含有所述核糖开关的天然存在的基因或RNA的表达的化合物。如果所述基因对含有它的细胞或生物体的存活是必需的，那么激活、灭活或阻断所述核糖开关可导致所述细胞或生物体的死亡、瘀滞或虚弱。
还公开了通过激活、失活或阻断核糖开关来调节经分离、工程改造或重组得到的含有所述核糖开关的基因或RNA的表达的化合物。由于本文公开的核糖开关可控制可变剪接，所以激活、灭活或阻断所述核糖开关可调节基因表达。核糖开关作为对这种调节的一级控制的一个优点是核糖开关触发分子可以是非抗原小分子。
还公开了识别可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物的方法。例如，激活核糖开关的化合物可通过使测试化合物与核糖开关相接触并评估所述核糖开关的激活情况来识别。如果所述核糖开关被激活，那么所述测试化合物就被识别为可激活所述核糖开关的化合物。可用任何合适的方式评估核糖开关的激活情况。例如，核糖开关可被连接至一个报告RNA，然后在存在和不存在所述测试化合物的情况下测量所述报告RNA的表达、表达水平或表达水平的变化。作为另一个实例，所述核糖开关可包括一个构象依赖标签，其信号根据所述核糖开关的激活状态而改变。这种核糖开关优选地使用取自或衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。可以看出，对核糖开关的激活情况进行评估使用或不使用对照测定或测量均可。识别灭活核糖开关的化合物的方法可按类似方式进行。对阻断核糖开关的化合物的识别可通过任何合适的方法来完成。例如，可在已知可激活或灭活核糖开关的化合物存在的情况下和在测试化合物存在的情况下进行评估所述核糖开关的激活或失活的测定。如果未观察到在所述测试化合物不存在的情况下可观察到的激活或失活，那么所述测试化合物被识别为阻断所述核糖开关被激活或灭活的化合物。
还公开了通过识别可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物和并所识别出的化合物而制得的化合物。这可以通过例如将本文其他部分公开的化合物识别方法与生产所识别出的化合物的方法结合使用而实现。例如，可通过下述方法制备化合物：使待测化合物和核糖开关相接触，评估核糖开关的激活，以及如果核糖开关被待测化合物激活，则制备该激活核糖开关的待测化合物作为所述化合物。
还公开了通过检测某种化合物对核糖开关的激活、灭活或阻断作用并生产该经检测的化合物而制得的化合物。这可以通过例如将本文其他部分公开的化合物激活、灭活或阻断评估方法与生产经检测的化合物的方法结合使用而实现。例如，可通过下述方法制备化合物：使待测化合物和核糖开关相接触，评估核糖开关的激活，以及如果核糖开关被待测化合物激活，则制备该激活核糖开关待测化合物作为所述化合物。检测化合物激活、灭活或阻断核糖开关的能力指的是对以前并不知道可否激活、灭活或阻断核糖开关的化合物的鉴定，以及对已知可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物的激活、灭活或阻断核糖开关的能力的评估。
还公开了用于激活核糖开关的具体化合物。可用于TPP应答性核糖开关的化合物包括具有下式的化合物：
Figure G2008800169099D00231
该化合物可结合TPP应答性核糖开关或其衍生物，其中R1带正电，其中R2和R3每一个均独立地为C、O或S，其中R4为CH3、NH2、OH、SH、H或不存在，其中R5为CH3、NH2、OH、SH或H，其中R6为C或N，并且其中每个
Figure G2008800169099D00241
独立地代表单键或双键。还考虑了在按上述定义的化合物中其中R1为磷酸根、二磷酸根或三磷酸根的情况。
在上述定义范围内的每一种化合物都意图在并应被认为是在本文中具体地公开。此外，在上述定义范围内可识别的每个亚群都意图在并应被认为是在本文中具体地公开。因此，特别考虑了任何化合物或化合物的亚群可具体包括在用途中或从用途中排除，或者包括在化合物列表中或从化合物列表中排除。例如，作为一种选择，如果有某一组化合物，其中每种化合物都符合上述定义但并不是TPP、TP或硫胺素，那么该组也是被考虑到的。作为另一个实例，如果有某一组化合物，其中每种化合物都符合上述定义而且能激活TPP应答性核糖开关，那么该组也是被考虑到的。硫胺素焦磷酸(TPP)是TPP-应答性核糖开关的触发分子，可激活TPP-应答性核糖开关。吡啶硫胺素焦磷酸可激活TPP-应答性核糖开关。吡啶硫胺素和吡啶硫胺素焦磷酸可独立地及具体地包括在本文公开的化合物、触发分子和方法中，或者从本文公开的化合物、触发分子和方法排除。硫胺素和硫胺素焦磷酸可独立地及具体地包括在本文公开的化合物、触发分子和方法中，或者从本文公开的化合物、触发分子和方法排除。
D.构建体、载体和表达系统
所公开的核糖开关可在任何合适的表达系统中使用。重组表达可以使用例如质粒等载体来有效实现。载体可包括与核糖开关编码序列可操作地连接的启动子和待表达的RNA(例如，编码蛋白的RNA)。载体还可包括转录和翻译所需的其他元件。本文所述的载体指的是包含外源DNA的任何载体。因此，载体是可将外源核酸不降解地转移至细胞中的媒介，它包括启动子，可在它转入的细胞中表达所述核酸。载体包括但不限于：质粒、病毒核酸、病毒、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体。可以生产多种适于携带核糖开关调节的构建体的原核和真核的表达载体。这类表达载体包括例如：pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC和酵母载体。载体可在例如各种体内和体外环境中使用。
病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经营养病毒(neuronal trophic virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis)和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。还可使用与上述病毒具有共同的使其适于用作载体的性质的任何病毒家族。由Verma(1985)描述的逆转录病毒载体包括鼠类马罗尼白血病病毒MMLV和表现MMLV作为载体所需性质的逆转录病毒。通常，病毒载体包括非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和壳体化必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当被基因工程改造用作载体时，通常要移除病毒的一个或多个早期基因，并将一个基因或基因/启动子盒插入到病毒基因组中代替被移除的病毒DNA。
“启动子”通常为位于与转录起始位点相对固定的位置发挥功能的一个或多个DNA序列。“启动子”包括与RNA聚合酶发生基本相互作用所需的核心元件和转录因子，还可包括上游元件和应答元件。
“增强子”通常指的是为位于与转录起始位点相对不固定的位置发挥功能的DNA序列，它可以在转录单位的5’(Laimins，1981)或3’(Lusky et al.，1983)。此外，增强子除了可以在编码序列本身之中(Osborne et al.，1984)，也可以在内含子中(Banerji et al.，1983)。它们的长度通常为10bp至300bp之间，并且以顺式方式发挥作用。增强子的功能是增加邻近的启动子的转录。增强子与启动子类似，也经常含有介导转录的调节的应答元件。增强子经常对表达的调节有决定性作用。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核细胞)中的表达载体还可包括可以影响mRNA表达的转录终止所必需的序列。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中以多腺苷酸化区段的形式被转录。3’非翻译区还包括转录终止位点。优选地，转录单位也包括多腺苷酸化区域。这一区域的一个优点是它增加了被转录的单位像mRNA一样被加工和转运的可能性。多腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴定和用途已经广为人知。优选地，在转基因构建体中使用同源的多腺苷酸化信号。
载体可包括编码标记物产物的核酸序列。使用这种标记物产物来确定基因是否被送递至细胞以及在送递后是否被表达。优选的标记物基因为编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因和绿色荧光蛋白。
在一些实施方案中，标记物可为筛选标记物。当这类筛选标记物被成功地转移至宿主细胞中时，如果将宿主细胞置于筛选压力下，则被转化的宿主细胞可以存活。目前广泛使用的有两类不同的筛选策略。第一类是基于细胞代谢，使用离开添加培养基就不能生长的突变细胞系。第二类为显性筛选，它指的是在任何细胞类型中都可使用而不必使用突变细胞系的筛选方案。这些方案通常使用抑制宿主细胞生长的药物。含有新基因的那些细胞可以表达使细胞具有药物抗性的蛋白质，从而可以在筛选中存活。这类显性筛选的实例中使用的药物有新霉素(Southern and Berg，1982)、霉酚酸(Mulligan and Berg，1980)或潮霉素(Sugden et al.，1985)。
可以使用遗传物质的直接转移来获得基因转移，所述遗传物质包括在质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体中，但不限于此，或者通过细胞或载体例如阳离子脂质体中的遗传物质的转移来获得基因转移。这类方法为本领域所熟知，并且可以很容易的使之适用于本文所述的方法。转移载体可为任何可将基因送递至细胞内的核苷酸构建体(例如质粒)，或者作为送递基因的总体策略的一部分，例如作为重组逆转录病毒或重组腺病毒的一部分(Ram et al.Cancer Res.53：83-88，(1993))。用于转染的合适手段包括病毒载体、化学转染子或物理-机械方法例如电穿孔和DNA的直接扩散，这些手段描述于例如，Wolff，J.A.，et al.，Science，247，1465-1468，(1990)；和Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)。
1.病毒载体
优选的病毒载体为腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经营养病毒、辛德毕斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。还优选的是与上述病毒具有共同的使其适于用作载体的性质的任何病毒家族。优选的逆转录病毒包括鼠类马罗尼白血病病毒MMLV和表现MMLV作为载体所需性质的逆转录病毒。逆转录病毒载体可以比其他载体病毒携带更大的基因载量，即携带转基因或标记物基因，因此是常用的载体。但是它们不能用于非增殖细胞。腺病毒载体相对稳定并易于操作、具有高滴度、可在气溶胶制剂中送递并可以转染非分裂细胞。Pox病毒载体较大并具有多个可插入基因的位点，它们对热稳定，可在室温下储存。优选的实施方案为经过基因工程改造的病毒载体，这样可以抑制宿主生物由病毒抗原引起的免疫反应。优选的这种类型的载体应携带白细胞介素8或10的编码区域。
病毒载体与大多数将基因导入细胞的化学或物理方法相比，具有更高的处理能力(导入基因的能力)。通常，病毒载体包括非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和壳体化必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当被基因工程改造用作载体时，通常要移除病毒的一个或多个早期基因，并将一个基因或基因/启动子盒插入到病毒基因组中代替被移除的病毒DNA。这种类型的构建体可以携带最多达约8kb的外源遗传物质。被移除的早期基因的必需功能通常由经过基因工程改造而反式表达早期基因的基因产物的细胞系提供。
i.逆转录病毒载体
逆转录病毒为属于逆转录病毒科的动物病毒，包括任何类型、亚科、属或向性。Verma，I.M.，Retroviral vectors for gene transfer.In Microbiology-1985，American Society for Microbiology，pp.229-232，Washington，(1985)总体描述了逆转录病毒载体，上述文献以援引的方式纳入本文。将逆转录病毒载体用于基因疗法的方法的实例描述于美国专利No.4,868,116和4,980,286；PCT申请WO90/02806和WO 89/07136；以及Mulligan，(Science 260：926-932(1993))等文献中，以上文献中的教导以援引的方式纳入本文。
逆转录病毒本质上是一个包装，它将核酸负载包裹在内。核酸负载携带有包装信号，这使得复制出的子代分子可以被有效地包装在包衣中。除了包装信号以外，还有许多复制和复制病毒的包装所需要的顺式作用分子。通常逆转录病毒基因组包括参与蛋白质衣壳形成的gag、pol和env基因。通常使用待转入靶细胞的外源DNA来替代gag、pol和env基因。逆转录病毒载体通常包括：用于掺入至包衣的包装信号，起动gag转录单位的信号序列，逆转录必需的元件(包括引物结合位点以结合逆转录的tRNA引物)，在DNA合成过程中引导RNA链转换的末端重复序列，作为DNA合成中第二链合成起始位点的富含嘌呤的序列5’至3’LTR，以及可使DNA状态的逆转录病毒插入到宿主基因组中的LTR末端附近的特异性序列。gag、pol和env基因的移除可以使得约8kb的外源序列被插入到病毒基因组中、被反转录以及在复制后被包装到新的逆转录病毒颗粒中。根据每种转录物的大小，上述核酸量足够送递一至多个基因。优选地，在插入物中与其他基因一起含有阳性或阴性的筛选标记物。
由于在大多数逆转录病毒载体中，复制机制和包装蛋白(gag、pol和env)已经被移除，通常通过将载体置于包装细胞系中来生产载体。包装细胞系为已被含有复制和包装机制但不含任何包装信号的逆转录病毒转染或转化的细胞系。当携带所选DNA的载体被转染到这些细胞系中时，包含目的基因的载体通过辅助细胞提供的顺式机制而被复制并包装到新的逆转录病毒颗粒中。而具有该机制的基因组因为没有必需的信号而不被包装。
ii.腺病毒载体
对于复制缺陷型腺病毒的构建，前人已有所描述(Berkner et al.，J.Virology 61：1213-1220(1987)；Massie et al.，mol.Cell.Biol.6：2872-2883(1986)；Haj-Ahmad et al.，J.Virology 51：261-21A(1986)；Davidson et al.，J.Virology 61：1226-1239(1987)；Zhang″Generation and identification of recombinant adenovirusby liposome-mediated transfection and PCR analysis″BioTechniques 15：868-872(1993))。使用这些病毒作为载体的优点是它们散播至其他细胞类型的程度是有限的，因为它们可以在初始感染的细胞中复制，但是它们不能形成新的感染性病毒颗粒。重组腺病毒在直接体内送递至下列组织时已表现出可获得很高的基因转移效率：气道上皮、肝细胞、血管内皮、CNS实质以及多种其他组织位点(Morsy，J.Clin.Invest.92：1580-1586(1993)；Kirshenbaum，J.Clin.Invest.92：381-387(1993)；Roessler，J.Clin.Invest.92：1085-1092(1993)；Moullier，Nature Genetics 4：154-159(1993)；La Salle，Science 259：988-990(1993)；Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267：25129-25134(1992)；Rich，Human Gene Therapy4：461-476(1993)；Zabner，Nature Genetics 6：75-83(1994)；Guzman，Circulation Research 73：1201-1207(1993)；Bout，HumanGene Therapy 5：3-10(1994)；Zabner，Cell 75：207-216(1993)；Caillaud，Eur.J.Neuroscience 5：1287-1291(1993)；和Ragot，J.Gen.Virology 74：501-507(1993))。重组腺病毒与野生型或复制缺陷型腺病毒一样，通过结合特异性细胞表面受体而完成基因转导，然后病毒通过受体介导的胞吞作用而内化(Chardonnet and Dales，Virology 40：462-477(1970)；Brown and Burlingham，J.Virology12：386-396(1973)；Svensson and Persson，J.Virology55：442-449(1985)；Seth，et al.，J.Virol.51：650-655(1984)；Seth，et al.，mol.Cell.Biol.4：1528-1533(1984)；Varga etal.，J.Virology 65：6061-6070(1991)；Wickham et al.，Cell73：309-319(1993))。
一种优选的病毒载体为基于移除了E1基因的腺病毒的载体，这些病毒在例如人类293细胞的细胞系中产生。在另一个优选的实施方案中，E1和E3基因都被从腺病毒基因组中移除。
另一类病毒载体是基于腺伴随病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是一种优选的载体，因为它可以感染许多种细胞类型，并且对人类没有致病性。AAV型载体可以转运4至5kb的基因，并且已知野生型AAV可以稳定地插入到第19号染色体上。具有这种位点特异性整合性质的载体为优选的。这种载体的一种特别优选的实施方案是由Avigen，San Francisco，CA生产的P4.1C载体，它可包含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、HSV-tk和/或标记物基因，例如编码绿色荧光蛋白GFP的基因。
在病毒和逆转录病毒中插入的基因经常含有启动子和/或增强子以辅助对所需基因产物的表达的控制。启动子通常为位于与转录起始位点相对固定的位置时可以发挥功能的一个或多个DNA序列。“启动子”包含与RNA聚合酶发生基本相互作用所需的核心元件和转录因子，还可包含上游元件和应答元件。
2.病毒启动子和增强子
控制哺乳动物宿主细胞中的载体转录的优选启动子可由各种来源获得，例如，诸如下列病毒的基因组：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，最优选巨细胞病毒；或者来源于异源哺乳动物启动子例如β肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子可以方便地以同样包括SV40病毒复制起始位点的SV40限制性片段的形式获得(Fiers et al.，Nature，273：113(1978))。人类巨细胞病毒的即时早期启动子可以方便地以HindIII E限制性片段的形式获得(Greenway，PJ.et al.，Gene 18：355-360(1982))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也在此有用。
“增强子”通常指的是为位于与转录起始位点相对不固定的位置发挥功能的DNA序列，它可以在转录单位的5’(Laimins，L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78：993(1981))或3’(Lusky，M.L.，etal.，Mol.Cell bio.3：1108(1983))。此外，增强子除了可以在编码序列本身之中(Osborne，T.F.，et al.，mol.Cell bio.4：1293(1984))，也可以在内含子中(Banerji，J.L.et al.，Cell 33：729(1983))。它们的长度通常为10bp至300bp之间，并且以顺式方式发挥作用。增强子的功能是增加邻近的启动子的转录。增强子还经常含有介导转录的调节的应答元件。增强子还经常含有介导转录的调节的应答元件。增强子经常对表达的调节有决定性作用。虽然许多来自哺乳动物基因的增强子的序列是已知的(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)，但是通常还是使用来自真核细胞病毒的增强子。优选的实例为：在复制起点下游(late side)的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点下游的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
启动子和/或增强子可以被能触发它们功能的光或特异性化学事件特异性地激活。可以用例如四环素和地塞米松等试剂来调节系统。也有一些方法通过暴露于例如γ辐照的辐照方法或烷基化化疗药物来增强病毒载体的基因表达。
优选地，启动子和/或增强子区域在所有真核细胞类型中都是有活性的。这种类型的一种优选的启动子为CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子为SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTF。
已显示所有的特异性调节元件都可被克隆和用于构建在特定细胞类型例如黑素瘤细胞中选择性表达的表达载体。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子已被用于在神经胶质来源的细胞中选择性表达基因。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核细胞)中的表达载体还可包含可以影响mRNA表达的转录终止所必需的序列。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中以多腺苷酸化区段的形式被转录。3’非翻译区还包括转录终止位点。优选地，转录单位也包括多腺苷酸化区域。这一区域的一个优点是它增加了被转录的单位像mRNA一样被加工和转运的可能性。多腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴定和用途已经广为人知。优选地，在转基因构建体中使用同源的多腺苷酸化信号。在转录单位的一个优选实施方案中，多腺苷酸化区域来自SV40早期多腺苷酸化信号，由大约400个碱基组成。还优选地，转录单位单独包括其他标准序列或包括其他标准序列和上述序列，改进构建体的表达或稳定性。
3.标记物
载体可包括编码标记物产物的核酸序列。使用这种标记物产物来确定基因是否被送递至细胞以及在送递后是否被表达。优选的标记物基因为编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因和绿色荧光蛋白。
在一些实施方案中，标记物可为筛选标记物。用于哺乳动物细胞的筛选标记物的实例为二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当这类筛选标记物被成功地转移至哺乳动物宿主细胞中时，如果将宿主细胞置于筛选压力下，则被转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。目前广泛使用的有两类不同的筛选策略。第一类是基于细胞代谢，使用离开添加培养基就不能生长的突变细胞系。两个实例为：CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞在不添加如胸苷或次黄嘌呤营养物的情况下就不能生长。由于这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径中必需的某些基因，因此除非在添加培养基中提供那种没有的核苷酸，否则细胞就不能存活。另一种补充培养基的方式是将完整的DHFR或TK基因导入缺乏相应基因的细胞中，由此改变它们的生长需求。未被DHFR或TK基因转化的细胞将不能在非添加培养基上生长。
第二类为显性筛选，它指的是在任何细胞类型中都可使用而不必使用突变细胞系的筛选方案。这些方案通常使用抑制宿主细胞生长的药物。那些细胞可以表达使细胞具有药物抗性的蛋白质，从而可以在筛选中存活。这类显性筛选的实例中使用的药物有新霉素(SouthernP.and Berg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982))、霉酚酸(Mulligan，R.C.and Berg，P.Science 209：1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.et al.，mol.Cell.Biol.5：410-413(1985))。这三个实例使用了真核控制下的细菌基因来分别赋予细胞对于合适的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他的还有新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
E.生物传感器核糖开关
还公开了生物传感器核糖开关。生物传感器核糖开关是经过基因工程改造的核糖开关，它们在存在它们的同种触发分子时产生可检出的信号。可用的生物传感器核糖开关可以在触发分子达到或超过阈值水平时被触发。生物传感器核糖开关可被设计为体内应用或体外应用。例如，与编码作为信号的蛋白质或参与产生信号的蛋白质的报告RNA可操作地连接的控制可变剪接的核糖开关可通过基因工程改造细胞或生物，使其含有编码该核糖开关的核酸构建体从而在体内应用。用于体外的生物传感器核糖开关的一个实例是包括构象依赖性标签的核糖开关，由该标签产生的信号随核糖开关的激活状态而变化。优选地，这种生物传感器核糖开关使用天然存在的核糖开关的适体结构域或由天然存在的核糖开关衍生的适体结构域。
F.报告蛋白和报告肽
为评估核糖开关或生物传感器核糖开关的激活，可以使用报告蛋白或报告肽。报告蛋白或报告肽可以由通过核糖开关调节其表达的RNA编码。实施例中描述了一些特异性报告蛋白的使用。报告蛋白和报告肽的使用已为人所熟知，并可以容易地适于与核糖开关一起使用。报告蛋白可为任意可检出的或产生可检出信号的蛋白质或肽。优选地，该蛋白质或肽的存在可以用标准技术(例如放射免疫测定、放射性标记、免疫测定、酶活性测定、吸附、荧光、发光和蛋白质印迹)检测。更优选地，即使在报告蛋白的水平比较低的情况下，仍然可以使用标准技术对其水平定量。可用的报告蛋白包括萤光素酶、绿色荧光蛋白以及它们的衍生物，例如北美萤火虫(Photinus pyralis)的萤火虫萤光素酶(FL)和海参(Renilla reniformis)的海参萤光素酶(RL)。
G.构象依赖性标签
构象依赖性标签指的是具有下述性质的所有标签：在标签所连接的分子或化合物(例如核糖开关)的形式或构象发生改变的基础上，该标签可以产生荧光强度或波长的变化。在使用探针和引物的情况下，使用的构象依赖性标签的实例包括：分子信标(molecularbeacon)、Amplifluors、FRET探针、可切割的FRET探针、TaqMan探针、蝎形引物(scorpion primer)、荧光三聚体寡聚物(fluorescenttriplex oligos)包括但不限于三聚体分子信标或三聚体FRET探针、荧光水溶性缀合聚合物、PNA探针和QPNA探针。这类标签——具体而言它们的功能原理——可适于与核糖开关一起使用。一些类型的构象依赖性标签综述于Schweitzer and Kingsmore，Curr.Opin.Biotech.12：21-27(2001)中。
茎淬灭标签是构象依赖性标签的一种形式，它是位于核酸上的荧光标签，这样当茎结构形成时淬灭部分会接近荧光标签以使得标签发出的荧光被淬灭。当茎结构被破坏时(例如当含有标签的核糖开关被激活时)，淬灭部分就不再接近荧光标签，荧光就会增强。这种效应的实例可见于分子信标、荧光三聚体寡聚物、三聚体分子信标、三聚体FRET探针和QPNA探针中，它们的操作原理也可适于与核糖开关一起使用。
茎激活标签是构象依赖性标签的一种形式，它是通过茎结构的形成可以增强或改变荧光的标签或标签对。茎激活标签可包括受体荧光标签和供体部分，当受体和供体相互接近时(当包括标签的核酸链形成茎结构时)，荧光共振能量由供体向受体的转移会使受体发荧光。茎激活标签通常为位于核酸分子(例如核糖开关)上的标签对，这样当核酸分子中形成茎结构时受体和供体就会相互接近。如果茎激活标签的供体部分本身就是荧光标签，那么当它不与受体接近时(也就是未形成茎结构时)它就会以荧光的形式释放能量(通常这种荧光的波长与受体荧光的波长不同)。当茎结构形成时，总体的效果是供体荧光减少和受体荧光增加。FRET探针为使用茎激活标签的一个实例，它的操作原理也可适于与核糖开关一起使用。
H.检测标签
为帮助对核糖开关的激活、失活或阻断进行检测和量化，或对核糖开关的激活、失活或阻断后产生的核酸或蛋白质的表达进行检测和量化，可以在检测探针或者检测分子中导入检测标签，或者在表达的核酸或蛋白质中直接导入检测标签。本文中所述的检测标签为可以与核酸或蛋白质直接或间接地相连接、并由此直接或间接地产生可以测量的可检测信号的任何分子。许多这种标签均为本领域技术人员所已知。可用于所公开方法的合适的检测标签的实例为放射性同位素、荧光分子、磷光分子、酶、抗体和配体。
合适的荧光标签的实例包括异硫氰酸荧光素(FITC)、5，6-羧甲基荧光素、德克萨斯红(Texas red)、硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹酰氯、罗丹明、氨基甲基香豆素(AMCA)、曙红、藻红、
Figure G2008800169099D00341
Cascade
Figure G2008800169099D00342
Oregon芘、丽丝胺(lissamine)、加氧杂蒽(xanthenes)、吖啶、噁嗪、藻红蛋白、镧系金属离子的大环螯合物例如量子染料TM、荧光能量转移染料例如噻唑橙乙啡啶异源二聚体、以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其他特异性荧光标签的实例包括3-羟基芘5，8，10-三磺酸、5-羟色胺(5-HT)、酸性品红、茜素络合酮、茜素红、别藻蓝蛋白、氨基香豆素、蒽基硬脂酸、阿斯屈拉崇(Astrazon)亮红4G、阿斯屈拉崇橙R、阿斯屈拉崇红6B、阿斯屈拉崇黄7GLL、阿的平(Atabrine)、金胺(Auramine)、Aurophosphine、Aurophosphine G、BAO 9(双氨基苯基噁二唑)、BCECF、硫酸小檗碱、双苯酰胺、布兰科福尔(Blancophor)FFG溶液、Blancophor SV、Bodipy Fl、亮磺基黄素FF(Brilliant Sulphoflavin FF)、钙黄绿素蓝(Calcien Blue)、钙绿(Calcium Green)、卡尔科弗卢尔(Calcofluor)RW溶液、卡尔科弗卢尔白(Calcofluor White)、尔科弗卢尔白ABT溶液、尔科弗卢尔白标准溶液、Carbostyryl、Cascade Yellow、儿茶酚胺、奎纳克林(Chinacrine)、科里膦O、香豆素-鬼笔环肽、CY3.18、CY5.18、CY7、Dans(1-二甲基氨基-萘-5-磺酸)、Dansa(二氨基萘磺酸)、丹酰NH-CH3，二氨基苯基噁二唑(DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二吡咯亚甲基二氟化硼、联苯亮黄素7GFF、多巴胺、藻红ITC、吖啶橙(Euchrysin)、FIF(甲醛诱导荧光)、Flazo Orange、Fluo 3、荧光胺、Fura-2、Genacryl亮红B、Genacryl亮黄10GF、Genacryl粉红3G、Genacryl黄5GF、Gloxalic Acid、粒状蓝(Granular Blue)、血卟啉(Haematoporphyrin)、Indo-1、Intrawhite Cf液体、雷可福(Leucophor)PAF、雷可福SF、雷可福WS、丽丝胺罗丹明B200(RD200)、萤黄CH(LuciferYellow CH)、萤黄VS、苏丹红(MagdalaRed)、Marina Blue、麦西隆(Maxilon)亮黄素10GFF、麦西隆亮黄素8GFF、MPS(Methyl Green Pyronine Stilbene，甲基绿焦宁均二苯乙烯)、光神霉素、NBD胺、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)、去甲肾上腺素、核坚牢红(Nuclear FastRed)、核黄(Nuclear Yellow)、尼龙山(Nylosan)亮黄素E8G、噁二唑、Pacific蓝、碱性副品红(Feulgen)、Phorwite AR溶液、Phorwite BKL、Phorwite Rev、Phorwite RPA、膦3R、酞菁(Phthalocyanine)、藻红蛋白R、Polyazaindacene PontochromeBlue Black、卟啉、Primuline、普施安黄(Procion Yellow)、焦宁(Pyronine)、焦宁B、Pyrozal亮黄素7GF、芥奎吖因(QuinacrineMustard)、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B 200、罗丹明B Extra、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明WT、5-羟色胺、塞夫隆(Sevron)亮红2B、塞夫隆亮红4G、塞夫隆亮红B、塞夫隆橙、塞夫隆黄L、SITS(Primuline)、SITS(均二苯乙烯异硫磺酸，Stilbene Isothiosulphonic acid)、均二苯乙烯、Snarf 1、磺基罗丹明B Can C、磺基罗丹明G Extra、四环素、噻嗪红R、硫黄素S、硫黄素TCN、硫黄素5、Thiolyte、Thiozol Orange、TinopolCBS、纯蓝(True Blue)、Ultralite、荧光素钠(Uranine)B、优微添(Uvitex)SFC、二甲苯橙(Xylene Orange)和XRITC。
可用的荧光标签为荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、罗丹明(5，6-四甲基罗丹明)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。这些荧光染料的最大吸收和发射波长分别为：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm；672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)、Cy7(755nm；778nm)，这使得它们可以同时被检测。荧光素染料的其他实例包括：6-羧基荧光素(6-FAM)、2’，4’，1，4，-四氯荧光素(TET)、2’，4’，5’，7’，1，4-六氯荧光素(HEX)、2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基罗丹明(JOE)、2’-氯-5’-氟-7’，8’-稠苯-1，4-二氯-6-羧基荧光素(NED)和2’-氯-7’-苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)。荧光标签可由各种来源商购获得，包括Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；Molecular Probes，Eugene，OR；和ResearchOrganics，Cleveland，Ohio。
所关注的其他标签包括那些仅当它们所连接的探针与靶分子特异性结合时产生信号的标签，其中这类标签包括Tyagi&Kramer，Nature Biotechnology(1996)14：303和EP 0 070 685 B1中所述的“分子信标”。所关注的其他标签包括美国专利No.5,563,037、国际申请WO 97/17471和WO 97/17076中所述的那些标签。
被标记的核苷酸是检测标签的一种可用形式，可以在合成过程中直接导入被表达的核酸中。可以直接导入核酸中的检测标签的实例包括核苷酸类似物例如BrdUrd(5-溴脱氧尿苷，Hoy and Schimke，Mutation Research 290：217-230(1993))、氨基烯丙基脱氧尿苷(Henegariu et al：，Nature Biotechnology 18：345-348(2000))、5-甲基胞嘧啶(Sano et al.，Biochim.Biophys.Acta 951：157-165(1988))、溴尿核苷(Wansick et al，J.Cell Biology 122：283-293(1993))和经生物素修饰的核苷酸(Langer et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6633(1981))或经过例如地高辛抗原(digoxygenin)的合适的半抗原修饰的核苷酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205：359-364(1992))。合适的荧光标记的核苷酸有：异硫氰酸荧光素-dUTP、花青-3-dUTP和花青-5-dUTP(Yu et al，Nucleic Acids Res.，22：3226-3232(1994))。对于DNA而言优选的核苷酸类似物检测标签为BrdUrd(溴脱氧尿苷、BrdUrd、BrdU、BUdR，Sigma-Aldrich Co)。其他用于将检测标签导入DNA的可用的核苷酸类似物为AA-dUTP(氨基烯丙基脱氧尿苷三磷酸，Sigma-Aldrich Co.)和5-甲基-dCTP(Roche Molecular Biochemicals)。一种用于将检测标签导入RNA的可用的核苷酸类似物为生物素-16-UTP(生物素-16-尿苷-5’-三磷酸，Roche Molecular Biochemicals)。可将荧光素Cy3和Cy5连接至dUTP上用于直接标记。Cy3.5和Cy7可以以抗生物素蛋白或抗地高辛抗原缀合物的形式用于带有生物素或地高辛抗原标签的探针的二级检测。
被导入核酸的例如生物素的检测标签，随后可以使用本领域公知的灵敏方法进行检测。例如，使用链亲和素-碱性磷酸酶缀合物(Tropix，Inc.)可以检测生物素，这种缀合物可以与生物素结合并随后通过适当底物的化学发光进行检测(例如，化学发光底物CSPD：3-(4-甲氧基螺-[1，2，-二环氧丙烷-3-2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠(disodium，3-(4-methoxyspiro-[1，2，-dioxetane-3-2’-(5’-chloro)tricyclo[3.3.1.13，7]decane]-4-yl)phenyl phosphate)；Tropix，Inc.)。标签也可以是可检测的酶，例如碱性磷酸酶、大豆过氧化物酶、辣根过氧化物酶和聚合酶，检测例如使用化学信号放大法或使用能发光的酶的底物(例如化学发光的1，2-二环氧丙烷底物)或能产生荧光信号的酶的底物。
结合了两个或多个上述检测标签的分子也可被认为是检测标签。任何已知的检测标签都可与本发明公开的探针、标签、分子和方法一起使用，以便标记和检测本发明公开方法所产生的激活的或失活的核糖开关或核酸或蛋白质。用于检测和测量检测标签产生的信号的方法也是本领域技术人员已知的。例如，可以通过闪烁计数或直接显示法来检测放射性同位素；可用荧光分光光度计来检测荧光分子；可用分光光度计或直接照相显示的方法检测磷光分子；可通过检测或可视化酶促反应的产物来检测酶。可通过检测与抗体偶联的二级检测标签来检测抗体。本文所述的检测分子为偶联了一个或多个检测标签的与待测化合物或组合物相互作用的分子。
I.序列相似性
应当理解的是，本文所使用的术语同源性和同一性的含义是相同的，都是指相似性。因此，例如，如果在两个序列(例如非天然序列)之间使用同源性这一词语，应当理解这并不一定是指着两个序列之间的进化关系，而是着眼于它们的核酸序列之间的相似性或关联性。为了测量序列的相似性，确定两个进化上相关的分子之间相似性的很多方法都可以常规地应用于两个或多个核酸或蛋白质，而无需考虑它们在进化上是否相关。
总体而言，应当理解的是，为了定义本文所公开的核糖开关、适体、表达平台、基因和蛋白质的已知变体和衍生物或可能出现的种类，一种方法是通过定义变体和衍生物与特定已知序列的同源性。本文公开的具体序列的这种同一性在本文其他部分也有所讨论。总体而言，本文所公开的核糖开关、适体、表达平台、基因和蛋白质的变体与指定序列或天然序列通常有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。本领域技术人员很容易明白如何测定两种蛋白质或核酸(例如基因)之间的同源性。例如，可以在序列比对并使同源性达到最高水平后计算同源性。
计算同源性的另一种方法可以通过公开的算法进行。可使用下列算法进行用于比较的序列优化比对：Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)中所述的局部同源性算法；Needleman andWunsch，J.MoL Biol.48：443(1970)中所述的同源性比对算法；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988)中所述的相似性检索方法；或者这些算法的计算机实现形式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或者通过审查的方式进行。
通过例如Zuker，M.Science 244：48-52，1989；Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710，1989；Jaeger et al.Methods Enzymol.183：281-306，1989中公开的算法，可以获得核酸的相同类型的同源性，上述文献中至少与核酸比对有关的素材以援引的方式纳入本文。应当理解的是，通常可以使用任何方法，而在某些情况下这些不同的方法所得到的结果可能不同，但是本领域技术人员能够理解，如果使用上述方法中的至少一种发现了同一性，则该序列可被称为具有指定的同一性。
例如，如本文所使用的，所述的具有与另一序列相比的特定百分比同源性的序列，是指具有由上述任意一种或多种计算方法所计算出的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker计算方法，第一序列被计算为与第二序列具有80％的同源性，即使按照其他任何计算方法都计算出该第一序列与第二序列不具有80％的同源性，那么，如本文所定义的，第一序列与第二序列仍具有80％的同源性。另一个实例，如果使用Zuker计算方法和Pearson和Lipman计算方法，第一序列被计算为与第二序列具有80％的同源性，即使通过Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或任意其他计算方法计算，第一序列与第二序列不具有80％的同源性，那么，如本文所定义的，第一序列与第二序列仍具有80％的同源性。再一个实例，如果使用每一种计算方法，第一序列都被计算为与第二序列具有80％的同源性(尽管实际上不同的计算方法常得到不同的计算的同源性百分比)，那么如本文所定义的，第一序列与第二序列具有80％的同源性。
J.杂交和选择性杂交
术语杂交通常意为至少两种核酸分子例如引物或探针与核糖开关或基因间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用意为：以核苷酸特异性的方式发生于两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物间的相互作用。例如G与C相互作用或者A与T相互作用即为序列驱动的相互作用。通常序列驱动的相互作用发生于核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面。两种核酸的杂交受到本领域技术人员所知的许多条件和参数的影响。例如盐浓度、pH和反应温度均会影响两种核酸分子是否会杂交。
两种核酸分子间的选择性杂交的参数为本领域技术人员所熟知。例如，在一些实施方案中选择性杂交条件可被定义为严格杂交的条件。例如，杂交的严格性是通过杂交和/或洗涤步骤的温度和盐浓度共同控制的。例如实现选择性杂交的杂交条件可包括在比Tm(解链温度，在该温度下一半的分子与其杂交配对的另一部分解离)低大约12-25℃的温度下，在高离子强度溶液(6×SSC或6×SSPE)中杂交，然后在所选的温度和盐浓度的组合的条件下洗涤，此时洗涤温度为比Tm低大约5℃至20℃。在预实验中，可根据经验容易地确定温度和盐浓度条件，在该实验中使固定在滤膜上的参照DNA的样品与带标记的目的核酸杂交，然后在不同严格度的条件下洗涤。对于DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交而言杂交温度通常较高一些。可使用如上所述的或本领域已知的(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989；Kunkel et al.Methods Enzymol.1987：154：367，1987，上述文献中至少与核酸杂交相关的素材通过援引的方式纳入本文)条件以达到严格度。优选的DNA:DNA杂交的严格条件可以是在约68℃(水溶液中)，在6×SSC或6×SSPE中杂交，之后在68℃洗涤。如果需要，当所需的互补程度降低时，杂交和洗涤的严格性可作相应减小，并且还根据寻找可变性的任何区域中的G-C或A-T的丰富程度而定。同样，如果需要，当所需的同源性增大时，杂交和洗涤的严格性可作相应增加，并且还根据需要高同源性的任何区域中的G-C或A-T的丰富程度而定，所有这些均为本领域已知。
另一种定义选择性杂交的方法是通过着眼于一种核酸与另一核酸结合的量(百分比)。例如，在一些实施方案中选择性杂交的条件可以为至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的限量核酸与非限量核酸结合时的条件。通常非限量核酸要过量例如10或100或1000倍。这类测定可在限量核酸和非限量核酸均比它们的kd低例如10倍或100倍或1000倍时的条件下进行，或者只是一种核酸分子为比它的kd低例如10倍或100倍或1000倍时的条件下进行，或两种核酸分子之一或两者均在kd之上时的条件下进行。
另一种定义选择性杂交的方法是通过着眼于这样一种核酸的百分比，所述核酸是在需要杂交以促进所需的酶操作的条件下得到酶操作的核酸。例如，在一些实施方案中选择性杂交条件可以是至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的核酸在促进酶操作的条件下进行酶操作时的条件，例如，如果酶操作是DNA延伸，那么选择性杂交条件可以是至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的核酸分子被延伸时的条件。优选的条件还包括厂商所建议的或本领域所指出的适于酶进行操作的条件。
正如同源性一样，应当理解本文公开的用于确定两种核酸分子间的杂交水平的方法有许多种。应当理解这些方法和条件可提供两种核酸分子间的不同杂交百分比，但是除非另外指明，否则满足任何方法的参数都是足够的。例如，如果需要80％杂交并且只要在这些方法的任意一种中所要求的参数内发生杂交，就认为它在本文得到了公开。
应当理解，本领域技术人员知道，如果组合物或方法满足用于单独或联合确定杂交的这些标准的任意一条，那么它就是本文所公开的组合物或方法。
K.核酸
本文公开了基于核酸的多种分子，包括例如核糖开关、适体以及编码核糖开关和适体的核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物构成。本文讨论了这些分子及其他分子的非穷尽性实例。应当理解，例如当载体在细胞中表达时，表达的mRNA通常由A、C、G和U组成。同样，应当理解，如果核酸分子通过例如外源性送递被导入细胞或细胞环境中，那么核酸分子由核苷酸类似物构成是有利的，这样可减少核酸分子在细胞环境中的降解。
只要保留了它们相关的功能，核糖开关、适体、表达平台以及任何其他寡核苷酸和核酸都可以由经修饰的核苷酸(核苷酸类似物)构成或含有经修饰的核苷酸(核苷酸类似物)。很多经修饰的核苷酸是已知的，并可被用于寡核苷酸和核酸之中。核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸部分的一些类型的修饰的核苷酸。对碱基部分的修饰可以包括对A、C、G和T/U的天然性或合成性修饰，以及使用不同的嘌呤或嘧啶碱，例如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。经修饰的碱基包括但不限于：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基或其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基或其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤素尿嘧啶和5-卤素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；腺嘌呤和鸟嘌呤的8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基以及其他8-取代物；尿嘧啶和胞嘧啶的5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他的5-取代物；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他的碱基修饰物可见于例如美国专利No.3,687,808、Englisch et al.，AngewandteChemie，International Edition，1991，30，613、Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，第289-302页、Crooke，S.T.and Lebleu，B.ed.，CRC Press，1993。某些核苷酸类似物例如：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶可以增加双链体形成的稳定性。其他经修饰的碱基是那些有通用碱基功能的碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基可取代正常的碱基，但在碱基配对上没有偏好性。也就是说通用碱基可以与其他任何碱基进行碱基配对。碱基修饰经常可与例如糖修饰结合使用，例如2’-O-甲氧基乙基，以获得独特的属性例如提高的双链体稳定性。有多个美国专利具体描述了很多碱基修饰，例如4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617和5,681,941。以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于碱基修饰及其合成、使用和将其导入寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。
核苷酸类似物还可包括糖部分的修饰。对糖部分的修饰可包括核糖和脱氧核糖的天然性修饰及合成性修饰。糖修饰包括但不限于在2’位置的下列修饰：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)n-ONH2和-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m在1至大约10之间。
在2’位置的其他修饰包括但不限于：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2 CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、插入剂、可提高寡核苷酸药物动力学性质的基团或可提高寡核苷酸药效学性质的基团和其他具有类似性质的基团。还可以在糖的其他位置进行类似的修饰，特别是在3’端核苷酸上或2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位置，和在5’端核苷酸的5’位置。经修饰的糖可含有那些在环氧桥位置用例如CH2和S进行的修饰。核苷酸糖类似物还可具有糖模拟物，例如用环丁基部分代替五碳呋喃糖。有许多美国专利都教导了这类经修饰的糖结构的制备，例如4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于经修饰的糖结构及其合成、使用和将其导入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。
核苷酸类似物可以在磷酸部分加以修饰。经修饰的磷酸部分包括但不限于可经过修饰而使得在两个核苷酸之间的连接部分含有下列结构的磷酸部分，所述结构包括：硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；磷酸甲酯和其他磷酸烷基酯，包括磷酸3’-烯基酯和手性磷酸酯；次膦酸酯(phosphinate)；氨基磷酸酯，包括3’-氨基氨基磷酸酯(3’-amino phosphoramidate)和氨烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫代氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)和硼烷磷酸酯(boranophosphates)。应当理解的是，在两个核苷酸之间的这些磷酸连接或经修饰的磷酸连接可以通过3’-5’连接或2’-5’连接，连接可以包括极性的倒转，例如3’-5’至5’-3’或者2’-5’至5’-2’。还包括各种盐形式、混合盐形式和游离酸形式。许多美国专利教导了如何制备和使用含有经修饰磷酸的核苷酸，包括但不限于：3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于经修饰的磷酸及其合成、使用和将其导入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。
应当理解的是，核苷酸类似物仅需要包括一种修饰，但是也可以在一个部分或几个不同部分中包括多种修饰。
核苷酸替代物为与核苷酸具有类似功能特性但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物分子可以以Watson-Crick方式或Hoogsteen方式识别互补性核酸并与互补性核酸杂交(碱基配对)，但是它们通过非磷酸的部分连接起来。核苷酸替代物在与合适的靶核酸相互作用时能够形成双螺旋型结构。
核苷酸替代物为磷酸部分和/或糖部分被替换的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸替代物不包括标准的磷原子。磷酸的替代物可为例如：短链烷基或环烷基核苷间连接物、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连接物、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接物。这些连接物可包括具有下列结构的连接物：吗啉代连接物(形成核苷的糖部分的一部分)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基和硫甲酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他带有混合的N、O、S和CH2组成部分的连接物。许多美国专利公开了如何制备和使用这些种类的磷酸替换物，包括但不限于：5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于磷酸替换物及其合成、使用和将其导入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。
应当理解的是，在核苷酸替代物中核苷酸的糖部分和磷酸部分都可以被例如酰胺型连接物(氨基乙基甘氨酸)(PNA)所替换。美国专利5,539,082、5,714,331和5,719,262教导了如何制备和使用PNA分子，上述文献的每一篇都以援引的方式纳入本文。(还可参见Nielsen et al.，Science 254：1497-1500(1991))。
寡核苷酸和核酸可以由核苷酸构成，并可以由不同类型或相同类型的核苷酸构成。例如，在寡核苷酸中，一个或多个核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸的混合物；大约10％至约50％的核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸的混合物；大约50％或50％以上的核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸的混合物；或者全部核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-O-甲基核糖核苷酸的混合物。这类寡核苷酸和核酸可被称为嵌合寡核苷酸和嵌合核酸。
L.固体支持物
固体支持物为可连接分子(例如触发分子)和核糖开关(或其他由所公开的方法产生的或在所公开的方法中使用的组件)的固态基质或支持物，可以与支持物相连接。核糖开关和其他分子可以直接或间接地与固体支持物相连接。例如，分析物(例如触发分子，待测化合物)可以结合到固体支持物表面或与固定在固体支持物上的捕获试剂(例如结合分析物的化合物或分子)相连接。作为另一个实例，核糖开关可以结合到固体支持物表面或与固定在固体支持物上的探针相连接。多个核糖开关、探针或其他分子以阵列、网格或其他组织形式连接到固体支持物上构成阵列。
可用于固体支持物的固态基质可以包括可以与组件直接或间接连接的任何固体材料。这包括下述材料，例如丙烯酰胺、琼脂糖、纤维素、硝酸纤维素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、聚硅酸盐、聚碳酸酯、特氟隆(聚四氟乙烯树脂)，碳氟化合物、尼龙、硅橡胶、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚丙基延胡索酸盐(polypropylfumerate)、胶原、糖胺聚糖和聚氨基酸。固态基质可为任何可用的形式，包括薄膜、膜、瓶、盘、纤维、编织纤维、成型聚合物、颗粒、珠粒、微颗粒或它们的组合。固态基质和固体支持物可为有孔的和无孔的。芯片是一小片长方形或正方形的材料。优选的固态基质的形式为薄膜、珠粒或芯片。一种可用于固态基质的形式是微量滴定板。在一些实施方案中，可以使用多孔载玻片。
阵列可包括多个固定于固体支持物的确定位置或预定位置的核糖开关、触发分子、其他分子、化合物或探针。固体支持物上的每个预定位置通常具有一种类型的组件(即在该位置的所有组件都是相同的)。或者，在固体支持物上的同一预定位置可以固定化多种类型的组件。每一位置可以具有给定组件的多个拷贝。在固体支持物上的不同组件的空间隔离使得可以进行分别的检测和识别。
固体支持物为一个单独的单位或结构虽然是有用的，但不是必需的。一系列的核糖开关、触发分子、其他分子、化合物和/或探针可以分布于任意数目的固体支持物上。例如，一种极端的情况是每一个组件可被固定于分离的反应管或容器中，或在分离的珠粒或微颗粒上。
将寡核苷酸固定化于固态基质的方法已很成熟。可使用已知的偶联方法将包括定位探针(address probe)和检测探针的寡核苷酸偶联至基质上。例如，合适的附着方法描述于Pease et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(11)：5022-5026(1994)和Khrapko et al.，MolBiol(Mosk)(USSR)25：718-730(1991)。一种将3’-胺寡核苷酸固定于酪蛋白包被的载玻片上的方法描述于Stimpson et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6379-6383(1995)。一种将寡核苷酸附着于固态基质上的可用的方法描述于Guo et al，Nucleic Acids Res.22：5456-5465(1994)。
固定于固体支持物上的每一组件(例如，核糖开关、触发分子或其他分子)可以位于固体支持物的不同预定区域。不同的位置可以是不同的反应室。每一不同的预定区域可以与其他不同的预定区域在物理上彼此分离。固体支持物上的不同预定区域之间的距离可以是固定的，也可以是可变的。例如，在阵列中每一组件可以彼此之间以固定距离排列，而与珠粒相连接的组件就不会有固定的空间关系。特别地，多个固体支持物单位(例如多个珠粒)的使用方式会导致不同的距离。
组件可以以任何密度连接于或固定于固体支持物上。组件固定于固体支持物上的密度可以超过每立方厘米400个不同组件。组件的阵列可以有任何数目的组件。例如，阵列可以具有至少1,000个固定于固体支持物的不同组件、至少10,000个固定于固体支持物的不同组件、至少100,000个固定于固体支持物的不同组件或至少1,000,000个固定于固体支持物的不同组件.
M.试剂盒
上文所述的材料和其他材料可以以任意合适的组合被包装在一起，作为用于进行或辅助进行所公开方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组件被设计和调整为在所公开的方法中一起使用则是有用的。例如公开了用于检测化合物的试剂盒，该试剂盒包括一种或多种生物传感器核糖开关。该试剂盒还可包括检测核糖开关的激活的试剂和标签。
N.混合物
公开了通过实施或准备实施所公开方法而形成的混合物。例如，公开了包括核糖开关和触发分子的混合物。
不论何时，只要方法包括使组合物或组件或试剂混合或相接触，实行该方法就会产生多种不同的混合物。例如，如果方法包括3个混合步骤，如果各步骤分别进行，则在上述步骤的每一步之后都会形成一种特有的混合物。此外，不论各步骤如何进行，在所有步骤完成之后也会形成一种混合物。本发明的公开内容考虑了由实施所公开方法所获得的这些混合物，以及含有例如本文所公开的试剂、组合物或组件的混合物。
O.系统
公开了用于实施或辅助实施所公开方法的系统。系统通常包括制造的物品的组合例如结构、机械、装置等，以及组合物、化合物、材料等。这些组合为已公开的或从公开的内容可以显而易见，这些组合均被考虑。例如，公开了和考虑了包括生物传感器核糖开关、固体支持物和信号读取装置的系统。
P.数据结构和计算机控制
公开了所公开方法中使用的、由所公开方法产生的或从所公开方法中产生的数据结构。数据结构通常为在组合物或介质中采集、编组、储存和/或体现的任何形式的数据、信息和/或对象。以例如RAM或存储磁盘的电子形式储存的核糖开关的结构和激活测量结果就是一种类型的数据结构。
所公开的方法或其任意部分或由该方法制备的制品，都可以通过计算机控制来进行控制、管理或辅助。这类计算机控制可以通过计算机控制过程或方法来实现，可以使用和/或产生数据结构，并可以使用计算机程序。这类计算机控制、计算机控制的过程、数据结构和计算机程序都被考虑到并应理解为在本文中被公开。
方法
本文公开了用于调节RNA剪接的方法，包括将包含一种核糖开关的构建体导入所述RNA，其中所述核糖开关能够调节RNA的剪接。例如，所述核糖开关能够调节可变剪接。所述核糖开关可包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述核糖开关可在所述RNA的内含子内。所述核糖开关可由触发分子例如TPP激活。所述核糖开关可以是一种TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活可变剪接。所述核糖开关可抑制可变剪接。所述剪接可以非天然地发生。控制可变剪接的适体区域可出现于例如环5。控制可变剪接的适体区域可出现于例如茎P2。所述剪接位点例如可位于相对于所述适体5′端-6至-24之间的位置。所述剪接位点例如可接在所述适体的序列GUA之后。
“调节RNA剪接”是指核糖开关可控制RNA剪接，从而造成不同mRNA分子的形成，以及可能的(但不总是)不同蛋白的形成。例如，所述核糖开关可以调节可变剪接。
进一步公开了用于激活、灭活或阻断调节RNA剪接的核糖开关的方法。这类方法可包括例如使核糖开关和可激活、灭活或阻断该核糖开关的化合物或触发分子相接触。核糖开关通过触发分子的结合或移除来发挥控制基因表达的功能。化合物可用于激活、灭活或阻断核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其他的激活化合物)可被用于激活核糖开关。通常可使用除触发分子以外的化合物来灭活或阻断核糖开关(例如TPP)。还可以通过例如从核糖开关所在处移除触发分子来灭活核糖开关。因此，所公开的灭活核糖开关的方法可以包括例如移除核糖开关所在处的或与核糖开关接触的触发分子(或其他激活化合物)。可以例如通过不激活核糖开关的触发分子类似物的结合来阻断核糖开关。
还公开了通过使一化合物与RNA分子相接触来改变该RNA分子或编码该RNA分子的基因的表达的方法，其中所述RNA分子包括调节剪接的核糖开关。例如，所述核糖开关可调节所述RNA分子的可变剪接。核糖开关通过结合或者去除触发因子来发挥控制基因表达的功能。因此，将包含核糖开关的目的RNA分子置于激活、灭活或者阻断该核糖开关的条件下，可用于改变所述RNA的表达。表达可因例如转录被终止或核糖体与所述RNA的结合受到阻断而改变。与触发分子的结合可减少或防止所述RNA分子的表达，或者促进或者增加所述RNA分子的表达，这取决于核糖开关的性质及发生的可变剪接的类型。
还公开了通过激活、灭活或者阻断可调控剪接的核糖开关来调控含有所述核糖开关的天然存在的基因或RNA的表达的方法。例如，所述核糖开关可调节所述RNA的可变剪接。如果所述基因对于含有它的细胞或者生物体的生存是必需的，那么激活、灭活或阻断所述核糖开关会造成所述细胞或者生物体的死亡、瘀滞或虚弱。例如，激活微生物存活所必需的天然存在的基因中的天然存在的核糖开关会导致该微生物的死亡(如果所述核糖开关的激活控制可变剪接，可变剪接转而上调或下调关键蛋白)。这是使用所公开化合物和方法达到抗微生物或抗真菌效果的一个基础。具有这些抗微生物效果的化合物被认为具有抑菌、杀菌或杀真菌能力。
还公开了选择和识别可激活、灭活或阻断调节剪接的核糖开关的化合物的方法。例如，所述核糖开关可调节可变剪接。核糖开关的激活是指核糖开关结合触发分子时其状态的变化。核糖开关可由除触发分子以外的化合物并以不同于与触发分子结合的方式被激活。术语触发分子在本文中用来指可激活核糖开关的分子和化合物。这包括核糖开关的天然或正常的触发分子以及其他可以激活核糖开关的化合物。天然或正常的触发分子是给定的天然核糖开关本来就有的触发分子，或者对于某些非天然核糖开关而言是这样的触发分子：该核糖开关针对该触发分子被设计或该核糖开关通过该触发分子被选择(正如在例如体外选择或体外进化技术中那样)。不是天然的触发分子可被称为非天然触发分子。
还公开了一种抑制真菌生长的方法，所述方法包括：识别感染真菌的受试者；给与所述受试者有效量的抑制TPP-应答性核糖开关的化合物，从而抑制真菌生长。抑制真菌生长可包括真菌生物量减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
还公开了识别激活、失活或阻断调节剪接的核糖开关的化合物的方法。例如，激活核糖开关的化合物可通过以下途径识别：将测试化合物和核糖开关相接触，并且通过测量基因产物的可变剪接或测量作为剪接事件结果表达的蛋白差异水平评估所述核糖开关的激活情况。如果所述核糖开关被激活，则该测试化合物被识别为可激活核糖开关的化合物。核糖开关的激活可以任何合适的方式被评估。例如，核糖开关可被连接到一报告RNA上，并在存在或不存在所述测试化合物的情况下可测量所述报告RNA的表达、表达水平或表达水平的变化。再如，核糖开关可包含一个构象依赖标签，来自该构象依赖标签的信号随所述核糖开关的激活状态而改变。这种核糖开关优选使用来自或者衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。可以看出，对核糖开关的激活情况进行评估使用或不使用对照测定或测量均可。识别灭活核糖开关的化合物的方法可用类似方式进行。
除了本文其他部分公开的方法，对阻断可调节剪接的核糖开关的化合物的识别可以任何合适的方式完成，例如，在已知可激活或者灭活核糖开关的化合物存在时或者在测试化合物存在时可进行评估核糖开关的激活或失活的分析。如果未观察到在所述测试化合物不存在时可观察到的激活或失活，那么所述测试化合物被确定为阻断所述核糖开关激活或者失活的化合物。
还公开了使用调节可变剪接的生物传感器核糖开关检测化合物的方法。该方法可包括使一测试样本和生物传感器核糖开关接触以及评估所述生物传感器核糖开关的激活情况。生物传感器核糖开关的激活表示在测试样品中存在生物传感器核糖开关的触发分子。生物传感器核糖开关是在其关联触发分子存在的情况下可产生可检测信号的工程化改造的核糖开关。有用的生物传感器核糖开关可由阈水平或高于阈水平的触发分子触发。生物传感器核糖开关可被设计成体内或体外使用。例如，调节可变结合的生物传感器核糖开关可以被可操作地连接到编码用作信号或者参与产生信号的蛋白的报告RNA，可通过对细胞或者生物体进行工程改造使其包含编码所述核糖开关/报告RNA的核酸构建体从而在体内使用。生物传感器核糖开关体外应用的一个实例是包含构象依赖标签的核糖开关，来自该核糖开关的信号的变化取决于核糖开关的激活状态。这种生物传感器核糖开关优选使用来自或者衍生自天然存在的TPP核糖开关的适体结构域。
还公开了通过识别激活、灭活或阻断核糖开关的化合物以及制造所识别出的化合物制成的化合物。这可通过例如将如文中其他部分所公开的化合物的识别方法与制造所识别出的化合物的方法相结合来完成。例如，化合物可通过如下步骤制备：使一测试化合物和一核糖开关相接触，评估所述核糖开关的激活情况，并且如果所述核糖开关被所述测试化合物激活，则制造所述激活核糖开关的测试化合物作为所述化合物。
还公开了通过以下方式制备的化合物：检测一化合物对一核糖开关的激活、灭活或阻断并制造所述被检测的化合物。这可以通过例如将本文其他部分所公开的化合物激活、失活或阻断的评估方法与制造被检测的化合物的方法相结合来完成。例如，可通过如下步骤制备化合物：使一测试化合物和一核糖开关相接触，评估所述核糖开关的激活情况，并且如果所述核糖开关被所述测试化合物激活，则制造所述激活核糖开关的测试化合物作为所述化合物。检测化合物激活、灭活或阻断核糖开关的能力既指识别之前未知可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物，也指在已知某种化合物可激活、灭活或阻断核糖开关时，评估所述化合物激活、灭活或者阻断核糖开关的能力。
A.抗真菌的化合物的识别
如果存在某一化合物时的核糖开关测定与不存在该化合物时同样的核糖开关测定相比(即与对照测定相比)，信号增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，则该化合物可识别为可激活核糖开关或确定具有核糖开关激活活性。所述核糖开关测定可使用任何合适的核糖开关构建体进行。对于核糖开关激活测定特别有用的核糖开关构建体在本文其他地方描述。可激活核糖开关或具有核糖开关激活活性的化合物的识别可依据一个或多个具体核糖开关、核糖开关构建体或者核糖开关类别进行。为方便起见，被识别为可激活控制可变剪接的核糖开关的化合物可依此识别为针对具体核糖开关的化合物。
B.使用抗真菌化合物的方法
本文公开了体内和体外抗真菌方法。“抗真菌”意味着抑制或阻止真菌生长，杀灭真菌或者减少真菌数。因此，公开了抑制或阻止真菌生长的方法，包括用有效量的本文公开的一种或多种化合物接触真菌。被公开的化合物的其他结构在本文给出。
本文公开了一种抑制真菌细胞生长的方法，该方法包括：使细胞和可结合TPP-应答性核糖开关的化合物接触，其中所述细胞包含编码包含TPP-应答性核糖开关的RNA的基因，其中所述化合物通过结合于所述TPP-应答性核糖开关限制TPP产生而抑制细菌细胞生长，。该方法可使细菌细胞生长与未接触所述化合物的细胞相比至少降低10％。所述化合物和所述细胞可通过将所述化合物给予受试者而接触。所述细胞可以为受试者中的真菌细胞，其中所述化合物杀死或抑制所述真菌细胞生长。所述受试者可感染有真菌。所述化合物可与另一种真菌化合物联合给药。
真菌可选自：例如，蓝色梨头霉(Absidia coerulea)、灰绿犁头霉(Absidia glauca)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、枝顶孢霉菌(Acremonium strictrm)、交链格孢菌(Alternariaalternata)、Apophysomyces elegans、Saksena vasiformis、黄曲霉(Aspergillus flavus)、米曲霉、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、Neosartoryta fischeri、黑曲霉(Aspergillus niger)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、Aspergillus phoenicus、特曲霉(Aspergillus nomius)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、孔曲霉(Aspergillus ostianus)、Aspergillus auricomus、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、酱油曲霉(Aspergillu sojae)、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、Aspergillus caesillus、圆锥曲霉(Aspergillus conicus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、焦曲霉(Aspergillus ustus)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、芽枝状枝孢(Cladosporiumcladosporioides)、多主枝孢(Cladosporium herbarum)、球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)、冠状耳霉(Conidioboluscoronatus)、异孢耳霉(Conidiobolus incongruus)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、构巢裸胞壳(Emericellanidulans)、褶皱裸胞壳(Emericella rugulosa)、对四脊裸胞壳(Emericilla quadrilineata)、Apicoccum nigrum、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)、谢瓦散囊菌(Eurotium chevalieri)、蜡叶散囊菌(Eurotium herbariorum)、赤散囊菌(Eurotium rubrum)、匍匐散囊菌(Eurotium repens)、白地霉(Geotrichum candidum)、克氏地霉(Geotrichum klebahnii)、刺黑乌霉(Memnoniellaechinata)、多头被孢霉(Mortierella polycephala)、沃尔夫被孢霉(Mortierella wolfii)、高大毛霉(Mucor mucedo)、Mucoramphibiorum、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、冻土毛霉(Mucorheimalis)、印度毛霉菌(Mucor indicus)、总状毛霉(Mucorracemosus)、多枝毛霉(Mucor ramosissimus)、中华根霉(Rhizopusazygosporous)、Rhizopus homothalicus、小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)、少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)、弗瑞青霉(Penicilliumfreii)、疣状青霉(Penicillium verrucosum)、多毛青霉(Penicillium hirsutum)、Penicillium alberechii、橘灰青霉(Penicillum aurantiogriseum)、波兰青霉(Penicilliumpolonicum)、鲜绿青霉(Penicillium viridicatum)、多毛青霉(Penicillium hirsutum)、短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)、栎实青霉(Penicilliumglandicola)、Penicillium coprophilum、皮壳正青霉(Eupenicillium crustaceum)、埃及正青霉(Eupenicilliumegyptiacum)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、橘青霉(Penicillium citrinum)、Penicillium sartoryi、Penicilliumwestlingi、顶青霉(Penicillium corylophilum)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、棘刺青霉(Penicillium echinulatum)、离生青霉(Penicillium solitum)、卡门柏青霉(Penicilliumcamembertii)、普通青霉(Penicillium commune)、棘刺青霉(Penicillium echinulatum)、Penicillium sclerotigenum、意大利青霉(Penicillium italicum)、扩展青霉(Penicilliumexpansum)、瘿青霉(Penicillium fellutanum)、查理青霉(Penicillium charlesii)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)、Penicillium raperi、Penicillium madriti、唐菖蒲青霉(Penicillium gladioli)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、娄地青霉(Penicillium roquefortii)、简青霉(Penicilliumsimplicissimum)、赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)、小刺青霉(Penicillium spinulosum)、光孢青霉(Penicillium glabrum)、托姆青霉(Penicillum thomii)、变紫青霉(Penicilliumpupurescens)、石状正青霉(Eupenicillium lapidosum)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)、匍茎根毛霉(Rhizopusstolonifer)、Scopulariopsis asperula、短帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)、暗色帚霉(Scopulariopsis fusca)、布朗氏帚霉(Scopulariopsis brumptii)、纸帚霉(Scopulariopsis chartarum)、Scopulariopsis sphaerospora、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、Trichodermacitroviride、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、黑细基格孢(Ulocladium atrum)、纸状细基格孢(Ulocladium chartarum)、葡串细基格孢(Ulocladiumbotrytis)、Wallemia sebi和纸状葡萄穗霉(Stachybotryschartarum)。真菌存在的任何环境中的真菌生长也可被抑制。例如流体、生物被膜中和表面上的真菌生长可被抑制。本文公开的化合物可与任何其他化合物或者组合物联合给予或使用。例如，本公开的化合物可与另一种抗真菌化合物联合给予或使用。
“抑制真菌生长”被定义为减少单个真菌分裂成子细胞的能力，或减少真菌群形成子细胞的能力。真菌繁殖的能力可减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或100％或更高。
还提供了一种抑制真菌或真菌群生长和/或杀灭真菌或真菌群的方法，包括将所述真菌与本文所公开和描述的一种或多种化合物接触。
“杀灭真菌”被定义为使单个真菌死亡或减少多个真菌如集落中的真菌的数量。当以复数形式提及真菌时，“杀灭真菌”被定义为既定真菌群的细胞死亡率为群的10％、群的20％、群的30％、群的40％、群的50％、群的60％、群的70％、群的80％、群的90％或低于或等于群的100％。
本文公开的化合物和组合物具有体内或体外抗真菌活性，且可与同样为杀真菌剂的其他化合物和组合物结合使用。
术语“治疗有效量”的本文所提供的化合物是指无毒的、足以将一种或多种症状根据需要减轻的量。如将在下文指出的，所需化合物的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、所治疗疾病的严重程度，使用的具体化合物，其给药模式等等。因此，不可能指定一个确切的“有效量”。但是，适当的有效量由本领域的普通技术人员只使用常规实验即可确定。
本文公开的化合物和组合物可通过药学可接受载体体内给药。“药学可接受的”是指物质不会在生物学方面或者其他方面不合乎需要，即该物质可在不引起任何不良生物反应的情况下或在不会以有害方式与药物组合物所含有的任何其他组分相互作用的情况下被给予受试者。使活性成分的任何降解最小并使在受试者中的有害副作用最小的载体自然会被选择，这正如本领域技术人员所熟知的那样。
本文公开的组合物或者化合物可以口服给药、胃肠外给药(如静脉内给药)、肌内注射给药、腹膜内注射给药、经皮给药、体外给药、局部给药等等，包括局部鼻内给药或者通过吸入器给药。本文所用“局部鼻内给药”表示通过一个或者两个鼻孔将组合物送递到鼻和鼻道(nasal passage)，并可包括通过喷雾装置或者滴化装置送递，或通过雾化核酸或载体送递。组合物通过吸入器给药可通过鼻或嘴经由喷雾或滴化装置送递。也可通过插管直接送递到呼吸系统的任何区域(如肺部)。所需要的组合物的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄、体重和总体状况、所治疗变态反应性疾病的严重程度，使用的具体核酸或者载体，其给药模式等等。因此，不可能为每一种组合物指定一个确切量。但是，适当的量由本领域普通技术人员在本文的教导下只使用常规实验即可确定。
如果使用胃肠外途径给予组合物或者化合物，其特点一般为注射给药。注射剂被制备为常规形式，或者为液体溶液或者悬浮液、注射之前适合溶于或悬浮于液体中的固体形式，或者为乳剂。最近改进的胃肠外给药方法包括使用一个缓慢释放或持续释放系统，从而使得恒定剂量得以维持。见如美国专利No.3,610,795，其以援引的方式被纳入本文中。
本文公开的组合物和化合物可与药学可接受的载体联合用于治疗中。合适的载体及其制剂描述于Remington：The Science andPractice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，MackPublishing Company，Easton，PA 1995。通常情况下，合适量的药学可接受的盐用于制剂中使该制剂等渗。药学可接受的载体的实例包括但不限于生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5到约8，且更优选为约7至约7.5。其他载体包括缓释制剂如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透基质，该基质是特型制品形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员而言显而易见的是，可更优选某些载体，这取决于例如给药化合物的给药途径和浓度。
药学载体是本领域技术人员已知的。这些药学载体最通常是用于将药物给予人的标准载体，包括溶液如无菌水、盐水以及具有生理pH的缓冲液。组合物可通过肌内或皮下方式给药。其他化合物根据本领域技术人员使用的标准程序给药。
除了所选分子外，药物组合物还可包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等等。药物组合物可还包括一种或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉药等等。
药物组合物可以多种方式给药，这取决于是需要局部治疗还是全身治疗，以及治疗区域。给药可通过局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内)、口服、吸入或胃肠外途径例如通过静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射进行。本公开的抗体可静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、皮下给药、腔内给药或经皮给药。
胃肠外给药制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如那些基于林格氏右旋葡萄糖的电解质补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可存在，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。
局部给药制剂包括膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药学载体(以水、粉末或油为基础)、增稠剂等是必要的或可取的。
口服给药的组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂是可取的。
有些组合物可能作为药学可接受的酸或碱加成的盐形式给药，所述酸加成盐是与无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸反应所形成，所述碱加成盐是与无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，和有机碱如单烷基胺、双烷基胺、三烷基胺和芳胺和取代乙醇胺反应所形成。
本文所公开的治疗性组合物也可通过使用单克隆抗体作为与各化合物分子偶联的各独立载体给药。本公开的治疗性组合物还可与作为可靶向性药物载体的水溶性聚合物偶联。这类聚合物可包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酸-酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或由棕榈酰残基取代的聚乙烯-环氧乙烷聚赖氨酸。此外，本公开的治疗性组合物可与一类用于实现控制药物释放的可生物降解的聚合物例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢-吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联或两亲的水凝胶嵌段共聚物偶联。
优选由于化合物的给药至少约3％，更优选约10％、更优选约20％、更优选约30％、更优选约50％、更优选约75％甚至更优选约100％的真菌感染被降低。感染降低是由诸如白细胞计数减少、退热、炎症减轻、真菌数减少或其他真菌感染指标下降的参数决定。为了增加真菌感染降低的百分比，可将剂量增加到对受试者保持无毒的最有效水平。
如在整个说明书中所用的，“受试者”是指某一个体。优选地，该受试者是哺乳动物如除人外的哺乳动物或灵长类，且更优选为人。“受试者”可包括家养动物(如猫、狗等)、牲畜(如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鱼类。
“真菌感染”被定义为受试者或者样品内存在真菌。这种真菌可以是天然存在的真菌在受试者或者样品内或上的生长产生，或由于外来生物体入侵产生。
实施例
实施例1：真核核糖开关对可变RNA剪接和基因表达的控制
以前对携带TPP适体的真菌米曲霉thiA mRNA的研究(Kuboderaet al.(2003))揭示，生长培养基中添加硫胺素(维生素B1)会造成基因表达降低，以及删除核糖开关适体会破坏硫胺素应答性。这些结果表明，在真菌中硫胺素进入细胞、被磷酸化以生成TPP，并且所产生的辅酶作为配体，用于核糖开关介导的RNA剪接的控制(Sudarsan et al.(2003))。在该研究中，检查了出现在粗糙脉孢菌中的3个基因中的TPP适体的功能(图5)。已知这些基因的两个——NMT1(图1a)和CyPBP37(图1b；下文称作THI4同源物)是硫胺素代谢基因(McColl et al.(2003)，Faou&Tropschug(2003)，FaouTropschug(2004))。第三个基因NCU01977.1(图1c)编码未知功能的蛋白。
检查主要集中于NMT1基因，已知该基因在粗糙脉孢菌中(McCollet al.(2003))和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中(Maundrell(1989))受过量硫胺素抑制。所有3种前体mRNA都在位于5′端附近的内含子中携带核糖开关(图1和图6)。逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)方法被用于建立相对量，并且当在不存在或存在硫胺素的情况下培养粗糙脉孢菌时产生转录物5’端的核苷酸序列(图1d)。RNA产物的克隆和测序显示出与基因组DNA的序列匹配的前体转录物的存在以及，与图1中描述的RNA剪接产物一致的其他序列的存在。这些结果可证实，硫胺素可造成NMT1和THI4前体mRNA的可变剪接，以及造成NCU01977.1前体mRNA的剪接增加。硫胺素不影响不携带TPP核糖开关的RNA的剪接(图7)。
通过直读探测(in-line probing)确认了NMT1 RNA构建体的TPP结合(Soukup&Breaker(1999))(图8和9)。已知呈现主结构调整的核苷酸参与TPP结合(Thore et al.(2006)，Serganov et al.(2006)，Edwards&Ferré-D′Amaré(2006))，测得的这两种构建体的～300pM的表观离解常数(KD)类似于细菌TPP核糖开关呈现的表观离解常数(Winkler et al.(2002)，Welz&Breaker(2007))。通过使用RT-PCR进一步研究了NMT1 RNA可变剪接的硫胺素控制，以确立从在基本培养基中培养的粗糙脉孢菌及在补充硫胺素后不同时间取样的粗糙脉孢菌分离的转录物的类型和量(图2a)。在不存在添加的硫胺素(t＝0min)的情况下，转录物被加工以产生剪接产物I-3。在补充硫胺素后的第1小时内，出现剪接产物I-2和未剪接的NMT1前体RNA I-1。在4小时内，I-3几乎被I-2和I-1完全代替。这些结果表明，I-3在添加硫胺素后的急剧降低是NMT1表达降低的原因。
携带具有按阅读框与萤光素酶(LUC)报告基因融合的主ORF起始密码子的NMT1 5′UTR或其变体的构建体(图2b)被用于评估TPP适体对于基因控制的重要性。对野生型(WT)LUC报告物构建体的实质性遏制出现于在补充30μM硫胺素的培养基中过夜培养的粗糙脉孢菌中(图2c，上图)。而且，源自报告物构建体和天然NMT1 mRNA的RT-PCR产物是相当的(图2c，下图)。当细胞在无硫胺素的培养基中培养的时候，大多数的突变构建体呈现比WT增大2倍至4倍的报告物活性。在生长于基本培养基中的细胞中，弱化TPP结合亲和性的突变还可能消除由TPP合成造成的适度水平的基因遏制。
在茎P1至P5中破坏并随后恢复适体内的碱基配对的突变(构建体M1至M9，图2b)大多数产生与RNA的TPP结合能力相关的基因调节特征。虽然在M5中P3的伸展部分被破坏，但是该变化出现于适体的TPP结合核心之外，对基因控制几乎无影响。另外，大多数的伸展P3茎可以被删除(M10，类似于图8中的115 NMT1 RNA)，而不失去全部功能。M1中的突变可造成LUC活性的显著降低，并且检测不到通常的mRNA产物(图2c)，这表明除了起到结合TPP的作用之外，适体中的某些核苷酸和结构可影响mRNA转录或加工。
使用M9时出现了大多数出现的结果，它携带针对M8的P 5茎中破坏性突变的补偿性突变。M9仅呈现对硫胺素依赖的基因控制的部分恢复，而处于远低于WT或其他补偿性突变的表达水平(图2c)。M9的这些异常特征与这样一种机制是一致，即P5中的核苷酸可通过该机制参与可变剪接的控制(见下文)。
上述大多数突变对硫胺素调节作用的影响使本发明人推测：由于存在主ORF上游的起始密码子(图1a)，未剪接的或可变剪接的RNA是失活的。对该假设的检验是通过检查与WT或突变形式的所述三种类型NMT1 5′UTR的下游融合的其他LUC报告物构建体来进行(图3a)。所形成的构建体I-3R缺乏上游启动密码子并可模拟在不存在所添加的硫胺素时主要的短(或全长)剪接mRMA，该构建体I-3R可产生强的报告物活性(图3b)。相反，类似物I-2R构建体几乎没有表现出报告物活性，这与硫胺素存在时以及基因表达减少时该剪接变体的天然产生是一致的(图2c)。如预计的，具有构建体I-2R和I-3R的LUC表达水平未因添加硫胺素而被改变，这是因为不存在TPP核糖开关。
在主NMT1 ORF上游的可变剪接的I-2构建体(图3a)中对第一(M11)、第二(M12)或前述二者(M13)起始密码子的破坏可形成产生不断增多的转录物表达的构建体。已经观察到，真菌基因5′UTR的短上游ORF(uORF)可减少主ORF的表达(Vilela&McCarthy(2003))。因此，在同时破坏I-2中两个uORF起始密码子时LUC表达的恢复与这样的假设是一致的，即uORF翻译是主NMT1 ORF表达减少的原因。
在第一5’剪接位点(M14)、剪接分支位点(M15)或3’剪接位点(M16)携带突变的转录物(图3a)可形成均一的低报告物表达(图3b，上图)。RT-PCR分析显示，M14可产生I-2R RNA剪接产物，而M15和M16不进行剪接(图3b，下图)。这些结果可证明，需要合适的剪接来去除uORF并使主ORF表达。
对于许多细菌核糖开关，代谢物结合可以不涉及蛋白的方式改变位于适体下游的表达平台的折叠(Winkler et al.(2002)，Mironovet al.(2002)，Serganov et al.(2006))。为了评估NMT1 TPP核糖开关进行的剪接调节是否是由于适体侧翼的不依赖于蛋白的结构调整引起的，对NMT1 UTR构建体进行直读探测(Soukup&Breaker(1999))。有意思的是，添加TPP会导致在分支位点处的核苷酸的结构变得更为有序(图10)，并且会在第二5’剪接位点处产生更加灵活的结构(图4a)。再者，已经观察到，适体P4和P5元件的12个核苷酸与位于第二5’剪接位点的大多数在不存在配体时结构上退隐的核苷酸互补(图4b)。P4和P5元件是TPP的磷酸部分的识别所必需的，从而TPP结合和5’剪接位点封闭是互相排斥的。
在体内报告物测定中，构建体M9的异常特征与该核糖开关功能的模型是一致的。直读探测可确认，M9突变可破坏适体和第二5’剪接位点之间的碱基配对(图11)，并且该结构缺陷被预计有助于所出现的长剪接mRNA的产生和报告物表达的丧失(图2c)。而且，与其他真菌物种NMT1基因相关的所有TPP核糖开关中均存在相似的可变碱基配对可能(图12)，这说明这种保守的可变二级结构是TPP核糖开关表达平台的一个重要特征。已经被证明的是，当存在两个5’剪接位点时，来自真菌粟酒裂殖酵母的剪接体极偏好使用靠近3’剪接位点的位点(Romfo et al.(2000))。考虑到上述5’剪接位点的偏向性，那么简单地通过调节P4-P5适体区和第二5’剪接位点之间的碱基配对，NMT1 mRNA中的TPP核糖开关即可保持对可变剪接产物分布的完全控制。其他真菌基因中的TPP核糖开关似乎使用不同机制进行基因控制(图13)。
这些数据与TPP核糖开关介导的剪接调节机制是一致的，在TPP核糖开关介导的剪接调节机制中代谢物结合可改变内含子可变剪接位点和分支位点组分的可用性(图4c)。当TPP浓度较低时，新转录的mRNA采用一种封闭第二5’剪接位点的结构，而使得所述分支位点可进行剪接。来自第一5’剪接位点的mRNA前体剪接可导致I-3形式的mRNA的产生及NMT1蛋白的表达。当TPP浓度较高时，配体结合于TPP适体可造成RNA折叠的变构变化，以增加第二5’剪接位点附近的结构灵活性，以及封闭所述分支位点附近的核苷酸。这些变化的组合效应是I-1 mRNA的剪接效率的降低，以及那些确实被加工的mRNA的再定向以生成可变剪接的I-2 mRNA。I-1和I-2都携带与主ORF翻译竞争并抑制NMT1表达的uORF。
可变剪接在真核基因控制中的参与正逐渐变得清晰(Matlin etal.(2005)，Blencowe(2006))，这些结果表明了核糖开关可以如何调节剪接效率以及剪接位点的选择，而不需要蛋白因子。考虑到RNA折叠可能性的巨大多样性，成结构的RNA结构域可能通过以下方式被广泛地用于控制剪接(Buratti&Baralle(2004))：直接读取的物理变化例如温度(Colot et al.(2005))或者代谢物浓度的变化(Sudarsan et al.(2003)，Kubodera et al.(2003)，Borsuk etal.(2007))。再者，一种配体介导的剪接控制的实例最近已被报告，所述控制使用工程改造的适体(Kim et al.(2005))，这证明了配体-mRNA直接相互作用可束缚基因控制的应用。使用真菌TPP核糖开关的观察结果进一步显示了来自生命的各结构域的核糖开关的多变性，并且暗示未发现的核糖开关类有可能参与其他基因控制过程。
方法概要
寡核苷酸和化学品.合成RNA、购买合成的DNA(图14)和试剂并按详述的方法所示制备DAN构建体。
RNA分析.使用来自接种于100ml Vogel基本培养基(补充有0.5mg ml-1L-组氨酸)中的未转化粗糙脉孢菌的RNA进行RT-PCR分析。在不存在或存在添加的30μM硫胺素的情况下，在30℃下将培养物以150rpm振摇培养24h。使用补充信息(SupplementaryInformation)中所述引物和方法，将cDNA作为模板用于所述3个基因5′区的PCR扩增。所有剪接产物通过克隆及测序确认。
报告基因测定.使用新鲜悬浮的大分生孢子的电穿孔进行粗糙脉孢菌的转化，并通过使用来自基因组DNA的插入物特异性引物的PCR来验证靶基因的插入。萤光素酶报告物构建体的转录受插入至NMT15′UTR上游的粗糙脉孢菌β-微管蛋白(BTUB)启动子组成性地驱动。在不存在或存在30μM硫胺素的情况下，在30℃下将粗糙脉孢菌于2％的葡萄糖基本培养基中过夜培养。如下述分离样品并测定萤光素酶活性。
方法
生物信息学搜索和真菌TPP核糖开关.本发明人通过由已知的代表性TPP核糖开关修改的手工审校的种子序列比对，使用协方差模型搜索检查了RefSeq数据库(第13版)的“真菌”分支。协方差模型(Eddy et al.(1994))使用infernal软件包(Eddy，S.R，Department of Genetics，Washington University School ofMedicine.St.Louis，Missouri)(第0.55版)生成。另外的详情还见补充信息。
DNA寡核苷酸和化学品.合成的DNA购自耶鲁大学(YaleUniversity)HHMI Keck基金生物技术资源中心。TPP、硫胺素、碘乙酸钠(IAA)和L-组氨酸购自Sigma-Aldrich。[γ-32P]ATP购自Amersham Pharmacia。
体外转录.DNA模板通过PCR扩增从粗糙脉孢菌基因组DNA产生，使用的是设计用于将T7启动子导入构建体的引物。将序列CC添加至模板链转录起始点以促进体外转录效率，从而产生5′端携带GG的RNA。RNA使用RiboMax Transcription Kit(Promega)依照厂商说明书制备。如以前的描述(Seetharaman et al.(2001))通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化RNA，并进行5′32P-标记。
RNA构建体的直读探测.在存在或不存在如定义的TPP的情况下下，将5′32P-标记的RNA于50mM Tris-HCl(pH 8.3，25℃)、20mM MgCl2和100mM KCl中在23℃下孵育40分钟。切割产物通过变性10％PAGE分离、通过PhosphorImager(GE Healthcare)显像并使用ImageQuant软件定量。KD值是通过将标准化的切割RNA部分相对于所使用配体的对数浓度作图来进行确定。
菌株、质粒和培养基.粗糙脉孢菌87-74(bd；frq+a和his-3)(Froehlich et al.(2003))被用作转化用的宿主株。携带萤火虫萤光素酶(LUC)报告基因的质粒pLL07(由J.C.Dunlap的实验室馈赠)(Mehra et al.(2002))被用于报告基因构建。通过QuikChange(Stratagene)位点定向诱变移除pLL07中LUC报告基因的起始密码子以获得质粒pLL09。
粗糙脉孢菌中从1至355位的β-微管蛋白基因启动子(登录号M13630)(Orbach et al.(1986))是使用引物DNA3和DNA4通过PCR从基因组DNA扩增。以MfeI和EcoRI消化所扩增的DNA片段，并插入至pLL09的EcoRI位点，以得到pLUC。pLUC的序列通过测序(耶鲁大学HHMI Keck基金生物技术资源中心)确认。在质粒操作过程中将大肠杆菌Top 10细胞(Invitrogen)用作宿主。
对NMT1基因(登录号AY007661)5′UTR的克隆是以DNA5和DNA6为引物通过PCR从粗糙脉孢菌基因组DNA扩增378bp片段(开始于注释的转录起始位点)实现。首先使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆所产生的野生型(WT)PCR DNA。通过EcoRI和XbaI限制酶消化从所述载体释放NMT1片段，并将其克隆至pLUC的合适位点中。
为了生成适体突变体M1至M9和剪接位点突变体M14至M16，在包含TOTO载体的WT NMT1上进行PCR诱变(见引物列表)。在通过DNA测序确认诱变后，将每个突变体NMT1片段克隆至pLUC的EcoRI/XbaI位点中。对于P3缺失构建体(M10)的克隆，将NMT1以引物DNA5/DNA25和DNA26/DNA6扩增为两个片段，其中重叠区删除了大部分的天然P3a茎。这两个片段在以DNA5和DNA6作为外引物的后续PCR中被用作模板。所形成的片段经EcoRI和XbaI消化，并被克隆至pLUC中。NMT1的I-2R和I-3R构建体以及变体的制备是以DNA5和DNA6为引物通过RT-PCR扩增这两个可变剪接产物而实现。如上述将所产生的PCR产物克隆并突变。
为了生成NCU01977.15′区-LUC报告物融合物(图13)，如上所述，以DNA41和DNA42为引物从粗糙脉孢菌基因组DNA扩增预测起始密码子上游94个核苷酸起始的478个核苷酸的片段，并且克隆至pLUC的EcoRI/XbaI位点中。所有构建体的完整性通过测序(耶鲁大学HHMI Keck基金会生物技术资源中心)确认。在所有构建体中，主ORF(NMT1或NCU01977.1)的原始起始密码子都与LUC报告物序列按阅读框融合。
用于培养粗糙脉孢菌的标准液体培养基包含2％葡萄糖、0.5％L-精氨酸、1X Vogel基本培养基和50ng/ml生物素。用于粗糙脉孢菌生长的固体培养基(斜面)包含1X Vogel基本培养基、2％蔗糖和1.5％琼脂。用于选择粗糙脉孢菌转化体的培养基包含1X Vogel基本培养基、2％琼脂、2％L-山梨糖、0.05％果糖和0.05％葡萄糖。对于同核体分离，使用含1％IAA的0.1X Westergaard培养基。
粗糙脉孢菌转化和报告物测定.如以前的描述(Davis(2000)，Loros.&Dunlap(1991)，Vann(1995))，粗糙脉孢菌的转化是使用新鲜悬浮的大分生孢子的电穿孔进行。靶基因的插入是通过PCR使用插入物特异的引物从基因组DNA确认。如以前的描述(Ebbole&Sachs(1990))分离同型核的株。
萤光素酶报告基因测定.通过过滤分离来自以LUC报告物构建体转化的粗糙脉孢菌的菌丝体，并将大约100mg组织碾成细粉。在添加100μl 1X Passive裂解缓冲液(Promega)后，将样品剧烈混合并在冰上孵育30min，然后以13,000g离心15分钟。使用萤光素酶测定系统(Promega)和板读数(plate-reading)发光计(Wallac)测定所得上清液的萤光素酶活性。将萤光素酶活性按Bradford蛋白质测定法(BioRad)测定的提取物总蛋白浓度标准化，并最终以相对于参考构建体的值表示。相对于未添加硫胺素培养的细胞中的野生型NMT1构建体，萤光素酶背景活性(未转化的粗糙脉孢菌)为0.05％。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析.使用
Figure G2008800169099D00651
LS试剂(Invitrogen)依照厂商说明书从菌丝体分离总RNA。在37℃下将5μg总RNA以无RNA酶的DNA酶I(Promega)处理30min。cDNA是通过在42℃下使用SuperScriptTM II逆转录酶(Invitrogen)依照厂商说明书以polyT为引物逆转录1hr生成。为了排除来源于基因组DNA污染的扩增产物的可能性，在RT之前进行了使用RNA制剂的对照反应，并且对于NMT1，使用了一种跨越编码区外显子-外显子边界的反向引物。
生物信息学搜索和真菌TPP核糖开关.通过从已知的TPP核糖开关代表物修改的手工审校的种子序列比对，使用协方差模型搜索检查了RefSeq数据库(第13版)的“真菌”分支，。协方差模型(Eddy1994)是使用INFERNAL软件包(第0.55版)生成。
为了确认已知核糖开关序列被恢复，将最终结果与通过对硫胺素代谢基因的彻底比较基因组分析而编汇的TPP核糖开关列表比较。该方法成功地识别出以前在微生物物种中发现的每一核糖开关。另外，与来自11个丝状真菌种的23个基因相关的TPP核糖开关被鉴定(图5)。
已知在真菌中通过本方法鉴定的多个核糖开关相关的基因参与硫胺素代谢。基于它们各自ORF的氨基酸序列，还发现该列表中大多数以前表征的基因为硫胺素代谢蛋白的同源物。在真菌中发现的TPP适体与它们的真核生物同源物大部分相同，这与功能保守性是一致的。然而，真菌TPP适体代表物具有2个明显差异。第一点是一致地缺乏P3a茎，P3a茎有时存在于真核代表物中但对适体的TPP结合来说是非必需的。第二点是在丝状真菌的P3茎长度很不均一，在4-83个碱基对的区间变化。三种TPP核糖开关在粗糙脉孢菌中的定位在图6中示出。
DNA寡核苷酸和化学品.合成的DNA购自耶鲁大学(YaleUniversity)HHMI Keck基金生物技术资源中心。TPP、硫胺素、碘乙酸钠(IAA)和L-组氨酸购自Sigma-Aldrich。[γ-32P]ATP购自Amersham Pharmacia。
体外转录.DNA模板是通过PCR扩增从粗糙脉孢菌基因组DNA产生，使用的是设计用于将T7启动子导入构建体的引物。将序列CC添加至模板链转录起始点以促进体外转录的效率，从而产生5′端携带GG的RNA。RNA是使用RiboMax转录试剂盒(Promega)依照厂商说明书制备。如以前的描述(Seetharaman et al.(2001))通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化RNA并进行5′32P-标记。
RNA构建体的直读探测.在存在或不存在所定义的TPP的情况下，将5′32P标记的RNA于50mM Tris-HCl(pH 8.3，25℃)、20mM MgCl2和100mM KCl中在23℃下孵育40分钟。切割产物通过变性10％PAGE分离、通过Phosphor Imager(GE Healthcare)显像并使用ImageQuant软件定量。通过将标准化的切割RNA部分相对于所使用配体的对数浓度作图确定KD值。197 NMT1和115 NMT1的直读探测的结果在图8和图9中描述，261 NMT1的结果在图10中描述，273 NMT1的结果在图11种描述。与273 NMT1构建体中正被检查的可变碱基配对类似的可变碱基配对出现于位于NMT1 mRNA中的其他真菌TPP核糖开关中(图12)。
菌株、质粒和培养基.粗糙脉孢菌87-74(bd；frq+a和his-3)被用作转化的宿主株。携带萤火虫萤光素酶(LUC)报告基因的质粒pLL07(Froehlich 2004)被用于报告基因构建。通过QuikChange(Stratagene)位点定向诱变移除pLL07中LUC报告基因的起始密码子以获得质粒pLL09。
粗糙脉孢菌中从1至355位的β-微管蛋白基因启动子(登录号M13630)是通过PCR使用引物DNA3和DNA4从基因组DNA扩增。以MfeI和EcoRI消化所扩增的DNA片段，并将其插入至pLL09的EcoRI位点，以得到pLUC。pLUC的序列通过测序(耶鲁大学HHMI Keck基金生物技术资源中心)确认。在质粒操作过程中将大肠杆菌Top 10细胞(Invitrogen)用作宿主。
用于培养粗糙脉孢菌的标准液体培养基包含2％葡萄糖、0.5％L-精氨酸、1X Vogel基本培养基和50ng/ml生物素。用于粗糙脉孢菌生长的固体培养基(斜面)包含1X Vogel基本培养基、2％蔗糖和1.5％琼脂。用于选择粗糙脉孢菌转化体的培养基包含1X Vogel基本培养基、2％琼脂、2％L-山梨糖、0.05％果糖和0.05％葡萄糖。对于同核体分离，使用含1％IAA的0.1X Westergaard培养基(Westergaard 1947)。
粗糙脉孢菌转化和报告物测定.如以前的描述(Davis 2000，Loros 1991，Vann 1995)，粗糙脉孢菌的转化是使用新鲜悬浮的大分生孢子的电穿孔进行。靶基因的插入是通过PCR使用插入物特异的引物从基因组DNA证实。如以前的描述(Ebbole 1990)分离同型核的株。
5′UTR-报告基因质粒的构建.对NMT1基因(登录号AY007661)5′UTR的克隆是以DNA5和DNA6为引物通过PCR从粗糙脉孢菌基因组DNA扩增378bp片段(开始于所注明的转录起始位点)实现。所产生的野生型(WT)PCR DNA首先使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆。通过EcoRI和XbaI限制酶消化从所述载体释放NMT1片段，并将其克隆至pLUC的合适位点中。
为了生成适体突变体M1至M9和剪接位点突变体M14至M16，在包含TOPO载体的WT NMT1上进行PCR诱变(见引物列表)。在通过DNA测序确认诱变后，将每个突变体NMT1片段克隆至pLUC的EcoRI/XbaI位点中。对于P3缺失构建体(M10)的克隆，将NMT1以DNA5/DNA25和DNA26/DNA6为引物扩增为两个片段，其中重叠区删除了大部分的天然P3a茎。这两个片段在以DNA5和DNA6作为外引物的后续PCR中被用作模板。通过EcoRI和XbaI消化所形成的片段，并将其克隆至pLUC中。NMT1的I-2R和I-3R构建体以及变体的制备是以DNA5和DNA6为引物通过RT-PCR扩增这两个可变剪接产物而实现。如上述将所产生的PCR产物克隆并突变。
为了生成NCU01977.1 5′区-LUC报告物融合物(图12)，如上所述，以DNA41和DNA42为引物从粗糙脉孢菌基因组DNA扩增预测起始密码子上游94个核苷酸起始的478个核苷酸的片段，并且克隆至pLUC的EcoRI/XbaI位点中。所有构建体的完整性通过测序(耶鲁大学HHMI Keck基金生物技术资源中心)确认。在所有构建体中，主ORF(NMT1或NCU01977.1)的原始起始密码子都与LUC报告物序列按阅读框融合。
萤光素酶报告基因测定.通过过滤分离来自以LUC报告物构建体转化的粗糙脉孢菌的菌丝体，并将大约100mg组织碾成细粉。在添加100μl 1X Passive缓冲裂解液(Promega)后，将样品剧烈混合并在冰上孵育30min，然后以13,000g离心15分钟。使用萤光素酶测定系统(Promega)和板读数发光计(Wallac)确定所得上清液的萤光素酶活性。将萤光素酶活性按Bradford蛋白质测定法(BioRad)测定的提取物总蛋白浓度标准化，并最终以相对于参考构建体的值表示。相对于未添加硫胺素培养的细胞中的野生型NMT1构建体，萤光素酶背景活性(未转化的粗糙脉孢菌)为0.05％。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析.使用
Figure G2008800169099D00681
LS试剂(Invitrogen)依照厂商说明书从菌丝体分离总RNA。在37℃下将5μg总RNA以无RNA酶的DNA酶I(Promega)处理30min。cDNA是通过在42℃下使用SuperScriptTM II逆转录酶(Invitrogen)依照厂商说明书以polyT引物逆转录1hr生成。为了排除来源于基因组DNA污染的扩增产物的可能性，在RT之前进行了使用RNA制剂的对照反应，并且对于NMT1，使用了一种跨越编码区外显子-外显子边界的反向引物。RT-PCR分析从以polyT为引物通过RT生成的cDNA进行，但使用序列特异性的RT引物得到了相同的结果。同时，使用结合于NMT1编码区下游外显子的RT-PCR反向引物未造成任何差异(数据未显示)。这表明，所有转录物形式都是多腺苷酸化的，并且对包含核糖开关的内含子的下游内含子的剪接是不受影响的。为了识别序列，将所有扩增产物克隆并且通过对多个独立克隆的测序进行确认。此外，向生长培养基中添加硫胺素未出现对剪接控制的一般效应(图7)。另外，RT-PCR被用于确定从NMT1下游内含子剪接的范围，发现了在生长培养基中不存在及存在添加的硫胺素的情况下都进行组成型剪接。
对每个基因使用特异的引物组合，一个引物结合于所注明的转录物5’端，另一引物结合于包含核糖开关的内含子紧邻的下游。对于NMT1基因，使用的PCR引物是DNA37和DNA38(图14)，分别对应于所注明的NMT1 mRNA的5’端和包含TPP核糖开关的内含子下游大约50个核苷酸的区域。对于THI4(CyPBP37)基因，使用的PCR引物是DNA39和DNA40，分别对应于mRNA的5’端和包含TPP核糖开关的内含子下游大约125个核苷酸的区域。用分别结合预测起始密码子前94个核苷酸和含核糖开关的内含子的预测3′端下游的22个核苷酸的引物DNA41和DNA42，扩增NCU01977.1的5′区。PCR产物是通过2％琼脂糖凝胶电泳分离，并通过溴化乙锭染色显示。将不同的扩增产物使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，并依照厂商的说明书克隆至TOPO-TA克隆载体(Invitrogen)中。每个产物的多克隆序列均通过测序分析(耶鲁大学HHMI Keck基金生物技术资源中心)。
为了在粗糙脉孢菌转化体中检测NMT1-LUC融合转录物，使用引物DNA37和DNA43，它们对应于NMT1转录物的5′端和LUC开放阅读框起始点下游大约130个核苷酸的区域。天然NMT1转录物以及所示的某些突变构建体携带伸展的P3茎(图10)。
其他真菌TPP核糖开关的机制.通过一种核糖开关作用、可变剪接和uORF翻译的类似相互作用，粗糙脉孢菌THI4基因可能被TPP抑制。相反，NCU01977.1前体转录物在内含子中携带TPP核糖开关适体，所述内含子隔断主ORF。未剪接的转录物的翻译被存在于内含子中的早期终止密码子中断。NCU01977.1mRNA的RT-PCR分析(图1b)表明，剪接的mRNA相对于未剪接的mRNA的比例在存在硫胺素时会增大，这表明其TPP核糖开关作为“开启的”基因开关的功能，所述开启的基因开关会增加结合TPP后的剪接和基因表达。该结论还得到了对在粗糙脉孢菌中表达的NCU01977.1报告融合构建体的分析结果的支持，粗糙脉孢菌对补充硫胺素的反应是产生升高的LUC表达(图13)。
应理解，所公开的方法和组合物不限于所述的具体方法、方案和试剂，因而它们可有所变化。还应理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案而不意欲限制本发明的范围，本发明的范围只被所附的权利要求所限制。
必须注意的是，除非上下文中另外明确指出，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种核糖开关”包括多个这样的核糖开关，提及“该核糖开关”是指本领域技术人员已知的一个或多个核糖开关及其等价物，等等。
“任选的”或“任选地”是指后面描述的事件、情况或材料可能发生或存在，也可能不发生或不存在，且该描述包括所述事件、情况或材料发生或存在以及不发生或不存在的情形。
范围在本文中可被表示为从“大约”一个具体值，和/或到“大约”另一个具体值。当表示为这样一个范围时，除非上下文另外特别指出，否则也具体地考虑和认为公开了从前述的一个具体值和/或到前述的另一个具体值的范围。类似地，当通过在前面使用“大约”将数值表示为近似值时，除非上下文另外特别指出，否则应理解成该具体数值可形成另一个应认为被公开的具体考虑的实施方案。还应理解，除非上下文另外特别指出，每个范围的端点在与另一个端点相关或独立于另一个端点时都是有意义的。最后，应该理解的是，除非文中另外特别说明，否则在明确公开的范围中所包括的所有单个的数值和子范围也被特别考虑和认为被公开。不论在具体的情况下这些实施方案的全部或部分是否被明确地公开，上述的原则都适用
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与所公开方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明方法和组合物的实施或检测，但是本文仍然描述了特别有用的方法、设备和材料。本文引用的出版物和因其而被引用的内容在此特别地以援引的方式纳入本文。本文不应被解释为承认本发明不能先于在先发明的这些公开内容。且并非承认任何参考文献都构成现有技术。参考文献的讨论说明了它们的作者的论断，但是本申请人保留怀疑所引用文献的正确性和相关性的权利。可以清楚地理解，虽然本文中提及了许多出版物，但是这些参考文献并不表示承认任何这些文件都构成本领域的公知常识的一部分。
在通篇本申请的说明书和权利要求中，词语“包含”和该词的变化形式如“包括”和“含有”意指“包括但不限于”，而不意欲排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。
本领域的技术人员仅使用常规的实验即可认识到或能够确定本文所述方法和组合物的具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案意欲被随附的权利要求所涵盖。
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Claims (34)

1.一种可调节的基因表达构建体，所述构建体包含一个编码如下一种RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地连接于一个编码区的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的剪接，其中所述核糖开关和编码区是异源的。
2.权利要求1的构建体，其中所述核糖开关调节可变剪接。
3.权利要求1或2的构建体，其中所述核糖开关包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。
4.权利要求1-3任一项的构建体，其中所述RNA进一步包含一个内含子，其中所述表达平台结构域在所述内含子中包含一个可变剪接点。
5.权利要求1-4任一项的构建体，其中所述RNA进一步包含一个内含子，其中所述表达平台结构域在所述内含子的一端包含一个剪接点。
6.权利要求4或5的构建体，其中所述可变剪接点在所述核糖开关被激活时具有活性。
7.权利要求4或5的构建体，其中所述可变剪接点在所述核糖开关未被激活时具有活性。
8.权利要求1-7任一项的构建体，其中所述核糖开关被一种触发分子激活。
9.权利要求8的构建体，其中所述触发分子为TPP。
10.权利要求1-9任一项的构建体，其中所述核糖开关是一种TPP-应答性核糖开关。
11.权利要求1-10任一项的构建体，其中所述核糖开关激活可变剪接。
12.权利要求1-10任一项的构建体，其中所述核糖开关抑制可变剪接。
13.权利要求1-12任一项的构建体，其中RNA具有一个分支结构。
14.权利要求1-13任一项的构建体，其中所述RNA是mRNA前体。
15.权利要求3-13任一项的构建体，其中所述适体结构域控制剪接的区域位于P4茎和P5茎。
16.权利要求15的构建体，其中所述适体结构域控制剪接的区域还位于环5。
17.权利要求15或16的构建体，其中所述适体结构域控制剪接的区域还位于茎P2。
18.权利要求3-17任一项的构建体，其中所述剪接位点位于相对于所述适体结构域5′端的-6至-24之间的位置。
19.权利要求3-17任一项的构建体，其中所述剪接位点在序列GUA之后。
20.一种用于调节RNA剪接的方法，包括将包含一个核糖开关的构建体导入所述RNA，其中所述核糖开关能够调节RNA剪接。
21.权利要求20的方法，其中所述核糖开关包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。
22.权利要求20或21的方法，其中所述核糖开关在RNA的一个内含子中。
23.权利要求20-22任一项的方法，其中所述核糖开关被一种触发分子激活。
24.权利要求23的方法，其中所述触发分子为TPP。
25.权利要求20-24任一项的方法，其中所述核糖开关是一种TPP-应答性核糖开关。
26.权利要求20-25任一项的方法，其中所述核糖开关激活可变剪接。
27.权利要求20-25任一项的方法，其中所述核糖开关抑制可变剪接。
28.权利要求20-27任一项的方法，其中所述剪接不是天然发生的。
29.权利要求21-28任一项的方法，其中所述适体结构域控制剪接的区域位于环5。
30.权利要求21-28任一项的方法，其中所述适体结构域控制剪接的区域位于茎P2。
31.权利要求21-30任一项的方法，其中所述剪接位点位于相对于所述适体结构域5′端的-6至-24之间的位置。
32.权利要求21-30任一项的方法，其中所述剪接位点在所述适体结构域中序列GUA之后。
33.一种抑制真菌生长的方法，所述方法包括：
(a)识别感染真菌的受试者；
(b)给与所述受试者有效量的抑制TPP-应答性核糖开关的化合物，从而抑制真菌生长。
34.权利要求33的方法，其中抑制真菌生长包括真菌生物量减少10％或更多。
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