KR20100015757A - 택일적 스플라이싱을 조절하는 리보스위치와 관련된 방법 및 조성물 - Google Patents

택일적 스플라이싱을 조절하는 리보스위치와 관련된 방법 및 조성물 Download PDF

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나라심한 수다르산
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Abstract

택일적 스플라이싱(alternative splicing)을 조절하는 리보스위치(riboswitch)와 관련된 방법 및 조성물이 개시되어 있다.

Description

택일적 스플라이싱을 조절하는 리보스위치와 관련된 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO RIBOSWITCHES THAT CONTROL ALTERNATIVE SPLICING}
개시된 본 발명은 일반적으로 유전자 발현 분야, 구체적으로 유전자 발현의 조절 분야에 관한 것이다.
관련된 출원의 상호-참조
본원은 전체가 본원에 참고로 도입되는, 2007년 3월 22일자로 출원된 미국 가출원 제60/919,433호를 우선권 주장한다.
연방정부 지원 연구에 대한 선언
본 발명은 NIH에 의해 부여된 승인번호 GM068819 하의 정부 지원으로 완성되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.
배경기술
정확한 유전적 조절은 살아있는 시스템의 본질적인 특징인데, 이는 세포가 유전적 발현 패턴을 변화시켜 무수한 생화학적 신호 및 환경적 신호에 반응해야 하기 때문이다. 유전적 조절의 대부분의 공지된 기작은 화학적 또는 물리적 자극을 감지한 후 관련 DNA 또는 메신저 RNA 서열과 선별적으로 상호작용함으로써 유전자 발현을 조절하는 단백질 인자들의 사용을 수반한다. 단백질은 복잡한 형태를 채택할 수 있고 살아있는 시스템이 그의 화학적 환경 및 물리적 환경을 정확히 감지하게 하는 다양한 기능을 수행할 수 있다. 대사물질에 반응하는 단백질 인자는 전형적으로 DNA에 결합하여 전사 개시를 조절하는 작용을 하거나(예를 들어, lac 발현억제제(represser) 단백질; 문헌(Matthews, K.S., and Nichols, J.C., 1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164)), 또는 RNA에 결합하여 전사 종결(예를 들어, PyrR 단백질; 문헌(Switzer, R.L., et al., 1999, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367)) 또는 번역(예를 들어, TRAP 단백질; 문헌(Babitzke, P., and Gollnick, P., 2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802))을 조절하는 작용을 한다. 단백질 인자는 알로스테릭(allosteric) 조절 또는 번역 후 변경과 같은 다양한 기작에 의해 환경적 자극에 반응하고 상기 기작들을 활용하는 데 능통하여 고도 반응성 유전적 스위치로서 작용한다(예를 들어, 문헌(Ptashne, M., and Gann, A. (2002). Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 참조).
유전적 조절에 있어서 단백질 인자의 광범위한 참여 이외에, RNA도 유전적 조절에 있어서 능동적인 역할을 수행할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 최근 연구는 파괴할 mRNA를 선별적으로 표적화하여 유전자 발현을 하향-조절하는 데 있어서 작은 비-코딩 RNA가 수행하는 실질적인 역할을 밝혀내기 시작하였다(예를 들어, 문헌(Hannon, G.J. 2002, Nature 418, 244-251) 및 상기 문헌에서 언급된 참고문헌 참조). 이러한 RNA 간섭 과정은 와슨-크릭 염기쌍 형성을 통해 원하는 mRNA 표적을 인식하는 짧은 RNA의 능력을 이용하는데, 상기 인식 후 결합된 mRNA는 단백질의 작용에 의해 파괴된다. RNA는 이 시스템에서 분자 인식을 위한 이상적인 물질인데, 이는 신규하되 고도로 특이적인 RNA 결합 부위를 갖는 단백질 인자를 생성하는 것보다는 진화적 과정을 통해 신규한 표적-특이적 RNA 인자를 생성하는 것이 훨씬 더 용이하기 때문이다.
단백질이 효소, 수용체 및 구조적 기능에 대해 생물학적 면에서 요구되는 대부분의 요건을 충족시킨다 하더라도, RNA 또한 이러한 능력들을 가질 수 있다. 예를 들어, RNA는 상당한 효소적 능력 및 정확한 분자 인식을 보이는 다수의 리보자임 도메인(Cech & Golden, Building a catalytic active site using only RNA. In: The RNA World R. F. Gesteland, T. R. Cech, J. F. Atkins, eds., pp.321-350 (1998); Breaker, In vitro selection of catalytic polynucleotides. Chem. Rev. 97, 371-390 (1997)) 및 수용체 도메인(Osborne & Ellington, Nucleic acid selection and the challenge of combinatorial chemistry. Chem. Rev. 97, 349-370 (1997); Hermann & Patel, Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 287, 820-825 (2000))을 형성하기에 충분한 구조적 유연성을 갖는다. 나아가, 이 활성들은 조합되어 이펙터(effector) 분자에 의해 선별적으로 조절되는 알로스테릭 리보자임을 생성할 수 있다(Soukup & Breaker, Engineering precision RNA molecular switches. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3584-3589 (1999); Seetharaman et al, Immobilized riboswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures. Nature Biotechnol. 19, 336-341 (2001)).
택일적 스플라이싱(alternative splicing)은 mRNA 전구체 상의 스플라이스 부위의 선별적 사용을 수반하는 과정이다. 택일적 스플라이싱은 단일 유전자로부터 많은 단백질이 생산될 수 있게 함으로써 상이한 기능을 갖는 단백질의 생성을 가능하게 한다. 택일적 스플라이싱은 엑손 스킵핑(exon skipping), 상호 배타적 엑손의 사용 및 5' 및/또는 3' 스플라이스 부위의 차등적 선별을 포함하는 다양한 방법을 통해 일어날 수 있다. 많은 유전자들(예를 들어, 호메오진(homeogene), 온코진(oncogene), 뉴로펩티드, 세포외 매트릭스 단백질, 근육 수축 단백질)의 경우, 택일적 스플라이싱은 발생학적 또는 조직-특이적 방식으로 조절된다. 따라서, 택일적 스플라이싱은 유전자 발현에 있어서 핵심적인 역할을 수행한다. 최근 연구는 복잡한 유기체의 발현 방식에 있어서 택일적 스플라이싱의 중요성을 밝혀내었다.
mRNA 전구체(전구-mRNA)의 택일적 스플라이싱은 포유동물 유전자 발현의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 택일적 스플라이싱의 조절은 다양한 계통의 세포 내에서 일어나고 다수의 유전자의 발현 프로그램의 일부이다. 최근에, 택일적 스플라이싱이 종종 완전히 상이한 기능을 갖는 단백질 아이소폼(isoform)의 생성을 조절함이 명백해졌다. 세포 형질전환에 대해 상이하지만 종종 길항적인 성질을 나타내는 온코진 및 프로토-온코진 단백질 아이소폼은 택일적 스플라이싱을 통해 생성된다. 이러한 종류의 예는 문헌(Makela, T. P. et al. 1992, Science 256:373; Yen, J. et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5077; Mumberg, D. et al. 1991, Genes Dev. 5:1212; Foulkes, N. S. and Sassone-Corsi, P. 1992, Cell 68:411)에서 발견된다. 또한, 택일적 스플라이싱은 종종 계획된(programmed) 세포 사멸에 관여하는 단백질, 예컨대, Fas, Bcl-2, Bax 및 Ced-4의 생성을 조절한다(Jiang, Z. H. and Wu J. Y., 1999, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 220: 64). 전구-mRNA의 택일적 스플라이싱은 발현억제제 단백질을 생성할 수 있지만, 활성화제는 상이한 조건 하에서 동일한 전구-mRNA로부터 생성될 수 있다(Black D. L. 2000, Cell 103:367; Graveley, B. R. 2001, Trends Genet. 17:100). 당업계에서 요구되는 것은 리보스위치(riboswitch)를 통해 택일적 스플라이싱을 조절하는 데 사용될 수 있는 방법 및 조성물이다.
본 명세서에 도입되어 있고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 방법 및 조성물의 여러 실시양태를 예시하고 본 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 방법 및 조성물의 원리를 설명하기 위한 것이다.
도 1은 3가지 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유전자가 5' 인트론 내에 티아민 피로포스페이트(TPP) 리보스위치를 보유함을 보여준다. 도 1a는 NMT1 mRNA에 대한 전구체 5' UTR(I-1) 및 택일적으로 스플라이싱된 생성물(I-2 및 I-3)을 보여준다. 엑손은 진회색 직사각형이고 인트론은 음영으로 표시되지 않은 밝은 회색 직사각형이다. 5'(GU) 및 3'(AG) 스플라이스 부위, 잠정적 개시 코돈(*) 및 uORF 및 주 NMT1 ORF로부터의 상응하는 번역 생성물이 표시되어 있다. 도 1b는 THI4에 대한 전구체 mRNA 및 이의 스플라이싱된 생성물의 5' UTR을 보여주고, 도 1c는 NCUO1977.1에 대한 전구체 mRNA 및 이의 스플라이싱된 생성물의 5' UTR을 보여준다. 도 1d는 30 μM 티아민의 부재(-) 또는 존재(+) 하에서 생장한 뉴로스포라 크라사로부터의 mRNA 5' 영역의 RT-PCR 검출을 보여준다. THI4에 대한 밴드 II-3a 및 II-3b는 업스트림 인트론이 남아있는 스플라이스 형태 II-3(II-3a) 또는 업스트림 인트론이 제거된 스플라이스 형태 II-3(II-3b)를 나타낸다. 마커 DNA(M)는 100개 염기쌍씩 증가된 형태로 존재한다.
도 2는 NMT1 TPP 리보스위치에 의한 택일적 스플라이싱 및 유전자 조절을 보여준다. 도 2a는 30 μM의 티아민을 티아민-무함유 배지에서 생장된 뉴로스포라 크라사의 배양물에 첨가한 후(t=0) NMT1 전사체 스플라이싱(RT-PCR 생성물)의 변화를 보여주고, 도 2b는 루시퍼라제(LUC) ORF의 업스트림에 융합된 야생형(WT) 또는 다양한 돌연변이체 NMT1 리보스위치(M1 내지 M10)의 레포터 구축물(서열번호 1 및 2)을 보여준다. 도 2c는 30 μM의 티아민의 부재(채워진 원) 또는 존재(빈 원) 하에서 생장된 다양한 돌연변이체 NMT1-LUC 구축물에 대한 WT-LUC 구축물(표준화된 상대적 광 유니트(RLU) = 1)로부터의 RLU를 보여준다. 값은 3회의 독립적인 분석 반복 실시로부터 얻은 평균이고 표준 오차 막대는 기호의 직경보다 더 작다. 바닥: 각 형질전환체에 대한 LUC 융합체(상부 패널) 및 천연 NMT1 RNA(하부 패널)로부터의 5' UTR의 RT-PCR 분석. 세부사항은 도 1에 표시되어 있다.
도 3은 스플라이싱되지 않은 mRNA 및 택일적으로 스플라이싱된 mRNA가 NMT1 발현억제(repression)를 야기함을 보여준다. 도 3a는 스플라이싱되지 않은 RNA(I- 1R) 및 스플라이싱된 RNA(I-2R 및 I-3R)를 자극하기 위해 LUC 레포터에 융합된 야생형 구축물 및 돌연변이체 구축물을 보여준다. 도 3b는 배지 중의 30 μM 티아민의 부재(-, 채워진 막대) 또는 존재(+, 빈 막대) 하에서 LUC 활성을 보여준다(상부). 발현은 티아민이 첨가되지 않은 경우의 야생형 I-3R의 값을 기준으로 표준화되었다. 값은 3회의 독립적인 분석 반복 실시로부터 얻은 평균이고 표준 오차 막대가 표시되어 있다. 바닥: 티아민의 부재(-) 또는 존재(+) 하에서 생장된 뉴로스포라 크라사에 대한 LUC 융합체(상부 패널) 및 천연 NMT1(하부 패널) 전사체의 RT-PCR 분석. 다른 세부사항은 도 2c에 대한 설명 부분에 기재된 바와 같다.
도 4는 뉴로스포라 크라사 내에서 mRNA의 TPP 리보스위치-매개된 택일적 스플라이싱의 기작을 보여준다. 도 4a는 제2의 5' 스플라이스 부위 근처에 존재하는 구조의 TPP-유도된 조절을 보여준다. 5' 32P-표지된 273 NMT1 RNA의 천연 발생적 절단 생성물(-78번 뉴클레오티드부터 195번 뉴클레오티드까지)을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하고 정량하여 구조 내에서 10 μM TPP-매개된 변화의 위치를 밝혀내었다. 도 4b는 일부 P4-P5 뉴클레오티드가 TPP에 의해 매개되는 제2의 5' 스플라이스 부위 근처에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적임을 보여준다(서열번호 3 및 4). 도 4c는 핵심 스플라이싱 결정인자(determinant)가 앱타머(aptamer)의 다양한 점유(occupancy) 상태 도중에 활성화되거나 억제되는 NMT1 발현의 리보스위치 조절 기작을 보여준다.
도 5는 3가지 세균 및 23가지 진균 TPP 리보스위치 앱타머에 대한 서열 정렬 을 보여준다(서열번호 5 내지 30). 두드러지게 표시된 영역은 상부에서 화살표로 표시된 줄기(stem) 파트너에 상응한다.
도 6은 뉴로스포라 크라사로부터 유래된 3가지 TPP 리보스위치의 서열 내용을 보여준다. AUG는 주 개시 코돈을 나타내고; AUG는 택일적 개시 코돈(주 ORF에서는 개시 코돈이 아님)을 나타내고; GU 및 GC는 5' 스플라이스 부위를 나타내며; AG는 3' 스플라이스 부위를 나타낸다. 각 유전자의 경우, 음영으로 표시된 뉴클레오티드는 인트론을 나타내고, 인트론의 어두운 음영으로 표시된 영역은 TPP 앱타머를 나타낸다(서열번호 31 내지 33). AG 는 스플라이싱된 생성물의 시퀀싱을 기초로 할 때 사용되지 않는, 데이터베이스에 존재하는 NCU01977.1에 대한 예측된 3' 스플라이스 부위를 나타낸다. UAG는 스플라이싱이 일어나지 않는 경우 번역을 종결시킬 NCU01977.1 내의 정지 코돈을 나타낸다.
도 7은 스플라이싱에서의 티아민-의존적 변경이 TPP 리보스위치를 필요로 함을 보여준다. 도 7은 30 μM 티아민의 부재(-) 또는 존재(+) 하에서 최소 배지 중에서 생장된 뉴로스포라로부터 얻은 FREQUENCY(FRQ)(도 7a) 및 NMT1(도 7b) 전사체의 택일적으로 스플라이싱된 5' 영역의 RT-PCR 분석을 보여준다. 각 mRNA 당 2개의 복제물이 도시되어 있다. 이미 보고되어 있는 바와 같이, FRQ의 상이한 스플라이스 형태(도 7a, 7b 및 7c)는 티아민 처리 후 서로를 기준으로 수치 면에서 변하지 않는다. FRQ의 RT-PCR 생성물은 프라이머 5'-CATTGCAAAAACGGCATTGGA(서열번호 34) 및 5'-TGTGGGGACTTTTCATGATAC(서열번호 35)를 사용하여 생성하였다. 생성물을 아가로스 겔(2%) 전기영동을 이용하여 분리하였다. "M"은 100개 염기쌍씩 증가하 는 DNA를 함유하는 크기 마커를 표시한다. DNA는 에티디움 브로마이드 염색 및 UV 조명으로 가시화하였다.
도 8은 NMTl mRNA와 TPP의 결합을 보여준다. 도 8a는 NMT1 리보스위치 앱타머(115 NMT1 앱타머를 나타내는 서열번호 36)의 서열, 2차 구조 및 TPP-유도된 조절을 보여준다. 이용가능한 원자-해상 구조 데이터를 반영하도록 이전에 보고된 모델을 변경하였다. 구축물 197 NMT1은 천연 P3 줄기를 포함하는 반면(도 9), 상기 줄기의 82개 뉴클레오티드는 구축물 115 NMT1에서 결실되어 있다. 구조적 조절 부위는 도 8b에 도시된 115 NMT1의 인-라인 프로빙(in-line probing)에 의해 확립되었다. 서열번호 36의 뉴클레오티드 30, 31, 43, 44, 54, 56, 71 및 93에 대해 일정한 절단이 발견되었다. 서열번호 36의 뉴클레오티드 13-16, 22, 27, 49-53, 55, 63, 65, 69, 77-81, 86 및 87에 대해 감소된 절단이 발견되었다. 서열번호 36의 뉴클레오티드 62, 64 및 88에 대해 증가된 절단이 발견되었다. 도 8b는 115 NMT1의 인-라인 프로빙 분석이 TPP-유도된 RNA 구조체 조절을 시사함을 보여주고, 상기 RNA 구조체의 부위 1 및 2는 도 8c에서 리간드 친화성을 정량하는 데 사용되었다. 레인은 반응 부재(NR) 후, RNase T1(T1)을 사용한 부분적 절단 후, 또는 알칼리(-OH)를 사용한 부분적 절단 후 로딩된 전구체 RNA를 포함한다. U2G 변경은 시험관내 전사에 의한 제조를 용이하게 하기 위해 수행되었다. 도 8c는 천연 발생적으로 절단된 RNA의 표준화된 분획 대(versus) 도 8b에 도시된 부위 1 및 2에 대한 TPP의 농도의 로그를 작도한 도면이다.
도 9는 구축물 197 NMT1의 연장된 P3 줄기에 대한 서열 및 인-라인 프로빙 결과를 보여준다. 음영으로 표시된 뉴클레오티드는 1 mM 이하의 TPP의 부재 및 존재 하에 천연 발생적 절단이 일어나는 RNA 내의 위치를 표시한다(서열번호 37).
도 10은 261 NMTl RNA 구축물의 인-라인 프로빙 분석이 분지 부위에서의 적당한 구조적 변경을 시사함을 보여준다. 도 10a는 5' 32P-표지된 261 NMT1 RNA(시험관내 전사를 용이하게 하기 위해 추가 5' G를 포함하는 11번 뉴클레오티드부터 270번 뉴클레오티드까지)를 사용하여 수행한 인-라인 프로빙 분석으로부터 얻은 천연 발생적 RNA 절단 생성물의 PAGE 분리를 보여준다. 밴드 강도를 정량함으로써, 10 μM TPP에 의해 매개된 RNA 구조체 내의 변경이 일어난 위치를 확인하였다. 추가 세부사항에 대해서는 도 4 및 8에 대한 설명을 참조한다.
도 11은 TPP의 부재 하에서 273 NMT1 야생형(WT) RNA 구축물 및 M9 NMT1 RNA 구축물의 인-라인 프로빙 분석이 제2의 5' 스플라이스 부위에서의 차이를 시사함을 보여준다. 도 11a는 표시된 5' 32P-표지된 WT RNA 및 M9 273 NMT1 RNA(-78번 뉴클레오티드부터 195번 뉴클레오티드까지)를 사용하여 수행한 인-라인 프로빙 분석으로부터의 천연 발생적 RNA 절단 생성물의 PAGE 분리를 보여준다. 도 11b는 상대적 밴드 강도를 측정함으로써, WT와 비교할 때 M9 내의 돌연변이 도입에 의해 야기된 구조적 변경이 일어난 위치를 확인하였음을 보여준다. 추가 세부사항에 대해서는 도 8 및 9에 대한 설명을 참조한다. -14번 뉴클레오티드, -13번 뉴클레오티드 및 -12번 뉴클레오티드가 M9에서 실질적인 천연 발생적 절단을 보이고 WT 구축물에 비 해 염기쌍을 형성하지 않을 수 있지만 -13번째 뉴클레오티드만이 TPP의 부재 하에서 염기쌍을 형성하지 않을 것으로 예측됨을 주목해야 한다.
도 12는 다양한 진균 종으로부터 유래된 NMT1 유전자들의 제2의 5' 스플라이스 부위의 플래킹 영역과 TPP 앱타머 사이의 택일적 염기쌍 형성을 보여준다(서열번호 38 내지 43 및 96 내지 101). 도 12a는 뉴로스포라 크라사로부터 유래된 NMT1 유전자의 개략도이다. 2개의 택일적 5' 스플라이스 부위, 분지점 및 3' 스플라이스 부위가 TPP 앱타머 및 주 ORF의 위치를 기준으로 표시되어 있다. 음영으로 표시된 뉴클레오티드는 제2의 5' 스플라이스 부위를 플랭킹하는 서열과 앱타머 내의 유사 영역 사이의 염기쌍 형성 잠재력을 표시한다. 도 12b 내지 12f는 다양한 진균 종으로부터 유래된 NMT1 유전자들의 앱타머 옆에 위치한 잠정적 5' 스플라이스 부위를 둘러싸는 영역의 상보적 서열, 및 상기 NMT1 유전자들에 대한 앱타머의 일부의 상보적 서열을 보여준다. 택일적 염기쌍 형성 잠재력을 갖는 앱타머의 영역은 P4 및 P5 줄기의 한쪽에 주로 위치하지만, 일부 경우 루프(loop) 5 및 P2 줄기까지 연장될 수도 있다. 잠정적인 택일적 5' 스플라이스 부위는 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -6 내지 -24의 위치에 존재한다. 표시된 스플라이스 부위의 사용은 뉴로스포라로부터 유래된 NMT1 유전자(도 1 참조) 및 아스퍼길러스 오리자애(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 NMT1 유전자((도 12b, AB226284)에 대한 전사체 데이터에 의해 확인된다. 일부 유전자의 경우, 컨센서스 서열 "GUA" 다음에 위치한 여러 잠재적 5' 스플라이스 부위가 상보적 영역 내에서 발견된다.
도 13은 뉴로스포라 크라스 NCU01977.1 mRNA 내의 TPP 리보스위치에 의한 유 전자 활성화를 보여준다. 뉴로스포라 크라사 생장 배지 중의 30 μM 티아민의 부재 또는 존재 하에서 LUC 활성(도 13a), 및 천연 NCU01977.1의 리보스위치 영역 및 NMT1 전사체의 RT-PCR 분석(도 13b)이 도시되어 있다. 뉴로스포라 크라사는 LUC 레포터 유전자와 인 프레임(in frame)으로 융합되어 있는 개시 코돈을 포함하는, NCU01977.1의 5' 부분을 포함하는 구축물로 형질전환시키고 티아민의 부재(-) 하에서 밤새 생장시켰다. 이어서, 진균 조직을 30 μM 티아민을 함유하지 않거나(0시) 함유하는 새로운 배지로 옮기고 24시간 동안 더 생장시켰다. 티아민의 부재(-) 하에서 생장시킨 배양물로부터 여러 시점에서 샘플을 취하고, 티아민을 첨가한 지(+) 24시간 후 배양물로부터 샘플을 취하였다. LUC 활성은 t = 0시에서 측정된 값으로 표준화시켰다. 천연 전사체에 대해 RT-PCR 분석을 수행하였다. M은 100개 염기쌍씩 증가하는 DNA를 함유하는 크기 마커이고, 이때 바닥 밴드는 100 bp를 나타낸다. 첨가된 티아민의 부재 하에서 상당한 양의 스플라이싱된 생성물 III-2의 존재는 세포가 상기 조건 하에서 주로 리보스위치-유도된 스플라이싱을 유발하기에 충분한 양의 TPP를 생성함을 의미할 것이다.
도 14는 DNA 프라이머의 서열을 보여준다(서열번호 44 내지 95).
발명의 개요
본 명세서에는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조절가능한 유전자 발현 구축물이 개시되어 있는데, 상기 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 조절하고, 리보스위치 및 코딩 영역은 이종 영역이다. 상기 리보스위치는 상기 RNA의 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 상기 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼(platform) 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인은 이종성 도메인이다. 본 발명의 RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에 택일적 스플라이스 접합부(splice junction)를 포함한다. 본 발명의 RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론의 말단에서 스플라이스 접합부(즉, 5' 스플라이스 접합부 또는 3' 스플라이스 접합부)를 포함한다. 본 발명의 RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에 분지 부위를 포함한다. 택일적 스플라이스 접합부는 리보스위치가 활성화될 때 활성 상태일 수 있다. 택일적 스플라이스 접합부는 리보스위치가 활성화되지 않았을 때 활성 상태일 수 있다. 리보스위치는 TPP와 같은 유발 분자에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 억제할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경시킬 수 있다. 상기 RNA는 분지된 구조를 가질 수 있다. 상기 RNA는 전구-mRNA일 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P4 및 P5 줄기 내에 위치할 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프 5 내에서도 발견될 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P2 줄기 내에서도 발견될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 발현 플랫폼 도메인은 P4 서열 및 P5 서열, 루프 5 서열 및/또는 P2 서열과 상호작용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 앱타머 서열은 유발 분자가 앱타머 도메인에 결합되지 않은 경우에만 발현 플랫폼 도메인과의 상호작용에 이용될 수 있다. 스플라이스 부위 및/또는 분지 부위는 예를 들어, 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -6 내지 -24의 위치에 존재할 수 있다. 스플라이스 부위는 예를 들어, 서열 GUA 다음에 위치할 수 있다.
본 명세서에는 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있는 리보스위치를 포함하는 구축물을 RNA 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법도 개시되어 있다. 상기 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있고, 상기 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인은 이종 도메인이다. 리보스위치는 RNA의 인트론 내에 있을 수 있다. 리보스위치는 TPP와 같은 유발 분자에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 억제할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경시킬 수 있다. 스플라이싱은 비-천연적으로 발생할 수 있다. 택일적 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프 5 내에서 발견될 수 있다. 택일적 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P2 줄기 내에서도 발견될 수 있다. 스플라이스 부위는 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -6 내지 -24의 위치에 존재할 수 있다. 스플라이스 부위는 예를 들어, 앱타머 내의 서열 GUA 다음에 위치할 수 있다.
본 명세서에는 진균에 감염된 개체를 식별하는 단계, 및 TPP-반응성 리보스위치를 억제하는 화합물 유효량을 상기 개체에게 투여하여 진균 생장을 억제하는 단계를 포함하는, 진균 생장을 억제하는 방법도 개시되어 있다. 진균 생장의 억제는 진균 생체질량(biomass)의 10% 이상의 감소를 포함할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물의 추가 이점은 부분적으로는 하기 상세한 설명에 기재될 것이고 부분적으로는 상세한 설명으로부터 이해되거나 또는 개시된 방법 및 조성물의 실시를 통해 인식될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물의 이점은 첨부된 청구의 범위에서 구체적으로 언급되어 있는 요소 및 조합을 통해 인식되고 달성될 것이다. 상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 예시 및 설명을 위한 것일 뿐 청구된 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 개시된 본 방법 및 조성물은 구체적인 실시양태에 대한 하기 상세한 설명 및 그에 포함된 실시예, 및 도면 및 도면에 대한 상기 설명 및 하기 설명을 참조함으로써 더 용이하게 이해될 수 있다.
메신저 RNA는 전형적으로 번역 과정 동안에 단백질- 또는 작은 RNA-조절 인자 및 리보좀이 작용하는 유전정보의 수동 운반체로서 여겨진다. 일부 mRNA는 천연 앱타머 도메인을 보유하고 이 RNA 도메인과 특정 대사물질의 직접적 결합은 유전자 발현의 조절을 초래함이 밝혀져 있다. 천연 리보스위치는 전형적으로 천연 RNA와 관련되어 있지 않은 2가지 놀라운 기능을 나타낸다. 첫째, mRNA 요소는 상이한 구조적 상태를 채택할 수 있는데, 이때 한 구조는 그의 표적 대사물질에 대한 정확한 결합 포켓(pocket)으로서 작용한다. 둘째, 구조적 상태 사이에서 대사물질에 의해 유도된 알로스테릭 상호전환은 여러 상이한 기작 중 한 기작에 의해 유전자 발현의 수준 변화를 야기한다. 리보스위치는 전형적으로 2개의 분리된 도메인, 즉 표적에 선별적으로 결합하는 도메인(앱타머 도메인)과 유전적 조절에 영향을 미치는 도메인(발현 플랫폼 도메인)으로 절단될 수 있다. 유전자 발현의 대사물질-의존적 알로스테릭 조절을 야기하는 것은 상기 2개 도메인 사이의 동적 상호작용이다.
리보스위치의 다양한 클래스가 동정되어 있고 활성 화합물(본원에서 유발 분자로서 지칭됨)을 선별적으로 인식하는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 보조효소 B12, 글라이신, TPP 및 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)는 상기 화합물의 대사 경로 또는 수송 경로에서 핵심 효소를 코딩하는 유전자에 존재하는 리보스위치를 활성화시킨다. 각 리보스위치 클래스의 앱타머 도메인은 고도로 보존된 컨센서스 서열 및 구조를 따른다. 따라서, 서열 유사성 검색은 관련된 리보스위치 도메인들을 동정하는 데 이용될 수 있다. 리보스위치 도메인은 다양한 세균계, 고세균계(archae) 및 진핵생물계 유기체에서 발견되어 왔다.
10가지 상이한 대사물질을 감지하는 리보스위치의 11가지 구조적 클래스가 진정세균(eubacteria )에서 보고되어 있다(Mandal 2004; Winkler 2005; Breaker 2006; Fuchs 2006; Roth). 쿠에유오신(queuosine) 전구체 preQ1에 대해 선별적인 진정세균 리보스위치는 드물게 작은 앱타머 도메인을 함유하고(Nat. Struct. Mol. Biol. (2007)), 무수한 다른 클래스는 현재 특징규명중이다. 각 리보스위치의 앱타머 도메인은 관련성이 거의 없는 유기체 사이에서조차도 고도로 보존된 상태로 유지되어 있는 그의 뉴클레오티드 서열(Rodionov 2002; Vitreschak 2002; Vitreschak 2003) 및 폴딩된 구조(Nahvi 2004; Batey 2004; Serganov 2004; Montange 2006; Thore 2006; Serganov 2006; Edwards 2006)에 의해 구별된다. 리보스위치는 발현 플랫폼이 서열, 구조 및 조절 기작에 있어서 상당히 상이할 수 있다 하더라도 통상적으로 앱타머에 의한 대사물질 결합에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 발현 플랫폼을 포함한다.
이례적인 앱타머 보존 수준은 생체정보의 이용이 다양한 유기체에서 대표적인 유사한 리보스위치들을 동정할 수 있게 한다. 현재, TPP 리보스위치 앱타머 컨센서스를 따르는 서열들만이 모든 3가지 생명체로부터 유래된 유기체에서 동정되어 있다(Sudarsan 2003). 진균(Sudarsan 2003; Galagan 2005)(도 5) 및 식물로부터의 일부 예측된 진핵 TPP 앱타머는 TPP에 결합하는 것으로 밝혀져 있지만((Sudarsan 2003 Yamauchi), 대사물질 결합이 유전자 발현을 조절하는 정확한 기작은 알려져 있지 않다. 진균에서, 각 TPP 앱타머는 mRNA의 5' UTR 내의 인트론 또는 단백질 코딩 영역 내에 존재하는데, 이는 mRNA 스플라이싱이 대사물질 결합에 의해 조절됨을 암시한다(Sudarsan 2003; Kubodera 2003).
A. 리보스위치 RNA의 일반적인 구성
세균의 리보스위치 RNA는 특정 mRNA의 주 코딩 영역의 5' UTR 내에 주로 위치한 유전적 조절 요소이다. 구조적 프로빙 연구(이하, 더 논의됨)는 리보스위치 요소가 일반적으로 2개의 도메인, 즉 리간드-결합 도메인으로서 작용하는 천연 앱타머(T. Hermann, D. J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763), 및 유전자 발현에 관여하는 RNA 요소와 상호접촉하는 "발현 플랫폼"(예를 들어, 샤인-달가노(SD) 요소; 전사 종결요소 줄기)으로 구성되어 있다. 이 결론은 시험관내에서 합성된 앱타머 도메인이 발현 플랫폼의 부재 하에서 적절한 리간드에 결합한다는 관찰로부터 도출되었다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2, 3 및 6 참조). 뿐만 아니라, 구조적 프로빙 연구는 대부분의 리보스위치의 앱타머 도메인이 독립적으로 조사된 경우 특정 2차- 및 3차-구조 폴드(fold)(전체 5' 리더 RNA 면에서 조사되었을 때 앱타머 구조와 본질적으로 동일함)를 채택함을 시사한다. 이것은 많은 경우 앱타머 도메인이 발현 플랫폼과 무관하게 폴딩하는 모듈 유니트(modular unit)임을 의미한다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2, 3 및 6 참조).
궁극적으로, 앱타머 도메인의 리간드-결합된 또는 비결합된 상태는 유전자 발현에 대한 영향 발휘를 담당하는 발현 플랫폼을 통해 해석된다. 리보스위치를 모듈 요소로서 보는 것은 앱타머 도메인이 다양한 유기체 사이에서 고도로 보존되어 있다는 점(심지어 계(kingdom) 사이에서도 TPP 리보스위치에 대해 관찰됨)에 의해 더 지지되지만(N. Sudarsan, et al., RNA 2003, 9, 644), 발현 플랫폼은 서열, 구조, 및 첨부된 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 발현이 조절되는 기작 면에서 다양하다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 tenA mRNA의 TPP 리보스위치에 결합하는 리간드는 전사 종결을 야기한다(A. S. Mironov et al., Cell 2002, 111, 747). 이 발현 플랫폼은 에스케리치아 콜라이(Eschericha coli)의 thiM mRNA 내의 TPP 리보스위치의 발현 플랫폼과 비교될 때 서열 및 구조 면에서 상이하고, 이때 TPP 결합은 SD 차단 기작에 의해 번역 억제를 야기한다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2 참조). TPP 앱타머 도메인은 용이하게 인식될 수 있고 상기 2개의 전사 유니트 사이에 거의 동일한 기능적 특성을 갖지만, 유전적 조절 기작 및 이를 수행하는 발현 플랫폼은 매우 상이하다.
리보스위치 RNA에 대한 앱타머 도메인은 전형적으로 그 길이가 -70 내지 170 뉴클레오티드이다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 도 11). 이 관찰은 시험관내 진화 실험이 길이 면에서 상당히 더 짧고 구조적 복잡성 면에서 상당히 더 단순한 매우 다양한 소분자-결합 앱타머를 동정시켜주기 때문에 다소 예측되지 않은 결과이다(T. Hermann, D. J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763; M. Famulok, Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, 324). 인공 앱타머와 비교할 때 천연 앱타머 서열의 복잡성 및 정보 내용에 있어서의 상당한 증가에 대한 이유가 입증되어 있지만, 이 복잡성은 높은 친화성 및 선별성으로 작용하는 RNA 수용체를 형성하는 데 필요한 것으로 생각된다. 리간드-리보스위치 결합체에 대한 겉보기 KD 값은 낮은 nM 내지 낮은 μM이다. 첨부된 발현 플랫폼으로부터 단리된 일부 앱타머 도메인들이 완전한 리보스위치에 비해 표적 리간드에 대한 개선된 친화성(약 10배 내지 100배)(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2 참조)을 나타낸다는 사실도 주목할만하다. 추정컨대, 완전한 리보스위치 RNA는 다수의 상이한 RNA 구조를 샘플링하는 데 있어서 에너지를 필요로 하고, 이것이 리간드 친화성의 손실로 반영된다. 앱타머 도메인은 분자 스위치로서 작용해야 하기 때문에, 이것은 천연 앱타머의 보다 정교한 구조를 재구성하는 것을 보조해야 한다는 기능적 요구를 천연 앱타머에 부가할 수도 있다.
B. TPP 리보스위치
보조효소 TPP는 단백질이 촉매로서 작용하는 많은 반응에서 필수적인 참여자인 비타민 B1의 활성 형태이다. 세균, 식물 및 진균을 포함하는, 모든 3가지 생명체로부터 유래된 유기체는 TPP-감지 리보스위치를 사용하여 티아민 및 그의 인산화된 유도체의 이입 또는 합성을 담당하는 유전자를 조절하므로, 이 리보스위치 클래스는 대사물질-감지 RNA 조절 시스템의 가장 널리 분포된 구성원이다. 이 구조는, 1개의 서브도메인이 TPP의 4-아미노-5-하이드록시메틸-2-메틸피리미딘 잔기에 대한 삽입 포켓을 형성하는 반면 또 다른 서브도메인이 리간드의 피로포스페이트 잔기에의 가교 접촉을 만들기 위해 2가 금속 이온 및 물 분자를 사용하는 보다 넓은 포켓을 형성하는 폴딩된 RNA를 보여준다. 상기 2개의 포켓은 연장된 구조에서 TPP를 인식하는 분자 측정 장치로서 작용하도록 배치된다. 중심 티아졸 잔기는 RNA에 의해 인식되지 않는데, 이것은 항균 화합물인 피리티아민 피로포스페이트가 이 리보스위치를 표적화하여 티아민 대사 유전자의 발현을 하향-조절하는 이유이다. 천연 리간드 및 이의 약물-유사 동족체는 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 합성을 조절하기 위해 리보스위치에 의해 이용되는 2차 및 3차 구조 요소들을 안정화시킨다. 또한, 이 구조는 폴딩된 RNA가 단백질 유전적 인자에 의해 형성된 결합 포켓과 경쟁하는 정밀한 결합 포켓을 어떻게 형성할 수 있는지를 알 수 있게 한다.
3가지 TPP 리보스위치가 섬유상 진균 뉴로스포라 크라사에서 조사되었고, 상기 3가지 TPP 리보스위치들 중 하나는 mRNA 스플라이싱을 조절함으로써 유전자 발현을 활성화시키고 나머지 둘은 유전자 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 리보스위치-매개된 염기쌍 형성 변화 및 택일적 스플라이싱 조절을 수반하는 상세한 기작은 TPP 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 전구체 NMT1 mRNA에 대해 밝혀졌다(실시예 1). 이 결과는 진핵세포가 대사물질-결합 RNA를 이용하여 핵심적인 생화학적 과정의 조절에 중요한 RNA 스플라이싱을 조절함을 입증한다. TPP 리보스위치는 그 전체가 본원에 참고로 도입되고 특히 TPP 리보스위치 구조, 기능 및 용도의 설명이 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호에도 기재되어 있다. 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 임의의 보호대상 및 설명, 특히 TPP 리보스위치 구조, 기능 및 용도에 대한 임의의 설명이 본 명세서에 개시된 다른 보호대상에 구체적으로 포함될 수 있거나 본 명세서에 개시된 다른 보호대상으로부터 배제될 수 있음을 특히 고려해야 한다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 달리 명시하지 않은 한 특정 합성 방법, 특정 분석 기법 또는 특정 시약으로 한정되지 않고 따라서 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
재료
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 상기 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있거나, 상기 방법 및 조성물의 제조에 사용될 수 있거나 상기 방법 및 조성물의 생성물인 재료, 조성물 및 성분이 개시되어 있다. 이 재료들 및 다른 재료들은 본 명세서에 개시되어 있고, 상기 재료의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되어 있는 경우, 상기 화합물들의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 치환 각각에 대한 구체적 언급이 명시적으로 개시되어 있지 않더라도 각각이 본 명세서에 구체적으로 고려되고 개시되어 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 리보스위치 또는 앱타머 도메인이 개시되고 논의되어 있으며 리보스위치 또는 앱타머 도메인을 포함한 다수의 분자에 부가할 수 있는 다수의 변경이 논의되어 있는 경우, 리보스위치 또는 앱타머 도메인의 각각 및 모든 조합 및 치환 및 가능한 변경은 달리 명시되어 있지 않은 한 구체적으로 고려된다. 따라서, 분자 A, B 및 C의 클래스뿐만 아니라 분자 D, E 및 F의 클래스가 개시되어 있고 조합 분자 A-D의 예가 개시되어 있는 경우, 심지어 각각이 개별적으로 개시되어 있지 않더라도 각각은 개별적으로 및 총체적으로 고려된다. 따라서, 이 예에서, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F가 각각 구체적으로 고려되고 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적 조합 A-D의 개시로부터 개시된 것으로 인정되어야 한다. 마찬가지로, 임의의 하위세트 또는 이의 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 하위군이 구체적으로 고려되고 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적 조합 A-D의 개시로부터 개시된 것으로 인정되어야 한다. 이 개념은 본 명세서에 개시된 조성물의 제조 방법 및 사용 방법에서 수반되는 단계를 포함하나 이로 한정되지 않는 본원의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 존재하는 경우, 이 추가 단계는 본 명세서에 개시된 방법의 임의의 구체적 실시양태 또는 실시양태들의 조합을 이용하여 각각 수행할 수 있고, 이러한 조합은 각각 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 인정되어야 함을 이해해야 한다.
A. 리보스위치
리보스위치는, 발현될 RNA 분자의 일부이면서 유발 분자와 결합하였을 때 상태를 변화시키는 발현 조절 요소이다. 리보스위치는 전형적으로 2개의 분리된 도메인, 즉 표적에 선별적으로 결합하는 도메인(앱타머 도메인)과 유전적 조절에 영향을 미치는 또 다른 도메인(발현 플랫폼 도메인)으로 절단될 수 있다. 유전자 발현의 대사물질-의존적 알로스테릭 조절을 야기하는 것은 상기 2개의 도메인 사이의 동적 상호작용이다. 단리된 리보스위치 및 재조합 리보스위치, 이러한 리보스위치를 함유하는 재조합 구축물, 상기 리보스위치에 작동가능하게 연결되어 있는 이종 서열, 및 상기 리보스위치, 리보스위치 재조합 구축물, 및 상기 이종 서열에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 보유하는 세포 및 형질전환 유기체가 개시되어 있다. 이종 서열은 예를 들어, 레포터 단백질 또는 펩티드를 포함하는 원하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열일 수 있다. 바람직한 리보스위치는 천연 발생적 리보스위치이거나 천연 발생적 리보스위치로부터 유도된다. 예를 들어, 앱타머 도메인은 천연 발생적 리보스위치의 앱타머 도메인일 수 있거나 천연 발생적 리보스위치의 앱타머 도메인으로부터 유도될 수 있다. 리보스위치는 인공 앱타머를 포함할 수 있거나 경우에 따라 인공 앱타머를 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 인공 앱타머는 시험관내 진화 및/또는 시험관내 선별을 통해 디자인되거나 선별된 앱타머를 포함한다. 리보스위치는 천연 발생적 리보스위치의 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. 다양한 리보스위치의 컨센서스 서열은 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호, 예컨대, 도 11에 개시되어 있다.
본 명세서에는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조절가능한 유전자 발현 구축물이 개시되어 있는데, 상기 리보스위치는 상기 RNA의 스플라이싱을 조절하고, 상기 리보스위치 및 상기 코딩 영역은 이종 영역이다. 리보스위치는 RNA의 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치는 앱타머 도메인 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인은 이종 도메인이다. RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에서 또는 상기 인트론의 말단에서 택일적 스플라이스 접합부(즉, 5' 스플라이스 접합부 또는 3' 스플라이스 접합부)를 포함한다. RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에서 분지 부위를 포함한다. 택일적 스플라이스 접합부는 리보스위치가 활성화되거나 활성화되지 않은 경우 활성을 나타낼 수 있다. 리보스위치는 유발 분자, 예컨대, TPP에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다.
리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 리보스위치의 활성화는 택일적 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있거나, 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 택일적 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 또는 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있다. 다른 예로서, 불활성 리보스위치 또는 리보스위치의 불활성화는 택일적 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있거나, 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 택일적 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 또는 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있다. 일반적으로, 스플라이싱 조절의 형태는 RNA 분자 내에서 리보스위치와 스플라이스 접합부, 택일적 스플라이스 접합부 및 분지 부위의 물리적 관계에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 리보스위치의 활성화/불활성화는 일반적으로 RNA 내에서의 택일적 2차 구조(예를 들어, 염기쌍이 형성된 줄기)의 형성 및/또는 파괴를 수반하고, 이러한 구조적 변화는 기능적 RNA 서열을 감추거나 노출시키는 데 이용될 수 있다. 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인은 일반적으로 상기 기능적 RNA 서열을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 리보스위치가 활성화되거나 불활성화되었을 때 또는 리보스위치가 불활성화되거나 활성화되었을 때 스플라이스 접합부 또는 분지 부위가 택일적으로 감춰지거나 노출되는 방식으로 스플라이스 접합부 또는 분지 부위를 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인 내에 포함시킴으로써, RNA의 스플라이싱을 조절하거나 RNA의 스플라이싱에 영향을 미칠 수 있다.
리보스위치는 스플라이싱을 활성화시키거나 억제할 수 있다. "스플라이싱을 활성화시킨다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 스플라이싱이 일어나게 할 수 있음을 의미한다. 이것은 예를 들어, 임의의 스플라이싱이 일어날 수 있게 하는 것(예컨대, 스플라이싱이 일어나지 않는 것과 비교하여 스플라이싱이 한번 일어날 수 있게 하는 것) 또는 택일적 스플라이싱이 일어날 수 있게 하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 스플라이싱 횟수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상까지 스플라이싱을 증가시킬 수 있다.
"스플라이싱을 억제한다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 스플라이싱을 억제할 수 있음을 의미한다. 이것은 예를 들어, 임의의 스플라이싱이 일어나는 것을 방해하거나 감소시키는 것(예컨대, 스플라이싱이 한번 일어나는 것과 비교하여 스플라이싱이 전혀 일어나지 않는 것) 또는 택일적 스플라이싱이 일어나는 것을 방해하거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 택일적 스플라이싱의 회수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 택일적 스플라이싱을 감소시킬 수 있다.
리보스위치는 택일적 스플라이싱을 활성화시키거나 억제할 수 있다. "택일적 스플라이싱을 활성화시킨다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 택일적 스플라이싱이 일어날 수 있게 함을 의미한다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 택일적 스플라이싱 횟수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상까지 택일적 스플라이싱을 증가시킬 수 있다.
"택일적 스플라이싱을 억제한다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 택일적 스플라이싱을 억제할 수 있음을 의미한다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 택일적 스플라이싱의 회수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 택일적 스플라이싱을 감소시킬 수 있다.
리보스위치는 RNA에 의해 코딩된 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 스플라이싱 또는 택일적 스플라이싱의 조절은 번역될 RNA의 능력에 영향을 미칠 수 있거나, 코딩 영역을 변경시킬 수 있거나, 또는 번역 개시 또는 종결을 변경시킬 수 있다. 택일적 스플라이싱은 예를 들어, 개시 코돈 또는 정지 코돈(또는 이들 둘다)이 통상적으로 프로세싱된 전사체에 존재하지 않는 프로세싱된 전사체에서 나타나게 할 수 있다. 또 다른 예로서, 택일적 스플라이싱은 정상적인 개시 코돈 또는 정지 코돈이 프로세싱된 전사체로부터 제거되게 할 수 있다. RNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 조절하기 위해 리보스위치-조절된 스플라싱을 이용하는 데 있어서 유용한 한 방법은 리보스위치를 RNA의 5' UTR 내의 인트론 내에 도입하고 상기 인트론 내의 개시 코돈이 택일적으로 스플라이싱된 RNA 내에서 제1 개시 코돈이 되도록 상기 인트론 내의 개시 코돈을 포함하거나 이용하는 것이다. RNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 조절하기 위해 리보스위치-조절된 스플라이싱을 이용하는 데 있어서 유용한 또 다른 방법은 리보스위치를 상기 RNA의 5' UTR 내의 인트론 내에 도입하고 상기 인트론 내의 짧은 오픈 리딩 프레임이 택일적으로 스플라이싱된 RNA 내에서 가장 먼저 나타나도록 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하거나 이용하는 것이다.
RNA 분자는 분지된 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, TPP 리보스위치(실시예 1)에 있어서, TPP 농도가 낮은 경우, 새롭게 전사된 mRNA는 스플라이싱에서 이용가능한 분지 부위를 남기면서 제2의 5' 스플라이스 부위를 차단하는 구조를 채택한다. 제1의 5' 스플라이스 부위로부터의 전구-mRNA 스플라이싱은 I-3 형태의 mRNA의 생성 및 NMT1 단백질의 발현을 야기한다. TPP 농도가 높은 경우, TPP 앱타머와 리간드의 결합은 RNA 폴딩의 알로스테릭 변화가 5' 스플라이스 부위 근처에서 구조적 유연성을 증가시키고 분지 부위 근처에 있는 뉴클레오티드를 차단하게 한다.
스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P4 및 P5 줄기 내에 위치할 수 있다. 택일적 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역도 예를 들어, 루프 5 및 P2 줄기 내에서 발견될 수 있다. 스플라이스 부위는 예를 들어, 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -6 내지 -24의 위치에 존재할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 발현 플랫폼 도메인은 P4 및 P5 서열, 루프 5 서열 및/또는 P2 서열과 상호작용할 수 있다. 이러한 앱타머 서열은 일반적으로 유발 분자가 앱타머 도메인에 결합되지 않는 경우에만 발현 플랫폼 도메인과의 상호작용에 이용될 수 있다. 스플라이스 부위는 서열 GUA 다음에 위치할 수 있다. 실시예 1에는 리보스위치 상의 앱타머의 구체적 위치가 논의되어 있다.
많은 세균 리보스위치의 경우, 대사물질 결합은 단백질을 수반하지 않으면서 앱타머의 다운스트림에 위치한 발현 플랫폼의 폴딩을 변경시킨다(Winkler et al. (2002), Mironov et al. (2002), Serganov et al. (2006)). 택일적 스플라이싱을 조절하는 TPP 리보스위치에 있어서 이것을 평가하기 위해, NMT1 TPP 리보스위치에 의한 스플라이싱 조절이 앱타머 플랭킹 영역의 단백질-비의존적 구조적 조절로 인한 것인지를 확인하기 위한 시험을 실시하였다. NMT1 UTR 구축물에 대해 인-라인 프로빙을 수행하였다(Soukup & Breaker (1999)). 흥미롭게도, TPP의 첨가는 분지 부위에 있는 뉴클레오티드가 더 구조화되게 하고(도 10) 제2의 5' 스플라이스 부위에서 더 유연한 구조가 형성되게 한다(도 4a). 나아가, 앱타머의 P4 및 P5 요소의 12개 뉴클레오티드는 리간드가 존재하지 않는 경우 구조적으로 격리되어 있는 제2의 5' 스플라이스 부위에 있는 뉴클레오티드들의 대부분과 상보적임이 관찰되었다(도 4b). P4 및 P5 요소는 TPP의 피로포스페이트 잔기의 인식에 필요하므로, TPP 결합 및 5' 스플라이스 부위 차단은 상호적으로 배제된다(실시예 1).
천연 발생적 리보스위치 및 드 노보(de novo)로 디자인된 리보스위치를 포함하는 개시된 리보스위치(이의 유도체 및 재조합 형태를 포함함)는 일반적으로 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 리보스위치들은 이들이 택일적 스플라이싱을 조절하는 것으로 확인되기만 하면 개시된 본 방법에서 사용될 수 있다. 그러나, 다양한 종류의 리보스위치가 정의될 수 있고, 이러한 하위 종류들 중 일부는 특정 방법(일반적으로 본 명세서의 모든 곳에 기재되어 있음)에서 유용할 수 있다. 리보스위치의 종류에는 예를 들어, 천연 발생적 리보스위치, 천연 발생적 리보스위치의 유도체 및 변경된 형태, 키메라 리보스위치 및 재조합 리보스위치가 있다. 천연 발생적 리보스위치는 천연 상태로 발견되는 리보스위치의 서열을 갖는 리보스위치이다. 이러한 천연 발생적 리보스위치는 천연 상태로 발생되기 때문에 천연 발생적 리보스위치의 단리된 또는 재조합 형태일 수 있다. 즉, 리보스위치는 동일한 1차 구조를 가질 수 있되 새로운 유전적 면에서 또는 핵산 면에서 단리되어 있거나 개조되어 있을 수 있다. 키메라 리보스위치는 예를 들어, 임의의 클래스 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치 또는 특정 클래스 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치의 일부, 및 동일한 클래스 또는 종류의 리보스위치에 속하는 상이한 리보스위치 또는 임의의 상이한 클래스 또는 종류의 리보스위치에 속하는 상이한 리보스위치의 일부; 또는 임의의 클래스 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치 또는 특정 클래스 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치의 일부, 및 임의의 비-리보스위치 서열 또는 요소로 구성될 수 있다. 재조합 리보스위치는 새로운 유전적 면에서 또는 핵산 면에서 단리되어 있거나 개조되어 있는 리보스위치이다.
리보스위치는 단일 또는 다중 앱타머 도메인을 가질 수 있다. 다중 앱타머를 갖는 리보스위치 내의 앱타머 도메인들은 유발 분자의 상호협동적 결합을 보일 수 있거나 유발 분자의 상호협동적 결합을 보이지 않을 수 있다(즉, 앱타머들은 상호협동적 결합을 보일 필요가 없음). 엡타머 도메인들이 상호협동적 결합을 보이지 않는 경우, 앱타머 도메인들은 독립적 결합제인 것으로 지칭될 수 있다. 다중 앱터머를 갖는 리보스위치는 단일 또는 다중 발현 플랫폼 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, 유발 분자의 상호협동적 결합을 보이는 2개의 앱타머 도메인을 갖는 리보스위치는 상기 2개의 앱타머 도메인에 의해 조절되는 단일 발현 플랫폼 도메인에 연결될 수 있다. 다중 앱타머를 갖는 리보스위치는 링커를 통해 연결된 1개 이상의 앱타머를 가질 수 있다. 이러한 앱타머가 유발 분자의 상호협동적 결합을 보이는 경우, 링커는 상호협동적 링커일 수 있다.
앱타머 도메인들은 이들이 x와 x-1 사이에서 힐(Hill) 계수를 갖는 경우 상호협동적 결합을 보인다고 기재될 수 있고, 이때 x는 상호협동적 결합에 대해 분석될 앱타머 도메인의 수(또는 앱타머 도메인 상의 결합 부위의 수)이다. 따라서, 예를 들어, 2개의 앱타머 도메인(예컨대, 글리신-반응성 리보스위치)을 갖는 리보스위치는 이 리보스위치가 2와 1 사이의 힐 계수를 갖는 경우 상호협동적 결합을 보인다고 기재될 수 있다. 사용된 x의 값은 상호협동적 결합에 대해 분석될 앱타머의 수(그러나, 반드시 리보스위치 내에 존재하는 앱타머 도메인의 수는 아님)에 좌우됨을 이해해야 한다. 이것은 리보스위치가 다중 앱타머 도메인을 가질 수 있고, 이때 일부 앱타머 도메인들만이 상호협동적 결합을 보이기 때문인 것으로 이해된다.
본 명세서에는 이종 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함하는 키메라 리보스위치가 개시되어 있다. 즉, 키메라 리보스위치는 한 공급원으로부터 유래된 앱타머 도메인 및 또 다른 공급원으로부터 유래된 발현 플랫폼 도메인으로 구성될 수 있다. 이종 공급원은 예를 들어, 상이한 특정 리보스위치, 상이한 종류의 리보스위치 또는 상이한 클래스의 리보스위치일 수 있다. 또한, 이종 앱타머는 비-리보스위치 앱타머로부터 유래될 수 있다. 이종 발현 플랫폼 도메인은 비-리보스위치 공급원으로부터 유래될 수도 있다.
변경된 리보스위치 또는 유도체 리보스위치는 시험관내 선별 및 진화 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 리보스위치에 적용되는 시험관내 진화 기법은 리보스위치 서열의 일부가 변경되어 있지만 리보스위치의 나머지 부분이 변경되지 않은 상태로 유지되어 있는 변이체 리보스위치 세트를 제조하는 단계를 포함한다. 그 다음, 변이체 리보스위치 세트의 활성화, 불활성화 또는 차단(또는 다른 기능적 또는 구조적 기준)을 평가할 수 있고, 원하는 기준을 충족시키는 변이체 리보스위치를 사용 또는 추가 진화 순환을 위해 선별할 수 있다. 변이체의 발생에 유용한 염기 리보스위치는 본 명세서에 개시된 특정 또는 컨센서스 리보스위치이다. 컨센서스 리보스위치는 시험관내 선별 및 진화를 위해 리보스위치의 어느 부분을 변경시켜야 할지를 알아내는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에는 조절이 변화된 변경된 리보스위치도 개시되어 있다. 리보스위치의 조절은 앱타머 도메인을 리보스위치(키메라 리보스위치)의 발현 플랫폼에 작동가능하게 연결함으로써 변경시킬 수 있다. 이어서, 앱타머 도메인은 예를 들어, 상기 앱타머 도메인의 유발 분자의 작용을 통해 리보스위치의 조절을 매개할 수 있다. 앱타머 도메인은 예를 들어, 리보스위치의 정상 또는 천연 앱타머 도메인을 신규 앱타머 도메인으로 치환시키는 방법을 포함하는 임의의 적당한 방법으로 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인에 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 앱타머 도메인의 출처인 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 임의의 화합물 또는 조건은 키메라 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에는 불활성화된 리보스위치도 개시되어 있다. 리보스위치는 리보스위치를 공유결합적으로 변경시킴으로써(예를 들어, 리보스위치의 일부를 가교결합시키거나 화합물을 리보스위치에 커플링시킴으로써) 불활성화시킬 수 있다. 이러한 방식의 리보스위치 불활성화는 예를 들어, 유발 분자가 리보스위치에 결합하는 것을 방해하거나, 유발 분자의 결합 시 리보스위치의 상태 변화를 방해하거나, 또는 유발 분자의 결합 시 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인이 발현에 영향을 미치는 것을 방해하는 변경으로부터 비롯될 수 있다.
또한, 본 명세서에는 바이오센서 리보스위치가 개시되어 있다. 바이오센서 리보스위치는 그의 동족 유발 분자의 존재 하에서 검출가능한 신호를 발생시키는 개조된 리보스위치이다. 유용한 바이오센서 리보스위치는 유발 분자의 역치 수준 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 리보스위치는 생체내 또는 시험관내에서 사용되도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 신호로서 작용하는 단백질 또는 신호를 발생시키는 데 관여하는 단백질을 코딩하는 레포터 RNA에 작동가능하게 연결된 바이오센서 리보스위치는 리보스위치/레포터를 코딩하는 핵산 구축물을 보유하도록 세포 또는 유기체를 개조함으로써 생체 내에서 사용할 수 있다. 시험관내에서 사용되는 바이오센서 리보스위치의 일례는 리보스위치의 활성화 상태에 의존하는 변화를 표시하는 신호인 구조-의존적 표지를 포함하는 리보스위치이다. 이러한 바이오센서 리보스위치는 바람직하게는 천연 발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연 발생적 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다. 바이오센서 리보스위치는 다양한 상황 및 플랫폼에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이오센서 리보스위치는 고체 지지체, 예컨대, 플레이트, 칩, 스트립 및 웰과 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에는 새로운 유발 분자를 인식하는 변경된 리보스위치 또는 유도체 리보스위치가 개시되어 있다. 새로운 유발 분자를 인식하는 새로운 리보스위치 및/또는 새로운 앱타머는 공지된 리보스위치에 대해 선별될 수 있거나, 공지된 리보스위치로부터 디자인될 수 있거나, 또는 공지된 리보스위치로부터 유도될 수 있다. 이것은 예를 들어, 리보스위치 내의 앱타머 변이체 세트를 생성하는 단계, 원하는 화합물의 존재 하에서 변이체 리보스위치의 활성화를 평가하는 단계, 활성화된 변이체 리보스위치(또는, 예를 들어, 가장 고도로 또는 가장 선별적으로 활성화된 리보스위치)를 선별하는 단계, 및 원하는 활성, 특이성, 활성과 특이성의 조합 또는 성질들의 다른 조합을 갖는 변이체 스위치를 수득할 때까지 상기 단계들을 반복하는 단계에 의해 달성될 수 있다.
일반적으로, 임의의 앱타머 도메인은 발현 플랫폼 도메인 내의 조절된 가닥이 앱타머 도메인의 대조군 가닥에 상보적이도록 설계하거나 개조함으로써 임의의 발현 플랫폼 도메인과 함께 사용되도록 개조될 수 있다. 별법으로, 앱타머의 서열 및 앱타머 도메인의 대조군 가닥의 서열은 상기 대조군 가닥이 발현 플랫폼 내의 기능적으로 유의한 서열에 상보적이도록 개조될 수 있다.
본 명세서에는 이종 리보스위치 및 코딩 영역을 포함하는 RNA 분자도 개시되어 있다. 즉, 상기 RNA 분자는 한 공급원으로부터의 리보스위치 및 또 다른 공급원으로부터의 코딩 영역으로 구성된다. 상기 이종 공급원은 예를 들어, 상이한 RNA 분자, 상이한 전사체, 상이한 유전자로부터의 RNA 또는 전사체, 상이한 세포로부터의 RNA 또는 전사체, 상이한 유기체로부터의 RNA 또는 전사체, 상이한 종으로부터의 RNA 또는 전사체, 천연 서열 및 인공 또는 개조된 서열, 특정 리보스위치, 상이한 종류의 리보스위치 또는 상이한 클래스의 리보스위치일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "코딩 영역"은 아미노산을 코딩하는 핵산의 임의의 영역을 지칭한다. 이것은 코돈 또는 코돈에 대한 주형을 포함하는 핵산 가닥, 이중가닥 핵산 분자의 경우 상기 핵산 가닥의 상보체 둘다를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 아닌 핵산의 영역은 비-코딩 영역으로 지칭될 수 있다. 전형적으로 전사되는 메신저 RNA 분자는 5' 말단 및 3' 말단 둘다에서 비-코딩 영역을 포함한다. 진핵 mRNA 분자는 내부 비-코딩 영역, 예컨대, 인트론도 포함할 수 있다. 특정 종류의 RNA 분자는 기능성 코딩 영역, 예컨대, tRNA 및 rRNA 분자를 포함하지 않는다.
1. 앱타머 도메인
앱타머는 특정 화합물 및 특정 클래스의 화합물에 선별적으로 결합할 수 있는 핵산 분절 및 구조체이다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 시 상기 리보스위치의 상태 또는 구조를 변화시키는 앱타머 도메인을 갖는다. 기능적 리보스위치에서, 앱타머 도메인에 연결된 발현 플랫폼 도메인의 상태 또는 구조는 유발 분자가 상기 앱타머 도메인에 결합할 때 변한다. 리보스위치의 앱타머 도메인은 예를 들어, 리보스위치의 천연 앱타머 도메인, 인공 앱타머, 개조된, 선별된, 진화된 또는 유도된 앱타머 또는 앱타머 도메인을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 리보스위치 내의 앱타머는 일반적으로 예컨대, 줄기 구조를 형성함으로써 상기 연결된 발현 플랫폼 도메인의 일부와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 부분을 갖는다. 상기 줄기 구조는 유발 분자의 결합 시 형성되거나 파괴될 것이다.
다양한 천연 리보스위치의 컨센서스 앱타머 도메인은 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 도 11 및 본 명세서의 임의의 부분에 나타나 있다. 상기 앱타머 도메인(이의 모든 직접적인 변이체를 포함함)은 리보스위치 내에서 사용될 수 있다. 컨센서스 서열 및 구조는 서열 및 구조 내의 변경을 표시한다. 표시된 변경 내에 있는 앱타머 도메인은 본 명세서에서 직접적 변이체로서 지칭된다. 상기 앱타머 도메인은 변경된 또는 변이체 앱타머 도메인을 생성하도록 변경될 수 있다. 보존적 변경은 염기쌍 내의 뉴클레오티드가 상보적인 상태를 유지하도록 염기쌍이 형성된 뉴클레오티드에서의 임의의 변화를 포함한다. 중등도(moderate) 변경은 표시된 길이 범위의 20% 이하의 줄기 또는 루프(이에 대한 길이 또는 길이 범위는 표시되어 있음) 길이의 변화를 포함한다. 루프 및 줄기 길이는 컨센서스 구조가 특정 길이의 줄기 또는 루프를 보여주는 경우 또는 길이 범위가 기재되어 있거나 표시되어 있는 경우 "표시된" 것으로 간주된다. 중등도 변경은 표시된 길이 범위의 40% 이하의 줄기 또는 루프(이에 대한 길이 또는 길이 범위는 표시되어 있지 않음) 길이의 변화를 포함한다. 중등도 변경은 앱타머 도메인의 비-특정된 부분의 기능적 변이체도 포함한다.
개시된 리보스위치의 앱타머 도메인은 임의의 다른 목적을 위해 사용될 수도 있고 임의의 다른 내용에서 앱타머로서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 앱타머는 구조 변화가 RNA의 기능에 영향을 미칠 수 있는 경우 라이보자임, 다른 분자 스위치 및 임의의 RNA 분자를 조절하는 데 사용될 수 있다.
2. 발현 플랫폼 도메인
발현 플랫폼 도메인은 리보스위치를 포함하는 RNA 분자의 발현에 영향을 미치는 리보스위치의 일부이다. 발현 플랫폼 도메인은 일반적으로, 예컨대, 줄기 구조를 형성함으로써 그 자신에 연결된 앱타머 도메인의 일부와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 부위를 갖는다. 이 줄기 구조는 유발 분자의 결합 시 형성되거나 파괴될 것이다. 상기 줄기 구조는 일반적으로 발현 조절 구조이거나 발현 조절 구조의 형성을 방해한다. 발현 조절 구조는 상기 구조를 보유하는 RNA 분자의 발현을 허용하거나, 방해하거나, 상승시키거나 또는 억제하는 구조이다. 그 예로는 샤인-달가노 서열, 개시 코돈, 전사 종결요소, 안정성 신호, 및 프로세싱 신호, 예컨대, RNA 스플라이싱 접합부 및 조절 요소가 있다. 스플라이싱 조절의 경우, 스플라이스 접합부, 택일적 스플라이스 접합부, 및/또는 발현 플랫폼 도메인 내의 인트론의 분지 부위를 포함하는 것이 유용하다. 상기 발현 플랫폼 도메인과 리보스위치의 앱타머 도메인 내의 서열의 상호작용은 발현 플랫폼 도메인과 앱타머 도메인 사이의 상보적 서열에 의해 매개될 수 있다.
B. 유발 분자
유발 분자는 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 분자 및 화합물이다. 이것은 리보스위치에 대한 천연 또는 통상의 유발 분자 및 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 다른 화합물을 포함한다. 천연 또는 통상의 유발 분자는 천연 상태의 소정의 리보스위치에 대한 유발 분자이거나, 또는 일부 비-천연 리보스위치의 경우 리보스위치의 디자인 또는 리보스위치의 선별(예컨대, 시험관내 선별 또는 시험관내 진화 기법에 의한 선별)에서 사용되는 유발 분자이다.
C. 화합물
본 명세서에는 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 화합물, 및 상기 화합물을 함유하는 조성물도 개시되어 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 화합물은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 데 사용될 수 있다. 리보스위치에 대한 유발 분자(및 다른 활성화 화합물)는 리보스위치를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 상기 유발 분자 이외의 화합물은 일반적으로 리보스위치를 불활성화시키거나 차단하는 데 사용될 수 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치의 존재 하에서 유발 분자를 제거함에 의해 불활성화될 수도 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키지 않는 유발 분자의 유사체의 결합에 의해 차단될 수 있다.
본 명세서에는 RNA 분자의 발현 또는 RNA 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 변경하는 화합물도 개시되어 있는데, 이때 상기 RNA 분자는 리보스위치를 포함한다. 이것은 화합물을 RNA 분자와 접촉시켜 달성할 수 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 따라서, 리보스위치를 포함하는 원하는 RNA 분자를 상기 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 조건으로 처리함으로써 RNA의 발현을 변경할 수 있다. 발현은 예를 들어, 전사의 종결 또는 라이보좀과 RNA의 결합 차단의 결과로서 변경될 수 있다. 유발 분자의 결합은 리보스위치의 성질에 따라 RNA 분자의 발현을 감소시키거나 방해하거나, 또는 RNA 분자의 발현을 촉진하거나 증가시킬 수 있다. 본 명세서에는 RNA 분자의 발현, 또는 RNA 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 화합물도 개시되어 있다. 또한, 본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단함으로써 리보스위치를 함유하는 천연 발생적 유전자 또는 RNA의 발현을 조절하는 화합물이 개시되어 있다. 상기 유전자가 이 유전자를 보유하는 세포 또는 유기체의 생존에 필수적인 경우, 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단은 상기 세포 또는 유기체의 사망, 생장 정지 또는 약화를 초래할 수 있다.
본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단함으로써 상기 리보스위치를 포함하는 단리된, 개조된 또는 재조합 유전자 또는 RNA의 발현을 조절하는 화합물도 개시되어 있다. 본 명세서에 개시된 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 조절하기 때문에, 상기 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단은 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 이러한 조절을 위한 1차 조절로서의 리보스위치의 이점은 리보스위치 유발 분자가 작은 비-항원성 분자일 수 있다는 점이다.
본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하는 방법도 개시되어 있다. 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키는 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고 리보스위치의 활성화를 평가함으로써 동정할 수 있다. 리보스위치가 활성화되는 경우, 시험 화합물은 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정된다. 리보스위치의 활성화는 임의의 적절한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 리보스위치는 레포터 RNA에 연결될 수 있고, 상기 레포터 RNA의 발현, 발현 수준 또는 발현 수준 변화가 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 측정될 수 있다. 또 다른 예로서, 리보스위치는 리보스위치의 활성화 상태에 의존하는 변화를 표시하는 신호인 구조-의존적 표지를 포함할 수 있다. 이러한 리보스위치는 바람직하게는 천연 발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연 발생적 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 리보스위치의 활성화 평가는 대조군 분석 또는 측정을 이용하거나 이용하지 않고 수행할 수 있다. 리보스위치를 불활성화시키는 화합물의 동정 방법은 유사한 방식으로 수행할 수 있다. 리보스위치를 차단하는 화합물의 동정은 임의의 적절한 방식으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 분석은 리보스위치를 활성화시키거나 불활성화시키는 것으로 공지되어 있는 화합물의 존재 및 시험 화합물의 존재 하에서 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 평가하기 위해 수행할 수 있다. 활성화 또는 불활성화가 시험 화합물의 부재 하에서 관찰되는 것처럼 관찰되지 않는 경우, 시험 화합물은 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 차단하는 화합물로서 동정된다.
본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하고 동정된 화합물을 제조함으로써 수득된 화합물도 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서의 임의의 부분에 개시되어 있는 화합물 동정 방법을 동정된 화합물의 제조 방법과 조합함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고, 리보스위치의 활성화를 평가하고, 리보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화되는 경우, 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득할 수 있다.
또한, 본 명세서에는 화합물에 의한 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단을 조사하고 조사된 화합물을 제조함으로써 수득한 화합물도 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서의 임의의 부분에 개시된 화합물 활성화, 불활성화 또는 차단 평가 방법과 조사된 화합물의 제조 방법을 조합함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고, 리보스위치의 활성화를 평가하고, 리보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화되는 경우, 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득할 수 있다. 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물의 능력에 대해 화합물을 조사하는 것은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이전에 공지되지 않은 화합물을 동정하는 것, 및 화합물이 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이미 공지되어 있는 경우 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단화하는 화합물의 능력을 평가하는 것 둘다를 의미한다.
본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키는 데 사용될 수 있는 구체적인 화합물들도 개시되어 있다. TPP-반응성 리보스위치에서 유용한 화합물은 TPP-반응성 리보스위치 또는 이의 유도체에 결합할 수 있는 하기 화학식 I의 화합물을 포함한다:
Figure 112009064380127-PCT00001
상기 식에서,
R1은 양으로 하전되어 있고,
R2 및 R3은 서로 독립적으로 C, O 또는 S이고,
R4는 CH3, NH2, OH, SH 또는 H이거나 존재하지 않고,
R5는 CH3, NH2, OH, SH 또는 H이고,
R6은 C 또는 N이며,
Figure 112009064380127-PCT00002
은 서로 독립적으로 단일 또는 이중 결합을 표시한다. R1이 포스페이트, 다이포스페이트 또는 트라이포스페이트인 상기 정의된 화합물도 고려된다.
상기 정의 내에 있는 모든 화합물은 본 명세서에 구체적으로 개시되고 본 명세서에 구체적으로 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 또한, 상기 정의 내에서 확인될 수 있는 모든 하위군은 본 명세서에 구체적으로 개시되고 본 명세서에 구체적으로 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 임의의 화합물 또는 화합물의 하위군은 화합물의 사용에 구체적으로 포함될 수 있거나 사용으로부터 배제될 수 있거나, 또는 화합물의 목록에 포함될 수 있거나 화합물의 목록으로부터 배제될 수 있다. 예를 들어, 한 방법으로서 일군의 화합물은 각 화합물이 상기 정의된 바와 갖되 TPP, TP 또는 티아민이 아닌 경우 고려된다. 또 다른 예로서, 일군의 화합물은 각 화합물이 상기 정의된 바와 같고 TPP-반응성 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 경우 고려된다. TPP는 TPP-반응성 리보스위치용 유발 분자이고 TPP-반응성 리보스위치를 활성화시킬 수 있다. 피리티아민 피로포스페이트는 TPP-반응성 리보스위치를 활성화시킬 수 있다. 피리티아민 및 피리티아민 피로포스페이트는 본 명세서에 개시된 화합물, 유발 분자 및 방법에 독립적으로 및 구체적으로 포함될 수 있거나 본 명세서에 개시된 화합물, 유발 분자 및 방법으로부터 독립적으로 및 구체적으로 배제될 수 있다.
D. 구축물, 벡터 및 발현 시스템
개시된 리보스위치는 임의의 적절한 발현 시스템과 함께 사용될 수 있다. 재조합 발현은 벡터, 예컨대, 플라스미드를 사용하여 유용하게 달성한다. 상기 벡터는 발현될 리보스위치-코딩 서열 및 RNA(예컨대, 단백질 코딩 RNA)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 전사 및 번역에 필요한 다른 요소들도 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 벡터는 외래 DNA를 코딩하는 임의의 운반체를 지칭한다. 따라서, 벡터는 외래 핵산을 분해 없이 세포 내로 수송하는 물질이고 핵산이 전달되는 세포 내에서 핵산을 발현시키는 프로모터를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 핵산, 바이러스, 파지 핵산, 파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 리보스위치-조절된 구축물을 운반하기에 적합한 다양한 원핵 발현 벡터 및 진핵 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 예를 들어, pET, pET3d, pCR2.1, pBAD, pUC 및 효모 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 예를 들어, 다양한 생체내 및 시험관내 조건 하에서 사용될 수 있다.
바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 향신경성 바이러스, 신드비스(Sindbis) 및 다른 RNA 바이러스(HIV 골격을 갖는 바이러스를 포함함)를 포함한다. 벡터로서 사용되기에 적합하게 만드는 바이러스의 성질을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리도 유용하다. 버마(Verma)(1995)에 기재된 레트로바이러스 벡터는 뮤린 말로니 백혈병 바이러스(MMLV), 및 벡터로서의 MMLV의 바람직한 성질을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비-구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 캡시드화에 필수적인 도립된 말단 반복부, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 조절하는 프로모터를 함유한다. 바이러스가 벡터로서 개조된 경우, 전형적으로 바이러스의 초기 유전자들 중 1가지 이상은 제거되고, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈 내로 삽입된다.
"프로모터"는 일반적으로 전사 개시 부위에 대해 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. "프로모터"는 RNA 중합효소 및 전사 인자의 기본 상호작용에 필요한 핵심 요소를 함유하고 업스트림 요소 및 반응 요소를 함유할 수 있다.
"인핸서"는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 기능 하는 DNA의 서열을 의미하고 전사 유니트에 대해 5'(Laimins, 1981) 또는 3'(Lusky et al., 1983) 방향에 존재할 수 있다. 나아가, 인핸서는 인트론 내에 존재할 수 있을 뿐만 아니라(Banerji et al., 1983) 코딩 서열 자체 내에도 존재할 수 있다(Osborne et al., 1984). 인핸서의 길이는 통상 10 내지 300 bp이고, 인핸서는 시스(cis)로 작용한다. 인핸서는 근처에 있는 프로모터로부터의 전사를 증가시키는 작용을 한다. 프로모터처럼 인핸서도 종종 전사 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 종종 발현의 조절을 결정한다.
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사 종결에 필요한 서열을 함유할 수도 있다. 이 영역은 조직 인자 단백질을 코딩하는 mRNA의 비-번역 부분 내에 있는 폴리아데닐화된 분절로서 전사된다. 3' 비-번역 영역은 전사 종결 부위도 포함한다. 전사 유니트는 폴리아데닐화 영역도 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 이점은 상기 영역이, 전사되는 유니트가 mRNA처럼 프로세싱되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 점이다. 발현 구축물 내의 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용은 잘 확립되어 있다. 트랜스진 구축물 내의 동종 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것이 바람직하다.
벡터는 마커 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포로 전달되고 일단 전달되면 발현되는지를 확인하는 데 사용된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 에스케리치아 콜라이 lacZ 유전자이다.
일부 실시양태에서, 마커는 선별가능한 마커일 수 있다. 이러한 선별가능한 마커가 숙주 세포 내로 성공적으로 전달된 경우, 형질전환된 숙주 세포는 선별 압력 하에 놓였을 때 생존할 수 있다. 널리 이용되는 2가지 상이한 선별 방법이 있다. 첫 번째 방법은 세포 대사, 및 보충된 배지와 무관하게 생장하는 능력을 결여하는 돌연변이체 세포주의 사용에 기초한 방법이다. 두 번째 방법은 임의의 세포 종류에서 이용되며 돌연변이체 세포주의 사용을 필요로 하지 않는 선별 방법을 의미하는 우성 선별이다. 상기 방법은 전형적으로 숙주 세포의 생장을 정지시키기 위한 약물을 사용한다. 신규 유전자를 갖는 세포는 약물 내성을 전달하는 단백질을 발현할 것이고 선별에서 생존할 것이다. 상기 우성 선별의 예는 네오마이신(Southern and Berg, 1982), 마이코페놀산(Mulligan and Berg, 1980) 또는 하이그로마이신(Sugden et al., 1985)을 사용한다.
유전자 전달은 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 유전 물질의 직접적인 전달, 또는 세포 또는 담체, 예컨대, 양이온성 리포좀 내의 유전 물질의 전달을 통해 달성될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있도록 용이하게 개조될 수 있다. 전달 벡터는 유전자를 세포 내로 전달하는 데 사용되는 임의의 뉴클레오티드 구축물(예컨대, 플라스미드)일 수 있거나, 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적 수단의 일부, 예컨대, 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 일부일 수 있다(Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)). 바이러스 벡터, 화학적 형질감염체, 또는 물리-기계적 방법, 예컨대, 전기천공 및 DNA의 직접적 확산을 비롯한, 형질감염에 적합한 수단은 예를 들어, 문헌(Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); and Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991))에 기재되어 있다.
1. 바이러스 벡터
바람직한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 향신경성 바이러스, 신드비스 및 다른 RNA 바이러스(HIV 골격을 갖는 바이러스를 포함함)이다. 벡터로서 사용되기에 적합하게 만드는 바이러스의 성질을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리도 바람직하다. 바람직한 레트로바이러스는 MMLV, 및 벡터로서의 MMLV의 바람직한 성질을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 큰 유전적 적재물, 즉 트랜스진 또는 마커 유전자를 운반할 수 있고 이러한 이유로 통상적으로 사용되는 벡터이다. 그러나, 레트로바이러스 벡터는 비-증식 세포에서는 유용하지 않다. 아데노바이러스 벡터는 비교적 안정하고 다루기 용이하며 높은 역가를 갖고 에어로졸 제제로 전달될 수 있고 비-분열 세포를 형질감염시킬 수 있다. 폭스 바이러스 벡터는 유전자를 삽입하기 위한 여러 부위를갖기 때문에 열적안정성을 나타내며 실온에서 저장될 수 있다. 바람직한 실시양태는 바이러스 항원에 의해 유발되는 숙주 유기체의 면역 반응을 억제하도록 개조된 바이러스 벡터이다. 이러한 종류의 바람직한 벡터는 인터루킨 8 또는 10에 대한 코딩 영역을 운반할 것이다.
바이러스 벡터는 유전자를 세포 내로 도입하는 대부분의 화학적 또는 물리적 방법보다 더 높은 처리능력(유전자 도입 능력)을 갖는다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비-구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 캡시드화에 필요한 도립된 말단 반복부, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 조절하는 프로모터를 함유한다. 바이러스가 벡터로서 개조된 경우, 전형적으로 바이러스의 초기 유전자들 중 1가지 이상의 초기 유전자가 제거되어 있고 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈 내로 삽입되어 있다. 이러한 종류의 구축물은 약 8 kb 이하의 외래 유전 물질을 운반할 수 있다. 제거된 초기 유전자의 필수적 기능은 전형적으로 상기 초기 유전자의 유전자 생성물을 트랜스(trans)로 발현하도록 개조된 세포주에 의해 공급된다.
i. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 임의의 종류, 하위패밀리, 속 또는 주성을 비롯한 레트로비리대의 바이러스 패밀리에 속하는 동물 바이러스이다. 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌(Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985))에 기재되어 있다. 유전자 요법을 위해 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법의 예는 그 교시가 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,868,116호 및 제4,980,286호, 국제특허출원 공개 제WO 90/02806호 및 제WO 89/07136호, 및 문헌(Mulligan, Science 260:926-932 (1993))에 기재되어 있다.
레트로바이러스는 본질적으로 핵산 적재물로 채워진 팩키지이다. 핵산 적재물은 복제된 딸분자가 팩키지 코트 내에 효율적으로 팩키징되게 하는 팩키징 신호 를 보유한다. 팩키징 신호 이외에, 복제 및 복제된 바이러스의 팩키징을 위해 시스로 요구되는 다수의 분자가 존재한다. 전형적으로, 레트로바이러스 게놈은 단백질 코트의 제조에 관여하는 gag, pol 및 env 유전자를 함유한다. 표적 세포로 전달되는 외래 DNA에 의해 전형적으로 치환되는 유전자는 gag, pol 및 env 유전자이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 팩키지 코트 내로의 도입을 위한 팩키징 신호; gag 전사 유니트의 시작 부위임을 알려주는 서열; 역전사의 tRNA 프라이머와 결합하는 프라이머 결합 부위를 포함하는 역전사에 필요한 요소; DNA 합성 과정 동안에 RNA 가닥의 전환을 안내하는 말단 반복부 서열; DNA 합성의 제2 가닥의 합성을 위한 프라이밍 부위로서 작용하는 5' 방향으로부터 3' 방향으로의 퓨린 풍부 서열 LTR; 및 DNA 상태의 레트로바이러스가 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있게 하는, LTR의 말단 근처에 있는 특정 서열을 함유한다. gag, pol 및 env 유전자의 제거는 약 8 kb의 외래 서열이 바이러스 게놈 내로 삽입되어 역전사될 수 있게 하고 복제 시 새로운 레트로바이러스 입자 내로 팩키징될 수 있게 한다. 이러한 양의 핵산은 각 전사체의 크기에 따라 1개 유전자 내지 많은 수의 유전자의 전달에 충분하다. 다른 유전자들과 함께 양성 또는 음성 선별가능한 마커를 삽입체 내에 포함시키는 것이 바람직하다.
대부분의 레트로바이러스 벡터 내의 복제 기구 및 팩키징 단백질(gag, pol 및 env)은 제거되어 있기 때문에, 벡터는 전형적으로 상기 벡터를 팩키징 세포주 내에 도입함으로써 발생시킨다. 팩키징 세포주는 복제 및 팩키징 기구를 함유하나 임의의 팩키징 신호를 갖지 않은 레트로바이러스로 형질감염되거나 형질전환된 세 포주이다. 선택된 DNA를 운반하는 벡터가 상기 세포주 내로 형질감염되는 경우, 원하는 유전자를 함유하는 벡터는 헬퍼 세포에 의해 시스로 제공된 기구에 의해 복제되어 새로운 레트로바이러스 입자 내로 팩키징된다. 상기 기구에 대한 게놈은 상기 게놈이 필수적인 신호를 결여하고 있기 때문에 팩키징되지 않는다.
ii. 아데노바이러스 벡터
복제-결손 아데노바이러스의 구축은 문헌(Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 51:261-21 A (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993))에 기재되어 있다. 벡터로서의 상기 바이러스 사용의 이점은 상기 바이러스가 초기 감염된 세포 내에서 복제할 수 있되 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없기 때문에 다른 세포 종류로 퍼질 수 있는 정도에 있어서 한계가 있다는 점이다. 재조합 아데노바이러스는 기도 상피, 간세포, 혈관 상피, 중추신경계(CNS) 실질조직 및 다수의 다른 조직 부위로의 직접적인 생체내 전달 후 고효율 유전자 전달을 달성하는 것으로 밝혀져 있다(Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). 재조합 아데노바이러스는 이 바이러스가 특정 세포 표면 수용체에 결합한 후 상기 바이러스가 야생형 또는 동일한 방식 또는 복제-결손 아데노바이러스와 동일한 방식으로 수용체-매개된 세포내이입에 의해 내부이입됨으로써 유전자 형질도입을 달성한다(Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).
바람직한 바이러스 벡터는 E1 유전자가 제거되어 있는 아데노바이러스를 기초로 한 바이러스 벡터이고, 이 비리온은 인간 293 세포주와 같은 세포주 내에서 발생된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, E1 유전자 및 E3 유전자 둘다 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다.
바이러스 벡터의 또 다른 종류는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 기초로 한 것이다. 이 결손 파보바이러스는 이것이 많은 종류의 세포를 감염시킬 수 있고 인간에 대해 비-병원성을 나타내기 때문에 바람직한 벡터이다. AAV 타입 벡터는 약 4 내지 5 kb를 수송할 수 있고, 야생형 AAV는 19번 염색체 내로 안정하게 삽입되는 것으로 공지되어 있다. 이 부위 특이적 삽입 성질을 갖는 벡터가 바람직하다. 이 러한 종류의 벡터의 특히 바람직한 실시양태는 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코에 소재하는 아비겐(Avigen)에 의해 제조된 P4.1 C 벡터인데, 이 벡터는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 유전자인 HSV-tk 및/또는 마커 유전자, 예컨대, 녹색 형광 단백질인 GFP를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있다.
바이러스 및 레트로바이러스 내에 삽입된 유전자는 통상 프로모터, 및/또는 원하는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 데 도움을 주는 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 개시 부위에 대해 상대적으로 고정된 위치에 존재하는 경우 작용하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소와 전사 인자의 기본 상호작용에 필요한 코어 요소를 함유하고 업스트림 요소 및 반응 요소를 함유할 수 있다.
2. 바이러스 프로모터 및 인핸서
포유동물 숙주 세포 내에서 벡터로부터의 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들어, 폴리오마, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득될 수 있거나, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터로부터 수득될 수 있다. SV40 바이러스의 초기 프로모터 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다(Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다(Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). 물론, 숙주 세포 또는 관련된 종으로부터 유래된 프로모터도 본원에서 유용하다.
인핸서는, 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 작용하고 전사 유니트에 대해 5' 방향(Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) 또는 3' 방향(Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983))으로 존재할 수 있는 DNA의 서열을 의미한다. 나아가, 인핸서는 한 인트론 내에 존재할 수 있을 뿐만 아니라(Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)) 코딩 서열 자체 내에서도 존재할 수 있다(Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)). 인핸서의 길이는 통상 10 내지 300 bp이고 인핸서는 시스로 작용한다. 인핸서는 근처에 있는 프로모터로부터의 전사를 증가시키는 작용을 한다. 또한, 인핸서는 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 종종 함유한다. 프로모터 또한 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 함유할 수 있다. 인핸서는 종종 유전자의 발현의 조절을 결정한다. 현재 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있지만, 전형적으로 진핵 세포 바이러스로부터 유래된 인핸서가 사용될 것이다. 바람직한 예는 복제 기점의 후측 상에 존재하는 SV40 인핸서(100 내지 270 bp), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후측 상에 존재하는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서이다.
프로모터 및/또는 인핸서는 이들의 작용을 유발하는 광 또는 특정 화학적 사건에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 조사, 예컨대, 감마 조사 또는 알킬화 화학 요법 약물에의 노출을 통해 바이러스 벡터 유전자 발현을 상승시키는 방법도 있다.
프로모터 및/또는 인핸서 영역은 모든 종류의 진핵 세포에서 활성을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 종류의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터(650개 염기)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(전장 프로모터) 및 레트로바이러스 벡터 LTF이다.
모든 특이적 조절 요소가 클로닝되어 특정 종류의 세포, 예컨대, 흑색종 세포 내에서 선별적으로 발현되는 발현 벡터를 구축하는 데 사용될 수 있다. 신경교원섬유 산 단백질(GEAP) 프로모터가 신경교원 유래의 세포 내에서 유전자를 선별적으로 발현하는 데 사용되어 왔다.
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사 종결에 필요한 서열도 함유할 수 있다. 이 영역은 조직 인자 단백질을 코딩하는 mRNA의 비-번역 부위 내에 있는 폴리아데닐화된 분절로서 전사된다. 3' 비-번역 영역은 전사 종결 부위도 포함한다. 전사 유니트는 폴리아데닐화 영역도 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 이점은 상기 영역이, 전사되는 유니트가 mRNA처럼 프로세싱되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 점이다. 발현 구축물 내의 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용은 잘 확립되어 있다. 트랜스진 구축물 내의 동종 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것이 바람직하다. 전사 유니트의 바람직한 실시양태에서, 폴리아데닐화 영역은 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유래되고 약 400개의 염기로 구성된다. 또 한, 전사된 유니트는 다른 표준 서열만을 함유하거나 상기 서열과 함께 구축물의 발현 또는 안정성을 개선시키는 것이 바람직하다.
3. 마커
벡터는 마커 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포로 전달되고 일단 전달되면 발현되는지를 확인하는 데 사용된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 에스케리치아 콜라이 lacZ 유전자이다.
일부 실시양태에서, 마커는 선별가능한 마커일 수 있다. 포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 하이그로마이신 및 퓨로마이신이다. 이러한 선별가능한 마커가 포유동물 숙주 세포 내로 성공적으로 전달된 경우, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선별 압력 하에 놓였을 때 생존할 수 있다. 널리 이용되는 2가지 상이한 선별 방법이 있다. 첫 번째 방법은 세포 대사, 및 보충된 배지와 무관하게 생장하는 능력을 결여하는 돌연변이체 세포주의 사용에 기초한 방법이다. 이의 두 가지 예는 CHO DHFR- 세포 및 마우스 LTK- 세포이다. 상기 세포들은 티미딘 또는 하이포잔틴과 같은 영양분을 첨가하지 않은 상태에서 생장하는 능력을 결여하고 있다. 상기 세포들이 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필수적인 일부 유전자를 결여하고 있기 때문에, 상기 세포들은 빠진 뉴클레오티드가 보충된 배지 중에 제공되어 있지 않은 한 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 다른 방법은 완전한 DHFR 또는 TK 유전자를 이 유전자가 결여된 세포 내로 도입하여 상기 세포의 생장 요건을 변경하는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 개개의 세포는 비-보충된 배지 중에서 생존할 수 없을 것이다.
두 번째 방법은 임의의 세포 종류에서 이용되며 돌연변이체 세포주의 사용을 필요로 하지 않는 선별 방법을 의미하는 우성 선별이다. 이 방법은 전형적으로 숙주 세포의 생장을 정지시키기 위한 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 갖는 세포는 약물 내성을 전달하는 단백질을 발현할 것이고 선별에서 생존할 것이다. 상기 우성 선별의 예는 네오마이신(Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1 : 327 (1982)), 마이코페놀산(Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) 또는 하이그로마이신(Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))을 사용한다. 이 3가지 예는 적절한 약물인 G418 또는 네오마이신(제네티신), xgpt(마이코페놀산) 또는 하이그로마이신에 대한 내성을 전달하기 위해 진핵 조절 하에서 세균 유전자를 사용한다. 다른 예로는 네오마이신 유사체인 G418 및 퓨로마이신이 있다.
E. 바이오센서 리보스위치
또한, 본 명세서에는 바이오센서 리보스위치가 개시되어 있다. 바이오센서 리보스위치는 그의 동족 유발 분자의 존재 하에서 검출가능한 신호를 발생시키는 개조된 리보스위치이다. 유용한 바이오센서 리보스위치는 유발 분자의 역치 수준 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 리보스위치는 생체내에서 또는 시험관내에서 사용되도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절하는 바이 오센서 리보스위치는 신호로서 작용하는 단백질 또는 신호를 발생시키는 데 관여하는 단백질을 코딩하는 레포터 RNA에 작동가능하게 연결될 수 있고 상기 리보스위치를 코딩하는 핵산 구축물을 보유하도록 세포 또는 유기체를 개조함으로써 생체내에서 사용될 수 있다. 시험관내에서 사용되는 바이오센서 리보스위치의 일례는 리보스위치의 활성화 상태에 의존하는 변화를 표시하는 신호인 구조-의존적 표지를 포함하는 리보스위치이다. 이러한 바이오센서 리보스위치는 바람직하게는 천연 발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연 발생적 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다.
F. 레포터 단백질 및 펩티드
리보스위치 또는 바이오센서 리보스위치의 활성화 평가를 위해 레포터 단백질 또는 펩티드를 사용할 수 있다. 레포터 단백질 또는 펩티드는 리보스위치에 의해 조절되는 발현을 보이는 RNA에 의해 코딩될 수 있다. 본 실시예는 일부 특정 레포터 단백질의 사용을 개시하고 있다. 레포터 단백질 및 펩티드의 사용은 잘 공지되어 있고 리보스위치와 함께 사용될 수 있도록 용이하게 개조될 수 있다. 레포터 단백질은 검출될 수 있거나 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 단백질 또는 펩티드의 존재는 표준 기법(예를 들어, 방사선면역분석, 방사선-표지, 면역분석, 효소 활성 분석, 흡광도, 형광도, 발광도 및 웨스턴 블롯)을 이용하여 검출할 수 있다. 보다 바람직하게는, 레포터 단백질의 수준은 낮은 수준에서조차도 표준 기법에 의해 용이하게 정량될 수 있다. 유용한 레포터 단백질은 루시퍼라제, GFP 및 이들의 유도체, 예컨대, 포 티누스 피랄리스(Photinus pyralis)로부터의 초파리 루시퍼라제(FL) 및 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)로부터의 레닐라 루시퍼라제(RL)를 포함한다.
G. 구조-의존적 표지
구조-의존적 표지는 표지와 결합되어 있는 분자 또는 화합물(예컨대, 리보스위치)의 형태 또는 구조의 변화를 기초로 한 형광 강도 또는 파장의 변화를 발생시키는 모든 표지를 지칭한다. 프로브 및 프라이머 면에서 사용되는 구조-의존적 표지의 예는 분자 비콘(beacon), 앰플리플루오르(Amplifluor), FRET 프로브, 절단가능한 FRET 프로브, TaqMan 프로브, 스코르피온(scorpion) 프라이머, 형광 삼중 올리고(삼중 분자 비콘 또는 삼중 FRET 프로브를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 형광 수용성 접합 중합체, 펩티드 핵산(PNA) 프로브 및 QPNA 프로브를 포함한다. 이러한 표지 및 특히 이의 작용 원리는 리보스위치와 함께 사용될 수 있도록 개조될 수 있다. 여러 종류의 구조-의존적 표지가 문헌(Schweitzer and Kingsmore, Curr. Opin. Biotech. 12:21-27 (2001))에 기재되어 있다.
구조-의존적 표지의 한 형태인 줄기 켄칭된(stem quenched) 표지는 줄기 구조가 켄칭 부분을 형성하는 경우 상기 표지로부터의 형광이 켄칭되도록 인접하여 존재할 수 있게끔 핵산 상에 위치한 형광 표지이다. 줄기가 파괴되는 경우(예컨대, 표지를 함유하는 리보스위치가 활성화되는 경우), 켄칭 부분은 더 이상 형광 표지에 인접하여 존재하지 않고 형광도는 증가한다. 이 효과의 예는 분자 비콘, 형광 삼중 올리고, 삼중 분자 비콘, 삼중 FRET 프로브 및 QPNA 프로브에서 발견될 수 있고, 이들의 작용 원리는 리보스위치와 함께 사용될 수 있도록 개조될 수 있 다.
구조-의존적 표지의 한 형태인 줄기 활성화된 표지는 형광도가 줄기 구조의 형성에 의해 증가되거나 변화된 경우 표지 또는 표지 쌍이다. 줄기 활성화된 표지는 (상기 표지를 함유하는 핵산 가닥이 줄기 구조를 형성하는 경우) 수용체 형광 표지 및 공여체 부분이 인접하여 존재할 때 공여체 부분으로부터 수용체 형광 표지로의 형광 공명 에너지 전달이 수용체로 하여금 형광을 발휘하도록 상기 수용체 형광 표지 및 공여체 부분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 줄기 활성화된 표지는 줄기 구조가 핵산 분자 내에서 형성되는 경우 상기 수용체 형광 표지 및 공여체 부분이 인접하여 존재하도록 핵산 분자(예컨대, 리보스위치) 상에 위치한 표지 쌍이다. 줄기 활성화된 표지의 공여체 부분 자체가 형광 표지인 경우, 상기 공여체 부분은 수용체와 인접하여 존재하지 않는 경우(즉, 줄기 구조가 형성되지 않은 경우) (전형적으로 수용체 형광 표지의 형광과 상이한 파장에서) 에너지를 형광으로서 방출할 수 있다. 줄기 구조가 형성된 경우, 전체적인 효과는 공여체 형광도의 감소 및 수용체 형광도의 증가일 것이다. FRET 프로브는 줄기 활성화된 표지 사용의 일례이고, 이의 작용 원리는 리보스위치와 함께 사용되도록 개조될 수 있다.
H. 검출 표지
리보스위치 활성화, 불활성화 또는 차단의 검출 및 정량화, 또는 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단 시 일어나는 핵산 또는 단백질의 발현의 검출 및 정량화를 돕기 위해, 검출 표지를 검출 프로브 또는 검출 분자 내로 도입할 수 있거나 발현된 핵산 또는 단백질 내로 직접 도입할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 검출 표지는 핵산 또는 단백질과 직접적으로 또는 간접적으로 결합하여 측정가능하고 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 발생시키는 임의의 분자이다. 이러한 많은 분자들이 당업자에게 공지되어 있다. 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되기에 적합한 검출 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광 분자, 인광 분자, 효소, 항체 및 리간드이다.
적절한 형광 표지의 예는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC), 5,6-카복시메틸 플루오레세인, 텍사스 레드, 니트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일(NBD), 쿠마린, 댄실 클로라이드, 로다민, 아미노-메틸 쿠마린(AMCA), 에오신, 에리쓰로신, BODIPY®, 캐스캐이드 블루®, 오레곤 그린®, 피렌, 리스아민, 잔텐, 아크리딘, 옥사진, 피코에리쓰린, 란타나이드 이온의 거대환형 킬레이트, 예컨대, 양자 안료™, 형광 에너지 전달 안료, 예컨대, 티아졸 오랜지-에티듐 이종이량체, 및 시아닌 안료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7을 포함한다. 다른 구체적인 형광 표지의 예는 3-하이드록시피렌 5,8,10-트라이설폰산, 5-하이드록시 트립타민(5-HT), 산 푸치신, 알리자린 콤플렉손, 알리자린 레드, 알로피코시아닌, 아미노쿠마린, 안쓰로일 스테아레이트, 아스트라존 브릴리안트 레드 4G, 아스트라존 오랜지 R, 아스트라존 레드 6B, 아스트라존 옐로우 7 GLL, 아타브린, 아우라민, 아우로포스핀, 아우로포스핀 G, BAO 9(비스아미노페닐옥사다이아졸), BCECF, 버베린 설페이트, 비스벤즈아마이드, 블란코포르 FFG 솔푸션, 블란코포르 SV, 보다이피 F1, 브릴리안트 설포플라빈 FF, 칼시엔 블루, 칼슘 그린, 칼코플루오르 RW 솔루션, 칼코플루오르 화이트, 칼코포르 화이트 ABT 솔루션, 칼코포르 화이트 스탠다드 솔루션, 카보스티릴, 캐스캐이드 옐로우, 카테콜아민, 키나크린, 코리포스핀 O, 쿠마린-팔로이딘, CY3.1 8, CY5.1 8, CY7, 단스(1-다이메틸 아미노 나팔린 5 설폰산), 댄사(다이아미노 나프틸 설폰산), 댄실 NH-CH3, 다이아미노 페닐 옥시다이아졸(DAO), 다이메틸아미노-5-설폰산, 다이피로메탄보론 다이플루오라이드, 다이페닐 브릴리안트 플라빈 7GFF, 도파민, 에리쓰로신 ITC, 유크리신, FIF(포름알데하이드 유도된 형광), 플라조 오랜지, 플루오 3, 플루오레스카민, 푸라-2, 제나크릴 브릴리안트 레드 B, 제나크릴 브릴리안트 옐로우 10GF, 제나크릴 핑크 3G, 제나크릴 옐로우 5GF, 글록살산, 크래뉼라 블루, 해마토포피린, 인도-1, 인트라화이트 Cf 리퀴드, 류코포르 PAF, 류코포르 SF, 류코포르 WS, 리사민 로다민 B200(RD200), 루시퍼 옐로우 CH, 루시퍼 옐로우 VS, 마그달라 레드, 마리나 블루, 맥실론 브릴리안트 플라빈 10 GFF, 맥실론 브릴리안트 플라빈 8 GFF, MPS(메틸 그린 피로닌 스틸벤), 미쓰라마이신, NBD 아민, 니트로벤족사디돌, 노르아드레날린, 뉴클리어 패스트 레드, 뉴클리어 옐로우, 나일로산 브릴리안트 플라빈 E8G, 옥사다이아졸, 파시픽 블루, 파라로사닐린(페울겐), 포르와이트 AR 솔루션, 포르와이트 BKL, 포르와이트 Rev, 포르와이트 RPA, 포스핀 3R, 프탈로시아닌, 피코에리쓰린 R, 폴리아자인다센 폰토크롬 블루 블랙, 포피린, 프리뮬린, 프로시온 옐로우, 피로닌, 피로닌 B, 피로잘 브릴리안트 플라빈 7GF, 퀴나크린 무스타드, 로다민 123, 로다민 5 GLD, 로다민 6G, 로다민 B, 로다민 B 200, 로다민 B 엑스트라, 로다민 BB, 로다민 BG, 로다민 WT, 세로토닌, 세브론 브릴리안트 레드 2B, 세브론 브릴리안트 레드 4G, 세브론 브릴리안트 레드 B, 세브론 오랜 지, 세브론 옐로우 L, SITS(프리뮬린), SITS(스틸벤 아이소티오설폰산), 스틸벤, Snarf 1, 설포 로다민 B Can C, 설포 로다민 G 엑스트라, 테트라사이클린, 티아진 레드 R, 티오플라빈 S, 티오플라빈 TCN, 티오플라빈 5, 티올라이트, 티오졸 오랜지, 티노폴 CBS, 트루 블루, 울트라라이트, 유라닌 B, 유비텍스 SFC, 크실렌 오랜지 및 XRITC를 포함한다.
유용한 형광 표지는 플루오레세인(5-카복시플루오레세인-N-하이드록시석신이미드 에스터), 로다민(5,6-테트라메틸 로다민), 및 시아닌 안료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7이다. 이 형광 표지들에 대한 흡수 및 방출 최대 파장은 각각 다음과 같으므로 이들의 동시적인 검출이 가능하다: FITC(490 nm; 520 nm), Cy3(554 nm; 568 nm), Cy3.5(581 nm; 588 nm), Cy5(652 nm: 672 nm), Cy5.5(682 nm; 703 nm) 및 Cy7(755 nm; 778 nm). 형광 안료의 다른 예는 6-카복시플루오레세인(6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인(TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-다이메톡시-4',5'-다이클로로-6-카복시로다민(JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-다이클로로-6-카복시플루오레세인(NED), 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-다이클로로-6-카복시플루오레세인(VIC)을 포함한다. 형광 표지는 아머샴 파마샤 바이오테크(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 몰레큘라 프로브스(미국 오레곤주 유진 소재) 및 리서치 오가닉스(미국 오하이오주 클리브랜드 소재)를 비롯한 다양한 시판 공급처로부터 구입할 수 있다.
흥미로운 다른 표지는 표지와 결합된 프로브가 표적 분자에 특이적으로 결합된 경우에만 신호를 방출하는 표지이고, 이때 상기 표지는 문헌(Tyagi & Kramer, Nature Biotechnology (1996) 14:303) 및 유럽 특허 제0 070 685 B1호에 기재된 "분자 비콘"을 포함한다. 흥미로운 다른 표지는 미국 특허 제5,563,037호, 및 국제특허출원 공개 제WO 97/17471호 및 제WO 97/17076호에 기재된 표지를 포함한다.
표지된 뉴클레오티드는 합성 과정 동안에 발현된 핵산 내로 직접 도입되는 검출 표지의 유용한 형태이다. 핵산 내로 도입될 수 있는 검출 표지의 예는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대, BrdUrd(5-브로모데옥시유리딘, Hoy and Schimke, Mutation Research 290:217-230 (1993)), 아미노알릴데옥시유리딘(Henegariu et al., Nature Biotechnology 18:345-348 (2000)), 5-메틸사이토신(Sano et al., Biochim. Biophys. Acta 951:157-165 (1988)), 브로모유리딘(Wansick et al., J. Cell Biology 122:283-293 (1993)), 및 바이오틴(Langer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633 (1981)) 또는 적절한 햅텐(예컨대, 디곡시제닌)(Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364 (1992))으로 변경된 뉴클레오티드를 포함한다. 적절한 형광-표지된 뉴클레오티드는 플루오레세인-아이소티아시아네이트-dUTP, 시아닌-3-dUTP 및 시아닌-5-dUTP(Yu et al., Nucleic Acids Res., 22:3226-3232 (1994))이다. DNA에 도입하기에 바람직한 뉴클레오티드 유사체 검출 표지는 BrdUrd(브로모데옥시유리딘, BrdUrd, BrdU, BUdR, 시그마-알드리치 캄퍼니)이다. 검출 표지를 DNA 내로 도입하는 데 유용한 다른 뉴클레오티드 유사체는 AA-dUTP(아미노알릴-데옥시유리딘 트라이포스페이트, 시그마-알드리치 캄퍼니) 및 5-메틸-dCTP(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)이다. 검출 표지를 RNA 내로 도입하는 데 유용한 뉴클레오티드 유사체는 바이오틴-16-UTP(바이오틴-16-유리딘-5'-트라이포스페이트, 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)이다. 플루오레세인, Cy3 및 Cy5는 직접적인 표지를 위해 dUTP에 연결될 수 있다. Cy3.5 및 Cy7은 바이오틴- 또는 디곡시제닌-표지된 프로브의 2차 검출을 위한 아비딘 또는 항-디곡시제닌 접합체로서 사용될 수 있다.
핵산 내로 도입되는 검출 표지, 예컨대, 바이오틴은 당업계에 잘 공지되어 있는 민감한 방법들을 이용하여 추후에 검출할 수 있다. 예를 들어, 바이오틴은 바이오틴에 결합된 후 적절한 기질(예를 들어, 화학발광 기질 CSPD: 다이소듐, 3-(4-메톡시스피로-[1,2-다이옥세탄-3-2'-(5'-클로로)트라이사이클로[3.3.1.13'7]데칸]-4-일)페닐 포스페이트: 트로픽스 인코포레이티드)의 화학발광에 의해 검출되는 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 접합체(트로픽스 인코포레이티드)를 사용하여 검출할 수 있다. 표지는 예를 들어, 화학 신호 증폭을 이용하거나 광(예를 들어, 화학발광 1,2-다이옥세탄 기질) 또는 형광 신호를 발생시키는 효소에 대한 기질을 사용하여 검출할 수 있는 효소, 예컨대, 알칼리 포스파타제, 대두 퍼록시다제, 호스라디쉬 퍼록시다제 및 중합효소일 수도 있다.
이 검출 표지들 중 둘 이상을 겸비하는 분자도 검출 표지로서 간주된다. 공지된 검출 표지들 중 임의의 검출 표지는 개시된 프로브, 태그, 분자 및 방법과 함께 사용되어 활성화된 또는 불활성화된 리보스위치, 또는 개시된 방법에서 생성된 핵산 또는 단백질을 검출할 수 있다. 검출 표지에 의해 발생된 신호를 검출하고 측정하는 방법도 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 방사성 동위원소는 신틸레이션 계수 또는 직접적 가시화로 검출할 수 있고, 형광 분자는 형광 분광계로 검 출할 수 있으며, 인광 분자는 분광계로 검출할 수 있거나 카메라로 직접적으로 가시화할 수 있고, 효소는 이 효소에 의해 촉진된 반응의 생성물의 검출 또는 가시화를 통해 검출할 수 있으며, 항체는 이 항체에 커플링된 2차 검출 표지를 검출하여 검출할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 검출 분자는 1가지 이상의 검출 표지에 커플링되어 검출될 화합물 또는 조성물과 상호작용하는 분자이다.
I. 서열 유사성
본 명세서에 개시된 바와 같이 용어 "유사성" 및 "동일성"의 사용은 유사할 만큼 동일한 것을 의미함을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "유사성"이 2개의 서열(예컨대, 비-천연 서열) 사이에서 사용되는 경우, 이것은 반드시 상기 2개의 서열 사이의 진화적 관계를 의미하는 것이라기보다는 오히려 그들의 핵산 서열 사이의 유사성 또는 관련성에 관한 것임을 이해해야 한다. 2개의 진화적으로 관련된 분자들 사이의 유사성을 측정하는 방법들 중 대부분의 방법이 상기 2개의 서열들이 진화적으로 관련되어 있는지와 관계없이 서열 유사성을 측정하기 위한 목적으로 임의의 2개 이상의 핵산 또는 단백질에 관용적으로 적용된다.
일반적으로, 본 명세서에 개시된 리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질의 임의의 공지된 변이체 및 유도체, 또는 본 명세서에 개시된 리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질로부터 유래될 수 있는 변이체 및 유도체를 정의하는 한 방법은 특정 공지된 서열들에 대한 유사성 면에서 상기 변이체 및 유도체를 정의하는 것임을 이해해야 한다. 본 명세서에 개시된 특정 서열들의 동일성도 본 명세서의 모든 부분에서 논의되어 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개 시된 리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질의 변이체는 전형적으로 언급된 서열 또는 천연 서열에 대해 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 유사성을 나타낸다. 당업자라면 2가지 단백질 또는 핵산, 예컨대, 유전자의 유사성을 측정하는 방법을 용이하게 이해한다. 예를 들어, 유사성은 유사성이 최대 수준에 있도록 2개의 서열을 정렬한 후 계산할 수 있다.
유사성을 계산하는 또 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교할 서열들의 최적 정렬은 문헌(Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))의 국지적 유사성 알고리즘, 문헌(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970))의 유사성 정렬 알고리즘, 문헌(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988))의 유사성 검색 방법, 상기 알고리즘들의 전산화된 실시(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 제네틱스 컴퓨터 그룹)) 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.
핵산의 경우 동일한 종류의 유사성이 예를 들어, 문헌(Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989)(적어도 핵산 정렬에 관련된 물질에 대해 참고로 본원에 도입되어 있음)에 개시된 알고리즘에 의해 수득될 수 있다. 상기 방법들 중 임의의 방법이 이용될 수 있고 일부 경우 이 다양한 방법들 의 결과는 상이할 수 있음을 이해해야 하지만, 당업자라면 상기 방법들 중 1가지 이상의 방법에서 동일성이 발견되면 서열들이 언급된 동일성을 나타낸다고 기재될 수 있음을 이해할 것이다.
예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 또 다른 서열에 대해 특정 비율의 유사성을 나타낸다고 언급된 서열은 전술한 계산 방법들 중 임의의 1가지 이상의 방법에 의해 계산된 경우 언급된 유사성을 나타내는 서열을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 제1 서열이 주커(Zuker) 문헌에 기재된 계산 방법을 이용하였을 때 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타낸다고 계산된 경우 심지어 상기 제1 서열이 나머지 다른 임의의 계산 방법에 의해 계산되었을 때 상기 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타내지 않는 경우조차도 상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 제1 서열이 주커 문헌에 기재된 계산 방법 및 피어슨(Pearson) 및 립만(Lipman)의 문헌에 기재된 계산 방법을 이용하였을 때 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타낸다고 계산된 경우 심지어 상기 제1 서열이 스미스(Smith) 및 와터만(Waterman) 문헌에 기재된 계산 방법, 니들만(Needleman) 및 분슈(Wunsch) 문헌에 기재된 계산 방법, 재거(Jaeger) 문헌에 기재된 계산 방법 또는 임의의 다른 계산 방법에 의해 계산되었을 때 상기 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타내지 않는 경우조차도 상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 제1 서열이 모든 계산 방법들 각각을 이용하였을 때(비록, 실제로 다양한 계산 방법들이 다양 한 계산된 유사성 비율을 산출할지라도) 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타낸다고 계산된 경우 상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 80%의 유사성을 나타낸다.
J. 혼성화 및 선별적 혼성화
용어 "혼성화"는 전형적으로 2가지 이상의 핵산 분자, 예컨대, 프라이머 또는 프로브와 리보스위치 또는 유전자 사이의 서열-매개된 상호작용을 의미한다. 서열-매개된 상호작용은 2가지 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 유도체 사이에 뉴클레오티드 특이적 방식으로 일어나는 상호작용을 의미한다. 예를 들어, C와 상호작용하는 G, 또는 T와 상호작용하는 A는 서열-매개된 상호작용이다. 전형적으로 서열-매개된 상화작용은 뉴클레오티드의 와슨-크릭 면 또는 호오그스틴(Hoogsteen) 면에서 일어난다. 2가지 핵산의 혼성화는 당업자에게 공지되어 있는 다수의 조건 및 파라미터에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 염 농도, pH 및 반응 온도 모두가 2가지 핵산 분자가 혼성화할지에 대해 영향을 미친다.
2가지 핵산 분자 사이의 선별적 혼성화를 위한 파라미터는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 선별적 혼성화 조건은 엄격한 혼성화 조건으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격도는 혼성화 단계 및 세척 단계 중 하나 또는 이들 단계 둘다의 온도 및 염 농도 둘다에 의해 조절된다. 예를 들어, 선별적 혼성화를 달성하는 혼성화 조건은 Tm(분자의 절반이 그들의 혼성화 파트너로부터 해리되는 용융 온도)보다 약 12 내지 25℃ 낮은 온도에서 높은 이온 강도 용액(6X SSC 또는 6X SSPE) 중에서의 혼성화에 이어서 세척 온도가 Tm보다 약 5 내지 20℃ 더 낮도록 선택된 온도와 염 농도의 조합 조건에서 세척하는 것 을 포함할 수 있다. 상기 온도 및 염 조건은 필터 상에 고정된 기준 DNA 샘플이 원하는 표지된 핵산에 혼성화된 후 엄격도가 상이한 조건 하에서 세척되는 예비 실험에서 실험적으로 용이하게 결정된다. 혼성화 온도는 전형적으로 DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화의 경우 더 높다. 상기 조건들은 엄격도를 달성하기 위해 전술한 바와 같이 이용될 수 있거나 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 이용될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Kunkel et al., Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987); 적어도 핵산의 혼성화에 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 도입되어 있음). DNA:DNA 혼성화에 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 약 68℃의 (수용액 상태의) 6X SSC 또는 6X SSPE 중에서의 혼성화 후 68℃에서의 세척일 수 있다. 필요에 따라 혼성화 및 세척의 엄격도는 원하는 상보성 정도가 감소됨에 따라 상응하게 감소될 수 있고 가변성이 검색되는 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 풍부도에 따라 감소될 수 있다. 마찬가지로, 필요에 따라 혼성화 및 세척의 엄격도는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 원하는 유사성이 증가됨에 따라 상응하게 증가될 수 있고 높은 유사성이 필요한 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 풍부도에 따라 증가될 수 있다.
선별적 혼성화를 정의하는 또 다른 방법은 핵산들 중 한 핵산에 결합된 다른 핵산의 양(비율)을 측정하는 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 선별적 혼성화 조건은 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상 의 제한 핵산이 비-제한 핵산에 결합된 경우 선별적 혼성화가 일어날 것이다. 전형적으로, 비-제한 핵산은 예를 들어, 10, 100 또는 1000배 과량으로 존재한다. 이러한 종류의 분석은 제한 핵산 및 비-제한 핵산 둘다가 예를 들어, 그들의 kd보다 10배, 100배 또는 1000배 더 적은 조건, 상기 핵산 분자들 중 하나만이 그들의 kd보다 10배, 100배 또는 1000배 더 적은 조건, 또는 상기 핵산 분자들 중 하나 또는 둘다가 그들의 kd를 초과하는 조건 하에서 수행될 수 있다.
선별적 혼성화를 정의하는 또 다른 방법은 원하는 효소적 개조를 촉진하기 위해 요구되는 혼성화 조건 하에서 효소적으로 개조된 핵산의 비율을 측정하는 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 선별적 혼성화 조건은 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 핵산이 효소적 개조를 촉진하는 조건 하에서 효소적으로 개조된 경우의 혼성화 조건일 것이고, 예를 들어, 효소적 개조가 DNA 연장인 경우, 선별적 혼성화 조건은 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 핵산 분자가 연장된 경우의 혼성화 조건일 것이다. 바람직한 조건은 시판사에 의해 제시된 조건, 또는 개조를 수행하는 효소에 적합한 것으로서 당업계에 공지되어 있는 조건을 포함한다.
유사성과 마찬가지로, 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화 수준을 측정하는, 본 명세서에 개시된 다양한 방법들이 있음을 이해해야 한다. 상기 방법 및 조건은 2 개의 핵산 분자 사이에 상이한 혼성화 비율을 제공할 수 있지만, 달리 명시하지 않은 한 상기 방법들 중 임의의 방법의 파라미터를 충족시키는 것만으로 충분할 것임을 이해해야 한다. 예를 들어, 80% 혼성화가 필요한 경우 혼성화가 상기 방법들 중 어느 한 방법에서 요구되는 파라미터 내에서 일어나기만 하면 80% 혼성화는 본 명세서에 개시된 것으로 간주된다.
당업자라면 조성물 또는 방법이 총체적으로 또는 단독으로 혼성화를 측정하기 위한 상기 기준들 중 어느 하나를 충족시키는 경우, 상기 조성물 또는 방법이 본 명세서에 개시된 조성물 또는 방법임을 이해할 것이다.
K. 핵산
예를 들어, 리보스위치, 앱타머, 및 리보스위치 및 앱타머를 코딩하는 핵산을 비롯하여, 본 명세서에 개시된 다양한 핵산-기재 분자들이 존재한다. 상기 개시된 핵산들은 예를 들어, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 대체물로 구성될 수 있다. 이 분자들 및 다른 분자들의 비-제한적 예는 본 명세서에 기재되어 있다. 예를 들어, 벡터가 세포 내에서 발현되는 경우 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G 및 U로 구성될 것임을 이해해야 한다. 마찬가지로, 핵산 분자가 예를 들어, 외래 전달을 통해 세포 또는 세포 환경 내로 도입되는 경우, 핵산 분자는 세포 환경 내에서 상기 핵산 분자의 분해를 감소시키는 뉴클레오티드 유사체로 구성되는 것이 유리할 수 있음을 이해해야 한다.
리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼 및 임의의 다른 올리고뉴클레오티드 및 핵산은 이들의 관련 기능이 유지되는 한 변경된 뉴클레오티드(뉴클레오티드 유사체) 로 구성될 수 있거나 변경된 뉴클레오티드(뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다. 많은 변경된 뉴클레오티드들이 공지되어 있고 올리고뉴클레오티드 및 핵산에서 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 또는 포스페이트 부분에 대한 일부 종류의 변경을 갖는 뉴클레오티드이다. 염기 부분에 대한 변경은 A, C, G 및 T/U의 천연 또는 합성 변경뿐만 아니라 다른 퓨린 또는 피리미딘 염기, 예컨대, 우라실-5-일, 하이포잔틴-9-일(I) 및 2-아미노아데닌-9-일의 천연 또는 합성 변경도 포함한다. 변경된 염기는 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 유도체 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 염기 변경은 예를 들어, 미국 특허 제3,687,808호, 및 문헌(Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993)에서 찾을 수 있다. 일부 뉴클레오티드 유사체, 예컨대, 2-아미노프로필아데 닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 비롯한 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린은 이중가닥 형성의 안정성을 증가시킬 수 있다. 다른 변경된 염기는 보편적인 염기로서 작용하는 염기이다. 보편적인 염기는 3-니트로피롤 및 5-니트로인돌을 포함한다. 보편적인 염기는 일반 염기를 치환시키지만 염기쌍 형성에 있어서 편향되지 않는다. 즉, 보편적인 염기는 임의의 다른 염기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 염기 변경은 종종 예를 들어, 당 변경, 예컨대, 2'-O-메톡시에틸과 조합되어 증가된 이중가닥 안정성과 같은 독특한 성질을 제공할 수 있다. 염기 변경의 범위를 상세히 기술하는 다수의 미국 특허, 예컨대, 미국 특허 제4,845,205호, 제5,130,302호, 제5,134,066호, 제5,175,273호, 제5,367,066호, 제5,432,272호, 제5,457,187호, 제5,459,255호, 제5,484,908호, 제5,502,177호, 제5,525,711호, 제5,552,540호, 제5,587,469호, 제5,594,121호, 제5,596,091호, 제5,614,617호 및 제5,681,941호가 있다. 상기 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 염기 변경, 이의 합성, 이의 용도, 및 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 염기 변경의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입된다.
뉴클레오티드 유사체는 당 부분의 변경도 포함할 수 있다. 당 부분에 대한 변경은 리보스 및 데옥시리보스의 천연 변경 및 합성 변경을 포함한다. 당 변경은 2' 위치에서의 하기 변경들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-0-알킬(이때, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 비-치환된 C1 내지 C10 알킬, 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 2' 당 변경은 -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)n-ONH2 및 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2도 포함하나 이들로 한정되지 않고, 이때 n 및 m은 1 내지 약 10이다.
2' 위치에서의 다른 변경은 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 이탈기, 레포터 기, 인터킬레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선시키는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 성질을 개선시키는 기, 및 유사한 성질을 갖는 다른 치환기를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 유사한 변경을, 당의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합된 올리고뉴클레오티드의 당의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 만들 수도 있다. 변경된 당은 가교 고리 산소에서 변경, 예컨대, CH2 및 S를 갖는 당도 포함할 것이다. 뉴클레오티드 당 유사체는 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 부분과 같은 당 모사체도 가질 수 있다. 이러한 변경된 당 구조의 제조를 교시하는 다수의 미국 특허, 예컨대, 미국 특허 제4,981,957호, 제5,118,800호, 제5,319,080호, 제5,359,044호, 제5,393,878호, 제5,446,137호, 제5,466,786호, 제5,514,785호, 제5,519,134호, 제5,567,811호, 제5,576,427호, 제5,591,722호, 제5,597,909호, 제5,610,300호, 제5,627,053호, 제 5,639,873호, 제5,646,265호, 제5,658,873호, 제5,670,633호 및 제5,700,920호가 있다(상기 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 변경된 당 구조, 이의 합성, 이의 용도, 및 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 변경된 당 구조의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입됨).
뉴클레오티드 유사체는 포스페이트 부분에서도 변경될 수 있다. 변경된 포스페이트 부분은 2개의 뉴클레오티드 사이의 결합이 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함함), 포스피네이트, 포스포르아미데이트(3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함함), 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스터, 및 보라노포스페이트를 갖도록 변경될 수 있는 포스페이트 부분을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 2개의 뉴클레오티드 사이의 상기 포스페이트 또는 변경된 포스페이트 결합이 3'-5' 결합 또는 2'-5' 결합을 통해 형성될 수 있고 상기 결합이 도립된 극성, 예컨대, 3'-5'로부터 5'-3', 또는 2'-5'로부터 5'-2'를 가질 수 있음을 이해해야 한다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태도 포함된다. 다수의 미국 특허가 변경된 포스페이트를 갖는 뉴클레오티드를 제조하고 사용하는 방법을 교시하고 상기 미국 특허는 미국 특허 제3,687,808호, 제4,469,863호, 제4,476,301호, 제5,023,243호, 제5,177,196호, 제5,188,897호, 제5,264,423호, 제5,276,019호, 제5,278,302호, 제5,286,717호, 제5,321,131호, 제5,399,676호, 제5,405,939호, 제5,453,496호, 제 5,455,233호, 제5,466,677호, 제5,476,925호, 제5,519,126호, 제5,536,821호, 제5,541,306호, 제5,550,111호, 제5,563,253호, 제5,571,799호, 제5,587,361호 및 제5,625,050호를 포함하나 이들로 한정되지 않는다(상기 미국 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 변경된 포스페이트, 이의 합성, 이의 용도, 및 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 변경된 포스페이트의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입됨).
뉴클레오티드 유사체는 단일 변경뿐만 아니라 한 부분 내에서 또는 상이한 부분 사이에서 다수의 변경도 가질 수 있음을 이해해야 한다.
뉴클레오티드 대체물은 뉴클레오티드와 유사한 기능적 성질을 갖되 포스페이트 부분을 갖지 않는 분자, 예컨대, PNA이다. 뉴클레오티드 대체물은 와슨-크릭 또는 호오그스틴 방식으로 상보적인 핵산을 인식하여 상기 상보적인 핵산에 혼성화하되(염기쌍을 형성하되) 포스페이트 부분 이외의 다른 부분을 통해 서로 연결되어 있는 분자이다. 뉴클레오티드 대체물은 적절한 표적 핵산과 상호작용하는 경우 이중 나선형 구조를 따를 수 있다.
뉴클레오티드 대체물은 포스페이트 부분 및/또는 당 부분이 치환되어 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체이다. 뉴클레오티드 대체물은 표준 인 원자를 갖지 않는다. 포스페이트에 대한 대체물은 예를 들어, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 인터뉴클레오시드 결합일 수 있다. 이들은 (부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로 부터 형성된) 모르폴리노 결합을 갖는 것; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격; 아마이드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 골격들을 포함한다. 다수의 미국 특허가 이러한 종류의 포스페이트 대체물들을 제조하고 사용하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 미국 특허는 미국 특허 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,185,444호, 제5,214,134호, 제5,216,141호, 제5,235,033호, 제5,264,562호, 제5,264,564호, 제5,405,938호, 제5,434,257호, 제5,466,677호, 제5,470,967호, 제5,489,677호, 제5,541,307호, 제5,561,225호, 제5,596,086호, 제5,602,240호, 제5,610,289호, 제5,602,240호, 제5,608,046호, 제5,610,289호, 제5,618,704호, 제5,623,070호, 제5,663,312호, 제5,633,360호, 제5,677,437호 및 제5,677,439호를 포함하나 이들로 한정되지 않는다(상기 미국 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 포스페이트 대체물, 이의 합성, 이의 용도, 및 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 포스페이트 대체물의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입됨).
또한, 뉴클레오티드 대체물에서 뉴클레오티드의 당 부분 및 포스페이트 부분은 예를 들어, 아마이드 타입 결합(아미노에틸글리신)(PNA)으로 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 미국 특허 제5,539,082호, 제5,714,331호 및 제5,719,262호는 PNA 분자의 제조 및 사용 방법을 교시하고 있으며, 상기 특허들 각각은 본원에 참고로 도입된다(문헌(Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)) 또한 참조).
올리고뉴클레오티드 및 핵산은 뉴클레오티드로 구성될 수 있고 상이한 종류의 뉴클레오티드 또는 동일한 종류의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내의 1개 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있고, 약 10 내지 약 50%의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있고, 모든 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 및 핵산은 키메라 올리고뉴클레오티드 및 키메라 핵산으로서 지칭될 수 있다.
L. 고체 지지체
고체 지지체는 분자(예컨대, 유발 분자) 및 리보스위치(또는 개시된 방법에서 사용되거나 개시된 방법에 의해 제조된 다른 성분들)가 결합될 수 있는 고체-상태 기판 또는 지지체이다. 리보스위치 및 다른 분자는 고체 지지체와 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 피분석물(예컨대, 유발 분자, 시험 화합물)은 고체 지지체의 표면에 결합될 수 있거나 고체 지지체 상에 고정된 포획제(예를 들어, 피분석물에 결합하는 화합물 또는 분자)와 결합될 수 있다. 또 다른 예로서, 리보스위치는 고체 지지체의 표면에 결합될 수 있거나 고체 지지체 상에 고정된 프로브와 결합될 수 있다. 어레이는 다수의 리보스위치, 프로브 또는 다른 분자가 어레이, 격자 또는 다른 조직화된 패턴으로 결합되어 있는 고체 지지 체이다.
고체 지지체에서 사용되는 고체-상태 기판은 성분들이 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있는 임의의 고체 물질을 포함할 수 있다. 이것은 아크릴아마이드, 아가로스, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 유리, 금, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리실리케이트, 폴리카보네이트, 테플론, 플루오로카본, 나일론, 실리콘 고무, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 폴리아세트산, 폴리오르토에스터, 작용기화된 실란, 폴리프로필푸메레이트, 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 폴리아미노산을 포함한다. 고체-상태 기판은 박막, 막, 병, 접시, 섬유, 직조 섬유, 성형된 중합체, 입자, 비드, 마이크로입자 또는 조합물을 포함하는 임의의 유용한 형태를 가질 수 있다. 고체-상태 기판 및 고체 지지체는 다공성 또는 비-다공성 기판 및 지지체일 수 있다. 칩은 직사각형 또는 정사각형의 작은 물질 조각이다. 고체-상태 기판에 있어서 바람직한 형태는 박막, 비드 또는 칩이다. 고체-상태 기판에 있어서 유용한 형태는 마이크로타이터 접시이다. 일부 실시양태에서, 다중웰 유리 슬라이드가 사용될 수 있다.
어레이는 고체 지지체 상의 확인된 위치 또는 소정의 위치에 고정되어 있는 복수의 리보스위치, 유발 분자, 다른 분자, 화합물 또는 프로브를 포함할 수 있다. 고체 지지체 상의 소정의 위치는 일반적으로 한 가지 종류의 성분을 각각 갖는다(즉, 상기 위치에서 모든 성분이 동일하다). 별법으로, 다수의 종류의 성분들이 고체 지지체 상의 상기 소정의 위치에 고정될 수 있다. 각 위치는 주어진 성분들 의 다수의 카피를 가질 것이다. 고체 지지체 상에서의 다양한 성분들의 공간적 분리는 분리된 검출 및 확인을 가능하게 한다.
유용할지라도 고체 지지체가 단일 유니트 또는 구조일 필요는 없다. 리보스위치, 유발 분자, 다른 분자, 화합물 및/또는 프로브로 구성된 한 세트가 임의의 수의 고체 지지체 상에 분포될 수 있다. 예를 들어, 극단적으로, 각 성분은 분리된 반응 튜브 또는 용기 내에, 또는 분리된 비드 또는 마이크로입자 상에 고정될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 고체-상태 기판에 고정시키는 방법은 잘 확립되어 있다. 어드레스(address) 프로브 및 검출 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 확립된 커플링 방법을 이용하여 기판에 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 적절한 부착 방법은 문헌(Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 91(11):5022-5026 (1994), and Khrapko et al., Mol. Biol. (Mosk) (USSR) 25:718-730 (1991))에 기재되어 있다. 카세인-코팅된 슬라이드 상에 3'-아민 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 방법은 문헌(Stimpson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383 (1995))에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드를 고체-상태 기판에 부착시키는 유용한 방법은 문헌(Guo et al, Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994))에 기재되어 있다.
고체 지지체 상에 고정된 성분들 각각(예를 들어, 리보스위치, 유발 분자 또는 다른 분자)은 고체 지지체의 다양한 소정의 영역 내에 위치할 수 있다. 다양한 위치들은 다양한 반응 챔버일 수 있다. 상기 다양한 소정의 영역들은 각각 서로 물리적으로 분리되어 있을 수 있다. 고체 지지체의 다양한 소정의 영역들 사이의 거리는 고정될 수 있거나 변동될 수 있다. 예를 들어, 어레이에서 성분들은 각각 서로로부터 고정된 거리를 두고 정렬될 수 있지만, 비드와 결합된 성분들은 고정된 공간적 관계에 있지 않을 것이다. 특히, 다수의 고체 지지체 유니트(예를 들어, 다수의 비드)의 사용은 변동가능한 거리를 제공할 것이다.
성분들은 임의의 밀도로 고체 지지체 상에 결합될 수 있거나 고정될 수 있다. 성분들은 400가지 상이한 성분들/㎤를 초과하는 밀도로 고체 지지체에 고정될 수 있다. 성분들의 어레이는 임의의 수의 성분들을 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이는 고체 지지체 상에 고정된 1,000가지 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있거나, 고체 지지체 상에 고정된 10,000가지 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있거나, 고체 지지체 상에 고정된 100,000가지 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있거나, 또는 고체 지지체 상에 고정된 1,000,000 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있다.
M. 키트
상기 물질들 및 다른 물질들은 개시된 본 방법의 실시 또는 실시 보조에 유용한 키트로서 임의의 적절한 조합물 형태로 함께 팩키징될 수 있다. 이것은 소정의 키트 내의 키트 성분들이 개시된 본 방법에서 함께 사용되도록 디자인되고 개조된 경우 유용하다. 예를 들어, 1가지 이상의 바이오센서 리보스위치를 포함하는, 화합물을 검출하기 위한 키트가 개시되어 있다. 상기 키트는 리보스위치의 활성화를 검출하기 위한 시약 및 표지도 함유할 수 있다.
N. 혼합물
본 명세서에는 개시된 본 방법을 수행함으로써 형성된 혼합물, 또는 개시된 본 방법을 수행하기 위해 제조함으로써 형성된 혼합물이 개시되어 있다. 예를 들어, 리보스위치 및 유발 분자를 포함하는 혼합물이 개시되어 있다.
본 방법이 조성물, 성분 또는 시약을 혼합하거나 접촉시키는 단계를 포함할 때마다, 본 방법의 수행은 많은 다양한 혼합물을 발생시킨다. 예를 들어, 본 방법이 3개의 혼합 단계를 포함하는 경우, 이 단계들이 따로 수행되는 경우 상기 단계들 각각을 수행한 후 독특한 혼합물이 형성된다. 또한, 혼합물은 단계들이 수행되는 방법과 무관하게 단계들 모두의 완결 시 형성된다. 본 개시내용은 개시된 본 방법의 수행에 의해 수득된 혼합물, 및 임의의 개시된 시약, 조성물 또는 성분, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 시약, 조성물 또는 성분을 함유하는 혼합물도 고려한다.
O. 시스템
본 명세서에는 개시된 본 방법의 수행 또는 개시된 본 방법의 수행 보조에 유용한 시스템이 개시되어 있다. 시스템은 일반적으로 제품, 예컨대, 구조체, 기구, 장치 등과 조성물, 화합물, 물질 등의 조합물을 포함한다. 개시되어 있거나 개시내용으로부터 자명한 상기 조합물이 고려된다. 예를 들어, 바이오센서 리보스위치, 고체 지지체 및 신호-판독 장치를 포함하는 시스템이 개시되어 있고 고려된다.
P. 데이터 구조 및 컴퓨터 제어
본 명세서에는 개시된 본 방법에서 사용되거나, 개시된 본 방법에 의해 발생 되거나, 또는 개시된 본 방법으로부터 발생된 데이터 구조가 개시되어 있다. 데이터 구조는 일반적으로 조성물 또는 매질 형태로 수집되고/되거나, 조직화되고/되거나, 저장되고/되거나 구현된 임의의 형태의 데이터, 정보 및/또는 물체이다. 전자적 형태, 예컨대, RAM 형태로 저장되거나 저장 디스크 상에 저장된 리보스위치 구조 및 활성화 측정치는 데이터 구조의 한 종류이다.
개시된 본 방법, 또는 이의 일부 또는 이를 위한 제제는 컴퓨터 제어에 의해 제어될 수 있거나, 관리될 수 있거나 또는 보조될 수 있다. 이러한 컴퓨터 제어는 컴퓨터 제어된 프로세스 또는 방법에 의해 달성될 수 있고, 데이터 구조를 사용하고/하거나 발생시킬 수 있으며, 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 상기 컴퓨터 제어, 컴퓨터 제어된 프로세스, 데이터 구조 및 컴퓨터 프로그램이 고려되고 본 명세서에 개시된 것으로 이해되어야 한다.
방법
본 명세서에는 리보스위치를 포함하는 구축물을 RNA 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법이 개시되어 있는데, 이때 상기 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치는 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인은 이종성 도메인이다. 리보스위치는 RNA의 인트론 내에 있을 수 있다. 리보스위치는 유발 분자, 예컨대, TPP에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위 치는 택일적 스플라이싱을 억제할 수 있다. 스플라이싱은 비-천연적으로 일어날 수 있다. 택일적 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프 5에서 발견될 수 있다. 택일적 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 줄기 P2에서 발견될 수도 있다. 스플라이스 부위는 예를 들어, 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -6 내지 -24 사이의 위치에 존재할 수 있다. 스플라이스 부위는 예를 들어, 앱타머의 서열 GUA 다음에 위치할 수 있다.
"RNA의 스플라이싱을 조절하는"은 RNA의 스플라이싱을 조절하여 상이한 mRNA 분자가 형성되어 잠재적으로 상이한 단백질이 형성되게 하는(언제나 상이한 단백질이 형성되게 하는 것은 아님) 리보스위치를 의미한다. 리보스위치는 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다.
또한, 본 명세서에는 RNA의 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 예를 들어, 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 화합물 또는 유발 분자를 리보스위치와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 화합물은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 차단하는 데 사용될 수 있다. 리보스위치에 대한 유발 분자(및 다른 활성화 화합물)를 사용하여 리보스위치를 활성화시킬 수 있다. 일반적으로, 유발 분자 이외의 화합물(예컨대, TPP)을 사용하여 리보스위치를 불활성화시킬 수 있거나 차단할 수 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치의 존재로부터 유발 분자를 제거함으로써 불활성화시킬 수도 있다. 따라서, 리보스위치를 불활성화시키는 개시된 방법은 예를 들어, 리보스위치의 존재로부터 또는 리보스위치와의 접촉으로부터 유발 분자(또는 다른 활성화 화합물)을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키지 않는 유발 분자의 유사체의 결합에 의해 차단될 수 있다.
또한, 본 명세서에는 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 포함하는 RNA 분자와 화합물을 접촉시켜 상기 RNA 분자의 발현 또는 상기 RNA 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 변경시키는 방법이 개시되어 있다. 리보스위치는 예를 들어, RNA 분자의 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 따라서, 리보스위치를 포함하는 원하는 RNA 분자를, 상기 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 조건 하에 둠으로써 RNA의 발현을 변경할 수 있다. 발현은 예를 들어, 전사 종결의 결과로서 변경될 수 있거나 또는 리보좀과 RNA의 결합 차단의 결과로서 변경될 수 있다. 유발 분자의 결합은 리보스위치의 성질 및 일어나는 택일적 스플라이싱의 종류에 따라 RNA 분자의 발현을 감소시키거나 방해할 수 있거나, 또는 RNA 분자의 발현을 촉진하거나 증가시킬 수 있다.
본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단함으로써 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 포함하는 천연 발생적 유전자 또는 RNA의 발현을 조절하는 방법도 개시되어 있다. 리보스위치는 예를 들어, RNA의 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 상기 유전자가 이것을 보유하는 세포 또는 유 기체의 생존에 필수적인 경우, 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단은 세포 또는 유기체의 사멸, 생장 저지 또는 약화를 초래할 수 있다. 예를 들어, 미생물의 생존에 필수적인 천연 발생적 유전자 내의 천연 발생적 리보스위치를 활성화시키면 상기 미생물이 사멸할 수 있다(상기 리보스위치의 활성화가 택일적 스플라이싱을 조절하고, 택일적 스플라이싱이 핵심적인 단백질을 상향-조절하거나 하향-조절하는 경우). 이것은 항균 효과 및 항진균 효과를 위해 개시된 화합물 및 방법을 이용하는 것에 대한 근거이다. 이 항균 효과를 나타내는 화합물은 세균 생장 저지, 살균 또는 살진균 화합물인 것으로 간주된다.
또한, 본 명세서에는 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 화합물을 선별하고 확인하는 방법이 개시되어 있다. 리보스위치는 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치의 활성화는 유발 분자의 결합 시 리보스위치의 상태 변화를 의미한다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 이외의 방법으로 유발 분자 이외의 화합물에 의해 활성화될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유발 분자"는 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 분자 및 화합물을 지칭하는 데 사용된다. 이것은 리보스위치에 대한 천연 또는 통상의 유발 분자, 및 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 다른 화합물을 포함한다. 천연 또는 통상의 유발 분자는 천연 상태의 소정의 리보스위치에 대한 유발 분자이거나, 또는 일부 비-천연 리보스위치의 경우, 리보스위치를 디자인하는 데 사용되거나 리보스위치를 선별하는 데(예를 들어, 시험관내 선별 또는 시험관내 진화 기법에서 선별하는 데) 사용된 유발 분자이다. 비-천연 유발 분자 는 비-천연 유발 분자로서 지칭될 수 있다.
또한, 본 명세서에는 진균 생장을 억제하는 방법으로서, 진균에 감염된 개체를 식별하는 단계, 및 TPP-반응성 리보스위치를 억제하는 화합물 유효량을 상기 개체에게 투여하여 진균 생장을 억제하는 단계를 포함하는 방법이 개시되어 있다. 진균 생장의 억제는 진균 생체질량에서의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 감소를 포함할 수 있다.
본 명세서에는 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하는 방법도 개시되어 있다. 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키는 화합물은, 시험 화합물을 리보스위치와 접촉시키고 유전자 생성물의 택일적 스플라이싱을 측정하거나 스플라이싱의 결과로서 발현된 단백질의 차등 발현 수준을 측정하여 상기 리보스위치의 활성화를 평가함으로써 동정할 수 있다. 리보스위치가 활성화되는 경우, 시험 화합물은 상기 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정된다. 리보스위치의 활성화는 임의의 적절한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 리보스위치는 레포터 RNA에 연결될 수 있고, 상기 레포터 RNA의 발현, 발현 수준 또는 발현 수준의 변화는 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 측정될 수 있다. 또 다른 예로서, 리보스위치는 구조-의존적 표지를 포함할 수 있고, 이 표지로부터의 신호는 상기 리보스위치의 활성화 상태에 따라 변한다. 이러한 리보스위치는 바람직하게는 천연 발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연 발생적 리보스위치로부터 유래된 앱타머 도메인을 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 리보스위치의 활성화 평가는 대조군 분석 또는 측정을 이용하거나 이용하지 않고 수행할 수 있다. 리보스위치를 불활성화시키는 화합물을 동정하는 방법도 유사한 방식으로 수행할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법들 이외에, 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 차단하는 화합물의 동정은 임의의 적절한 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키거나 불활성화시키는 것으로 공지된 화합물의 존재 및 시험 화합물의 존재 하에서 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 평가하는 분석을 수행할 수 있다. 활성화 또는 불활성화가 시험 화합물의 부재 하에서 관찰되는 것처럼 관찰되지 않는 경우, 상기 시험 화합물은 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 차단하는 화합물로서 동정된다.
본 명세서에는 택일적 스플라이싱을 조절하는 바이오센서 리보스위치를 사용하여 화합물을 검출하는 방법도 개시되어 있다. 상기 방법은 시험 화합물과 바이오센서 리보스위치를 접촉시키는 단계, 및 상기 바이오센서 리보스위치의 활성화를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 바이오센서 리보스위치의 활성화는 시험 샘플 중에 바이오센서 리보스위치에 대한 유발 분자가 존재함을 표시한다. 바이오센서 리보스위치는 그의 동족 유발 분자의 존재 하에서 검출가능한 신호를 발생시키는 개조된 리보스위치이다. 유용한 바이오센서 리보스위치는 유발 분자의 역치 수준 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 리보스위치는 생체내에서 또는 시험관내에서 사용될 수 있도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 택일적 결합을 조절하는 바이오센서 리보스위치는 리보스위치/레포터 RNA를 코딩하는 핵산 구축물을 보유하는 세포 또는 유기체를 개조함으로써 생체내에서 사용될 수 있는 신호로서 작용하거나 상기 신호를 발생시키는 데 관여하는 단백질을 코딩하는 레포터 RNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 시험관내에서 사용되는 바이오센서 리보스위치의 일례는 구조-의존적 표지를 포함하는 리보스위치이고, 상기 표지로부터의 신호는 상기 리보스위치의 활성화 상태에 따라 변한다. 이러한 바이오센서 리보스위치는 바람직하게는 천연 발생적 TPP 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연 발생적 TPP 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다.
또한, 본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하고 동정된 화합물을 제조함으로써 수득되는 화합물이 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물 동정 방법을 동정된 화합물의 제조 방법과 조합하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고, 상기 리보스위치의 활성화를 평가하고, 상기 리보스위치가 상기 시험 화합물에 의해 활성화되는 경우, 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득할 수 있다.
또한, 본 명세서에는 화합물에 의한 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단을 동정하고 동정된 화합물을 제조함으로써 수득되는 화합물이 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물 활성화, 불활성화 또는 차단 평가 방법을 확인된 화합물의 제조 방법과 조합하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 시험 화합물을 리보스위치와 접촉시키고, 상기 리보스위치의 활성화를 평가하고, 상기 리보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된 경우 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득할 수 있다. 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 능력에 대해 화합물을 조사하는 것은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이전에 공지되지 않은 화합물을 동정하는 것, 및 화합물이 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이미 공지되어 있는 경우 상기 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물의 능력을 평가하는 것 둘다를 의미한다.
A. 항진균 화합물의 동정
화합물은 리보스위치 분석에서의 신호가 상기 화합물의 부재 하에서의 동일한 리보스위치 분석(즉, 대조군 분석)에 비해 상기 화합물의 존재 하에서 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500% 이상 증가되는 경우 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정될 수 있거나 리보스위치 활성화 활성을 나타내는 화합물로서 동정될 수 있다. 리보스위치 분석은 임의의 적절한 리보스위치 구축물을 사용하여 수행할 수 있다. 리보스위치 활성화 분석에 특히 유용한 리보스위치 구축물은 본 명세서에 기재되어 있다. 리보스위치를 활성화시키는 화합물 또는 리보스위치 활성화 활성을 나타내는 화합물의 동정은 1가지 이상의 특정 리보스위치, 리보스위치 구축물 또는 리보스위치 클래스의 관점에서 수행될 수 있다. 편의상, 택일적 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정된 화합물은 특정 리보스위치에 대해서도 그와 같은 활성이 확인될 수 있다.
B. 항진균 화합물의 사용 방법
본 명세서에는 생체내 및 시험관내 항진균 방법이 개시되어 있다. "항진균"은 진균 생장의 억제 또는 저해, 진균 사멸, 또는 진균 수의 감소를 의미한다. 따라서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 1가지 이상의 화합물 유효량과 진균을 접촉시키는 단계를 포함하는, 진균 생장의 억제 또는 저해 방법이 개시되어 있다. 개시된 화합물에 대한 추가 구조는 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에는 TPP-반응성 리보스위치에 결합하는 화합물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 진균 세포 생장의 억제 방법이 개시되어 있는데, 이때 상기 화합물은 TPP-반응성 리보스위치에 결합하여 TPP 생성을 제한함으로써 세균 세포 생장을 억제한다. 이 방법은 상기 화합물과 접촉하지 않은 세포에 비해 세균 세포 생장을 10% 이상 감소시킬 수 있다. 상기 화합물과 상기 세포는 상기 화합물을 개체에게 투여함으로써 접촉할 수 있다. 상기 세포는 개체 내에 있는 진균 세포일 수 있고, 이때 상기 화합물은 진균 세포의 생장을 사멸시키거나 억제한다. 상기 개체는 진균에 감염될 수 있다. 상기 화합물은 또 다른 항진균 화합물과 함께 투여될 수 있다.
진균은 예를 들어, 하기 진균을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다: 애브시디아 코에룰레아(Absidia coerulea), 애브시디아 글라우카(Absidia glauca), 애브시디아 코라임비페라(Absidia corymbifera), 아크레모니움 스트릭툼(Acremonium strictum), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 아포파이소마이세스 엘레간스(Apophysomyces elegans), 사크세나 바시포르미스(Saksena vasiformis), 아스퍼길러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼길러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼길러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 네오사르토라이타 피셔리(Neosartoryta fischeri), 아스퍼길러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼길러스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스퍼길러스 포에니쿠스(Aspergillus phoenicus), 아스퍼길러스 노미누스(Aspergillus nomius), 아스퍼길러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼길러스 오스티아누스(Aspergillus ostianus), 아스퍼길러스 아우리코무스(Aspergillus auricomus), 아스퍼길러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼길러스 소자에(Aspergillus sojae), 아스퍼길러스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스퍼길러스 카에실루스(Aspergillus caesillus), 아스퍼길러스 코니쿠스(Aspergillus conicus), 아스퍼길러스 사이도위이(Aspergillus sydowii), 아스퍼길러스 타마리이(Aspergillus tamarii), 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼길러스 우스투스(Aspergillus ustus), 아스퍼길러스 버시칼라(Aspergillus versicolor), 카에토미움 글로보숨(Chaetomium globosum), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides), 클라도스포리움 허바룸(Cladosporium herbarum), 클라도스포리움 스파에로스퍼뭄(Cladosporium sphaerospermum), 코니디오볼루스 코로나투스(Conidiobolus coronatus), 코니디오볼루스 인콘그루우스(Conidiobolus incongruus), 컨닝하멜라 엘레간스(Cunninghamella elegans), 에메리셀라 니둘란스(Emericella nidulans), 에메리셀라 루굴로사(Emericella rugulosa), 에메리실라 쿠아드릴리네아타(Emericilla quadrilineata), 아피코쿰 니그룸(Apicoccum nigrum), 유로티움 암스텔로다미(Eurotium amstelodami), 유로티움 체말리에리(Eurotium chevalieri), 유로티움 허바리오룸(Eurotium herbariorum), 유로티움 루브룸(Eurotium rubrum), 유로티움 레펜스(Eurotium repens), 제오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 제오트리쿰 클레바니이(Geotrichum klebahnii), 멤모니엘라 에키나타(Memnoniella echinata), 모티에렐라 폴리세팔라(Mortierella polycephala), 모티에렐라 울피이(Mortierella wolfii), 뮤코르 무세도(Mucor mucedo), 뮤코르 앰피비오룸(Mucor amphibiorum), 뮤코르 시르시넬로이데스(Mucor circinelloides), 뮤코르 헤이말리스(Mucor heimalis), 뮤코르 인디쿠스(Mucor indicus), 뮤코르 라세모수스(Mucor racemosus), 뮤코르 라모시스시무스(Mucor ramosissimus), 리조푸스 아자이고스포로우스(Rhizopus azygosporous), 리조푸스 호모탈리쿠스(Rhizopus homothalicus), 리조푸스 마이크로스포레스(Rhizopus microspores), 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 마이로쎄시움 버루카리아(Myrothecium verrucaria), 마이로쎄시움 로리둠(Myrothecium roridum), 파에실로마이세스 릴라시누스(Paecilomyces lilacinus), 파에실로마이세스 바리토티이(Paecilomyces variotii), 페니실리움 프레이이(Penicillium freii), 페니실리움 버루코숨(Penicillium verrucosum), 페니실리움 히르수툼(Penicillium hirsutum), 페니실리움 알버레키이(Penicillium alberechii), 페니실리움 아우란티오그리세움(Penicillium aurantiogriseum), 페니실리움 폴로니쿰(Penicillium polonicum), 페니실리움 비리디카툼(Penicillium viridicatum), 페니실리움 히르수툼(Penicillium hirsutum), 페니실리움 브레비콤팩툼(Penicillium brevicompactum), 페니실리움 크라이소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 그리세오풀붐(Penicillium griseofulvum), 페니실리움 글란디콜라(Penicillium glandicola), 페니실리움 코프로필룸(Penicillium coprophilum), 유페니실리움 크루스타세움(Eupenicillium crustaceum), 유페니실리움 에깁티아쿰(Eupenicillium egyptiacum), 페니실리움 크루스토숨(Penicillium crustosum), 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum), 페니실리움 사토라이이(Penicillium sartoryi), 페니실리움 베스트링기(Penicillium westlingi), 페니실리움 코라일로필룸(Penicillium corylophilum), 페니실리움 데쿰벤스(Penicillium decumbens), 페니실리움 에키눌라툼(Penicillium echinulatum), 페니실리움 솔리툼(Penicillium solitum), 페니실리움 카멤버티이(Penicillium camembertii), 페니실리움 콤뮨(Penicillium commune), 페니실리움 에키눌라툼(Penicillium echinulatum), 페니실리움 스클레로티게눔(Penicillium sclerotigenum), 페니실리움 이탈리쿰(Penicillium italicum), 페니실리움 익스판숨(Penicillium expansum), 페니실리움 펠루타눔(Penicillium fellutanum), 페니실리움 찰레시이(Penicillium charlesii), 페니실리움 잔티넬룸(Penicillium janthinellum), 페니실리움 라페리(Penicillium raperi), 페니실리움 마드리티(Penicillium madriti), 페니실리움 글라디올리(Penicillium gladioli), 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum), 페니실리움 로쿠에포티이(Penicillium roquefortii), 페니실리움 심플리시스시뭄(Penicillium simplicissimum), 페니실리움 오크로클로론(Penicillium ochrochloron), 페니실리움 스피놀루숨(Penicillium spinulosum), 페니실리움 글라브룸(Penicillium glabrum), 페니실리움 쏨미 이(Penicillium thomii), 페니실리움 푸푸레센스(Penicillium pupurescens), 유페니실리움 라피도숨(Eupenicillium lapidosum), 리조뮤코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 리조뮤코르 푸실루스(Rhizomucor pusillus), 리조뮤코르 바리애빌리스(Rhizomucor variabilis), 리조푸스 스톨로니퍼(Rhizopus stolonifer), 스코풀라리오프시스 아스퍼룰라(Scopulariopsis asperula), 스코풀라리오프시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis), 스코풀라리오프시스 푸스카(Scopulariopsis fusca), 스코풀라리오프시스 브룸프티이(Scopulariopsis brumptii), 스코풀라리오프시스 차타룸(Scopulariopsis chartarum), 스코풀라리오프시스 스파에로스포라(Scopulariopsis sphaerospora), 트라이코더마 아스퍼렐룸(Trichoderma asperellum), 트라이코더마 하마툼(Trichoderma hamatum), 트라이코더마 비리드(Trichoderma viride), 트라이코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트라이코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트라이코더마 시트로비리드(Trichoderma citroviride), 트라이코더마 아트로비리드(Trichoderma atroviride), 트라이코더마 콘닝기이(Trichoderma koningii), 울로클라디움 아트룸(Ulocladium atrum), 울로클라디움 차타룸(Ulocladium chartarum), 울로클라디움 보트라이티스(Ulocladium botrytis), 왈레미아 세비(Wallemia sebi), 및 스타카이보트라이스 차타룸(Stachybotrys chartarum). 진균 생장은 진균이 발견되는 임의의 부분에서 억제될 수도 있다. 예를 들어, 체액, 생체막 및 표면에서의 진균 생장이 억제될 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물은 임의의 다른 화합물 또는 조성물과 함께 투여될 수 있거나 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물은 또 다른 항진균 화합물과 함께 투여될 수 있거나 사용될 수 있다.
"진균 생장의 억제"는 딸세포로 분열하는 단일 진균의 능력 감소, 또는 딸세포를 형성하는 진균 집단의 능력 감소로서 정의된다. 진균의 재생 능력은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 100% 이상까지 감소될 수 있다.
또한, 본 명세서에는 본 명세서에 개시되고 기재된 1가지 이상의 화합물과 진균을 접촉시키는 단계를 포함하는, 진균 또는 진균 집단 생장 억제 방법 및/또는 진균 또는 진균 집단의 사멸 방법이 개시되어 있다.
"진균의 사멸"은 단일 진균의 사멸 야기, 또는 복수의 진균, 예컨대, 콜로니 중의 진균의 수 감소로서 정의된다. 진균이 복수형으로 언급되는 경우, "진균들의 사멸"은 소정의 진균 집단의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이하의 진균이 사멸하는 속도로 상기 진균 집단의 세포가 사멸하는 것으로서 정의된다.
본 명세서에 개시된 화합물 및 조성물은 시험관내에서 또는 생체내에서 항진균 활성을 나타내고 살진균 활성을 나타낼 수 있는 다른 화합물 또는 조성물과 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물의 "치료 유효량"이라는 용어는 독성을 나타내지 않되 1가지 이상의 증상에서의 원하는 감소를 제공하기에 충분한 화합물 양을 의미한다. 이하에 기재되는 바와 같이, 화합물의 정확한 필요량은 개체의 종, 성별 및 일반적인 증상, 치료될 질환의 심각도, 사용되는 구체적인 화합물, 투여 방식 등에 따라 개체마다 다를 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정할 수는 없다. 그러나, 적정한 유효량은 관용적인 실험만으로 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 생체내로 투여될 수 있다. "약학적으로 허용가능한"은 생물학적 활성을 나타내지 않거나 바람직하지 않은 활성을 나타내지 않는 물질, 즉 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나 약학 조성물 중에 함유된 임의의 다른 성분들과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 상기 담체는 일반적으로 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 개체 내에서 임의의 불리한 부작용을 최소화하도록 선택될 것이다.
본 명세서에 개시된 조성물 또는 화합물은 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내), 근육내 주사, 복강내 주사, 경피, 체외, 국소(국소 비강내 투여 또는 흡입제에 의한 투여를 포함함) 경로 등을 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "국소 비강내 투여"는 콧구멍 중 하나 또는 둘다를 통해 코 또는 비강 경로 내로 조성물을 전달하는 것을 의미하고 분무 기작 또는 소적 기작을 통한 전달, 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한 전달을 포함할 수 있다. 흡입제에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 소적 기작에 의한 전달을 통한 코 또는 입을 통해 이루어질 수 있다. 전달은 삽관을 통해 호흡 시스템의 임의의 영역(예컨대, 폐)으로 직접적으로 이루어질 수도 있다. 필요한 조성물의 정확한 양은 개체의 종, 성별, 체중 및 일반적 증상, 치료될 알레르기성 장애의 심각도, 사용될 구체적인 핵산 또는 벡터, 투여 방식 등에 따라 개체마다 다를 것이다. 따라서, 조성물마다 정확한 양을 특정할 수는 없다. 그러나, 적정량은 본 명세서의 교시가 주어진 한 관용적인 실험만으로 당업자에 의해 결정될 수 있다.
조성물 또는 화합물의 비경구 투여는 이용되는 경우 일반적으로 주사를 특징으로 한다. 주사제는 액상 용액 또는 현탁액과 같은 보편적인 형태, 주사 전에 액체 중의 현탁액을 제조하기에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 비경구 투여에 대한 보다 최근의 개선된 방법은 일정한 투여량이 유지되도록 서방출 또는 지속 방출 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제3,610,795호를 참조한다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 치료적으로 사용될 수 있다. 적절한 담체 및 이의 제제는 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995)에 기재되어 있다. 전형적으로, 적정량의 약학적으로 허용가능한 염을 제제 중에 사용하여 상기 제제가 등장성을 나타내게 한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 생리식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이고, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가 담체는 지속 방출 제제, 예컨대, 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체로 이루어져 있고 성형 제품, 예컨대, 막, 리포좀 또는 미세입자의 형태인 반투과성 매트릭스를 포함한다. 일부 담체가 예를 들어, 투여 경로 및 투여될 조성물의 농도에 따라 더 바람직할 수 있음은 당업자에게 자 명할 것이다.
약학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 이들 대부분은 전형적으로 약물을 인간에게 투여하는 데 있어서 표준 담체(멸균수, 생리식염수, 및 생리학적 pH로 완충된 용액과 같은 용액들을 포함함)일 것이다. 조성물은 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자에 의해 이용되는 표준 절차에 따라 투여될 것이다.
약학 조성물은 선택된 분자 이외에 담체, 비후제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면활성제 등을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 항균제, 소염제, 마취제 등과 같은 1가지 이상의 활성 성분을 포함할 수도 있다.
약학 조성물은 국소 치료가 필요한지 아니면 전신 치료가 필요한지, 및 치료될 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안내, 질내, 직장, 비강내를 포함함), 경구, 흡입 또는 비경구, 예컨대, 정맥내 드립, 피하, 복강내 또는 근육내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 개시된 항체는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 강내 또는 경피 경로로 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용액의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액(생리식염수 및 완충된 매질을 포함함)을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거 또는 고정된 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스를 기초로 한 보충제) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 기체 등도 존재할 수 있다.
국소 투여용 제제는 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 분무제, 액체 및 산제를 포함할 수 있다. 보편적인 약학적으로 허용가능한 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 비후제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
경구 투여용 조성물은 산제 또는 과립제, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐제, 샤세, 또는 정제를 포함한다. 비후제, 방향제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 필요할 수 있다.
일부 조성물은 무기 산, 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산 및 인산, 및 유기 산, 예컨대, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산 및 푸마르산과의 반응에 의해 형성되거나, 또는 무기 염기, 예컨대, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 및 유기 염기, 예컨대, 모노알킬 아민, 다이알킬 아민, 트라이알킬 아민, 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된 약학적으로 허용가능한 산 부가 염 또는 염기 부가 염으로서 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 치료 조성물은 화합물 분자에 커플링된 개별 담체로서의 단일클론 항체의 사용을 통해 전달될 수도 있다. 본 명세서에 개시된 치료 조성물은 표적화가능한 약물 담체로서의 가용성 중합체와 커플링될 수도 있다. 상기 중합체는 폴리비닐-피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필메타크릴-아마이 드페놀, 폴리하이드록시에틸아스파르트아마이드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥사이드폴리라이신을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 게다가, 본 명세서에 개시된 치료 조성물은 약물의 조절된 방출을 달성하는 데 유용한 생분해가능한 중합체 클래스, 예컨대, 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르쏘에스터, 폴리아세탈, 폴리다이하이드로-피란, 폴리시아노아크릴레이트, 및 가교-결합된 또는 양친매성 하이드로겔 블록 공중합체에 커플링될 수 있다.
바람직하게는 약 3% 이상, 더 바람직하게는 약 10%, 더 바람직하게는 약 20%, 더 바람직하게는 약 30%, 더 바람직하게는 약 50%, 더 바람직하게는 75%, 훨씬 더 바람직하게는 약 100%의 진균 감염이 화합물의 투여로 인해 감소될 수 있다. 감염의 감소는 감소된 백혈구 세포수, 낮아진 열, 완화된 염증, 감소된 진균 수 및 진균 감염에 있어서의 다른 증상의 감소와 같은 파라미터에 의해 결정된다. 진균 감염 감소의 비율을 증가시키기 위해, 투여량은 개체에 대해 무독성을 나타내는 가장 효과적인 수준까지 증가될 수 있다.
본 명세서 전체에서 사용된 "개체"는 단일체를 지칭한다. 바람직하게는, 개체는 비-인간 포유동물 또는 영장류, 더 바람직하게는 인간과 같은 포유동물이다. "개체"는 애완동물(예컨대, 고양이, 개 등), 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험용 동물(예컨대, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피그 등) 및 어류를 포함할 수 있다.
"진균 감염"은 개체 또는 샘플 중의 진균의 존재로서 정의된다. 상기 진균 은 상기 개체 또는 샘플 중에서의 천연 발생적 진균의 생장일 수 있거나, 또는 외래 유기체의 침윤에 기인할 수 있다.
실시예 1: 진핵 리보스위치에 의한 택일적 RNA 스플라이싱 및 유전자 발현의 조절
TPP 앱타머를 보유하는 진균 아스퍼길러스 오리자에 thiA mRNA의 선행 연구(Kubodera et al. (2003))는 생장 배지의 티아민(비타민 B1) 보충이 유전자 발현을 감소시키고 리보스위치 앱타머 부분의 결실이 티아민 반응성을 파괴함을 밝혔다. 이 발견은 티아민이 세포로 들어가 인산화되어 TPP를 발생시키고 생성된 보조효소가 진균에서의 RNA 스플라이싱의 리보스위치-매개된 조절에 대한 리간드로서 작용함을 보여준다(Sudarsan et al. (2003)). 이 연구에서, 뉴로스포라 크라사 내의 3가지 유전자에 존재하는 TPP 앱타머(도 5)의 기능이 조사되었다. 상기 유전자들 중 2가지 유전자, 즉 NMT1(도 1a) 및 CyPBP37(도 1b; 이하, THI4의 유사체로서 지칭됨)은 티아민 대사 유전자로서 공지되어 있다(McColl et al. (2003), Faou & Tropschug (2003), Faou Tropschug (2004)). 세 번째 유전자, 즉 NCU01977.1(도 1c)은 공지되지 않은 기능을 갖는 단백질을 코딩한다.
상기 조사는 뉴로스포라 크라사(McColl et al. (2003)) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(Maundrell (1989)) 내의 과도한 티아민에 의해 억제되는 것으로 공지되어 있는 NMT1 유전자에 주로 초점을 맞추었다. 3가지 전구체 mRNA 모두 5' 말단 근처에 존재하는 인트론 내에 리보스위치를 갖는다(도 1 및 6). 역전사 및 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용하여, 뉴로스포라 크라사가 티아민의 부재 또는 존재 하에서 생장한 경우 생성된 전사체의 5' 말단의 상대적인 양 및 뉴클레오티드 서열을 확립하였다(도 1d). RNA 생성물의 클로닝 시퀀싱은 게놈 DNA의 서열과 일치하는 전구체 전사체의 존재, 및 도 1에 나타낸 RNA 스플라이싱 생성물과 일치하는 다른 서열의 존재를 보여준다. 결과는 티아민이 NMT1 및 THI4 전구체 mRNA의 택일적 스플라이싱을 야기하고 NCUO1977.1 전구체 mRNA의 스플라이싱에서의 증가를 야기함을 확인시켜준다. 티아민은 TPP 리보스위치를 갖지 않은 RNA의 스플라이싱에는 영향을 미치지 않는다(도 7).
NMT1 RNA 구축물에 의한 TPP 결합은 인-라인 프로빙(Soukup & Breaker (1999))에 의해 확인되었다(도 8 및 9). 주요 구조적 조절을 나타내는 뉴클레오티드는 TPP의 결합에 관여하는 것으로 공지되어 있고(Thore et al. (2006), Serganov et al. (2006), Edwards & Ferre-D'Amare (2006)), 두 구축물에 대해 측정된 약 300 pM의 겉보기 해리 상수(KD)는 박테리아 TPP 리보스위치에 의해 나타나는 겉보기 KD와 유사하다(Winkler et al. (2002), Welz & Breaker (2007)). NMT1 RNA 택일적 스플라이싱의 티아민 조절을 RT-PCR로 더 조사함으로써, 최소 배지 중에서 생장되고 티아민 보충 후 다양한 시점에서 샘플링된 뉴로스포라 크라사로부터 단리된 전사체의 종류 및 양을 확립하였다(도 2a). 첨가된 티아민의 부재 하에서(t = 0 분), 전사체를 프로세싱하여 스플라이싱 생성물 1-3을 수득하였다. 티아민 보충 후 1시간 내에 스플라이싱 생성물 I-2, 및 스플라이싱되지 않은 NMT1 전구체 RNA I-1 이 나타났다. 4시간 내에, 생성물 I-3은 생성물 I-2 및 I-1로 거의 완전히 대체되었다. 이 결과는 티아민 첨가 후 생성물 1-3의 급격한 감소가 감소된 NMT1 발현의 원인임을 보여준다.
루시퍼라제(LUC) 레포터 유전자와 인 프레임으로 융합되어 있는 주 ORF의 개시 코돈을 갖는 NMT1 5' UTR 및 이의 변이체를 보유하는 구축물을 사용하여, 유전자 조절에 있어서 TPP 앱타머의 중요성을 평가하였다. 야생형(WT) LUC 레포터 구축물의 상당한 억제가 30 μM 티아민으로 보충된 배지 중에서 밤새 생장된 뉴로스포라 크라사에서 일어났다(도 2c, 상부). 뿐만 아니라, 레포터 구축물로부터 유래된 RT-PCR 생성물과 천연 NMT1 mRNA는 동등하였다(도 2c, 하부). 대부분의 돌연변이체 구축물은 세포가 티아민-무함유 배지 중에서 생장된 경우 WT에 비해 레포터 활성에서의 2배 내지 3배 증가를 보였다. TPP 결합 친화성을 약화시키는 돌연변이는 최소 배지 중에서 생장하는 세포 내에서의 TPP의 합성에 의해 야기된 중등도의 유전자 억제를 없앨 수도 있다.
앱타머 내에서의 염기쌍 형성을 파괴한 후 복원시키는 P1 줄기 내지 P5 줄기에서의 돌연변이 대부분(구축물 M1 내지 M9, 도 2b)은 TPP에 결합하는 RNA의 능력과 상호관련된 유전자 조절 특성을 발생시킨다. P3의 연장된 부분이 M5에서 파괴되더라도, 이 변화는 앱타머의 TPP-결합 코어 외부에서 일어나고 유전자 조절에 대해 거의 영향을 미치지 않는다. 또한, 연장된 P3 줄기의 대부분은 기능의 완전한 손실 없이 결실될 수 있다(도 8에서 115 NMT1 RNA와 유사한 M10). M1 내에서의 돌연변이는 LUC 활성의 급격한 감소를 야기하고, 전형적인 mRNA 생성물은 검출되지 않았는데(도 2c), 이는 앱타머 내의 일부 뉴클레오티드 및 구조가 TPP에의 결합에서의 그들의 역할 이외에 mRNA 전사 또는 프로세싱에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
가장 두드러진 결과는 M8의 P5 줄기 내에 파괴적 돌연변이에 대한 보상 돌연변이를 갖는 M9에서 발견되었다. M9는 WT 또는 다른 보상 돌연변이체보다 훨씬 더 낮은 발현 수준에서 티아민-의존적 유전자 조절의 부분적 회복만을 나타내었다(도 2c). M9의 이러한 독특한 특성은 P5 내의 뉴클레오티드가 택일적 스플라이싱의 조절에 참여하는 기작과 일치한다(하기 참조).
티아민 조절에 대한 대부분의 돌연변이의 효과는 본 연구자들로 하여금 스플라이싱되지 않은 RNA 또는 택일적으로 스플라이싱된 RNA가 주 ORF의 업스트림에 위치한 개시 코돈의 존재로 인해 불활성 상태로 존재한다고 추측하게 하였다(도 1a). 이 가설은 3가지 종류의 NMT1 5'UTR의 WT 및 돌연변이체 형태의 업스트림에 융합된 추가 LUC 레포터 구축물을 조사함으로써 시험하였다(도 3a). 업스트림 개시 코돈을 갖지 않고 첨가된 티아민의 부재 하에서 주로 생성되는 짧은(또는 완전히) 스플라이싱된 mRNA를 모방하는 생성된 구축물 I-3R은 강한 레포터 활성을 나타낸다(도 3b). 대조적으로, 유사체인 I-2R 구축물은 레포터 활성을 거의 나타내지 않는데, 이것은 티아민이 존재하고 유전자 발현이 감소된 경우 상기 스플라이스 변이체의 천연 발생과 일치한다(도 2c). 구축물 I-2R 및 I-3R을 사용한 LUC 발현 수준은 TPP 리보스위치가 존재하지 않기 때문에 예측한 대로 티아민의 첨가에 의해 변경되지 않는다.
주 NMT1 ORF의 업스트림에 위치한, 택일적으로 스플라이싱된 I-2 구축물(도 3a) 내의 제1 개시 코돈의 파괴(M11), 제2 개시 코돈의 파괴(M12) 또는 이들 코돈 둘다(M13)의 파괴는 점진적으로 더 많은 레포터를 발현하는 구축물을 발생시킨다. 진균 유전자의 5' UTR 내의 짧은 업스트림 ORF(uORF)는 주 ORF의 발현을 감소시키는 것으로 관찰되었다(Vilela & McCarthy (2003)). 따라서, I-2 구축물 내의 두 uORF 개시 코돈의 파괴 시 LUC 발현의 회복은 uORF 번역이 주 NMT1 ORF의 감소된 발현의 원인이라는 가설과 일치한다.
제1의 5' 스플라이스 부위에서 돌연변이를 갖는 전사체(M14), 스플라이싱 분지 부위에서 돌연변이를 갖는 전사체(M15) 또는 3' 스플라이스 부위에서 돌연변이를 갖는 전사체(M16)(도 3a)는 레포터를 균일하게 낮은 수준으로 발현한다(도 3b, 상부). RT-PCR 분석은 M14가 I-2R RNA 스플라이싱 생성물을 발생시키지만, M15 및 M16이 스플라이싱을 겪지 않음을 보여준다(도 3b, 하부). 이 발견은 적절한 스플라이싱이 uORF를 제거하고 주 ORF 발현을 허용하는 데 필요함을 입증한다.
많은 세균 리보스위치에 있어서, 대사물질 결합은 단백질을 수반하지 않으면서 앱타머의 다운스트림에 위치한 발현 플랫폼의 폴딩을 변경시킨다(Winkler et al. (2002), Mironov et al. (2002), Serganov et al. (2006)). NMT1 TPP 리보스위치에 의한 스플라이싱 조절이 앱타머 플랭크(flank)의 단백질-비의존적 구조적 조절로 인한 것인지를 확인하기 위해, NMT1 UTR 구축물에 대해 인-라인 프로빙을 실시하였다(Soukup & Breaker (1999)). 놀랍게도, TPP의 첨가는 분지 부위에서의 뉴클레오티드가 더 구조화되게 하고(도 10) 제2의 5' 스플라이스 부위에서 보다 유 연한 구조를 발생시킨다(도 4a). 나아가, 앱타머의 P4 요소 및 P5 요소의 12개 뉴클레오티드는 리간드의 부재 시 구조적으로 격리되어 있는 제2의 5' 스플라이스 부위에 있는 뉴클레오티드의 대부분과 상보적임이 관찰되었다(도 4b). 상기 P4 요소 및 P5 요소는 TPP의 피로포스페이트 부분의 인식에 필요하므로 TPP 결합과 5' 스플라이스 부위 폐쇄는 상호 배타적이다.
생체내 레포터 분석에서 구축물 M9의 독특한 특성은 리보스위치 기능에 대한 상기 모델과 일치한다. 인-라인 프로빙은 M9 돌연변이가 앱타머와 제2의 5' 스플라이스 부위 사이의 염기쌍 형성을 파괴하고(도 11) 이 구조적 결함이 긴 스플라이싱된 mRNA의 관찰된 생성 및 레포터 발현의 상실을 촉진할 것으로 예측됨(도 2c)을 확인시켜준다. 뿐만 아니라, 유사한 택일적 염기쌍 형성 가능성이 다른 진균 종의 NMT1 유전자와 관련된 모든 TPP 리보스위치의 경우 존재하는데(도 12), 이것은 상기 보존된 택일적 2차 구조가 TPP 리보스위치 발현 플랫폼의 중요한 특징임을 시사한다. 2개의 5' 스플라이스 부위가 제시된 경우, 진균 사카로마이세스 폼베로부터의 스플라이시오좀(spliceosome)은 3' 스플라이스 부위에 인접한 5' 스플라이스 부위를 사용하는 것을 훨씬 더 선호함이 입증되었다(Romfo et al. (2000)). 5' 스플라이스 부위 선호도가 상기와 같은 한, NMT1 mRNA 내의 TPP 리보스위치는 단순히 P4-P5 앱타머 영역과 제2의 5' 스플라이스 부위 사이의 염기쌍 형성을 조절함으로써 택일적 스플라이싱 생성물의 분포에 대한 완전한 조절을 유지할 수 있다. 다른 진균 유전자 내의 TPP 리보스위치는 유전자 조절에 있어서 상이한 기작을 이용하는 듯하다(도 13).
상기 데이터는 TPP 리보스위치-매개된 스플라이싱 조절에 대한 기작과 일치하는데, 이때 대사물질 결합은 택일적 스플라이스 부위 및 인트론의 분지 부위 성분의 이용가능성을 변경시킨다(도 4c). TPP 농도가 낮은 경우, 새롭게 전사된 mRNA는 스플라이싱에 사용될 수 있는 분지 부위를 남기면서 제2의 5' 스플라이스 부위를 폐쇄하는 구조를 채택한다. 제1의 5' 스플라이스 부위로부터의 전구-mRNA 스플라이싱은 mRNA의 I-3 형태의 생성 및 NMT1 단백질의 발현을 이끌어낸다. TPP 농도가 높은 경우, TPP 앱타머와 리간드의 결합은 RNA 폴딩의 알로스테릭 변화를 야기하여 제2의 5' 스플라이스 부위 근처의 구조적 유연성을 증가시키고 분지 부위 근처의 뉴클레오티드를 폐쇄한다. 이 변화들의 조합된 효과는 I-1 mRNA의 스플라이싱 효율의 감소, 및 택일적으로 스플라이싱된 I-2 mRNA를 발생시키도록 프로세싱되는 mRNA의 증가이다. I-1 mRNA 및 I-2 mRNA 둘다 주 ORF의 번역과 경쟁하고 NMT1 발현을 억제하는 uORF를 갖는다.
진핵 유전자 조절에 있어서 택일적 스플라이싱의 수반은 점차적으로 분명해지고 있고(Matlin et al. (2005), Blencowe (2006)), 이 발견은 리보스위치가 단백질 인자를 요구하지 않으면서 스플라이싱 효율 및 스플라이스 부위 선택을 어떻게 조절할 수 있는 지를 보여준다. 매우 다양한 RNA 폴딩이 가능하다면, 구조화된 RNA 도메인은 온도 변화(Colot et al. (2005)) 또는 대사물질 농도 변화(Sudarsan et al. (2003), Kubodera et al. (2003), Borsuk et al. (2007))와 같은 물리적 변화의 직접적 판독을 통해 스플라이싱을 조절하는 데 널리 사용될 것이다(Buratti & Baralle (2004)). 나아가, 개조된 앱타머를 사용한 스플라이싱의 리간드-매개된 조절의 일례가 최근에 보고되었는데(Kim et al. (2005)), 이것은 직접적인 리간드-mRNA 상호작용이 유전자 조절 분야에 있어서 이용될 수 있음을 입증한다. 또한, 진균 TPP 리보스위치에서의 관찰은 생명체의 분리된 도메인들로부터 유래된 리보스위치가 다용도로 사용될 수 있음을 보여주고 미발견된 리보스위치 클래스가 다른 유전자 조절 과정에서 관여할 수 있음을 암시한다.
방법 개요
올리고뉴클레오티드 및 화학물질
RNA를 합성하고, 합성 DNA(도 14) 및 시약을 구입하고, DNA 구축물을 상세한 방법란에 기재된 바와 같이 제조하였다.
RNA 분석
0.5 mg ㎖-1 ℓ-히스티딘으로 보충된 보겔(Vogel) 최소 배지 100 ㎖ 내로 접종된 비-형질전환된 뉴로스포라 크라사로부터 얻은 RNA를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 배양물을 보충된 30 μM 티아민의 부재 또는 존재 하에서 150 rpm에서 24시간 동안 진탕하면서 30℃에서 생장시켰다. 보충 정보란에 기재된 프라이머 및 방법을 이용하여 3가지 유전자의 5' 영역의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 cDNA를 사용하였다. 모든 스플라이싱 생성물을 클로닝 및 시퀀싱으로 확인하였다.
레포터 유전자 분석
새롭게 현탁된 거대분생포자(macroconidia)의 전기천공을 이용하여 뉴로스포라 크라사의 형질전환을 수행하고, 게놈 DNA로부터 유래된 삽입체 특이적 프라이머를 사용한 PCR로 표적 유전자의 삽입을 검증하였다. 루시퍼라제 레포터 구축물의 전사는 NMT1 5' UTR의 업스트림에 삽입된 뉴로스포라 크라사 베타-튜불린(BTUB) 프로모터를 사용하여 구성적으로 유도하였다. 뉴로스포라 크라사는 30 μM 티아민의 부재 또는 존재 하에서 30℃의 2% 글루코스 최소 배지 중에서 밤새 생장시켰다. 샘플을 단리하고 이하에 기재된 바와 같이 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다.
방법
생물정보 검색 및 진균 TPP 리보스위치
본 발명자들은 공지되어 있는 대표적인 TPP 리보스위치들로부터 유도된 수동 큐레이티된 시드 서열 정렬(manually curated seed sequence alignment)을 이용한 공분산 모델 검색을 이용하여 RefSeq 데이터베이스(버젼 13)의 "진균" 분열을 조사하였다. 공분산 모델(Eddy et al. (1994))은 INFERNAL 소프트웨어 팩키지(버젼 0.55)를 사용하여 수득하였다(Eddy, S. R, Department of Genetics, Washington University School of Medicine(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)). 추가 세부사항에 대해서는 보충 정보란 또한 참조한다.
DNA 올리고뉴클레오티드 및 화학물질
합성 DNA는 예일 유니버시티의 HHMI 켁크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터(HHMI Keck Foundation Biotechnology Resource Center)로부터 구입하였다. TPP, 티아민, 소듐 요오도아세테이트(IAA) 및 L-히스티딘은 시그마-알드리치 캄퍼니로부터 구입하였다. [γ-32P]ATP는 아머샴 파마샤로부터 구입하였다.
시험관내 전사
T7 프로모터를 구축물 내로 도입하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR로 뉴로스포라 크라사의 게놈 DNA를 증폭함으로써 DNA 주형을 제조하였다. 서열 CC를 주형 가닥 전사 개시 부위에 부가하여 효율적인 시험관내 전사를 촉진함으로써, 5' 말단에서 GG를 갖는 RNA를 생성하였다. RNA는 제조자의 지시에 따라 RiboMax 전사 키트(프로메가)를 사용하여 제조하였다. 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 RNA를 정제하고 이미 공지되어 있는 바와 같이(Seetharaman et al. (2001)) 32P로 5' 말단을 표지하였다.
RNA 구축물의 인-라인 프로빙
5' 32P-표지된 RNA를 정의된 바와 같이 TPP의 존재 또는 부재 하에서 50 mM Tris-HCl(25℃에서 pH 8.3), 20 mM MgCl2 및 100 mM KCl 중에서 23℃에서 40시간 동안 항온처리하였다. 절단 생성물을 변성 10% PAGE로 분리하고 PhosphorImager(지이 헬쓰케어)로 가시화하고, ImageQuant 소프트웨어를 이용하여 정량하였다. 절단된 RNA의 표준화된 분획 대 사용된 리간드 농도의 로그를 작도함으로써 KD 값을 측정하였다.
균주, 플라스미드 및 배지
뉴로스포라 크라사 87-74(bd; frq+ a; his-3)(Froehlich et al. (2003))를 형질전환을 위한 숙주 균주로서 사용하였다. 초파리 LUC 레포터 유전자를 보유하는 플라스미드 pLL07(J. C. Dunlap의 실험실에 의해 제공됨)(Mehra et al. (2002)) 을 레포터 유전자 구축을 위해 사용하였다. pLL07 내의 LUC 레포터 유전자에 대한 개시 코돈을 QuikChange(스트라타진) 부위-지정 돌연변이유발법으로 제거하여 플라스미드 pLL09를 수득하였다.
위치 1 내지 355에 걸쳐 존재하는, 뉴로스포라 크라사 내의 베타-튜불린 유전자(등록번호 M13630)(Orbach et al. (1986))에 대한 프로모터를, 프라이머 DNA3 및 DNA4를 사용하여 PCR로 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 MfeI 및 EcoRI으로 절단하고 pLL09의 EcoRI 부위 내로 삽입하여 pLUC를 수득하였다. pLUC의 서열은 시퀀싱으로 확인하였다(예일 유니버시티의 HHMI 켁크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터). 에스케리치아 콜라이 Top 10 세포(인비트로겐)를 플라스미드의 개조 과정 동안에 숙주로서 사용하였다.
NMT1 유전자(등록번호 AY007661)의 5' UTR의 클로닝은 프라이머 DNA5 및 DNA6을 사용하여 뉴로스포라 크라사의 게놈 DNA로부터 378 bp 단편(해석된 전사 개시 부위로 시작됨)을 PCR 증폭함으로써 달성하였다. 생성된 WT PCR DNA를 먼저 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 사용하여 클로닝하였다. NMT1 단편을, EcoRI 및 XbaI 제한효소 절단을 이용하여 벡터로부터 방출시키고 pLUC의 적절한 부위 내로 클로닝하였다.
앱타머 돌연변이체 M1 내지 M9 및 스플라이스 부위 돌연변이체 M14 내지 M16을 발생시키기 위해, WT NMT1 함유 TOPO 벡터에 대해 PCR 돌연변이유발법을 수행하였다(프라이머 목록 참조). DNA 시퀀싱으로 돌연변이유발을 확인한 후, 각 돌연변이체 NMT1 단편을 pLUC의 EcoRI/XbaI 부위 내로 클로닝하였다. P3 결실 구축 물(M10)을 클로닝하기 위해, NMT1을 프라이머 DNA5/DNA25 및 DNA26/DNA6을 사용하여 2개의 단편으로 증폭하였는데, 이때 중첩 영역에는 천연 P3a 줄기의 대부분이 결실되어 있었다. 상기 2개의 단편을 외부 프라이머 DNA5 및 DNA6을 사용한 후속 PCR에서 주형으로서 사용하였다. 생성된 단편을 EcoRI 및 XbaI으로 절단하여 pLUC 내로 클로닝하였다. I-2R 및 I-3R 구축물, 및 NMT1의 변이체의 제조는 상기 2개의 택일적으로 스플라이싱된 생성물을 프라이머 DNA5 및 DNA6을 사용한 RT-PCR로 증폭함으로써 달성하였다. 생성된 PCR 생성물을 전술한 바와 같이 클로닝하고 돌연변이시켰다.
NCU01977.1 5' 영역-LUC 레포터 융합체(도 13)를 발생시키기 위해, 예측된 개시 코돈의 업스트림에 위치한 94개의 뉴클레오티드로 시작되는 478개 뉴클레오티드로 구성된 단편을, 프라이머 DNA41 및 DNA42를 사용하여 뉴로스포라 크라사의 게놈 DNA로부터 증폭하고 전술한 바와 같이 pLUC의 EcoRI/XbaI 부위 내로 클로닝하였다. 모든 구축물의 완전성은 시퀀싱으로 확인하였다(예일 유니버시티의 HHMI 켁크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터). 모든 구축물에서 주 ORF(NMT1 또는 NCU01977.1)의 원 개시 코돈이 LUC 레포터 서열과 인 프레임으로 융합되어 있었다.
뉴로스포라 크라사의 생장을 위해 사용되는 표준 액체 배지는 2% 글루코스, 0.5% L-아르기닌, 1X 보겔 최소 배지 및 50 ng/㎖ 바이오틴을 함유하였다. 뉴로스포라 크라사 생장을 위해 사용된 고체 배지(슬랜트)는 1X 보겔 최소 배지, 2% 수크로스 및 1.5% 아가를 함유하였다. 뉴로스포라 크라사 형질전환체의 선별을 위해 사용된 배지는 1X 보겔 최소 배지, 2% 아가, 2% L-소르보스, 0.05% 프럭토스 및 0.05% 글루코스를 함유하였다. 동형다핵세포 단리의 경우, 1% IAA를 함유하는 0.1X 웨스터가드(Westergaard) 배지를 사용하였다.
뉴로스포라 크라사 형질전환 및 레포터 분석
뉴로스포라 크라사의 형질전환을, 공지되어 있는 바와 같이 새롭게 현탁된 거대분생포자의 전기천공을 이용하여 수행하였다(Davis (2000), Loros. & Dunlap (1991), Vann (1995)). 표적 유전자의 삽입은 게놈 DNA로부터의 삽입체 특이적 프라이머를 사용한 PCR로 검증하였다. 동형다핵세포 균주를 공지되어 있는 바와 같이 단리하였다(Ebbole & Sachs (1990)).
LUC 레포터 유전자 분석
LUC 레포터 구축물로 형질전환된 뉴로스포라 크라사로부터 얻은 균사체를 여과하여 단리하고, 약 100 mg의 조직을 미세한 분말 형태로 분쇄하였다. 100 ㎕의 1X 수동 용해 완충제(프로메가)를 첨가한 후, 샘플을 철저하게 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한 후, 13,000 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 수득된 상청액에 대한 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가) 및 플레이트-판독 발광측정계(발락)를 이용하여 측정하였다. 브래드포드 단백질 분석(바이오라드)에 의해 측정된, 추출물의 총 단백질 농도에 걸쳐 루시퍼라제 활성을 표준화하하고 기준 구축물을 기준으로 최종적으로 표시하였다. 루시퍼라제 배경 활성(비-형질전환된 뉴로스포라 크라사)은 첨가된 티아민이 없는 상태에서 생장된 세포 내의 야생형 NMT1 구축물을 기준으로 0.05%이었다.
RT-PCR 분석
제조자의 지시에 따라 TRIzol® LS 시약(인비트로겐)을 사용하여 균사체로부터 총 RNA를 단리하였다. 5 ㎍의 총 RNA를 37℃에서 RNase-무함유 DNase I(프로메가)으로 30분 동안 처리하였다. 제조자의 지시에 따라 SuperScriptTM II 역전사 효소(인비트로겐)를 사용하여 42℃에서 폴리T 프라이머를 사용한 역전사를 1시간 동안 수행하여 cDNA를 생성하였다. 게놈 DNA로의 오염으로부터 유래된 증폭 생성물의 가능성을 배제하기 위해, 역전사 전에 RNA 제제를 사용한 대조군 반응을 수행하였고, NMT1의 경우, 코딩 영역 내의 엑손-엑손 경계에 걸쳐 있는 역방향 프라이머를 사용하였다.
생물정보 검색 및 진균 TPP 리보스위치
공지되어 있는 대표적인 TPP 리보스위치들로부터 유도된 수동 큐레이티된 시드 서열 정렬을 이용한 공분산 모델 검색을 이용하여 RefSeq 데이터베이스(버젼 13)의 "진균" 분열을 조사하였다. 공분산 모델(Eddy et al. (1994))은 INFERNAL 소프트웨어 팩키지(버젼 0.55)를 사용하여 수득하였다.
공지되어 있는 리보스위치 서열의 회수를 검증하기 위해, 최종 결과를, 티아민 대사 유전자의 철저한 비교 게놈 분석을 통해 수집된 TPP 리보스위치 목록과 비교하였다. 이 방법은 미생물 종에서 이미 확인된 모든 리보스위치를 성공적으로 확인시켜주었다. 추가로, 섬유상 진균 11종으로부터의 23가지 유전자와 관련된 TPP 리보스위치가 확인되었다(도 5).
상기 방법으로 진균에서 확인된 리보스위치-관련 유전자들 중 몇몇 유전자는 티아민 대사에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 또한, 이들의 각 ORF의 아미노산 서열을 기초로 할 때, 상기 목록에 있는 대부분의 특징규명되지 않은 유전자들이 티아민 대사 단백질의 유사체임이 발견되었다. 진균에서 발견된 TPP 앱타머는 이의 진정세균 유사체와 거의 동일한데, 이것은 기능적 보존과 일치한다. 그러나, 대표적인 진균 TPP 앱타머는 2가지 뚜렷한 차이점을 갖는다. 첫 번째 차이점은 대표적인 진정세균에는 종종 존재하지만 앱타머와 TPP의 결합에는 필요하지 않은 P3a 줄기가 일관되게 존재하지 않는다는 점이다. 두 번째 차이점은 섬유상 진균에서 P3 줄기의 길이가 4 내지 83개 염기쌍일 정도로 상당히 불균질하다는 점이다. 뉴로스포라 크라사 내의 3가지 TPP 리보스위치의 위치는 도 6에 표시되어 있다.
DNA 올리고뉴클레오티드 및 화학물질
합성 DNA는 예일 유니버시티의 HHMI 켁크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터로부터 구입하였다. TPP, 티아민, IAA 및 L-히스티딘은 시그마-알드리치 캄퍼니로부터 구입하였다. [γ-32P]ATP는 아머샴 파마샤로부터 구입하였다.
시험관내 전사
T7 프로모터를 구축물 내로 도입하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR로 뉴로스포라 크라사의 게놈 DNA를 증폭함으로써 DNA 주형을 제조하였다. 서열 CC를 주형 가닥 전사 개시 부위에 부가하여 효율적인 시험관내 전사를 촉진함으로써, 5' 말단에서 GG를 갖는 RNA를 생성하였다. RNA는 제조자의 지시에 따라 RiboMax 전사 키트(프로메가)를 사용하여 제조하였다. 변성 PAGE로 RNA를 정제하고 이미 공지되 어 있는 바와 같이(Seetharaman et al. (2001)) 32P로 5' 말단을 표지하였다.
RNA 구축물의 인-라인 프로빙
5' 32P-표지된 RNA를 정의된 바와 같이 TPP의 존재 또는 부재 하에서 50 mM Tris-HCl(25℃에서 pH 8.3), 20 mM MgCl2 및 100 mM KCl 중에서 23℃에서 40시간 동안 항온처리하였다. 절단 생성물을 변성 10% PAGE로 분리하고 PhosphorImager(지이 헬쓰케어)로 가시화하고, ImageQuant 소프트웨어를 이용하여 정량하였다. 절단된 RNA의 표준화된 분획 대 사용된 리간드 농도의 로그를 작도함으로써 KD 값을 측정하였다. 197 NMT1 및 115 NMT1의 인-라인 프로빙에 대한 결과는 도 8 및 9에 도시되어 있고, 261 NMT1에 대한 결과는 도 10에 도시되어 있으며, 273 NMT1에 대한 결과는 도 11에 도시되어 있다. 273 NMT1 구축물에서 관찰된 것과 유사한 택일적 염기쌍 형성이 NMT1 mRNA 내에 위치한 다른 진균 TPP 리보스위치에서 관찰되었다(도 12).
균주, 플라스미드 및 배지
뉴로스포라 크라사 87-74(bd; frq+ a; his-3)를 형질전환을 위한 숙주 균주로서 사용하였다. 초파리 LUC 레포터 유전자를 보유하는 플라스미드 pLL07(Froehlich, (2004))을 레포터 유전자 구축을 위해 사용하였다. pLL07 내의 LUC 레포터 유전자에 대한 개시 코돈을 QuikChange(스트라타진) 부위-지정 돌연변이유발법으로 제거하여 플라스미드 pLL09를 수득하였다.
위치 1 내지 355에 걸쳐 존재하는, 뉴로스포라 크라사 내의 베타-튜불린 유전자(등록번호 M13630)에 대한 프로모터를, 프라이머 DNA3 및 DNA4를 사용하여 PCR로 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 MfeI 및 EcoRI으로 절단하고 pLL09의 EcoRI 부위 내로 삽입하여 pLUC를 수득하였다. pLUC의 서열은 시퀀싱으로 확인하였다(예일 유니버시티의 HHMI 켁크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터). 에스케리치아 콜라이 Top 10 세포(인비트로겐)를 플라스미드의 개조 과정 동안에 숙주로서 사용하였다.
뉴로스포라 크라사의 생장을 위해 사용되는 표준 액체 배지는 2% 글루코스, 0.5% L-아르기닌, 1X 보겔 최소 배지 및 50 ng/㎖ 바이오틴을 함유하였다. 뉴로스포라 크라사 생장을 위해 사용된 고체 배지(슬랜트)는 1X 보겔 최소 배지, 2% 수크로스 및 1.5% 아가를 함유하였다. 뉴로스포라 크라사 형질전환체의 선별을 위해 사용된 배지는 1X 보겔 최소 배지, 2% 아가, 2% L-소르보스, 0.05% 프럭토스 및 0.05% 글루코스를 함유하였다. 동형다핵세포 단리의 경우, 1% IAA를 함유하는 0.1X 웨스터가드 배지를 사용하였다(Westergaard 1947).
뉴로스포라 크라사 형질전환 및 레포터 분석
뉴로스포라 크라사의 형질전환을, 공지되어 있는 바와 같이 새롭게 현탁된 거대분생포자의 전기천공을 이용하여 수행하였다(Davis 2000; Loros 1991; Vann 1995). 표적 유전자의 삽입은 게놈 DNA로부터의 삽입체 특이적 프라이머를 사용한 PCR로 검증하였다. 동형다핵세포 균주를 공지되어 있는 바와 같이 단리하였다(Ebbole 1990).
5' UTR-레포터 유전자 플라스미드의 구축
NMT1 유전자(등록번호 AY007661)의 5' UTR의 클로닝은 프라이머 DNA5 및 DNA6을 사용하여 뉴로스포라 크라사의 게놈 DNA로부터 378 bp 단편(해석된 전사 개시 부위로 시작됨)을 PCR 증폭함으로써 달성하였다. 생성된 WT PCR DNA를 먼저 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 사용하여 클로닝하였다. NMT1 단편을, EcoRI 및 XbaI 제한효소 절단을 이용하여 벡터로부터 방출시키고 pLUC의 적절한 부위 내로 클로닝하였다.
앱타머 돌연변이체 M1 내지 M9 및 스플라이스 부위 돌연변이체 M14 내지 M16을 발생시키기 위해, WT NMT1 함유 TOPO 벡터에 대해 PCR 돌연변이유발법을 수행하였다(프라이머 목록 참조). DNA 시퀀싱으로 돌연변이유발을 확인한 후, 각 돌연변이체 NMT1 단편을 pLUC의 EcoRI/XbaI 부위 내로 클로닝하였다. P3 결실 구축물(M10)을 클로닝하기 위해, NMT1을 프라이머 DNA5/DNA25 및 DNA26/DNA6을 사용하여 2개의 단편으로 증폭하였는데, 이때 중첩 영역에는 천연 P3a 줄기의 대부분이 결실되어 있었다. 상기 2개의 단편을 외부 프라이머 DNA5 및 DNA6을 사용한 후속 PCR에서 주형으로서 사용하였다. 생성된 단편을 EcoRI 및 XbaI으로 절단하여 pLUC 내로 클로닝하였다. I-2R 및 I-3R 구축물 및 NMT1의 변이체의 제조는 상기 2개의 택일적으로 스플라이싱된 생성물을 프라이머 DNA5 및 DNA6을 사용한 RT-PCR로 증폭함으로써 달성하였다. 생성된 PCR 생성물을 전술한 바와 같이 클로닝하고 돌연변이시켰다.
NCU01977.1 5' 영역-LUC 레포터 융합체(도 12)를 발생시키기 위해, 예측된 개시 코돈의 업스트림에 위치한 94개의 뉴클레오티드로 시작되는 478개 뉴클레오티드로 구성된 단편을, 프라이머 DNA41 및 DNA42를 사용하여 뉴로스포라 크라사의 게놈 DNA로부터 증폭하고 전술한 바와 같이 pLUC의 EcoRI/XbaI 부위 내로 클로닝하였다. 모든 구축물의 완전성은 시퀀싱으로 확인하였다(예일 유니버시티의 HHMI 켁크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터). 모든 구축물에서 주 ORF(NMT1 또는 NCU01977.1)의 원 개시 코돈이 LUC 레포터 서열과 인 프레임으로 융합되어 있었다.
LUC 레포터 유전자 분석
LUC 레포터 구축물로 형질전환된 뉴로스포라 크라사로부터 얻은 균사체를 여과하여 단리하고, 약 100 mg의 조직을 미세한 분말 형태로 분쇄하였다. 100 ㎕의 1X 수동 용해 완충제(프로메가)를 첨가한 후, 샘플을 철저하게 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한 후, 13,000 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 수득된 상청액에 대한 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가) 및 플레이트-판독 발광측정계(발락)를 이용하여 측정하였다. 브래드포드 단백질 분석(바이오라드)에 의해 측정된, 추출물의 총 단백질 농도에 걸쳐 루시퍼라제 활성을 표준화하하고 기준 구축물을 기준으로 최종적으로 표시하였다. 루시퍼라제 배경 활성(비-형질전환된 뉴로스포라 크라사)은 첨가된 티아민이 없는 상태에서 생장된 세포 내의 야생형 NMT1 구축물을 기준으로 0.05%이다.
RT-PCR 분석
제조자의 지시에 따라 TRIzol® LS 시약(인비트로겐)을 사용하여 균사체로부 터 총 RNA를 단리하였다. 5 ㎍의 총 RNA를 37℃에서 RNase-무함유 DNase I(프로메가)으로 30분 동안 처리하였다. 제조자의 지시에 따라 SuperScriptTM II 역전사 효소(인비트로겐)를 사용하여 42℃에서 폴리T 프라이머를 사용한 역전사를 1시간 동안 수행하여 cDNA를 생성하였다. 게놈 DNA로의 오염으로부터 유래된 증폭 생성물의 가능성을 배제하기 위해, 역전사 전에 RNA 제제를 사용한 대조군 반응을 수행하였고, NMT1의 경우, 코딩 영역 내의 엑손-엑손 경계에 걸쳐 있는 역방향 프라이머를 사용하였다. RT-PCR 분석은 폴리T 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 제조한 cDNA로부터 수행되었으나, RT-PCR에 대한 서열 특이적 프라이머의 사용은 동일한 결과를 제공하였다. NMT1의 코딩 영역의 다운스트림 엑손에 결합되는 RT-PCR용 역방향 프라이머의 사용은 어떠한 차이도 초래하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 이것은 모든 전사체 형태가 폴리아데닐화되고 리보스위치 함유 인트론의 인트론 다운스트림의 스플라이싱이 영향을 받지 않음을 의미한다. 서열 확인을 위해, 모든 증폭 생성물을 클로닝하고 여러 독립적 클론들을 시퀀싱하여 확인하였다. 뿐만 아니라, 생장 배지에의 티아민 첨가가 스플라이싱 조절에 미치는 일반적 효과는 관찰되지 않았다(도 7). 또한, RT-PCR을 이용하여 NMT1 내의 다운스트림 인트론으로부터의 스플라이싱 정도를 측정하였는데, 생장 배지 중의 첨가된 티아민의 부재 및 존재 하에서 구성적으로 스플라이싱이 일어남을 확인하였다.
전사체의 해석된 5' 말단에 결합하는 제1 프라이머 및 리보스위치 함유 인트론의 바로 다운스트림에 결합하는 제2 프라이머를 사용한 특정 프라이머 조합이 모 든 유전자에 대해 사용되었다. NMT1 유전자의 경우, PCR을 위해 사용되는 프라이머는 NMT1 mRNA의 해석된 5' 말단에 상응하는 DNA37, 및 TPP 리보스위치 함유 인트론으로부터 약 50개 뉴클레오티드만큼 다운스트림에 위치한 영역에 상응하는 DNA38이었다(도 14). THI4(CyPBP37) 유전자의 경우, 사용된 프라이머는 mRNA의 5' 말단에 상응하는 DNA39, 및 TPP 리보스위치 함유 인트론으로부터 약 125개 뉴클레오티드만큼 다운스트림에 위치한 영역에 상응하는 DNA40이었다. NCU01977.1의 5' 영역은 예측된 개시 코돈의 앞에 위치한 94개 뉴클레오티드에 결합하는 프라이머 DNA41, 및 리보스위치 함유 인트론의 예측된 3' 말단의 다운스트림에 위치한 22개 뉴클레오티드에 결합하는 프라이머 DNA42로 증폭하였다. PCR 생성물을 2% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 에티디움 브로마이드 염색으로 가시화하였다. 다양한 증폭 생성물을 QIAquick Gel 추출 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하고 제조자의 지시에 따라 TOPO-TA 클로닝 벡터(인비트로겐) 내로 클로닝하였다. 모든 생성물에 대한 다수의 클론의 서열을 시퀀싱으로 분석하였다(예일 유니버시티의 HHMI 켁크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터).
뉴로스포라 크라사 형질전환체 내의 NMT1-LUC 융합 전사체를 검출하기 위해, NMT1 전사체의 5' 말단에 상응하는 프라이머 DNA37, 및 LUC 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈으로부터 약 130개 뉴클레오티드만큼 다운스트림에 위치한 영역에 상응하는 프라이머 DNA43을 사용하였다. 천연 NMT1 전사체, 및 표시된 일부 돌연변이체 구축물은 연장된 P3 줄기를 보유하였다(도 10).
다른 진균 TPP 리보스위치의 기작
뉴로스포라 크라사 THI4 유전자는 리보스위치 작용, 택일적 스플라이싱 및 uORF 번역의 유사한 상호작용을 통해 TPP에 의해 억제되는 것 같다. 대조적으로, 전구체 NCU01977.1 전사체는 주 ORF에 개재되어 있는 인트론 내에 TPP 리보스위치 앱타머를 보유한다. 스플라이싱되지 않은 전사체의 번역은 인트론 내에 존재하는 조기 정지 코돈에 의해 저해된다. NCU01977.1 mRNA의 RT-PCR 분석(도 1b)은 티아민이 존재하는 경우 스플라이싱되지 않은 mRNA를 기준으로 한 스플라이싱된 mRNA의 비가 증가함을 보여주는데, 이것은 그의 TPP 리보스위치가 TPP와의 결합 시 스플라이싱 및 유전자 발현을 증가시키는 유전적 "점등(ON)" 스위치로서 작용함을 시사한다. 이 결론은 티아민 보충에 반응하여 LUC 발현을 증가시키는, 뉴로스포라 크라사 내에서 발현된 NCU01977.1 레포터 융합 구축물의 분석에 의해서도 지지된다(도 13).
개시된 방법 및 조성물은 변경될 수 있으므로 본 명세서에 기재된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐, 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명시하지 않은 한 단수형은 복수형의 언급을 포함함을 인식해야 한다. 따라서, 예를 들어, "리보스위치"라 함은 복수의 리보스위치를 포함하고, "리보스위치"에 대한 언급은 1가지 이상의 리보스위치 및 당업자에게 공지된 리보스위치의 등가물 등에 대한 언급이다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기재되는 사건, 조건 또는 물질이 일어나거나 존재할 수 있거나 일어나지 않거나 존재하지 않을 수 있음을 의미하고, 이러한 기재는 상기 사건, 조건 또는 물질이 존재하는 경우, 및 상기 사건, 조건 또는 물질이 일어나지 않거나 존재하지 않는 경우를 포함한다.
본 명세서에서 범위는 "약"으로 시작되는 하나의 구체적인 값 내지 "약"으로 시작되는 또 다른 구체적인 값으로서 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시되는 경우, 문맥상 달리 명시하지 않은 한, 상기 하나의 구체적인 값, 나머지 다른 구체적인 값, 및/또는 상기 하나의 구체적인 값 내지 나머지 다른 구체적인 값이 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주된다. 유사하게, 값이 근사치로서 표시된 경우, "약"의 사용은 문맥상 달리 명시하지 않은 한 특정 값이 개시된 것으로 간주되어야 하는 또 다른 구체적으로 고려되는 실시양태를 형성함을 이해할 것이다. 또한, 문맥상 달리 구체적으로 기재하지 않은 한, 각 범위의 한계 값은 다른 한계 값과 관련하여 유의할 뿐만 아니라 다른 한계 값과 무관하게 유의함을 이해할 것이다. 마지막으로, 문맥상 달리 구체적으로 기재하지 않은 한, 개개의 값 및 명시된 범위 내에 포함되는 값들의 하위범위 전부도 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 함을 이해해야 한다. 상술한 것은 일부 경우 실시양태들의 일부 또는 전부가 명시적으로 개시되어 있는지와 관계없이 적용된다.
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물이 속하는 분야에서 숙련된 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특히 유용한 방법, 장치 및 물질이 기재되어 있다. 본 명세서에서 인용된 공개문헌 및 이 공개문헌에서 인용된 참조문헌은 본원에 참고로 구체적으로 도입되어 있다. 이러한 문헌의 인용은 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 개시내용을 예상할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 임의의 인용문헌이 선행 기술을 구성함을 인정하는 것도 아니다. 인용문헌의 논의는 상기 문헌의 저자가 주장하는 것을 설명하는 것이고, 출원인은 인용된 문헌의 정확성 및 타당성을 조사할 권리를 유보한다. 다수의 공개문헌이 본 명세서에서 언급되어 있지만, 이러한 언급은 상기 문헌들 중 임의의 문헌이 당업계의 통상의 일반적인 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것은 아니다.
본 명세서의 상세한 설명 및 청구의 범위 전체에 걸쳐, "포함한다" 및 이의 어미변화, 예컨대, "포함하는" 및 "포함하고"는 "포함하지만 이로 한정되지 않는"을 의미하고 예를 들어, 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하기 위한 것이 아니다.
당업자라면 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 특정 실시양태들의 많은 등가물을 인식할 것이고 상기 등가물을 과도한 실험 없이 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함된다.
참고문헌
Figure 112009064380127-PCT00003
Figure 112009064380127-PCT00004
Figure 112009064380127-PCT00005
Figure 112009064380127-PCT00006
Figure 112009064380127-PCT00007
Figure 112009064380127-PCT00008
SEQUENCE LISTING <110> Yale University <120> METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO RIBOSWITCHES THAT CONTROL ALTERNATIVE SPLICING <130> 25006.0030P1 <140> PCT/US2008/058045 <141> 2008-03-22 <150> 60/919,433 <151> 2007-03-22 <160> 101 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 1 agcuaccggg uguccauguu ggccacguug gucugagaaa accggcgaac uugacuggau 60 aauaccagcg aaggauuggc u 81 <210> 2 <211> 85 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 2 acguaccggg uguccaugua ccggaaccac guuggucuga gaaaacgcgc gaacaagaca 60 ggauaauacg uccgaaggau ugcgu 85 <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 3 uccaagaucg agguaaag 18 <210> 4 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 4 aggucuaguu caa 13 <210> 5 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; 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note = synthetic construct <400> 15 uccacgcacu gcgggugcug agaaaacacc gccgaacucg accaagauaa uacuugcgug 60 agaaagugca cauu 74 <210> 16 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 16 gacuugcacu gcgggugcug agauuacacc gccacacucg aacaagauaa ugcuugcugg 60 agaaagugcg uuac 74 <210> 17 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 17 aagaacgcau ccgggugcug agaaauaccg gcgaacuuga ucuggauaau accuacgaaa 60 gcgacaugcu ucuug 75 <210> 18 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 18 ucaugcauga gccggugcug agaauauacg gcaaaacuug aucuggauaa uaccagcgaa 60 aggaucaugu ccuc 74 <210> 19 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 19 gcggcucacu acgggcgcug agauugaucc guaaauacuc gaucaaguua augcuugcgu 60 gggaaaagug uugcc 75 <210> 20 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 20 caaugagacu agcgggugcu gagaauacac cguuugaacu cgaucaaguu aguacuugcg 60 ugaggaaguu uuuguuug 78 <210> 21 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 21 uuaugcuaga gccggugcug agauuauacg gccuugaacu ugaucuggau gguaccagcg 60 aaaggaucau gcaug 75 <210> 22 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 22 gcggcucacu acgggcgcug agaguuguac cgugauuacu cgaucaagau aaugcuugcg 60 ugggaaacgu gcugcc 76 <210> 23 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 23 cauccgcaug acaggugcug agauuauacu gucauaacuu gaucuagaua auacuagcga 60 aaggacaugc guugc 75 <210> 24 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 24 ugcaguauga ccggugcuga gaucauacgg uugaacuuga ucuggauaau uccagcgaaa 60 gaacucaugc gcg 73 <210> 25 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; 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note = synthetic construct <400> 30 uaugagcaac acgggugcug agaucauacc gucgagcgga acaggauaau gccugcgucg 60 cuaguugcuu ccc 73 <210> 31 <211> 392 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 31 cucuugacuu ugaaucaaca accugcuaua ccuuugguac gccgccagcg uccgaagagc 60 caugaaaucu aucacaaugg gaacuccaag aucgagguaa aguaaacaag acagcuaccg 120 gguguccaug uugguacagc cacaguuggu ucacccuuau cgcucuucca ugccuucugu 180 gacaaggucu uuggaaugag uuugauacga ugggccaacu gcggcgguac cacguugguc 240 ugagaaauac cggcgaacuu gaucuggaua auaccagcga aaggauuggc uucuugggac 300 cccuuccccu ccccucauug gagaucaacu aacucuaggg uugcagcuuu gcucguguug 360 cgccaacaug ucuaccgaua agauaacuuu cc 392 <210> 32 <211> 527 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 32 cugucuucgu uccaaggacu accagcaaua aauaccaaca cgcaaguauc accaagcuug 60 uucgggcuuc aucugucucc ucucccccau gguguugaua uacuaacacc cucaagcaag 120 cagacagacu cucaacacca ggguacagac cacccaccuc cuccaccaag auggccacaa 180 accaucguuc caggaggagc ugaagccaug aacuccccau cggcugguug auuauaccau 240 gauucgauca cguucaaaca uacuuucaga gguaacuauc ugaaugcaug agccggugcc 300 aacuucuguc cuggguauua ggucgcuucu agcaccugua cccaggggag aaguacaggc 360 ugagaauaua cggcgacgaa cuugaucugg auaauaccag cgaaaggauc augcuucaac 420 uuuccucccc cgcucccccc uucucccgua cagucauucu aacauuccca gauaacucug 480 auccaucauc accaugucuc ccucuguucu cgagccgcag agcgucc 527 <210> 33 <211> 400 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 33 auggauauua cucaagguua gaugagaggu ugcggcucac uacgggcgcc gagucaaaag 60 cuugcucgcc uggauccaac cuccugcucu uucauccucg ucuuacacaa aagccuccua 120 ggggaauaug guauuuccga ggauagagag gaugaacaca gaggagaucu ggcgacuugc 180 uggacgacga agcugagauu guaccgugau uacucgauca aguuaaugcu ugcgugagaa 240 acgugcugcc gcuccgaucu auuccccccc ucccuacucc cccuuccucu cuccccuuua 300 cucuuguggg uuggaaaaac uaaccugcgu agcucucggu ucuggaaucc uuuucacuua 360 uccagaaauc gccacguugg cuggucuuca gggcguccuu 400 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 34 cattgcaaaa acggcattgg a 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 35 tgtggggact tttcatgata c 21 <210> 36 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 36 ggaaacaaga agcuaccggg uguccauguu ggccacguug gucugagaaa uaccggcgaa 60 cuugacugga uaauaccagc gaaaggauug gcuucuuggg 100 <210> 37 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 37 gguacagcca caguugguuc acccuuaucg cucuuccaug ccuucuguga caaggucuuu 60 ggaaugaguu ugauacgaug ggccaacugc ggcgguacc 99 <210> 38 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 38 uccaagaucg aggu 14 <210> 39 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 39 aggucuacuu caa 13 <210> 40 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 40 gggucaaggu aucguacaua guauaa 26 <210> 41 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 41 ucuaguucaa uacugucaua uu 22 <210> 42 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 42 uauaccaagu aucaaggu 18 <210> 43 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 43 auaauagguc auaguuc 17 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 44 ccccgggtct agcatctaga ggacgccaag aac 33 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 45 gttcttggcg tcctctagat gctagacccg ggg 33 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 46 gatccaattg gtcgacaggg ggccttccac ccttcc 36 <210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 47 gatcgaattc gacggtttgg tgatgacgaa cacggg 36 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 48 gatcgaattc ctcttgactt tgaatcaaca acctgctata cc 42 <210> 49 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; 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note = synthetic construct <400> 67 gccaatcctt tcggacgtat tatcgtcatc aag 33 <210> 68 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 68 gatcgaattc ctcttgactt tgaatcaaca acctgctata cc 42 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 69 gaccaacgtg gttccccaac atggacaccc ggtagc 36 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 70 ggaaccacgt tggtctgaga aat 23 <210> 71 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 71 gatctctaga tcggtagaca tgttggcgca acacgagc 38 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 72 ccgaggagcc aagaaatcta tcac 24 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 73 gtgatagatt tcttggctcc tcgg 24 <210> 74 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 74 gaaatctatc acaaagggaa ctccaag 27 <210> 75 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 75 cttggagttc cctttgtgat agatttc 27 <210> 76 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 76 cctgctatac ctttgcgacg ccgccagcgt cc 32 <210> 77 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 77 ggacgctggc ggcgtcgcaa aggtatagca gg 32 <210> 78 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 78 cattggagat caacgacctc tagggttgc 29 <210> 79 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 79 gcaaccctag aggtcgttga tctccaatg 29 <210> 80 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 80 ctctagggtt gcgactttgc tcgtgttgc 29 <210> 81 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 81 gcaacacgag caaagtcgca accctagag 29 <210> 82 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 82 ctcttgactt tgaatcaaca acctgctata cctttg 36 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 83 cgtagcgtgc cagttggcg 19 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 84 ctgtcttcgt tccaaggact accatcaatt aaatacc 37 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 85 gctccagaag aggcttggac aagc 24 <210> 86 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 86 atgcgaattc cacccaatct ccaacctatc tt 32 <210> 87 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 87 atgctctaga ccagccaacg tggcgattt 29 <210> 88 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 88 ctcttgactt tgaatcaaca acctgctata cctttg 36 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 89 gatgtgggcg tcggtgaag 19 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 90 taatacgact cactatagga aacaagacag ctaccgggtg 40 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 91 cccaagaagc caatcctttc gc 22 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 92 taatacgact cactataggc tatacctttg gtacgccgcc 40 <210> 93 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 93 caagaagcca atcctttcgc tggtattatc c 31 <210> 94 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 94 taatacgact cactatagga cagctaccgg gtgtc 35 <210> 95 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 95 acatgttggc gcaacacgag caaag 25 <210> 96 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 96 gggucaaggu aucguacaga uuau 24 <210> 97 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 97 ucuaguucaa uacugucaua 20 <210> 98 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 98 auucaauuca aaucaucaag gu 22 <210> 99 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 99 uaauaggucu aguucaa 17 <210> 100 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 100 ugggucaagg uaucguagau uguauaau 28 <210> 101 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 101 aucuaguucc aauacuuguc auauua 26

Claims (34)

  1. 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치(riboswitch)를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조절가능한 유전자 발현 구축물(construct)로서, 상기 리보스위치가 RNA의 스플라이싱(splicing)을 조절하고, 상기 리보스위치 및 상기 코딩 영역이 이종 영역인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  2. 제1항에 있어서,
    택일적 스플라이싱(alternative splicing)을 조절하는 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    리보스위치가 앱타머(aptamer) 도메인 및 발현 플랫폼(platform) 도메인을 포함하고, 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인이 이종 도메인인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA가 인트론을 추가로 포함하고, 발현 플랫폼 도메인이 상기 인트론 내에 택일적 스플라이스 접합부(splice junction)를 포함하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA가 인트론을 추가로 포함하고, 발현 플랫폼 도메인이 상기 인트론의 말단에서 스플라이스 접합부를 포함하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    택일적 스플라이스 접합부가, 리보스위치가 활성화되었을 때 활성을 나타내는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    택일적 스플라이스 접합부가, 리보스위치가 활성화되지 않았을 때 활성을 나타내는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 유발(trigger) 분자에 의해 활성화되는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  9. 제8항에 있어서,
    유발 분자가 티아민 피로포스페이트(TPP)인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 TPP-반응성 리보스위치인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 활성화시키는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 억제하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA가 분지된 구조를 갖는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA가 전구-mRNA인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  15. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 P4 및 P5 줄기(stem) 내에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  16. 제15항에 있어서,
    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 루프(loop) 5 내에도 위치하는, 조 절가능한 유전자 발현 구축물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    스플라이싱을 조절하는 앱터머 도메인의 영역이 P2 줄기 내에도 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  18. 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이스 부위가 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -6 내지 -24 위치에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  19. 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이스 부위가 서열 GUA 다음에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
  20. RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있는 리보스위치를 포함하는 구축물을 RNA 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    리보스위치가 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함하고, 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인이 이종 도메인인, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    리보스위치가 RNA의 인트론 내에 위치하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 유발 분자에 의해 활성화되는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    유발 분자가 TPP인, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 TPP-반응성 리보스위치인, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 활성화시키는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  27. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 억제하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이싱이 천연적으로 일어나지 않는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 루프 5 내에 위치하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  30. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 P2 줄기 내에 위치하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이스 부위가 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -6 내지 -24 위치에 위치하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  32. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    스플라이스 부위가 앱타머 도메인 내의 서열 GUA 다음에 위치하는, RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법.
  33. (a) 진균에 감염된 개체(subject)를 식별하는 단계; 및
    (b) TPP-반응성 리보스위치를 억제하는 화합물 유효량을 상기 개체에게 투여하여 진균 생장을 억제하는 단계
    를 포함하는, 진균 생장을 억제하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    진균 생장의 억제가 진균 생체질량(biomass)의 10% 이상의 감소를 포함하는, 진균 생장을 억제하는 방법.
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