JP2010503619A - ｇｌｍＳリボスイッチ、ｇｌｍＳリボスイッチを用いた構造に基づく化合物設計、ならびにｇｌｍＳリボスイッチを用いた使用のための方法および組成物 - Google Patents

ｇｌｍＳリボスイッチ、ｇｌｍＳリボスイッチを用いた構造に基づく化合物設計、ならびにｇｌｍＳリボスイッチを用いた使用のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

ｇｌｍＳリボスイッチは、抗生物質および他の小分子治療に対する標的である。化合物を使用することにより、ｇｌｍＳリボスイッチを刺激し、活性化し、阻害し、そして／または不活性化することができる。ｇｌｍＳリボスイッチの原子構造を使用することにより、リボスイッチを刺激し、活性化し、阻害し、そして／または不活性化する新規化合物を設計することができる。化合物とＲＮＡ分子とを接触させることによってＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための組成物および方法もまた開示され、ここで、そのＲＮＡ分子は、ｇｌｍＳリボスイッチを含む。

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年９月６日に出願された米国仮特許出願第６０／８４２，８７０号、および２００６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／８４４，８４４号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８４２，８７０号、および２００６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／８４４，８４４号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（政府支援の研究に関する陳述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより授与された助成金番号ＭＣＢ ０５４４２５５およびＥＩＡ−０３２３５１；ＤＡＲＰＡにより授与された助成金番号Ｗ９１１ＮＦ−０４−１−０４１６；ならびにＮＩＨにより授与された助成金番号ＮＩＨ Ｒ３３−ＤＫ０７０２７０の下、政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
（発明の分野）
開示される発明は、概して、遺伝子発現の分野におけるものであり、詳細には、遺伝子発現の調節の範囲におけるものである。
（発明の背景）
細胞は、遺伝子発現パターンを変化させることによって多数の生化学的シグナルおよび環境的なキューに応答しなければならないので、正確な遺伝子制御は、生物系の不可欠な特徴である。既知のほとんどの遺伝子制御メカニズムは、化学的または物理的な刺激を感知し、そして関連するＤＮＡ配列またはメッセンジャーＲＮＡ配列と選択的に相互作用することによって遺伝子発現を調節するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複雑な形状をとり、それらの化学的および物理的な環境を生物系が正確に感知することを可能にする種々の機能を果たすことができる。代謝産物に応答するタンパク質因子は、代表的には、ＤＮＡに結合して、転写開始を調節することによって作用する（例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質；非特許文献１）か、またはＲＮＡに結合して、転写終結を制御することによって作用する（例えば、ＰｙｒＲタンパク質；非特許文献２）か、もしくは翻訳を制御することによって作用する（例えば、ＴＲＡＰタンパク質；非特許文献３）。タンパク質因子は、様々なメカニズム（例えば、アロステリック調節または翻訳後修飾）によって環境刺激に応答し、そして、これらのメカニズムを巧みに利用することによって、高度に応答性である遺伝子スイッチとして機能する（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
遺伝子制御におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、ＲＮＡが、遺伝子調節において積極的な役割を果たし得ることも知られている。近年の研究は、低分子非コードＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）が破壊のためにｍＲＮＡを選択的に標的化する際に働くことによって遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらすという実質的な役割を明らかにするために始められた（例えば、非特許文献５およびこの文献中の参考文献を参照のこと）。このＲＮＡ干渉プロセスは、短鎖ＲＮＡが、ワトソン−クリック塩基相補性を介して、意図されるｍＲＮＡ標的を選択的に認識した後、タンパク質の作用によってその結合したｍＲＮＡを破壊するという能力を利用する。進化的プロセスを介して新しい標的特異的ＲＮＡ因子を作製することのほうが、新規であるが高度に特異的なＲＮＡ結合部位を有するタンパク質因子を作製することよりもはるかに簡単であるので、ＲＮＡは、この系における分子認識に対する理想的な薬剤である。
タンパク質は、酵素、レセプターおよび構造上の機能に対して生物学が有するほとんどの要求を満たすが、ＲＮＡもまた、これらの能力を果たすことができる。例えば、ＲＮＡは、十分な構造上の可塑性を有することにより、かなりの酵素の能力および正確な分子認識を示す、多くのリボザイムドメイン（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，ｅｄｓ．中の非特許文献６；非特許文献７）およびレセプタードメイン（非特許文献８；非特許文献９）を形成する。さらに、これらの活性を組み合わせることにより、エフェクター分子が選択的に調節するアロステリックなリボザイム（非特許文献１０；非特許文献１１）を作製することができる。
細菌のリボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主要なコード領域の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に配置されている遺伝子制御エレメントである。構造的に調査する研究（以下で詳細に記述する）によって、リボスイッチエレメントが、通常、２つのドメイン：リガンド結合ドメインとして働く天然のアプタマー（非特許文献１２；非特許文献１３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）エレメント；転写ターミネーターステム）を干渉する「発現プラットフォーム」から構成されることが明らかになっている。当該分野において必要とされているものは、ｇｌｍＳリボスイッチを調節するために使用することができる方法および組成物である。
Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｃ．，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８，１２７−１６４ Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２，３２９−３６７ Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｐ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７９５−５８０２ Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇａｎｎ，Ａ．（２００２）．Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１８，２４４−２５１ Ｃｅｃｈ ＆ Ｇｏｌｄｅｎ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｕｓｉｎｇ ｏｎｌｙ ＲＮＡ．，ｐｐ．３２１−３５０（１９９８） Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３７１−３９０（１９９７） Ｏｓｂｏｒｎｅ ＆ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７） Ｈｅｒｍａｎｎ ＆ Ｐａｔｅｌ，Ａｄａｐｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｐｔａｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，８２０−８２５（２０００） Ｓｏｕｋｕｐ ＆ Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，３５８４−３５８９（１９９９） Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，３３６−３４１（２００１） Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，２８７，８２０ Ｌ．Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，６４，７６３
（発明の簡潔な要旨）
ある特定の天然のｍＲＮＡが、代謝産物感受性の遺伝子スイッチとして働くことが発見されており、そのＲＮＡは、有機小分子に直接結合する。この結合プロセスは、そのｍＲＮＡの立体配座を変化させ、それによって、種々の様々なメカニズムにより遺伝子発現の変化が引き起こされる。その天然のスイッチは、抗生物質および他の小分子治療に対する標的である。
ｇｌｍＳリボスイッチを活性化し得るか、不活性化し得るか、または遮断し得る化合物およびそのような化合物を含んでいる組成物が開示される。ｇｌｍＳリボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断するための組成物および方法もまた開示される。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去を介して遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用することによって、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断することができる。リボスイッチに対するトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）を使用することによって、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物は、一般に、リボスイッチを不活性化するか、または遮断するために使用され得る。リボスイッチはまた、例えば、リボスイッチが存在するところからトリガー分子を除去することによって、不活性化され得る。リボスイッチは、例えば、そのリボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断され得る。
化合物とＲＮＡ分子とを接触させることによってＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための組成物および方法もまた開示され、ここで、そのＲＮＡ分子は、ｇｌｍＳリボスイッチを含む。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去を介して遺伝子発現を調節するように機能する。従って、ｇｌｍＳリボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を、そのリボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する条件に供することによって、そのＲＮＡの発現を変化させることができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡとリボソームとの結合の遮断の結果として、発現を変化させることができる。リボスイッチの性質に応じて、トリガー分子またはそのアナログの結合は、ＲＮＡ分子の発現を減少させ得るか、もしくは妨害し得るか、またはＲＮＡ分子の発現を促進し得るか、もしくは増加させ得る。
ｇｌｍＳリボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断することによってこのリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を制御するための組成物および方法もまた開示される。その遺伝子が、それを含んでいる細胞または生物の生存に不可欠である場合、ｇｌｍＳリボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、その細胞または生物の死、停止または衰弱をもたらし得る。例えば、微生物の生存に不可欠な天然に存在する遺伝子内の天然に存在するリボスイッチの活性化は、微生物の死をもたらし得る（そのリボスイッチの活性化が発現を停止させるか、または抑制する場合）。これは、抗菌作用および抗生作用のために、開示される化合物および方法を使用することに対する１つの根拠である。
式Ｉ：
Figure 2010503619
 の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩、その生理的に加水分解可能かつ許容可能なエステルまたはその両方が、本明細書中に開示され、ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、Ｒ２は、ＮＨ−Ｒ６であり、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）イソ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＮＨ２であり、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、Ｒ４は、水素結合供与体であり、Ｒ５は、水素結合受容体であり、この化合物は、グルコサミン−６−リン酸ではない。Ｒ４がＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ３＋、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨアルキル、＝ＮＨ、＝ＮＯＨ、＝ＮＳＨ、＝ＮＣＯ２Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ＝ＮＨ、ＣＨ＝ＮＯＨ、ＣＨ＝ＮＳＨ、ＣＨ＝ＮＣＯ２Ｈ、ＯＣＨ２ＯＨ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＰｈＯＨ、ＮＨアルキル、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨアルキル、ＮＨＣＯアルキル、ＮＨＣＯ２アルキル、ＮＨＣＯＮＨ２、ＮＨＳＯ２アルキルまたはＮＨＯアルキルである化合物もまた開示される。Ｒ１がＨまたはＯＨであるときＲ４はＯＨではなく、そしてＲ２はＮＨ２またはＮＨＣＨ３である化合物もまた開示される。Ｒ５がＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｓ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）ＯＨＳＨ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである化合物がさらに開示される。Ｒ５がＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである化合物もまた開示される。さらに、Ｒ５は、負に帯電している可能性がある。Ｒ５が＝Ｏ、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、Ｒ９が−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である化合物がさらに開示される。Ｒ５が、＝Ｏ、ＯＨ、ＯＲ９、ＣＯＲ９、ＣＮ、ＮＯ２、テトラゾール、ＳＯＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、Ｒ９は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である化合物もまた開示される。Ｒ４がＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである化合物もまた開示される。Ｒ４がＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである化合物もまた開示される。上で開示された化合物は、ｇｌｍＳ応答性リボスイッチを活性化し得る。
遺伝子発現を阻害する方法もまた本明細書中に開示され、その方法は、上で開示されたような化合物と細胞とを接触させる工程を包含し、ここで、その細胞は、ｇｌｍＳ応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、その化合物は、ｇｌｍＳ応答性リボスイッチに結合することによって遺伝子の発現を阻害する。上記細胞は、例えば、細菌細胞であり得、上記化合物は、その細菌細胞を殺滅し得るか、または阻害し得る。上記細胞は、ｇｌｍＳリボスイッチを含み得る。上記細胞は、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓであり得る。
対象に化合物を投与することによってその化合物と細胞とを接触させることによってその細胞を含んでいる対象において、細胞内の遺伝子発現を阻害する方法および／または細胞の成長を阻害する方法もまた開示される。本方法のいくつかの形態において、本化合物は、基質としてグルコサミン−６−リン酸を有する対象の酵素に対する基質ではない。本方法のいくつかの形態において、本化合物は、グルコサミン−６−リン酸を変化させる対象の酵素に対する基質ではない。本方法のいくつかの形態において、本化合物は、グルコサミン−６−リン酸を代謝する対象の酵素に対する基質ではない。本方法のいくつかの形態において、本化合物は、グルコサミン−６−リン酸を異化する対象の酵素に対する基質ではない。本方法のいくつかの形態において、上記細胞は、対象内の細菌細胞であり、上記化合物は、その細菌細胞を殺滅するか、または細菌細胞の成長を阻害する。本方法のいくつかの形態において、対象は、細菌に感染している。本方法のいくつかの形態において、本化合物は、別の抗菌化合物と併用して投与される。本方法のいくつかの形態において、本化合物は、バイオフィルムにおける細菌の成長を阻害する。
上に記載された化合物、ならびにコード領域に作動可能に連結されたｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含んでいる調節可能な遺伝子発現構築物を含む組成物がさらに開示され、ここで、このｇｌｍＳリボスイッチは、ＲＮＡの発現を調節し、そしてこのｇｌｍＳリボスイッチおよびコード領域は、異種性である。ｇｌｍＳリボスイッチは、本化合物によって活性化されるとき、シグナルを生成することができる。例えば、そのリボスイッチは、本化合物によって活性化されたときに立体配座を変化させることができ、その立体配座の変化は、立体配座依存性標識を介してシグナルを生成することができる。さらに、そのリボスイッチは、本化合物によって活性化されたときに立体配座を変化させることができ、その立体配座の変化が、リボスイッチに連結されたコード領域の発現の変化を引き起こし、その発現の変化が、シグナルを生成する。そのシグナルは、上記リボスイッチに連結されたコード領域から発現されるレポータータンパク質によって生成され得る。
（ａ）上に記載されたような化合物を、ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について試験する工程（その阻害は、ｇｌｍＳリボスイッチを介するものである）および（ｂ）細胞と、工程（ａ）において遺伝子発現を阻害した化合物とを接触させることによって遺伝子発現を阻害する工程を包含する方法もまた開示され、ここで、上記細胞は、ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、上記化合物は、ｇｌｍＳリボスイッチに結合することによって遺伝子の発現を阻害する。
リボスイッチの結晶性原子構造もまた開示される。例えば、表２に列挙される原子座標を含む原子構造を含む天然のｇｌｍＳ応答性リボスイッチの原子構造、図９に描かれているような活性部位および結合ポケットの原子構造、ならびに表２内に含まれる図９に描かれている活性部位および結合ポケットの原子座標が開示される。表２内に含まれる図９に描かれている結合ポケットの原子座標は、本明細書中において結合ポケット原子構造と呼ばれる。表２内に含まれる図９に描かれている活性部位の原子座標は、本明細書中において、活性部位の原子構造と呼ばれる。これらの構造は、結合リガンドとリボスイッチとの相互作用のモデル化および評価において有用である。それらはまた、リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法においても有用である。その構造の任意の有用な部分は、本明細書中に記載されるように企図され、モデル化に使用され得る。特に、さらなる周囲の構造を含むかまたは含まずに、活性部位の原子構造または結合ポケット原子構造は、モデル化され得、開示される方法において使用され得る。
リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法もまた開示され、その方法は、試験化合物を用いてリボスイッチの原子構造をモデル化する工程およびその試験化合物がリボスイッチと相互作用するかを判定する工程を包含する。これは、リボスイッチと試験化合物との原子の接触を判定することによって行われ得る。さらに、リボスイッチと相互作用することが知られている化合物のアナログは、その原子の接触を解析し、次いで、相互作用を最大にするようにそのアナログの原子構造を最適化することによって作製され得る。これらの方法は、ハイスループットスクリーニングとともに使用され得る。
リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法がさらに開示され、その方法は：試験化合物を用いてｇｌｍＳリボスイッチの原子構造をモデル化する工程；および試験化合物がリボスイッチと相互作用するかを判定する工程を包含する。さらに、試験化合物がリボスイッチと相互作用するかを判定する工程は、リボスイッチのモデル化において、試験化合物に対する、予測される最小の相互作用エネルギー、予測される結合定数、予測される解離定数または組み合わせを決定する工程を包含し得る。試験化合物がリボスイッチと相互作用するかを判定する工程は、そのリボスイッチのモデルを用いて、試験化合物の、１つ以上の予測される結合、１つ以上の予測される相互作用または組み合わせを測定する工程を包含し得る。原子の接触が判定され得ることによって、試験化合物とリボスイッチとの相互作用が判定される。リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法は、試験化合物のアナログを同定する工程；および試験化合物のアナログがリボスイッチと相互作用するかを判定する工程をさらに包含し得る。
細菌を殺滅するか、または細菌の成長を阻害する方法がさらに開示され、その方法は、その細菌と、上で開示された方法によって同定される化合物とを接触させる工程を包含する。細菌を殺滅する方法がさらに開示され、その方法は、その細菌と、上に開示された方法によって同定された化合物とを接触させる工程を包含する。ゲルベースのアッセイまたはチップベースのアッセイを使用することによって、試験化合物がリボスイッチと相互作用するかを判定することができる。その試験化合物は、ファンデルワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用または組み合わせを介して相互作用することができる。リボスイッチは、例えば、ＲＮＡ切断リボザイムを含み得る。蛍光シグナルは、クエンチング部分を含む核酸が切断されたときに生成され得る。分子ビーコン技術を使用して、蛍光シグナルを生成することができる。本明細書中に開示される方法は、ハイスループットスクリーニングを使用して行われ得る。
リボスイッチを活性化し得るか、不活性化し得るか、または遮断し得る化合物を選択するためおよび同定するための組成物および方法もまた開示される。リボスイッチの活性化とは、トリガー分子が結合したときのリボスイッチの状態の変化のことを指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物によって、そして、トリガー分子の結合以外の方法で活性化され得る。トリガー分子という用語は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物のことを指すために本明細書中で使用される。これは、リボスイッチに対する天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物を含む。天然または通常のトリガー分子は、天然における所与のリボスイッチに対するトリガー分子であるか、または、いくつかの天然でないリボスイッチの場合は、リボスイッチが設計されたか、またはリボスイッチが選択された（例えば、インビトロ選択またはインビトロ進化技術などにおいて）トリガー分子である。天然でないトリガー分子は、非天然トリガー分子と呼ばれ得る。
リボスイッチの不活性化とは、トリガー分子が結合していないときのリボスイッチの状態の変化のことを指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物の結合によって、そしてトリガー分子の除去以外の方法において、不活性化され得る。リボスイッチの遮断とは、トリガー分子の存在がリボスイッチを活性化しない、リボスイッチの条件または状態のことを指す。リボスイッチの活性化は、任意の適当な様式で評価され得る。例えば、リボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結され得、そのレポーターＲＮＡの発現、発現レベルまたは発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下において、測定することができる。別の例として、リボスイッチは、立体配座依存性標識を含み得、その標識からのシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。そのようなリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからのアプタマードメインまたは天然に存在するリボスイッチに由来するアプタマードメインを使用する。リボスイッチの活性化の評価は、理解されているように、コントロールアッセイもしくは測定を使用して行われ得るか、またはコントロールアッセイもしくは測定を使用せずに行われ得る。リボスイッチを不活性化する化合物を同定するための方法は、同様の方法で行われ得る。
リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する化合物を同定し、そしてその同定された化合物を製作することによって作製される化合物もまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他の箇所に開示されるような化合物の同定方法を、同定された化合物を製作するための方法と組み合わせることによって達成され得る。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価し、そして、リボスイッチが試験化合物によって活性化された場合にリボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製作することによって、作製され得る。
化合物によるリボスイッチの活性化、不活性化または遮断を確認し、そしてその確認された化合物を製作することによって作製される化合物もまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他の箇所に開示されるような化合物の活性化、不活性化または遮断の評価方法を、確認された化合物を製作するための方法と組み合わせることによって達成され得る。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価し、そしてリボスイッチが試験化合物によって活性化された場合にリボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製作することによって作製され得る。リボスイッチを活性化する能力、不活性化する能力または遮断する能力について化合物を確認することは、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断すると事前に知られていない化合物の同定と、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断するとすでに知られた化合物がリボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する能力の評価との両方のことを指す。
対象内の細菌細胞などの細胞の成長を阻害する方法もまた本明細書中に開示され、その方法は、本明細書中に開示されるような有効量の化合物を対象に投与する工程を包含する。これによって、化合物が細胞と接触し得る。対象は、例えば、細菌に感染している可能性があり、細菌細胞は、上記化合物によって阻害されるべき細胞であり得る。その細菌は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌などの任意の細菌であり得る。細菌の成長は、細菌が見出される任意の状況においても阻害され得る。例えば、体液中、バイオフィルム中および表面上の細菌の成長が、阻害され得る。本明細書中に開示される化合物は、他の任意の化合物または組成物と併用して投与され得るか、または使用され得る。例えば、開示される化合物は、別の抗菌化合物と併用して投与され得るか、または使用され得る。
開示される方法および組成物のさらなる利点は、以下の説明に部分的に示され、また、その説明から部分的に理解されるか、または開示される方法および組成物の実施によって理解され得る。開示される方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されるエレメントおよび組み合わせを用いて実現化され、達成される。前述の全般的な説明と以下の詳細な説明との両方が、例示であって単なる説明であり、特許請求される本発明を限定しないと理解されるべきである。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を図示し、そして、説明と併せて、開示される方法の原理および組成物の説明に役立つものである。
図１は、ｇｌｍＳリボザイムに対する構造的な情報を示している。ａ）Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来のｇｌｍＳリボザイムの二次構造モデル、およびｂ）ｇｌｍＳリボザイムのリガンドであるＧｌｃＮ６Ｐのβ−アノマー（１ａ）と、非環状型（１ｂ）と、α−アノマー（１ｃ）との平衡状態。二次構造モデルは、Ｘ線データに基づいて、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来のｇｌｍＳリボザイムに対するモデルから適合されたものである。 図２は、ＧｌｃＮ６ＰアナログおよびｇｌｍＳのリボザイム自己切断に対する影響を示している。ａ）ＧｌｃＮ６Ｐアナログの化学構造。これらの構造とＧｌｃＮ６Ｐとを比較することによってＧｌｃＮ６Ｐとの違いが理解され得る。ｂ）ＧｌｃＮ６Ｐ（１）または示されている様々な化合物とともにインキュベートされる２００ヌクレオチドのｇｌｍＳ ＲＮＡ構築物を使用したリボザイム切断アッセイの収量。５’３２Ｐ−標識された前駆体（Ｐｒｅ）ＲＮＡを、各レーンに対して表されるような１ｍＭエフェクターの存在下で３０分間インキュベートした。（−）と示されている横棒は、１ｍＭ ＧｌｃＮ６Ｐを含む反応物が、時間０においてローディング緩衝液を用いて終結されたときのＲＮＡ切断の程度を表している。すべてのアッセイに対するデータを、最も少ない量の切断を生成する反応物（７を含んでいる反応物）中に存在した切断されたＲＮＡの量に対して補正した。白棒は、リボザイム速度定数を確定するためにさらに調べられた活性な化合物を指し示している。ｃ）リボザイム切断に対して観察された速度定数（ｋｏｂｓ）および最も活性なＧｌｃＮ６Ｐアナログ（各々１００μＭにおいて）に対するＧｌｃＮ６Ｐ（１）を使用して測定された速度定数の比（ｋ１／ｋ）。残留化合物に対する速度定数は、０．００１分−１未満と推定される。 図３は、８の様々な濃度におけるリボザイム自己切断に対して観察された速度定数を示している。挿入図は、３つの代表的なアッセイを示しており、ここで、放射標識された前駆体（Ｐｒｅ）を、示されるような様々な濃度（ｃ）の８とともに、様々な時間にわたってインキュベートする。切断された（Ｃｌｖ）ＲＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離する。リボザイム反応物のアリコートが０、４、１５．３および１９．５時間において取り出され、その反応は終結された。 図４は、ｇｌｍＳリボザイムの予測される分子認識決定基を示している。いくつかの官能基に対する分子接触物の正確な型または数の確証には、さらなるアナログの試験が必要である。 図５は、ＧｌｃＮ６ＰアナログによるＢ．ｃｅｒｅｕｓの２００ヌクレオチドのｇｌｍＳリボザイムの濃度依存的な活性化を示している。化合物１３（黒四角）、９（白四角）、８（白三角）、１２（白丸）および４（黒三角）に対するデータを示している。８に対するデータは、メインテキストの図３にも表す。 図６は、ｇｌｍＳリボスイッチの３次元結晶構造を示しており、その調節は、細菌の細胞壁生合成および生存能に不可欠である。示されるリボスイッチの構造は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓのものである。この構造は、このリボザイム／リボスイッチにおけるＲＮＡの３次元配置を明らかにしており、このＲＮＡの活性部位に結合している小分子エフェクターであるグルコサミン−６−リン酸を示している。 図７Ａおよび図７Ｂは、２つのｇｌｍＳリボザイムの配列および構造を示している。Ａ．Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の単分子のｇｌｍＳリボザイム（５’末端から３’末端へ、配列番号：１−８）。矢印は、ＧｌｃＮ６Ｐによって刺激されるリボザイム媒介性切断の部位を特定している（Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００６；１３：１−３）。Ｂ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来する二分子のｇｌｍＳリボザイム構築物（５’末端から３’末端へ、配列番号：９−１８。この構築物は、Ｐ１ステムの切断および１５ヌクレオチドの基質ＲＮＡの使用に起因して、野生型ｇｌｍＳリボザイムと異なる（灰色で示されている；配列番号：９および１０）。この基質は、その５’末端においてＣｙ３ＴＭ受容体および３’末端において５／６−ＦＡＭ供与体で標識されている。 図８は、ｇｌｍＳリボザイムに対するコンセンサス配列および構造を示している。矢頭は、切断部位を特定している。丸で囲まれたヌクレオチドは、代表的なｇｌｍＳリボザイムの少なくとも９７％において保存されている。 図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓのｇｌｍＳリボザイムによるＧｌｃＮ６Ｐ結合を示している。（Ａ）ＧｌｍＳリボザイムにおける２つのマグネシウムイオンによるリン酸配位。Ｐ２．１、Ａ２８およびＧ１におけるヌクレオチドは、水媒介性の接触を使用することにより、２つの水和したマグネシウムイオンを配置し、活性部位におけるＧｌｃＮ６Ｐリン酸の酸素を方向付ける。（Ｂ）核酸塩基官能基によるＧｌｃＮ６Ｐ糖環の認識。その糖は、ヌクレオチドＡ−４２、Ｕ４３およびＧ５７ならびにＧ１の糖および３’−リン酸と接触している。Ｇ１におけるキニン塩基（ＧｌｃＮ６Ｐの上部に積み重なっている（図９Ａ））は、水素結合の接触物が可視化されることを可能にするために示されていない。（Ｃ）この立体配座を安定化すると予想される活性部位の相互作用は、細い破線として示されている。ＧｌｃＮ６Ｐのエタノールアミン部分と反応性のリン酸との触媒的に極めて重大な相互作用は、太い破線として示されている。切れやすいリン酸、５’−Ｏ脱離基（メチル化されている）および２’−Ｏ求核剤は球として示している。Ｃｏｃｈｒａｎｅ ２００７（このナンバリングについて本明細書で参考として援用される）においてｇｌｍｓリボスイッチに対して使用されているナンバリングによってヌクレオチドを同定する。
（発明の詳細な説明）
開示される方法および組成物は、以下の特定の実施形態の詳細な説明およびその中に含まれる実施例ならびに図およびその図の前後の説明を参照することにより、一層容易に理解することができる。
メッセンジャーＲＮＡは、代表的には、タンパク質または低分子ＲＮＡが制御する因子および翻訳プロセス中のリボソームによって作用される、遺伝情報の受動的な運搬体であると考えられている。ある特定のｍＲＮＡが、天然のアプタマードメインを有し、そしてこれらのＲＮＡドメインに特定の代謝産物が直接結合することによって、遺伝子発現の調節がもたらされることが発見された。天然のリボスイッチは、典型的には天然のＲＮＡと関連しない２つの驚くべき機能を示す。第１に、そのｍＲＮＡエレメントは、異なる構造状態をとり得、ここで、１つの構造は、その標的代謝産物に対する正確な結合ポケットとして機能する。第２に、その構造状態間の代謝産物誘導性のアロステリックな相互変換が、いくつかの異なるメカニズムのうちの１つによって、遺伝子発現のレベルの変化をもたらす。リボスイッチは、典型的には、２つの別個のドメインに分けられ得る：一方は、標的に選択的に結合し（アプタマードメイン）、他方は、遺伝子制御に影響を及ぼす（発現プラットフォーム）。これらの２つのドメイン間の動的な相互作用が、遺伝子発現の代謝産物依存性のアロステリック制御をもたらす。
様々なクラスのリボスイッチが同定されており、リボスイッチは、活性化化合物（本明細書中でトリガー分子と呼ばれる）を選択的に認識すると示されている。例えば、コエンザイムＢ１２、グリシン、チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路において重要な酵素をコードする遺伝子内に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に一致する。従って、配列相同性検索を使用することにより、関連するリボスイッチドメインを同定することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌および真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）の様々な生物において発見されている。
ｇｌｍＳリボザイムは、グルコサミン−６−リン酸合成酵素をコードする細菌ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲに配置されているシス切断型の（ｃｉｓ−ｃｌｅａｖｉｎｇ）触媒性リボスイッチである（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４）。このリボザイムは、ｇｌｍＳにコードされるタンパク質自体の代謝産物である代謝産物グルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮ６Ｐ）によってｇｌｍＳ−ｍＲＮＡ切断のために特異的に活性化され得る。従って、この制御は、細胞壁前駆体として機能する代謝産物の存在を感知するフィードバック阻害メカニズムに依存している（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｆａｍｕｌｏｋ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２００６，Ｖｏｌ．７，ｐ．６０２−６０４、ｇｌｍＳリボスイッチに関する教示についてその全体が本明細書によって参考として援用される）。
Ａ．リボスイッチＲＮＡの一般的な構成
細菌のリボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主要なコード領域の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に配置されている遺伝子制御エレメントである。構造的に探索する研究（以下でさらに述べる）から、リボスイッチエレメントが、一般に２つのドメイン：リガンド結合ドメインとして働く天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，６４，７６３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）エレメント；転写ターミネーターステム）を干渉する「発現プラットフォーム」から構成されることが明らかになっている。これらの結論は、インビトロにおいて合成されたアプタマードメインが、発現プラットフォームの非存在下において適切なリガンドと結合するという観察結果から導き出される（米国出願公開番号２００５−００５３９５１の実施例２、３および６を参照のこと）。さらに、構造的に探索する調査から、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインは、独立して調べられたときに特定の２次構造および３次構造をとる（５’リーダーＲＮＡ全体の状態において調べられたときのアプタマー構造と本質的に同一である）と示唆される。このことから、多くの場合において、そのアプタマードメインは、発現プラットフォームとは無関係に折り畳まれるモジュラーユニットであることが示唆される（米国出願公開番号２００５−００５３９５１の実施例２、３および６を参照のこと）。
最終的には、そのアプタマードメインのリガンドに結合した状態または結合していない状態は、遺伝子発現に対して影響を及ぼすことに関与する発現プラットフォームを介して説明される。リボスイッチをモジュラーエレメントとみなすことは、アプタマードメインが、様々な生物間で（また、ＴＰＰリボスイッチに対して観察されるように界の間でさえも）高度に保存されている（Ｎ．Ｓｕｄａｒｓａｎら、ＲＮＡ ２００３，９，６４４）のに対し、発現プラットフォームは、配列、構造および付随するオープンリーディングフレームの発現を制御するメカニズムの点で異なるという事実によってさらに裏付けられる。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｔｅｎＡ ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチへのリガンド結合は、転写終結を引き起こす（Ａ．Ｓ．Ｍｉｒｏｎｏｖら、Ｃｅｌｌ ２００２，１１１，７４７）。この発現プラットフォームは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｔｈｉＭ ｍＲＮＡにおけるＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比べて配列および構造の点で異なり、ここで、ＴＰＰ結合は、ＳＤを遮断するメカニズムによって翻訳の阻害を引き起こす（米国出願公開番号２００５−００５３９５１の実施例２を参照のこと）。そのＴＰＰアプタマードメインは、容易に認識可能であり、これらの２つの転写単位間でほぼ同一の機能的特徴を有するが、それらを行う遺伝子制御メカニズムおよび発現プラットフォームは、非常に異なる。
リボスイッチＲＮＡに対するアプタマードメインは、典型的には、約７０〜１７０ｎｔ長の範囲である（米国出願公開番号２００５−００５３９５１の図１１）。インビトロ進化実験から、長さがかなり短くて構造が複雑な多岐にわたる小分子結合アプタマーが同定されたことを考えると上記の観察結果は、やや予想外のことであった（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，６４，７６３；Ｍ．Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９９，９，３２４）。人工アプタマーと比べて天然のアプタマー配列の複雑度および情報量が実質的に多いことに対する原因は、依然明らかにされていないが、この複雑度は、高い親和性および選択性で機能するＲＮＡレセプターを形成するために必要であると考えられる。リガンド−リボスイッチ複合体に対する見かけのＫＤ値は、低ナノモル濃度から低マイクロモル濃度の範囲である。いくつかのアプタマードメインが、付随する発現プラットフォームから単離されるときに、インタクトなリボスイッチの親和性よりも、標的リガンドに対して改善された親和性を示す（約１０〜１００倍）こともまた、注目に値する（米国出願公開番号２００５−００５３９５１の実施例２を参照のこと）。おそらく、非常に完全なリボスイッチＲＮＡが求める多数の異なるＲＮＡ立体配座をサンプリングするには、かなりの労力がかかり、このことは、リガンド親和性の低下によって反映される。アプタマードメインが、分子スイッチとして機能しなければならないので、これは、より複雑な構造を合理的に説明するのを助けうる天然のアプタマーに対する機能的な要求に加えられ得る。
Ｂ．細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は、転写を終結させるために主に２つの方法を使用する。ある特定の遺伝子は、Ｒｈｏタンパク質に依存する終結シグナルを組み込んでおり（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ２００２，１５７７，２５１）、他の遺伝子は、転写伸長複合体を不安定化するために、Ｒｈｏとは無関係のターミネーター（内因性ターミネーター）を使用する（Ｉ．Ｇｕｓａｒｏｖ，Ｅ．Ｎｕｄｌｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １９９９，３，４９５；Ｅ．Ｎｕｄｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２００２，７，７５５）。後者のＲＮＡエレメントは、１続きの６〜９個のウリジル残基が続くＧＣリッチのステムループから構成される。内因性ターミネーターは、細菌のゲノム全体に広がっており（Ｆ．Ｌｉｌｌｏら、２００２，１８，９７１）、典型的には遺伝子またはオペロンの３’末端に配置されている。興味深いことに、５’−ＵＴＲ内に配置された内因性ターミネーターについてのますます多くの例が、観察されている。
細菌によって用いられる多岐にわたる遺伝子制御ストラテジーのうち、ＲＮＡポリメラーゼが制御された様式で５’−ＵＴＲ内の終結シグナルに応答するクラスの例が増大している（Ｔ．Ｍ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００，３，１４９）。ある特定の条件において、ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、外部シグナルによって、終結シグナルを感知するか、または無視するように指示される。転写開始は、調節なしに起き得るが、ｍＲＮＡ合成に対する（および遺伝子発現の）制御は、最終的には内因性ターミネーターの調節によって決定される。おそらく、少なくとも２つの相互排他的なｍＲＮＡ立体配座のうちの１つが、転写終結をシグナル伝達するＲＮＡ構造の形成または破壊をもたらす。トランス作用因子は、いくつかの場合においてＲＮＡであり（Ｆ．Ｊ．Ｇｒｕｎｄｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００２，９９，１１１２１；Ｔ．Ｍ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２００２，２４，７００）、他の場合ではタンパク質であり（Ｊ．Ｓｔｕｌｋｅ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２，１７７，４３３）、一般には、特定の細胞内シグナルを受け、その後にＲＮＡ立体配座の１つを安定化するために必要である。リボスイッチは、ＲＮＡ構造調節と遺伝子制御機構によって判断される代謝産物シグナルとを直接結びつける。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のｇｌｍＳリボザイム（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；Ｂａｒｒｉｃｋ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ２００５；Ｓｏｕｋｕｐ ２００６；Ｒｏｔｈ ２００６；Ｊａｎｓｅｎ ２００６）は、固有のリボスイッチ（Ｍａｎｄａｌ ２００４；Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００５）クラスの代表であり、このクラスのメンバーは、グルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮ６Ｐ）に結合しているとき、高い速度定数で自己切断を受ける。これらの代謝産物を感知するリボザイムは、多くのグラム陽性細菌に見られ、それらのグラム陽性細菌においてそのリボザイムはｇｌｍＳ遺伝子の発現を制御している。ｇｌｍＳ遺伝子産物（グルタミン−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ）は、ＧｌｃＮ６Ｐを生成し（Ｂａｄｅｔ−Ｄｅｎｉｓｏｔ １９９３；Ｍｉｌｅｗｓｋｉ ２００２）、ＧｌｃＮ６Ｐは、リボザイムに結合して、リン酸エステルの内部移行によって自己切断を引き起こす（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４）。そのリボザイムは、ｇｌｍＳメッセンジャーＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に抱え込まれており、自己切断によってＧｌｍＳタンパク質の生成が妨害され、それによって、ＧｌｃＮ６Ｐの濃度が低下する。分子の感知と自己切断と遺伝子調節機能との組み合わせによって、この低分子ＲＮＡが、リボザイムとリボスイッチとの両方として作動することが可能になる。
Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来のｇｌｍＳリボザイムおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の相同なリボザイムが、約２００μＭという見かけの解離定数（ＫＤ）でＧｌｃＮ６Ｐに応答することが示されている（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５；Ｒｏｔｈ ２００６）。このＫＤ値が、他のほとんどの天然のリボスイッチに対して測定されている値よりも高いにもかかわらず、ｇｌｍＳリボザイムは、高レベルの分子認識特異性を示す。例えば、グルコサミン−６−硫酸は、約１００倍高い濃度で存在するときであってもＧｌｃＮ６Ｐと同程度にリボザイム活性化を誘導することができる。対照的に、ＧｌｃＮ６Ｐの２−アミン基がヒドロキシル基で置換されているグルコース−６−リン酸は、リボザイム作用を全く引き起こさない（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。
リボスイッチは、代謝遺伝子の望ましくない調節を防止するためにそのリボスイッチの天然のリガンドに関連する化合物を識別できなければならない。しかしながら、リシン（Ｓｕｄａｒｓａｎ ２００３）およびチアミンピロホスフェート（Ｓｕｄａｒｓａｎ ２００６）に対して正常に応答するリボスイッチについて証明されているように、リボスイッチ機能を引き起こし、かつ、細菌の成長を阻害するアナログを作製することが可能である。ＧｌｍＳタンパク質の適正な発現は、細菌の生存能にとって極めて重大であり（Ｂａｄｅｔ−Ｄｅｎｉｓｏｔ １９９３；Ｍｉｌｅｗｓｋｉ ２００２）、ｇｌｍＳリボザイム活性を引き起こすことによって正常な遺伝子発現を妨害し得るＧｌｃＮ６Ｐのアナログは、新しいタイプの抗菌剤として機能し得る。ゆえに、ｇｌｍＳリボザイムの分子認識の特徴に関する深い理解が求められていた。
開示される方法および組成物は、別段詳細に述べられない限り、特定の合成方法、特定の分析技術または特定の試薬に限定されず、多様であり得ることが理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであって、限定する意図はないことも理解されるべきである。
材料
開示される方法および組成物のために使用され得るか、その方法および組成物と組み合わせて使用され得るか、その方法および組成物のための調製において使用され得るか、またはその方法および組成物の生成物である、材料、組成物および構成要素が開示される。これらの材料および他の材料が本明細書中に開示され、また、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されるときに、これらの化合物の様々な個別の組み合わせおよび集合的な組み合わせならびに順列のそれぞれに対する具体的な言及は、明示的に開示され得ないが、その各々は、本明細書中に明確に企図され、記載されることが理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインが開示されて記述され、そして、そのリボスイッチまたはアプタマードメインをはじめとした多くの分子に対してなされ得る多くの改変が記述される場合、具体的に逆のことが示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインのありとあらゆる組み合わせおよび順列ならびに可能な改変が、具体的に企図される。従って、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスならびに分子の組み合わせの例Ａ−Ｄと同時に開示される場合、各々が個別に列挙されていなかったとしても、その各々は、個別かつ集合的に企図される。従って、この例では、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆの各々が、具体的に企図され、開示されると考えられるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図され、開示される。従って、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄから、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅというサブグループが、具体的に企図され、開示されると考えられるべきである。この考えは、本願のすべての態様（例えば、開示される組成物を作製する方法および使用する方法における工程が挙げられるがこれらに限定されない）に適用される。従って、実施され得る種々の追加工程が存在する場合、これらの追加工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせとともに行われ得、そしてそのような組み合わせの各々は、具体的に企図され、開示されると考えられるべきであると理解される。
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現されるＲＮＡ分子の一部であり、トリガー分子によって結合されたときに状態を変化させる発現制御エレメントである。リボスイッチは、典型的には、２つの別個のドメインに分けられ得る：一方は、標的に選択的に結合し（アプタマードメイン）、他方は、遺伝子制御に影響を及ぼす（発現プラットフォームドメイン）。これらの２つのドメイン間の動的な相互作用が、遺伝子発現の代謝産物依存性のアロステリック制御をもたらす。単離されたリボスイッチおよび組換えリボスイッチ、そのようなリボスイッチを含んでいる組換え構築物、そのようなリボスイッチに作動可能に連結された異種性配列、ならびにそのようなリボスイッチ、リボスイッチ組換え構築物および異種性配列に作動可能に連結されたリボスイッチを有する細胞およびトランスジェニック生物が開示される。異種性配列は、例えば、レポータータンパク質またはペプチドをはじめとした目的のタンパク質またはペプチドをコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであるか、またはそれに由来するものである。
開示されるリボスイッチ（その誘導体および組換え型を含む）は、一般に、天然に存在するリボスイッチおよび新規に設計されたリボスイッチをはじめとした任意の起源に由来し得る。任意のそのようなリボスイッチは、開示される方法において使用され得るか、または開示される方法とともに使用され得る。しかしながら、様々なタイプのリボスイッチが定義され得、いくつかのそのようなサブタイプが、（概して本明細書中の他の箇所に記載されているように）特定の方法において有用であり得るか、またはその特定の方法とともに有用であり得る。リボスイッチのタイプとしては、例えば、天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および改変型、キメラリボスイッチならびに組換えリボスイッチが挙げられる。天然に存在するリボスイッチは、天然に見られるようなリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。そのような天然に存在するリボスイッチは、それが天然に存在するとき、天然に存在するリボスイッチの単離型または組換え型であり得る。つまり、そのリボスイッチは、同じ１次構造を有するが、新しい遺伝的状況または核酸状況において単離されているか、または操作されている。キメラリボスイッチは、例えば、任意のリボスイッチまたは特定のクラスもしくはタイプのリボスイッチの一部およびそれとは異なるリボスイッチまたは任意の異なるクラスもしくはタイプのリボスイッチの一部；任意のリボスイッチまたは特定のクラスもしくはタイプのリボスイッチの一部および任意のリボスイッチでない配列または構成要素から構成され得る。組換えリボスイッチは、新しい遺伝的状況または核酸状況において単離されているか、または操作されているリボスイッチである。
リボスイッチは、単一または複数のアプタマードメインを有し得る。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチ内のアプタマードメインは、トリガー分子の協同的結合を示し得るか、またはトリガー分子の協同的結合を示し得ない（すなわち、アプタマーは、必ずしも協同的結合を示す必要はない）。後者の場合、アプタマードメインは、独立した結合体（ｂｉｎｄｅｒ）と呼ばれ得る。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、１つまたは複数の発現プラットフォームドメインを有し得る。例えば、そのトリガー分子の協同的結合を示す２つのアプタマードメインを有するリボスイッチは、その両方のアプタマードメインによって制御される単一の発現プラットフォームドメインに連結され得る。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して連接される１つ以上のアプタマーを有し得る。そのようなアプタマーがトリガー分子の協同的結合を示す場合、そのリンカーは、協同的なリンカーであり得る。
アプタマードメインは、ｘとｘ−１との間のヒル係数ｎを有する場合、協同的結合を示すということができ、ここで、ｘは、協同的結合について解析されているアプタマードメインの数（またはアプタマードメイン上の結合部位の数）である。従って、例えば、２つのアプタマードメインを有するリボスイッチ（例えば、グリシン応答性リボスイッチ）は、そのリボスイッチが、２と１との間のヒル係数を有する場合、協同的結合を示すということができる。用いられるｘの値は、協同的結合について解析されているアプタマードメインの数に左右されるが、必ずしもリボスイッチ内に存在するアプタマードメインの数でなくてもよいことが理解されるべきである。このことは、リボスイッチが、複数のアプタマードメインを有し得るので、いくつかのみが協同的結合を示す場合に意味をなす。
異種性アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含んでいるキメラリボスイッチが開示される。つまり、キメラリボスイッチは、１つの起源由来のアプタマードメインおよび別の起源由来の発現プラットフォームドメインで構成されている。異種性の起源は、例えば、異なる特定のリボスイッチ、異なるタイプのリボスイッチまたは異なるクラスのリボスイッチ由来であり得る。異種性アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。異種性発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ起源にも由来し得る。
改変されたリボスイッチまたは誘導体リボスイッチが、インビトロにおける選択および進化技術を使用して作製され得る。一般に、リボスイッチに適用されるインビトロにおける進化技術は、バリアントリボスイッチのセットを作製することを含み、ここで、そのリボスイッチ配列の一部は、そのリボスイッチの他の部分が一定に保持されつつ、変更される。そして、そのバリアントリボスイッチのセットの活性化、不活性化または遮断（または他の機能的または構造的な基準）を評価することができ、目的の基準を満たしているバリアントリボスイッチを、使用するために選択するか、またはさらなる進化のために選択する。バリアントを作製するために有用な基礎リボスイッチは、本明細書中に開示される特定のリボスイッチおよびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチは、どのリボスイッチの部分をインビトロにおける選択および進化のために変更するかを知らせるために使用され得る。
調節が変更された改変リボスイッチもまた開示される。リボスイッチの調節は、リボスイッチ（これは、キメラリボスイッチである）のアプタマードメインを発現プラットフォームドメインに作動可能に連結することによって変更され得る。そして、そのアプタマードメインは、例えば、そのアプタマードメインに対するトリガー分子の作用を介してリボスイッチの制御を媒介することができる。アプタマードメインは、任意の適当な様式で、例えば、リボスイッチの通常または天然のアプタマードメインを新しいアプタマードメインに置き換えることによって、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに作動可能に連結され得る。一般に、アプタマードメインが由来するリボスイッチを活性化し得るか、不活性化し得るか、または遮断し得る任意の化合物または条件を使用することによって、そのキメラリボスイッチを活性化することができるか、不活性化することができるか、または遮断することができる。
不活性化されたリボスイッチもまた開示される。リボスイッチは、リボスイッチを共有結合的に変化させることによって（例えば、リボスイッチの一部を架橋するか、または化合物をリボスイッチに結合することによって）不活性化され得る。この様式におけるリボスイッチの不活性化は、例えば、そのリボスイッチに対するトリガー分子が結合することを妨害する変更、トリガー分子が結合するときのリボスイッチの状態の変更を妨害する変更、またはリボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合時に発現に影響を及ぼすことを妨害する変更に起因し得る。
バイオセンサーリボスイッチもまた開示される。バイオセンサーリボスイッチは、その同族トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する改変されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベル以上において引き起こされ得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボまたはインビトロにおける用途のために設計され得る。例えば、シグナルとして機能するタンパク質またはシグナルを生成する際に関連するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を有する細胞または生物を操作することによってインビボにおいて使用され得る。インビトロにおいて使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、そのリボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナルである立体配座依存性標識を含むリボスイッチである。そのようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからのアプタマードメインまたは天然に存在するリボスイッチに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチは、様々な状況およびプラットフォームにおいて使用され得る。例えば、バイオセンサーリボスイッチは、固体支持体（例えば、プレート、チップ、ストリップおよびウェル）とともに使用され得る。
新しいトリガー分子を認識する改変されたリボスイッチまたは誘導体リボスイッチもまた開示される。新しいトリガー分子を認識する新しいリボスイッチおよび／または新しいアプタマーは、公知のリボスイッチに対して選択され得るか、公知のリボスイッチから設計され得るか、または公知のリボスイッチに由来し得る。これは、例えば、リボスイッチにおけるアプタマーバリアントのセットを作製し、目的の化合物の存在下においてそのバリアントリボスイッチの活性化を評価し、活性化されたバリアントリボスイッチ（または、例えば、最も高度に活性化されたか、または最も選択的に活性化されたリボスイッチ）を選択し、そして所望の活性、特異性、活性と特異性との組み合わせまたは他の特性の組み合わせのバリアントリボスイッチが生じるまでこれらの工程を繰り返すことによって、達成され得る。
一般に、任意のアプタマードメインは、発現プラットフォームドメイン内の調節鎖をアプタマードメインの制御鎖に相補的であるように設計するか、または適合させることによって、任意の発現プラットフォームドメインとともに使用するために適応され得る。あるいは、アプタマードメインのアプタマー鎖および制御鎖の配列は、制御鎖が、発現プラットフォーム内の機能的に重要な配列に相補的であるように適合され得る。例えば、制御鎖は、ＲＮＡのシャイン・ダルガノ配列に相補的であるように適合され得、制御鎖とＳＤ配列との間にステム構造を形成するとき、ＳＤ配列は、リボソームに接近できなくなるので、翻訳開始が減少するか、または妨害される。アプタマー鎖は、アプタマードメインにおいてＰ１ステムが形成できるように配列の対応する変化を起こし得ることに注意されたい。協同的結合を示す複数のアプタマーを有するリボスイッチの場合、活性化アプタマー（発現プラットフォームドメインと相互作用するアプタマー）のＰ１ステムは、ＳＤ配列とステム構造を形成するように設計される必要がある。
別の例として、転写ターミネーターが、ＲＮＡ分子に（そのＲＮＡの非翻訳領域において最も便利よく）付加され得、ここで、その転写ターミネーターの配列の一部は、アプタマードメインの制御鎖に対して相補的である（その配列は調節鎖であり得る）。このことによって、アプタマードメインの制御配列がアプタマー鎖および調節鎖と別のステム構造を形成することが可能になるので、そのリボスイッチの活性化時または不活性化時に転写ターミネーターステムが形成されるか、または破壊される。他の任意の発現エレメントは、別のステム構造の同様の設計によってリボスイッチの制御下に置かれ得る。
リボスイッチによって制御される転写ターミネーターに対して、転写の速度ならびにリボスイッチおよび発現プラットフォームエレメントのスペーシングは、適正な制御のために重要であり得る。転写の速度は、例えば、転写を休止し、リボスイッチを形成してトリガー分子を感知することを可能にするポリメラーゼ休止エレメント（例えば、１続きのウリジン残基）を含めることによって調整され得る。
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含んでいる調節可能な遺伝子発現構築物が開示され、ここで、そのリボスイッチは、そのＲＮＡの発現を調節し、そのリボスイッチおよびコード領域は、異種性である。そのリボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み得、そのアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは、異種性である。そのリボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み得、そのアプタマードメインは、Ｐ１ステムを含み、そのＰ１ステムは、アプタマー鎖および制御鎖を含み、発現プラットフォームドメインは、調節鎖を含み、調節鎖、制御鎖またはその両方は、ステム構造を形成するように設計されている。そのリボスイッチは、２つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み得、ここで、そのアプタマードメインのうちの少なくとも１つおよび発現プラットフォームドメインは、異種性である。そのリボスイッチは、２つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み得、ここで、アプタマードメインのうちの少なくとも１つは、Ｐ１ステムを含み、そのＰ１ステムは、アプタマー鎖および制御鎖を含み、発現プラットフォームドメインは、調節鎖を含み、その調節鎖、制御鎖またはその両方は、ステム構造を形成するように設計されている。
１．アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および特定のクラスの化合物に選択的に結合することができる核酸セグメントおよび核酸構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合時にリボスイッチの状態または構造の変化をもたらすアプタマードメインを有する。機能的なリボスイッチでは、アプタマードメインに連結された発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がそのアプタマードメインに結合したときに変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、例えば、リボスイッチの天然のアプタマードメイン、人工アプタマー、操作されたか、選択されたか、進化されたか、もしくは誘導された、アプタマーまたはアプタマードメインをはじめとした任意の起源に由来し得る。リボスイッチ内のアプタマーは、一般に、連結された発現プラットフォームドメインの一部とステム構造を形成することなどによって相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子が結合すると形成するか、または破壊される。
種々の天然のリボスイッチのコンセンサスアプタマードメインは、米国出願公開番号２００５−００５３９５１の図１１および本明細書中の他の箇所に示されている。ｇｌｍＳリボザイムに対するコンセンサス配列およびコンセンサス構造は、図８に見られる。これらのアプタマードメイン（その中に具体化されている直接的なバリアントのすべてを含む）は、リボスイッチにおいて使用され得る。そのコンセンサス配列およびコンセンサス構造は、配列および構造におけるバリエーションを示唆する。示唆されるバリエーション内のアプタマードメインは、本明細書中において直接的なバリアントと呼ばれる。これらのアプタマードメインは、改変アプタマードメインまたはバリアントアプタマードメインを生成するために改変され得る。保存的な改変としては、その対におけるヌクレオチドが相補性を保持するような、塩基対形成したヌクレオチドの任意の変更が挙げられる。中程度の改変としては、示されている長さの範囲の２０％以下のステムまたはループの長さ（長さまたは長さの範囲が示されている）の変更が挙げられる。ループおよびステムの長さは、そのコンセンサス構造が特定の長さのステムまたはループを示すか、または長さの範囲が列挙されているか、もしくは描かれている場合に、「示されている」と考えられる。中程度の改変としては、示されている長さの範囲の４０％以下のステムまたはループの長さの変更（長さまたは長さの範囲が示されていない）の変更が挙げられる。中程度の改変としてはまた、アプタマードメインの不特定の部分の機能的バリアントが挙げられる。
Ｐ１ステムおよびその構成鎖は、発現プラットフォームおよびＲＮＡ分子とともに使用するためにアプタマードメインを適合する際に改変され得る。そのような改変は、広範であり得、本明細書中においてＰ１改変と呼ばれる。Ｐ１改変としては、アプタマードメインのＰ１ステムの配列および／または長さに対する変更が挙げられる。図８に示されるアプタマードメインは、インビトロ選択またはインビトロ進化技術を介して、誘導されるアプタマードメインを作製するための開始配列として特に有用である。
開示されるリボスイッチのアプタマードメインはまた、他の任意の目的のために、そして他の任意の状況において、アプタマーとして使用され得る。例えば、アプタマーは、リボザイム、他の分子スイッチおよび任意のＲＮＡ分子を制御するために使用され得、ここで、構造の変化は、ＲＮＡの機能に影響を及ぼし得る。
２．発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むＲＮＡ分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、連結されたアプタマードメインの一部とステム構造を形成することなどによって相互作用することができる少なくとも一部分を有する。このステム構造は、トリガー分子が結合すると形成するか、または破壊される。このステム構造は、一般に、発現制御構造であるか、または発現制御構造の形成を妨害する。発現制御構造は、その構造を含むＲＮＡ分子の発現を可能にするか、妨害するか、増強するか、または阻害する構造である。例としては、シャイン・ダルガノ配列、開始コドン、転写ターミネーターならびに安定性シグナルおよびプロセシングシグナルが挙げられる。
Ｂ．トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。このトリガー分子としては、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化することができる他の化合物に対する天然または通常のトリガー分子が挙げられる。天然または通常のトリガー分子は、所与のリボスイッチに対する天然におけるトリガー分子であるか、または、いくつかの非天然のリボスイッチの場合、リボスイッチを設計したか、またはリボスイッチを選択したトリガー分子（例えば、インビトロ選択またはインビトロ進化技術において）である。
Ｃ．化合物
リボスイッチを活性化することができるか、不活性化することができるか、または遮断することができる化合物およびそのような化合物を含んでいる組成物もまた開示される。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去を介して遺伝子発現を調節するように機能する。化合物は、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断するために使用され得る。リボスイッチに対するトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために使用され得る。トリガー分子以外の化合物は、通常、リボスイッチを不活性化するか、または遮断するために使用され得る。リボスイッチは、例えば、リボスイッチが存在するところからトリガー分子を除去することによっても不活性化され得る。リボスイッチは、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログを結合することによって遮断され得る。
ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物もまた開示され、ここで、そのＲＮＡ分子は、リボスイッチを含む。これは、化合物をそのＲＮＡ分子と接触させることによって達成され得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去を介して遺伝子発現を調節するように機能する。従って、リボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する条件に供することを用いて、そのＲＮＡの発現を変化させることができる。発現は、例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボソーム結合の遮断の結果として、変化し得る。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を低下させ得るか、もしくは妨害し得るか、またはそのＲＮＡ分子の発現を促進し得るか、もしくは増加させ得る。
ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物もまた開示される。リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断することによって、リボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物もまた開示される。その遺伝子が、それを含んでいる細胞または生物の生存に不可欠である場合、そのリボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、その細胞または生物の死、停止または衰弱をもたらし得る。
リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断することによって、そのリボスイッチを含む、単離されたか、操作されたか、もしくは組換えの遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物もまた開示される。その遺伝子が、所望の発現産物をコードする場合、そのリボスイッチの活性化または不活性化は、遺伝子の発現を誘導するために使用され得るので、発現産物が生成され得る。その遺伝子が、遺伝子発現または別の細胞プロセスのインデューサーまたはリプレッサーをコードする場合、そのリボスイッチの活性化、不活性化または遮断によって、他の制御される遺伝子または細胞プロセスの誘導、抑制または抑制解除がもたらされ得る。多くのそのような二次的な調節作用が知られており、リボスイッチとともに使用するために適合され得る。そのような調節のための主要な制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が低分子で非抗原性の分子であり得る点である。
リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する化合物を同定する方法もまた開示される。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価することによって同定され得る。リボスイッチが活性化される場合、その試験化合物は、そのリボスイッチを活性化する化合物と同定される。リボスイッチの活性化は、任意の適当な様式で評価され得る。例えば、リボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結され得、レポーターＲＮＡの発現、発現レベルまたは発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下において測定することができる。別の例として、リボスイッチは、立体配座依存性標識を含み得、その標識からのシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。そのようなリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからのアプタマードメインまたは天然に存在するリボスイッチに由来するアプタマードメインを使用する。理解され得るように、リボスイッチの活性化の評価は、コントロールアッセイもしくは測定を使用して行われ得るか、またはコントロールアッセイもしくは測定を使用せずに行われ得る。リボスイッチを不活性化する化合物を同定するための方法は、同様の方法で行われ得る。
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、任意の適当な様式で達成され得る。例えば、リボスイッチを活性化するか、または不活性化すると知られている化合物の存在下において、および試験化合物の存在下において、リボスイッチの活性化または不活性化を評価するために、アッセイが行われ得る。試験化合物の非存在下において観察されるような活性化または不活性化が観察されない場合、その試験化合物は、そのリボスイッチの活性化または不活性化を遮断する化合物と同定される。
化合物は、リボスイッチの原子結晶構造を使用することによってもまた同定され得る。ｇｌｍＳリボスイッチの原子構造の原子座標を表２に列挙する。図９に描かれているような活性部位および結合ポケットの原子構造ならびに表２内に含まれる図９に描かれている活性部位および結合ポケットの原子座標もまた、使用することができる。例えば、試験化合物を用いてリボスイッチの原子構造をモデル化し；そしてその試験化合物がそのリボスイッチと相互作用するかを判定することによって、リボスイッチの結晶構造を使用して、化合物を同定することができる。これは、リボスイッチのモデルにおいて試験化合物に対する予測される最小の相互作用エネルギー、予測される結合定数、予測される解離定数または組み合わせを使用することによって行われ得る。また、例えば、リボスイッチと、リボスイッチに結合すると知られている化合物（例えば、トリガー分子）との適合を評価し、化合物の結合性に対して明らかな有害作用がほとんどないか、または全くなく、その化合物を変化し得る部位を同定し、そして新規化合物を作製するために１つ以上のそのような変更を組み込むことによって化合物を同定することができる。リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法もまた、そのように同定される化合物の作製を含み得る。
典型的には、その方法は、まず、「公知の化合物」または「公知の標的」とも呼ばれる化合物を有しているリボスイッチの３次元構造を利用する。本明細書中に開示されるトリガー分子および化合物のいずれかが、そのような公知の化合物として使用され得る。リボスイッチの構造は、任意の公知の手段（例えば、結晶学または溶液ＮＭＲ分光法）を使用して決定され得る。その構造は、ＡｕｔｏＤｏｃｋなどのコンピュータ分子モデリングシミュレーションプログラムを介しても得ることができる。上記方法は、結合の量を測定すること（例えば、リボスイッチとそのリボスイッチに対する有望な化合物との間の結合エネルギーを測定すること）を含み得る。活性な化合物は、リボスイッチに対していくらかの活性（例えば、リボスイッチの活性の阻害またはリボスイッチの活性の増強）を有する化合物である。さらに、その有望な化合物は、その分子に対する公知の化合物といくらかの構造上の関係性を有するアナログであり得る。トリガー分子、公知の化合物および本明細書中に開示される化合物のいずれかが、有望な化合物の基準として使用され得るか、有望な化合物を得るために使用され得る。
公知の化合物と有望な化合物との、構造、特性、相互作用または結合パラメータなどの同一性または関係性が、多くの方法において考察され得る。例えば、構造モデルを使用して測定され得るか、もしくは評価され得る基準または相互作用パラメータのいずれかと、公知の化合物および有望な化合物に対して得られるそのような基準およびパラメータとを比較し得る。すべての公知の化合物および有望な化合物との同一性を考察することができる。有望な化合物がリボスイッチと相互作用するドメインにおいてのみ、アナログなどの有望な化合物と公知の化合物との同一性を考察することもできる。有望な化合物と公知の化合物との同一性を、サブドメインのレベル（例えば、公知の化合物においてリボスイッチと接触している部分または原子の７Å、６Å、５Å、４Å、３Åまたは２Å以内の、有望な化合物におけるそれらの部分または原子のみ）において考察することもできる。一般に、サブドメインが明確になるほど、有望な化合物の部分と公知の化合物の部分との同一性は高くなる。例えば、全体として公知の化合物と有望な化合物との間には３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の同一性が存在し得、公知の化合物と有望な化合物の結合ドメインとの間には５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の同一性が存在し得、そして、リボスイッチと相互作用する部分または原子の５Å以内の公知の化合物の部分または原子に対応する有望な化合物の部分間または原子間には７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の同一性が存在し得る。別のサブドメインは、そのリボスイッチと実際に接触する部分または原子のサブドメインである。この場合、同一性は、例えば、５０％超、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である。
典型的には、有望な化合物は、有望な化合物のファミリー、すなわち、アナログのセットで存在し、それらのすべては、リボスイッチについて公知の化合物といくらかの構造上の関係性を有する。任意の数のメンバーからなるファミリーをスクリーニングすることができる。そのファミリーにおけるメンバーの最大数は、所望の時間において各メンバーをスクリーニングするために利用可能なコンピュータ能力の量によってのみ制限される。その方法は、リボスイッチおよび標的の少なくとも１つの鋳型構造を含み得、しばしばこれは、公知の標的を用いうる。この構造は、いくつかの場合において、開示される方法の間に標準的な構造決定技術を用いて作製され得るので、現存するものである必要はない。実際の構造が、その方法が使用される時点において存在することが好ましい。
上記方法はまた、公知の化合物の構造からの情報を使用する、有望な化合物の構造のモデル化を含み得る。このモデル化は、任意の方法において行われ得、本明細書中に記載されるように行われ得る。
有望な化合物の立体配座および位置は、計算の間、固定されて保持され得る；すなわち、リボスイッチは、公知の化合物に結合するのと全く同じ配向で有望な化合物に結合すると仮定され得る。
そして、リボスイッチと有望な化合物との間における結合エネルギー（または他の特性またはパラメータ）が決定され得、結合エネルギー（または他の特性またはパラメータ）が、ある特定の基準を満たす場合、その有望な化合物は、実際の化合物（すなわち、リボスイッチと相互作用する可能性がある化合物）と明示され得る。以下のことは、結合エネルギーの使用のことを指すが、化合物とリボスイッチとの相互作用またはモデル化に関する任意の特性またはパラメータが使用され得ると理解されるべきである。判定基準は、リボスイッチと有望な化合物との計算された結合エネルギーが、同じリボスイッチと公知の化合物との計算された結合エネルギーと類似か、またはそれよりも好ましいことであり得る。例えば、実際の化合物は、本明細書中に記述されるように計算された結合エネルギーが、例えば、公知の化合物の結合エネルギーの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上である化合物であり得る。実際の化合物はまた、結合エネルギーの強度に関してすべての有望な化合物を順序付けた後に、例えば、有望な化合物のセット（そのセットは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、５００、７００または１０００個の有望な化合物である）の計算された結合強度の上位２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％に入る化合物であり得る。
本明細書中に開示されるように、有望な化合物がいったん同定されると、従来の試験および解析を行うこと（例えば、リボスイッチおよび実際の化合物を使用して生物学的アッセイを行うこと）によって、実際の化合物がリボスイッチと相互作用する能力および／または調節する能力をさらに定義することができることも理解される。開示される方法は、リボスイッチおよび化合物の活性をアッセイする工程ならびに例えばリボスイッチに基づくライブラリーを用いて例えばコンビナトリアルケミストリー研究を行う工程を包含し得る。
エネルギーの計算は、例えば、分子力学または量子力学に基づき得る。分子力学は、結合伸縮（ｂｏｎｄ ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）、ファンデルワールス力または静電相互作用のような全エネルギーの成分を表す一連の経験的関数を合計することによって系のエネルギーを近似する。量子力学方法は、様々な程度の近似を使用して、シュレーディンガー方程式を解く。これらの方法は、電子構造を扱うことにより、化学反応の特徴づけを可能にする。
リボスイッチの有望な化合物が同定され得る。これは、公知の化合物に対する所与の類似度を用いて有望な化合物を選択することによって達成され得る。例えば、公知の化合物と同じファミリーの化合物を選択することができる。
計算のために各リボスイッチを調製するために、有望な化合物の結晶構造から分解されなかったか、または有望な化合物の結晶構造に存在しなかった原子が組み入れられ得る。これは、例えば、ＰＲＯＤＲＧウェブサーバーｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｖａｐｃ１．ｂｉｏｃｈ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ．／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐｒｏｄｒｇまたは標準的な分子モデリングプログラム（例えば、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ，Ｑｕａｎｔａ（両方ともｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍにおけるもの）、ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら、Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ＆ ＮＭＲ ｓｙｓｔｅｍ：高分子構造決定に適した新規ソフトウェア．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ５４，９０５−９２１（１９９８））またはリボスイッチ構造を調製することができる他の任意の分子モデリングシステム）を使用して行われ得る。
そして、有望な化合物とリボスイッチとの結合エネルギー（または他の特性またはパラメータ）を計算することができる。これを行うための手段は多数存在する。例えば、そのモデル内の原子のすべての対の間の静電相互作用およびファンデルワールス相互作用の和として、有望な化合物−分子のエネルギーをモデル化する経験的関数を使用して、側鎖の位置のサンプリングおよび結合熱力学の計算が達成され得る。リボスイッチと有望な化合物との結合エネルギーをスコア付けするための他の任意のコンピュータによる方法（Ｈ．Ｇｏｈｌｋｅ，＆ Ｇ．Ｋｌｅｂｅ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１，２６４４−４６７６（２００２））が使用され得る。そのようなスコア付けの方法の例としては、プログラム（例えば、ＡｕｔｏＤｏｃｋ（Ｇ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ Ｌａｍａｒｃｋｉａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ａｎｄ ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１９，１６３９−１６６２（１９９８））、Ｇｏｌｄ（Ｇ．Ｊｏｎｅｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５，４３−５３（１９９５））、Ｃｈｅｍ−Ｓｃｏｒｅ（Ｍ．Ｄ．Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１１，４２５−４４５（１９９７））およびＤｒｕｇ−Ｓｃｏｒｅ（Ｈ．Ｇｏｈｌｋｅら、Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ｓｃｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５，３３７−３５６（２０００））において実行される方法が挙げられるが、これらに限定されない。
回転異性体ライブラリーは、当業者に公知であり、インターネットをはじめとした種々の供給源から得ることができる。回転異性体は、低エネルギー側鎖立体配座である。回転異性体のライブラリーを使用することにより、最も可能性のある側鎖立体配座を試すための構造のモデル化が可能になり、時間が節約され、妥当である可能性が最も高い構造が作製される。回転異性体のライブラリーの使用は、有望な化合物の所与の領域内に存在する残基、例えば、結合部位に存在するか、またはその化合物の明示された距離内に存在する残基に制限され得る。後者の距離は、任意の所望の長さにおいて設定され得、例えば、有望な化合物は、その分子の任意の原子から２、３、４、５、６、７、８または９Åであり得る。
すべての原子対間における静電相互作用は、例えば、式：
Ｅｅｌｅｃ＝３３２．０８ｑ１ｑ２／εг（ここで、ｑ１およびｑ２は、部分的な原子の荷電であり、гは、それらの間の距離であり、εは、誘電率である）を用いるＣｏｕｌｏｍｂｉｃモデルを使用して計算され得る。
部分的な原子の荷電は、分子内の電荷分布を描写するために開発された、既存のパラメータセットから得ることができる。パラメータセットの例としては、ＰＡＲＳＥ（Ｄ．Ａ．Ｓｉｔｋｏｆｆら、Ａｃｃｕｒａｔｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｆｒｅｅ−ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８，１９７８−１９８８（１９９４））、ＣＨＡＲＭＭ（ＭａｃＫｅｒｅｌｌら、Ａｌｌ−ａｔｏｍ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ １０２，３５８６−３６１６，１９９８）およびＡＭＢＥＲ（Ｗ．Ｄ．Ｃｏｒｎｅｌｌら、Ａ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ−ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｎｕｃｌｅｉｃ−ａｃｉｄｓ，ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７．５１７９−５１９５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。原子に対する部分的な荷電は、類似の官能基の荷電との類似性によってか、またはＰＲＯＤＲＧサーバーにおいて実行される方法などの経験的な割り当て方法（Ｄ．Ｍ．Ｆ．ｖａｎ Ａａｌｔｅｎら、ＰＲＯＤＲＧ，ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ １０，２５５−２６２（１９９６））によってか、もしくは標準的な量子力学的計算方法（例えば、Ｃ．Ｉ．Ｂａｙｌｙら、Ａ ｗｅｌｌ−ｂｅｈａｖｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｃｈａｒｇｅ ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ ｆｏｒ ｄｅｒｉｖｉｎｇ ａｔｏｍｉｃ ｃｈａｒｇｅｓ−ｔｈｅ ＲＥＳＰ ｍｏｄｅｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９７，１０２６９−１０２８０，（１９９３））を使用することによって、割り当てられ得る。
静電相互作用は、静電気的な脱溶媒和作用を組み込む一層精巧な方法によっても計算され得る。これらとしては、明示的な溶媒モデルおよび間接的な溶媒モデルが挙げられ得る：前者において、水分子は、計算に直接含められるのに対し、後者では、水の作用は、誘電性連続体アプローチによって説明される。静電相互作用を計算するための間接的な溶媒方法の特定の例としては：Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｔｚｍａｎｎに基づく方法およびＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ法（Ｍ．Ｆｅｉｇ ＆ Ｃ．Ｌ．Ｂｒｏｏｋｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１４，２１７−２２４（２００４））が挙げられるがこれらに限定されない。
原子対（両方の原子が硫黄または炭素のいずれかである）の間のファンデルワールス相互作用および疎水性相互作用は、以下の方程式：
Ｅｖｄｗ＝Ｅ｛σａｔｔ １２／ｒ１２−σａｔｔ ６／ｒ６｝（ここで、Ｅは、エネルギーであり、ｒは、２つの原子間の距離であり、σａｔｔは、相互作用のエネルギーがゼロであるときの距離である）を用いる単純なレナードジョーンズ形式（ｓｉｍｐｌｅ Ｌｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓ ｆｏｒｍａｌｉｓｍ）を使用して計算され得る。
原子対（片方または両方の原子が硫黄でもなく、炭素でもない）の間のファンデルワールス相互作用は、単純な反発エネルギー項：
Ｅｖｄｗ＝Ｅ｛σｒｅｐ １２／ｒ１２｝（ここで、Ｅは、エネルギーであり、ｒは、２つの原子間の距離であり、σｒｅｐは、反発的な相互作用がＥに等しいときの距離を決定する）を使用して計算され得る。
原子間の疎水性相互作用はまた、当業者に公知の種々の他の方法を用いて計算され得る。例えば、エネルギー的寄与は、複合体が形成されるときに埋もれているリガンドおよびレセプターの溶媒に接近可能な表面積に比例すると計算され得る。そのような寄与は、ＳｔｒｅｅｔおよびＭａｙｏによって提唱されている方法におけるような原子対間の相互作用に関して表され得る（Ａ．Ｇ．Ｓｔｒｅｅｔ ＆ Ｓ．Ｌ．Ｍａｙｏ．Ｐａｉｒｗｉｓｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａｓ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ＆ Ｄｅｓｉｇｎ ３，２５３−２５８（１９９８））。疎水性寄与もしくはファンデルワールス寄与または他のエネルギー的寄与を説明するための形式の他の任意の手段が、計算に含められ得る。
結合エネルギーは、有望な化合物−リボスイッチ相互作用の各々について計算され得る。例えば、リボスイッチの存在下および非存在下においてモンテカルロサンプリングを行うことができ、各シミュレーションにおける平均エネルギーが計算され得る。次いで、有望な化合物とのリボスイッチに対する結合エネルギーを、計算された２つの平均エネルギー間の差として計算することができる。
リボスイッチと有望な化合物との計算された結合エネルギーを、リボスイッチと公知の化合物との計算された結合エネルギーと比較することにより、有望な化合物が実際の化合物である可能性があるかを判定することができる。次いで、実験データを用いてこれらの結果を確認することができ、ここで、リボスイッチと化合物との間の実際の相互作用が、測定され得る。リボスイッチと化合物との間の実際の相互作用を判定するために使用され得る方法の例としては：平衡透析の測定（放射性型の化合物とリボスイッチとの結合を検出する）、酵素阻害アッセイ（化合物の存在下および非存在下においてリボスイッチの活性をモニターすることができる）および化学シフトの摂動測定（原子のＮＭＲ化学シフトの変化を観察することによってリボスイッチと有望な化合物との結合をモニターする）が挙げられるがこれらに限定されない。
モデリングは、コンピュータ、コンピュータプログラムまたはコンピュータオペレーティングプログラムにおいて行われ得るか、またはそれらの助けを受けて行われ得る。コンピュータは、構造の画像を３Ｄで表示し得るか、または３Ｄとして表し得る。その画像は、表２の原子座標によって表される構造の任意のものまたはすべてであり得る。例えば、図９に描かれているような活性部位および結合ポケットの原子構造ならびに表２内に含まれる図９に描かれている活性部位および結合ポケットの原子座標によって表されている構造を表示することができる。化合物がｇｌｍＳリボスイッチと特異的に結合するか、または相互作用する能力をモデル化するためおよび／または評価するために使用され得る表２の原子座標によって表される構造の任意の部分は、モデリングおよび本明細書中に記載されるような関連の方法に使用され得る。
リボスイッチの原子結晶構造が、有望な化合物を用いてモデル化された後、リボスイッチとその化合物との実際の相互作用を判定するためにさらなる試験が行われ得る。例えば、ゲルベースおよびチップベースの検出方法を用いるアロステリックなリボザイムアッセイならびにインラインプロービング（ｉｎ−ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｉｎｇ）アッセイをはじめとした多数の様々なアプローチを使用することによって、ＲＮＡの結合を検出することができる。ハイスループット試験もまた、例えば、蛍光検出方法を使用することによって達成され得る。例えば、ＲＮＡ切断リボザイムを活性化することによって遺伝子発現を制御する、グルコサミン−６−リン酸を感知するリボスイッチの天然の触媒活性が使用され得る。このリボザイムは、再構成されることにより、多数のターンオーバー動力学で別個の基質分子を切断し得る。ゆえに、化合物がリボザイム機能を誘発する場合、クエンチング基に近接した蛍光基は、脱共役され得る（従って一層蛍光性になる）。第２に、分子ビーコン技術が使用され得る。これは、ビーコンがリボスイッチＲＮＡにドッキングするのを化合物が妨害する場合、蛍光を抑制する系をもたらす。本明細書中に記載されるＲＮＡ操作ストラテジーを使用することによって、任意のリボスイッチクラスにいずれかのアプローチが適用され得る。
本明細書中に開示されるｇｌｍＳリボスイッチと相互作用するアナログもまた、本明細書中に開示される。そのようなアナログの例は、図２に見られる。合成され、試験される化合物の多くは、ＧｌｃＮ６Ｐの定数と等しいか、またはそれよりも良好な定数でｇｌｍＳリボスイッチに結合する。極めて変わりやすい化学組成物の付属物が機能を示すという事実は、これらの化学骨格の多くのバリエーションを作製することができ、インビトロおよび細胞内における機能について試験することができることを示している。具体的には、これらの化合物のさらに改変されたバージョンが、ＲＮＡ構造における他の官能基に対する新しい接触物を作製することによってｇｌｍＳリボスイッチへの結合を改善し得る。さらに、バイオアベイラビリティ、毒性および合成の容易さ（他の特徴の中でも）の調節は、リボスイッチに対する構造モデルが、これらの部位において多くの改変が可能であることを示すとき、骨格のこれらの２つの領域を改変することによって調節可能であり得る。
分子認識の標準的な様式または標準的でない様式でリボスイッチＲＮＡにも結合する全く新しい化学骨格を明らかにするために、ハイスループットスクリーニングを使用することもできる。リボスイッチは、発見されている天然の代謝産物結合ＲＮＡの最も主要な型であるので、ハイスループットスクリーニングに適合することができる結合アッセイを開発する努力がこれまでほとんどなされてこなかった。代謝産物結合ＲＮＡを検出するために、ゲルベースおよびチップベースの検出方法を用いるアロステリックなリボザイムアッセイならびにインラインプロービングアッセイをはじめとした多数の様々なアプローチを使用することができる。リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する化合物を同定し、そしてその同定された化合物を製造することによって作製された化合物もまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他の箇所に開示されるような化合物同定方法と、同定された化合物を製造するための方法とを組み合わせることによって達成され得る。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、そのリボスイッチが試験化合物によって活性化される場合にリボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製造することによって、作製され得る。
化合物によるリボスイッチの活性化、不活性化または遮断を確認し、そしてその確認された化合物を製造することによって作製される化合物もまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他の箇所に開示されるような化合物の活性化、不活性化または遮断を評価する方法と確認された化合物を製造するための方法とを組み合わせることによって達成され得る。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そのリボスイッチが試験化合物によって活性化された場合に、リボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製造することによって作製され得る。リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する能力について化合物を確認することは、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断することがこれまで知られていない化合物の同定と、化合物がリボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断することがすでに知られている場合にその化合物がリボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する能力を評価することとの両方のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「置換され（てい）る」は、有機化合物の許容できる置換基のすべてを包含すると企図される。広範な態様において、その許容できる置換基は、非環式および環式の、分枝型および非分枝型の、炭素環式および複素環式の、ならびに芳香族および非芳香族の、有機化合物の置換基を包含する。例示的な置換基としては、例えば、以下に記載されるものが挙げられる。許容できる置換基は、１つ以上であり得るし、適切な有機化合物と同じかまたは異なり得る。本開示の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たす本明細書中に記載される有機化合物の任意の許容できる置換基を有し得る。本開示は、有機化合物の許容できる置換基によって任意の様式で限定されると意図されない。また、用語「置換」または「〜で置換された」は、そのような置換が、置換される原子および置換基の許容される原子価に従い、そしてその置換によって、安定な化合物（例えば、転位、環化、脱離などによる変換を自発的に起こさない化合物）がもたらされるという暗黙の条件を包含する。
「Ａ１」、「Ａ２」、「Ａ３」および「Ａ４」は、様々な特定の置換基を表す一般的な符号として本明細書中において使用される。これらの符号は、任意の置換基であり得、本明細書中に開示されるものに限定されず、それらが１つの場合においてある特定の置換基であると定義されるとき、それらは別の場合において他のいくつかの置換基と定義され得る。
用語「アルキル」は、本明細書中で使用されるとき、１〜２４個の炭素原子の分枝型または非分枝型の飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど）である。アルキル基は、置換され得るか、または置換され得ない。アルキル基は、１つ以上の基（アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールが挙げられるがこれらに限定されない）で以下に記載されるように置換され得る。用語「低級アルキル」は、６個以下の炭素原子を有するアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）である。
本明細書全体を通して、「アルキル」は、通常、非置換アルキル基と置換アルキル基との両方を指すために使用される；しかしながら、置換アルキル基は、そのアルキル基上の特定の置換基を同定することによって本明細書中において具体的に指されることもある。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」とは、具体的には、１つ以上のハロゲン化物、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素で置換されているアルキル基のことを指す。用語「アルコキシアルキル」とは、具体的には、以下に記載されるように、１つ以上のアルコキシ基で置換されているアルキル基のことを指す。用語「アルキルアミノ」とは、具体的には、以下に記載されるように、１つ以上のアミノ基などで置換されているアルキル基のことを指す。１つの場合において「アルキル」が使用され、別の場合において「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語が使用されるとき、用語「アルキル」は、「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語のことを指さないことを示唆すると意図されない。
この慣例は、本明細書中に記載される他の基に対しても使用される。つまり、「シクロアルキル」などの用語は、非置換シクロアルキル部分と置換シクロアルキル部分の両方のことを指すが、その置換部分は、さらに本明細書中において具体的に特定され得る；例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」と呼ばれ得る。同様に、置換アルコキシは、具体的には、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」と呼ばれ得、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」などであり得る。また、「シクロアルキル」などの一般的な用語および「アルキルシクロアルキル」などの特定の用語を使用する慣例は、その一般的な用語が、その特定の用語を包含しないと示唆すると意図されない。
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用されるとき、末端の単結合のエーテル結合を介して結合されているアルキル基である；すなわち、「アルコキシ」基は、−ＯＡ１（Ａ２は上で定義されたようなアルキルである）と定義され得る。
用語「アルケニル」は、本明細書中で使用されるとき、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含んでいる構造式を有する２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。（Ａ１Ａ２）Ｃ＝Ｃ（Ａ３Ａ４）などの不斉性の構造は、Ｅ異性体とＺ異性体との両方を包含すると意図される。これは、不斉性のアルケンが存在するか、または構造式が結合符号Ｃ＝Ｃによって明示的に示され得る本明細書中の構造式において想定され得る。アルケニル基は、１つ以上の基（アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールが挙げられるがこれらに限定されない）で以下に記載されるように置換され得る。
用語「アルキニル」は、本明細書中で使用されるとき、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含んでいる構造式を有する２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基は、１つ以上の基（アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールが挙げられるがこれらに限定されない）で以下に記載されるようなに置換され得る。
用語「アリール」は、本明細書中で使用されるとき、任意の炭素系の芳香族基を含む基であり、それらとしては、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどが挙げられるがこれらに限定されない。用語「アリール」はまた、芳香族基の環内に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基を含んでいる基と定義される「ヘテロアリール」も包含する。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、用語「アリール」内にも含められる用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含んでいない芳香族基を含んでいる基と定義する。アリール基は、置換され得るか、または置換され得ない。アリール基は、１つ以上の基（アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールが挙げられるがこれらに限定されない）で本明細書中に記載されるように置換され得る。用語「ビアリール」は、特定のタイプのアリール基であり、アリールの定義内に含められる。ビアリールとは、ナフタレンにおけるような縮合環構造を介してともに結合されているか、またはビフェニルにおけるような１つ以上の炭素−炭素結合を介して結合されている、２つのアリール基のことを指す。
用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用されるとき、少なくとも３個の炭素原子から構成されている非芳香族の炭素系環である。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルキル」は、上で定義されたようなシクロアルキル基であり、ここで、その環の炭素原子の少なくとも１つは、ヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄またはリンであるがこれらに限定されない）で置換されている。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換され得るか、または置換され得ない。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、１つ以上の基（アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールが挙げられるがこれらに限定されない）で本明細書中に記載されるように置換され得る。
用語「シクロアルケニル」は、本明細書中で使用されるとき、少なくとも３個の炭素原子から構成され、少なくとも１つの二重結合、すなわち、Ｃ＝Ｃを含んでいる非芳香族の炭素系環である。シクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上で定義されたようなシクロアルケニル基の一種であり、用語「シクロアルケニル」の意味の中に含まれ、ここでその環の炭素原子の少なくとも１つは、ヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄またはリンであるがこれらに限定されない）で置換されている。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換され得るか、または置換され得ない。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、１つ以上の基（アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシドまたはチオールが挙げられるがこれらに限定されない）で本明細書中に記載されるように置換され得る。
用語「環状の基」は、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基）のいずれかまたはその両方のことを指すために本明細書中で使用される。環状の基は、置換され得るか、または置換され得ない１つ以上の環系を有する。環状の基は、１つ以上のアリール基、１つ以上の非アリール基または１つ以上のアリール基および１つ以上の非アリール基を含み得る。
用語「アルデヒド」は、本明細書中で使用されるとき、式−Ｃ（Ｏ）Ｈによって表される。本明細書全体を通して、「Ｃ（Ｏ）」は、Ｃ＝Ｏに対する簡潔な表記法である。
用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書中で使用されるとき、式ＮＡ１Ａ２Ａ３によって表され、ここで、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、独立して、水素、上で説明されたアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用されるとき、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって表される。「カルボキシレート」は、本明細書中で使用されるとき、式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−によって表される。
用語「エステル」は、本明細書中で使用されるとき、式−ＯＣ（Ｏ）Ａ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＡ１によって表され、ここで、Ａ１は、上で説明されたアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
用語「エーテル」は、本明細書中で使用されるとき、式Ａ１ＯＡ２によって表され、ここで、Ａ１およびＡ２は、独立して、上で説明されたアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
用語「ケトン」は、本明細書中で使用されるとき、式Ａ１Ｃ（Ｏ）Ａ２によって表され、ここで、Ａ１およびＡ２は、独立して、上で説明されたアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基であり得る。
用語「ハロゲン化物」は、本明細書中で使用されるとき、ハロゲンであるフッ素、塩素、臭素およびヨウ素のことを指す。
用語「ヒドロキシル」は、本明細書中で使用されるとき、式−ＯＨによって表される。
用語「スルホ−オキソ」は、本明細書中で使用されるとき、式−Ｓ（Ｏ）Ａ１（すなわち、「スルホニル」）、Ａ１Ｓ（Ｏ）Ａ２（すなわち、「スルホキシド」）、−Ｓ（Ｏ）２Ａ１、Ａ１ＳＯ２Ａ２（すなわち、「スルホン」）、−ＯＳ（Ｏ）２Ａ１または−ＯＳ（Ｏ）２ＯＡ１によって表され、ここで、Ａ１およびＡ２は、水素、上で説明されたアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基であり得る。本明細書全体を通して、この「Ｓ（Ｏ）」という記載は、Ｓ＝Ｏに対する簡潔な表記法である。
用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、本明細書中で使用されるとき、式−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−によって表される。
用語「チオール」は、本明細書中で使用されるとき、式−ＳＨによって表される。
本明細書中で使用されるとき、「Ｒｎ」（ｎは、何らかの整数である）は、独立して、上に列挙された基のうちの１つ以上を有し得る。例えば、Ｒ１０が、アリール基を含む場合、そのアリール基の水素原子のうちの１つは、任意に、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミン基、アルキル基、ハロゲン化物などで置換され得る。選択される基に応じて、第１の基は、第２の基の中に組み込まれ得るか、あるいは、第１の基は、第２の基の側鎖であ得る（すなわち、結合され得る）。例えば、句「アミノ基を含んでいるアルキル基」において、アミノ基は、アルキル基の骨格内に組み込まれ得る。あるいは、そのアミノ基は、アルキル基の骨格に結合され得る。選択される基の性質は、第１の基が第２の基に組み込まれるのか、または結合するのかを決定する。
特段の記載がない限り、実線のみで示され、楔形または破線で示されない化学結合を含む式は、可能な異性体の各々、例えば、エナンチオマーおよびジアステレオマーの各々ならびに異性体の混合物（たとえば、ラセミ混合物またはスケールミック（ｓｃａｌｅｍｉｃ）混合物）を企図する。
本明細書中に開示されるある特定の材料、化合物、組成物および構成要素は、市販されているか、または当業者に通常知られている手法を用いて容易に合成することができる。例えば、開示される化合物および組成物を調製する際に使用される出発物質および試薬は、市販業者（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）またはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））から入手可能であるか、または参考文献（例えば、Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−１７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４０（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；およびＬａｒｏｃｋ’ｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，１９８９））に示されている手順に従って当業者に公知の方法によって調製される。
ｇｌｍＳ応答性リボスイッチ（およびｇｌｍＳ応答性リボスイッチに由来するリボスイッチ）とともに有用な化合物としては、式Ｉ：
Figure 2010503619
 によって表される化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、その生理的に加水分解可能かつ許容可能なエステルまたはその両方が挙げられ、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、
Ｒ２は、ＮＨ−Ｒ６であり、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）イソ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＮＨ２であり、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、
Ｒ４は、水素結合供与体であり、
Ｒ５は、水素結合受容体であり、
本化合物は、グルコサミン−６−リン酸ではない。
一例において、Ｒ４は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ３＋、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨアルキル、＝ＮＨ、＝ＮＯＨ、＝ＮＳＨ、＝ＮＣＯ２Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ＝ＮＨ、ＣＨ＝ＮＯＨ、ＣＨ＝ＮＳＨ、ＣＨ＝ＮＣＯ２Ｈ、ＯＣＨ２ＯＨ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＰｈＯＨ、ＮＨアルキル、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨアルキル、ＮＨＣＯアルキル、ＮＨＣＯ２アルキル、ＮＨＣＯＮＨ２、ＮＨＳＯ２アルキルまたはＮＨＯアルキルである。
別の例において、Ｒ１がＨまたはＯＨであるときＲ４はＯＨではなく、そしてＲ２は、ＮＨ２またはＮＨＣＨ３である。
別の例において、Ｒ５は、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｓ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）ＯＨＳＨ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨであり得る。Ｒ５はまた、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨであり得る。Ｒ５は、負に帯電している可能性がある。Ｒ５は、＝Ｏ、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり得、Ｒ９は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である。
別の例において、Ｒ５はまた、＝Ｏ、ＯＨ、ＯＲ９、ＣＯＲ９、ＣＮ、ＮＯ２、テトラゾール、ＳＯＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり得、Ｒ９は、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である。
Ｒ４は、ＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムであり得る。
Ｒ４はまた、ＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムであり得る。
特定の部分または基が、本明細書中において水素結合供与体または水素結合受容体と呼ばれ得るが、この用語は、言及を簡単にするために様々な置換基を単に分類するために使用されることが理解されるべきである。そのような用語は、特定の部分が、リボスイッチまたはいくつかの他の化合物との水素結合に実際に関与することを意味すると解釈されるべきでない。例えば、水素結合受容体（または水素結合供与体）と本明細書中で呼ばれる部分は、単独でか、または追加で、リボスイッチまたは他の化合物との、疎水性、イオン性、ファンデルワールスまたは他のタイプの相互作用に関与し得ることができる。
本明細書中に開示されるある特定の基は、本明細書中において、水素結合受容体と水素結合供与体との両方と呼ばれ得ることも理解される。例えば、−ＯＨは、水素原子を供与することによって水素結合供与体であり得；−ＯＨは、酸素原子上の非結合電子対の１つ以上を介する水素結合受容体でもあり得る。従って、本明細書全体を通して、様々な部分が、水素結合供与体および水素結合受容体であり得、また、そのように呼ばれ得る。
上の定義の中のすべての化合物が、本明細書中に具体的に開示されると意図され、また、そのように考えられるべきである。さらに、上の定義内に特定され得るすべてのサブグループが、本明細書中に具体的に開示されると意図され、また、そのように考えられるべきである。結果として、任意の化合物または化合物のサブグループが、化合物の使用に具体的に含められ得るか、もしくは化合物の使用から除外され得るか、または化合物のリストに含められ得るか、もしくは化合物のリストから除外され得ることが具体的に企図される。例として、ある化合物の群は、各化合物が、上に定義されているとおりのものであり、ｇｌｍＳ応答性リボスイッチを活性化することができると企図される。
リボスイッチと相互作用する化合物に対して本明細書中に記載される特定の接触および相互作用（例えば、水素結合の供与または受容）が好ましいが、リボスイッチと化合物との相互作用に必須ではないことが理解されるべきである。例えば、化合物は、開示される接触および相互作用を有する化合物よりも低い親和性および／または特異性でリボスイッチと相互作用し得る。さらに、化合物における別の官能基またはさらなる官能基が、リボスイッチとの新しい接触、異なる接触および／または補完する接触をもたらし得る。例えば、ｇｌｍＳリボスイッチに対して、大きな官能基が使用され得る。そのような官能基は、リボスイッチの他の部分との接触および相互作用を有し得、また、有するように設計され得る。そのような接触および相互作用は、トリガー分子およびコア構造の接触および相互作用を補い得る。
Ｄ．構築物、ベクターおよび発現系
開示されるｇｌｍＳリボスイッチは、任意の適当な発現系とともに使用され得る。組換え発現は、プラスミドなどのベクターを用いて有効に達成される。そのベクターは、リボスイッチをコードする配列および発現されるべきＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードするＲＮＡ）に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。そのベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントも含み得る。本明細書中で使用されるとき、ベクターとは、外来性ＤＮＡを含んでいる任意の運搬体のことを指す。従って、ベクターは、外来性核酸を分解することなく細胞内に輸送する物質であり、それが送達される細胞においてその核酸の発現をもたらすプロモーターを含んでいる。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体が挙げられるがこれらに限定されない。リボスイッチによって調節される構築物の運搬に適した種々の原核生物および真核生物の発現ベクターが、作製され得る。そのような発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣおよび酵母ベクターが挙げられる。そのベクターは、例えば、種々のインビボおよびインビトロでの状況において使用され得る。
ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｒｏｐｈｉｃ）ウイルス、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶのバックボーンを有するこれらのウイルスを含む）が挙げられる。ベクターとして使用するのに適当であるようにするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーもまた有用である。Ｖｅｒｍａ（１９８５）において報告されたレトロウイルスベクターとしては、マウスモロニー白血病ウイルスＭＭＬＶ、およびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を示すレトロウイルスが挙げられる。ウイルスベクターは、代表的には、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な末端逆位配列、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を調節するプロモーターを含む。ウイルスがベクターとして操作されるとき、そのウイルスは、典型的には、除去される初期遺伝子の１つ以上を有し、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットは、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム内に挿入される。
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して相対的に固定された位置に存在するとき機能する配列またはＤＮＡの配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から一定でなく離れた箇所において機能し、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，１９８１）または３’（Ｌｕｓｋｙら、１９８３）に存在し得るＤＮＡの配列のことを指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在し得る（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３）し、コード配列自体の中にも存在し得る（Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９８４）。これらは、通常１０〜３００ｂｐ長であり、シスにおいて機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターから転写を増加させるように機能する。プロモーターと同様にエンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含むことが多い。エンハンサーは、しばしば発現の調節を決定する。
真核生物の宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞または有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化されたセグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位も含む。転写単位もまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写される単位がプロセシングされ、ｍＲＮＡのように輸送される可能性を高めることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。トランスジーン構築物において同種のポリアデニル化シグナルを使用することが、好ましい。
ベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が、細胞に送達されたか否か、および送達された場合発現されているか否かを判定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子および緑色蛍光タンパク質である。
いくつかの実施形態において、マーカーは、選択可能マーカーであり得る。そのような選択可能マーカーが宿主細胞内に首尾よく運搬されると、形質転換された宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生存することができる。広く使用されている２つの特徴的な選択型のカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充された培地とは無関係に成長することができない変異細胞株の使用に基づくものである。第２のカテゴリーは、任意の細胞型において使用される選択スキームのことを指し、変異細胞株の使用を必要としない、優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止する薬物を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、その選択に対して生き残る。そのような優性選択の例は、薬物のネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，１９８２）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，１９８０）またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５）を使用する。
遺伝子導入は、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体（これらに限定されない）における遺伝物質の直接的な運搬を使用してもたらされ得るか、または細胞もしくは運搬体（例えば、陽イオン性リポソーム）における遺伝物質の運搬を介してもたらされ得る。そのような方法は、当該分野で周知であり、本明細書中に記載される方法で使用するために容易に適用することができる。トランスファーベクターは、遺伝子を細胞内に送達するために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であり得るか、または遺伝子を送達する一般的なストラテジーの一部、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部としての任意のヌクレオチド構築物であり得る（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））。トランスフェクションのための適切な手段（ウイルスベクター、化学的なトランスフェクタントまたは物理的機械的方法（例えば、エレクトロポレーション）および直接的なＤＮＡの拡散を含む）は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。
１．ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶのバックボーンを有するこれらのウイルスを含む）である。ベクターとして使用するのに適当であるようにするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーもまた好ましい。好ましいレトロウイルスとしては、マウスモロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶおよびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を示すレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝的荷重量、すなわち、トランスジーンまたはマーカー遺伝子を保持することができ、この理由のために、レトロウイルスベクターは、通常使用されるベクターである。しかしながら、これらは、非増殖細胞において有用でない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、機能しやすく、高力価を有し、エアロゾル製剤で送達することができ、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、大型であり、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、熱安定性であり、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８または１０に対するコード領域を有する。
ウイルスベクターは、細胞内に遺伝子を導入するほとんどの化学的または物理的な方法よりも高い処理能力（遺伝子を導入する能力）を有する。ウイルスベクターは、典型的には、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な末端逆位配列、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ウイルスがベクターとして操作されるとき、そのウイルスは、典型的には、除去される初期遺伝子の１つ以上を有し、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットは、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム内に挿入される。このタイプの構築物は、最大約８ｋｂの外来遺伝物質を保持することできる。除去された初期遺伝子に必要とされる機能は、典型的には、トランスにおいて初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞株によって供給される。
ｉ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、任意のタイプ、サブファミリー、属または向性を含むＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ中のＶｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書中において参考として援用される）によって報告されている。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載されており；これらの教示は、本明細書中において参考として援用される。
レトロウイルスは、本質的に、その中に核酸カーゴをパッケージングしているパッケージである。その核酸カーゴは、複製された娘分子をパッケージコート内に効率的に確実にパッケージングするパッケージングシグナルをその中に有する。パッケージシグナルに加えて、シスにおいて複製に必要とされ、そして複製されたウイルスのパッケージングに必要とされる多くの分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの生成に関与するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。標的細胞に運搬されるのは、典型的には、外来ＤＮＡによって置換されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、逆転写に必要なエレメントであるｇａｇ転写単位の開始を示す配列である、パッケージコート内に組み込むためのパッケージングシグナルを含んでおり、そのエレメントとしては、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２鎖を合成するためのプライミング部位として働く３’ＬＴＲに対して５’のプリンリッチ配列およびＤＮＡ状態のレトロウイルスの挿入物を宿主ゲノム内に挿入することを可能にするＬＴＲの末端近くの特定の配列が挙げられる。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を除去することにより、ウイルスゲノム内に約８ｋｂの外来配列が挿入され、逆転写されるようになり、そして、複製時に新しいレトロウイルス粒子内にパッケージングされることが可能となる。この量の核酸は、各転写物のサイズにもよるが、一対多の遺伝子を送達するのに十分である。その挿入物の中に他の遺伝子とともに正または負の選択可能マーカーのいずれかを含めることが好ましい。
ほとんどのレトロウイルスベクターにおける複製の機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）、それらのベクターは、典型的には、パッケージング細胞株内に置かれることによって生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージングの機構を含むが任意のパッケージングシグナルを欠くレトロウイルスでトランスフェクトされたかまたは形質転換された細胞株である。目的のＤＮＡを有するベクターが、これらの細胞株にトランスフェクトされるとき、目的の遺伝子を含んでいるベクターは、複製され、ヘルパー細胞によってシスにおいて提供される機構によって新しいレトロウイルス粒子内にパッケージングされる。その機構のためのゲノムは、必要なシグナルを欠いているので、パッケージングされない。
ｉｉ．アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は、すでに報告されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用する利点は、これらのウイルスは、最初に感染した細胞内で複製することができるが、新しい感染性のウイルス粒子を形成することができないので、それらは、他の細胞型に広がり得る程度を制限するという点である。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質および他の多くの組織部位に直接インビボ送達された後、高効率な遺伝子導入を達成すると示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じ様式でレセプター媒介性のエンドサイトーシスによって内部移行された後、特定の細胞表面レセプターに結合することによって遺伝子形質導入を達成する（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９（１９９３））。
好ましいウイルスベクターは、除去されるＥ１遺伝子を有していたアデノウイルスに基づくものであり、これらのビリオンは、ヒト２９３細胞株などの細胞株において産生される。別の好ましい実施形態において、Ｅ１遺伝子とＥ３遺伝子の両方が、アデノウイルスゲノムから除去される。
別のタイプのウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくものである。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染することができ、ヒトに対して非病原性であるので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、１９番染色体に安定的に挿入されることが知られている。この部位特異的な組み込み特性を含むベクターが好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって製造されているＰ４．１Ｃベクターであり、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、すなわちＨＳＶ−ｔｋおよび／またはマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、すなわちＧＦＰをコードする遺伝子）を含み得る。
ウイルスおよびレトロウイルス内に挿入される遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に対して相対的に固定された位置に存在するとき機能する配列またはＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物の宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な起源、例えば、ウイルス（例えば：ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルス）のゲノムまたは異種性哺乳動物プロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含んでいるＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして便利に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０（１９８２））。当然のことながら、宿主細胞または関連する種由来のプロモーターもまた、本明細書中において有用である。
エンハンサーとは、一般に、転写開始部位から一定でなく離れた箇所において機能し、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））であり得るＤＮＡの配列のことを指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在し得（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、コード配列自体の中にも存在し得る（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））。これらは、通常１０〜３００ｂｐ長であり、シスにおいて機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターから転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答エレメントも含むことが多い。プロモーターはまた、転写の調節を媒介する応答エレメントも含むことが多い。エンハンサーは、しばしば遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）由来で知られているが、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。好ましい例は、複製起点の後ろ側（ｂｐ１００−２７０）に存在するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側に存在するポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を引き起こす、小さいかまたは特異的な化学的事象によって特異的に活性化され得る。テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって系が調節され得る。ガンマ線照射などの照射またはアルキル化化学療法薬物に曝露することによって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法も存在する。
プロモーター領域および／またはエンハンサー領域がすべての真核細胞型において活性であることが好ましい。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
すべての特定の調節エレメントが、クローニングされており、メラノーマ細胞などの特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用することができることが示されている。グリア起源の細胞において遺伝子を選択的に発現させるために、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが使用される。
真核生物の宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞または有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る、転写の終結に必要な配列も含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化されたセグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写単位もまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写される単位が、ｍＲＮＡのようにプロセシングされて運搬される可能性を高めるという点である。発現構築物内のポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。トランスジーン構築物において同種のポリアデニル化シグナルを使用することが、好ましい。転写単位の好ましい実施形態において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来するものであり、約４００塩基からなる。転写される単位が、他の標準的な配列を単独で含むか、またはその構築物からの発現またはその構築物の安定性を改善する上記配列と組み合わせて含むこともまた、好ましい。
３．マーカー
ベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が、細胞に送達されたか否か、および送達された場合発現されているか否かを判定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子および緑色蛍光タンパク質である。
いくつかの実施形態において、マーカーは、選択可能マーカーであり得る。哺乳動物の細胞に適した選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシンおよびピューロマイシンである。そのような選択可能マーカーが哺乳動物の宿主細胞内に首尾よく運搬されると、形質転換された哺乳動物の宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生存することができる。広く使用されている２つの特徴的な選択型のカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充された培地とは無関係に成長する能力を欠いている変異細胞株の使用に基づくものである。２つの例は：ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養分を加えずに成長する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要なある特定の遺伝子を欠いているので、それらは、喪失しているヌクレオチドを補充された培地中に供されない限り、生存することができない。培地を補充することの代替法は、完全なＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を、各々の遺伝子を欠いている細胞内に導入することによって、それらの成長の必要条件を変更することである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換されていない個別の細胞は、補充されていない培地中で生存することはできない。
第２のカテゴリーは、任意の細胞型において使用される選択スキームのことを指し、変異細胞株の使用を必要としない、優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止する薬物を使用する。それらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、その選択に対して生き残る。そのような優性選択の例は、薬物のネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。この３つの例は、適切な薬物であるＧ４１８またはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するそれぞれの細菌の遺伝子を真核生物の支配下において使用する。他のものとしては、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンが挙げられる。
Ｅ．バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチもまた開示される。バイオセンサーリボスイッチは、その同族トリガー分子の存在下において検出可能なシグナルを生成する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベル以上において引き起こされ得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボまたはインビトロにおける用途のために設計され得る。例えば、シグナルとして機能するタンパク質またはシグナルを生成する際に関連するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたｇｌｍＳバイオセンサーリボスイッチは、ｇｌｍＳリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を有する細胞または生物を操作することによってインビボにおいて使用され得る。インビトロにおいて使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、立体配座依存性標識を含み、その標識からのシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化するリボスイッチである。そのようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチ（例えば、ｇｌｍＳ）からのアプタマードメインまたはそのリボスイッチに由来するアプタマードメインを使用する。
Ｆ．レポータータンパク質およびペプチド
リボスイッチまたはバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価するために、レポータータンパク質またはレポーターペプチドを使用することができる。レポータータンパク質またはレポーターペプチドは、ＲＮＡによってコードされ得、そのＲＮＡの発現は、リボスイッチによって制御される。その例は、いくつかの特定のレポータータンパク質の使用を説明している。レポータータンパク質およびレポーターペプチドの使用は、周知であり、リボスイッチとともに使用するために容易に適合され得る。このレポータータンパク質は、検出可能であり得るか、または検出可能なシグナルを生成し得る任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくは、そのタンパク質またはペプチドの存在は、標準的な手法（例えば、ラジオイムノアッセイ、放射標識、イムノアッセイ、酵素活性に対するアッセイ、吸光度、蛍光、ルミネセンスおよびウエスタンブロット）を使用して検出され得る。より好ましくは、レポータータンパク質のレベルは、低レベルであったとしても標準的な手法を使用して容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質およびそれらの誘導体（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）およびＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬ））が挙げられる。
Ｇ．立体配座依存性標識
立体配座依存性標識とは、その標識と会合する分子または化合物（例えば、リボスイッチ）の形態または立体配座の変化に基づいて蛍光強度または波長の変化をもたらすすべての標識のことを指す。プローブおよびプライマーの状況において使用される立体配座依存性標識の例としては、分子ビーコン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ、ＦＲＥＴプローブ、切断可能なＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマー、蛍光性三重鎖オリゴ（例えば、三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖ＦＲＥＴプローブが挙げられるがこれらに限定されない）、蛍光性水溶性結合体化ポリマー、ＰＮＡプローブおよびＱＰＮＡプローブが挙げられる。そのような標識、および特にそれらの機能の原理は、リボスイッチとともに使用するために適合され得る。いくつかのタイプの立体配座依存性標識は、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）において概説されている。
立体配座依存性標識の形状である、ステム型でクエンチされる標識は、ステム構造が形成されると、クエンチング部分が近接するようになって、標識からの蛍光をクエンチするように核酸上に位置している蛍光標識である。ステムが破壊されるとき（例えば、標識を含んでいるリボスイッチが活性化されるとき）、そのクエンチング部分は、蛍光標識と近接しなくなり、蛍光が増大する。この作用の例は、分子ビーコン、蛍光性三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブおよびＱＰＮＡプローブにおいて見られ、その作動原理は、リボスイッチとともに使用するために適合され得る。
立体配座依存性標識の形状であるステム型の活性化された標識は、ステム構造の形成によって蛍光が増大されるか、もしくは変更される標識または標識の対である。ステム型の活性化された標識は、受容体蛍光標識および供与部分を含み得、受容体と供与体とが近接しているとき（標識を含んでいる核酸鎖がステム構造を形成しているとき）、供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移によって、受容体が蛍光を発するようになる。ステム型の活性化された標識は、典型的には、核酸分子においてステム構造が形成されるときに、受容体と供与体とが近接するように、核酸分子（例えば、リボスイッチ）上に位置する標識の対である。ステム型の活性化された標識の供与体部分が、それ自体で蛍光標識である場合、その供与体部分は、受容体に近接していないときに（すなわち、ステム構造が形成されていないときに）、蛍光としてエネルギーを放出し得る（典型的には、受容体の蛍光とは異なる波長において）。ステム構造が形成されるときの、全体の作用は、供与体の蛍光の減少および受容体の蛍光の増加である。ＦＲＥＴプローブは、ステム型の活性化された標識の用途の例であり、その作動原理は、リボスイッチとともに使用するために適合され得る。
Ｈ．検出標識
リボスイッチの活性化、不活性化もしくは遮断の検出および定量化、またはリボスイッチが活性化、不活性化もしくは遮断されるときにもたらされる核酸もしくはタンパク質の発現の検出および定量化を助けるために、検出標識は、検出プローブもしくは検出分子内に組み込まれ得るか、または発現される核酸もしくはタンパク質内に直接組み込まれ得る。本明細書中で使用されるとき、検出標識は、核酸またはタンパク質と直接または間接的に会合され得、その結果、測定可能で検出可能なシグナルが直接または間接的にもたらされる任意の分子である。多くのそのような標識は、当業者に公知である。開示される方法における使用に適した検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光性分子、酵素、抗体およびリガンドである。
適当な蛍光標識の例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ランタニドイオンの大環状キレート（例えば、ｑｕａｎｔｕｍ ｄｙｅＴＭ）、蛍光エネルギー移動色素（例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体）ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。他の特定の蛍光標識の例としては、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸フクシン、アリザリンコンプレクソン（Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎ）、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ（Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ）、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコフォア（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ）ＦＦＧ溶液、ブランコフォアＳＶ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆ１、ブリリアントスルフォフラビン（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎ）ＦＦ、カルセインブルー、カルシウムグリーン、カルコフロール（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ）ＲＷ溶液、カルコフロールホワイト（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ）、カルコフォアホワイト（Ｃａｌｃｏｐｈｏｒ Ｗｈｉｔｅ）ＡＢＴ溶液、カルコフォアホワイト標準液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、チナクリン（Ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ）、コリホスフィン（Ｃｏｒｉｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）Ｏ、クマリン−ファロイジン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン（Ｄｉｐｈｅｎｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎｅ）７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン（Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ）、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ（Ｆｌａｚｏ Ｏｒａｎｇｅ）、フルオ（Ｆｌｕｏ）３、フルオレサミン、フラ−２（Ｆｕｒａ−２）、ゲナクリルブリリアントレッドＢ（Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ）、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、グロキサン酸（Ｇｌｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ）、グラニュラーブルー（Ｇｒａｎｕｌａｒ Ｂｌｕｅ）、ヘマトポルフィリン（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、Ｉｎｄｏ−１、イントラホワイト（Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ）Ｃｆ液、ロイコフォア（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ）ＰＡＦ、ロイコフォアＳＦ、ロイコフォアＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド（Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ）、マリナブルー（Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ）、マキシロンブリリアントフラビン（Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ）１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾオキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファーストレッド（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ）、ヌクレアーイエロー（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、ナイロサンブリリアントフラビン（Ｎｙｌｏｓａｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ）Ｅ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、パラロザニリン（フォイルゲン）、ホルワイト（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ）ＡＲ溶液、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトＲｅｖ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック（Ｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂｌｕｅ Ｂｌａｃｋ）、ポルフィリン（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、プリムリン（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）、プロシオンイエロー（Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ）、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン（Ｐｙｒｏｚａｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ）７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド（Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ）２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ））、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、Ｓｎａｒｆ１、スルホローダミンＢ Ｃａｎ Ｃ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッド（Ｔｈｉａｚｉｎｅ Ｒｅｄ）Ｒ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ）、チオゾールオレンジ（Ｔｈｉｏｚｏｌ Ｏｒａｎｇｅ）、チノポール（Ｔｉｎｏｐｏｌ）ＣＢＳ、トゥルーブルー（Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ）、ウルトラライト（Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ）、ウラニン（Ｕｒａｎｉｎｅ）Ｂ、ユビテックス（Ｕｖｉｔｅｘ）ＳＦＣ、キシレンオレンジおよびＸＲＩＴＣが挙げられる。
有用な蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光に対する最大吸収および最大発光は、それぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であるので、これらを同時に検出することができる。フルオレセイン色素の他の例としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が挙げられる。蛍光標識は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏをはじめとした種々の商業的供給源から入手することができる。
さらなる目的の標識としては、それらが会合するプローブが標的分子に特異的に結合しているときにだけシグナルを提供するものが挙げられ、ここで、そのような標識としては：Ｔｙａｇｉ ＆ Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３およびＥＰ００７０６８５Ｂ１に記載されているような「分子ビーコン」が挙げられる。他の目的の標識としては、米国特許第５，５６３，０３７号；ＷＯ９７／１７４７１およびＷＯ９７／１７０７６に記載されているものが挙げられる。
標識されたヌクレオチドは、発現される核酸内に合成中に直接組み込むための検出標識の有用な型である。核酸内に組み込まれ得る検出標識の例としては、ヌクレオチドアナログ（例えば、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン，Ｈｏｙ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９０：２１７−２３０（１９９３））、アミノアリルデオキシウリジン（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３４５−３４８（２０００））、５−メチルシトシン（Ｓａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５１：１５７−１６５（１９８８））、ブロモウリジン（Ｗａｎｓｉｃｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２２：２８３−２９３（１９９３））およびビオチン（Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６６３３（１９８１））または適当なハプテン（例えば、ジゴキシゲニン）（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））を用いて改変されたヌクレオチド）が挙げられる。適当な蛍光標識されたヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））である。ＤＮＡに対する好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ）である。ＤＮＡ内に検出標識を組み込むための他の有用なヌクレオチドアナログは、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジン三リン酸，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）および５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。ＲＮＡ内に検出標識を組み込むための有用なヌクレオチドアナログは、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識するためにｄＵＴＰに連結され得る。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識されたプローブの二次検出のためにアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として利用可能である。
核酸内に組み込まれる検出標識（例えば、ビオチン）は、その後、当該分野で周知の感度の高い方法を使用して検出され得る。例えば、ビオチンは、ビオチンに結合し、続いて、適当な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光によって検出されるストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して検出され得る。例えば、化学シグナル増幅を用いてか、または光を生成する酵素に対する基質（例えば、化学発光の１，２−ジオキセタン基質）もしくは蛍光シグナルを使用することによって検出され得る標識はまた、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびポリメラーゼ）であり得る。
これらの検出標識の２つ以上を組み合わせた分子もまた、検出標識と考えられる。公知の検出標識のいずれかを、開示されるプローブ、タグ、分子および方法とともに使用することによって、開示される方法においてもたらされる活性化もしくは不活性化された、リボスイッチまたは核酸またはタンパク質を標識および検出することができる。検出標識によって生成されるシグナルを検出し、測定するための方法もまた、当業者に公知である。例えば、放射性同位体は、シンチレーション測定法または直接的な可視化によって検出され得；蛍光分子は、蛍光分光光度計を用いて検出され得；リン光性分子は、分光光度計を用いて検出され得るか、またはカメラを用いて直接可視化され得；酵素は、その酵素によって触媒される反応の生成物を検出または可視化することによって検出され得；抗体は、その抗体に結合された２次検出標識を検出することによって検出され得る。本明細書中で使用されるとき、検出分子は、検出されるべき化合物または組成物と相互作用する分子であり、１つ以上の検出標識がその検出分子に結合されている。
Ｉ．配列類似性
本明細書中において記述されるように、相同性および同一性という用語の使用が、類似性と同じものを意味すると理解される。従って、例えば、相同性という単語が、２つの配列間（例えば、天然でない配列）において使用される場合、必ずしもこれらの２つの配列間の進化的関係を示すわけではないが、それらの核酸配列間に類似性または関連性が考察されると理解される。２つの進化的に関連する分子間の相同性を判定するための方法の多くは、それらが進化的に関連するか否かに関係なく、配列類似性を測定する目的で、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に対して慣例的に適合される。
一般に、本明細書中に開示されるリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子およびタンパク質の任意の公知のバリアントおよび誘導体またはそれらから生じ得るものを定義するための１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性に関してそれらのバリアントおよび誘導体を定義することを介するものであると理解される。本明細書中に開示される特定の配列の同一性は、本明細書中の他の箇所にも記述される。通常、本明細書中に開示されるリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子およびタンパク質のバリアントは、代表的には、決められた配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの相同性を有する。２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を判定する方法を当業者は容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配列をアラインメントした後に計算され得る。
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって行われ得る。比較するための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視によって、行われ得る。
同じタイプの相同性を、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（少なくとも核酸アラインメントに関する材料に対して本明細書中で参考として援用される）に開示されているアルゴリズムによって、核酸に対して得ることができる。上記方法のいずれかが、典型的に使用され得、ある特定の場合においてこれらの様々な方法の結果は異なり得ることが理解されるが、当業者は、同一性がこれらの方法のうちの少なくとも１つを用いて見出される場合に、それらの配列は、定められた同一性を有すると言われ得ると理解する。
例えば、本明細書中で使用されるとき、別の配列に対して特定の相同性パーセントを有するといわれる配列とは、上に記載された計算方法の任意の１つ以上によって計算されるときにそのいわれた相同性を有する配列のことを指す。例えば、第１配列が、Ｚｕｋｅｒ計算法を使用して第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合に、第１配列が他の計算方法のいずれかによって計算されるときに第２配列に対して８０パーセントの相同性を有しない場合でさえも、その第１配列は、第２配列に対して、本明細書中に定義されるような８０パーセントの相同性を有する。別の例として、第１配列が、Ｚｕｋｅｒ計算法とＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算法との両方を使用して、第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合に、第１配列がＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ計算法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法または他の計算方法のいずれかによって計算されるときに第２配列に対して８０パーセントの相同性を有しない場合でさえも、その第１配列は、第２配列に対して、本明細書中に定義されるような８０パーセントの相同性を有する。なおも別の例として、上記計算方法の各々を使用して、第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合に、その第１配列は、第２配列に対して、本明細書中に定義されるような８０パーセントの相同性を有する（実際のところ、様々な計算方法では、様々な相同性パーセンテージが算出されることが多い）。
Ｊ．ハイブリダイゼーションおよび選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、少なくとも２つの核酸分子間（例えば、プライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子との間）における、配列によって動かされる相互作用を意味する。配列によって動かされる相互作用とは、ヌクレオチド特異的様式で２つのヌクレオチド間またはヌクレオチドアナログ間またはヌクレオチド誘導体間に生じる相互作用のことを意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは、配列によって動かされる相互作用である。典型的には、配列によって動かされる相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面において生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多くの条件およびパラメータによって影響される。例えば、反応物の塩濃度、ｐＨおよび温度のすべてが、２つの核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響する。
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションに対するパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件と定義され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程のいずれかまたはその両方の温度と塩濃度との両方によって支配される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（半数の分子がそのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度における高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーション、その後の、洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択された温度と塩濃度との組み合わせにおける洗浄を含み得る。その温度および塩の条件は、フィルター上に固定化された参照ＤＮＡのサンプルを目的の標識核酸にハイブリダイズさせ、次いで、様々なストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備試験において経験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションよりも高い。その条件は、ストリンジェンシーを達成するために上に記載されたようにか、または当該分野で公知のとおりに（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７（核酸のハイブリダイゼーションに少なくとも関連する材料に対して本明細書中で参考として援用される）使用され得る。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに対する好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥにおける約６８℃（水溶液中）に続く６８℃での洗浄であり得る。所望であれば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が下げられるのに従って、さらには、可変性が探索される任意の領域のＧ−ＣリッチまたはＡ−Ｔリッチに応じて、低下され得る。同様に、所望であれば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相同性が上げられるのに従って、さらには、高い相同性が望まれる任意の領域のＧ−ＣリッチまたはＡ−Ｔリッチに応じて、上昇され得、これらすべては当該分野で公知のとおりである。
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、他の核酸に結合される核酸のうちの１つの量（パーセンテージ）を検討することによる方法である。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、限定的な核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、非限定的な核酸に結合するときのものであり得る。典型的には、その非限定的な核酸は、例えば、１０倍または１００倍または１０００倍過剰である。このタイプのアッセイは、限定的な核酸と非限定的な核酸との両方が、例えば、それらのｋｄよりも１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍低いか、または核酸分子のうちのただ１つが、１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍であるか、または一方もしくは両方の核酸分子がそれらのｋｄよりも高い、条件下で行われ得る。
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素的操作を促進するために必要とされる条件下で、酵素的に操作される核酸のパーセンテージを検討することによる方法である。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、酵素的操作を促進する条件下において酵素的に操作されるときのものであり得、例えば、その酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、核酸分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長されるときのものであり得る。好ましい条件としてはまた、製造者によって提案される条件または操作を行う酵素に対して適切であると当該分野において示されている条件が挙げられる。
相同性と全く同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを判定するために本明細書中に開示される種々の方法が存在すると理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間の様々なパーセンテージのハイブリダイゼーションを提供し得るが、別段示されない限り、それらの方法のいずれかのパラメータを満たすことで十分であり得ることが理解される。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが求められる場合、そしてこれらの方法のうちのいずれか１つにおいて求められるパラメータ内でハイブリダイゼーションが生じる限り、それは、本明細書中に開示されると考えられる。
組成物または方法が、集合的に、または単独で、ハイブリダイゼーションを判定するためのこれらの基準のうちのいずれか１つを満たす場合に、その組成物または方法は、本明細書中に開示される組成物または方法であると当業者は理解すると理解される。
Ｋ．核酸
例えば、リボスイッチ、アプタマーならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸をはじめとした核酸ベースの種々の分子が、本明細書中に開示される。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物で構成され得る。これらの分子および他の分子の非限定的な例は、本明細書中に記述されている。例えば、ベクターが細胞において発現されるとき、発現されるｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵで構成されると理解される。同様に、核酸分子が、例えば外来性送達を介して細胞内または細胞環境内に導入される場合、その核酸分子が、細胞環境においてその核酸分子の分解を低下させるヌクレオチドアナログで構成されていることが有益であると理解される。
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォームならびに他の任意のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、改変ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）で構成され得るか、または改変ヌクレオチドを含み得る。多くの改変ヌクレオチドが公知であり、オリゴヌクレオチドおよび核酸において使用され得る。ヌクレオチドアナログは、塩基、糖またはリン酸部分のいずれかにいくつかのタイプの改変を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕならびに様々なプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イル）の天然および合成の改変を含み得る。改変塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体ならびに他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体ならびに他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニンおよび８−ハログアニン、８−アミノアデニンおよび８−アミノグアニン、８−チオールアデニンおよび８−チオールグアニン、８−チオアルキルアデニンおよび８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび８−ヒドロキシルグアニンならびに他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、特に５−ブロモウラシルおよび５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロメチルシトシンならびに他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる塩基の改変は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号，Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に見られる。ある特定のヌクレオチドアナログ（例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む））。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増大し得る。他の改変塩基は、ユニバーサル塩基として機能するものである。ユニバーサル塩基としては、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。ユニバーサル塩基は、通常の塩基の代わりとなるが、塩基対形成の際に偏りを有しない。すなわち、ユニバーサル塩基は、他の任意の塩基と塩基対形成することができる。塩基の改変は、例えば、固有の特性（例えば、二重鎖安定性の増大）を達成するために糖の改変（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル）と組み合わされ得ることが多い。一連の塩基の改変を詳述し、記載している米国特許が数多く存在する（例えば、米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号）。これらの特許の各々は、本明細書中においてそれらの全体が参照により援用され、具体的には、塩基の改変、その合成、使用ならびにオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みの説明のために参考として援用される。
ヌクレオチドアナログはまた、糖部分の改変を含み得る。糖部分に対する改変としては、リボースおよびデオキシリボースの天然の改変ならびに合成の改変が挙げられ得る。糖の改変としては、２’位における以下の改変：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルもしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニルもしくはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルもしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルが挙げられるがこれらに限定されず、ここで、そのアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されていても、または置換されていないＣ１〜Ｃ１０のアルキルまたはＣ２〜Ｃ１０のアルケニルおよびアルキニルであってもよい。２’糖改変としては、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２も挙げられるがこれらに限定されず、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である。
２’位における他の改変としては：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的な特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学的な特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基が挙げられるがこれらに限定されない。糖の他の位置、特に、３’末端のヌクレオチド上または２’−５’結合したオリゴヌクレオチド内の糖の３’位および５’末端のヌクレオチドの５’位においても同様の改変がなされ得る。改変された糖はまた、架橋環酸素における改変（例えば、ＣＨ２およびＳ）を含む糖を含み得る。ヌクレオチド糖アナログはまた、糖模倣物（例えば、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分）を有し得る。そのような改変された糖構造の調製を教示している数多くの米国特許（例えば、４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；および５，７００，９２０（これらの各々は本明細書中でその全体が参照により援用され、そして具体的には改変された糖構造、その合成、使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みに関する説明のために援用される））が存在する。
ヌクレオチドアナログはまた、リン酸部分において改変され得る。改変されたリン酸部分としては、２つのヌクレオチド間の結合が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルならびにボラノホスフェートを含むように改変され得るものが挙げられるがこれらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸エステル結合または改変リン酸エステル結合は、３’−５’結合または２’−５’結合を介するものであり得、その結合は、逆転した極性（例えば、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’）を含み得ると理解される。様々な塩、混合された塩および遊離酸の形態もまた含まれる。多くの米国特許は、改変リン酸を含んでいるヌクレオチドの作製方法および使用方法を教示しており、そのような米国特許としては、３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；および５，６２５，０５０号（これらの各々は本明細書中でその全体が参照により援用され、そして具体的には改変されたリン酸、その合成、使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みに関する説明のために援用される））が挙げられるがこれらに限定されない。
ヌクレオチドアナログが、単一の改変を含む必要があるだけでなく、その部分の１つの中または様々な部分の間において多数の改変も含み得ることが理解される。
ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドと類似の機能的特性を有する分子であるが、それらは、リン酸部分を含まない（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））。ヌクレオチド代替物は、ワトソン−クリック様式またはフーグスティーン様式で相補的な核酸を認識し、それにハイブリダイズ（塩基対形成）する分子であるが、リン酸部分以外の部分を介してともに連結される。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用するとき、二重らせん型の構造と一致し得る。
ヌクレオチド代替物は、リン酸部分および／または糖部分が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド代替物は、標準的なリン原子を含まない。そのリン酸に対する代替物は、例えば、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合または１つ以上の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合であり得る。これらとしては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分が混合した部分を有するその他のものを有するものが挙げられる。多くの米国特許は、これらのタイプのリン酸代替物の作製方法および使用方法を開示しており、そのような米国特許としては、５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；および５，６７７，４３９号（これらの各々は本明細書中でその全体が参照により援用され、そして具体的にはリン酸代替物、その合成、使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みに関する説明のために援用される））が挙げられるがこれらに限定されない。
ヌクレオチド代替物において、そのヌクレオチドの糖部分とリン酸部分との両方が、例えば、アミド型の結合（アミノエチルグリシン）で置換され得る（ＰＮＡ）ことも理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子の作製方法および使用方法を教示しており、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）もまた参照のこと）。
オリゴヌクレオチドおよび核酸は、ヌクレオチドから構成され得、異なるタイプのヌクレオチドまたは同じタイプのヌクレオチドから構成され得る。例えば、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドのうちの１つ以上は、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物であり得るか；そのヌクレオチドの約１０％〜約５０％は、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物であり得るか；そのヌクレオチドの約５０％以上は、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物であり得るか；またはそのヌクレオチドのすべてが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物である。そのようなオリゴヌクレオチドおよび核酸は、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と呼ばれ得る。
Ｌ．固体支持体
固体支持体は、分子（例えば、トリガー分子）およびリボスイッチ（または開示される方法において使用されるか、もしくは開示される方法によって生成される他の成分）と会合し得る固体状態の基材または支持体である。リボスイッチおよび他の分子は、固体支持体と直接または間接的に会合され得る。例えば、被検体（例えば、トリガー分子、試験化合物）は、固体支持体の表面に結合され得るか、または固体支持体上に固定化された捕捉物質（例えば、被検体に結合する化合物または分子）と会合され得る。別の例として、リボスイッチは、固体支持体の表面に結合され得るか、または固体支持体上に固定化されたプローブと会合され得る。アレイは、多数のリボスイッチ、プローブまたは他の分子が整列パターン、格子パターンまたは他の組織化パターンで会合されている固体支持体である。
固体支持体において使用するための固体状態の基材としては、成分が直接または間接的に会合され得る任意の固体材料が挙げられ得る。これとしては、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸などの材料が挙げられる。固体状態の基材は、薄膜、膜、瓶、ディッシュ、繊維、織り繊維（ｗｏｖｅｎ ｆｉｂｅｒ）、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微小粒子または組み合わせをはじめとした任意の有用な形態を有し得る。固体状態の基材および固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得る。チップは、長方形または正方形の小片の材料である。固体状態の基材に対して好ましい形態は、薄膜、ビーズまたはチップである。固体状態の基材に対して有用な形態は、マイクロタイターディッシュである。いくつかの実施形態において、マルチウェルガラススライドが使用され得る。
アレイは、その固体支持体上の同定された位置または予め規定された位置に固定化された、複数のリボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物またはプローブを含み得る。固体支持体上の予め規定された各位置は、通常、１種類の成分を有する（すなわち、その位置における成分のすべてが同一である）。あるいは、多数の種類の成分が、固体支持体上の予め規定された同じ位置に固定化され得る。各位置は、多コピーの所与の成分を有することになる。固体支持体上の様々な成分の空間的隔離によって、別個の検出および同定が可能になる。
固体支持体が単一のユニットまたは構造であることは、有用であるが、必要ではない。
１組のリボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物および／またはプローブは、任意の数の固体支持体にわたって分配され得る。例えば、１つの極端な場合において、各成分は、別個の反応チューブもしくは反応容器内に固定化され得るか、または別個のビーズもしくは微小粒子上に固定化され得る。
オリゴヌクレオチドを固体状態の基材に固定化するための方法は、十分に確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立された結合方法を使用して基材に結合され得る。例えば、適当な接着方法は、Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）およびＫｈｒａｐｋｏら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）によって報告されている。３’−アミンオリゴヌクレオチドをカゼインコーティングされたスライド上に固定化するための方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６３７９−６３８３（１９９５）によって報告されている。オリゴヌクレオチドを固体状態の基材に接着する有用な方法は、Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）によって報告されている。
固体支持体上に固定化された成分（例えば、リボスイッチ、トリガー分子または他の分子）の各々は、その固体支持体の予め規定された異なる領域に配置され得る。その異なる位置は、様々な反応チャンバーであり得る。予め規定された異なる領域の各々は、その異なる領域の互いと物理的に隔離され得る。固体支持体の予め規定された異なる領域間の距離は、固定され得るか、または変化し得る。例えば、アレイにおいて、成分の各々は、互いに固定された距離で配置され得るが、ビーズと会合された成分は、固定された空間的関係にない。特に、多数の固体支持体ユニット（例えば、多数のビーズ）を使用することにより、様々な距離がもたらされる。
成分は、任意の密度で固体支持体上に会合され得るか、または固定化され得る。成分は、１立方センチメートルあたり４００個を超える異なる成分の密度で固体支持体に固定化され得る。成分のアレイは、任意の数の成分を有し得る。例えば、アレイは、固体支持体上に固定化された少なくとも１，０００個の異なる成分、固体支持体上に固定化された少なくとも少なくとも１０，０００個の異なる成分、固体支持体上に固定化された少なくとも少なくとも１００，０００個の異なる成分または固体支持体上に固定化された少なくとも１，０００，０００個の異なる成分を有し得る。
Ｍ．キット
上に記載された材料ならびに他の材料は、開示される方法を実施するためか、またはその実施を補助するために有用なキットとして任意の適当な組み合わせで共にパッケージされ得る。所与のキット内のキット構成要素が、開示される方法においてともに使用するために設計され、適合されている場合に、キットは有用である。例えば、化合物を検出するためのキットが開示され、そのキットは、１つ以上のバイオセンサーリボスイッチを備えている。そのキットは、リボスイッチの活性化を検出するための試薬および標識も含み得る。
Ｎ．混合物
開示される方法を実施することによって形成されるか、またはその実施のために調製することによって形成される混合物が開示される。例えば、リボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物が開示される。
本方法が、組成物または成分または試薬を混合する工程またはそれらを接触させる工程を含むときはいつでも、その方法の実施によって多くの異なる混合物が生成される。例えば、本方法が、３つの混合工程を含む場合、これらの工程の各々１つの後に（その工程が別個に行われる場合）、特有の混合物が形成される。さらに、どのように工程が実施されたかに関係なく、それらの工程のすべてが完了したときに、混合物が形成される。本開示は、開示される方法の実施によって得られるこれらの混合物ならびに開示される任意の試薬、組成物または成分を含む混合物、例えば、本明細書中に開示されたものを企図する。
Ｏ．システム
開示される方法を実施するためか、またはその実施を補助するために有用なシステムが、開示される。システムは、一般に、製品（例えば、構造、装置、デバイスなど）と組成物、化合物、材料などとの組み合わせを含む。開示されるか、または本開示から明らかであるそのような組み合わせが企図される。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体およびシグナル読取デバイスを含むシステムが開示され、企図される。
Ｐ．データ構造およびコンピュータ制御
開示される方法において使用されるか、開示される方法によって生成されるか、または開示される方法から生成される、データ構造が開示される。データ構造は、一般に、構成物または媒体中に回収、編成、保存および／または具体化された、任意の形態のデータ、情報および／またはオブジェクトである。電子的形態（例えば、ＲＡＭ）に保存されたか、またはストレージディスク上に保存されたリボスイッチ構造および活性化の測定値は、一種のデータ構造である。
開示される方法またはその任意の一部またはそのための準備は、コンピュータ制御によって制御され得るか、管理され得るか、あるいは支援され得る。そのようなコンピュータ制御は、コンピュータに制御されたプロセスまたは方法によって達成され得、データ構造を使用および／または生成し得、そしてコンピュータプログラムを使用し得る。そのようなコンピュータ制御、コンピュータに制御されたプロセス、データ構造およびコンピュータプログラムが企図され、本明細書中において開示されると理解されるべきである。
方法
リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断するための方法が開示される。そのような方法は、例えば、リボスイッチと、そのリボスイッチを活性化し得るか、不活性化し得るか、もしくは遮断し得る化合物またはトリガー分子とを接触させる工程を包含し得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去を介して遺伝子発現を制御するように機能する。化合物は、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断するために使用され得る。リボスイッチに対するトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために使用され得る。トリガー分子以外の化合物は、一般に、リボスイッチを不活性化するか、または遮断するために使用され得る。リボスイッチはまた、例えば、リボスイッチが存在するところからトリガー分子を除去することによって不活性化され得る。従って、リボスイッチを不活性化する、開示される方法は、例えば、そのリボスイッチが存在するところからか、またはそのリボスイッチと接触しているところから、トリガー分子（または他の活性化化合物）を除去する工程を包含し得る。リボスイッチは、例えば、そのリボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断され得る。
化合物とそのＲＮＡ分子とを接触させることによって、ＲＮＡ分子の発現またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための方法もまた開示され、ここで、そのＲＮＡ分子は、リボスイッチを含む。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去を介して遺伝子発現を調節するように機能する。従って、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する条件にリボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を供することを用いて、そのＲＮＡの発現を変化させることができる。発現は、例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボソーム結合の遮断の結果として、変化し得る。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を低下させ得るか、もしくは妨害し得るか、またはそのＲＮＡ分子の発現を促進し得るか、もしくは増加させ得る。
リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断することによって、リボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を制御するための方法もまた開示される。その遺伝子が、それを含んでいる細胞または生物の生存に不可欠である場合、そのリボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、その細胞または生物の死、停止または衰弱をもたらし得る。例えば、微生物の生存に不可欠な天然に存在する遺伝子における天然に存在するリボスイッチを活性化することによって、微生物の死がもたらされ得る（そのリボスイッチの活性化が発現を停止させるかまたは抑制する場合）。これは、抗菌作用および抗生作用のための、開示される化合物および方法の使用に対する１つの根拠である。これらの抗菌性の作用を有する化合物は、静菌性または殺菌性であると考えられる。
リボスイッチを活性化し得るか、不活性化し得るか、または遮断し得る化合物を選択し、同定するための方法もまた開示される。リボスイッチの活性化とは、トリガー分子が結合したときのリボスイッチの状態の変化のことを指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物によって、そしてトリガー分子の結合以外の方法で活性化され得る。トリガー分子という用語は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物を指すために本明細書中において使用される。これは、リボスイッチに対する天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化し得る他の化合物を含む。天然または通常のトリガー分子は、天然における所与のリボスイッチに対するトリガー分子であるか、または、いくつかの天然でないリボスイッチの場合は、リボスイッチが設計されたか、もしくはリボスイッチが選択された（例えば、インビトロ選択またはインビトロ進化技術などにおいて）トリガー分子である。天然でないトリガー分子は、非天然トリガー分子と呼ばれ得る。
リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法もまた本明細書中に開示され、その方法は：試験化合物を用いて原子構造リボスイッチをモデル化する工程；およびその試験化合物がそのリボスイッチと相互作用するかを判定する工程を包含する。上記試験化合物が上記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程は、例えば、そのリボスイッチのモデルにおける試験化合物に対する、予測される最小の相互作用エネルギー、予測される結合定数、予測される解離定数または組み合わせを、本明細書中の他の箇所に記載されているように決定することによって達成され得る。上記試験化合物が上記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程は、例えば、そのリボスイッチのモデルを用いて、試験化合物の、１つ以上の予測される結合、１つ以上の予測される相互作用または組み合わせを測定することによって達成され得る。その予測される相互作用は、例えば、上に記載されたようなファンデルワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用または組み合わせからなる群から選択され得る。１つの例において、リボスイッチは、グアニンリボスイッチである。
原子の接触は、リボスイッチとの相互作用が測定されることによって、試験化合物とリボスイッチとの相互作用が測定されるときに、判定され得る。試験化合物のアナログが同定され得、そしてその試験化合物のアナログが、リボスイッチと相互作用するかが判定され得る。
細菌を殺滅するか、または阻害する方法もまた開示され、その方法は、細菌を、本明細書中に開示される化合物または本明細書中に開示される方法によって同定される化合物と接触させる工程を包含する。
リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する化合物を同定する方法もまた開示される。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価することによって同定され得る。リボスイッチが活性化される場合、その試験化合物は、そのリボスイッチを活性化する化合物と同定される。リボスイッチの活性化は、任意の適当な様式で評価され得る。例えば、リボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結され得、そのレポーターＲＮＡの発現、発現レベルまたは発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下において測定することができる。別の例として、リボスイッチは、立体配座依存性標識を含み得、その標識からのシグナルは、リボスイッチの活性化状態に応じて変化する。そのようなリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからのアプタマードメインまたは天然に存在するリボスイッチに由来するアプタマードメインを使用する。理解されるように、リボスイッチの活性化の評価は、コントロールアッセイもしくは測定を使用して行われ得るか、またはコントロールアッセイもしくは測定を使用せずに行われ得る。リボスイッチを不活性化する化合物を同定するための方法は、類似の方法において行われ得る。
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、本明細書中の他の箇所に開示される方法に加えて、任意の適当な様式で達成され得る。例えば、リボスイッチを活性化するか、または不活性化すると知られている化合物の存在下において、および試験化合物の存在下において、そのリボスイッチの活性化または不活性化を評価するためのアッセイが行われ得る。試験化合物の非存在下において観察されるような活性化または不活性化が観察されない場合、その試験化合物は、そのリボスイッチの活性化または不活性化を遮断する化合物と同定される。
バイオセンサーリボスイッチを使用して化合物を検出する方法もまた開示される。その方法は、試験サンプルとバイオセンサーリボスイッチとを接触させる工程およびそのバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価する工程を包含し得る。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験サンプル中にバイオセンサーリボスイッチに対するトリガー分子が存在することを示唆する。バイオセンサーリボスイッチは、その同族トリガー分子の存在下において検出可能なシグナルを生成する、操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベル以上において引き起こされ得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボまたはインビトロにおける用途のために設計され得る。例えば、シグナルとして機能するタンパク質またはシグナルを生成する際に関連するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたｇｌｍＳバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を有する細胞または生物を操作することによってインビボにおいて使用され得る。インビトロにおいて使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、立体配座依存性標識を含み、その標識からのシグナルは、そのリボスイッチの活性化状態に応じて変化するｇｌｍＳリボスイッチである。そのようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するｇｌｍＳリボスイッチからのアプタマードメインまたは天然に存在するｇｌｍＳリボスイッチに由来するアプタマードメインを使用する。
リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する化合物を同定し、そしてその同定された化合物を製作することによって作製された化合物もまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他の箇所に開示されるような、化合物の同定方法を、同定された化合物を製作するための方法と組み合わせることによって達成され得る。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価し、そして、そのリボスイッチがその試験化合物によって活性化された場合に、リボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製作することによって、作製され得る。
化合物によるリボスイッチの活性化、不活性化または遮断を確認し、そしてその確認された化合物を製作することによって作製される化合物もまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他の箇所に開示されるような化合物の活性化、不活性化または遮断の評価方法を、確認された化合物を製作するための方法と組み合わせることによって達成され得る。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価し、そしてそのリボスイッチがその試験化合物によって活性化された場合に、リボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製作することによって作製され得る。リボスイッチを活性化する能力、不活性化する能力または遮断する能力について化合物を確認することは、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断すると事前に知られていない化合物の同定と、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断するとすでに知られた化合物がリボスイッチを活性化するか、不活性化するか、または遮断する能力の評価との両方のことを指す。
目的の化合物を検出する方法が開示され、その方法は、サンプルとｇｌｍＳリボスイッチとを接触させる工程を包含し、ここで、そのリボスイッチは、目的の化合物によって活性化され、そのリボスイッチは、その目的の化合物によって活性化されたときにシグナルを生成し、そのリボスイッチは、サンプルが目的の化合物を含んでいるときにシグナルを生成する。上記リボスイッチは、目的の化合物によって活性化されたときに立体配座を変化させ得、ここで、その立体配座の変化は、立体配座依存性標識を介してシグナルを生成する。上記リボスイッチは、目的の化合物によって活性化されたときに立体配座を変化させ得、ここで、立体配座の変化は、上記リボスイッチに連結されたＲＮＡの発現の変化をもたらし、その発現の変化は、シグナルを生成する。そのシグナルは、リボスイッチに連結されたＲＮＡから発現されるレポータータンパク質によって生成され得る。
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程（その阻害は、そのリボスイッチを介するものである）および（ｂ）細胞と、工程（ａ）において遺伝子発現を阻害した化合物とを接触させることによって遺伝子発現を阻害する工程を包含する方法（ここで、上記細胞は、リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、上記化合物は、上記リボスイッチに結合することによって上記遺伝子の発現を阻害する）が開示される。
Ａ．抗菌化合物の同定
リボスイッチは、有機小分子と結合するために進化した、構造化されたＲＮＡの新規クラスである。リボスイッチの天然の結合ポケットは、代謝産物アナログを用いて標的化され得るか、または天然の代謝産物の形状空間を模倣する化合物によって標的化され得る。リボスイッチの小分子リガンドは、候補薬物を生成する誘導体化に有用な部位を提供する。いくつかのリボスイッチの分布が米国出願公開番号２００５−００５３９５１の表１に示されている。いったん、リボスイッチの１つのクラスが同定され、薬物標的（例えば、ｇｌｍＳリボスイッチ）としての潜在能力が評価されると、候補分子を同定することができる。
細菌の薬物耐性株の出現によって、抗生物質の新規クラスの同定の必要性が際立つ。抗リボスイッチ薬物は、以下の理由でかなり興味深い抗細菌作用の様式を示す。リボスイッチは、基礎的な代謝プロセスに極めて重大な遺伝子の発現を制御する。ゆえに、薬物を用いてこれらの遺伝子調節エレメントを操作することによって、新規抗生物質がもたらされる。これらの抗菌剤は、静菌性または殺菌性であると考えられ得る。リボスイッチはまた、代謝産物に選択的に結合するように進化したＲＮＡ構造を有するので、これらのＲＮＡレセプターは、タンパク質酵素およびレセプターと同様の良好な薬物標的をもたらす。さらに、（上述の）２つの抗菌化合物が、ＲＮＡ標的の変異によって生じる抗生物質耐性を不活性化することによって細菌を殺滅することが示されている。
本明細書中に開示されるように、ｇｌｍＳリボスイッチに対する原子分解構造モデルが明らかにされており（Ｃｏｃｈｒａｎｅ ２００７，ｇｌｍＳリボザイム構造に関して教示するためにその全体が本明細書中に参考として援用される）、これによって、リボスイッチ結合化合物を作製するために、構造に基づく設計方法を使用することができる。具体的には、ｇｌｍＳリボスイッチの結合部位に対するモデルは、リガンドの改変を許容し得る２つのチャネルが存在することを示している（図２）。本明細書中に開示されるある特定の部位において化学修飾を用いてＧｌｃＮ６Ｐアナログを作製し、これまで試験されたほぼすべてが、ナノモル濃度以下の解離定数でリボスイッチに結合する。図２は、改変された化学構造を有する、合成されたＧｌｃＮ６Ｐアナログの構造を示している。これらの化合物のほとんどが、結合部位モデルにおいて分子認識「盲点」を利用するか、または、アプタマードメインが、ｇｌｍＳリボスイッチを形成する。成功した化合物は、骨格として使用され得、その際、さらなる化学的バリエーションが無毒性で生物利用可能な高親和性の抗リボスイッチ化合物を作製するために導入され得る。
実施例１に見られるように、ｇｌｍＳリボザイムの分子認識の特徴は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来の２００ヌクレオチドのｇｌｍＳリボザイム構築物の自己切断活性に対するＧｌｃＮ６Ｐおよび様々なＧｌｃＮ６Ｐアナログの効果を測定することによって見出された（図１）。リガンド濃度に対してリボザイム速度定数をプロットすることによって、各リガンドに対するＫＤ値が決定された。同様の方法を使用した以前の研究によって、ＧｌｃＮ６Ｐのリン酸部分（図１ｂ；１ａ）が、リガンドとｇｌｍＳリボザイムとの最大親和性のために必要であることが明らかになった（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。リガンドのアミン基は、リボザイム機能にとって不可欠であることも知られている（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。しかしながら、線状のアミン含有化合物は、わずかなリボザイム活性を誘導することができる（ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）ことから、ＧｌｃＮ６Ｐの非環状型（図１ｂ）または別のアノマー型（図１ｃ）が、活性であり得ることが示唆される。ゆえに、一連のアナログを試験することにより（図２）、ＧｌｃＮ６Ｐおよびそのピラノース環上の個別の官能基の構造的な立体配座の重要性を探索した。
生理学的条件下において、ＧｌｃＮ６Ｐは、非環状型（図１ｂ）と２つの環状のβ−アノマー型（図１ａ）およびα−アノマー型（図１ｃ）との間で平衡になる（図１ｂ）（Ｓｃｈｒａｙ １９７８）。溶液中での１ａと１ｃとの相対量は、Ｄ２Ｏにおける１Ｈ ＮＭＲによって測定されるとき、２５℃において６０：４０であり、非環状型は、１％未満である（Ｓｃｈｒａｙ １９７８）。各配座異性体は、ＧｌｍＳタンパク質に対して観察されたものと類似のＲＮＡ結合親和性およびリボザイム活性の差を示し得る（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ １９９８）。
他のリボスイッチクラスの分子認識の特徴に関する以前の研究から、高レベルの分子識別が、天然のリガンド結合ＲＮＡによって達成され得ることが明らかになっている（Ｌｉｍ ２００６）。ｇｌｍＳリボザイム切断を効率的かつ選択的に引き起こすアナログは、病原性の細菌においてＧｌｍＳ代謝性酵素の発現を乱すために使用され得、これによって、それらの正常な細胞機能が乱され得る。
所与の化合物の活性を評価するために、以下の例を基準として使用することができる。ｇｌｍＳエレメントの天然の配列は、単分子のシス−切断リボザイムを形成するが、活性なｇｌｍＳリボザイムもまた、生体分子シス作用性リボザイムとして構築され得る。この形式において、基質と呼ばれる切断される鎖は、対形成エレメント１（Ｐ１）およびＰ１の上流の保存されたヌクレオチドの半分を形成する５’塩基対を含む。切断されていないリボザイム鎖は、Ｐ１およびｇｌｍＳエレメントの残存配列の３’半分を含む。この生体分子形式を用いて、１６ヌクレオチドの基質鎖を、蛍光プローブであるフルオレセイン（Ｆ１）およびｃｙ３でそれぞれ３’末端および５’末端において標識した。切断されていない基質ＲＮＡでは、強制的にｃｙ３クエンチャーの近位になることによって励起状態のフルオレセインの放出がクエンチされる。Ｇｌｎ６Ｐ系の存在下で切断されるとき、ｇｌｍＳリボスイッチへのＧｌｎ６Ｐ（または関連誘導体）の結合は、標準的なハイスループット技術を使用して迅速にスクリーニングされ得る。
最低１０時間のインキュベートの後、フルオレセインの蛍光強度は、約１６０μＭグルコサミン−６−リン酸の存在下で約４倍増加したのに対し、Ｇｌｎ６Ｐの非存在下では、観察可能な変化は検出されなかった。例えば、リボスイッチが活性化されるときに、化合物を同定することができるか、または化合物の存在下でのリボスイッチアッセイにおけるシグナルが、その化合物の非存在下における同じリボスイッチアッセイと比べて（すなわち、コントロールアッセイと比べて）、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％増加する場合、リボスイッチ活性化活性を有すると判定され得る。そのリボスイッチアッセイは、任意の適当なリボスイッチ構築物を用いて行われ得る。リボスイッチ活性化アッセイに特に有用なリボスイッチ構築物は、本明細書中の他の箇所に記載されている。リボスイッチを活性化するときまたはリボスイッチ活性化活性を有するときの化合物の同定は、１つ以上の特定のリボスイッチ、リボスイッチ構築物またはリボスイッチのクラスに関して行われ得る。便宜上、ｇｌｍＳリボスイッチを活性化するか、またはｇｌｍＳリボスイッチに対するリボスイッチ活性化活性を有すると同定された化合物は、特定のｇｌｍＳリボスイッチ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓに見られるｇｌｍＳリボスイッチ）に対してそのように同定され得る。低濃度のＲＮＡがプラスチックチューブおよびプレートに接着するのを妨害するためにドデシル硫酸ナトリウムが有用であることに関する以前の証明と一致して、ハイスループット法を用いてスクリーニングするとき、０．０１％のドデシル硫酸ナトリウムを含めることが、完全なリボザイム活性に必要であった。この検出システムの識別能力の限界をさらに調べるために、１６個のＧｌｎ６Ｐ誘導体のライブラリーもまたスクリーニングした。その結果得られたｇｌｍＳ結合活性は、ゲル電気泳動法によって独立して測定された結合活性と十分に一致した（表１）。
Figure 2010503619
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 Ｂ．抗菌化合物を使用する方法
インビボおよびインビトロにおける抗細菌の方法が本明細書中に開示される。「抗細菌」とは、細菌の成長の阻害もしくは予防、細菌の殺滅または細菌数の減少を意味する。従って、細菌の成長を阻害または予防する方法が開示され、その方法は、細菌を、本明細書中に開示される有効量の１つ以上の化合物と接触させる工程を包含する。開示される化合物に対するさらなる構造が、本明細書中に提供される。
対象内の細胞（例えば、細菌細胞）の成長を阻害する方法もまた本明細書中に開示され、その方法は、本明細書中に開示されるような有効量の化合物をその対象に投与する工程を包含する。これによって、上記化合物が上記細胞と接触し得る。その対象は、例えば、細菌に感染している可能性があり、上記細菌細胞は、上記化合物によって阻害され得る。上記細菌は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来の細菌などの任意の細菌であり得る。細菌の成長はまた、細菌が見出される任意の状況において阻害され得る。例えば、体液中、バイオフィルム中および表面上の細菌の成長が、阻害され得る。本明細書中に開示される化合物は、他の任意の化合物または組成物と併用して投与され得るか、または使用され得る。例えば、開示される化合物は、別の抗菌化合物と併用して投与され得るか、または使用され得る。
「細菌の成長の阻害」とは、単一の細菌が娘細胞に分裂する能力を低下させること、または細菌の集団が娘細胞を形成する能力を低下させること、と定義される。細菌が繁殖する能力は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％もしくは１００％またはそれ以上低下し得る。
細菌または細菌の集団を殺滅する方法もまた提供され、その方法は、細菌と、本明細書中に開示され、記載される化合物の１つ以上とを接触させる工程を包含する。
「細菌の殺滅」とは、単一の細菌の死をもたらすこと、または複数の細菌（例えば、コロニーにおける細菌）の数を減少させること、と定義される。細菌が、複数形で言及されるとき、「細菌の殺滅」とは、細菌の所与の集団の１０％、その集団の２０％、その集団の３０％、その集団の４０％、その集団の５０％、その集団の６０％、その集団の７０％、その集団の８０％、その集団の９０％またはその集団の１００％以下の割合での細胞死と定義される。
本明細書中に開示される化合物および組成物は、インビトロまたはインビボにおいて抗細菌活性を有し、同様に殺菌性であり得る他の化合物または組成物とともに使用され得る。
化合物の「治療有効量」という用語は、本明細書中に提供されるとき、無毒性であるが、１つ以上の症状の所望の低減をもたらすのに十分な化合物の量を意味する。以下で指摘されるように、必要とされる化合物の正確な量は、対象の種、年齢および全身の状態、処置される疾患の重症度、使用される特定の化合物、その投与様式などに応じて、対象ごとに異なる。従って、正確な「有効量」を特定することはできない。しかしながら、適切な有効量は、通例の実験のみを使用することで当業者によって決定され得る。
本明細書中に開示される組成物および化合物は、インビボにおいて薬学的に許容可能なキャリア中で投与され得る。「薬学的に許容可能な」とは、生物学的に望ましくなくないか、または別段望ましくなくない材料のことを意味する。すなわち、材料は、任意の望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはその材料に含まれている薬学的組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、対象に投与され得る。上記キャリアは、当業者に周知のとおり、当然、活性成分の任意の分解を最小限にするように、および対象において任意の有害な副作用を最小限にするように、選択される。
本明細書中に開示される組成物または化合物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内投与）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外に、局所的に（局所的な鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む）、投与され得る。本明細書中で使用されるとき、「局所的な鼻腔内投与」とは、片方または両方の鼻孔を介した鼻および鼻腔への組成物の送達のことを意味し、核酸またはベクターの、噴霧メカニズムもしくは液滴メカニズムによる送達またはエアロゾル投与を介する送達を含み得る。吸入剤による組成物の投与は、噴霧メカニズムまたは液滴メカニズムによる送達によって鼻または口を介するものであり得る。送達はまた、挿管によって呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に直接送達されるものであり得る。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身の状態、処置されるアレルギー性障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与様式などに応じて、対象ごとに異なる。従って、すべての組成物に対して正確な量を特定することはできない。しかしながら、適切な量は、本明細書中に教示が与えられるとき、通例の実験のみを使用することで当業者によって決定され得る。
組成物または化合物の非経口投与は、使用される場合、通常、注射によって特徴付けられる。注射可能物は、従来の形態、液体の溶液もしくは懸濁液のいずれか、注射前に液体での懸濁液の溶解に適した固体の形態、またはエマルジョンとして、調製され得る。近年見直された非経口投与用のアプローチは、一定の投与量が維持される緩効性の系または徐放系の使用を含む。例えば、本明細書中において参考として援用される米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。
本明細書中に開示される組成物および化合物は、薬学的に許容可能なキャリアと併用して治療的に使用され得る。適当なキャリアおよびその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。典型的には、製剤に等張性を付与するために、適切な量の薬学的に許容可能な塩がその製剤において使用される。その薬学的に許容可能なキャリアの例としては、食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。その溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは、約７〜約７．５である。さらなるキャリアとしては、徐放調製物（例えば、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス）が挙げられ、そのマトリックスは、成形された物品の形態、例えば、フィルム、リポソームまたは微小粒子である。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、ある特定のキャリアが、より好ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬物の投与用の標準的なキャリアであり得、例えば、滅菌水、食塩水および生理学的ｐＨにおける緩衝溶液などの溶液が挙げられる。その組成物は、筋肉内投与または皮下投与され得る。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与される。
薬学的組成物は、最適な分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、１つ以上の活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤など）を含み得る。
薬学的組成物は、局所的処置または全身性処置が望まれるのかに応じて、そして処置される領域に応じて、多くの方法で投与され得る。投与は、局所的投与（眼、膣、直腸、鼻腔内を含む）、経口的投与（吸入による）、または非経口的投与（例えば、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射または筋肉内注射による）であり得る。開示される抗体は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、腔内投与、または経皮投与され得る。
非経口投与のための調製物は、滅菌された、水性または非水性の溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性のキャリアとしては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝媒質を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体補給剤および養分補給剤、電解質補給剤（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存剤および他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなど）もまた、存在し得る。
局所的投与用の製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、坐剤、スプレー、液体および散剤が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水溶液、散剤または油性基剤、増粘剤などは、必要であり得るか、または望ましい場合がある。
経口投与用の組成物としては、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒質の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ剤または錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が、望ましい場合がある。
組成物のいくつかは、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸）および有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸）との反応または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）および有機塩基（例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミンおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミン）との反応によって形成される薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として潜在的に投与され得る。
本明細書中に開示されるような治療的な組成物はまた、化合物分子が結合した個別のキャリアとしてモノクローナル抗体を使用することによって送達され得る。本開示の治療的な組成物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして可溶性ポリマーと結合され得る。そのようなポリマーとしては、ポリビニル−ピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ−ｅｎｅｏｘｉｄｅｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、本開示の治療的な組成物は、薬物の放出制御を達成するのに有用なあるクラスの生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋ブロック共重合体または両親媒性ブロック共重合体）に結合され得る。
細菌感染の好ましくは少なくとも約３％、より好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは７５％およびなおもより好ましくは約１００％が、本化合物の投与によって減少する。感染の減少は、白血球数の減少、熱の低下、炎症の減少、細菌数の減少または細菌感染の他の徴候の減少のようなパラメータによって判定される。細菌感染減少のパーセンテージを上昇させるために、投与量は、対象に対して無毒性を保持する最も効果的なレベルにまで増加させることができる。
本明細書全体を通じて使用されるとき、「対象」とは、個体のことを指す。好ましくは、対象は、哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物または霊長類）であり、より好ましくは、ヒトである。「対象」は、飼い慣らされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および魚類が挙げられ得る。
「細菌の感染」は、対象またはサンプル中における細菌の存在と定義される。そのような細菌は、対象中もしくはサンプル中、または対象上もしくはサンプル上における天然に存在する細菌の副産物であり得るか、または外来性生物の侵入に起因するものであり得る。
本明細書中に開示される化合物は、抗生物質と同じ様式で使用され得る。抗生物質の用途は、当該分野において十分に確立されている。それらの用途の１つの例としては、動物の処置が挙げられる。必要とされるとき、開示される化合物は、通常、獣医師または栄養学者の専門的な指導を用いて、注射によって、または食餌もしくは水を介して、動物に投与され得る。それらは、疾患の重症度および動物の種などの状況に応じて、個々に、または一緒に、動物に送達される。集団または群れの全体の処置および治療は、すべての動物が同様の免疫状態である場合およびすべての動物が同じ疾患を引き起こす微生物に曝露されている場合に、必要であり得る。
本化合物を使用する別の例としては、水生動物の微生物感染の減少が挙げられ、それは、微生物に感染した水生動物を選択する工程、開示されるような化合物、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、ＴＲＩＥＮＥを含む抗菌溶液を提供する工程、その溶液にｐＨ緩衝剤を加えて、そのｐＨを約７．０〜約９．０の値に調整する工程、その溶液中に水生動物を浸漬して、その水生動物の微生物負荷を低減するのに有効な期間にわたってその動物をその中に放置する工程、水生動物をその溶液から取り出す工程、および上記溶液を含まない水にその動物を戻す工程を包含する。ＥＤＴＡ、開示されるような化合物ならびにＴＲＩＥＮＥおよびｐＨ緩衝剤を含んでいる溶液中に水生動物を浸漬する工程は、その動物の微生物負荷が排除されるまで繰り返され得る（米国特許第６，５１８，２５２号）。
本明細書中に開示される化合物の他の用途としては、歯の処置および水の精製（これは、例えば、都市用水、下水処理システム、飲用水および非飲用水の供給および孵化場が挙げられ得る）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態
遺伝子発現を阻害する方法が本明細書中に開示され、その方法は、（ａ）化合物と細胞とを接触させる工程を包含し、（ｂ）その化合物は、式Ｉ：
Figure 2010503619
 の構造を有するか、またはその薬学的に許容可能な塩、その生理的に加水分解可能かつ許容可能なエステルまたはその両方であり、ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、Ｒ２は、ＮＨ−Ｒ６であり、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）イソ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＮＨ２であり、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、Ｒ４は、水素結合供与体であり、Ｒ５は、水素結合受容体であり、そしてその化合物は、グルコサミン−６−リン酸ではなく、上記細胞は、ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、上記化合物は、ｇｌｍＳリボスイッチに結合することによって遺伝子の発現を阻害する。遺伝子発現を阻害する方法もまた本明細書中に開示され、その方法は、上に開示されたような化合物と細胞とを接触させる工程を包含し、ここで、その細胞は、ｇｌｍＳ応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、上記化合物は、ｇｌｍＳ応答性リボスイッチに結合することによってその遺伝子の発現を阻害する。上記細胞は、例えば、細菌細胞であり得、上記化合物は、その細菌細胞を殺滅または阻害し得る。上記細胞は、ｇｌｍＳリボスイッチを含み得る。上記細胞は、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓであり得る。
化合物を対象に投与することによってその化合物と細胞とを接触させることによって、その細胞において遺伝子発現を阻害する方法および／またはその細胞を含む対象において細胞の成長を阻害する方法もまた開示される。本方法のいくつかの形態において、上記化合物は、基質としてグルコサミン−６−リン酸を有する対象の酵素に対する基質ではない。化合物の１％未満、２％、３％、４％または５％が、酵素がその主要な基質の８０％以上を変化させるかまたは代謝する条件下、かつ、ある長さの時間にわたって、その酵素によって変化されるか、または代謝される場合に、その化合物は、その酵素の基質ではない。酵素に対する主要な基質は、その酵素が最も高い酵素活性を有するときのその酵素に対する通常の生物学的基質である。本方法のいくつかの形態において、化合物は、グルコサミン−６−リン酸を変化させる対象の酵素に対する基質ではない。本方法のいくつかの形態において、化合物は、グルコサミン−６−リン酸を代謝する対象の酵素に対する基質ではない。本方法のいくつかの形態において、化合物は、グルコサミン−６−リン酸を異化する対象の酵素に対する基質ではない。本方法のいくつかの形態において、細胞は、対象内の細菌細胞であり、ここで、前記化合物が、その細菌細胞を殺滅するか、またはその細菌細胞の成長を阻害する。本方法のいくつかの形態において、対象は、細菌に感染している。本方法のいくつかの形態において、化合物は、別の抗菌化合物と併用して投与される。本方法のいくつかの形態において、化合物は、バイオフィルムにおいて細菌の成長を阻害する。
式Ｉ：
Figure 2010503619
 の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩、その生理的に加水分解可能かつ許容可能なエステルまたはその両方が本明細書中に開示され、ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、Ｒ２は、ＮＨ−Ｒ６であり、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）イソ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＮＨ２であり、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、Ｒ４は、水素結合供与体であり、Ｒ５は、水素結合受容体であり、この化合物は、グルコサミン−６−リン酸ではない。Ｒ４が、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ３＋、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨアルキル、＝ＮＨ、＝ＮＯＨ、＝ＮＳＨ、＝ＮＣＯ２Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ＝ＮＨ、ＣＨ＝ＮＯＨ、ＣＨ＝ＮＳＨ、ＣＨ＝ＮＣＯ２Ｈ、ＯＣＨ２ＯＨ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＰｈＯＨ、ＮＨアルキル、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨアルキル、ＮＨＣＯアルキル、ＮＨＣＯ２アルキル、ＮＨＣＯＮＨ２、ＮＨＳＯ２アルキルまたはＮＨＯアルキルである化合物もまた開示される。Ｒ１がＨまたはＯＨであるときＲ４はＯＨではなく、そしてＲ２はＮＨ２またはＮＨＣＨ３である、化合物もまた開示される。Ｒ５がＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｓ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）ＯＨＳＨ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである化合物が、さらに開示される。Ｒ５がＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである化合物もまた開示される。さらに、Ｒ５は、負に帯電している可能性がある。Ｒ５が、＝Ｏ、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、Ｒ９が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）または−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＦ３である化合物がさらに開示される。Ｒ５が、＝Ｏ、ＯＨ、ＯＲ９、ＣＯＲ９、ＣＮ、ＮＯ２、テトラゾール、ＳＯＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、Ｒ９が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である化合物もまた開示される。Ｒ４が、ＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである化合物もまた開示される。Ｒ４がＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである化合物もまた開示される。１つの例において、細胞は、遺伝子発現が阻害される必要があると同定されている。その細胞は、細菌細胞であり得、本化合物は、その細菌細胞を殺滅し得るか、またはその細菌細胞の成長を阻害し得る。本化合物は、ｇｌｍＳリボスイッチに結合され得る。本化合物は、ｇｌｍＳリボスイッチに結合し得る。本化合物は、ｇｌｍＳリボスイッチを活性化し得る。
上に記載された化合物、およびコード領域に作動可能に連結されたｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物を含んでいる組成物がさらに開示され、ここで、そのｇｌｍＳリボスイッチは、そのＲＮＡの発現を制御し、そのｇｌｍＳリボスイッチおよびコード領域は、異種性である。そのｇｌｍＳリボスイッチは、本化合物によって活性化されるとき、シグナルを生成し得る。例えば、そのリボスイッチは、本化合物によって活性化されるとき、立体配座を変化させ得、その立体配座の変化は、立体配座依存性標識を介してシグナルを生成し得る。さらに、そのリボスイッチは、本化合物によって活性化されるとき、立体配座を変化させ得、その立体配座の変化は、そのリボスイッチに連結されたコード領域の発現の変化を引き起こし、その発現の変化は、シグナルを生成する。そのシグナルは、そのリボスイッチに連結されたコード領域から発現されるレポータータンパク質によって生成され得る。
（ａ）上に記載されたような化合物を、ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について試験する工程（その阻害は、ｇｌｍＳリボスイッチを介するものである）および（ｂ）細胞と、工程（ａ）において遺伝子発現を阻害した化合物とを接触させることによって遺伝子発現を阻害する工程を包含する方法もまた開示され、ここで、その細胞は、ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、その化合物は、そのｇｌｍＳリボスイッチに結合することによってその遺伝子の発現を阻害する。
表２に列挙される原子座標を含む原子構造を含む天然のｇｌｍＳ応答性リボスイッチの原子構造もまた開示される。図９に描かれているような活性部位および結合ポケットの原子構造ならびに表２内に含まれる図９に描かれている活性部位および結合ポケットの原子座標もまた開示される。
リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法がさらに開示され、その方法は：ｇｌｍＳリボスイッチの原子構造を、試験化合物を用いてモデル化する工程；およびその試験化合物がそのリボスイッチと相互作用するかを判定する工程を包含する。さらに、上記試験化合物が上記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程は、そのリボスイッチのモデルにおいて試験化合物に対する、予測される最小の相互作用エネルギー、予測される結合定数、予測される解離定数または組み合わせを決定する工程を包含し得る。上記試験化合物が上記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程は、そのリボスイッチのモデルを用いて、試験化合物の、１つ以上の予測される結合、１つ以上の予測される相互作用または組み合わせを測定する工程を包含し得る。原子の接触が判定され得ることによって、上記試験化合物と上記リボスイッチとの相互作用が判定される。リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法は：試験化合物のアナログを同定する工程；およびその試験化合物のアナログが上記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程をさらに包含し得る。
細菌を殺滅する方法がさらに開示され、その方法は、細菌と、上で開示された方法によって同定されたアナログとを接触させる工程を包含する。細菌を殺滅する方法がさらに開示され、その方法は、細菌と、上で開示された方法によって同定された化合物とを接触させる工程を包含する。ゲルベースのアッセイまたはチップベースのアッセイを使用して、上記試験化合物が上記リボスイッチと相互作用するかを判定することができる。その試験化合物は、ファンデルワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用または組み合わせを介して相互作用し得る。そのリボスイッチは、例えば、ＲＮＡ切断リボザイムを含み得る。蛍光シグナルは、クエンチング部分を含む核酸が切断されたときに生成され得る。分子ビーコン技術を使用して、蛍光シグナルを生成することができる。本明細書中に開示される方法は、ハイスループットスクリーニングを使用して行われ得る。
対象内に存在する細菌細胞などの細胞の成長を阻害する方法もまた本明細書中に開示され、その方法は、本明細書中に開示されるような有効量の化合物を対象に投与する工程を包含する。これにより、その化合物が細胞と接触し得る。対象は、例えば、細菌に感染している可能性があり、細菌細胞は、化合物によって阻害されるべき細胞であり得る。細菌は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来の細菌などの任意の細菌であり得る。細菌の成長はまた、細菌が見出される任意の状況において阻害され得る。例えば、体液中、バイオフィルム中および表面上の細菌の成長が、阻害され得る。本明細書中に開示される化合物は、他の任意の化合物または組成物と併用して投与され得るか、または使用され得る。例えば、開示される化合物は、別の抗菌化合物と併用して投与され得るか、または使用され得る。
Ａ．実施例１：ｇｌｍＳ自己切断型リボザイムによるリガンド認識の特徴
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のｇｌｍＳリボザイム（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；Ｂａｒｒｉｃｋ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ２００５；Ｓｏｕｋｕｐ ２００６；Ｒｏｔｈ ２００６；Ｊａｎｓｅｎ ２００６）は、固有のリボスイッチ（Ｍａｎｄａｌ ２００４；Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００５）クラスの代表であり、このクラスのメンバーは、グルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮ６Ｐ）と結合しているとき、高い速度定数で自己切断を起こす。これらの代謝産物を感知するリボザイムは、多くのグラム陽性細菌に見られ、それらのグラム陽性細菌においてそのリボザイムはｇｌｍＳ遺伝子の発現を調節している。ｇｌｍＳ遺伝子産物（グルタミン−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ）は、ＧｌｃＮ６Ｐを生成し（Ｂａｄｅｔ−Ｄｅｎｉｓｏｔ １９９３；Ｍｉｌｅｗｓｋｉ ２００２）、ＧｌｃＮ６Ｐは、リボザイムに結合して、リン酸エステルの内部移行によって自己切断を引き起こす（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４）。そのリボザイムは、ｇｌｍＳメッセンジャーＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に包埋されており、自己切断によってＧｌｍＳタンパク質の生成が妨害され、それによって、ＧｌｃＮ６Ｐの濃度が低下する。分子の感知と自己切断と遺伝子制御機能との組み合わせによって、この低分子ＲＮＡが、リボザイムとリボスイッチとの両方として作動することが可能になる。
Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来のｇｌｍＳリボザイムおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の相同なリボザイムが、約２００μＭという見かけの解離定数（ＫＤ）でＧｌｃＮ６Ｐに応答することが示されている（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５；Ｒｏｔｈ ２００６）。このＫＤ値が、他のほとんどの天然のリボスイッチに対して測定されている値よりも高いにもかかわらず、ｇｌｍＳリボザイムは、高レベルの分子認識特異性を示す。例えば、グルコサミン−６−硫酸は、約１００倍高い濃度で存在するときであってもＧｌｃＮ６Ｐと同程度にリボザイム活性化を誘導することができる。対照的に、ＧｌｃＮ６Ｐの２−アミン基がヒドロキシル基で置換されているグルコース−６−リン酸は、リボザイム作用を完全に引き起こさない（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。
リボスイッチは、代謝遺伝子の望ましくない調節を防止するためにそのリボスイッチの天然のリガンドに関連する化合物を識別できなければならない。しかしながら、リシン（Ｓｕｄａｒｓａｎ ２００３）およびチアミンピロホスフェート（Ｓｕｄａｒｓａｎ ２００６）に対して正常に応答するリボスイッチについて証明されているように、リボスイッチ機能を引き起こし、かつ、細菌の成長を阻害するアナログを作製することが可能である。ＧｌｍＳタンパク質の適正な発現は、細菌の生存能にとって極めて重大であり（Ｂａｄｅｔ−Ｄｅｎｉｓｏｔ １９９３；Ｍｉｌｅｗｓｋｉ ２００２）、ｇｌｍＳリボザイム活性を引き起こすことによって正常な遺伝子発現を妨害するＧｌｃＮ６Ｐのアナログは、抗菌剤として機能し得る。ゆえに、ｇｌｍＳリボザイムの分子認識の特徴に関する深い理解が求められていた。
ｇｌｍＳリボザイムの分子認識の特徴は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来の２００ヌクレオチドのｇｌｍＳリボザイム構築物の自己切断活性に対するＧｌｃＮ６Ｐおよび様々なＧｌｃＮ６Ｐアナログの効果を測定することによって見出された（図１）。リガンド濃度に対してリボザイム速度定数をプロットすることによって、各リガンドに対するＫＤ値が決定された（実験の項）。同様の方法を使用した以前の研究では、ＧｌｃＮ６Ｐのリン酸部分（図１ｂ；１ａ）が、リガンドとｇｌｍＳリボザイムとの最大親和性のために必要であることが明らかになった（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。リガンドのアミン基は、リボザイム機能にとって不可欠であることも知られている（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。しかしながら、線状のアミン含有化合物は、わずかなリボザイム活性を誘導することができる（ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）ことから、ＧｌｃＮ６Ｐの非環状型（１ｂ）または別のアノマー型（１ｃ）が、活性であり得ることが示唆される。ゆえに、一連のアナログを試験することにより（図２）、ＧｌｃＮ６Ｐおよびそのピラノース環上の個別の官能基の構造的な立体配座の重要性を探索した。
生理学的条件下において、ＧｌｃＮ６Ｐは、非環状型（１ｂ）と２つの環状のβ−アノマー型（１ａ）とα−アノマー型（１ｃ）との間で平衡になる（図１ｂ）（Ｓｃｈｒａｙ １９７８）。溶液中での１ａと１ｃとの相対量は、Ｄ２Ｏにおける１Ｈ ＮＭＲによって測定されるとき、２５℃において６０：４０であり、非環状型は、１％未満である（Ｓｃｈｒａｙ １９７８）。各配座異性体は、ＧｌｍＳタンパク質に対して観察されたものと類似のＲＮＡ結合親和性およびリボザイム活性の差を示し得る（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ １９９８）。
小分子（例えば、セリノール（ｓｅｒｉｎｏｌ）およびエタノールアミン）は、リボザイム活性を高めるが、それらは、ＧｌｃＮ６Ｐよりも有効性が低い（ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。同様に、非環状アナログ３は、本研究において使用されるアッセイ条件下において検出可能な活性を有しない（図２ｂ、実験の項）。対照的に、１位のヒドロキシル基を欠いている環状アナログ８は、ＧｌｃＮ６Ｐが示した活性の約７０分の１でリボザイム自己切断を活性化する（図２ｃ，図３）。これらの結果から、ピラノース環の１位における化学構造の変化は、リボザイム活性に対してわずかな効果しか有しないが、この位置における開環（３およびおそらく１ｂのように）は、はるかに有害であることが証明される。
１ｂがリボザイムの通常の機能に関する可能性はないので、ＧｌｃＮ６Ｐの片方または両方のアノマーがアクチベーターとして機能しなければならない。アナログの１ａ（５）および１ｃ（６）を試験し、ここで、アナログの立体化学は、１位における酸素原子のメチル化によって維持される。この結果から、リボザイムが、アナログ結合を妨げる堅固な結合ポケットを１位付近において形成することが示される。８は、リボザイム切断を実質的に活性化することができるので、１位における改変は、リガンドとリボザイムとの分子相互作用をわずかにだけ乱し得る。あるいは、２−アミン基のｐＫａに対する１−ヒドロキシル基の影響は、８の活性の低下の原因でもあり得る。例えば、エチルアミン（ｐＫａ＝１０．７）は、エタノールアミン（ｐＫａ＝９．５０）よりも高いｐＫａを有する（Ｌｉｄｅ １９９４）ことから、隣接するヒドロキシル基がアミンの塩基性度を１単位より多く低下させ得ることが示唆される。ゆえに、８に１−ヒドロキシル基が無いことによって引き起こされるｐＫａの変化は、リガンド結合またはリボザイム触媒のいずれかを乱し得る。
リボザイム活性化に対する３−および４−ヒドロキシル基の重要性を決定するために化合物２および１３を調べた。１３はＧｌｃＮ６Ｐと同様の活性を示すが、２は、使用されるアッセイ条件下において活性を誘導しない（図２ｂおよび２ｃ）。これらの結果は、４−ヒドロキシル基が結合に極めて重大であることを示唆している。対照的に、３−ヒドロキシル基は、結合に対して中程度の影響しか有し得ないか、または別途２−アミン基に対する誘導性の作用を介して反応性に影響を及ぼし得る。
スルフェートによるリン酸基の置換によって、リガンドに対する親和性が約１００倍低下する（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４）。しかしながら、リン酸基の除去（グルコサミン）は、リガンド親和性の一様な大きい低下をもたらす。ホスフェートの酸素原子の重要性をさらに評価するために、ホスホロチオレートアナログ４を作製した。この変更によって、リボザイム切断の速度定数が１に比較しておよそ２桁低下する。しかしながら、ＧｌｃＮ６Ｐは、グルコサミンよりも＞１０００倍堅固にリボザイムと結合する（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５；Ｌｉｄｅ １９９４；Ｍａｙｅｒ ２００６）。試験されたリン酸の改変は、リガンドとリボザイムとの単一の相互作用を部分的にだけ乱し得るが、このリガンドのこの部分に対して２以上の結合性の相互作用が生じる可能性がある。
２−アミン基または類似のアミンが、リボザイム活性を誘導するすべての化合物に存在する（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４；ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。ゆえに、１の一連の構造異性体および立体化学異性体を試験し、ここで、この官能基を変更した。７における１−ヒドロキシル基と２−アミン基との交換によって、リボザイム切断が支援されないことから、２−アミン基の位置が、活性にきわめて重大であることが示唆される。メチル基によって立体障害が引き起こされ得るにもかかわらず、ＧｌｃＮ６Ｐと比べて効率がわずかに減少しつつも９によってリボザイムは活性化される。対照的に、１０および１１は、不活性であることから、結合または触媒のためにアミンがプロトンを受容する能力または供与する能力が不可欠であることが示される。
化合物１２は、反対の立体化学的配置で２位にアミン基を有し、驚いたことに、天然のリガンドの３５分の１で切断を誘導する。１２は、ＧｌｃＮ６Ｐに結合するために使用されるのと同じ接触物を使用して結合することができるが、このポケットにおけるアミン基の再配置は、結合する能力またはプロトン移動媒介性触媒に関与する能力をわずかに減じるだけである。
これらの知見に基づいて、ＧｌｃＮ６Ｐ結合に対する一連の分子認識決定基を決定した（図４）。６−リン酸基および４−ヒドロキシル基は、水素結合供与体部位および水素結合受容体部位として機能し得る。リン酸基の非架橋酸素原子は、内圏配位を介して金属イオンと相互作用し得るが、Ｍｇ２＋イオンがコバルトヘキサミンで置換されるときに、リボザイムが完全な活性を達し得るので、このＲＮＡにおいて上記のような金属イオンとの相互作用はありそうにない（Ｒｏｔｈ ２００６）。コバルトヘキサミンは、完全に水和したＭｇ２＋イオンを刺激し、隣接するリン酸と水素結合を形成することだけができる。
８に対する活性の低下は、アミンのｐＫａの予想される上昇に起因し得、これにより、プロトン移動反応において機能する能力に影響を及ぼし得る。８で観察される活性の低下は、アミンのｐＫａの変化に起因し得るか、または分子認識接触の破壊に少なくとも部分的に起因し得る。ＧｌｃＮ６Ｐは、ＲＮＡ切断に対するコファクターとして機能し得（Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００４）、プロトン移動を補助するためにおそらく小分子を使用する核酸酵素は、以前に同定されている。ＲＮＡのリガンド誘導型の形状に変化がないこと（Ｒｏｔｈ １９９８）と様々なリガンドアナログを使用することによって生じたｐＨプロファイルの変化（ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）との両方によって、ＧｌｃＮ６Ｐが反応の化学的な工程に直接関与することが示される。
ＧｌｃＮ６Ｐのアミン基が、リボザイム活性部位において重要な部分である場合、このデータに対する最も簡潔な説明は、そのリガンドが通常の塩基触媒として機能するという説明である。ｐＨが大きくなるにつれてリボザイム活性に対するｋｏｂｓの対数は、傾きが１の直線で増加する。さらに、アミン基についてより高いｐＫａ値を示すＧｌｃＮ６Ｐアナログは、それほど効率的でないリボザイム活性のインデューサー（８）であるか、または最大半量のリボザイム活性に達するために必要なｐＨの上昇を示す（ＭｃＣａｒｔｈｙ ２００５）。他の一層複雑なメカニズムがありうるが、このリボザイムは、不安定なヌクレオチド間結合における２’−ヒドロキシル基の脱プロトン化を補助するためにＧｌｃＮ６Ｐを使用することができる（Ｒｏｔｈ ２００６）。
他のリボスイッチクラスの分子認識の特徴に関する以前の研究から、高レベルの分子識別が、天然のリガンド結合ＲＮＡによって達成され得ることが明らかになっている（Ｌｉｍ ２００６）。ｇｌｍＳリボザイム切断を効率的かつ選択的に誘発するアナログは、病原性の細菌においてＧｌｍＳ代謝性酵素の発現を乱すために使用され得、これによって、それらの正常な細胞機能が破壊され得る。
実験の項
Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来のｇｌｍＳリボザイム（図１ａ）を、以前に報告されているように（Ｒｏｔｈ ２００６）インビトロにおける転写によって作製し、５’−３２Ｐ−放射標識し（Ｌｉｍ ２００６）、そしてＰＡＧＥによって精製した。反応混合物がＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の代わりに５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（２３℃においてｐＨ７．５）を含んでいることを除いて、以前に報告されたもの（Ｒｏｔｈ ２００６）と同様の方法および反応条件を使用して、速度定数を確定した。使用されたリガンド濃度およびインキュベート時間は、各アッセイについて規定される。Ｔｙｐｈｏｏｎ撮像装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、切断されたＲＮＡおよび切断されていないＲＮＡの量を定量することによってリボザイム活性を確定した。
全般的な方法：別段述べられない限り、市販業者から入手した試薬をさらに精製せずに使用した。熱伝式毛細管融点装置（Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて融点を測定し、報告される値は補正していない。ＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃおよび３１Ｐ）スペクトルを、Ｄ２Ｏ（１Ｈに対して４．７９ｐｐｍ）またはＣＤＣｌ３（１Ｈに対して７．２７ｐｐｍおよび１３Ｃに対して７７．０ｐｐｍ）を基準にして、記述されているように記録した（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−４００ＭＨｚまたはＢｒｕｋｅｒ Ａｄｖａｎｃｅ ＤＲＸ−５００ＭＨｚ）。Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０ Ｆ２５４プレートを使用して、分析用薄層クロマトグラフィを行った。ニンヒドリン溶液中にプレートを浸漬し、加熱することによって、ＵＶ不活性化合物を可視化した。合成ＤＮＡをＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）のＨＨＭＩ Ｋｅｃｋ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから購入した。
材料：以下の化合物または試薬は、示される供給源から市販されている：Ｄ−（＋）−グルコサミン塩酸塩、Ｄ−グルコース６−リン酸、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のヘキソキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸、Ｄ−マンノサミン塩酸塩、Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩、２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース１，３，４，６−四酢酸、２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシルクロリド、塩化ホスホリル、塩化チオホスホリル、アデノシン５’−三リン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）；１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アミノ−２−デスオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース塩酸塩（Ｏａｋｗｏｏｄ）；２−デオキシ−２−（トリメチルアンモニオ）−Ｄ−グルコース（Ｔｉｍｔｅｃ）。以下に記載されるような本研究のために合成された化合物としては、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルシトール−６−リン酸（Ｂｅａｒｎｅ １９９６）２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンノース６−リン酸（Ｌｉｕ ２００１）２−デオキシ−２−アミノ−Ｄ−アロース（Ｊｅａｎｉｏｚ １９５７）、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｄ−グルコース（Ｇｏｒｉｎ １９７１）、２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２−デオキシグルシトール塩酸塩（Ｓｃｈａｅｆｅｒ １９９８）、メチル２−アミノ−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコース６−リン酸（Ｏｈｎｏ １９８１）、メチル２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース６−リン酸（Ｏｈｎｏ １９８１）および２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース６−リン酸（Ｄｉｓｔｌｅｒ １９５８）が挙げられる。
２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−（トリメチルシリル）−α−Ｄ−グルコピラノース。２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−（トリメチルシリル）−α−Ｄ−グルコピラノースをＧａｕｔｈｅｒｏｎの手順の変法（Ａｕｇｅ １９９８）によって調製し、Ｄ−グルコサミン塩酸塩（１．０ｇ，４．６４ｍｍｏｌ）を４５ｍＬのピリジンに溶解し、７．０ｍＬ（３３．３９ｍｍｏｌ）のヘキサメチルジシラザンおよび３．５ｍＬ（２７．８２ｍｍｏｌ）のクロロトリメチルシランで処理した。その混合物を３時間６０℃で加熱し、濾過した。その濾液をｎ−ヘキサンと水との間で分割させ、有機相を分離した。水相をｎ−ヘキサンで抽出し、併せた有機相を１Ｎ ＨＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして真空中で濃縮することにより、所望の生成物を黄白色の固体として得た。１００％収率；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ５．１０（ｄ，１ Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１−Ｈ），３．６８（ｍ，３Ｈ，３−，４−および５−Ｈ），３．４９（ｍ，２Ｈ，６−Ｈ），２．５１（ｄｄ，１Ｈ，２−Ｈ），０．０−０．２（ｓ，３６Ｈ，４（ＣＨ３）３Ｓｉ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ９５．０，７７．９，７３．３，７２．４，６２．４，５７．８，１．７，１．２，０．３，０．１；ＩＲ（ニート，ｃｍ−１）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ４６８．０（［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１８Ｈ４５ＮＯ５Ｓｉ４ 計算値４６７．９）。
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 ２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース６−チオリン酸。２ｍＬのトルエンおよび１４０μＬ（１．６８ｍｍｏｌ）のピリジン中の２−アミノ−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−（トリメチルシリル）−α−Ｄ−グルコピラノース（３５７ｍｇ，０．７６ｍｍｏｌ）の混合物に、塩化チオホスホリル（１５８μＬ，１．５３ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を３０℃で１６時間加熱した。その混合物を濃縮し、エタノールに溶解し、次いで、真空中で共蒸発させた。粗混合物を水で処理し、６０℃で１６時間加熱した後、濃縮した。その残渣を水とともに３回共蒸発させた。エタノールおよびジエチルエーテルを用いて結晶化することにより、所望の生成物を白色固体として得た。ｍｐ１８５−１８７℃ 分解；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ；１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）δ；３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１６２ＭＨｚ）δ４１．９；ＩＲ（ニート，ｃｍ−１）３３６３，１０２８，７２２；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ２７５．１（［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ６Ｈ１４ＮＯ７ＰＳ 計算値２７５．２）。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅヘキソキナーゼによる酵素的なリン酸化に対する全般的な手順。この手順は、本質的にはＬｉｕおよびＬｅｅ（２００１）の手順に基づくものであり、ヘキソサミン塩酸塩（２．００ｍｍｏｌ）、塩化マグネシウム六水和物（１．４０ｍｍｏｌ）およびアデノシン５’−三リン酸（２．２０ｍｍｏｌ）を５４ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液を、０．５Ｎ ＫＯＨを用いてｐＨ７．５に調整し、１．０ｍＬの水に溶解したヘキソキナーゼ（１３２０Ｕ）を加えた。反応混合物を周囲温度において２〜３時間にわたって連続して撹拌した。この反応の間、半時間ごとに０．５Ｎ ＫＯＨを加えることによってｐＨが安定するようになるまでこの溶液のｐＨを７．５に維持した。ＴＬＣ（２：１：１のｎ−ＢｕＯＨ−ＨＯＡｃ−Ｈ２Ｏ）は、出発物質が完全に消失し、新しい化合物がニンヒドリン陽性かつＵＶ陰性のスポットとして現れたことを示した。次いで、濃塩酸を加えることによって、その混合物をｐＨ２．０に調整し、その３分の１量をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ×８（Ｈ＋，２００−４００メッシュ）陽イオン交換樹脂のカラム（２．５×２５ｃｍ）に充填した。そのカラムを水で溶出し、直ちに主要な陰イオンを溶出した後、ヘキソサミン６−リン酸を溶出した。所望の生成物を含んでいる画分をプールし、４５℃未満でロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、次いで、凍結乾燥することにより、生成物を得た。
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 ２−アミノ−１，５−アンヒドロ−２−デオキシグルシトール６−リン酸。２−デオキシ−１，５−アンヒドロ−２−デオキシグルシトール６−リン酸をＬｉｕおよびＬｅｅ（２００１）の手順によって調製した。ｍｐ１８５−１８７℃ 分解；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ４．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１），３．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６），３．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６），３．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３），３．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１），３．２９（ｍ，２Ｈ，Ｈ４ ＆ Ｈ−５），３．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２）；１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）δ８１．０，７４．６，７０．２，６６．４，６１．１，５１．９；３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１６２ＭＨｚ）δ４．１０；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ２４３．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ６Ｈ１４ＮＯ７Ｐの計算値２４３．２）。
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 ２−メチルアミノ−２−デオキシグルコース６−リン酸。２−メチルアミノ−２−デオキシグルコース６−リン酸をＬｉｕおよびＬｅｅ（２００１）の手順によって調製した。ｍｐ １８５−１８７℃ 分解；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ５．２１（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），４．０５（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），３．６７（ｍ，３Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ＆５−Ｈ）３．３４（ｍ，２Ｈ，６−Ｈ），３．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２）；１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）δ９３．２，８９．６，７２．２，７１．１，６９．５，６４．１，５４．６；３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１６２ＭＨｚ）δ４．５９；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ２７３．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ７Ｈ１６ＮＯ８Ｐの計算値２７３．２）。
Figure 2010503619
 ２−アミノ−２−デオキシアロース６−リン酸。２−アミノ−２−デオキシアロース６−リン酸をＬｉｕおよびＬｅｅ［２］の手順によって調製した。ｍｐ１８５−１８７ ℃ 分解；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１β），４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１α），４．０４（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４＆Ｈ−５），３．５０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６），３．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２）；１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）δ９１．２，８８．６，７０．５，６８．５，６３．４，５８．１；３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１６２ＭＨｚ）δ４．３８；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ２５９．１（［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ６Ｈ１４ＮＯ８Ｐの計算値２５９．２）。
Figure 2010503619
 ２−（トリメチルアンモニオ）−２−デオキシグルコース６−リン酸。２−（トリメチルアンモニオ）−２−デオキシ−グルコース６−リン酸をＤｉｓｔｌｅｒ（１９５８）の手順によって調製した。ｍｐ１８５−１８７℃ 分解；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ５．２４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１），３．５５（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４＆Ｈ−５），３．５０（ｓ，９Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）３），３．１４（ｓ，２Ｈ，Ｈ−６）；１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）δ９５．６，９１．８，７５．５，７４．０，７１．２，６９．４；３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１６２ＭＨｚ）δ３．４０；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ３０３．１（［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ９Ｈ２１ＮＯ８Ｐの計算値３０２．２）。
Figure 2010503619
 １−アミノ−１−デオキシ６−リン酸。１−アミノ−１−デオキシグルコース６−リン酸をＧａｌｌｏｐの手順の変法（Ｖｅｔｔｅｒ １９９５）によって調製した。飽和炭酸アンモニウム水溶液中のＤ−グルコース６−リン酸の溶液を、５日間室温において撹拌した。その反応の経過中に、固体の炭酸アンモニウムを分けて加えることにより、確実に飽和にした。その混合物をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ×８（Ｈ＋，２００−４００メッシュ）陽イオン交換樹脂のカラム（２．５×２５ｃｍ）に充填した。そのカラムを水で溶出し、直ちに主要な陰イオンを溶出した後、ヘキソサミン６−リン酸を溶出した。所望の生成物を含んでいる画分をプールし、４５℃未満のロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、次いで、凍結乾燥することにより、生成物を得た。ｍｐ１８５−１８７℃ 分解；１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１β），４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１α），４．０４（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４＆Ｈ−５），３．５０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６），３．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２）；１３Ｃ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）δ９５．６，９１．８，７５．５，７４．０，７１．２，６９．４；３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１６２ＭＨｚ）δ３．４０；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｅ ２５９．１（［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ６Ｈ１４ＮＯ８Ｐの計算値２５９．２）。
表２．ｇｌｍＳリボスイッチの原子座標
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 開示される方法および組成物は、記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬が変更され得るように、これらに限定されないことが理解される。本明細書中において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定すると意図されないこともまた理解されるべきである。
本明細書中で使用されるとき、そして添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のものを示していない限り、複数の言及物を包含することに注意されなければならない。従って、例えば、「リボスイッチ（ａ ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ）」という言及は、複数のそのようなリボスイッチを包含し、「その（上記）リボスイッチ（ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ）」という言及は、１つ以上のリボスイッチおよび当業者に公知のその均等物に対する言及などである。
「任意の」または「任意に」とは、それに続いて記載される事象、状況または材料が、起きてもよいし、起きなくてもよいか、または存在してもよいし、存在しなくてもよいこと、ならびに、その記載が、その事象、状況または材料が、起きる場合または存在する場合、およびそれが起きない場合または存在しない場合を包含することを意味する。
本明細書中において、範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、と表現され得る。そのような範囲が表されるとき、文脈が明確に別のことを示していない限り、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までの範囲もまた具体的に企図され、開示されると考えられる。同様に、文脈が明確に別のことを示していない限り、値が先行詞「約」を使用することによって近似として表されるとき、その特定の値が、開示されると考えられるべき別の具体的に企図される実施形態を形成すると理解される。文脈が明確に別のことを示していない限り、範囲の各終点は、他の終点に関して、および他の終点とは無関係に、の両方において重要であることがさらに理解される。最後に、明示的に開示される範囲内に含まれる個別の値のすべておよび値の部分的な範囲もまた、文脈が明確に別のことを示していない限り、具体的に企図され、開示されると考えられるべきであると理解されるべきである。前述のことは、特定の場合において、これらの実施形態の一部または全部が明示的に開示されるか否かに関係なく適用される。
別段定義されない限り、本明細書中において使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示される方法および組成物が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料が、本方法および本組成物の実施または試験において使用され得るが、特に有用な方法、デバイスおよび材料は、記載されたものである。本明細書中において引用された刊行物およびそれらが引用しているものは、本明細書に明確に参考として援用される。本発明が、先願発明という理由でそのような開示に先行する権利はないという承諾として解釈されるべきものは、本明細書中には一切存在しない。任意の参考文献が従来技術とみなされるという承諾をしない。参考文献における議論は、それらの参考文献の著者が断言していることを述べているにすぎず、本出願人は、引用された文献の正確性および妥当性に異議を唱える権利を留保する。多くの刊行物が、本明細書中で参照されているが、そのような参考文献は、これらの文献のいずれかが、当該分野における通常の一般的な知識の一部を形成するという承諾としてみなされないことが、明白に理解される。
本明細書の記載および特許請求の範囲の全体を通じて、単語「〜を含む（包含する）（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその単語の変化形（例えば、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、「〜が挙げられるがこれらに限定されない」を意味し、例えば、他の追加物、構成要素、整数または工程を排除すると意図されない。
当業者は、本明細書中に記載される方法および組成物の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または単なる通例の実験を使用して確かめることができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されると意図される。
（参考文献）
Figure 2010503619

Claims (59)

  1. 遺伝子発現を阻害する方法であって、該方法は、
    （ａ）化合物と細胞とを接触させる工程を包含し、
    （ｂ）ここで、該化合物は、式Ｉ：
    Figure 2010503619
     の構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容可能な塩、その生理学的に加水分解可能かつ許容可能なエステルもしくはその両方であり、
    ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、
    Ｒ２は、ＮＨ−Ｒ６であり、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）イソ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＮＨ２であり、
    Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、
    Ｒ４は、水素結合供与体であり、
    Ｒ５は、水素結合受容体であり、
    該化合物は、グルコサミン−６−リン酸ではなく、
    該細胞は、ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物は、該ｇｌｍＳリボスイッチに結合することによって該遺伝子の発現を阻害する、方法。
  2. Ｒ４が、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ３＋、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨアルキル、＝ＮＨ、＝ＮＯＨ、＝ＮＳＨ、＝ＮＣＯ２Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ＝ＮＨ、ＣＨ＝ＮＯＨ、ＣＨ＝ＮＳＨ、ＣＨ＝ＮＣＯ２Ｈ、ＯＣＨ２ＯＨ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＰｈＯＨ、ＮＨアルキル、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨアルキル、ＮＨＣＯアルキル、ＮＨＣＯ２アルキル、ＮＨＣＯＮＨ２、ＮＨＳＯ２アルキルまたはＮＨＯアルキルである、請求項１に記載の方法。
  3. Ｒ１がＨまたはＯＨであるときＲ４はＯＨではなく、そしてＲ２はＮＨ２またはＮＨＣＨ３である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
  4. Ｒ５が、ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｓ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）ＯＨＳＨ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. Ｒ５が、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. Ｒ５が、負に帯電している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. Ｒ５が、＝Ｏ、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、
    Ｒ９が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である、
    請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. Ｒ５が、＝Ｏ、ＯＨ、ＯＲ９、ＣＯＲ９、ＣＮ、ＮＯ２、テトラゾール、ＳＯＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、
    Ｒ９が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である、
    請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. Ｒ４が、ＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. Ｒ４が、ＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記細胞が、遺伝子発現が阻害される必要があると同定されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記細胞が、細菌細胞である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記化合物が、前記細菌細胞を殺滅するか、または該細菌細胞の成長を阻害する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記化合物と前記細胞とが、該化合物を対象に投与することによって接触する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記化合物が、基質としてグルコサミン−６−リン酸を有する前記対象の酵素に対する基質ではない、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記化合物が、グルコサミン−６−リン酸を変化させる前記対象の酵素に対する基質ではない、請求項１４または１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記化合物が、グルコサミン−６−リン酸を代謝する前記対象の酵素に対する基質ではない、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記化合物が、グルコサミン−６−リン酸を異化する前記対象の酵素に対する基質ではない、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記細胞が、前記対象内の細菌細胞であり、前記化合物が、該細菌細胞を殺滅するか、または該細菌細胞の成長を阻害する、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記対象が、細菌に感染している、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記細胞が、ｇｌｍＳリボスイッチを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 前記細菌が、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである、請求項１２、１３または１９〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記化合物が、別の抗菌化合物と組み合わせて投与される、請求項１４〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記化合物が、バイオフィルムにおける細菌の成長を阻害する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 式Ｉ：
    Figure 2010503619
     の構造を有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩、その生理学的に加水分解可能かつ許容可能なエステルまたはその両方であって、
    ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、
    Ｒ２は、ＮＨ−Ｒ６であり、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ｎ−プロピル、Ｃ（Ｏ）イソ−プロピル、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２またはＮＨ２であり、
    Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２またはＣＨ３であり、
    Ｒ４は、水素結合供与体であり、
    Ｒ５は、水素結合受容体であり、
    該化合物は、グルコサミン−６−リン酸ではない、
    化合物またはその薬学的に許容可能な塩、その生理学的に加水分解可能かつ許容可能なエステルまたはその両方。
  26. Ｒ４が、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ３＋、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨアルキル、＝ＮＨ、＝ＮＯＨ、＝ＮＳＨ、＝ＮＣＯ２Ｈ、＝ＣＨ２、ＣＨ＝ＮＨ、ＣＨ＝ＮＯＨ、ＣＨ＝ＮＳＨ、ＣＨ＝ＮＣＯ２Ｈ、ＯＣＨ２ＯＨ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＰｈＯＨ、ＮＨアルキル、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨアルキル、ＮＨＣＯアルキル、ＮＨＣＯ２アルキル、ＮＨＣＯＮＨ２、ＮＨＳＯ２アルキルまたはＮＨＯアルキルである、請求項２５に記載の化合物。
  27. Ｒ１がＨまたはＯＨであるときＲ４はＯＨではなく、そしてＲ２がＮＨ２またはＮＨＣＨ３である、請求項２５または２６のいずれかに記載の化合物。
  28. Ｒ５がＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｓ）（ＯＨ）２、ＯＰ（Ｏ）ＯＨＳＨ、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである、請求項２５〜２７のいずれかに記載の化合物。
  29. Ｒ５が、ＯＳ（Ｏ）２ＯＨまたはＯＳ（Ｏ）２ＳＨである、請求項２５〜２８のいずれかに記載の化合物。
  30. Ｒ５が、負に帯電している、請求項２５〜２９のいずれかに記載の化合物。
  31. Ｒ５が、＝Ｏ、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、
    Ｒ９が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である、
    請求項２５〜３０のいずれかに記載の化合物。
  32. Ｒ５が、＝Ｏ、ＯＨ、ＯＲ９、ＣＯＲ９、ＣＮ、ＮＯ２、テトラゾール、ＳＯＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、ＣＯ２Ｒ９、ＯＣＯ２Ｒ９、ＯＣＨ２ＯＲ９、ＯＣ２Ｈ５ＯＲ９、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＯＣＯＮＨＲ９、ＯＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＲ９、ＣＯＮ（Ｒ９）２、ＣＯＮＨＣＨ３ＯＣＨ３、ＣＯＮＨＳＯ２ＯＨ、ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ９、ＳＯ２Ｒ９、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２ＮＨＲ９、ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、ＰＯ（Ｒ９）２、ＰＯ２（Ｒ９）２、ＰＯ（ＯＲ９）２、ＰＯ２（ＯＨ）Ｒ９、ＰＯ２Ｒ９Ｎ（Ｒ９）２、ＮＨＣＨ（ＮＲ９）２、ＮＨＣＯＲ９、ＮＨＣＯ２Ｒ９、ＮＨＣＯＮＨＲ９、ＮＨＣＯＮ（Ｒ９）２、ＮＨＣＯＮＨＲ９、Ｎ（ＣＯＲ９）２、Ｎ（ＣＯ２Ｒ９）２、ＮＨＳＯ２Ｒ９、ＮＲ９ＳＯ２Ｒ９、ＮＨＳＯ２ＮＨＲ９、ＮＲ９ＳＯ２ＮＨ２、ＮＨＰＯ（Ｒ９）２、ＮＲ９ＰＯ（Ｒ９）２、ＮＨＰＯ２ＯＲ９またはＢ（ＯＨ２）２であり、
    Ｒ９が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ３）３または−ＣＦ３である、
    請求項２５〜３１のいずれかに記載の化合物。
  33. Ｒ４が、ＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである、請求項２５〜３２のいずれかに記載の化合物。
  34. Ｒ４が、ＮＨ２、ＮＨ３ ＋、ＳＨ、ＮＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＨ３ ＋、ＣＯ２Ｈ、ＳＯ２ＯＨ、Ｂ（ＯＨ）２またはイミダゾリウムである、請求項２５〜３３のいずれかに記載の化合物。
  35. 前記化合物が、ｇｌｍＳリボスイッチに結合する、請求項２５〜３４のいずれかに記載の化合物。
  36. 前記化合物が、ｇｌｍＳリボスイッチを活性化する、請求項２５〜３５のいずれかに記載の化合物。
  37. 前記化合物が、ｇｌｍＳリボスイッチに結合されている、請求項２５〜３６のいずれかに記載の化合物。
  38. 請求項２５〜３７のいずれかに記載の化合物、およびコード領域に作動可能に連結されたｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含んでいる調節可能な遺伝子発現構築物を含む組成物であって、ここで、該ｇｌｍＳリボスイッチは、該ＲＮＡの発現を調節し、該ｇｌｍＳリボスイッチおよびコード領域は、異種性である、組成物。
  39. 前記ｇｌｍＳリボスイッチが、前記化合物によって活性化されたときにシグナルを生成する、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記リボスイッチが、前記化合物によって活性化されたときに立体配座を変化させ、該立体配座の変化は、立体配座依存性標識を介してシグナルを生成する、請求項３８または３９のいずれかに記載の組成物。
  41. 前記リボスイッチが、前記化合物によって活性化されたときに立体配座を変化させ、該立体配座の変化が、該リボスイッチに連結されたコード領域の発現の変化を引き起こし、該発現の変化が、シグナルを生成する、請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物。
  42. 前記シグナルが、前記リボスイッチに連結されたコード領域から発現されるレポータータンパク質によって生成される、請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物。
  43. （ａ）請求項２５〜４２のいずれかに記載の化合物を、ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について試験する工程であって、該阻害は、該ｇｌｍＳリボスイッチを介するものである工程、
    （ｂ）細胞と、工程（ａ）において遺伝子発現を阻害した化合物とを接触させることによって遺伝子発現を阻害する工程
    を包含する方法であって、
    ここで、該細胞は、該ｇｌｍＳリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物は、該ｇｌｍＳリボスイッチに結合することによって該遺伝子の発現を阻害する、方法。
  44. 表２に列挙される原子座標を含む原子構造を含む天然のｇｌｍＳ応答性リボスイッチの原子構造。
  45. 結合ポケット原子構造を含む原子構造を含む天然のｇｌｍＳ応答性リボスイッチの原子構造。
  46. リボスイッチと相互作用する化合物を同定する方法であって：
    （ａ）試験化合物を用いて請求項４４または４５のいずれかに記載の原子構造をモデル化する工程；および
    （ｂ）該試験化合物が該リボスイッチと相互作用するかを判定する工程
    を包含する、方法。
  47. 前記試験化合物が前記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程が、該リボスイッチのモデルにおいて該試験化合物に対する、予測される最小の相互作用エネルギー、予測される結合定数、予測される解離定数または組み合わせを決定する工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記試験化合物が前記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程が、該リボスイッチのモデルを用いて、該試験化合物の、１つ以上の予測される結合、１つ以上の予測される相互作用または組み合わせを測定する工程を包含する、請求項４６または４７のいずれかに記載の方法。
  49. 原子の接触が工程（ｂ）において判定されることによって、前記試験化合物と前記リボスイッチとの相互作用を判定する、請求項４６〜４８のいずれかに記載の方法。
  50. （ｃ）前記試験化合物のアナログを同定する工程；
    （ｄ）該試験化合物の該アナログが前記リボスイッチと相互作用するかを判定する工程
    をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
  51. 細菌を殺滅するか、または細菌の成長を阻害する方法であって、該細菌と、請求項５０に記載の方法によって同定されたアナログとを接触させる工程を包含する、方法。
  52. 細菌を殺滅するか、または細菌の成長を阻害する方法であって、該細菌と、請求項４６〜５１のいずれかに記載の方法によって同定された化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
  53. 前記試験化合物が前記リボスイッチと相互作用するかを判定するためにゲルベースのアッセイが使用される、請求項４６〜５２のいずれかに記載の方法。
  54. 前記試験化合物が前記リボスイッチと相互作用するかを判定するためにチップベースのアッセイが使用される、請求項４６〜５３のいずれかに記載の方法。
  55. 前記試験化合物が、ファンデルワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用または組み合わせを介して相互作用する、請求項４６〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 前記リボスイッチが、ＲＮＡ切断リボザイムを含む、請求項４６〜５５のいずれかに記載の方法。
  57. クエンチング部分を含む核酸が切断されたときに、蛍光シグナルが生成される、請求項４６〜５６のいずれかに記載の方法。
  58. 前記蛍光シグナルを生成するために分子ビーコン技術が使用される、請求項４６〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. 前記方法が、ハイスループットスクリーニングを使用して行われる、請求項４６〜５８のいずれかに記載の方法。
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