CN107760643B - 一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于基因工程技术领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌(SGN6‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1)作为出发菌株，通过同源重组将glmS核酶分别整合至glmM基因和pfkA基因的rbs序列与其启动子序列中间，利用glmS核酶突变体具有延长mRNA的稳定性，将其整合至pgi基因的rbs序列与启动子序列之间，使重组表达后的菌株乙酰氨基葡萄糖的产量达到11.79～20.05g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。以往构建的重组枯草芽孢杆菌(S5-PxylA-glmS-P43-GNA1)在发酵培养基中乙酰氨基葡萄糖产率相对较低。
已有研究表明，6-磷酸果糖在GlmS的催化作用下生成6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)的过程受到由glmS核酶开关介导的严格反馈控制，该步是GlcNAc合成途径中的重要限速反应，具体调控过程如下：当胞内GlcN6P积累时，其能够与glmS核酶开关结合，激活核酶开关对glmS基因转录产物进行自切割；3’端mRNA切割部分因切割形成的5’-OH端被RNA酶J1特异性识别，在RNA酶J1作用下mRNA被进一步降解，造成glmS基因的mRNA无法翻译，降低glmS基因的表达；而当GlcN6P浓度较低时，glmS基因转录产物可正常翻译。但是，当glmS核酶的断裂位点由AG突变为CC碱基，其断裂活性明显下降，其转录产物半衰期明显增强，gmS核酶突变体(断裂位点AG突变为CC)能够增强报告基因GFP的表达。在B.subtilis中GlcNAc代谢网络可以分为GlcNAc合成模块、中心代谢模块(6-磷酸果糖激酶PFK是该模块关键酶)和肽聚糖合成模块(磷酸氨基葡萄糖变位酶GlmM是该模块关键酶)，而中心代谢模块和肽聚糖合成模块是GlcNAc合成模块的竞争模块。要实现GlcNAc的高效合成，需要在强化GlcNAc合成模块的同时弱化中心代谢模块和肽聚糖合成模块，而由于中心代谢模块和肽聚糖合成模块是细胞生长所必须的，只能在细胞生长过程中进行弱化表达。目前，常用的弱化基因表达的策略主要是启动子工程、RBS工程和基因敲除；但是这些策略通常会产生一些不良性状，如中间产物抑制，积累毒性代谢中间产物，目的产物合成效率低，影响细胞生长等。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种产乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，该基因工程菌利用glmS核酶和/或其突变体调控基因表达；所述调控基因表达是抑制glmM和pfkA基因的表达，并增强pgi基因的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述调控基因表达是在高浓度GlcN6P的情况下，加快glmS核酶断裂速度，增强对pfkA和glmM抑制效果；在低浓度GlcN6P的情况下，减弱glmS核酶激活效果，使glmS核酶断裂速度变慢，减弱pfkA和glmM的抑制效果。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，并将编码glmS核酶突变体的基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis 168。
在本发明的一种实施方式中，所述编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因序列如Gene ID:8302932所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码glmS核酶突变体的基因序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组枯草芽孢杆菌S5-PxylA-glmS-P43-GNA1氨基葡萄糖合成酶基因glmS的核酶编码基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间；同时将glmS核酶突变体编码基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间构建而成的重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：(1)构建氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因整合框，通过同源重组将敲除框(glmM上游同源臂-筛选标记spc基因片段-glmS核酶基因片段-glmM下游同源臂)中的壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶编码基因插入到重组枯草芽孢杆菌基因组中氨基葡萄糖磷酸变位酶(glmM)基因的rbs序列与启动子序列之间；(2)通过同源重组将敲除框(pfkA上游同源臂-筛选标记spc基因片段-glmS核酶基因片段-pfkA下游同源臂)中的壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶编码基因插入到重组枯草芽孢杆菌基因组中6-磷酸果糖激酶(pfkA)基因的rbs序列与启动子序列之间；(3)构建氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶突变体-编码基因整合框，通过同源重组将敲除框(pgi上游同源臂-筛选标记spc基因片段-glmS核酶基因片段-pgi下游同源臂)中的壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶突变体编码基因插入到重组枯草芽孢杆菌基因组中葡萄糖磷酸异构酶(pgi)基因的rbs序列与启动子序列之间。
本发明的第三个目的是提供一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的方法，所述方法是在含有乙酰氨基葡萄糖代谢途径的微生物中，将编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，并将编码glmS核酶突变体的基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间。
在本发明的一种实施方式中，所述编码氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶基因序列如GeneID:8302932所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码glmS核酶突变体的基因序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明的第四个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖的生产方法，是将所述基因工程菌接种至培养基中，于37℃培养72h。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分包括(按g/L计)：葡萄糖100.0，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸铵6，蛋白胨6，酵母粉12.0，硫酸镁3，以及10mL/L的微量元素溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素溶液含有(按g/L计)：硫酸锰1.0，氯化钴0.4，钼酸钠0.2，硫酸锌0.2，氯化铝0.1，氯化铜0.1，硼酸0.05。
本发明还提供所述基因工程菌在生产含乙酰氨基葡萄糖的产品中的应用。
有益效果：本发明，通过氨基葡萄糖-6-磷酸反馈抑制glmS核酶，进而调控glmM和pfkA两个基因的表达，并利用glmS核酶突变体增强pgi基因的表达，实现乙酰氨基葡萄糖产量的提高。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖的产量，其浓度最高可达到20.05g/L，相比于出发菌株提高了63.9％，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
附图说明
图1为利用glmS核酶控制不同代谢位点对细胞生长和GlcNAc产生的影响结果；在发酵培养基中，图1a为不同菌株的细胞生长情况；图1b为不同菌株GlcNAc滴度的比较结果；图1c为不同菌株GlcNAc生产力的比较；
图2为在发酵10h时PFK、GlmM、PGI的酶活和胞内GlcN6P的浓度；其中，图2a为不同菌株的PFK的酶活情况；图2b为不同菌株的GlmM的酶活情况；图2c为不同菌株的PGI的酶活情况；图2d为不同菌株胞内的GlcN6P的含量情况。
具体实施方式
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0、磷酸氢二钾12.5、磷酸二氢钾2.5、硫酸铵6、蛋白胨6、酵母粉12.0、硫酸镁3、10mL/L的微量元素溶液。
微量元素溶液(g/L)：硫酸锰1.0，氯化钴0.4，钼酸钠0.2，硫酸锌0.2，氯化铝0.1，氯化铜0.1，硼酸0.05。
培养条件：将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养72h。
乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖-6-磷酸的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，RID检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。
关键酶的酶活测定方法：PFK的酶活测定方法可参阅文献“Site-directedmutagenesis in Bacillus stearothermophilus fructose-6-phosphate 1-kinase(Journal ofBiology Chemical，264(1989)p131-135)”；GlmM的酶活测定方法可参阅文献“Characterization ofthe essential gene glmMencodingphosphoglucosamine mutaseinEscherichia coli(Journal ofBiology Chemical，271(1996)p32–39)”；PGI的酶活测定方法可参阅文献“Model-driven redox pathway manipulation for improvedisobutanol production inBacillus subtilis complemented with experimentalvalidation and metabolic profiling analysis(PLoSOne，9(2014))”在此不作进一步描述。
实施例1 glmS核酶调控6-磷酸果糖激酶基因pfkA
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因上下游序列，设计扩增引物，
上游引物为：GlmS-F
GCATACATTATACGAACGGTAGAGCTTGTCTTGTTCTTATTTTCTCAATAGG；
下游引物为GlmS-R
TTCTCCATTCACCTCAGCAACAAGATTGTAAAAGGAGACGAAGAAAGTCAAA。
根据已公布6-磷酸果糖激酶基因pfkA上下游序列，设计上下游同源臂扩增引物，
上游同源臂扩增引物为：
pfk-U-F：CGAACACCTGTTTACCGACTT，
pfk-U-R：
GCTATACGAACGGTAGAATCTCCCCTCAGCAACATATATGATTAAACATAACA；
下游同源臂扩增引物为：
pfk-D-F：
TTTGACTTTCTTCGTCTCCTTTTACAATCTTGTTGCTGAGGTGAATGGAGAA，
pfk-D-R：AATACTGTGCTTCTTGCCGCGTT。
壮观霉素抗性基因扩增引物为：
spc1-F：TGTTATGTTTAATCATATATGTTGCTGAGGGGAGATTCTACCGTTCGTATAGC
spc1-R：CCTATTGAGAAAATAAGAACAAGACAAGCTCTACCGTTCGTATAATGTATGC
再利用融合PCR技术，将pfk上游同源臂、壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶编码基因、pfk下游同源臂融合成改造pfk敲除框片段(上游同源臂-spc-glmS核酶-下游同源臂)。
实施例2 glmS核酶调控氨基葡萄糖磷酸变位酶基因glmM
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因上下游序列，设计扩增引物，
上游引物为：GlmS-F：
GCATACATTATACGAACGGTAGAGCTTGTCTTGTTCTTATTTTCTCAATAGG；
下游引物为GlmS-R：
CTTGCCCATTTTATAATCGCTTCCTCCTAAGATTGTAAGATTGTAAAAGGAGACGAAGAAAGTCAAA。
根据NCBI上公布的氨基葡萄糖磷酸变位酶基因glmM上下游序列，设计上下游同源臂扩增引物，
上游同源臂扩增引物为：
glm-U-F：AAATTGAACGGACAGGAAGCC，
glm-U-R：GCTATACGAACGGTAGAATCTCCTTATTCCGATGAGGATTGTG；
下游同源臂扩增引物为：
glm-D-F：
TTTGACTTTCTTCGTCTCCTTTTACAATCTTACAATCTTAGGAGGAAGCGATTATAAAATGGGCAAG，
glm-D-R：CAAGACCGAGATCCGCGTTTTT。
壮观霉素抗性基因扩增引物为：
spc1-F：CACAATCCTCATCGGAATAAGGAGATTCTACCGTTCGTATAGC
spc1-R：
CCTATTGAGAAAATAAGAACAAGACAAGCTCTACCGTTCGTATAATGTATGC
再利用融合PCR技术，将glm上游同源臂、壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶编码基因、glm下游同源臂融合成改造glmM敲除框片段(上游同源臂-spc-glmS核酶-下游同源臂)。
实施例3glmS核酶突变体调控葡萄糖磷酸异构酶基因pgi
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168，购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)氨基葡萄糖合成酶基因glmS核酶编码基因上下游序列，设计扩增glmS核酶突变体(断裂位点AG突变为CC)引物，
上游引物为：GlmS-F：
GCATACATTATACGAACGGTAGGCTTTACCTATAATTATCCCGCCCG；
下游引物为GlmS-R：
GTCATTGCTTGTCCCTCCATAACGGACTTTCAATCGTCCCCTCCTACATG。
根据NCBI上公布的葡萄糖磷酸异构酶基因pgi上下游序列，设计上下游同源臂扩增引物，
上游同源臂扩增引物为：
pgi-U-F：GGTTGACATGATGAGCCACGTATTC，
pgi-U-R：
GCTATACGAACGGTAGAATCTCCCCATAACGGTATAATGTTTTCATCTTTCACTTTAT；
下游同源臂扩增引物为：
pgi-D-F：
CATGTAGGAGGGGACGATTGAAAGTCCGTTATGGAGGGACAAGCAATGAC，
pgi-D-R：CTGACAGCAATCGGCAAGAGACCTA。
壮观霉素抗性基因扩增引物为：
spc1-F：
ATAAAGTGAAAGATGAAAACATTATACCGTTATGGGGAGATTCTACCGTTCGTATAGC
spc1-R：CGGGCGGGATAATTATAGGTAAAGCCTACCGTTCGTATAATGTATGC
再利用融合PCR技术，将pgi上游同源臂、壮观霉素抗性基因spc、glmS核酶编码基因、pgi下游同源臂融合成改造pgi敲除框片段。
实施例4重组枯草芽孢杆菌的构建
将实施例1～3构建好的敲除框转化重组枯草芽孢杆菌S5(S5-PxylA-glmS-P43-GNA1)(以下实施例中简称为S5)，重组枯草芽孢杆菌S5是通过以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglmS5’UTR::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达得到。其构建方法参见申请号为WO/2016/015469的专利，在此不作进一步描述。
通过壮观霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、抗性基因消除，验证glmS核酶基因插入6-磷酸果糖激酶基因pfkA区域成功，得到重组枯草芽孢杆菌SF；glmS核酶基因插入氨基葡萄糖磷酸变位酶基因glmM区域，得到重组枯草芽孢杆菌SM；glmS核酶突变体基因插入葡萄糖磷酸异构酶基因pgi区域得到重组枯草芽孢杆菌SI；glmS核酶基因分别插入6-磷酸果糖激酶基因pfkA和氨基葡萄糖磷酸变位酶基因glmM区域得到重组枯草芽孢杆菌SFM；glmS核酶和其突变体基因分别插入6-磷酸果糖激酶基因pfkA和葡萄糖磷酸异构酶基因pgi区域，得到重组枯草芽孢杆菌SFI；glmS核酶和其突变体基因分别插入氨基葡萄糖磷酸变位酶基因glmM和葡萄糖磷酸异构酶基因pgi区域，得到重组枯草芽孢杆菌SMI；glmS核酶基因分别插入6-磷酸果糖激酶基因pfkA和氨基葡萄糖磷酸变位酶基因glmM区域，同时glmS核酶突变体基因插入葡萄糖磷酸异构酶基因pgi区域得到重组枯草芽孢杆菌SFMI。
实施例5发酵生产乙酰氨基葡萄糖
将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养72h。发酵72h，出发菌株S5的乙酰氨基葡萄糖产量达到12.23g/L；重组菌株SI、SF、SM、SFI、SMI、SFM、SFMI的乙酰氨基葡萄糖的产量分别达到12.93、13.27、11.79、13.89、12.27、14.54、20.05g/L(图1所示)。通过glmS核酶多位点控制基因的表达，重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖胞外产量提高了63.9％。
如图1所示，从图中可以看出，本发明重组枯草芽孢杆菌SFMI的GlcNAc的得率0.39g/g葡萄糖，其发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到20.05g/L，分别是出发菌株的2.35倍和163.9％，说明本发明通过glmS核酶多位点调控代谢途径，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。
实施例6关键酶酶活与GlcN6P浓度的关系
将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养。发酵10h，检测胞内GlcN6P的含量和关键酶的酶活。
如图2所示，从图中可以看出，当胞内GlcN6P浓度不断升高，PFK和GlmM的酶活也随着不断下降，这说明，GlcN6P的浓度越高，glmS核酶的调控能力越强，对PFK和GlmM的酶活抑制作用越强。胞内GlcN6P的浓度由6.9mM升高至18.9mM时，PFK的酶活由861.8U/mg下降至173.0U/mg，下降了79.9％；同时GlmM的酶活由157.6U/mg下降至50.6U/mg，下降了67.9％。这说明，胞内GlcN6P的浓度可以调节glmS核酶的酶活，glmS核酶进而调控pfkA和glmM的表达。当glmS核酶突变体插入到SI菌株的pgi基因的mRNA中，PGI的酶活也由原来的180.6U/mg提高至287.6U/mg，当glmS核酶突变体插入到SFMI菌株的pgi基因的mRNA中，PGI的酶活由170.4U/mg提高至202.1U/mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctttaccta taattatccc gcccgaacta agcgcccgga aaaaggctta gttgacgagg 60
atggaggtta tcgaattttc ggcggatgcc tcccggctga gtgtgcagat cacagccgta 120
aggatttctt caaaccaagg gggtgactcc ttgaacaaag agaaatcaca tgatcttcca 180
aaaaacatgt aggaggggac gattgaaagt 210
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcatacatta tacgaacggt agagcttgtc ttgttcttat tttctcaata gg 52
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttctccattc acctcagcaa caagattgta aaaggagacg aagaaagtca aa 52
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgaacacctg tttaccgact t 21
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctatacgaa cggtagaatc tcccctcagc aacatatatg attaaacata aca 53
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttgactttc ttcgtctcct tttacaatct tgttgctgag gtgaatggag aa 52
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aatactgtgc ttcttgccgc gtt 23
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgttatgttt aatcatatat gttgctgagg ggagattcta ccgttcgtat agc 53
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cctattgaga aaataagaac aagacaagct ctaccgttcg tataatgtat gc 52
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcatacatta tacgaacggt agagcttgtc ttgttcttat tttctcaata gg 52
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttgcccatt ttataatcgc ttcctcctaa gattgtaaga ttgtaaaagg agacgaagaa 60
agtcaaa 67
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaattgaacg gacaggaagc c 21
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gctatacgaa cggtagaatc tccttattcc gatgaggatt gtg 43
<210> 14
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tttgactttc ttcgtctcct tttacaatct tacaatctta ggaggaagcg attataaaat 60
gggcaag 67
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caagaccgag atccgcgttt tt 22
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cacaatcctc atcggaataa ggagattcta ccgttcgtat agc 43
<210> 17
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cctattgaga aaataagaac aagacaagct ctaccgttcg tataatgtat gc 52
<210> 18
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcatacatta tacgaacggt aggctttacc tataattatc ccgcccg 47
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtcattgctt gtccctccat aacggacttt caatcgtccc ctcctacatg 50
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggttgacatg atgagccacg tattc 25
<210> 21
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctatacgaa cggtagaatc tccccataac ggtataatgt tttcatcttt cactttat 58
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
catgtaggag gggacgattg aaagtccgtt atggagggac aagcaatgac 50
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctgacagcaa tcggcaagag accta 25
<210> 24
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ataaagtgaa agatgaaaac attataccgt tatggggaga ttctaccgtt cgtatagc 58
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cgggcgggat aattataggt aaagcctacc gttcgtataa tgtatgc 47

Claims (8)

1.一种产乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌以合成乙酰氨基葡萄糖的菌株为出发菌株，将编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，并将编码glmS核酶突变体的基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间以调控基因表达；所述调控基因表达是抑制glmM和pfkA基因的表达，并增强pgi基因的表达；编码glmS核酶突变体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，glmS核酶基因的核苷酸序列如GeneID:8302932所示。
3.根据权利要求1-2任一所述的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主细胞。
4.一种构建权利要求3所述基因工程菌的方法，其特征在于，通过同源重组将重组枯草芽孢杆菌氨基葡萄糖合成酶基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，同时将glmS核酶突变体编码基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间。
5.一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的方法，其特征在于，在含有乙酰氨基葡萄糖代谢途径的微生物中，将编码氨基葡萄糖合成酶的基因glmS的核酶基因分别插入到glmM、pfkA基因的rbs序列和启动子序列之间，并将编码glmS核酶突变体的基因插入到pgi基因的rbs序列和启动子序列之间；编码glmS核酶突变体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，glmS核酶基因的核苷酸序列如Gene ID:8302932所示。
7.一种乙酰氨基葡萄糖的生产方法，其特征在于，是将权利要求1-3任一所述的基因工程菌接种至培养基中，于35～37℃培养48～144h。
8.权利要求1-3任一所述的基因工程菌在生产含乙酰氨基葡萄糖的产品中的应用。
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