CN113493760B - 一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用 - Google Patents

一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物合成2‑苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用，构建方法包括，敲除所述受体菌的cg0641基因或抑制所述cg0641基因的表达或抑制所述cg0641基因编码的蛋白质的活性，获得突变株PE1；增加所述突变株PE1中酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强所述酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE2；增加所述突变株PE2中酪氨酸转氨酶编码基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强转氨酶基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE3。本发明所构建的高产2‑苯乙醇的谷氨酸棒杆菌安全，且克服了现有的菌株生产效率低、耐受性缺陷等缺点，该菌株可以利用葡萄糖和秸秆水解液好氧发酵生产2‑苯乙醇，发酵产量达到5.3g/L。

Description

一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用。
背景技术
2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香味的芳香醇,在化妆品、食品和医药等领域有着广泛的应用。目前，生产2-苯乙醇的方法有化学合成法、植物提取法和生物合成法。化学合成法以石油基苯或苯乙烯为原料，不但原料具有致癌风险，而且产物中常含有一些难以去除的副产物，严重影响产品质量，从而限制其使用范围；植物提取法和生物合成法生产的2-苯乙醇具有很好的生物安全性，且被认定为“天然”级，因此市场需求量日益增加。然而，从植物中提取2-苯乙醇生产周期长、成本高，无法进行大规模生产，生物合成法作为一种原料可再生和环境友好型的制造方式能从根本上解决化学合成和提取方法的弊端。
目前，能合成2-苯乙醇的微生物细胞工厂主要有两类：第一类是酿酒酵母，另外一类是通过代谢工程改造的大肠杆菌。酿酒酵母生物合成2-苯乙醇主要通过2种途径：艾氏途径和莽草酸途径，艾氏途径合成2-苯乙醇仅需要3步反应，代谢途径短，是提高2-苯乙醇产量的关键途径。然而，酿酒酵母合成2-苯乙醇周期较长，其生产率相对较低，因此，有研究者对生长速度较快、遗传背景清晰的大肠杆菌进行改造用于2-苯乙醇的合成。以E.coliMG1655为出发菌株，共表达芳香族氨基酸转氨酶基因aro8、2-酮酸脱羧酶编码基因kdc和醇脱氢酶编码基因yigB，2-苯乙醇发酵产量提高到0.28g/L。在大肠杆菌中利用谷氨酸脱氢酶设计一个“桥梁”构建辅因子自平衡的细胞工厂，无需外源添加任何辅因子，细胞催化效率提高近4倍，实现了苯丙氨酸高效转化为2-苯乙醇。尽管多种代谢工程改造策略的应用，2-苯乙醇发酵产量还处于较低水平，这是由于高浓度的2-苯乙醇会抑制菌株的生长。2g/L的2-苯乙醇可以完全抑制大肠杆菌的生长，4g/L的2-苯乙醇几乎完全抑制酿酒酵母的生长。选育或者改造获得耐受性优异的高产细胞工厂是降低生产成本、提高产量的有效途径。
谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业微生物菌种，具有耐受高强度发酵的鲁棒性、环境适应性强等特点，已被广泛用于氨基酸的工业发酵，以及有机酸、核苷酸和醇类等生物基化学品的制造。此外，其对木质纤维素糖化液中芳香族化合物的降解及耐受能力与一般的工业微生物菌种相比有着明显的优势，因此能较好地利用木质纤维素类等可再生原料。目前，利用谷氨酸棒杆菌作为宿主构建细胞工厂生物合成2-苯乙醇还未见报道。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括，
敲除所述受体菌的短链脱氢酶编码基因或抑制所述短链脱氢酶编码基因的表达或抑制所述短链脱氢酶编码基因编码的蛋白质的活性，获得突变株PE1；
增加所述突变株PE1中酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强所述酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE2；
增加所述突变株PE2中转氨酶基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强转氨酶基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE3。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述受体菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 21420。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述短链脱氢酶编码基因，其蛋白质序列如GenBank号：CAF19257.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述酮酸脱羧酶编码基因，其核苷酸序列如GenBank号：NC_001136.10，Gene ID:851987(updated on 6-Jun-2021)。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述酪氨酸转氨酶编码基因，其核苷酸序列如GenBank号：NC_000913.3，Gene ID:948563(updated on 6-May-2021)。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述醇脱氢酶编码基因，其核苷酸序列如GenBank号：NC_000913.3，Gene ID:944975(updated on 6-May-2021)。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述获得突变株PE1的具体方法为，以cg0641a和cg0641b为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC21420的基因组为模板，使用fast Pfu高保真聚合酶扩增大小为750bp的上游同源臂；以cg0641c和cg0641d为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 21420的基因组为模板，使用fast Pfu高保真聚合酶扩增大小为793bp的下游同源臂；回收上下游同源臂后，以cg0641a和cg0641d为引物进行融合PCR得到大小为1543bp的融合产物；将融合产物和敲除载体pK18mobsacB分别用HindIII和XbaI酶切后并连接得到重组质粒pK18mobsacB-cg0641；将重组质粒pK18mobsacB-cg0641电击转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 21420，经过两步同源重组获得突变株PE1。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述引物cg0641a的序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物cg0641b的序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物cg0641c的序列如SEQ ID NO.4所示；所述引物cg0641d的序列如SEQ IDNO.5所示。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述获得突变株PE2的具体方法为，将酮酸脱羧酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.6所示的片段，将所述片段和pXMJ19分别用HindIII和PstI酶切后并连接得到重组质粒pXMJ19-aro10，将所述重组质粒pXMJ19-aro10电击转化至突变株PE1中，获得突变株PE2。
作为本发明生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述获得突变株PE3的具体方法为，将酪氨酸转氨酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.7所示的片段，将所述片段和pECXK99E分别用EcoRI和KpnI酶切后并连接得到重组质粒pECXK99E-tyrB；
将醇脱氢酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.8所示的片段，将所述片段和所述重组质粒pECXK99E-tyrB分别用KpnI和XbaI酶切后并连接得到重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK；
将所述重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK电击转化至突变株PE2中，获得突变株PE3。
本发明的另一个目的是提供一种如上述任一所述的构建方法构建的谷氨酸棒杆菌。
本发明的另一个目的是提供如上述所述的谷氨酸棒杆菌在生产2-苯乙醇中的应用。
作为本发明谷氨酸棒杆菌在生产2-苯乙醇中的应用的一种优选方案，其中，以葡萄糖为原料进行2-苯乙醇生产。
本发明的另一个目的是提供一种通过上述所述的谷氨酸棒杆菌制备2-苯乙醇的方法，所述方法包括以葡萄糖为原料，利用所述谷氨酸棒杆菌进行生物转化，制备2-苯乙醇。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所构建的高产2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌安全，且克服了现有的菌株生产效率低、耐受性缺陷等缺点，此外该菌株可以利用葡萄糖和秸秆水解液好氧发酵生产2-苯乙醇，发酵产量达到5.3g/L，为后续2-苯乙醇工业化生物制造奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中C.glutamicum ATCC13032、E.coli MG1655和B.subtilis 168对2-苯乙醇的耐受能力的结果对比图；
图2为本发明中C.glutamicum ATCC13032和E.coli MG1655对异丁醇的耐受能力的结果对比图；
图3为本发明重组质粒pK18mobsacB-cg0641的质粒图谱；
图4为本发明重组质粒pXMJ19-aro10的质粒图谱；
图5为本发明重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK的质粒图谱；
图6为本发明构建的突变株PE3利用葡萄糖合成2-苯乙醇的产量随时间变化图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
C.glutamicum ATCC 13032：来源于ATCC(The Global Bioresource Center，http://www.atcc.org/)；
C.glutamicum ATCC 21420：来源于ATCC(The Global Bioresource Center，http://www.atcc.org/)；
E.coli MG 1655：来源于CGSC(Coli Genetic Stock Center，http://cgsc.biology.yale.edu/)；
B.subtilis 168：来源于BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)；
质粒pK18mobsacB：来源于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)；
质粒pXMJ19：来源于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)；
质粒pECXK99E：来源于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)；
实施例1谷氨酸棒杆菌溶剂耐受能力
针对2-苯乙醇的细胞毒性，比较3种常见的底盘细胞对2-苯乙醇的耐受能力，将C.glutamicum ATCC13032在CGIII培养基中于30℃、220rpm培养48h，将E.coli MG1655和B.subtilis 168在LB培养基中于37℃、220rpm培养48h；其中，CGIII培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，NaCl 2.5g/L；LB培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L。
通过测定OD600确定菌体的生长情况，结果如图1所示，其中，图1(A)为E.coliMG1655对2-苯乙醇的耐受能力；图1(B)为B.subtilis 168对2-苯乙醇的耐受能力；图1(C)为C.glutamicum ATCC13032对2-苯乙醇的耐受能力。由图1可以看出，C.glutamicumATCC13032相对于E.coli MG1655和B.subtilis168显示出更优异的耐受能力，在培养基中添加2g/L 2-苯乙醇时，C.glutamicumATCC13032的相对生长速率为不添加2-苯乙醇的61％，B.subtilis 168仅为15％，而E.coli MG1655几乎停止生长；在培养基添加3g/L 2-苯乙醇时，C.glutamicum ATCC13032的相对生长速率为不添加2-苯乙醇的45％，而B.subtilis168几乎停止生长。
进一步，针对异丁醇的细胞毒性，将C.glutamicum ATCC13032在CGIII培养基中于30℃、220rpm培养，将E.coli MG1655在LB培养基中于37℃、220rpm培养。通过测定OD600确定菌体的生长情况，当菌株OD600达到0.5时，分别将两株菌的培养物适当稀释后均匀涂布在含有不同浓度异丁醇(6g/L、12g/L)的固体平板上，在合适的培养条件下培养24h后计算菌株的存活率。菌株存活率＝添加异丁醇培养基平板上的菌落数/未加异丁醇培养基平板上的菌落数*100％。结果如图2所示，由图2可以看出，谷氨酸棒杆菌同样显示了较好的耐受性。因此可见，谷氨酸棒杆菌相对于大肠杆菌更适合作为溶剂生产的细胞工厂。
实施例2构建谷氨酸棒杆菌C.glutamicumPE3
(1)敲除cg0641基因
cg0641基因是短链脱氢酶编码基因，其蛋白质序列如GenBank号：
CAF19257.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
合成cg0641基因敲除所用的引物cg0641a、cg0641b、cg0641c和cg0641d，
其中，引物的序列如下：
cg0641a 5’-GAAAGCTTAAAATCAAGGCAACAGTCAG-3’SEQ ID NO.2
cg0641b 5’-GTCTTTCGGTTGGCTTCGCCCAATGCTTTCAG-3’SEQ ID NO.3
cg0641c 5’-AAGCCAACCGAAAGAC-3’SEQ ID NO.4
cg0641d 5’-ACATCTAGAACAAACGGGAGCAATC-3’SEQ ID NO.5
以cg0641a和cg0641b为引物，以C.glutamicum ATCC 21420的基因组为模板，使用fast Pfu高保真聚合酶扩增大小为750bp的上游同源臂，以cg0641c和cg0641d为引物，以C.glutamicum ATCC 21420的基因组为模板，使用fast Pfu高保真聚合酶扩增大小为793bp的下游同源臂。回收上下游同源臂后，以cg0641a和cg0641d为引物进行融合PCR得到大小为1543bp的融合产物。然后将融合产物和敲除载体pK18mobsacB分别用HindIII和XbaI酶切后并连接得到重组质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pK18mobsacB-cg0641，pK18mobsacB-cg0641质粒图谱如图3所示。将pK18mobsacB-cg0641电击转化至C.glutamicum ATCC21420，经过两步同源重组获得敲除cg0641基因的突变株C.glutamicum PE1。
(2)过表达aro10基因
aro10基因是酮酸脱羧酶编码基因，其核苷酸序列如GenBank号：NC_001136.10，Gene ID:851987(updated on 6-Jun-2021)。
将来源于酿酒酵母的酮酸脱羧酶编码基因aro10，经过密码子优化后合成如SEQID NO.6所示的片段，该片段大小为1908bp，然后将该片段和pXMJ19分别用HindIII和PstI酶切后并连接得到重组质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pXMJ19-aro10，pXMJ19-aro10质粒图谱如图4所示。将该质粒电击转化至C.glutamicum PE1中，获得突变株C.glutamicumPE2。
(3)过表达tyrB基因和yahK基因
tyrB基因是酪氨酸转氨酶编码基因，其核苷酸序列如GenBank号：NC_000913.3，Gene ID:948563(updated on 6-May-2021)。
yahK基因是醇脱氢酶编码基因，其核苷酸序列如GenBank号：NC_000913.3，GeneID:944975(updated on 6-May-2021)。
将来源于大肠杆菌的酪氨酸转氨酶编码基因tyrB，经过密码子优化后合成如SEQID NO.7所示的片段，该片段大小为1191bp，然后将该片段和pECXK99E分别用EcoRI和KpnI酶切后并连接得到重组质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pECXK99E-tyrB。
将来源于大肠杆菌的醇还原酶编码基因yahK，经过密码子优化后合成如SEQ IDNO.8所示的片段，该片段大小为1047bp，然后将该片段和重组质粒pECXK99E-tyrB分别用KpnI和XbaI酶切后并连接得到重组质粒，将此重组质粒命名为重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK，pECXK99E-tyrB-yahK质粒图谱如图5所示。将重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK电击转化至C.glutamicum PE2中，获得突变株C.glutamicum PE3。
实施例3构建的突变株C.glutamicum PE3利用葡萄糖合成2-苯乙醇
为了研究突变株C.glutamicum PE3合成2-苯乙醇的能力，我们进行了摇瓶批发酵试验。取一管-80℃保藏的对数期种子培养液，冰上融化后全部接入装有20mL CGIII液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃，200rpm过夜培养。以2％接种量接种到500mL三角瓶中，其中装有50mL添加40g/L葡萄糖的发酵培养基中，30℃，200rpm培养96h。发酵初始OD600约等于0.1，初始葡萄糖浓度为40g/L,24h和48h分别补入40g/L的葡萄糖。发酵培养基中添加终浓度为25mg L-1的卡那霉素和10mg L-1的氯霉素，以及1mM的IPTG。于30℃，250rpm恒温摇床振荡培养，直到葡萄糖全部耗尽。
发酵培养基的成份：
(NH4)2SO4(5g/L),urea(1g L-1),KH2PO4(1g/L),K2HPO4(1g/L),MgSO4·7H2O(0.25g/L),CaCl2(10mg L-1),FeSO4·7H2O(10mg L-1),MnSO4·H2O(0.1mg L-1),ZnSO4·7H2O(1mg L-1),CuSO4·5H2O(0.2mg L-1),NiCl2·6H2O(20μg L-1),biotin(0.4mg L-1),3-morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)(15g/L)，yeast extract(5g/L)。
整个过程的2-苯乙醇产量如图6所示，发酵96h，2-苯乙醇浓度为5.3g/L。
本发明所构建的高产2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌安全，且克服了现有的菌株生产效率低、耐受性缺陷等缺点，此外该菌株可以利用葡萄糖和秸秆水解液好氧发酵生产2-苯乙醇，发酵产量达到5.3g/L，为后续2-苯乙醇工业化生物制造奠定了基础。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 泰州学院
<120> 一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttagatgaac tgtcggccac catcaacgat gagtgtttgc ccagtgatgt attcggcttc 60
tggggatgca agaaacatgg tggtgccgac gatgtctttc ggttggcttg cgcgcttgat 120
ggatccgcga tcgacaccgt acgtttccgc gctatccatg agtcccaagc tggcttcagt 180
cagcgtaaac ccaggcgcaa ccgcattgac cgtgatccca cgaccaccca gctctttagc 240
aagcaccctg gttaaagcaa tgaccccacc tttggatgcc acgtagtgcg cccagtgtgc 300
agatcctgaa aacacagtcg cgctggaaag attgaccaca cgggcattat cggacaaaaa 360
cggactcaca gaacgcgtca ccaaccacgg gcctttgaga ttgactccca tgaccaaatc 420
ccactccgca gggtcaatat cctcaaacgg tgaacgagtc actgtcgcat atatcgctgc 480
gttattaata aggacatcaa ttcggccacc gccaaactca gcggcaccgg cggctagggc 540
ctcggtggac tccaaagacg tgacatcaac ttcaaaggct gcggcatctg cgcccaatgc 600
tttcagcttg tcaacggtct cttgcgcccc atccagattg atatccgcca ccgcgatacg 660
gtctccttgg gctgcgaaac cttcagcgaa tgcccgaccc aaaccgccag cggcaccagt 720
gataagaaca gtgcgtggac taggcat 747
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<400> 2
gaaagcttaa aatcaaggca acagtcag 28
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<400> 3
gtctttcggt tggcttcgcc caatgctttc ag 32
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<400> 4
aagccaaccg aaagac 16
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<400> 5
acatctagaa caaacgggag caatc 25
<210> 6
<211> 1908
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<400> 6
atggcacctg tgaccattga aaagtttgtg aaccaagaag aaaggcacct ggtgtccaat 60
aggtctgcaa ccatcccatt tggtgaatac atcttcaaga ggctgctgtc cattgatacc 120
aagtctgtgt ttggtgtgcc tggtgatttc aacctgtccc tgctggaata cctgtactcc 180
ccatctgtgg aatcagctgg cctgaggtgg gtgggcacct gcaatgaact gaatgcagca 240
tatgcagcag atggctactc taggtactcc aacaagattg gctgcctgat caccacctat 300
ggtgtgggtg aactgtctgc actgaatggc attgctggct cctttgcaga aaatgtgaag 360
gtgctgcaca ttgtgggtgt ggcaaagtcc attgattcta ggtcctccaa cttctctgat 420
aggaacctgc accacctggt gccacagctg catgattcca acttcaaggg cccaaaccac 480
aaggtgtacc atgatatggt gaaggatagg gtggcatgct ctgtggcata cctggaagat 540
attgaaactg catgtgatca agtggataat gtgattaggg atatctacaa gtactccaag 600
cctggctaca tctttgtgcc agcagatttt gcagatatgt ctgtgacctg tgataacctg 660
gtgaatgtgc caaggatctc tcagcaagat tgcattgtgt acccatctga aaatcagctg 720
tctgatatca tcaacaagat cacttcctgg atctactcct ccaagacccc tgcaatcctg 780
ggtgatgtgc tgactgatag gtatggtgtg tccaacttcc tgaacaagct gatctgcaag 840
actggcatct ggaacttctc cactgtgatg ggcaagtctg tgattgatga atccaaccca 900
acctacatgg gtcagtacaa tggcaaggaa ggcctgaagc aagtgtatga acactttgaa 960
ctgtgtgatc tggtgctgca ctttggtgtg gatatcaatg aaatcaacaa tggccactac 1020
accttcacct acaagccaaa tgcaaagatc attcagttcc acccaaacta cattaggctg 1080
gtggatacta ggcaaggcaa tgaacagatg ttcaagggca tcaactttgc accaatcctg 1140
aaggaactgt acaagaggat tgatgtgtcc aagctgtcct tgcagtatga ttccaatgtg 1200
actcagtaca ccaatgaaac catgaggctg gaagatccaa ccaatggtca gtcctccatc 1260
atcacccaag tgcacttgca gaagaccatg ccaaagttcc tgaaccctgg tgatgtggtg 1320
gtgtgtgaaa ctggctcctt tcagttctct gtgagggatt ttgcattccc atctcagctg 1380
aagtacatct cccaaggctt cttcctgtcc attggcatgg cactgccagc agcactgggt 1440
gtgggcattg caatgcaaga tcactccaat gcacacatca atggtggcaa tgtgaaggaa 1500
gattacaagc caaggctgat cctgtttgaa ggtgatggtg cagcacagat gaccatccaa 1560
gaactgtcca ccatcctgaa gtgcaacatc ccactggaag tgatcatctg gaacaacaat 1620
ggctacacca ttgaaagggc aatcatgggc ccaactaggt cctacaatga tgtgatgtcc 1680
tggaagtgga ccaagctgtt tgaagcattt ggtgattttg atggcaagta caccaactcc 1740
accctgattc agtgcccatc caagctggca ctgaagctgg aagaactgaa gaactccaac 1800
aagaggtctg gcattgaact gctggaagtg aagctgggtg aactggattt ccctgaacag 1860
ctgaagtgca tggtggaagc agcagcactg aagaggaaca agaagtaa 1908
<210> 7
<211> 1194
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<400> 7
atgtttcaga aggtggatgc atatgctggt gatccaatcc tgaccctgat ggaaaggttc 60
aaggaagatc caaggtctga taaggtgaac ctgtccattg gcctgtacta caatgaagat 120
ggcatcatcc cacagctgca agcagtggca gaagcagaag caaggctgaa tgcacagcca 180
catggtgcat ccctgtacct gccaatggaa ggcctgaact gctataggca tgcaattgca 240
ccactgctgt ttggtgcaga tcaccctgtg ctgaagcagc agagggtggc aacaattcag 300
accctgggtg gctctggtgc actgaaggtg ggtgcagatt tcctgaagag gtacttccct 360
gaatctggtg tgtgggtgtc tgatccaacc tgggaaaacc atgtggcaat ctttgctggt 420
gctggctttg aagtgtccac ctacccatgg tatgatgaag caaccaatgg tgtgaggttc 480
aatgatctgc tggcaaccct gaagaccctg cctgcaaggt ccattgtgct gctgcaccca 540
tgctgccaca acccaactgg tgcagatctg accaatgatc agtgggatgc agtgattgaa 600
atcctgaagg caagggaact gatcccattc ctggatattg cataccaagg ctttggtgct 660
ggcatggaag aagatgcata tgcaattagg gcaattgcat cagctggcct gcctgcactg 720
gtgtccaact ccttctccaa gatcttctcc ctgtatggtg aaagggtggg tggcctgtct 780
gtgatgtgtg aagatgcaga agcagctggt agggtgctgg gtcagctgaa ggcaactgtg 840
aggaggaact actcctcccc accaaacttt ggtgcacaag tggtggcagc agtgctgaat 900
gatgaagcac tgaaggcatc ctggctggca gaagtggaag aaatgaggac tagaatcctg 960
gcaatgaggc aagaactggt gaaggtgctg tccactgaaa tgcctgaaag gaactttgat 1020
tacctgctga atcagagggg catgttctcc tacactggcc tgtcagcagc acaagtggat 1080
aggctgaggg aagaatttgg tgtgtacctg attgcatctg gtaggatgtg tgtggctggc 1140
ctgaacactg caaatgtgca aagggtggca aaagcatttg cagcagtgat gtaa 1194
<210> 8
<211> 1128
<212> DNA
<213> Artificial sequences
<400> 8
atgaagatca aggcagtggg tgcatactct gcaaagcagc cactggaacc aatggatatc 60
actaggaggg aacctggccc aaatgatgtg aagattgaaa ttgcatactg tggtgtgtgc 120
cactctgatc tgcaccaagt gaggtctgaa tgggctggca ctgtgtaccc atgtgtgcct 180
ggccatgaaa ttgtgggtag ggtggtggca gtgggtgatc aagtggaaaa gtatgcacct 240
ggtgatctgg tgggtgtggg ctgcattgtg gattcctgca agcactgtga agaatgtgaa 300
gatggcctgg aaaactactg tgatcacatg actggcacct acaactcccc aacccctgat 360
gaacctggcc acaccctggg tggctactct cagcagattg tggtgcatga aaggtatgtg 420
ctgaggatta ggcacccaca agaacagctg gcagcagtgg caccactgct gtgtgctggc 480
atcaccacct actctccact gaggcactgg caagctggcc ctggcaagaa ggtaggtgtg 540
gtgggcattg gtggcctggg ccacatgggc atcaagctgg cacatgcaat gggtgcacat 600
gtggtggcat tcaccacctc tgaagcaaag agggaagcag caaaggcact gggtgcagat 660
gaagtggtga actctaggaa tgcagatgaa atggcagcac acctgaagtc ctttgatttc 720
atcctgaaca ctgtggcagc accacacaac ctggatgatt tcaccaccct gctgaagagg 780
gatggcacca tgaccctggt gggtgcacct gcaaccccac acaagtcccc tgaagtgttc 840
aacctgatca tgaagaggag ggcaattgct ggctccatga ttggtggcat ccctgaaacc 900
caagaaatgc tggatttctg tgcagaacat ggcattgtgg cagatattga aatgattagg 960
gcagatcaga tcaatgaagc atatgaaagg atgctgaggg gtgatgtgaa gtataggttt 1020
gtgattgata ataggaccct gactgattaa tctctgctta aaagcacaga atctaagatc 1080
cctgccattt ggcggggatt tttttatttg ttttcaggaa ataaataa 1128

Claims (5)

1.一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：包括，
敲除受体菌的短链脱氢酶编码基因或抑制所述短链脱氢酶编码基因的表达或抑制所述短链脱氢酶编码基因编码的蛋白质的活性，获得突变株PE1；
增加所述突变株PE1中酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强所述酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE2；
增加所述突变株PE2中酪氨酸转氨酶编码基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强转氨酶基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE3；
所述受体菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 21420；
所述获得突变株PE1的具体方法为，以cg0641a和cg0641b为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 21420的基因组为模板，使用fast Pfu 高保真聚合酶扩增大小为750bp的上游同源臂；以cg0641c和cg0641d为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 21420的基因组为模板，使用fastPfu 高保真聚合酶扩增大小为793bp的下游同源臂；回收上下游同源臂后，以cg0641a和cg0641d为引物进行融合PCR得到大小为1543bp的融合产物；将融合产物和敲除载体pK18mobsacB分别用HindIII和XbaI酶切后并连接得到重组质粒pK18mobsacB-cg0641；将重组质粒pK18mobsacB-cg0641电击转化至谷氨酸棒杆菌 ATCC 21420，经过两步同源重组获得突变株PE1；所述引物cg0641a的序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物cg0641b的序列如SEQID NO.3所示；所述引物cg0641c的序列如SEQ ID NO.4所示；所述引物cg0641d的序列如SEQID NO.5所示；
所述获得突变株PE2的具体方法为，将酮酸脱羧酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.6所示的片段，将所述片段和pXMJ19分别用HindIII和PstI酶切后并连接得到重组质粒pXMJ19-aro10，将所述重组质粒pXMJ19-aro10电击转化至突变株 PE1中，获得突变株PE2；
所述获得突变株PE3的具体方法为，将酪氨酸转氨酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.7所示的片段，将所述片段和pECXK99E分别用EcoRI和KpnI酶切后并连接得到重组质粒pECXK99E-tyrB；
将醇脱氢酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.8所示的片段，将所述片段和所述重组质粒pECXK99E-tyrB分别用KpnI和XbaI酶切后并连接得到重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK；
将所述重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK电击转化至突变株PE2中，获得突变株 PE3。
2.一种如权利要求1所述的构建方法构建的谷氨酸棒杆菌。
3.如权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌在生产2-苯乙醇中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：以葡萄糖为原料进行2-苯乙醇生产。
5.一种通过权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述方法包括以葡萄糖为原料，利用所述谷氨酸棒杆菌进行生物转化，制备2-苯乙醇。
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