CN106957827B - 一种对酚类化合物氧化的生物催化系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体的说是一种对酚类化合物氧化的生物催化系统及其应用。对酚类化合物进行不同程度的氧化的生物催化系统为CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD或上述酶的功能等同体。同时，加入CreC、CreG可以强化酚类化合物氧化过程。本发明生物催化系统能够广泛并高效地对多种酚类化合物进行氧化，在生物化工等领域具备很高的应用潜力及经济价值。

Description

一种对酚类化合物氧化的生物催化系统及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体的说是一种对酚类化合物氧化的生物催化系统及其应用。
背景技术
酚类化合物具有广泛的生理活性，如抗氧化、清除自由基、抗紫外线辐射、抑菌效应及抗病毒作用等，在医药、农药、化妆品原料和食品添加剂的生产方面也有着广泛的用途，与人们的生活和工业生产密切相关(Cuvelier et al.,2014)。
酚类化合物作为一种重要的生产原料和有机中间体而被广泛应用到各个领域，所以具有相当大的市场需求和应用价值。对羟基苯甲醛是一种十分重要的精细化工产品，被广泛用于医药、香料、农药、石油化工、电镀和液晶等领域，尤其是作做为合成抗菌增效剂甲氧苄胺嘧啶、羟氨苄青霉素、羟氨苄头抱霉素、茴香醛、香兰素、乙基香兰素和复盆子酮等合成的原料(Fitzgerald et al.,2005；Guang-you et al.,2009)。对羟基苯甲酸是用途广泛的有机合成原料，特别是其酯类，包括对羟基苯甲酸甲酯(尼泊金甲)、乙酯(尼泊金乙)、丙酯等，也可做食品添加剂，用于酱油、醋、清凉饮料(汽水除外)等，还广泛用于食品、化妆品、医药的防腐、防霉剂和杀菌剂等方面(Ritzer&Sundermann,2002)。对羟基苯乙醇是一种重要的医药和香料中间体，其用途广泛，可用于合成美多心安、倍他洛尔等心血管药物，合成具有抗衰老、抗疲劳等重要药理活性的红景天苷和羟基酪醇，以及合成具有抗艾滋病病毒活性的间羟基内精醇和苄基异喹啉生物碱(Bernini et al.,2011；Pesnot et al.,2011)。
另外，研究表明，许多食品饮料(如葡萄酒、茶、咖啡等等)中都含有酚类化合物，这些具有抗氧化作用的生物活性化合物对人体的健康状况起到有益的作用(Silva et al.,2000)。
合成化合物的方法主要有传统的化学合成法和生物催化/转化法，化学合成法具有反应步骤多、立体选择性差、条件不够温和、容易产生副产物和对环境污染严重等缺点。
随着生化技术的进展，酶催化反应越来越多地被有机化学家作为一种手段应用于化合物合成。利用酶催化反应，许多生产原料和有机中间体得以人工合成，进行工业生产(Mandai,2010)。应用生物技术为基础的酶催化反应体系具有很多优越性，用酶催化反应方法通常可以一步到位,避免了副产物和中间有害产物的多次转移(Nestl et al.,2014)。酶催化反应过程通常都是在常温常压和接近中性的条件下进行的,与常常需要高温高压的化工过程相比,反应条件大大简化,不仅反应速度快、副产物少，而且对结构有化学选择性和非对映异构体选择性，并且还有严格的区域选择性和对映体选择性，因而其投资省,费用少,耗能低,并且效果好,过程稳定,操作简便。上述这些原因使得酶催化技术获得突破性进展，成为一个非常热门生物合成研究领域(Hudlicky&Reed,2009；Martins et al.,2011)。
发明内容
本发明的目的是提供一种对酚类化合物进行氧化的酶催化氧化系统及应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种对酚类化合物进行氧化的生物催化系统，对酚类化合物进行不同程度的氧化的生物催化系统为CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD或上述酶的功能等同体。
进一步的是，对酚类化合物进行不同程度的氧化的生物催化系统为CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG、CreC或上述酶的功能等同体。
生物催化系统CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG、CreC的氨基酸编码序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或者与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8同源的其它序列，以及可实现本发明中酚类化合物的磷酸化、氧化、水解等任一反应的其它相似酶的同源序列。
所述对酚类化合物进行不同程度的氧化为磷酸化、氧化、水解中的一种或几种。
所述酚类化合物包含但不限于如下：对甲酚、3-甲基甲酚、4-乙基苯酚、4-丙基苯酚、3-乙基苯酚、4-异丙基苯酚、4-乙烯基苯酚、3-乙烯基苯酚等酚类化合物。
所述对酚类化合物进行磷酸化的催化系统为CreH和CreI；其，催化系统识别酚类化合物，对其酚羟基进行磷酸化，生成磷酸化酚类化合物；催化体系包括底物、ATP、辅因子Mg2+、Mn2+、CreH、CreI。
所述对磷酸化酚类化合物进行氧化的催化系统为CreJ、CreE和CreF；其，催化系统识别磷酸化酚类化合物，并对其进行氧化，生成磷酸化酚类化合物的氧化产物；所述磷酸化酚类化合物的氧化产物为相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种；催化体系包括底物、NADPH、CreJ、CreE、CreF。
所述对磷酸化酚类化合物氧化产物进行水解的催化系统为CreD；其，识别磷酸化氧化产物，并对其磷酸酯键进行水解，生成去磷酸化氧化产物；所述去磷酸化氧化产物为相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种；催化体系包括底物、辅因子Mg2+、Mn2+、CreD。
所述对酚类化合物进行磷酸化、氧化和水解的催化系统为CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD；其，CreH和CreI催化系统首先识别酚类化合物，对其酚羟基进行磷酸化，生成磷酸化酚类化合物；而后CreJ、CreE和CreF催化系统识别磷酸化酚类化合物，并对其进行氧化，生成磷酸化酚类化合物氧化生成相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种的产物；最后CreD催化系统识别磷酸化氧化产物，并对其磷酸酯键进行水解，生成去磷酸化氧化生成相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种的产物；催化体系包括底物、辅因子Mg2+、Mn2+、NADPH、CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD。
所述对酚类化合物进行磷酸化、氧化和水解的催化系统为CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG、CreC；其，CreH和CreI催化系统首先识别酚类化合物，对其酚羟基进行磷酸化，生成磷酸化酚类化合物；其次CreJ、CreE和CreF催化系统识别磷酸化酚类化合物，并对其进行氧化，生成磷酸化酚类化合物氧化生成相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种的产物；再次CreD催化系统识别磷酸化氧化产物，并对其磷酸酯键进行水解，生成去磷酸化氧化生成相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种的产物；同时，CreG催化系统识别氧化磷酸化酚类化合物的醇氧化物和去磷酸化酚类化合物的醇氧化物，从而强化相应醇到醛或酮的转化；CreC催化系统识别和氧化磷酸化酚类化合物的醛氧化物以及去磷酸化酚类化合物的醛氧化物，从而强化相应醛到酸的转化；催化体系包括底物、辅因子Mg2+、Mn2+、NADPH、NAD+、NADP+、CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG、CreC。
一种对酚类化合物进行氧化的生物催化系统，所述催化系统在氧化催化酚类化合物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明对酚类化合物进行氧化的酶催化氧化系统，可以实现对多种酚类化合物进行不同程度的氧化，生成醇、醛、酮或酸。该方法简单易得，对环境友好，对涉及酚类化合物氧化产物的制备和生产具有很大的应用价值。
本发明酶催化氧化系能对酚类化合物进行广泛和高效的氧化，生成相应的醇、醛、酮或酸产物。该系统对酚类化合物进行氧化，反应生产安全，涉及的八个关键酶制备简单，工艺成熟，整个过程不含有害杂质，无毒，对环境非常友好。
附图说明
图1为本发明实施例提供的对甲酚磷酸化产物高分辨质谱
图2为本发明实施例提供的对甲酚磷酸化产物核磁图谱。
图3为本发明实施例提供的4-羟基苯甲醇磷酸化产物高分辨质谱。
图4为本发明实施例提供的4-羟基苯甲醇磷酸化产物核磁图谱。
图5为本发明实施例提供的4-羟基苯甲醛磷酸化产物高分辨质谱。
图6为本发明实施例提供的4-羟基苯甲醛磷酸化产物核磁图谱。
图7为本发明实施例提供的4-羟基苯甲酸磷酸化产物高分辨质谱。
图8为本发明实施例提供的4-羟基苯甲酸磷酸化产物核磁图谱。
图9为本发明实施例提供的4-羟基苯甲醇高分辨质谱。
图10为本发明实施例提供的4-羟基苯甲醛高分辨质谱。
图11为本发明实施例提供的4-羟基苯甲酸高分辨质谱。
图12为本发明实施例提供的对甲酚一锅法氧化反应的HPLC图谱。
图13为本发明实施例提供的3-甲基苯酚氧化反应的HPLC图谱。
图14为本发明实施例提供的3-羟基苯甲醇高分辨质谱。
图15为本发明实施例提供的3-羟基苯甲醛高分辨质谱。
图16为本发明实施例提供的3-羟基苯甲酸高分辨质谱。
图17为本发明实施例提供的对羟基苯乙酮高分辨质谱。
图18为本发明实施例提供的对羟基苯丙酮的高分辨质谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步的阐述。
首先，利用CreH/CreI与酚类化合物进行反应，对酚类化合物苯环上的酚羟基进行磷酸化；然后利用CreJ/CreE/CreF对磷酸化产物苯环上的其它取代基团进行氧化得到相应的醇、醛、酮或酸；最后，利用CreD对氧化的磷酸酯化产物进行水解，去除磷酸基团，得到去磷酸化酚类化合物的氧化产物醇、醛、酮或酸。为了提高反应转化率，CreG可以用来提高相应醇到醛或酮的转化率；CreC可以用来提高相应醛到酸的转化率。
具体为：
(1)CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC酶的表达和纯化。CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC八个酶的氨基酸序列分别为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，编码这八个酶的基因可通过以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)基因组为模板进行PCR的方法获得，相应的基因为creH(Ncgl0528)、creI(Ncgl0529)、creJ(Ncgl0530)、creE(Ncgl0525)、creF(Ncgl0526)、creD(Ncgl0524)、creG(Ncgl0527)和creC(Ncgl0523)。
将获得的8个基因分别连接到pET28b蛋白表达载体上，将表达载体转化到蛋白表达菌株E.coli BL21(DE3)中，进行蛋白诱导表达，收集菌体，进行超声裂解，并通过Ni-ATA蛋白亲和层析柱进行蛋白纯化。
CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC酶的同源酶或功能等同体可以通过分子生物学手段，在数据库中以CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC 8个酶中任一酶的序列为模板进行序列比对搜索。同源酶或功能等同体包含但不限于如下：分别与8个酶同源的Corynebacterium efficiens YS-314菌株中CE0555、CE0556、CE0557、CE0558、CE0559、CE0560、CE0561、CE0562基因编码的蛋白质；分别与8个酶同源的Arthrobactersp.FB24菌株中Arth_2001、Arth_2000、Arth_1999、Arth_1998、Arth_1997、Arth_1996、Arth_1995、Arth_1994基因编码的蛋白质；与CreH、CreI同源的Geobactermetallireducens GS-15菌种中Gmet_2100、Gmet_2100编码的蛋白质；与CreC同源的Pseudomonas putida F1菌株中Pput_2043基因编码的蛋白质序列、Corynebacteriumglutamicum ATCC13032菌株中Ncgl2578基因编码的蛋白质序列、Pseudomonas mendocinaKR1菌株中PcuC基因编码的蛋白质序列；与CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC8个酶中任一酶同源的其他酶。同源酶或功能等同体的表达和纯化与CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC酶的表达纯化方法相同。
(2)酚类化合物的磷酸化反应。建立反应体系，以酚类化合物作为底物，反应体系中加入ATP，并加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreH和CreI两种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度。一定时间后，可将酚类化合物转化为相应的磷酸化酚类化合物。
(3)磷酸化酚类化合物的氧化反应。建立反应体系，以磷酸化酚类化合物作为底物，反应体系中加入辅因子NADPH，加入CreJ、CreE和CreF三种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度。一定时间后，可将磷酸化酚类化合物转化为相应的磷酸化酚类化合物氧化产物—醇、醛、酮或酸。
(4)磷酸化酚类化合物氧化产物的水解反应(酚类化合物氧化产物的获得)。建立反应体系，以磷酸化酚类化合物氧化产物作为底物，反应体系中加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreD酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度。一定时间后，可将磷酸化酚类化合物氧化产物转化为相应的酚类化合物氧化产物。
(5)酚类化合物醇氧化物(或磷酸化酚类化合物醇氧化物)的氧化反应(CreG)；建立反应体系，以酚类化合物醇氧化物(或磷酸化酚类化合物醇氧化物)作为底物，反应体系中加入辅因子NAD+，加入CreG酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度。一定时间后，可将酚类化合物醇氧化物(或磷酸化酚类化合物醇氧化物)转化为相应的醛或酮氧化产物。
(6)酚类化合物醛氧化物(或磷酸化酚类化合物醛氧化物)的氧化反应(CreC)；建立反应体系，以酚类化合物醛氧化物(或磷酸化酚类化合物醛氧化物)作为底物，反应体系中加入辅因子NADP+，加入CreC酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度。一定时间后，可将酚类化合物醛氧化物(或磷酸化酚类化合物醛氧化物)转化为相应的酸氧化产物。
实施例中，选取4种酚类化合物(对甲酚、4-乙基苯酚、3-甲酚、4-丙基苯酚)作为酚类化合物的代表，选取谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)的8个酶creH(Ncgl0528)、creI(Ncgl0529)、creJ(Ncgl0530)、creE(Ncgl0525)、creF(Ncgl0526)、creD(Ncgl0524)、creG(Ncgl0527)和creC(Ncgl0523)作为获取此生物氧化系统中酶的代表进行阐述。但本发明并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，例如与本生物氧化系统8种酶同源的可实现本系统中磷酸化、氧化、水解任一反应的其它酶，均属于本发明的保护范围。
实施例中所采用的分子生物学实验技术包括基因组提取、PCR扩增、DNA片段连接、酶切、转化等，如无特殊说明，通常按照分子生物学常规手段进行操作或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC酶表达菌株的构建。
首先根据CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC酶八种蛋白相应的编码基因creH(Ncgl0528)、creI(Ncgl0529)、creJ(Ncgl0530)、creE(Ncgl0525)、creF(Ncgl0526)、creD(Ncgl0524)、creG(Ncgl0527)和creC(Ncgl0523)的序列设计引物，如下：
creH-F：GCGCCATATGGCTAATAAATCTTTCCCCAAGCCC
creH-R：ACGCGGATCCGTGGACTAGGCATGTGTATC
creI-F：TCGCCATATGGGAGACACCATGACCAACAGT
creI-R：GCCCAAGCTTAACGAGGTAGTACGGGTACA
creJ-F：CGTGCCATGGGCACAATGACTTCCCAGACT
creJ-R：CGGGAAGCTTAGCGTTCCAAGTCACGGGAA
creE-F：GACACATATGAATACTTCAGCTGAAACTGGA
creE-R：GGAGCTCTCCCAAGCGGGTAAAT
creF-F：GCGCCATATGAAGATCATGTCTACTATTCATT
creF-R：TCATAAGCTTTCACACTTGCGTTTCTGGCG
creD-F：GACACATATGACTCGCAGTAATTTACCCGC
creD-R：CGGAATTCGAGAAGCACGCCTGGTTG
creG-F：GACACATATGCCTAGTCCACGCACTGTTC
creG-R：CGGAATTCAGTAGACATGATCTTCTCCTTAG
creC-F：CCGCCATATGCCGATGAATGCTGCAACCA
creC-R：GCGCGGATCCGTGTTTAGCTGAGAACTTTCAG
以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)基因组为模板，用上述设计的引物进行PCR，获得相应的DNA片段，分别进行酶切，而后分别连接到表达载体pET28b上，构建出CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC的表达载体。分别将CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC的表达载体转化进入E.coli BL21(DE3)中，筛选得到正确的表达菌株。
实施例2
CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC的蛋白表达与纯化。
分别接种上述获得的表达菌株于含有50ug/mL卡那霉素的LB中，37℃，220rpm，培养过夜。按1:100(v/v)接种新鲜的LB培养基(含4％甘油，50μg/mL卡那霉素)，37℃，220rpm培养2-4小时，至OD600＝0.4-0.6。加入终浓度为0.2mM的IPTG，20℃，220rpm培养18小时。4℃，5000rpm离心5min收集菌体，每1L发酵液的菌体用50mL裂解缓冲液(NaH2PO450mM，NaCl300mM，甘油10％，咪唑10mM)溶解，用漩涡震荡仪混匀。用超声仪对菌体进行超声裂解，分别收集裂解液，4℃，12000g离心30min，取上清。每50mL上清加入1mL Ni-NTA树脂，4℃孵育20min。而后分别加入蛋白纯化柱中，静止10min，收集树脂，用洗涤缓冲液(NaH2PO450mM，NaCl 300mM，甘油10％，咪唑20mM)洗涤树脂，直至无杂蛋白流出。用洗脱缓冲液(NaH2PO450mM，NaCl 300mM，甘油10％，咪唑250mM)洗脱目的蛋白。
利用脱盐柱或层析法对目的蛋白进行脱盐，分别得到纯化目的蛋白。
实施例3
对甲酚(4-甲基苯酚)的磷酸化反应。
建立酶反应体系：
对甲酚1mM，
Mg2+20mM，
Mn2+2mM，
ATP 1mM，
CreH蛋白10μM，
CreI蛋白10μM。
30℃孵育30min，即可将对甲酚转化为对甲酚磷酸化产物，转化率为100％。反应式如下：
Figure BDA0000904117560000071
对甲酚磷酸化产物高分辨质谱见图1，核磁图谱见图2。
其中，CreH、CreI蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代，也可以实现将对甲酚转化为对甲酚磷酸化产物。
实施例4
对甲酚磷酸化产物的氧化反应。
建立酶反应体系：
对甲酚磷酸化产物1mM，
NADPH 2-6mM，
CreJ蛋白10μM，
CreE蛋白10μM，
CreF蛋白10μM。
30℃孵育30min，即可将对甲酚磷酸化产物连续氧化，转化为4-羟基苯甲醇磷酸化产物、4-羟基苯甲醛磷酸化产物和4-羟基苯甲酸磷酸化产物，转化率为100％。三种产物的产率根据NADPH加入量的不同有所区别，当NADPH增加至6mM时，可完全转化为4-羟基苯甲酸磷酸化产物。
反应式如下：
Figure BDA0000904117560000081
4-羟基苯甲醇磷酸化产物高分辨质谱和核磁图谱见图3和图4，4-羟基苯甲醛磷酸化产物高分辨质谱和核磁图谱见图5和图6，4-羟基苯甲酸磷酸化产物高分辨质谱和核磁图谱见图7和图8。
其中，CreJ、CreE、CreF蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代，也可以实现将对甲酚磷酸化产物转化成相应的磷酸化氧化产物。
实施例5
对甲酚磷酸化氧化产物的水解反应。
建立酶反应体系：
对甲酚磷酸化氧化产物1mM，
Mg2+20mM，
Mn2+2mM，
CreD蛋白10μM。
30℃孵育30min，即可将对甲酚磷酸化对甲酚氧化产物转化为4-羟基苯甲醇、4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸，转化率都为100％。反应式如下：
Figure BDA0000904117560000091
4-羟基苯甲醇的高分辨质谱见图9，4-羟基苯甲醛的高分辨质谱见图10，4-羟基苯甲酸的高分辨质谱见图11。
其中，CreD蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代，也可以实现将对甲酚磷酸化氧化产物水解为相应的氧化产物。
实施例6
CreG对4-羟基苯甲醇或磷酸化4-羟基苯甲醇的氧化反应。
建立酶反应体系：
4-羟基苯甲醇或磷酸化4-羟基苯甲醇1mM，
NAD+2mM，
CreG蛋白10μM。
30℃孵育30min，即可将4-羟基苯甲醇或磷酸化4-羟基苯甲醇转化为4-羟基苯甲醛或磷酸化4-羟基苯甲醛，转化率都为100％。反应式如下：
Figure BDA0000904117560000101
其中，CreG蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代，也可以实现将4-羟基苯甲醇或磷酸化4-羟基苯甲醇转化为4-羟基苯甲醛或磷酸化4-羟基苯甲醛。
实施例7
CreC对4-羟基苯甲醛或磷酸化4-羟基苯甲醛的氧化反应。
建立酶反应体系：
4-羟基苯甲醛或磷酸化4-羟基苯甲醛1mM，
NADP+2mM，
CreC蛋白10μM。
30℃孵育30min，即可将4-羟基苯甲醛或磷酸化4-羟基苯甲醛转化为4-羟基苯甲酸或磷酸化4-羟基苯甲酸，转化率都为100％。反应式如下：
Figure BDA0000904117560000102
其中，CreC蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代，也可以实现将4-羟基苯甲醛或磷酸化4-羟基苯甲醛转化为4-羟基苯甲酸或磷酸化4-羟基苯甲酸。
实施例8
对甲酚的一锅法氧化反应。
建立酶反应体系：
对甲酚1mM，
Mg2+20mM，
Mn2+2mM，
ATP 3mM，
NAD+1mM，
NADP+1mM，
NADPH+1-3mM，
CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC蛋白各10μM。
30℃孵育30min，即可将对甲酚转化为4-羟基苯甲酸，转化率为100％。反应式如下：
Figure BDA0000904117560000111
HPLC图谱见图12。
其中，CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代，也可以实现将对甲酚转化为4-羟基苯甲酸。
实施例9
此系统对3-甲基苯酚的氧化反应。
根据实施例3-5的条件，以3-甲基苯酚为底物分别进行磷酸化、氧化、水解反应。
建立反应体系，以3-甲基苯酚作为底物，反应体系中加入ATP，并加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreH和CreI两种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将3-甲基苯酚转化为磷酸化3-甲基苯酚；以磷酸化3-甲基苯酚作为底物，反应体系中加入辅因子NADPH，加入CreJ、CreE和CreF三种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将磷酸化3-甲基苯酚转化为相应的磷酸化氧化产物；建立反应体系，以磷酸化氧化产物作为底物，反应体系中加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreD酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将磷酸化氧化产物转化为3-羟基苯甲醇、3-羟基苯甲醛、3-羟基苯甲酸。反应式如下：
Figure BDA0000904117560000121
HPLC图谱见图13，相应的高分辨质谱见图14-16。
其中，CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代。
实施例10
此系统对4-乙基苯酚的氧化反应。
根据实施例3-5的条件，以4-乙基苯酚为底物进行分别进行磷酸化、氧化、水解反应。
建立反应体系，以4-乙基苯酚作为底物，反应体系中加入ATP，并加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreH和CreI两种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将4-乙基苯酚转化为磷酸化4-乙基苯酚；以磷酸化4-乙基苯酚作为底物，反应体系中加入辅因子NADPH，加入CreJ、CreE和CreF三种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将磷酸化4-乙基苯酚转化为相应的磷酸化对羟基苯乙酮；建立反应体系，以磷酸化对羟基苯乙酮作为底物，反应体系中加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreD酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将磷酸化对羟基苯乙酮转化为对羟基苯乙酮。
反应式如下：
Figure BDA0000904117560000122
高分辨质谱见图17。
其中，CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代。
实施例11
此系统对4-丙基苯酚的氧化反应。
根据实施例3-5的条件，以4-丙基苯酚为底物分别进行磷酸化、氧化、水解反应。
建立反应体系，以4-丙基苯酚作为底物，反应体系中加入ATP，并加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreH和CreI两种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将4-丙基苯酚转化为磷酸化4-丙基苯酚；以磷酸化4-丙基苯酚作为底物，反应体系中加入辅因子NADPH，加入CreJ、CreE和CreF三种酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将磷酸化4-丙基苯酚转化为相应的磷酸化对羟基苯丙酮；建立反应体系，以磷酸化对羟基苯丙酮作为底物，反应体系中加入辅因子Mg2+、Mn2+，加入CreD酶作为酶反应催化剂，选择30℃作为酶反应温度，将磷酸化对羟基苯丙酮转化为对羟基苯丙酮。反应式如下：
Figure BDA0000904117560000131
高分辨质谱见图18。
其中，CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC蛋白可以由其同源蛋白或功能等同体替代。
SEQ ID NO：1
MANKSFPKPSDLPVPKGAEGWEDLYPYYLVFQDKLMDQENEKFWFCDSQHWPTVFKPFETIGGEFAVKCLGQYNARHLMIPNANGIEFRVHLGYLYMSPIPVPEDQIAERVPMFQERITHYFQNWEPMLANWKERVLGTINELESLEFKPLPDYVPIDDIVSGKAKDGTEVLMENFDRLIQLAYQNWQYHFEFLNLGYIAYLDFFNFCKEVFPDIPDQSISMMVQGVDMELFRPDDELKILAQLAVDLGLQTHFANPDDPQATLAAIAKAEGGATWIARWEEAQDPWFNFTVGNGFYGHDKYWIEHLELPLGYIADYIRRLDEGQTISRPKDELIAEKERVVEEYRDLLDGEQLAQFDAKCGLAATAYPYVENHNFYIEHWTMSVFWRKVRELSRTLQGYGFWENEDDMLYLNRTEVRDVLFDLATAWGVGAPGGPIGTIIWPEEIERRKAIVTALKTARPAPALNTPPESITEPFTRMLWGITTEQVQSWLGNDEDAEEGTLKGMAASPGVVEGYARVILSADDLSEIQQDEILVAPVTAPSWGPIFGKIKATVTDIGGMMSHAAIVCREYGLPAVTGTGAASTTIKTGDYLKVDGTKGKVVIVDPDAPRIEGPGAHSHAHSVAAHGVDTHA
(a)序列特征：
●长度：725AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreH
SEQ ID NO：2
MTNSLNIPFVQRFDEGLDPVLEVLGGKGASLVTMTDAGMPVPPGFVVTTASFDEFIREAGVAEHIDKFLNDLDAEDVKEVDRVSAIIRDELCSLDVPENARFAVHQAYRDLMERCGGDVPVAVRSSATAEDLPDASFAGQQDTYLWQVGLSAVTEHIRKCWASLFTSRAIIYRLKNNIPNEGLSMAVVVQKMVNSRVAGVAITMNPSNGDRSKITIDSSWGVGEMVVSGEVTPDNILLDKITLQVVSEHIGSKHAELIPDATSGSLVEKPVDEERANRRSLTDEEMLAVAQMAKRAEKHYKCPQDIEWALDADLPDGENLLLLQSRPETIHSNGVKKETPTPQAAKTIGTFDFSSITVAMTGTK
(a)序列特征：
●长度：364AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreI
SEQ ID NO：3
MTSQTSQQSTSTGGCPFGHTSESTSHHGYQPFDMHNPFPAYKELRQEEPVMFDERIGYWVVTKYDDIKTTFDDWETFSSENAQAPVRKRGPQATQIMTDGGFTAYSGLSARIPPEHTRIRAIAQKAFTPRRYKALEPDIRAMVIDRVEKMLANDQHVGDMVSDLAYDIPTITILTLIGADISMVDTYKRWSDSRAAMTWGDLSDEEQIPHAHNLVEYWQECQRMVADAHAHGGDNLTADLVRAQQEGQEITDHEIASLLYSLLFAGHETTTTLISNCFRVLLDHPEQWQAILENPKLIPAAVDEVLRYSGSIVGWRRKALKDTEIGGVAIKEGDGVLLLMGSANRDEARFENGEEFDISRANAREHLSFGFGIHYCLGNMLAKLQAKICLEEVTRLVPSLHLVADKAIGFRENLSFRVPTSVPVTWNA
(a)序列特征：
●长度：428AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreJ
SEQ ID NO：4
MNTSAETGILIIGANQSGVQLAISLRATGFTESITLLGEEDHRPYQRPALSKEFLQDKIDKERLIFRSNEYWEENNIRLVKGVRIERIEKNDDGSGVAYGAGQEFAFRRLALAVGARPRHLDLPGATLEGVTYLRNADDALALKAMIGSVTDAVVVGGGFIGLEAACSLHDLGKNVTVLEYGPRLIGRAVGEETAAFFLEQHRSRGVNIVLDARMKQFVGKDGKLSGIELEDGTVIPAQLVIVGIGVIPNTELAAVLGLDINNGIVVDKHAVASDGTTIAIGDVANIPNPIPGSPADERIRLESVNNAIEHAKIAAYSLVGQPEAYAGIPWFWSNQGDLKLQIAGLTLGYDSTVIRQDPEKKKFSVLYYRGDNIIAADCVNAPLDFMAVRSALSRNQNIPADLAADISQPLKKLAVDLEVTR
(a)序列特征：
●长度：422AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreE
SEQ ID NO：5
MSTIHFIDHAGKTRTIEATVGDSVMETAVRNGVPGIVAECGGSLSCATCHVFVDPAQYDALPPMEEMEDEMLWGAAVDREDCSRLSCQIKVTEGMDLSLTTPETQV
(a)序列特征：
●长度：106AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreF
SEQ ID NO：6
MTRSNLPAWEQADPSVHASDPRAITFAEDFGIRPIPAVGPIDTTAICATPSNGFEQLWKAIEPETRTRANDIHLPIVVAYAERLCDAYPLADRELVLVAAILHDTGWAHVDESRIISEGFSGNWRKAAIRFEHETEGCTVARRVLPSLGYTVDFVEHVCDIIDGHDTRQVAYSLEDALVRDCDRLWRFDRAGITASSSWFGMPVSDYVDRLHREILPELITEAAHQMATADLNRAKALLRTDAIR
(a)序列特征：
●长度：245AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreD
SEQ ID NO：7
MPSPRTVLITGAAGGLGRAFAEGFAAQGDRIAVADINLDGAQETVDKLKALGADAAAFEVDVTSLESTEALAAGAAEFGGGRIDVLINNAAIYATVTRSPFEDIDPAEWDLVMGVNLKGPWLVTRSVSPFLSDNARVVNLSSATVFSGSAHWAHYVASKGGVIALTRVLAKELGGRGITVNAVAPGFTLTEASLGLMDSAETYGVDRGSIKRASQPKDIVGTTMFLASPEAEYITGQTLIVDGGRQFI
(a)序列特征：
●长度：248AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreG
SEQ ID NO：8
MNAATRRASLQLPYTHVDDFYINGSWVKAEGTQRNPVVDPAVGQEWGSVPEATASELDSAVGAARTALKSWSALTGAERTGYLLKIATEIESRSEALALTNTRENGSPISETRGAASNAAGIFRYFATLAPWLDGEDIRPFPAGSAESIVDKDPIGVCALIAPWNFPINLVVIKLAPALLAGCTVIIKPASPTPLSIRFIIEAIEAAGVPAGVVNLLTGSGRFGDALVRHPGVDKVAFTGSTPVGKKIAAACGELLRPVTLELGGKSSAIILPDADMSVLSTRLIRSCMRNTGQTCYISTRIIAPSSRYAEVVQTVASTIAAGRQGDPYDEETVFGPVASASQYSTVMSYIDSAREEGARVVAGGTRSISLSEGLESGEFIQPTVFADVTPDMRISREEIFGPVISILKYDDTNGVSEAIALANNTKFGLGGLVFGADEEQALEVARQVDSGSVGINFFGSNHSAPFGGRHESGMGVEYGIEGLSAYLTYKSIHRTI
(a)序列特征：
●长度：497AA
●类型：蛋白序列
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
(f)特异性名称：CreC
参考文献
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Figure IDA0000904117620000011
Figure IDA0000904117620000021
Figure IDA0000904117620000031
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Figure IDA0000904117620000081
Figure IDA0000904117620000091
Figure IDA0000904117620000101
Figure IDA0000904117620000111
Figure IDA0000904117620000121
Figure IDA0000904117620000131
Figure IDA0000904117620000141
Figure IDA0000904117620000151
Figure IDA0000904117620000161
Figure IDA0000904117620000171
Figure IDA0000904117620000181
Figure IDA0000904117620000191
Figure IDA0000904117620000201
Figure IDA0000904117620000211

Claims (1)

1. 一种通过生物催化系统对酚类化合物进行氧化的方法，其特征在于，所述生物催化系统为CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG、CreC；CreH、CreI、CreJ、CreE、CreF、CreD、CreG和CreC八个酶的氨基酸序列分别为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8；
其中，CreH和CreI催化系统首先识别酚类化合物，对其酚羟基进行磷酸化，生成磷酸化酚类化合物；其次CreJ、CreE和CreF催化系统识别磷酸化酚类化合物，并对其进行氧化，生成相应的磷酸化酚类化合物氧化产物，即相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种的产物；再次CreD催化系统识别磷酸化氧化产物，并对其磷酸酯键进行水解，生成相应酚类化合物氧化产物，即相应的醇、醛、酮、酸中的一种或几种的产物；同时，CreG催化系统识别氧化磷酸化酚类化合物的醇氧化物和去磷酸化酚类化合物的醇氧化物，从而强化相应醇到醛或酮的转化；CreC催化系统识别和氧化磷酸化酚类化合物的醛氧化物以及去磷酸化酚类化合物的醛氧化物，从而强化相应醛到酸的转化。
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Phosphorylation of phenol by phenylphosphate synthase: role of histidine phosphate in catalysis;Ariun Narmandakh;《Journal of bacteriology》;20060915;第188卷(第22期);第7820页图10及图10说明第1行，第7816页图2及说明部分 *
Tang Li.Genetic characterization of 4-cresol catabolism in Corynebacterium glutamicum.《Journal of Biotechnology》.2014,第192卷第360页表2第8-9行，第364页左栏第7-11行，第361页右栏第4-6行，最后一行及362页左栏第1行，第362页右栏第10-11行及第364页图6，第360页表2第三行. *

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