KR20090073131A - Ｇｌｍｓ 라이보스위치, ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용한 구조-기초 화합물 디자인, 및 ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용하는 방법 및 조성물 - Google Patents

Ｇｌｍｓ 라이보스위치, ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용한 구조-기초 화합물 디자인, 및 ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용하는 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20090073131A
KR20090073131A KR1020097006868A KR20097006868A KR20090073131A KR 20090073131 A KR20090073131 A KR 20090073131A KR 1020097006868 A KR1020097006868 A KR 1020097006868A KR 20097006868 A KR20097006868 A KR 20097006868A KR 20090073131 A KR20090073131 A KR 20090073131A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
riboswitches
riboswitch
glms
expression
Prior art date
Application number
KR1020097006868A
Other languages
English (en)
Inventor
로날드 알 브렉커
진수 임
스콧트 에이 스트로벨
제스 씨 코치레인
Original Assignee
예일 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 예일 유니버시티 filed Critical 예일 유니버시티
Publication of KR20090073131A publication Critical patent/KR20090073131A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7008—Compounds having an amino group directly attached to a carbon atom of the saccharide radical, e.g. D-galactosamine, ranimustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6552—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/50—Molecular design, e.g. of drugs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Computing Systems (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

glmS 라이보스위치는 항생제 및 다른 소분자 요법에 대한 표적이다. glmS 라이보스위치를 자극하고/하거나, 활성화하고/하거나, 억제하고/하거나, 불활성화하기 위해 화합물이 사용될 수 있다. 자극하고/하거나, 활성화하고/하거나, 억제하고/하거나, 불활성화하는 신규 화합물을 디자인하기 위해 glmS 라이보스위치의 원자 구조가 사용될 수 있다.

Description

ＧＬＭＳ 라이보스위치, ＧＬＭＳ 라이보스위치를 사용한 구조-기초 화합물 디자인, 및 ＧＬＭＳ 라이보스위치를 사용하는 방법 및 조성물{GLMS RIBOSWITCHES, STRUCTURE-BASED COMPOUND DESIGN WITH GLMS RIBOSWITCHES, AND METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE OF AND WITH GLMS RIBOSWITCHES}
본 발명은 일반적으로 유전자 발현 분야 및 구체적으로는 유전자 발현의 조절 분야에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 2006년 9월 6일자로 출원된 미국 가출원 제60/842,870호, 및 2006년 9월 16일자로 출원된 미국 가출원 제60/844,844호를 우선권 주장한다. 2006년 9월 6일자로 출원된 미국 가출원 제60/842,870호, 및 2006년 9월 16일자로 출원된 미국 가출원 제60/844,844호는 전체가 본원에 참고로 도입된다.
연방정부 개발기금에 대한 내용
본 발명은 미국국립과학재단(National Science Foundation)에 의해 번호 MCB 0544255 및 EIA-032351; DARPA에 의해 번호 W911NF-04-1-0416; NIH에 의해 번호 NIH R33-DK070270으로 정부 지원 하에서 진행되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.
배경기술
정확한 유전자 제어는 살아있는 시스템의 본질적인 특징인데, 이는 세포가 유전자 발현 패턴을 변화시킴으로써 여러 생화학적 신호와 환경적 단서에 대해 반응해야 하기 때문이다. 유전자 조절의 대부분의 공지된 메커니즘은, 화학적 또는 물리적 자극을 감지한 후, 관련 DNA 또는 메신저 RNA 서열과 선택적으로 상호작용함으로써 유전자 발현을 조절하는 단백질 인자들의 사용을 포함한다. 단백질은 복합체 형상을 채택할 수 있으며, 살아있는 시스템이 이들의 화학적 및 물리적 환경을 정확하게 감지하는 것을 가능하게 하는 다양한 기능을 수행할 수 있다. 전형적으로 대사산물에 대해 반응하는 단백질 인자들은, 전사 개시를 조절하기 위해 DNA를 결합시킴으로써(예컨대, lac 리프레서(repressor) 단백질: 매튜스(Matthews, K.S.) 및 니콜(Nichols, J.C.)의 문헌 [1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164]), 전사 종결을 조절하기 위해 RNA를 결합시킴으로써(예컨대, PyrR 단백질: 스위트저(Switzer, R.L.) 등의 문헌 [1999, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367]), 또는 번역을 위해 RNA를 결합시킴으로써(예컨대, TRAP 단백질: 바비트즈케(Babitzke, P.) 및 골닉(Gollnick, P.)의 문헌 [2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802]) 작용한다. 단백질 인자는 알로스테릭(allosteric) 조절 또는 후-번역 변경과 같은 다양한 메커니즘에 의해 환경적 자극에 대해 반응하고, 고도로 반응하는 유전자 스위치로서 작용하도록 이들 메커니즘을 개발하는데 능숙하다(예컨대, 프타슨(Ptashne, M.) 및 간(Gann, A.)의 문헌 [(2002). Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조).
유전자 조절에 단백질 인자가 광범위하게 관련되어 있다는 것과 더불어, RNA가 유전자 조절에서 능동적 역할을 할 수 있다는 것이 또한 알려져 있다. 최근 연구에서는 작은 비-암호 RNA가 파괴를 위해 mRNA를 선택적으로 표적화하는데 역할을 담당하며 그 결과로서 유전자 발현의 하향-조절을 초래한다는 실질적인 역할이 드러나기 시작하였다(예컨대, 한논(Hannon, G.J.)의 문헌 [2002, Nature 418, 244-251] 및 이 문헌의 참고문헌들 참조). 이 RNA 간섭 과정은 짧은 RNA가 왓슨-크릭 염기 상보성을 통해 의도한 mRNA 표적을 선택적으로 인지한 후, 결합된 mRNA들이 단백질의 작용에 의해 파괴될 수 있는 장점을 갖는다. RNA는 이 시스템에서 분자 인식에 대한 이상적인 요인인데, 이는, 진화적 과정을 통해 새로운 표적-특이적 RNA 인자들을 생성하는 것이, 새롭지만 고도로 특이한 RNA 결합 부위들을 갖는 단백질 인자들을 생성해야 하는 것보다 훨씬 더 용이하기 때문이다.
생물학이 효소, 수용체 및 구조 기능에 대해 갖는 대부분의 필요조건을 단백질이 충족하고 있지만, RNA도 또한 이들 능력을 제공할 수 있다. 예를 들면, RNA는 다수의 리보자임 도메인(문헌 [Cech & Golden, Building a catalytic active site using only RNA. In: The RNA World R. F. Gesteland, T. R. Cech, J. F. Atkins, eds., pp.321-350(1998)]; 문헌 [Breaker, In vitro selection of catalytic polynucleotides. Chem. Rev. 97, 371-390(1997)]) 및 상당한 효소적 힘 과 정확한 분자 인식을 나타내는 수용체 도메인(문헌 [Osborne & Ellington, Nucleic acid selection and the challenge of combinatorial chemistry. Chem. Rev. 97, 349-370(1997)]; 문헌 [Hermann & Patel, Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 287, 820-825(2000)])을 형성하기에 충분한 구조적 가소성을 갖고 있다. 더욱이, 이들 활성은 이펙터(effector) 분자들에 의해 선택적으로 조절되는 알로스테릭 리보자임(문헌 [Soukup & Breaker, Engineering precision RNA molecular switches. Proc. Natl. Acad. Sd. USA 96, 3584-3589(1999); 시타라만(Seetharaman) 등의 문헌 [Immobilized riboswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures. Nature Biotechnol. 19, 336-341(2001)])을 생성하기 위해 조합될 수 있다.
박테리아 라이보스위치 RNA는 특정 mRNA의 주요 암호화 영역의 5'-미번역 영역(5'-UTR) 내에 주로 위치하는 유전자 제어 요소이다. 구조 프로빙 연구들(이하 추가로 논의됨) 결과에서는, 라이보스위치 요소들이 일반적으로 2개의 도메인: 리간드-결합 도메인으로서 작용하는 천연 압타머(aptamer)(허만(T. Hermann, D. J.)의 문헌 [Patel, Science 2000, 287, 820]; 골드(L. Gold) 등의 문헌 [Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763]), 및 유전자 발현에 수반된 RNA 요소들과 상호작용하는 '발현 플랫폼'(예컨대, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno, SD) 요소; 전사 종료자 줄기)으로 구성되는 것으로 드러난다. 당해 분야에서 요구되는 것은 glmS 라이보스위치를 조절하는데 사용될 수 있는 방법과 조성물이다.
본 명세서에 포함되고 이의 일부를 구성하는 첨부 도면은 앞서 개시된 방법 및 조성물의 여러 실시양태를 설명하며, 상기 설명과 함께 앞서 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하기 위한 것이다.
도 1은 glmS 리보자임의 구조 정보를 도시한다. a) 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)로부터의 glmS 리보자임의 2차 구조 모델 및 b) β-아노머(anomer)(1a), 비사이클릭 형태(1b), 및 glmS 리보자임의 리간드인 GlcN6P의 α-아노머(1c)의 평형. 상기 2차 구조 모델은 x선 데이터에 기초하여 써모아나에로박터 텡콘젠시스(Thermoanaerobacter tengcongensis)로부터의 glmS 리보자임에 대한 모델로부터 채택되었다.
도 2는 GlcN6P 유사체, 및 glmS 리보자임 자가-절단에 대한 이의 영향을 도시한다. a) GlcN6P 유사체의 화학 구조. GlcN6P로부터의 차이점들이 구조를 GlcN6P와 비교함으로써 알 수 있다. b) GlcN6P(1) 또는 표시된 바와 같은 여러 화합물과 함께 항온처리된 200-뉴클레오타이드 glmS RNA 구축물(construct)을 사용하는 리보자임 절단 분석의 수율. 5' 32P-표지된 전구체(Pre) RNA는 각 레인에서 표시된 바와 같이 1 mM 이펙터(effector)의 존재 하에서 30분 동안 항온처리되었다. 바(-)로 표시된 것은 1 mM GlcN6P를 함유하는 반응이 0시에 적재 완충액으로 종결되는 경우 RNA 절단의 정도를 나타낸다. 모든 분석에 대한 데이터는 최저량의 절단을 발생하는 반응에 존재하는 절단된 RNA의 양에 대해 교정되었다(7을 포함하는 반응). 텅빈 바는 리보자임 속도 상수를 구축하기 위해 추가로 조사되는 활성 화합물을 표시한다. c) 각각 100μM에서의, 리보자임 절단에 대한 관찰된 속도 상수(kobs), 및 최고 활성 GlcN6P 유사체에 대한 GlcN6P(1)를 사용하여 측정된 속도 상수의 비율(kl/k). 잔존 화합물에 대한 속도 상수는 0.001 분-1 미만인 것으로 예측된다.
도 3은 8의 여러 농도에서 리보자임 자가-절단에 대한 관찰된 속도 상수를 도시한다. 삽입 부분은 방사선표지된 전구체(Pre)가 표시된 바와 같이 8의 여러 농도(c)로 다양한 시간 동안 항온처리된 3가지 대표적인 분석을 나타낸다. 절단된(Clv) RNA는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분리된다. 리보자임 반응의 분취물이 제거되고, 0, 4, 15.3 및 19.5시간에서 종결되었다.
도 4는 glmS 리보자임의 예정된 분자 인지 측정을 도시한다. 일부 작용기에 대한 분자 접촉의 정확한 유형 또는 개수의 확인이 추가 유사체들의 시험에서 요구된다.
도 5는 GlcN6P 유사체에 의한 바실루스 세레우스의 200-뉴클레오타이드 glmS 리보자임의 농도-의존성 활성화를 도시한다. 화합물 13(꽉찬 사각형), 9(텅빈 사각형), 8(텅빈 삼각형), 12(텅빈 원형) 및 4(꽉찬 삼각형)에 대한 데이터가 표시되고 있다. 8에 대한 데이터는 또한 도 3에 주로 제시된다.
도 6은 glmS 라이보스위치의 3차원 결정 구조를 나타내며, 이의 제어는 박테리아 세포벽 생합성 및 생존성에 대해 필수적인 것이다. 제시된 라이보스위치의 구조는 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 것이다. 상기 구조는 이 리보자임/라이보스위치 내의 RNA의 3차원 배열인 것으로 드러났으며, RNA의 활성 부위에서 결합된 작은 분자 이펙터, 글루코사민-6-포스페이트를 나타낸다.
도 7A 및 7B는 2개의 glmS 리보자임의 서열 및 구조를 도시한다. A. 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 단일분자 glmS 리보자임(5' 말단으로부터 3' 말단까지, 서열 번호 1 내지 8). 화살표는 GlcN6P에 의해 자극된 리보자임-매개 절단의 부위를 나타낸다(울프손(Wolfson)의 문헌 [Chem Biol 2006; 13: 1-3]). B. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphilococus aureus)로부터 유도된 이분자 glmS 리보자임 구축물(5' 말단으로부터 3' 말단까지, 서열 번호 9 내지 18). 이 구축물은 P1 줄기의 절두(truncation) 및 15-뉴클레오타이드 기질 RNA의 사용으로 인해 야생형 glmS 리보자임과 다르다(회색으로 제시됨; 서열 번호 9 및 10). 상기 기질은 이의 5'-터미날에서 Cy3(상표명) 수용체로 이의 3'-터미날에서 5/6-FAM 공여체로 표지된다.
도 8은 glmS 리보자임의 콘센서스 서열 및 구조를 도시한다. 화살촉 부분은 절단 부위를 나타낸다. 원형 뉴클레오타이드는 대표적인 glmS 리보자임의 97% 이상으로 보존된다.
도 9A, 9B 및 9C는 바실루스 안트라시스 glmS 리보자임에 의해 결합하는 GlcN6P를 도시한다. (A) GlmS 리보자임 내의 2개의 마그네슘 이온에 의한 포스페이트 결합. P2.1, A28 및 G1 내의 뉴클레오타이드는 2개의 수화된 마그네슘 이온을 조직화하기 하고 GlcN6P 포스페이트 산소를 활성 부위에서 배향시키기 위해 물- 매개 접촉을 사용한다. (B) 뉴클레오-염기 작용기에 의한 GlcN6P 당 고리의 인지. 상기 당은 뉴클레오타이드 A-42, U43 및 G57, 및 G1의 당과 3'-포스페이트를 접촉시킨다. glmS의 상부에 쌓인 G1에서의 퀴닌 염기(도 9A)는 수소 결합 접촉이 보이도록 도시되어 있지 않다. (C) 이 변경을 안정화하도록 기대된 활성 부위 상호작용은 얇은 대쉬선으로 표시된다. GlcN6P의 에탄올아민 부분과 반응성 포스페이트 사이의 촉매적 임계 상호작용은 더 두꺼운 대쉬선으로서 제시된다. 절단되기 쉬운 포스페이트, 5'-O 이탈기(이는 메틸화되어 있음) 및 2'-O 진핵물질이 구로서 제시된다. 뉴클레오타이드는 glmS 라이보스위치에 대해 문헌 [Cochrane 2007](이는 번호매김을 위해 본원에 참고로 인용하고 있다)에서 사용된 번호매김에 의해 한정된다.
특정 천연 mRNA는 RNA가 직접 작은 유기 분자를 결합시키는 대사산물-민감성 유전자 스위치로서 작용하는 것으로 밝혀져 있다. 이 결합 과정은 mRNA의 형태를 변화시키며, 이로 인해 다양한 여러 메커니즘에 의한 유전자 발현에서의 변화가 유발된다. 상기 천연 스위치들은 항생 및 다른 작은 분자 요법에 대한 표적이다.
본원은 glmS 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단할 수 있는 화합물, 및 이러한 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다. 또한, glmS 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 라이보스위치는 트리거 분자(trigger molecular)의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 제어하는 기능을 한다. 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하기 위해 화합물이 사용될 수 있다. 라이보스위치를 위한 트리거 분자(및 다른 활성화 화합물)는 라이보스위치를 활성화하는데 사용될 수 있다. 트리거 분자 이외의 화합물은 일반적으로 라이보스위치를 불활성화하거나 차단하는데 사용될 수 있다. 라이보스위치는 또한 예컨대 라이보스위치의 존재로부터 트리거 분자를 제거함으로써 불활성화될 수 있다. 라이보스위치는 예컨대 라이보스위치를 활성화하지 않는 트리거 분자의 유사체의 결합에 의해 차단될 수 있다.
또한 본원은, glmS 라이보스위치가 포함된 RNA 분자와 화합물을 접촉시킴으로써 RNA 분자의 발현, 또는 RNA 분자를 암호화하는 유전자의 발현을 변경하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 라이보스위치는 트리거 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 제어하는 기능을 한다. 따라서, glmS 라이보스위치가 포함된 해당 RNA 분자를, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나 또는 차단하는 조건에 가하는 것이 RNA의 발현을 변경하는데 사용될 수 있다. 발현은 예컨대 RNA의 전사의 종결의 결과로서 또는 RNA에 대한 리보솜 결합을 차단하는 결과로서 변경될 수 있다. 트리거 분자 또는 이의 유사체의 결합은 라이보스위치의 속성에 따라 RNA 분자의 발현을 감소 또는 방지하거나, 또는 RNA 분자의 발현을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.
또한 본원은, glmS 라이보스위치를 함유하는 RNA 또는 천연 발생 유전자의 발현을, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단함으로써 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 유전자가 이를 갖는 세포 또는 유기체의 생존에 필수적인 것이라면, glmS 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 것은 세포 또는 유기체의 사망, 정지 또는 쇠약에 이르게 할 수 있다. 예를 들면, 미생물의 생존에 필수적인 천연 발생 유전자 내의 천연 발생 라이보스위치를 활성화하면 미생물의 사망을 초래할 수 있다(라이보스위치의 활성화가 발현을 멈추거나 억제하는 경우). 이는 항미생물 및 항생 효과를 위해 앞서 개시된 화합물 및 방법을 사용하는 것에 대한 기초이다.
본원은 글루코사민-6-포스페이트가 아닌, 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 생리학적으로 가수분해 가능한 및 허용 가능한 에스터, 또는 둘 다를 제공한다:
Figure 112009020170115-PCT00001
상기 식에서,
R1은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R2는 NH-R6이고, 이때 R6은 H, CH3, C2H5, n-프로필, C(O)CH3, C(O)C2H5, C(O)n-프로필, C(O)아이소-프로필, C(O)OCH3, C(O)OC2H5, C(O)NH2 또는 NH2이고,
R3은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R4는 수소 결합 공여체이고,
R5는 수소 결합 수용체이다.
또한, R4가 OH, SH, NH2, NH3 +, CH2OH, CH(OH)CH3, CH2CH2OH, CH2SH, CH(SH)CH3, CH2CH2SH, CH2NH2, CH(NH2)CH3, CH2CH2NH3, CO2H, CONH2, CONH알킬, =NH, =NOH, =NSH, =NCO2H, =CH2, CH=NH, CH=NOH, CH=NSH, CH=NCO2H, OCH2OH, OCH2CH2OH, PhOH, NH알킬, NHNH2, NHNH알킬, NHCO알킬, NHCO2알킬, NHCONH2, NHSO2알킬 또는 NHO알킬인 화합물을 제공한다. 또한, R1이 H 또는 OH이고 R2가 NH2 또는 NHCH3인 경우, R4가 OH가 아닌 화합물을 제공한다. 또한, R5가 OP(O)(OH)2, OP(S)(OH)2, OP(O)OHSH, OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인 화합물을 제공한다. 또한, R5가 OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인 화합물을 제공한다. 더욱이, R5는 음으로 하전될 수 있다. 또한, R5가 =O, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, 이때 R9가 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인 화합물을 제공한다. 또한, R5가 =O, OH, OR9, COR9, CN, NO2, 테트라졸, SOR9, N(R9)2, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, 이때 R9가 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인 화합물을 제공한다. 또한, R4가 NH2, NH3 +, OH, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인 화합물을 제공한다. 또한, R4가 NH2, NH3 +, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인 화합물을 제공한다. 앞서 개시된 화합물은 glmS-반응성 라이보스위치를 활성화할 수 있다.
또한 본원은, 화학식 I의 화합물을, glmS-반응성 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포와 접촉시켜 상기 유전자 발현을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 화합물은 상기 glmS-반응성 라이보스위치에 결합함으로 써 상기 유전자의 발현을 억제하는, 방법을 제공한다. 세포는 예컨대 박테리아 세포일 수 있으며, 상기 화합물은 상기 박테리아 세포를 사멸시키거나 박테리아의 생장을 억제할 수 있다. 상기 세포는 glmS 라이보스위치를 함유할 수 있다. 상기 세포는 바실루스(Bacillus) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)일 수 있다.
또한 본원은, 세포 내의 유전자 발현을 억제하는 방법, 및/또는 화합물을 개체(subject)에게 투여하여 세포와 화합물을 접촉시킴으로써 상기 세포를 함유하는 개체 내의 세포 생장을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 글루코사민-6-포스페이트를 기질로서 사용하는 개체의 효소에 대한 기질이 아니다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 글루코사민-6-포스페이트를 변경시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아니다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 글루코사민-6-포스페이트를 물질대사시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아니다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 글루코사민-6-포스페이트를 이화시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아니다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 세포는 개체 내의 박테리아 세포이고, 이때 상기 화합물은 상기 박테리아 세포를 사멸시키거나 박테리아 세포의 생장을 억제한다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 개체는 박테리아로 감염되어 있다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 또 다른 항미생물 화합물과 조합 투여된다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 바이오필름 내의 박테리아 생장을 억제한다.
또한 본원은, 암호화 영역에 작동 가능하게 연결된 glmS 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조절 가능한 유전자 발현 구축물 및 앞서 기재된 화합물을 포함하는 조성물로서, 이대 glmS 라이보스위치는 RNA의 발현을 조절하고 glmS 라이보스위치 및 암호화 영역은 이종성을 나타내는, 조성물을 제공한다. 상기 glmS 라이보스위치는 상기 화합물에 의해 활성화된 경우 신호를 생성할 수 있다. 예를 들면, 라이보스위치는 상기 화합물에 의해 활성화된 경우 입체구조를 변화시킬 수 있으며, 입체구조의 변화는 입체구조 의존성 표지를 통해 신호를 생성할 수 있다. 더욱이, 라이보스위치는 상기 화합물에 의해 활성화된 경우 입체구조를 변화시킬 수 있고, 입체구조의 변화는 라이보스위치에 연결된 암호화 영역의 발현에 변화를 일으키며, 상기 발현에서의 변화는 신호를 생성한다. 상기 신호는, 라이보스위치에 연결된 암호화 영역으로부터 발현된 리포터(reporter) 단백질에 의해 생성될 수 있다.
또한 본원은, (a) glmS 라이보스위치를 통해 일어나는, glmS 라이보스위치가 포함된 RNA를 암호화하는 유전자의 유전자 발현의 억제에 대해 앞서 기재된 바와 같은 화합물을 시험하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 유전자 발현을 억제하는 화합물을 glmS 라이보스위치가 포함된 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 유전자 발현을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 화합물은 glmS 라이보스위치에 결합함으로써 유전자의 발현을 억제하는, 방법을 제공한다.
또한 본원은, 라이보스위치의 결정질 원자 구조를 제공한다. 예를 들면, 본 발명에는 표 2에 열거된 원자 배위를 포함하는 원자 구조, 도 9에서 표시된 바와 같은 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 구조, 및 표 2 내에 포함되는 도 9에서 표시 된 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 배위를 포함하는, 천연 glmS-반응성 라이보스위치의 원자 구조를 제공한다. 상기 표 2 내에 포함되는 도 9에서 표시된 결합 포켓의 원자 배위는 본원에서 결합 포켓 원자 구조로서 지칭된다. 상기 표 2 내에 포함되는 도 9에서 표시된 활성 부위의 원자 배위는 본원에서 활성 부위 원자 구조로서 지칭된다. 이들 구조는 라이보스위치와 결합 리간드의 상호작용을 모델링 및 평가에 유용하다. 이들은 또한 라이보스위치와 상호작용하는 화합물들을 확인하는 방법에 유용하다. 상기 구조의 임의의 유용한 부분은 본원에 기재된 바와 같이 목적 및 모델링에 사용될 수 있다. 특히, 추가의 주위 구조를 갖거나 갖지 않은 활성 부위 또는 결합 포켓 원자 구조는 앞서 개시된 방법들에서 모델링에 사용될 수 있다.
또한 본원은, 라이보스위치의 원자 구조를 시험 화합물로 모델링하고, 상기 시험 화합물이 상기 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 단계를 포함하는, 라이보스위치와 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이는 라이보스위치와 시험 화합물의 원자적 접촉을 측정함으로써 실시될 수 있다. 더욱이, 라이보스위치와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 화합물의 유사체는, 원자적 접촉을 분석한 후, 상기 유사체의 원자 구조를 최적화하여 상호작용을 최대화함으로써 생성될 수 있다. 이들 방법은 고출력 스크린과 함께 사용될 수 있다.
또한 본원은, glmS 라이보스위치의 원자 구조를 시험 화합물로 모델링하고, 상기 시험 화합물이 상기 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 단계를 포함하는, 라이보스위치와 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 더욱이, 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 것은, 라이보스위치의 모델에서 시험 화합물에 대한 예상된 최소 상호작용 에너지, 예상된 결합 상수, 예상된 해리 상수 또는 이들의 조합을 측정함을 포함할 수 있다. 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 것은, 라이보스위치의 모델로 시험 화합물의 하나 이상의 예상된 결합, 하나 이상의 예상된 상호작용 또는 이들의 조합을 측정함을 포함할 수 있다. 원자적 접촉을 측정함으로써 시험 화합물과 라이보스위치의 상호작용을 확인한다. 라이보스위치와 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법은 시험 화합물의 유사체를 확인하고, 시험 화합물의 유사체가 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인함을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본원은, 앞서 개시된 방법에 의해 확인된 화합물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하는, 박테리아를 사멸시키거나 박테리아의 생장을 억제하는 방법을 제공한다. 또한 본원은, 앞서 개시된 방법에 의해 확인된 화합물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하는 박테리아의 사멸 방법을 제공한다. 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하기 위해 겔-기초 분석 또는 칩-기초 분석을 이용할 수 있다. 시험 화합물은 반데르발스 상호작용, 수소 결합, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 상호작용할 수 있다. 라이보스위치는 예컨대 RNA 절단 리보자임을 포함할 수 있다. 켄칭(quenching) 부분을 포함하는 핵산이 절단되는 경우, 형광 신호가 생성될 수 있다. 분자 비콘 기술(molecular beacon technology)을 이용하여 형광 신호를 생성할 수 있다. 본원에 개시된 방법들은 고출력 스크린을 사용하여 실시될 수 있다.
또한 본원은, 라이보스위치를 활성화할 수 있거나, 불활성화할 수 있거나, 또는 차단할 수 있는 화합물을 선택하고 확인하는 조성물 및 방법을 제공한다. 라이보스위치의 활성화는 트리거 분자의 결합에 따른 라이보스위치의 상태 변화를 지칭한다. 라이보스위치는 트리거 분자 이외의 화합물에 의해 및 트리거 분자의 결합 이외의 방식으로 활성화될 수 있다. 용어 "트리거 분자"는 본원에서 라이보스위치를 활성화할 수 있는 분자 및 화합물을 지칭하는데 사용된다. 이는 라이보스위치를 위한 천연 또는 정상 트리거 분자, 및 라이보스위치를 활성화할 수 있는 다른 화합물을 포함한다. 천연 또는 정상 트리거 분자는 속성상 소정의 라이보스위치를 위한 트리거 분자이거나, 또는 일부 비-천연 라이보스위치의 경우 이에 대하여 라이보스위치가 디자인되거나, 또는 이를 사용하여 라이보스위치가 선택될 수 있는 트리거 분자이다(예컨대, 시험관 내 선택 또는 시험관 내 진화 기술에서와 같음). 비-천연 트리거 분자는 비-천연 트리거 분자로서 지칭될 수 있다.
라이보스위치의 불활성화는 트리거 분자가 결합되지 않는 경우 라이보스위치의 상태 변화를 지칭한다. 라이보스위치는 트리거 분자 이외의 화합물의 결합에 의해 및 트리거 분자의 제거 이외의 방식으로 불활성화될 수 있다. 라이보스위치의 차단은 트리거 분자의 존재가 라이보스위치를 활성화하지 않는 경우의 라이보스위치의 조건 또는 상태를 지칭한다. 라이보스위치의 활성화는 임의의 적합한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 라이보스위치는 리포터 RNA에 결합될 수 있고, 리포터 RNA의 발현, 발현 수준 또는 발현 수준의 변화는 시험 화합물의 존재와 부재시에 측정될 수 있다. 다른 예로서, 라이보스위치는 입체구조 의존성 표지를 포 함할 수 있으며, 이로부터의 신호는 라이보스위치의 활성화 상태에 따라 변한다. 이러한 라이보스위치는 바람직하게는 천연 발생 라이보스위치로부터 또는 이로부터 유도된 압타머 도메인을 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 라이보스위치의 활성화의 평가는 대조 분석 또는 측정을 사용하거나, 또는 대조 분석 또는 측정의 사용 없이 수행될 수 있다. 라이보스위치를 불활성화하는 화합물을 확인하는 방법은 유사한 방식들로 수행될 수 있다.
또한 본원은, 라이보스위치를 활성하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물을 확인하고 상기 확인된 화합물을 제조함으로써 수득된 화합물을 제공한다. 이는 예컨대 본원에 개시된 화합물의 확인 방법과 상기 확인된 화합물의 제조 방법을 조합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물과 라이보스위치를 접촉시키는 단계, 상기 라이보스위치의 활성화를 평가하는 단계, 및 라이보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된 경우 상기 라이보스위치를 활성화하는 시험 화합물을 화합물로서 제조하는 단계에 의해서 화합물이 제조될 수 있다.
또한 본원은, 화합물에 의한 라이보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단을 조사하고 상기 조사된 화합물을 제조함으로써 제조된 화합물을 제공한다. 이는 예컨대 본 발명에 개시된 화합물의 활성화, 불활성화 또는 차단 평가 방법과 상기 조사된 화합물의 제조 방법을 조합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물과 라이보스위치를 접촉시키는 단계, 상기 라이보스위치의 활성화를 평가하는 단계, 및 라이보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된 경우, 상기 라이보스위치를 활성화하는 시험 화합물을 화합물로서 제조하는 단계에 의해서 화합물이 제조될 수 있다. 라이보스위치를 활성하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 능력에 대해 화합물을 조사하는 것은, 라이보스위치를 활성하거나, 불활성화하거나, 또는 차단한다는 것이 이전에는 알려지지 않았던 화합물을 확인하는 것, 및 화합물이 라이보스위치를 활성하거나, 불활성화하거나, 또는 차단한다고 이미 알려진 경우에는 라이보스위치를 활성하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물의 능력을 평가하는 것을 모두 지칭한다.
또한 본원은, 세포, 예컨대 개체 내에 존재하는 박테리아 세포의 생장을 억제하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 효과량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이로 인해 화합물이 세포와 접촉하게 된다. 개체는 예컨대 박테리아로 감염될 수 있으며, 상기 박테리아 세포는 상기 화합물에 의해 억제될 수 있다. 박테리아는 임의의 박테리아, 예컨대 바실루스 속 또는 스타필로코쿠스 속으로부터의 박테리아일 수 있다. 이와 관련하여, 박테리아 생장은 또한 박테리아가 발견되는 장소에서 억제될 수 있다. 예를 들면, 유체 중, 바이오필름 내 및 표면 상에서의 박테리아 생장이 억제될 수 있다. 본원에 개시된 화합물은 임의의 다른 화합물 또는 조성물과 조합 투여 또는 사용될 수 있다. 예를 들면, 앞서 개시된 화합물은 다른 항미생물 화합물과 조합 투여 또는 사용될 수 있다.
앞서 개시된 방법 및 조성물의 추가 장점은 이하 상세한 설명에서 부분적으로 설명될 것이며, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 이해되거나, 또는 앞서 개시된 방법 및 조성물의 실시에 의해 알 수 있다. 앞서 개시된 방법 및 조성물의 장 점은 첨부된 청구의 범위에서 특별히 표시된 요소들 및 조합들에 의해 실현 및 얻어질 것이다. 상기 일반적인 설명과 하기 상세한 설명은 둘 다 예시적인 것이고, 단지 설명을 위한 것이며, 본 발명이 청구하는 것을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
앞서 개시된 방법 및 조성물은 본원에 포함된 특정 실시양태의 이하 상세한 설명 및 실시예, 및 도면 및 이의 앞선 설명 및 이하 설명에 의해 더 용이하게 이해될 수 있다.
메신저 RNA는 전형적으로 단백질- 또는 작은 RNA-조절 인자에 의해 및 번역 과정 동안 리보좀에 의해 작용할 때 유전자 정보의 수동적인 운반자로서 여겨져 왔다. 특정 mRNA는 천연 압타머 도메인을 운반하며, 이들 RNA 도메인에 특이적 대사산물이 직접 결합하는 것은 유전자 발현의 조절을 유도한다고 밝혀졌다. 천연 라이보스위치는 천연 RNA와 전형적으로 관련되지 않은 2가지 놀라운 기능을 나타낸다. 첫째, mRNA 요소는 한 구조가 이의 표적 대사산물에 대한 정확한 결합 포켓으로서 작용하는 구별되는 구조적 상태를 채택할 수 있다. 둘째, 구조적 상태들 사이의 대사산물-유도된 알로스테릭 상호전환은 일부 구별되는 메커니즘들 중 하나에 의해 유전자 발현 수준의 변화를 유발시킨다. 라이보스위치는 전형적으로 2개의 별도 도메인들로 나누어질 수 있다: 하나는 표적에 선택적으로 결합하고(압타머 도메인), 다른 하나는 유전자 제어에 영향을 미친다(발현 플랫폼). 유전자 발현의 대사산물-의존성 알로스테릭 제어를 유발하는 것은 바로 이 2개의 도메인들 사이의 동적인 상호작용이다.
구별되는 부류의 라이보스위치들이 확인되었고, 선택적으로 활성화 화합물(본 발명에서는 트리거 분자로서 언급됨)을 선택적으로 인지하는 것으로 나타났다. 예를 들면, 조효소 B12, 글리신, 싸이아민 피로포스페이트(TPP) 및 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN)는 이들 화합물의 대사 또는 수송 경로에서 핵심 효소를 암호화하는 유전자에 존재하는 라이보스위치를 활성화한다. 각 라이보스위치 부류의 압타머 도메인은 고도로 보존된 콘센서스 서열 및 구조를 따라 변경된다. 그러므로, 서열 상동성 연구는 관련된 라이보스위치 도메인을 확인하는데 사용될 수 있다. 라이보스위치 도메인은 박테리아, 고세균(archea) 및 진핵생물로부터의 다양한 유기체에서 발견되었다.
glmS 리보자임은 글루코사민-6-포스페이트 합성효소를 암호화하는 박테리아 mRNA의 5'-UTR에 위치하는 시스-절단 촉매 라이보스위치이다(문헌 [Winkler 2004]). 리보자임은 특별히 대사산물 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P), 즉 glmS-암호화된 단백질의 자체 대사산물에 의한 glmS-mRNA 절단을 위해 활성화될 수 있다. 따라서, 이 조절은 세포벽 전구체로서 작용하는 대사산물의 존재를 감지하는 피드백-억제 메커니즘에 의존한다(glmS 라이보스위치와 관련된 교시내용을 위해 전체가 본원에 참고로 인용하고 있는 메이어(Mayer) 및 파물록(Famulok)의 문헌 [ChemBioChem 2006, Vol. 7, p. 602-604]).
A. 라이보스위치 RNA의 일반적인 조직
박테리아 라이보스위치 RNA는 주로 특정 mRNA의 주요 암호화 영역의 5'-미번 역 영역(5'-UTR) 내에 위치한 유전자 제어 요소이다. 구조 프로빙 연구(이하 구체적으로 논의됨)에서는, 라이보스위치 요소가 일반적으로 2개의 도메인:리간드-결합 도메인으로서 작용하는 천연 압타머(허만의 문헌 [Science 2000, 287, 820]; 골드 등의 문헌 [Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763]) 및 유전자 발현에 포함된 RNA 요소와 상호작용하는 '발현 플랫폼'(예컨대, 샤인-달가노(SD) 요소; 전사 종료자 줄기)으로 구성되는 것으로 드러난다. 이들 결론은 시험관 내에서 합성된 압타머 도메인이 발현 플랫폼이 없을 때 적절한 리간드와 결합한다는 관찰로부터 유출되었다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2, 3 및 6 참조). 더욱이, 구조적 프로빙 연구에서는, 대부분의 라이보스위치의 압타머 도메인이 독립적으로 조사되었을 때 특정 2차- 및 3차-구조 접힘을 채택한다는 것, 즉 본질적으로는 전체 5' 리더 RNA의 관점에서 조사될 때의 압타머 구조와 동일하다는 것을 시사한다. 이는 많은 경우 압타머 도메인이 발현 플랫폼과는 무관하게 접히는 기본 단위라는 것을 의미한다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2, 3 및 6 참조).
궁극적으로, 압타머 도메인의 리간드-결합 또는 미결합 상태는 발현 플랫폼을 통해 간섭을 받으며, 이는 유전자 발현시 영향을 발휘하는 원인이다. 기본 요소로서의 라이보스위치의 관점은 압타머 도메인이 다양한 유기체들에서 고도로 보존된 반면(TPP 라이보스위치에 대해 관찰된 것과 같이 계들 사이에서조차), 발현 플랫폼은 서열, 구조 및 이에 의해 첨부된 개방 판독 프레임의 발현이 제어되는 메커니즘에서 상이하다는 사실에 의해 추가로 지지된다. 예를 들면, 바실루스 섭틸 리스의 tenA mRNA의 TPP 라이보스위치에 대한 리간드 결합은 전사 종결을 유발한다(미로노브(A. S. Mironov) 등의 문헌 [Cell 2002, 111, 747]). 이 발현 플랫폼은 TPP 결합이 SD 차단 메커니즘에 의해 번역의 억제를 유발하는 대장균의 thiM mRNA의 TPP 라이보스위치의 발현 플랫폼과 비교하였을 때 서열 및 구조가 다르다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2 참조). TPP 압타머 도메인은 용이하게 식별할 수 있으며, 이들 2개의 전사 유닛 사이에서 거의 동일한 기능적 특성을 나타내지만, 유전자 제어 메커니즘과 이들을 내포하는 발현 플랫폼은 매우 상이하다.
라이보스위치 RNA에 대한 압타머 도메인은 전형적으로 약 70 내지 170 nt 길이 범위이다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 도 11 참조). 이 관찰은 다소 예상된 밖의 것이었는데, 시험관 내 진화 실험에서는 길이가 상당히 더 짧고 구조가 복잡한 광범위한 작은 분자-결합 압타머가 확인되었다(허만의 문헌 [Science 2000, 287, 820]; 골드 등의 문헌 [Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763]; 파물록의 문헌 [Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, 324]). 인공 압타머와 관련하여 실제로 복잡성과 천연 압타머 서열의 정보 내용이 증가한데 대한 이유가 증명되어야 할 과제로 남아있지만, 이 복잡성은 고도의 친화성과 선택성으로 기능을 하는 RNA 리포터를 형성하기 위해 필요한 것으로 여겨진다. 리간드-라이보스위치 복합체에 대한 겉보기 KD 값의 범위는 수 나노몰로부터 수 마이크로몰까지의 범위이다. 또한, 일부 압타머 도메인이 첨부된 발현 플랫폼으로부터 분리될 때, 무상 라이보스위치의 친화성보다 월등한 표적 리간드에 대한 개선된 친화성을 나타낸다(약 10 내지 100배)(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2 참조). 아마도, 완전히 무상 라이보스위치 RNA에 의해 요구되는 다수의 구별되는 RNA 형태를 샘플화하는 데는 많은 비용이 들며, 이는 리간드 친화성의 손실을 반영하는 것이다. 압타머 도메인이 분자 스위치로서 작용해야 하기 때문에, 이는 또한 이들의 더 정교한 구조를 합리화하는 것을 도와주어야 하는 천연 압타머에 대한 기능적 수요에 부가되는 것이 될 것이다.
B. 박테리아의 전사 종결의 라이보스위치 조절
박테리아는 주로 전사를 종결하기 위해 2개 방법을 사용한다. 특정 유전자는 Rho 단백질에 의존적인 종결 신호에 통합하는 한편(리차드손(J. P. Richardson)의 문헌 [Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1577, 251]), 다른 것들은 전사 연장 복합체를 탈-안정화하기 위해 Rho-무관 종료자를 사용한다(구사로브(I. Gusarov), 누들러(E. Nudler)의 문헌 [Molecular Cell 1999, 3, 495]; 누들러, 고데스만(M. E. Gottesman)의 문헌 [Genes to Cells 2002, 7, 755]). 후자의 RNA 요소는 GC-풍부 줄기-루프 및 이어서 신축적인 6 내지 9개의 우리딜 부분로 구성된다. 고유의 종료자는 박테리아 게놈을 통해 널리 퍼져 있으며(릴로(F. Lillo) 등의 문헌 [2002, 18, 971]), 전형적으로 유전자 또는 오페론의 3'-말단에 위치한다. 흥미롭게도, 고유 종료자가 5'-UTR 내에 위치하고 있는 예가 점점 더 많이 관찰되고 있다.
박테리아에 의해 사용되는 광범위한 유전자 조절 방법 중에서도, RNA 중합효 소가 5'-UTR 내에 있는 종결 신호에 조절된 방식으로 반응하는 사례가 점점 더 많아지고 있다(헨킨(T. M. Henkin)의 문헌 [Current Opinion in Microbiology 2000, 3, 149]). 특정 조건 하에서는 RNA 중합효소 복합체가 종결 신호를 지각 또는 무시하기 위해 외부 신호에 의해 지시를 받기도 한다. 전사 개시가 조절 없이 일어나긴 하였지만, mRNA 합성에 대한 (및 유전자 발현의) 제어는 궁극적으로 고유 종료자의 조절에 의해 지시된다. 아마도, 적어도 2개의 상호 배타적인 mRNA 형태 중 하나가 전사 종결의 신호를 보내는 RNA 구조의 형성 또는 파괴를 초래한다. 반대로 작용하는 인자, 일부 경우에는 RNA이고(그룬디(F. J. Grundy) 등의 문헌 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002, 99, 11121]; 헨킨(T. M. Henkin), 야노프스키(C. Yanofsky)의 문헌 [Bioessays 2002, 24, 700]), 다른 경우에는, 단백질(스툴케(J. Stulke)의 문헌 [Archives of Microbiology 2002, 177, 433])은 일반적으로 특정 세포 내 신호를 받아들이고 계속해서 RNA 형태들 중 하나를 안정화하기 위해 요구된다. 라이보스위치는 RNA 구조 조정과 유전자 제어 절차에 의해 간섭되는 대사산물 신호 사이의 직접적인 연결을 제공한다.
바실루스 세레우스로부터의 glmS 리보자임(문헌 [Winkler 2004}; 문헌 [Barrick 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]; 문헌 [Wilkinson 2005]; 문헌 [Soukup 2006]; 문헌 [Roth 2006]; 문헌 [Jansen 2006])은, 구성원들이 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)에 결합될 때 가속화된 속도 상수로 자가-절단을 경험하는 대표적인 독특한 라이보스위치(문헌 [Mandal 2004]; 문헌 [Winkler 2005]) 부류이다. 이들 대사산물-감지 리보자임은 이들이 glmS 유전자의 발현을 제어하는 다수의 그람-양성 박테리아에서 발견된다. glmS 유전자 생성물(글루타민-프럭토스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼라제)은 리보자임에 결합되고 내부 포스포에스터 전달(문헌 [Winkler 2004])에 의해 자가-절단을 개시하는 GlcN6P(문헌 [Badet-Denisot 1993]; 문헌 [Milewski 2002])을 생성시킨다. 리보자임은 glmS 메신저 RNA의 5'-미번역된 영역(UTR) 내에 매립되고, 자가-절단은 GlmS 단백질 생산을 방지하며, 이로 인해 GlcN6P의 농도가 감소된다. 분자 감지, 자가-절단 및 유전자 제어 기능의 조합은 이 작은 RNA를 리보자임으로서 및 라이보스위치로서 모두 작동하도록 허용한다.
바실루스 세레우스로부터의 glmS 리보자임 및 바실루스 섭틸리스로부터의 동종 리보자임은 약 200μM의 겉보기 해리 상수(KD)를 갖는 GlcN6P에 대응하는 것으로 알려져 있다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]; 문헌 [Roth 2006]). 이 KD 값이 대부분의 다른 천연 라이보스위치에 대해 측정된 것보다 클지라도, glmS 리보자임은 고도의 분자 인지 특이성을 나타낸다. 예를 들면, 글루코사민-6-설페이트는 GlcN6P와 동일한 정도까지 리보자임 활성을 유도하지만, 약 100배 높은 농도에서 존재할 경우도 있다. 반면, GlcN6P의 2-아민 기가 하이드록실 기로 대체되는 글루코스-6-포스페이트는 리보자임 활성을 개시하는데 완전하게 실패한다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]).
라이보스위치는 대사 유전자의 원하지 않는 조절을 방지하기 위해 이의 천연 리간드와 관련된 화합물에 대해 식별할 수 있어야 한다. 그러나, 라이신(문헌 [Sudarsan 2003]) 및 싸이아민 피로포스페이트(문헌 [Sudarsan 2006])에 정상적으로 반응하는 라이보스위치에 대해 입증되어 온 바와 같이, 라이보스위치 기능을 개시하고 박테리아 생장을 억제하는 유사체를 생성시킬 수 있다. GlmS 단백질의 적절한 발현은 박테리아 생존을 위해 중요하며(문헌 [Badet-Denisot 1993]; 문헌 [Milewski 2002]), glmS 리보자임 활성을 개시함으로써 정상 유전자 발현을 간섭할 수 있는 GlcN6P의 유사체는 새로운 유형의 항미생물제로서 작용할 수 있게 된다. 따라서, glmS 리보자임의 분자 인지 특성에 대한 이해의 증가가 추구되어 왔다.
앞서 개시된 방법 및 조성물은 특이한 합성 방법, 특이한 분석 기법 또는 특정 시약에 대한 특별한 언급이 없는 한 제한되지 않으며, 그 자체로서 변화할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명할 목적인 것으로 제한하려는 의도가 없는 것으로 이해되어야 한다.
물질
본원은, 앞서 개시된 방법 및 조성물에 대해 사용될 수 있는, 이들과 조합 사용될 수 있는, 이들의 제조에 사용될 수 있는, 또는 이들의 생성물인 물질, 조성물 및 성분들을 제공한다. 이들 및 다른 물질들도 본원에 의해 제공되며, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때 한편으로 각각의 다양한 개별적이고 포괄적인 이들 화합물의 조합 및 변경에 대한 특정 참조는 명쾌하게 개시될 수 없으며, 각각은 본 발명에 구체적으로 포함되고 설명되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 라이보스위치 또는 압타머 도메인이 개시되고 논의되며 라이보스위치 또는 압타머 도메인을 포함하여 많은 분자에 대해 이루어질 수 있는 변경의 수가 논의된다면, 라이보스위치 또는 압타머 도메인 및 가능한 변경의 각각의 및 모든 조합 및 변경은 구체적으로 달리 언급이 없는 한 구체적으로 고려된다. 그러므로, 분자 A, B 및 C의 부류가 개시될 뿐 아니라 분자 D, E 및 F의 부류 및 조합 분자, A-D의 예가 개시되며, 그러면 각각이 개별적으로 인용되지 않아도, 각각은 개별적으로 및 포괄적으로 고려된다. 따라서, 이 예에서 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F의 각각은 구체적으로 고려되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예 조합 A-D의 개시 내용으로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 유사하게, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합은 또한 구체적으로 고려되고 개시되고 있다. 따라서 예컨대 A-E, B-F 및 C-E의 하위-그룹은 구체적으로 고려되고 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예로 든 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 이 개념은 이에 국한되는 것은 아니지만 앞서 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 단계들을 포함하여 본 출원의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가적 단계가 있다면, 이들 각각의 추가 단계는 임의의 특정 실시양태 또는 개시된 방법의 실시양태들의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합은 구체적으로 고려되며 개시된 대로 간주되어야 하는 것이 인지된다.
A. 라이보스위치
라이보스위치는 발현되는 RNA 분자의 일부이고 트리거 분자에 의해 결합될 때 상태가 변화하는 발현 제어 요소이다. 라이보스위치는 전형적으로 2개의 별도의 도메인: 표적에 선택적으로 결합하는 하나(압타머 도메인)와 유전자 제어에 영향을 미치는 다른 하나(발현 플랫폼 도메인)로 나누어진다. 유전자 발현의 대사산 물-의존성 알로스테릭 제어를 초래하는 것은 바로 이들 2개의 도메인 사이의 동적인 상호작용이다. 본원은, 분리되고 재조합된 라이보스위치, 이러한 라이보스위치를 함유하는 재조합 구축물, 이러한 라이보스위치에 작동 가능하게 연결된 이종성 서열, 및 이러한 라이보스위치, 라이보스위치 재조합 구축물, 및 이종성 서열에 작동 가능하게 연결된 라이보스위치를 은닉하는 세포 및 유전자도입 유기체를 제공한다. 이종성 서열은 예컨대 리포터 단백질 또는 펩타이드를 포함하여 해당 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 서열일 수 있다. 바람직한 라이보스위치는 천연 발생 라이보스위치이거나 이로부터 유도될 수 있다.
앞서 개시된 라이보스위치와 이의 유도체 및 재조합 형태는 일반적으로 임의의 공급원으로부터 예컨대 천연 발생 라이보스위치 및 새롭게 디자인된 라이보스위치로부터 유도될 수 있다. 임의의 이러한 라이보스위치는 앞서 개시된 방법에 또는 방법과 함께 사용될 수 있다. 그러나, 상이한 유형의 라이보스위치가 규정될 수 있고, 일부 이러한 하위-유형은 특정 방법에 또는 특정 방법과 함께(본 발명에서 대개는 설명됨) 사용될 수 있다. 라이보스위치의 유형으로는 예컨대 천연 발생 라이보스위치, 천연 발생 라이보스위치의 유도체 및 변경된 형태, 키메라 라이보스위치 및 재조합 라이보스위치가 있다. 천연 발생 라이보스위치는 천연에서 발견되는 대로의 라이보스위치의 서열을 갖는 라이보스위치이다. 이러한 천연 발생 라이보스위치는 이것이 천연에서 발생하는 것과 같은 천연 발생 라이보스위치의 분리된 또는 재조합 형태일 수 있다. 즉, 라이보스위치는 동일한 일차 구조를 갖지만 분리되었거나 새로운 유전자 또는 핵산 내용물로 유전 조작되었다. 키메라 라이보스 위치는 예컨대 임의의 또는 특정 부류 또는 유형의 라이보스위치의 일부와 동일하거나 임의의 상이한 부류 또는 유형의 라이보스위치의 상이한 라이보스위치의 일부; 또는 임의의 또는 특정 부류 또는 유형의 라이보스위치의 일부와 임의의 비-라이보스위치 서열 또는 성분으로 구성될 수 있다. 재조합 라이보스위치는 분리되었거나 새로운 유전자 또는 핵산 내용물로 유전자 조작된 라이보스위치이다.
라이보스위치는 단일 또는 다수의 압타머 도메인을 가질 수 있다. 다수의 압타머 도메인을 가진 라이보스위치의 압타머 도메인은 트리거 분자의 공동 결합을 나타낼 수 있거나 트리거 분자의 공동 결합을 나타내지 않을 수 있다(즉, 압타머는 공동 결합을 나타낼 필요가 없다). 후자의 경우에 압타머 도메인은 독립적인 결합제라고 말할 수 있다. 다수의 압타머를 갖는 라이보스위치는 하나 또는 다수의 발현 플랫폼 도메인을 가질 수 있다. 예를 들면, 2개의 압타머 도메인을 가지며 이들의 트리거 분자의 공동 결합을 나타내는 라이보스위치는 2개의 압타머 도메인에 의해 조절되는 단일 발현 플랫폼 도메인에 연결될 수 있다. 다수의 압타머를 갖는 라이보스위치는 링커(linker)를 통해 결합된 하나 이상의 압타머를 가질 수 있다. 이러한 압타머가 트리거 분자의 공동 결합을 나타내는 경우, 링커는 공동 링커일 수 있다.
압타머 도메인은 이들이 x와 x-1 사이의 Hill 계수 n을 갖는 경우, 공동 결합을 나타낸다고 말할 수 있는데, 이때 x는 공동 결합에 대해 분석되는 압타머 도메인의 수(또는 압타머 도메인 상의 결합 부위의 수)이다. 그러므로, 예컨대 2개의 압타머 도메인을 갖는 라이보스위치(예컨대, 글리신-반응성 라이보스위치)는, 라이보스위치가 2와 1 사이의 Hill 계수를 가진다면, 공동 결합을 나타낸다고 말할 수 있다. 사용된 x의 값은 본질적으로 라이보스위치에 존재하는 압타머 도메인의 수가 아니라, 공동 결합에 대해 분석되는 압타머 도메인의 수에 따라 좌우되는 것으로 이해되어야 한다. 이는 라이보스위치가 단지 일부만이 공동 결합을 나타내는 경우, 다수의 압타머 도메인을 가질 수 있기 때문에 타당하다.
또한 본원은, 이종성 압타머 도메인과 발현 플랫폼 도메인을 함유하는 키메라 라이보스위치를 제공한다. 즉, 키메라 라이보스위치는 한 공급원으로부터의 압타머 도메인과 다른 공급원으로부터의 발현 플랫폼 도메인으로 구성된다. 이종성 공급원은 예컨대 상이한 특이한 라이보스위치, 상이한 유형의 라이보스위치, 또는 상이한 부류의 라이보스위치로부터 유래될 수 있다. 이종성 압타머는 또한 비-라이보스위치 압타머로부처 유래될 수 있다. 이종성 발현 플랫폼 도메인은 또한 비-라이보스위치 공급원으로부터 유래될 수 있다.
변경 또는 유도된 라이보스위치는 또한 시험관 내 선택 및 진화 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 일반적으로, 라이보스위치에 적용된 것과 같은 시험관 내 진화 기술은 라이보스위치 서열의 부분(들)이 변화된 한편 라이보스위치의 다른 부분은 불변상태로 유지되는 변이 라이보스위치의 세트를 생성하는 것을 포함한다. 그 다음, 변이 라이보스위치의 세트의 활성화, 불활성화 또는 차단(또는 다른 기능성 또는 구조적 기준)이 평가될 수 있고, 해당 기준을 만족하는 그런 변이 라이보스위치가 사용 또는 추가의 진화 단계에 사용하기 위해 선택된다. 변이체를 제조하기 위해 유용한 기본 라이보스위치는 본원에 개시된 특이하고 일치하는 라이보스 위치이다. 일치 라이보스위치는 라이보스위치의 임의의 부분(들)이 시험관 내 선택 및 진화를 위해 변화하는 지에 대한 정보를 알기 위해 사용될 수 있다.
또한 본원은, 조절이 변경된 라이보스위치를 제공한다. 라이보스위치의 조절은 라이보스위치의 압타머 도메인을 발현 플랫폼 도메인에 작동 가능하게 연결함으로써(키메라 라이보스위치) 변경될 수 있다. 그 다음, 압타머 도메인은 예컨대 압타머 도메인에 대한 트리거 분자의 작용을 통해 라이보스위치의 조절을 중재할 수 있다. 압타머 도메인은 임의의 적당한 방식으로든지, 예컨대 라이보스위치의 정상 또는 천연 압타머 도메인을 새로운 압타머 도메인으로 대체함으로써, 라이보스위치의 발현 플랫폼 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일반적으로, 이로부터 압타머 도메인이 유도되는 라이보스위치를 활성화할 수 있거나, 불활성화할 수 있거나, 또는 차단할 수 있는 임의의 화합물 또는 조건은 키메라 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 데에도 사용될 수 있다.
또한 본원은 불활성화된 라이보스위치를 제공한다. 라이보스위치는 라이보스위치를 공유적으로 변경시킴으로써(예컨대, 라이보스위치의 일부를 교차결합하거나 또는 라이보스위치에 화합물을 결합시킴으로써) 불활성화될 수 있다. 이 방식으로 라이보스위치를 불활성화하는 것은 예컨대 트리거 분자가 라이보스위치에 결합하는 것을 방해하거나, 트리거 분자가 결합시 라이보스위치의 상태가 변화하는 것을 방해하거나, 또는 트리거 분자의 결합시 발현에 영향을 미치지 못하도록 라이보스위치의 발현 플랫폼 도메인을 방해하는 변경으로부터 유발될 수 있다.
또한 본원은, 바이오센서 라이보스위치를 제공한다. 바이오센서 라이보스위 치는 이들의 동족 트리거 분자의 존재 하에 검출 가능한 신호를 생성하는 유전자 조작된 라이보스위치이다. 유용한 바이오센서 라이보스위치는 트리거 분자의 역치에서 또는 그 이상의 수준에서 야기될 수 있다. 바이오센서 라이보스위치는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 디자인될 수 있다. 예를 들면, 바이오센서 라이보스위치는 신호로서 작용하거나 신호 생성에 포함되는 단백질을 암호화하는 리포터 RNA에 작동 가능하게 연결되어 라이보스위치/리포터 RNA를 암호화하는 핵산 구축물을 은닉하는 세포 또는 유기체에 유전자 조작됨으로써 생체 내에서 사용될 수 있다. 시험관 내에서 사용하기 위한 바이오센서 라이보스위치의 예는 이로부터의 신호가 라이보스위치의 활성화 상태에 따라 변화하는 입체구조 의존성 표지를 포함하는 라이보스위치이다. 이러한 바이오센서 라이보스위치는 바람직하게는 천연 발생 라이보스위치로부터의 또는 이로부터 유도된 압타머 도메인을 사용한다. 바이오센서 라이보스위치는 다양한 상황 및 플랫폼에 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이오센서 라이보스위치는 지지체, 예컨대 플레이트, 칩, 스트립 및 웰과 함께 사용될 수 있다.
또한 본원은, 새로운 트리거 분자를 인지하는 변경된 또는 유도된 라이보스위치를 제공한다. 새로운 트리거 분자를 인지하는 새로운 라이보스위치 및/또는 새로운 압타머는 공지된 라이보스위치로부터 디자인되거나 유도되기 위해 선택될 수 있다. 이는 예컨대 라이보스위치의 압타머 변이체 세트를 제조하는 단계, 해당 화합물의 존재 하에 변이체 라이보스위치의 활성화를 평가하는 단계, 활성화된 변이체 라이보스위치를 선택하는 단계(또는 예컨대 가장 고도로 또는 가장 선택적으 로 활성화된 라이보스위치를 선택한다), 그리고 원하는 활성, 특이성, 활성과 특이성의 조합, 또는 특성들의 다른 조합을 갖는 변이체 라이보스위치가 생성될 때까지 이들 단계를 반복하는 것에 의해 이루어질 수 있다.
일반적으로, 임의의 압타머 도메인이, 압타머 도메인의 대조 가닥에 상보할 발현 플랫폼 도메인에 조절된 가닥을 디자인하거나 채택함으로써 임의의 발현 플랫폼 도메인과 함께 사용할 수 있도록 채택될 수 있다. 다르게는, 압타머 도메인의 압타머 및 대조 가닥의 서열은 대조 가닥이 발현 플랫폼의 기능적으로 중요한 서열에 상보하도록 채택될 수 있다. 예를 들면, 대조 가닥은 RNA의 샤인-달가노 서열에 상보하도록 채택됨으로써, SD 서열과 대조 가닥 사이의 줄기 구조가 형성될 때, SD 서열이 리보솜에 접근하기 어렵게 되고, 이로 인해 번역 개시가 둔화되거나 방지될 수 있다. 압타머 가닥이 압타머 도메인에서 P1 줄기의 형성을 가능하게 하기 위해 서열에 상응하는 변화를 일으킬 수 있을 것임을 주지해야 한다. 공동 결합을 나타내는 다수의 압타머를 갖는 라이보스위치의 경우, 활성화 압타머(발현 플랫폼 도메인과 상호작용하는 압타머)의 하나의 P1 줄기는 SD 서열과 줄기 구조를 형성하도록 디자인될 필요가 있다.
다른 예로서, 전사 종료자는 전사 종료자의 서열의 일부가 압타머 도메인의 대조 가닥에 상보하는 RNA 분자(가장 편리하게는 RNA의 미번역 영역에 있는)에 부가될 수 있다(서열을 조절된 가닥이 될 것이다). 이는 압타머 도메인의 대조 서역이 압타머 가닥 및 조절된 가닥과 함께 대체 줄기 구조를 형성하는 것을 가능하게 할 것이며, 이로 인해 라이보스위치가 활성화되거나 불활성화될 때 전사 종료자는 형성되거나 파괴된다. 임의의 다른 발현 요소도 대체 줄기 구조의 유사한 디자인에 의해 라이보스위치의 제어 하에 발생할 수 있다.
라이보스위치에 의해 제어된 전사 종료자에서, 전사 속도 및 라이보스위치와 발현 플랫폼 요소의 공간 확보는 적절한 제어에 중요할 수 있다. 전사 속도는 예컨대 전사가 중지되고 라이보스위치가 형성되고 트리거 분자를 감지하는 것을 허용하기 위해 중합효소 중지 요소(예컨대, 일련의 우리딘 부분)에 의해 조정될 수 있다.
본원은, 암호화 영역에 작동 가능하게 연결된 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조절 가능한 유전자 발현 구축물로서, 이때 라이보스위치는 RNA의 발현을 조절하고, 라이보스위치와 암호화 영역이 이종성을 나타내는, 구축물을 제공한다. 라이보스위치는 압타머 도메인과 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있으며, 압타머 도메인과 발현 플랫폼 도메인은 이종성이다. 라이보스위치는 압타머 도메인과 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있는데, 이때 압타머 도메인은 P1 줄기를 포함하고, 이 P1 줄기는 압타머 가닥과 대조 가닥을 포함하며, 발현 플랫폼 도메인은 조절된 가닥을 포함하고, 이때 조절된 가닥, 제어 가닥 또는 둘 다는 줄기 구조를 형성하도록 디자인되었다. 라이보스위치는 2개 이상의 압타머 도메인과 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있는데, 이때 적어도 하나의 압타머 도메인과 발현 플랫폼 도메인은 이종성이다. 라이보스위치는 2개 이상의 압타머 도메인과 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있는데, 이때 적어도 하나의 압타머 도메인은 P1 줄기를 포함하고, P1 줄기는 압타머 가닥 및 대조 가닥을 포함하며, 발 현 플랫폼 도메인은 조절된 가닥을 포함하고, 이때 조절된 가닥, 제어 가닥 또는 둘 다는 줄기 구조를 형성하도록 디자인되었다.
1. 압타머 도메인
압타머는 특정 화합물 및 부류의 화합물에 선택적으로 결합할 수 있는 핵산 절편 및 구조이다. 라이보스위치는 트리거 분자의 결합시 라이보스위치의 상태 또는 구조에 변화를 유발할 수 있는 압타머 도메인을 갖는다. 기능성 라이보스위치에서, 압타머 도메인에 결합된 발현 플랫폼 도메인의 상태 또는 구조는 트리거 분자가 압타머 도메인에 결합할 때 변화한다. 라이보스위치의 압타머 도메인은 예컨대 라이보스위치의 천연 압타머 도메인, 인공 압타머, 유전자 조작된, 선택된, 진화된 또는 유도된 압타머 또는 압타머 도메인을 비롯해 임의의 공급원으로부터든지 유도될 수 있다. 라이보스위치의 압타머는 일반적으로, 예컨대 줄기 구조를 형성함으로써 결합된 발현 플래폼 도메인의 부분과 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 부분을 갖는다. 이 줄기 구조는 트리거 분자의 결합시 형성되거나 파괴될 것이다.
다양한 천연 라이보스위치의 일치 압타머 도메인은 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 도 11과 본 발명에서 도시된다. 이들 압타머 도메인(삽입된 모든 직접적인 변이체를 포함함)은 라이보스위치에 사용될 수 있다. 일치 서열 및 구조는 서열 및 구조의 변이를 나타낸다. 표시된 변이 내에 있는 압타머 도메인은 본 발명에서 직접 변이체로 언급된다. 이들 압타머 도메인은 변경된 또는 변이체 압타머 도메인을 생성하기 위해 변경될 수 있다. 보존성 변경은 쌍의 뉴클레오타 이드가 상보적인 채로 유지되도록 염기쌍의 뉴클레오타이드에 임의의 변화를 포함한다. 적당한 변경은 표시된 길이 범위의 20% 이하의 줄기 또는 루프(이에 대한 길이 또는 길이 범위가 표시된다)의 길이의 변화를 포함한다. 루프와 줄기 길이는 "표시된" 것으로 간주되는데, 이때 일치 구조는 특별한 길이의 줄기 또는 루프를 나타내거나 또는 길이의 범위는 열거되거나 도시된다. 적당한 변경은 표시된 길이 범위의 40% 이하의 줄기 또는 루프(이에 대한 길이 또는 길이 범위가 표시되지 않는다)의 길이의 변화를 포함한다. 적당한 변경은 또한 압타머 도메인의 비특정 부분의 기능성 변이체를 포함한다.
P1 줄기 및 이의 구성 가닥은 발현 플랫폼 및 RNA 분자를 사용하기 위한 압타머 도메인의 채택시에 변경될 수 있다. 이러한 변경은 광범위할 수 있으며, 본 발명에서 P1 변경으로서 언급된다. P1 변경은 압타머 도메인의 P1 줄기의 서열 및/또는 길이에 대한 변화를 포함한다. 도 8에 도시된 압타머 도메인은 특히 시험관 내 선택 또는 시험관 내 진화 기술을 통해 유도된 압타머 도메인을 생성하기 위한 초기 서열로서 유용하다.
앞서 개시된 라이보스위치의 압타머 도메인은 또한 임의의 다른 목적을 위해 및 임의의 다른 맥락에서 압타머로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 압타머는 리보자임, 다른 분자 스위치 및 구조의 변화가 RNA의 기능에 영향을 미칠 수 있는 임의의 RNA 분자를 제어하기 위해 사용될 수 있다.
2. 발현 플랫폼 도메인
발현 플랫폼 도메인은 라이보스위치를 함유하는 RNA 분자의 발현에 영향을 미치는 라이보스위치의 일부이다. 발현 플랫폼 도메인은 일반적으로 예컨대 줄기 구조를 형성함으로써 결합된 압타머 도메인의 부분과 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 부분을 가진다. 이 줄기 구조는 트리거 분자의 결합시 형성되거나 파괴될 것이다. 줄기 구조는 일반적으로 발현 조절 구조이거나, 또는 이의 형성을 방지한다. 발현 조절 구조는 구조를 함유하는 RNA 분자의 발현을 허용, 방지, 증진 또는 억제하는 구조이다. 이러한 것의 예로는 샤인-달가노 서열, 개시 코돈, 전사 종료자, 및 안정성 및 프로세싱 신호가 있다.
B. 트리거 분자
트리거 분자는 라이보스위치를 활성화할 수 있는 분자 및 화합물이다. 이는 라이보스위치 및 라이보스위치를 활성화할 수 있는 다른 화합물에 대한 천연 또는 정상 트리거 분자를 포함한다. 천연 또는 정상 트리거 분자는 성질상 소정의 라이보스위치에 대한 트리거 분자이거나, 또는 일부 비-천연 라이보스위치인 경우에 이에 대하여 라이보스위치가 디자인되거나 이를 사용하여 라이보스위치가 선택될 수 있는 트리거 분자이다(예컨대, 시험관 내 선택 또는 시험관 내 진화 기술에서와 같음).
C. 화합물
또한 본원은, 라이보스위치를 활성화할 수 있건, 불활성화할 수 있거나, 또는 차단할 수 있는 화합물, 및 이러한 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다. 라이보스위치는 트리거 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 제어하는 기능을 한다. 화합물은 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하기 위해 사용될 수 있다. 라이보스위치에 대한 트리거 분자(및 다른 활성화 화합물)는 라이보스위치를 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 트리거 분자 이외의 화합물은 일반적으로 라이보스위치를 불활성화하거나 차단하기 위해 사용될 수 있다. 라이보스위치는 또한 예컨대 라이보스위치의 존재로부터 트리거 분자를 제거함으로써 불활성화될 수 있다. 라이보스위치는 예컨대 라이보스위치를 활성화하지 않는 트리거 분자의 유사체의 결합에 의해 차단될 수 있다.
또한 본원은, RNA 분자, 또는 RNA 분자를 암호화하는 유전자의 발현을 변경하기 위한 화합물로서, 이때 RNA 분자는 라이보스위치를 포함하는, 화합물을 제공한다. 이는 화합물을 RNA 분자와 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 라이보스위치는 트리거 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 제어하는 기능을 한다. 따라서, 라이보스위치를 포함하는 해당 RNA 분자에 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 조건을 수행하는 것은 RNA의 발현을 변경하는데 사용될 수 있다. 발현은 예컨대 RNA의 전사의 종결 또는 이에 대한 리보솜 결합을 차단하는 결과로서 변경될 수 있다. 트리거 분자의 결합은 라이보스위치의 특성에 따라 RNA 분자의 발현을 감소 또는 방지하거나, 또는 RNA 분자의 발현을 촉진 또는 증가할 수 있다.
또한 본원은, RNA 분자 또는 RNA 분자를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하기 위한 화합물을 제공한다. 또한 본원은, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단함으로써 라이보스위치를 함유하는 RNA 또는 천연 발생 유전자의 발현을 조절하기 위한 화합물을 제공한다. 유전자가 이를 은닉하는 세포 또는 유기체의 생존에 필수적인 것이라면, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 것은 세포 또는 유기체의 사망, 정지 또는 쇠약에 이르게 할 수 있다.
또한 본원은, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단함으로써 상기 라이보스위치를 함유하는 분리된, 유전자 조작된 또는 재조합 유전자 또는 RNA의 발현을 조절하는 화합물을 제공한다. 유전자가 원하는 발현 생성물을 암호화한다면, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 것은 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있고, 따라서 발현 생성물의 생성을 초래한다. 유전자가 유전자 발현 또는 다른 세포 과정의 유도제(inducer) 또는 리프레서를 암호화한다면, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 것은 다른 조절된 유전자 또는 세포 과정의 유도, 억제, 또는 탈억제(de-repression)를 초래할 수 있다. 이러한 많은 이차 조절 효과는 공지되어 있고, 라이보스위치를 활용해 사용하기 위해 채택될 수 있다. 이러한 조절을 위해 일차 제어로서 라이보스위치를 사용하는 것의 장점은 라이보스위치 트리거 분자가 작고, 비-항원성 분자라는 것이다.
또한 본원은, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 라이보스위치를 활성화하는 화합물은 시험 화합물을 라이보스위치와 접촉시키고 라이보스위치의 활성화를 평가함으로써 확인될 수 있다. 라이보스위치가 활성화되면, 시험 화합물은 라이보스위치를 활성화하는 화합물로서 확인된다. 라이보스위치의 활성화는 임의의 적당한 방식으 로 평가될 수 있다. 예를 들면, 라이보스위치는 리포터 RNA에 결합될 수 있고, 리포터 RNA의 발현, 발현 수준 또는 발현 수준의 변화는 시험 화합물의 존재와 부재시에 측정될 수 있다. 다른 예로서, 라이보스위치는 입체구조 의존성 표지를 포함하며, 이로부터의 신호는 라이보스위치의 활성화 상태에 따라 변화한다. 이러한 라이보스위치는 바람직하게는 천연 발생 라이보스위치로부터 또는 이로부터 유도된 압타머 도메인을 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 라이보스위치의 활성화의 평가는 대조 분석 또는 측정을 사용하여 또는 대조 분석이나 측정의 사용 없이 수행될 수 있다. 라이보스위치를 불활성화하는 화합물을 확인하는 방법은 유사한 방법으로 수행될 수 있다.
라이보스위치를 차단하는 화합물의 확인은 모든 적당한 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 라이보스위치를 활성화하거나 불활성화하는 것으로 알려진 화합물의 존재 하에 및 시험 화합물의 존재 하에 라이보스위치의 활성화 또는 비활성화를 평가하기 위한 분석이 수행될 수 있다. 활성화 또는 비활성화가 시험 화합물의 부재시에 관찰된 것처럼 관찰되지 않는다면, 이때 시험 화합물은 라이보스위치의 활성화 또는 불활성화를 차단하는 화합물로서 확인된다.
화합물은 또한 라이보스위치의 원자 결정 구조를 사용하여 확인될 수 있다. glmS 리보자임의 원자 구조의 원자 배위는 표 2에 열거된다. 도 9에 표시된 바와 같은 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 구조, 및 표 2 내에 포함된 도 9에 표시된 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 배위 또한 사용될 수 있다. 화합물은 예컨대 라이보스위치의 원자 구조를 시험 화합물로 모델링하고, 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용한다면 이를 측정함으로써, 라이보스위치의 결정질 구조를 사용하여 확인될 수 있다. 이는 라이보스위치의 모델에서 시험 화합물에 대한 예상된 최소 상호작용 에너지, 예상된 결합 상수, 예상된 해리 상수 또는 조합을 사용함으로써 행해질 수 있다. 화합물은 또한 예컨대 라이보스위치에 결합하는 것으로 알려져 있는 화합물(예컨대, 트리거 분자)과 라이보스위치 사이의 적합성을 평가하고, 화합물이 화합물의 결합에 거의 또는 전혀 명백한 해로운 영향을 미치지 않으면서 변화할 수 있는 부위를 확인하고, 하나 이상의 이러한 변경을 통합하여 새로운 화합물을 생성함으로써 확인될 수 있다. 라이보스위치와 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법은 또한 그렇게 확인된 화합물의 생성을 포함할 수 있다.
전형적인 방법은 먼저 "공지된 화합물" 또는 "공지된 표적"으로도 불리는 화합물과 함께 라이보스위치의 3차원 구조를 활용한다. 본원에 개시된 임의의 트리거 분자 및 화합물이라도 이러한 공지 화합물로서 사용될 수 있다. 라이보스위치의 구조는 임의의 공지된 수단, 예컨대 결정학 또는 용액 NMR 분광학을 사용하여 측정될 수 있다. 그 구조는 또한 컴퓨터 분자 모델링 시뮬레이션 프로그램, 예컨대 AutoDock을 통해 얻어질 수 있다. 방법은 결합의 양을 측정하는 것, 예컨대 라이보스위치와, 그 라이보스위치에 대한 잠재성 화합물 사이의 결합 에너지를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 활성 화합물은 라이보스위치에 대하여 임의의 활성, 예컨대 라이보스위치의 활성을 억제한다거나 라이보스위치의 활성을 증강시키는 화합물이다. 또한, 잠재성 화합물은 분자에 대한 공지 화합물과 관련된 임의의 구조를 갖는 유사체일 수 있다. 트리거 분자, 공지 화합물, 및 본원에 개시된 화합물 중 어느 것이라도 잠재성 화합물의 기초로서 또는 잠재성 화합물을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
공지된 화합물 및 잠재성 화합물의 구조, 특성, 상호작용 또는 결합 파라미터 등의 동일성 또는 관계는 많은 방법으로 조망할 수 있다. 예를 들면, 임의의 척도 또는 상호작용 파라미터는 구조적 모델을 사용하여 측정되거나 평가될 수 있고, 공지 화합물 및 잠재성 화합물에 대해 얻어진 이러한 척도 및 파라미터들은 비교될 수 있다. 전체적으로 공지된 화합물과 잠재성 화합물 사이의 동일성을 주목할 수 있다. 또한 잠재성 화합물, 예컨대 유사체와 잠재성 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 도메인의 유일한 공지 화합물 사이의 동일성을 주목할 수 있다. 또한 하위-도메인, 예컨대 공지된 화합물의 라이보스위치와 접촉하는 부분 또는 원자의 7Å, 6Å, 5Å, 4Å, 3Å 또는 2Å 내에 있는 잠재성 화합물의 유일하게 그런 부분 또는 원자들의 수준에서 잠재성 화합물과 공지 화합물 사이의 동일성을 주목해 볼 수 있다. 일반적으로, 하위-도메인이 보다 구체적일수록 잠재성 화합물과 공지 화합물의부분 사이의 동일성은 보다 높아질 것이다. 예를 들면, 공지 화합물과 잠재성 화합물 사이에는 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 동일성이 있을 수 있는데, 이는 마치 전체로서 공지 화합물과 잠재성 화합물의 결합 도메인 사이에 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 동일성이 있고, 라이보스위치와 상호작용하는 부분 또는 원자의 5Å 내에 있는 공지 화합물의 부분 또는 원자들에 상응하는 잠재성 화합물의 부분 또는 원자들 사이의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 동일성과 같다. 다른 하위-도메인은 실제로 라이보스위치와 접촉하는 부분 또는 원자들의 하위-도메인이다. 이 경우, 동일성은 예컨대 50% 초과, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상일 수 있다.
전형적으로, 잠재성 화합물은 잠재성 화합물의 패밀리, 즉 유사체 세트에 존재하고, 이들은 모두 라이보스위치에 대해 공지된 화합물과 관련한 구조를 갖는다. 임의의 수의 구성원으로 구성되는 패밀리든지 스크린될 수 있다. 패밀리의 최대 수는 단지 원하는 양의 시간이 각 구성원을 스크린하기 위해 활용될 수 있는 컴퓨터 동력의 크기에 의해서만 제한된다. 방법은 라이보스위치의 적어도 하나의 주형 구조 및 때로는 공지된 표적일 수 있는 표적을 포함할 수 있다. 이 구조는 반드시 존재해야 할 필요는 없는데, 이는 임의의 경우에는 표준 구조 측정 기법을 사용하여 개시된 방법을 수행하는 중에 생성될 수 있기 때문이다. 진짜 구조는 방법이 사용되는 시점에 존재하는 것이 바람직하다.
상기 방법은 또한 공지된 화합물의 구조로부터의 정보를 사용하여 잠재성 화합물의 구조를 모델링함을 포함할 수 있다. 이 모델링은 임의의 방법으로 및 본원에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.
잠재성 화합물의 형태 및 위치는 계산하는 동안에는 고정된 채로 유지될 수 있다; 즉, 라이보스위치는 이것이 공지된 화합물에 대해 이러한 것과 동일한 배향으로 잠재성 화합물에 대해서 정확하게 결합한다.
그 다음, 라이보스위치와 잠재성 화합물 사이의 결합 에너지(또는 다른 특성 또는 파라미터)가 측정될 수 있으며, 결합 에너지(또는 다른 특성 또는 파라미터)가 특정 기준을 만족한다면, 잠재성 화합물은 실제 화합물, 즉, 라이보스위치와 상호작용하는 것 같은 화합물로서 표시될 수 있다. 이하 결합 에너지의 사용에 대해 언급하고는 있지만, 화합물과 라이보스위치의 상호작용 또는 모델링을 포함한 임의의 특성 또는 파라미터든지 사용될 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 기준은 라이보스위치와 잠재성 화합물과의 계산된 결합 에너지가 동일한 라이보스위치와 공지된 화합물과의 계산된 결합 에너지와 유사하거나 이보다 나은 것이어야 한다는 것이다. 예를 들면, 실제 화합물은 본 발명에서 논의된 것과 같은 계산된 결합 에너지가 공지된 화합물의 결합 에너지의 이보다 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상으로 더 큰 화합물일 수 있다. 실제 화합물은 또한 이들의 결합 에너지의 세기의 관점에서 모든 잠재성 화합물을 배열한 후에 예컨대 세트가 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 500, 700 또는 1000 개의 잠재성 화합물로 이루어진 잠재성 화합물의 세트의 계산된 결합 에너지의 상위 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%에 있는 화합물인 화합물일 수 있다.
또한, 일단 잠재성 화합물이 확인된 후에는 본 발명에서 논의된 바와 같이, 전통적인 시험 및 분석이 수행될 수 있는데 예컨대 라이보스위치와 실제 화합물을 사용하여 추가로 실제 화합물이 라이보스위치와 상호작용하고 및/또는 조절하는 능력을 규정하기 위해 생물학적 분석을 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 앞서 개시된 방법은 라이보스위치와 화합물의 활성을 분석하는 단계뿐만 아니라 예컨대 라이보스위치를 토대로 한 라이브러리를 사용하여 조합적인 화학 연구를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
에너지 계산은 예컨대 분자 또는 양자 역학을 토대로 할 수 있다. 분자 역학은 결합 스트레칭, 반데르발스 힘 또는 정전기적 상호작용과 같은 총 에너지의 성분들을 나타내는 일련의 실험 함수를 종합함으로써 시스템의 에너지의 근사치를 구한다. 양자 역학 방법은 슈뢰딩거 방정식(schrodinger equation)을 해결하기 위해 다양한 각의 근사치를 사용한다. 이들 방법은 전기적 구조를 다루며, 이로써 화학적 반응의 특성이 확인될 수 있다.
라이보스위치의 잠재성 화합물은 확인될 수 있다. 이는 공지된 화합물에 대한 소정의 유사성을 사용하여 잠재성 화합물을 선택함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 공지된 화합물과 동일한 과의 화합물이 선택될 수 있다.
계산을 위해 각 라이보스위치를 준비하기 위해, 원자는 잠재성 화합물의 결정 구조로부터 용해되지 않은 채로 또는 제거된 채로 세워질 수 있다. 이는 예컨대 PRODRG 웹서버 http://www.davapcl.bioch.dundee.ac.uk./programs/prodrg, 또는 표준 분자 모델링 프로그램, 예컨대 InsightII, Quanta(둘 다 www.accelrys.com에서), CNS(브룬거(Brunger) 등의 문헌 [Crystallography & NMR system: a new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr. D 54, 905-921(1998)]), 또는 라이보스위치 구조를 제조할 수 있는 임의의 다른 분자 모델링 시스템을 사용하여 행해질 수 있다.
그 다음, 잠재성 화합물과 라이보스위치의 결합 에너지(또는 다른 특성 또는 파라미터)가 계산될 수 있다. 이를 수행하기 위한 수단은 많다. 예를 들면, 측쇄 위치의 표본화와 결합 열역학의 계산은 잠재성 화합물-분자의 에너지를 모델 내에 있는 모든 쌍의 원자 사이의 정전기적 및 반데르발스 상호작용의 합으로서 모델링하는 실험 함수를 사용하여 이루어질 수 있다. 잠재성 화합물과 라이보스위치의 결합 에너지를 기록하기 위한 임의의 다른 계산 방법도 사용될 수 있다(골케(H. Gohlke) 및 클레베(G. Klebe)의 문헌 [Approaches to the description and prediction of the binding affinity of small-molecule ligands to macromolecular receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2644-4676(2002)]). 이러한 기록 방법의 예로는, 다음과 같은 프로그램에 사용되는 것들이 있지만 이에 국한되지 않는다: AutoDock(모리스(G. M. Morris) 등의 문헌 [Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. J. Comput. Chem. 19, 1639-1662(1998)]), Gold(존스(G. Jones) 등의 문헌 [Molecular recognition of receptor sites using a genetic algorithm with a description of desolvation. J. MoI. Biol. 245, 43-53(1995)]), Chem-Score(엘드 리지(M. D. Eldridge) 등의 문헌 [J. Comput-Aided Mol. Des. 11, 425-445(1997)]) 및 Drug-Score(골케 등의 문헌 [Knowledge-based scoring function to predict protein-ligand interactions. J Mol. Biol. 295, 337-356(2000)]).
로타머 라이브러리(rotamer library)는 당해 분야의 숙련자들에게 알려져 있으며, 다양한 공급원, 예컨대 인터넷으로부터 얻을 수 있다. 로타머는 저에너지 측쇄 형태이다. 로타머 라이브러리의 사용으로 가장 그럴듯한 측쇄 형태로 구조를 모델링하는 것이 가능해져서 기간이 절약되고 더욱 정확한 것으로 여겨지는 구조를 생성할 수 있다. 로타머 라이브러리의 사용은 잠재성 화합물의 소정의 영역 내에 있는 부분들로 예컨대 결합 부위 또는 화합물의 특정 거리 내에 있는 부분들로 제한될 수 있다. 후자의 거리는 임의의 원하는 길이로 설정될 수 있는데 예컨대 잠재성 화합물은 분자의 임의의 원자로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9Å 내에 있을 수 있다.
모든 쌍의 원자들 사이의 정전기적 상호작용은 예컨대 하기 식의 쿨롱(Coulombic) 모델을 사용하여 계산될 수 있다:
Eelec = 332.08 q1 q2/εr
상기 식에서,
q1 및 q2는 부분 원자 전하이고,
r은 이들 사이의 거리이고,
ε은 유전율이다.
부분 원자 전하는 분자 내의 전하 분포를 설명하기 위해 개발되었던 기존의 파라미터 세트로부터 얻을 수 있다. 예시적인 파라미터 세트로는 다음과 같은 것들이 있지만 이에 국한되지 않는다: PARSE(시트코프(D. A. Sitkoff) 등의 문헌 [Accurate calculation of hydration free-energies using macroscopic solvent models. J. Phys. Chem. 98, 1978-1988(1994)]), CHARMM(맥케렐(MacKerell) 등의 문헌 [All-atom empirical potential for molecular modeling and dynamics studies of proteins. J. Phys. Chem. B 102, 3586-3616, 1998]) 및 AMBER(코넬(W. D. Cornell) 등의 문헌 [A 2nd generation force-field for the simulation of proteins, nucleic-acids, and organic-molecules. J. Am. Chem. Soc. 117. 5179-5195(1995)]). 원자들에 대한 부분 전하는 유사한 작용기들의 이들을 사용하여 유추함으로써 또는 PRODRG 서버(아알텐(D. M. F. van Aalten) 등의 문헌 [PRODRG, a program for generating molecular topologies and unique molecular descriptors from coordinates of small molecules. J. Comput.-Aided Mol. Design 10, 255-262(1996)])에 사용된 것과 같은 실험적 지정에 의해, 또는 표준 양자 역학적 계산 방법(베일리(C. I. Bayly) 등의 문헌 [A well-behaved electrostatic potential based method using charge restraints for deriving atomic charges -the RESP model. J. Phys. Chem. 91, 10269-10280, (1993)])의 사용에 의해 지정될 수 있다.
정전기적 상호작용은 또한 정전기적 탈용매화 효과를 통합하는 더 복잡한 방법들에 의해 계산될 수 있다. 이들은 명백한 용매와 함축적인 용매 모델을 포함할 수 있다: 전자에서는 물 분자가 직접 계산에 포함되는 한편, 후자에서는 물의 효과가 연속 유전체 접근법에 의해 설명된다. 정전기적 상호작용을 계산하기 위한 명백한 용매 모델의 구체적인 예로는, 다음과 같은 것들이 있지만 이에 국한되지 않는다: 포이즌-볼츠만 기초 방법 및 일반화된 본 방법(페이그(M. Feig) 및 브룩스(C. L. Brooks)의 문헌 [Recent advances in the development and application of implicit solvent models in biomolecule simulations. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 217-224(2004)]).
원자 쌍 사이의 반데르발스 힘과 소수성 상호작용은(두 원자 모두 황이거나 탄소임) 하기 식을 사용하는 간단한 레나드-존스(Lennard-Jones) 식을 사용하여 계산될 수 있다:
Evdw = ε{σatt 12/r12 - σatt 6/r6}
상기 식에서,
ε은 에너지이고,
r은 2개의 원자 사이의 거리이고,
σatt는 상호작용 에너지가 0인 거리이다.
원자쌍 사이의 반데르발스 상호작용은 (하나 또는 2개의 원자는 황이거나 탄소가 될 수 없다) 다음의 간단한 척력 에너지를 사용하여 계산될 수 있다:
Evdw = ε{σrep 12/r12}
상기 식에서,
ε은 에너지이고,
r은 2개의 원자 사이의 거리이고,
σrep는 척력 상호작용이 ε와 같은 거리를 측정한다.
원자들 사이의 소수성 상호작용은 또한 당해 분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 다양한 다른 방법을 사용하여 계산될 수 있다. 예를 들면, 에너지 기여는 복합체가 형성될 때 형성되는 수용체와 리간드의 용매 접근성 표면적의 크기에 비례하는 것으로서 계산될 수 있다. 이러한 기여는 예컨대 스트리트(Street)와 마요(Mayo)에 의해 제안된 방법에서와 같이 원자쌍 사이의 상호작용의 견지에서 표현될 수 있다(스트리트(A. G. Street) 및 마요(S. L. Mayo)의 문헌 [Pairwise calculation of protein solvent-accessible surface areas. Folding & Design 3, 253-258(1998)]). 소수성 또는 반데르발스 또는 다른 에너지 기여를 설명하기 위한 형식의 임의의 다른 실행도 계산에 포함될 수 있다.
결합 에너지는 각각의 잠재성 화합물-라이보스위치 상호작용에 대해 계산될 수 있다. 예를 들면, 몬테 카를로(Monte Carlo) 표본화는 라이보스위치가 있거나 없을 때에 수행될 수 있으며, 각 시뮬레이션마다 평균 에너지가 계산될 수 있다. 그 다음, 잠재성 화합물과 라이보스위치에 대한 결합 에너지가 2회 계산된 평균 에너지 사이의 차이로서 계산될 수 있다.
잠재성 화합물의 라이보스위치와의 계산된 결합 에너지는 공지된 화합물과 라이보스위치와의 계산된 결합 에너지와 비교되어 잠재성 화합물이 실제 화합물인 지를 확인하였다. 그 다음, 이들 결과는 실험 데이터를 사용하여 확인하는 데, 이때 라이보스위치와 화합물 사이의 실제 상호작용이 측정될 수 있다. 라이보스위치와 화합물 사이의 실제 상호작용을 측정하기 위해 사용될 수 있는 방법의 예로는, 다음과 같은 것들이 있지만 이에 국한되지 않는다: 평형 투석 측정(화합물의 라이보스위치에 대한 방사성 형태의 결합이 검출된다), 효소 억제 분석(라이보스위치의 활성이 화합물의 존재 및 부재시에 모니터링될 수 있다), 그리고 화학적 쉬프트 섭동 측정(잠재성 화합물에 대한 라이보스위치의 결합이 원자의 NMR 화학적 쉬프트의 변화를 관찰함으로써 모니터링된다).
모델링은 컴퓨터, 컴퓨터 프로그램 또는 컴퓨터 작동 프로그램 상에서 또는 이들의 도움으로 실시될 수 있다. 컴퓨터는 3D로 또는 3D로서 대표되는 구조의 이미지를 표시하도록 만들어질 수 있다. 상기 이미지는, 표 2의 원자 배위로 대표되는 구조 중 임의의 것 또는 이들 모두일 수 있으며, 예컨대 도 9에서 표시된 바와 같은 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 구조로 대표되는 구조, 및 표 2 내에 포함되는 도 9에서 표시된 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 배위가 표시될 수 있다. 화합물이 glmS 라이보스위치와 결합 또는 특별히 상호작용하는 능력을 모델링 및 평가하는데 사용될 수 있는 표 2의 원자 배위로 대표되는 구조 중 임의의 부분이 본원에 기재된 바와 같이 모델링 및 관련 방법에 사용될 수 있다.
라이보스위치의 원자 결정 구조가 잠재성 화합물을 사용하여 모델링된 후에 라이보스위치와 화합물 사이의 실제 상호작용을 측정하기 위해 추가의 시험이 수행 될 수 있다. 예를 들면, 결합 RNA를 검출하기 위해 다수의 상이한 접근법들이 사용될 수 있는데, 예컨대 겔-기초 및 칩-기초 검출 방법을 사용하는 알로스테릭 리보자임 분석과 인-라인 프로빙 분석이 있다. 고출력 시험이 또한 예컨대 형광 검출 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, RNA-절단 리보자임을 활성화함으로써 유전자 발현을 제어하는 글루코사민-6-포스페이트 감지 라이보스위치가 사용될 수 있다. 이 리보자임은 다수의 턴오버(turnover) 역학을 사용하여 별도의 기질 분자를 절단하기 위해 다시 입체구조를 갖출 수 있다. 따라서, 켄칭 기에 가깝게 보유된 형광 기는, 화합물이 리보자임 기능을 야기한다면, 미결합 상태일 수 있다(따라서 더욱 형광이 된다). 둘째, 분자 비콘 기법이 사용될 수 있다. 이는 화합물이 라이보스위치 RNA에 비콘이 도킹하는 것을 방해한다면 형광을 억제하는 시스템을 생성한다. 어느 접근법이든지 본 발명에서 설명되는 RNA 유전자 조작 방법을 사용함으로써 라이보스위치 부류 중 어느 것에라도 적용될 수 있다.
또한 본원은, 본원에 개시된 구아닌 라이보스위치와 상호작용하는 유사체를 제공한다. 이러한 유사체의 예는 도 2에서 볼 수 있다. 합성되고 시험된 다수의 화합물이 GlcN6P의 것과 동일하거나 더 좋은 상수를 갖는 glmS 라이보스위치를 결합시킨다. 매우 가치있는 화학적 조성을 갖는 부속물이 기능을 나타낸다는 사실은 이들 화학적 골격의 다수의 변이가 생성될 수 있고, 기능에 대해 시험관 내 및 세포 내부에서 시험될 수 있음을 나타낸다. 구체적으로, 추가로 변경된 이들 화합물 버전은 RNA 구조에 있는 다른 기능 기와 새롭게 접촉시킴으로써 구아닌 라이보스위치에 대한 결합이 개선될 수 있다. 더욱이, 생체 내 적합성, 독성 및 합성 용이 성(다른 특성들 중에서도)의 조절은 골격의 이들 2개의 영역에서 변경을 이룸으로써 조정할 수 있는데, 이는 라이보스위치에 대한 구조적 모델이 이들 부위에서 가능한 많은 변경을 나타내기 때문이다.
표준 또는 비-표준 방식의 분자 인식을 하는 라이보스위치 RNA에 또한 결합하는 전체적으로 새로운 화학적 골격을 드러내기 위해 고출력 스크리닝이 또한 사용될 수 있다. 라이보스위치는 발견되는 천연 대사산물-결합 RNA의 제 1 주요 입체구조가기 때문에, 고출력 스크리닝을 위해 채택될 수 있는 결합 분석을 이루기 위한 노력은 이전에는 거의 이루어지지 않았었다. 다수의 상이한 접근법이 대사산물 결합 RNA를 검출하기 위해 사용될 수 있는데, 예컨대 겔-기초 및 칩-기초 검출 방법을 사용하는 알로스테릭 리보자임 분석과 인-라인 프로빙 분석이 있다. 또한 본원은, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물을 확인하고 확인된 화합물을 제조함으로써 만들어진 화합물을 제공한다. 이는 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 화합물 확인 방법과 확인된 화합물을 제조하는 방법을 조합함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 화합물은 시험 화합물을 리보 스위치와 접촉하고, 라이보스위치의 활성화를 평가하고, 라이보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된다면, 라이보스위치를 활성화하는 시험 화합물을 화합물로서 제조함으로써 제조될 수 있다.
또한 본원은, 화합물에 의해 라이보스위치의 활성화, 비활성화 또는 차단을 조사하고, 조사된 화합물을 제조함으로써 만들어진 화합물을 제공한다. 이는 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 화합물 활성화, 비활성화, 또는 차단 평가 방법을 조 사된 화합물의 제조 방법과 조합함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 화합물은 시험 화합물과 라이보스위치를 접촉시키고, 라이보스위치의 활성화를 평가하여, 라이보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된다면, 라이보스위치를 활성화하는 시험 화합물을 화합물로서 제조함으로써 제조될 수 있다. 화합물을 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 능력에 대해 조사하는 것은, 종래에는 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 것으로 알려져 있지 않은 화합물을 확인하는 것과, 화합물의 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 능력에 대하여 평가하는 것 둘 다를 의미하며, 이때 화합물은 이미 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 것으로 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환을 포함하는 것으로 고려된다. 광범위한 측면에서, 허용 가능한 치환기는 유기 화합물의 비-고리형 및 고리형, 분지된 또는 분지되지 않은, 탄소 고리형 및 헤테로 고리형, 및 방향족 및 비-방향족 치환기를 포함한다. 예시되는 치환기의 예컨대 이하 설명되는 것들과 같다. 허용 가능한 치환기는 하나 이상이며, 적절한 유기 화합물과 동일하거나 상이할 수 있다. 본 개시 내용의 목적에 대해, 헤테로원자, 예컨대 질소는 헤테로원자의 원자가를 만족시키는 본 발명에서 설명되는 유기 화합물의 수소 치환기 및/또는 임의의 허용 가능한 치환기를 가질 수 있다. 이 개시 내용은 임의의 방식으로든 유기 화합물의 허용 가능한 치환기에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않았다. 또한, 용어 "치환" 또는 "~로 치환된"은 이러 한 치환이 치환된 원자와 치환기의 허용된 원자가에 따르고, 치환이 안정한 화합물을 초래하는 경우, 예컨대 자발적으로 재배열, 고리화, 제거 등에 의한 형질변환을 진행하지 않는 화합물이라면 함축적이다.
"A1", "A2", "A3" 및 "A4"는 본 발명에서 다양한 특이적 치환기를 나타내기 위해 일반적인 기호로서 사용된다. 이들 기호는 모든 치환기일 수 있으며, 본원에 개시된 것들에 국한되지 않고, 한 경우에 특정 치환기인 것으로 규정될 때 이들은 다른 경우에는 약간 다른 치환기로 규정될 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자로 이루어진 분지된 또는 분지되지 않은 포화된 탄화수소 기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등이다. 알킬 기는 또한 치환 또는 비치환될 수도 있다. 알킬 기는 하나 이상의 기, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만, 이하 설명되는 바와 같이 알킬, 할로젠화된 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 알데하이드, 아미노, 카복실산, 에스터, 에터, 할라이드, 하이드록시, 케톤, 설포-옥소, 설포닐, 설폰, 설폭사이드 또는 싸이올로 치환될 수 있다. "저급 알킬"이란 용어는 6 이하의 탄소 원자를 갖는 알킬 기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 뷰틸, sec-뷰틸, 아이소-뷰틸, tert-뷰틸, 펜틸, 헥실 등을 지칭한다.
명세서 전체를 통해 "알킬"은 일반적으로 비치환된 알킬 기와 치환된 알킬 기 둘 다를 언급하기 위해 사용되지만; 치환된 알킬 기는 또한 본 발명에서 구체적으로 알킬 기에 있는 구체적인 치환기(들)를 확인함으로써 언급된다. 예를 들면, "할로젠화된 알킬"이란 용어는 구체적으로는 하나 이상의 할라이드예컨대 플루오르, 염소, 브롬, 또는 아이오딘으로 치환된 알킬 기를 지칭한다. "알콕시알킬"이란 용어는 구체적으로 이하 설명되는 바와 같이 하나 이상의 알콕시 기로 치환된 알킬 기이다. "알킬아미노"란 용어는 구체적으로 이하 설명되는 바와 같이 하나 이상의 아미노기로 치환된 알킬 기를 말하는 등이다. "알킬"이 한 경우에 사용되고 다른 경우에는 "할로젠화된 알킬"과 같은 구체적 용어가 사용될 때, "알킬"이란 용어는 또한 "할로젠화된 알킬"과 같은 구체적 용어를 언급하는 것이 아님을 의미하지는 않는다.
이 관행은 또한 본 발명에 설명된 다른 기에도 사용된다. 즉, "사이클로알킬"과 같은 용어가 비치환 또는 치환된 사이클로알킬 부분을 모두 언급하는 한편, 치환된 부분은 또한 본 발명에서 구체적으로 확인될 수 있다; 예를 들면, 특정 치환된 사이클로알킬은, 예컨대 "알킬사이클로알킬"로서 언급될 수 있다. 유사하게, 치환된 알콕시는 "할로젠화된 알콕시"로서, 특정 치환된 알켄일은 "알켄일알코올" 등으로서 언급될 수 있다. 다시 말하면, 일반적 용어, 예컨대 "사이클로알킬"과 구체적 용어, 예컨대 "알킬사이클로알킬"을 실제로 사용하는 것은 일반적 용어가 또한 구체적 용어를 포함하지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "알콕시"이란 용어는 단일한 말단 에터 연 쇄를 통해 결합된 알킬 기이다. 즉, "알콕시" 기는 -OA1(이때 A2는 앞서 규정된 것과 같은 알킬이다)로서 규정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "알켄일"이란 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 구조식을 갖는 2 내지 24개의 탄소 원자로 이루어진 탄화수소 기이다. (A1A2)C=C(A3A4)와 같은 비대칭 구조는 E와 Z 이성질체를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 이는 비대칭 알켄이 존재하거나 또는 결합 기호 C=C에 의해 명백하게 표시될 수 있는 구조식인 것으로 추정될 수 있다. 알켄일 기는 이하 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 기, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만, 알킬, 할로젠화된 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 알데하이드, 아미노, 카복실산, 에스터, 에터, 할라이드, 하이드록시, 케톤, 설포-옥소, 설포닐, 설폰, 설폭사이드 또는 싸이올로 치환될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "알킨일"이란 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 구조식을 갖는 2 내지 24개의 탄소 원자로 이루어진 탄화수소 기이다. 알킨일 기는 이하 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 기, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만, 알킬, 할로젠화된 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 알데하이드, 아미노, 카복실산, 에스터, 에터, 할라이드, 하이드록시, 케톤, 설포-옥소, 설포닐, 설폰, 설폭사이드 또는 싸이올로 치환될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "아릴"이란 용어는 임의의 탄소계 방향족 기, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만 벤젠, 나프탈렌, 페닐, 바이페닐, 페녹시벤젠 등을 함유하는 기이다. "아릴"이란 용어는 또한 "헤테로아릴"을 포함하는 데, 이는 방향족 기의 고리 안에 혼입된 적어도 하나의 헤테로원자를 갖는 방향족 기를 함유하는 기로서 규정된다. 헤테로원자의 예로는, 이들에 국한되는 것은 아니지만 질소, 산소, 황 및 인이 있다. 유사하게, "비-헤테로아릴"이란 용어는 또한 "아릴"이란 용어에 포함되는데, 헤테로원자를 함유하지 않는 방향족 기를 함유하는 기로서 규정된다. 아릴 기는 치환 또는 비치환될 수도 있다. 아릴 기는 본 발명에서 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 기, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만, 알킬, 할로젠화된 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 알데하이드, 아미노, 카복실산, 에스터, 에터, 할라이드, 하이드록시, 케톤, 설포-옥소, 설포닐, 설폰, 설폭사이드 또는 싸이올로 치환될 수 있다. "바이아릴"이란 용어는 구체적인 아릴 기 유형이고, 아릴의 정의에 포함된다. 바이아릴은 나프탈렌에서와 같이 융합된 고리 구조를 통해 함께 결합되거나, 바이페닐에서와 같이 하나 이상의 탄소-탄소 결합을 통해 부착된 2개의 아릴 기를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "사이클로알킬"이란 용어는 적어도 3개의 탄소 원자로 구성된 비-방향족 탄소계 고리이다. 사이클로알킬 기의 예로는, 이들에 국한되지는 않지만 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등이 있다. "헤테로사이클로알킬"이란 용어는 고리의 탄소 원자들 중 적어도 하나가 헤테로원자, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만 질소, 산소, 황, 또는 인으로 치환되는 앞서 규정되는 사이클로알킬 기이다. 사이클로알킬 기와 헤테로사이 클로알킬 기는 치환 또는 비치환될 수도 있다. 사이클로알킬 기와 헤테로사이클로알킬 기는 본 발명에서 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 기, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만, 알킬, 할로젠화된 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 알데하이드, 아미노, 카복실산, 에스터, 에터, 할라이드, 하이드록시, 케톤, 설포-옥소, 설포닐, 설폰, 설폭사이드 또는 싸이올로 치환될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "사이클로알켄일"이란 용어는 적어도 3개의 탄소 원자로 구성되고 적어도 하나의 이중 결합, 즉 C=C를 함유하는 비-방향족 탄소계 고리이다. 사이클로알켄일 기의 예로는, 이들에 국한되는 것은 아니지만 사이클로프로펜일, 사이클로뷰텐일, 사이클로펜텐일, 사이클로펜타다이엔일, 사이클로헥센일, 사이클로헥사다이엔일 등이 있다. "헤테로사이클로알켄일"이란 용어는 앞서 규정된 사이클로알켄일 기의 한 유형이고, "사이클로알켄일"이란 용어는 의미에 포함되는데, 고리의 탄소 원자들 중 적어도 하나가 헤테로원자, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만 질소, 산소, 황, 또는 인으로 치환된 것이다. 사이클로알켄일 기와 헤테로사이클로알켄일 기는 치환 또는 비치환될 수도 있다. 사이클로알켄일 기와 헤테로사이클로알켄일 기는 본 발명에서 설명되는 바와 같이, 하나 이상의 기, 예컨대 이들에 국한되는 것은 아니지만, 알킬, 할로젠화된 알킬, 알콕시, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 알데하이드, 아미노, 카복실산, 에스터, 에터, 할라이드, 하이드록시, 케톤, 설포-옥소, 설포닐, 설폰, 설폭사이드 또는 싸이올로 치환될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "사이클릭 기"란 용어는 아릴 기, 비-아릴 기(즉, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알켄일, 및 헤테로사이클로알켄일 기)의 어느 하나, 또는 둘 다를 지칭한다. 사이클릭 기는 치환 또는 비치환될 수 있는 하나 이상의 고리 시스템을 가진다. 사이클릭 기는 하나 이상의 아릴 기, 하나 이상의 비-아릴 기, 또는 하나 이상의 아릴 기와 하나 이상의 비-아릴 기를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "알데하이드"란 용어는 식 -C(O)H로 표시된다. 본 명세서 전체를 통해 "C(O)"는 간단하게 C=O로 표시한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "아민" 또는 "아미노 "라는 용어는 식 NA1A2A3로 표시되되, 이때 A1, A2 및 A3는 독립적으로 앞서 설명된 수소, 알킬, 할로젠화된 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알켄일 기일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "카복실산"이란 용어는 식 -C(O)OH로 표시된다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, "카복실레이트"는 식 -C(O)O-로 표시된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "에스터"란 용어는 식 -OC(O)A1 또는 -C(O)OA1로서 표시되되, 이때 A1는 앞서 설명된 알킬, 할로젠화된 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알켄일 기일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "에터"란 용어는 식 A1OA2로 표시되며, 이 때 A1과 A2는 독립적으로 앞서 설명된 알킬, 할로젠화된 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알켄일일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "케톤"이란 용어는 식 A1C(O)A2로 표시되며, 이때 A1과 A2는 독립적으로 앞서 설명된 알킬, 할로젠화된 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알켄일일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "할라이드"란 용어는 플루오르, 염소, 브롬 및 아이오딘과 같은 할로젠이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "하이드록실"이란 용어는 식 -OH로 표시된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "설포-옥소"이란 용어는 식 -S(O)A1(즉, "설포닐"), A1S(O)A2(즉, "설폭사이드"), -S(O)2A1, A1SO2A2(즉, "설폰"), -OS(O)2A1 또는 -OS(O)2OA1로 표시되며, 이때 A1과 A2는 독립적으로 앞서 설명된 알킬, 할로젠화된 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알켄일일 수 있다. 본 명세서를 통해 "S(O)"는 간단하게 S=O로 표시한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "설포닐아미노" 또는 "설폰아마이드" 이란 용어는 식 -S(O)2NH-로 표시된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "싸이올"이란 용어는 식 -SH로 표시된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, n이 일부 정수인 "Rn"은 독립적으로 하나 이상의 앞서 열거된 기를 포함할 수 있다. 예를 들면, R10이 아릴 기를 함유한다면, 아릴 기의 할로젠 원자들 중 하나는 임의로 하이드록실 기, 알콕시 기, 아민 기, 알킬 기, 할라이드 등으로 치환될 수 있다. 선택되는 기에 따라, 제 1 기는 제 2 기에 통합될 수 있고, 또는 달리 제 1 기는 제 2 기에 대해 펜던트(즉, 부착됨)일수 있다. 예를 들면, "아미노기를 포함하는 알킬 기"라는 구절을 보면, 아미노기가 알킬 기의 골격 안에 혼입될 수 있다. 또는, 달리 아미노 기는 알킬 기의 골격에 부착될 수 있다. 선택되는 기(들)의 특성은 제 1 기가 제 2 기에 삽입되거나 부착되는 경우 확인될 것이다.
달리 언급이 없다면, 오직 실선으로만 표시되고 쐐기형 선이나 점선으로는 표시되지 않은 식은 각각의 가능한 이성질체, 예컨대 각각의 경상이성질체 및 부분입체 이성질체, 및 이성질체의 혼합물, 예컨대 라세미 혼합물 또는 스칼레미(scalemic) 혼합물을 포함한다.
본원에 개시된 특정 물질, 화합물, 조성물, 및 성분들은 상업적으로 구입하거나 당해 분야의 숙련자들에게 일반적으로 공지되어 있는 기법들을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 개시된 화합물 및 조성물을 제조하는데 사용되는 출발 물 질 및 시약은 상업적인 공급체, 예컨대 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Co.)(위스콘신주 밀워키 소재), 아크로스 오르가닉스(Acros Organics)(뉴져지주 모리스 플레인스 소재), 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(펜실베니아주 피츠버그 소재) 또는 시그마(Sigma)(미저리주 세인트 루이스 소재)로부터 구하거나 또는 다음과 같은 문헌에 기재된 과정들을 따라 당해 분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다(문헌 [Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-17(John Wiley and Sons, 1991)]; 문헌 [Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals(Elsevier Science Publishers, 1989)]; 문헌 [Organic Reactions, Volumes 1-40(John Wiley and Sons, 1991)]; 문헌 [March's Advanced Organic Chemistry, (John Wiley and Sons, 4th Edition)]; 및 문헌 [Larock's Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc., 1989)]).
본원은 glmS-반응성 라이보스위치(및 glmS-반응성 라이보스위치로부터 유도된 라이보스위치)와 유용한 화합물은, 글루코사민-6-포스페이트가 아닌, 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 생리학적으로 가수분해 가능한 및 허용 가능한 에스터, 또는 둘 다를 제공한다:
화학식 I
Figure 112009020170115-PCT00002
상기 식에서,
R1은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R2는 NH-R6이고, 이때 R6은 H, CH3, C2H5, n-프로필, C(O)CH3, C(O)C2H5, C(O)n-프로필, C(O)아이소-프로필, C(O)OCH3, C(O)OC2H5, C(O)NH2 또는 NH2이고,
R3은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R4는 수소 결합 공여체이고,
R5는 수소 결합 수용체이다.
한 예에서, R4는 OH, SH, NH2, NH3 +, CH2OH, CH(OH)CH3, CH2CH2OH, CH2SH, CH(SH)CH3, CH2CH2SH, CH2NH2, CH(NH2)CH3, CH2CH2NH3, CO2H, CONH2, CONH알킬, =NH, =NOH, =NSH, =NCO2H, =CH2, CH=NH, CH=NOH, CH=NSH, CH=NCO2H, OCH2OH, OCH2CH2OH, PhOH, NH알킬, NHNH2, NHNH알킬, NHCO알킬, NHCO2알킬, NHCONH2, NHSO2알킬 또는 NHO알킬이다.
다른 예에서, R1이 H 또는 OH이고 R2가 NH2 또는 NHCH3인 경우, R4는 OH가 아니다.
다른 예에서, R5는 OP(O)(OH)2, OP(S)(OH)2, OP(O)OHSH, OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH일 수 있다. 또한, R5는 OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH일 수 있다. R5는 음으로 하전될 수 있다. 또한, R5는 =O, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, R9는 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3일 수 있다.
다른 예에서, R5는 또한 =O, OH, OR9, COR9, CN, NO2, 테트라졸, SOR9, N(R9)2, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, R9는 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3일 수 있다.
R4는 NH2, NH3 +, OH, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨일 수 있다.
또한, R4는 NH2, NH3 +, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨일 수 있다.
특정 부분 또는 기가 본 발명에서 수소 결합 공여체 또는 수용체로서 언급될 수 있는 한편, 이 용어는 단순히 다양한 치환기를 알아보기 쉽게 범주화하기 위해 사용된 것으로 이해되어야 한다. 이러한 용어는 특정 부분이 실제로 라이보스위치 또는 임의의 다른 화합물과 수소 결합하는데 참여하는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에서 부분은 라이보스위치 또는 다른 화합물과의 소수성, 이온, 반데르발스 또는 다른 유형의 상호작용에 단독으로 또는 부가적으로 포함될 수 있는 수소 결합 수용체(또는 공여체)로서 언급될 수 있다.
또한, 본원에 개시된 특정 기들은 본 발명에서 수소 결합 수용체 및 수소 결합 공여체로서 언급될 수 있음이 인지된다. 예를 들면, -OH는 수소 원자를 공여함으로써 수소 결합 공여체일 수 있고; -OH는 또한 산소 원자 상에 결합하지 않은 하나 이상의 전자쌍을 통해 수소 결합 수용체일 수도 있다. 따라서, 본 명세서 전체를 통해 다양한 부분이 수소 결합 공여체 및 수용체일 수 있으며, 그 자체로 언급될 수 있다.
상기 정의 내에 포함되는 모든 화합물은 구체적으로 본원에 개시되는 것으로 의도되고 간주되어야 한다. 더욱이, 상기 정의로 확인될 수 있는 모든 하위그룹도 구체적으로 본원에 개시되는 것으로 의도되고 간주되어야 한다. 그 결과로서, 임의의 화합물, 또는 화합물의 하위그룹은 구체적으로 포함되거나 또는 사용으로부터 배제될 수 있거나 화합물 목록으로부터 포함되거나 배제될 수 있다. 한 예로서, 화합물 그룹은 각 화합물이 앞서 규정된 것과 같고, glmS-반응성 라이보스위치를 활성화할 수 있도록 계획된다.
라이보스위치와 상호작용하는 화합물에 대하여 본 발명에 설명된 특정 접촉 및 상호작용(예컨대, 수소 결합 공여 또는 수용)은 바람직하지만 화합물과 라이보스위치와의 상호작용에 본질적인 것은 아니라는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 화합물은 라이보스위치와 개시된 접촉 및 상호작용을 나타내는 화합물보다 적은 친화성 및/또는 특이성으로 라이보스위치와 상호작용할 수 있다. 더욱이, 화합물 상의 상이한 또는 추가의 작용기는 라이보스위치와의 새로운, 상이한 및/또는 보상하는 접촉을 도입할 수 있다. 예를 들면, glmS 라이보스위치의 경우, 큰 작용기는 예컨대 R과 R에서 사용될 수 있다. 이러한 작용기는 라이보스위치의 한 부분과 접촉 및 상호작용을 할 수 있고, 그렇게 하도록 디자인될 수 있다. 이러한 접촉 및 상호작용은 트리거 분자 및 코어 구조의 접촉 및 상호작용을 보상할 수 있다.
D. 구축물, 벡터 및 발현 시스템
앞서 개시된 glmS 라이보스위치는 임의의 적합한 발현 시스템과 함께 사용될 수 있다. 재조합 발현은 플라스미드와 같은 벡터를 이용하여 편리하게 달성된다. 벡터는 라이보스위치-암호화 서열 및 발현될 RNA(예컨대, 단백질을 암호화하는 RNA)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 전사 및 번역에 필요한 다른 요소들을 포함할 수도 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 벡터는 외인성 DNA를 함유하는 임의의 담체를 지칭한다. 이와 같이, 벡터는 변성 없이 외인성 핵산을 세포로 수송하는 제제이며, 이것이 송달된 세포에서 핵산의 발현을 가져오는 프로모터를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 핵산, 바이러스, 파지 핵산, 파지, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 라이보스위치-조절 구축물을 운반하는데 적합한 다양한 원핵생물 및 진핵생물 발현 벡터가 생산될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 예컨대 pET, pET3d, pCR2.1, pBAD, pUC 및 효모 벡터를 포함한다. 벡터는 예컨대 다양한 생체 내 및 시험관 내 상황에서 사용될 수 있다.
바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 소아마비 바이러스, AIDS 바이러스, 신경세포 작용 바이러스, 신드비스(Shidbis) 바이러스 및 그 외 다른 RNA 바이러스를 포함하며, HTV 골격을 갖는 바이러스들도 포함한다. 또한, 벡터로서의 사용을 적합하게 하는 이들 바이러스의 특성을 공유하는 임의의 바이러스 과가 유용하다. 문헌 [Verma(1985)]에 의해 설명된 레트로바이러스 벡터는 뮤린 말로니(Murine Maloney) 백혈병 바이러스, MMLV, 및 벡터로서 MMLV의 바람직한 특성을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 전형적으로, 바이러스 벡터는, 비-구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 인캡시데이션(encapsidation)에 필요한 반전 말 단 반복부, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 제어하는 프로모터를 함유한다. 벡터로서 유전자 조작되었을 때, 바이러스는 전형적으로 하나 이상의 초기 유전자가 제거되고, 제거된 바이러스 DNA 대신에 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트가 바이러스 게놈에 삽입된다.
"프로모터"는 일반적으로 상대적으로 고정된 위치에서 전사 시작 부위와 관련하여 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. "프로모터"는 RNA 중합효소와 전사인자들의 기본적 상호작용에 필요한 중심 요소를 함유하며, 상류 요소와 반응 요소를 함유할 수 있다.
"인핸서(enhancer)"는 일반적으로 전사 시작 부위로부터 가변적 거리에서 기능하는 DNA의 서열을 지칭하며, 전사 유닛의 5'(문헌 [Laimins, 1981]) 또는 3'(루스키(Lusky) 등의 1983년 문헌) 일 수 있다. 또한, 인핸서는 니트론 내에 있을 수도 있고(바네르지(Banerji) 등의 1983년 문헌), 그 자신의 암호 서열 내에 있을 수도 있다(오스본(Osborne) 등의 1984년 문헌). 이들은 통상 10 내지 300bp의 길이이며 시스 상태로 기능한다. 인핸서는 프로모터 근처에서 전사를 증가시키는 기능을 한다. 또한, 인핸서는 대체로 프로모터처럼 전사 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 주로 발현의 조절을 결정한다.
또한, 진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 유핵 세포)에서 사용된 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이들 영역은 조직 인자 단백질을 암호화하는 mRNA의 미번역 부분에서 폴리아데닐화 절편으로서 전사된다. 또한, 3' 미번역 영역이 전 사 종결 부위를 포함한다. 전사 유닛은 또한 폴리아데닐화 영역을 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 가지 이점은 전사된 유닛이 mRNA와 같이 가공되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 점이다. 발현 구축물에서 폴리아데닐화 신호의 확인 및 이용은 잘 확립되어 있다. 트랜스유전자(transgene) 구축물에서는 상동성 폴리아데닐화 신호가 사용되는 것이 바람직하다.
벡터는 마커 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 산물은 유전자가 세포로 송달되었는 지를 확인하기 위해 사용되며, 일단 송달되면 발현된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 이. 콜라이(E. coli) lacZ 유전자이다.
일부 실시양태에서, 마커는 선택성 마커일 수 있다. 이러한 선택성 마커가 숙주 세포로 성공적으로 전달되었을 때, 이 형질전환된 숙주 세포는 선택적 압력 하에 있는 경우 생존할 수 있다. 2개 다른 카테고리의 선택적 방식이 폭넓게 사용된다. 제 1 카테고리는 세포의 대사와 보충 배지에서 독립적으로 생장하는 능력이 결여된 돌연변이 세포주의 이용에 기초한다. 제 2 카테고리는 우성 선택인데, 이는 임의의 세포 유형에서 사용된 선택 계획안을 지칭하며, 돌연변이 세포주의 이용은 필요하지 않다. 이들 계획안은 전형적으로 숙주 세포의 생장을 정지시키는 약물을 이용한다. 신규 유전자를 갖는 세포들은 약물-내성을 전달하는 단백질을 발현할 것이며, 선택시 생존할 것이다. 이러한 우성 선택의 예들은 네오마이신(문헌 [Southern and Berg, 1982]), 미코페놀산(문헌 [Mulligan and Berg, 1980]) 또는 히그로마이신(수그덴(Sugden) 등의 1985년 문헌) 약물을 이용한다.
유전자 전달은 이에 국한되지 않지만 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드 및 인공 염색체에 유전 물질을 직접 전달하거나, 또는 세포 또는 양이온 리포솜과 같은 캐리어(carrier)에 유전 물질을 전달함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 본 발명에 설명된 방법에서 사용하기 위해 쉽게 개조될 수 있다. 전달 벡터는 유전자를 세포로 송달하는데 사용된 임의의 뉴클레오타이드 구성(예컨대, 플라스미드)일 수 있거나, 또는 유전자를 송달하는 일반적인 전략의 일부분예컨대 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 부분일 수 있다(람(Ram) 등의 문헌 [Cancer Res. 53:83-88(1993)]). 바이러스 벡터, 화학적 트랜스펙탄트(transfectant), 또는 전기천공 및 DNA의 직접 확산과 같은 물리적-기계적 방법을 포함하는 적합한 트랜스펙션(transfection) 수단이 예컨대 문헌에 설명된다(울프(Wolff, J. A.) 등의 문헌 [Science, 247, 1465-1468(1990)]; 및 울프의 문헌 [Nature, 352, 815-818(1991)]).
1. 바이러스 벡터
바람직한 바이러스 벡터들은 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 소아마비 바이러스, AIDS 바이러스, 신경세포 작용 바이러스, 신드비스 및 그 외 다른 RNA 바이러스이며, HIV 골격을 갖는 바이러스들도 포함한다. 또한, 벡터로서의 사용을 적합하게 하는 이들 바이러스의 특성을 공유하는 임의의 바이러스 과가 유용하다. 바람직한 레트로바이러스 벡터는 뮤린 말로니 백혈병 바이러스, MMLV, 및 벡터로서 MMLV의 바람직한 특성을 발현하는 레트 로바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 더 큰 유전적 하중, 즉 트랜스유전자 또는 마커 유전자를 지닐 수 있는데, 이 이유 때문에 이 벡터가 일반적으로 사용되고 있다. 그러나, 이들은 비-증식성 세포에서는 유용하지 않다. 아데노바이러스 벡터가 비교적 안정하고 다루기 쉬우면서도 높은 역가를 갖는데, 이들은 에어로졸 제제로 송달될 수 있고, 비-분화성 세포를 트랜스펙션할 수 있다. 수두 바이러스 벡터는 크고, 유전자를 삽입하기 위한 몇 개의 부위를 가지며, 열에 안정하고, 실온에서도 보관될 수 있다. 바람직한 실시양태는 바이러스 항원에 의해 도출된 숙주 유기체의 면역반응을 억제하도록 유전자 조작된 바이러스 벡터이다. 이 종류의 바람직한 벡터는 인터류킨(Interleukin) 8 또는 10의 암호화 영역을 지닐 것이다.
바이러스 벡터는 유전자를 세포로 도입하기 위한 대부분의 화학적 또는 물리적 방법보다도 더 높은 상호작용 능력(유전자를 도입하는 능력)을 가진다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비-구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 인캡시데이션에 필요한 반전 말단 반복부, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 제어하는 프로모터를 함유한다. 벡터로서 유전자 조작되었을 때, 바이러스는 전형적으로 하나 이상의 초기 유전자가 제거되고, 제거된 바이러스 DNA 대신 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트가 바이러스 게놈에 삽입된다. 이 종류의 구축물은 약 8kb 이하의 외래 유전 물질을 지닐 수 있다. 전형적으로, 제거된 초기 유전자가 보유한 필수 기능은 트랜스 상태의 초기 유전자의 유전자 산물을 발현하도록 유전자 조작된 세포주에 의해 제공된다.
i. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 임의의 종류, 아과, 속 또는 향성(tropism)을 포함하는, 레트로비리다에(Retroviridae) 바이러스 과에 속한 동물 바이러스이다. 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 본 발명에 참고자료로 포함되는 문헌 Verma, I. M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)]에서 설명된다. 유전자 요법을 위해 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법의 예들이 미국 특허 4,868,116 및 4,980,286; 국제특허출원 공개 제WO 90/02806호 및 제WO 89/07136호; 및 문헌 [Mulligan, (Science 260:926-932(1993)]에 설명되며, 이들 문헌은 본 발명에 참고자료로 포함된다.
본질적으로 레트로바이러스는 이에 핵산 카고(cargo)를 패킹한 패키지이다. 핵산 카고는 그와 함께 패키지화 신호를 지니는데, 이는 복제된 딸 분자가 패키지 외피 내에 효과적으로 패킹되도록 확실히 한다. 패키지화 신호에 더하여, 복제 및 복제된 바이러스의 패키지화를 위해 시스 상태의 많은 분자들이 필요하다. 전형적으로, 레트로바이러스 게놈은 gag, pol 및 env 유전자를 함유하는 데, 이들은 단백질 외피의 제조에 연루된다. gag, pol 및 env 유전자는 전형적으로 표적 세포로 전달될 수 있는 외래 DNA에 의해 대체된다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로, 패키지 외피 내로의 포함을 위한 패키지 신호, gag 전사 유닛의 시작을 신호화하는 서열, 역전사의 tRNA 프라이머에 결합하는 프라이머 결합 부위를 포함하는 역전사에 필요한 요소, DNA 합성 동안 RNA 가닥의 교대를 가이드하는 말단 반복 서열, DNA 합성에서 제 2 가닥의 합성을 위한 개시 부위로 사용되는 퓨린 풍부 서열 5'에서 3' 방향 LTR, 및 DNA 상태의 레트로바이러스의 삽입과 이에 따른 숙주 게놈으로의 삽입을 가능하게 하는 LTR 단부 근처의 특정 서열을 함유한다. gag, pol 및 env 유전자의 제거는, 약 8kb의 외래 서열이 바이러스 게놈으로 삽입되고, 역전사되고 복제에 의해 새로운 레트로바이러스 입자 내에 패킹되는 것을 허용한다. 핵산의 양은 각 전사체의 크기에 따라서 1개의 유전자 내지 많은 유전자의 송달에 충분한 양이다. 삽입체 내에는 다른 유전자들과 함께 양성 또는 음성의 선택성 마커를 포함하는 것이 바람직하다.
대부분의 레트로바이러스 벡터에서는 복제 기구 및 패키지 단백질이 제거되기 때문에(gag, pol 및 env), 전형적으로 이 벡터는 이들을 패키지 세포주 내에 배치함으로써 발생된다. 패키지 세포주는 복제 및 패키지 기구를 함유하지만, 임의의 패키지 신호는 결여한 레트로바이러스로 트랜스펙션 또는 형질전환된 세포주이다. 선택된 DNA를 지닌 벡터가 이들 세포주 내로 /트랜스펙션되었을 때, 헬퍼(helper) 세포에 의해 시스 상태의 제공된 기구에 의해 해당 유전자를 함유하는 벡터가 복제되고 새로운 레트로바이러스 입자 내로 패킹된다. 이 기구의 게놈은, 이들이 필수 신호를 결여하고 있기 때문에 패킹되지 않는다.
ii. 아데노바이러스 벡터
복제-결함 아데노바이러스의 구성이 설명되었다(버크너(Berkner) 등의 문헌 [J. Virology 61:1213-1220(1987)]; 마시(Massie) 등의 문헌 [Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883(1986)]; 하즈-아마드(Haj-Ahmad) 등의 문헌 [J. Virology 57:267- 214(1986)]; 데이비슨(Davidson) 등의 문헌 [J. Virology 61:1226-1239(1987)]; 장(Zhang)의 문헌 ["Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)]. 이들 바이러스를 이용하는 것의 이점은, 이들이 다른 세포 유형으로 전파될 수 있는 범위에 제한이 있다는 점인데, 이는 이들이 초기 감염 세포에서는 복제할 수 있지만, 새로운 감염 바이러스 입자를 형성할 수는 없기 때문이다. 재조합 아데노바이러스는 기도 상피, 간세포, 혈관내피, CNS 실질 및 많은 다른 조직 부위들로 직접 생체 내 송달된 후에, 고 효능의 유전자 전달을 달성하는 것으로 밝혀졌다(모시(Morsy)의 문헌 [J. Clin. Invest. 92:1580-1586(1993)]; 키르센바움(Kirshenbaum)의 문헌 [J. Clin. Invest. 92:381387(1993)]; 로에슬러(Roessler)의 문헌 [J Clin. Investment 92:1085-1092(1993)]; 물리어(Moullier)의 문헌 [Nature Genetics 4:154-159(1993)]; 라 살레(La Salle)의 문헌 [Science 259:988-990(1993)]; 고메즈-포익스(Gomez-Foix)의 문헌 [J. Biol. Chem. 267:25129-25134(1992)]; 리치(Rich)의 문헌 [Human Gene Therapy 4:461-476(1993)]; 자브너(Zabner)의 문헌 [Nature Genetics 6: 75-83(1994)]; 구즈만(Guzman)의 문헌 [Circulation Research 73:1201-1207(1993)]; 부트(Bout))의 문헌 [Human Gene Therapy 5:3-10(1994)]; 자브너의 문헌 [Cell 75:207-216(1993)]; 카일라우드(Caillaud)의 문헌 [Eur. J. Neuro-science 5:1287-1291(1993)]; 및 라고트(Ragot)의 문헌 [J. Gen. Virology 74:501-507(1993)]. 재조합 아데노바이러스는 특정한 세포 표면 수용체에 결합함으로써 유전자 형질도입(transduction)을 달 성하고, 그 후에 이 바이러스는 야생형 또는 복제-결함 아데노바이러스와 같은 방식으로 수용체-매개 세포 내이입에 의해 내재화된다(차르도네트(Chardonnet) 및 데일즈(Dales)의 문헌 [Virology 40:462-477(1970)]; 브라운(Brown) 및 불링햄(Burlingham)의 문헌 [J. Virology 12:386-396(1973)]; 스벤손(Svensson) 및 페르손(Persson)의 문헌 [J. Virology 55:442-449(1985)]; 세트(Seth) 등의 문헌 [J. Virol. 51:650-655(1984)]; 세트 등의 문헌 [Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533(1984)]; 바르가(Varga) 등의 문헌 [J. Virology 65:6061-6070(1991)]; 위크햄(Wickham) 등의 문헌 [Cell 73:309319(1993)].
바람직한 바이러스 벡터는 E1 유전자가 제거된 아데노바이러스에 기초한 것이며, 이들 비리온은 사람 293 세포주와 같은 세포주에서 발생된다. 다른 바람직한 실시양태에서는 아데노바이러스 게놈으로부터 E1과 E3 유전자가 모두 제거된다.
다른 종류의 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV)에 기초한다. 이 결함성 파보 바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있고 사람에게 비-병원성이기 때문에 바람직한 벡터이다. AAV 유형 벡터는 약 4 내지 5kb를 수송할 수 있으며, 야생형 AAV는 19번 염색체에 안정하게 삽입된다고 알려져 있다. 이 부위 특이적 통합 특성을 함유하는 벡터가 바람직하다. 이 종류의 벡터에서 특히 바람직한 실시양태는 아비겐(캘리포니아 샌프란시스코)에 의해 생산된 P4.1 C인데, 이는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자, HSV-tk, 및/또는 녹색 형광 단백질 GFP를 암호화하는 유전자와 같은 마커 유전자를 함유할 수 있다.
바이러스 및 레트로바이러스에 삽입된 유전자는 통상 프로모터, 및/또는 원 하는 유전자 산물의 발현을 제어하도록 돕는 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 상대적으로 고정된 위치에서 전사 시작 부위와 관련하여 기능을 하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소와 전사인자들의 기본적 상호작용에 필요한 중심 요소를 함유하며, 상류 요소와 반응 요소를 함유할 수 있다.
2. 바이러스 프로모터 및 인핸서
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사를 제어하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원으로부터 예컨대 폴리오마(polyoma), 원숭이 바이러스 40(Simian Virus 40; SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 사이토메갈로 바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어지거나, 또는 이종성 포유동물 프로모터, 예컨대 베타 액틴 프로모터로부터 얻어질 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기원을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다(피어스(Fiers) 등의 문헌 [Nature, 273:113(1978)]). 사람 사이토메갈로 바이러스의 즉각 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다(그린웨이(Greenway, P.J.) 등의 문헌 [Gene 18:355-360(1982)]). 물론, 숙주 세포나 관련 종들로부터의 프로모터도 본 발명에서 유용하다.
인핸서는 일반적으로 전사 시작 부위로부터 가변적 거리에서 기능을 하는 DNA의 서열을 지칭하며, 이는 전사 유닛의 5'(라이민즈(Laimins, L.) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. 78:993(1981)]) 또는 3'(루스키(Lusky, M.L.) 등의 문헌 [Mol. Cell Bio. 3:1108(1983)])일 수 있다. 더욱이, 인핸서는 인트론 내에 있을 수도 있고(반네르지(Banerji, J. L.) 등의 문헌 [Cell 33:729 (1983)]), 그 자신의 암호 서열 내에 있을 수도 있다(오스본(Osborne, T. F.) 등의 문헌 [Mol. Cell Bio. 4:1293(1984)]). 이들은 통상 10 내지 300bp의 길이이며, 시스 상태로 기능을 한다. 인핸서는 프로모터 근처에서 전사를 증가시키는 기능을 한다. 또한, 인핸서는 대체로 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 프로모터도 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 함유할 수 있다. 인핸서는 주로 유전자의 발현의 조절을 결정한다. 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 많은 인핸서 서열이 현재 공지되어 있으며, 전형적으로는 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서를 이용하고 있다. 바람직한 예들은 복제 기원의 후기 쪽 SV40 인핸서(bp 100 내지 270), 사이토메갈로 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 쪽 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서이다.
프로모터 및/또는 인핸서는 그들의 기능을 유발하는 가벼운 또는 특이적 화학적 사건에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 또한, 감마 조사와 같은 광 조사 또는 알킬화 화학요법제에 노출함으로써 바이러스 벡터 유전자의 발현을 증진시킬 수 있는 방법도 있다.
프로모터 및/또는 인핸서 영역은 모든 진핵생물 세포 유형에서 활성인 것이 바람직하다. 이 종류의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터(650개의 염기)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로 바이러스(전체 길이의 프로모터), 및 레트로바이러스 벡터 LTF이다.
모든 특이적 조절 요소들이 클로닝될 수 있으며, 이들을 사용하여 흑색종 세포와 같은 특정 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 구성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 아교질 섬유매듭 아세트산 단백질(GFAP) 프로모터는 아교질 기원의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는데 사용되었다.
또한, 진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사 종결에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이들 영역은 조직 인자 단백질을 암호화하는 mRNA의 미번역 부분에서 폴리아데닐화 절편으로서 전사된다. 또한, 3' 미번역 영역이 전사 종결 부위를 포함한다. 전사 유닛은 또한 폴리아데닐화 영역을 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 가지 이점은 전사 유닛이 mRNA처럼 가공되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 점이다. 발현 구축물에서 폴리아데닐화 신호의 확인 및 이용은 잘 확립되어 있다. 트랜스유전자 구축물에서는 상동성 폴리아데닐화 신호가 사용되는 것이 바람직하다. 전사 유닛의 바람직한 실시양태에서는, 폴리아데닐화 영역이 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유래되며 약 400개의 염기로 구성된다. 또한, 구축물로부터의 발현이나, 또는 구축물의 안정성을 개선하기 위해서, 전사된 유닛은 단독으로 또는 상기 서열과 조합하여 다른 표준 서열을 함유하는 것이 바람직하다.
3. 마커
벡터는 마커 산물을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 산물은 유전자가 세포로 송달되었는 지를 확인하기 위해 사용되며, 일단 송달되면 발현 된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질을 암호화하는 이. 콜라이 lacZ 유전자이다.
일부 실시양태에서, 마커는 선택성 마커일 수 있다. 포유동물 세포의 적합한 선택성 마커의 예는 다이하이드로폴레이트 환원 효소(DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 하이드로마이신, 및 퓨로마이신이다. 이러한 선택성 마커가 포유동물 숙주 세포로 성공적으로 전달되었을 때, 이 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선택적 압력 하에 있는 경우 생존할 것이다. 2개 다른 카테고리의 선택적 방식이 폭넓게 사용되고 있다. 제 1 카테고리는 세포의 대사와 보충된 배지에 독립적으로 생장하는 능력이 결여된 돌연변이 세포주의 이용에 기초한다. 2개 예는 CHO DHFR-세포 및 생쥐 LTK-세포이다. 이들 세포는 티미딘이나 하이포잔틴과 같은 영양물의 첨가 없이 생장하는 능력을 결여하고 있다. 이들 세포는 완전한 뉴클레오타이드 합성 경로에 필요한 임의의 유전자를 결여하고 있기 때문에, 결여된 뉴클레오타이드가 보충 배지에서 제공되지 않는다면 이들은 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 것에 대한 대안은 각 유전자를 결여하고 있는 세포에 무손상 DHFR 또는 TK 유전자를 도입함으로써 이들의 생장 요건을 변경시키는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 세포는 비-보충 배지에서는 생존할 수 없을 것이다.
제 2 카테고리는 우성 선택인데, 이는 임의의 세포 유형에서 사용된 선택 계획안을 지칭하며, 돌연변이 세포주의 이용을 필요로 하지 않는다. 이들 계획안은 전형적으로 숙주 세포의 생장을 정지시키는 약물을 이용한다. 약물-내성을 전달하 는 단백질을 발현하는 세포가 선택시 생존할 것이다. 이러한 우성 선택의 예들은 약물로서 네오마이신(서던(Southern P.) 및 버그(Berg P.)의 문헌 [J. Molec. Appl. Genet. 1:327(1982)]), 미코페놀산(물리간(Mulligan, R.C.) 및 버그의 문헌 [Science 209: 1422(1980)]) 또는 히그로마이신(수그덴(Sugden, B.) 등의 문헌 [Mol. Cell Biol. 5:410-413(1985)])을 이용한다. 이 세 가지 예는 진핵생물 제어하에 각각의 박테리아 유전자를 이용하여 적합한 약물 G418 또는 네오마이신(지네티신), xgpt(미코페놀산) 또는 히그로마이신에 대한 내성을 전달한다. 다른 것은 네오마이신 유사체 G418 및 퓨라마이신을 포함한다.
E. 바이오센서 라이보스위치
또한, 본원은 바이오센서 라이보스위치를 제공한다. 바이오센서 라이보스위치는 그들의 동족 트리거 분자의 존재 하에 검출 가능한 신호를 생성하는 유전자 조작된 라이보스위치이다. 유용한 바이오센서 라이보스위치는 트리거 분자의 역치 수준에서 또는 그 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 라이보스위치는 생체 내 또는 시험관 내에서의 사용을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들면, 신호 생성에 사용되거나 또는 거기 연루된 단백질을 암호화하는 리포터 RNA에 작동 가능하게 연결된 glmS 바이오센서 라이보스위치는 glmS 라이보스위치/리포터 RNA를 암호화하는 핵산 구축물을 은닉하는 세포나 유기체를 유전자 조작함으로써 생체 내에서 사용될 수 있다. 시험관 내에서 사용되는 바이오센서 라이보스위치의 예는 라이보스위치의 활성화 상태에 따라 신호가 변하는 입체구조 의존성 표지를 포함하는 라이보스위치이다. 이러한 바이오센서 라이보스위치는 바람직하게는 천연 발생 라이보스위 치, 예컨대 glmS로부터의 또는 이로부터 유래된 압타머 도메인을 이용한다.
F. 리포터 단백질 및 펩타이드
라이보스위치의 활성화를 평가하기 위해서, 또는 바이오센서 라이보스위치에 있어서, 리포터 단백질 또는 펩타이드가 사용될 수 있다. 리포터 단백질 또는 펩타이드는 라이보스위치에 의해 발현이 조절되는 RNA에 의해 암호화될 수 있다. 예들은 임의의 특이적 리포터 단백질을 이용을 기술하고 있다. 리포터 단백질 및 펩타이드의 이용은 잘 공지된 것이며, 라이보스위치에의 사용에 적합하도록 쉽게 개조될 수 있다. 리포터 단백질은 검출될 수 있거나, 또는 검출 가능한 신호를 생성하는 임의의 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 바람직하게, 이 단백질 또는 펩타이드의 존재는 표준 기술(예컨대, 방사성 면역분석법, 방사성-표지화, 면역분석법, 효소활성분석, 흡광도, 형광, 발광, 및 웨스턴 블롯)을 이용하여 검출될 수 있다. 더욱 바람직하게, 리포터 단백질의 수준은 낮은 수준에서도 표준 기술을 이용하여 쉽게 정량될 수 있다. 유용한 리포터 단백질은 루시페라제, 녹색 형광 단백질 및 이들의 유도체 예컨대 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)로부터의 개똥벌레 루시페라제(FL), 및 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)로부터의 레닐라 루시페라제(RL)를 포함한다.
G. 입체구조 의존성 표지
입체구조 의존성 표지는, 표지가 결합된 분자 또는 화합물(예컨대, 라이보스위치)의 입체구조 또는 입체구조의 변화에 기초하여 형광 강도나 파장의 변화가 생기는 모든 표지를 지칭한다. 프로브 및 프라이머에 관련해서 사용되는 입체구조 의존성 표지의 예들은 분자 비콘, 암플리플루오르(Amplifluor), FRET 프로브, 절단형 FRET 프로브, TaqMan 프로브, 스콜피언 프라이머, 이에 국한되지 않지만, 트리플렉스 분자 비콘 또는 트리플렉스 FRET 프로브를 포함하는 트리플렉스 올리고, 형광 수용성 콘쥬게이트 폴리머, PNA 프로브 및 QPNA 프로브를 포함한다. 이러한 표지와, 특히 그 기능의 원리는 라이보스위치에의 사용에 적합하도록 개조될 수 있다. 슈바이쳐(Schweitzer) 및 킹스모어(Kingsmore)의 문헌 [Curr. Opin. Biotech. 12:21-27(2001)]에서 입체구조 의존성 표지의 몇몇 종류가 고찰된다.
입체구조 의존성 표지의 한 형태인 줄기 켄칭화 표지(stem quenched label)는, 줄기 구조가 켄칭 부분을 형성하는 경우 근접하게 되어서 표지로부터 형광이 켄칭되도록 핵산 상에 위치한 형광 표지이다. 줄기가 와해되었을 때(예컨대, 표지를 함유하는 라이보스위치가 활성화되었을 때), 켄칭 부분은 더 이상 형광 표지에 근접하지 않게 되어 형광이 증가한다. 이 효과의 예는 분자 비콘, 형광 트리플렉스 올리고, 트리플렉스 분자 비콘, 트리플렉스 FRET 프로브 및 QPNA 프로브에서 발견할 수 있으며, 이들의 작동 원리는 라이보스위치에의 사용에 적합하도록 개조될 수 있다.
입체구조 의존성 표지의 한 형태인 줄기 활성화 표지(stem activated label)는, 줄기 구조의 형성에 의해 형광이 증가하거나 변경되는 표지들 또는 표지들의 쌍이다. 줄기 활성화 표지는 수용체 형광 표지와 공여체 부분을 포함할 수 있으며, 이로 인해 수용체와 공여체가 근접해 있을 때(표지를 함유하는 핵산 가닥이 줄기 구조를 형성할 때), 형광 공명 에너지가 공여체로부터 수용체로 전달되어서 수 용체가 형광을 발생하게 된다. 줄기 활성화 표지는 전형적으로 핵산 분자에서 줄기 구조가 형성된 경우 수용체와 공여체가 근접하게 되도록 핵산 분자(라이보스위치 같은) 상에 위치한 표지들의 쌍이다. 만일 줄기 활성화 표지의 공여체 부분 자체가 형광 표지라면, 이는 수용체와 근접해 있지 않아도(즉, 줄기 구조가 형성되지 않아도) 형광 에너지(전형적으로는 수용체의 형광과는 다른 파장의)를 진화할 수 있다. 줄기 구조가 형성되었을 때의 전체적인 효과는 공여체 형광의 감소와 수용체 형광의 증가이다. FRET 프로브가 줄기 활성화 표지를 이용하는 예이며, 이의 작동 원리는 라이보스위치에의 사용에 적합하도록 개조될 수 있다.
H. 검출 표지
라이보스위치의 활성화, 불활성화 및 차단, 또는 라이보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단에 의해 생성된 핵산 또는 단백질의 발현의 검출 또는 정량을 돕기 위해서, 검출 표지가 검출 프로브 또는 검출 분자에 포함되거나, 또는 발현된 핵산이나 단백질에 직접 포함될 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은, 검출 표지는 핵산 또는 단백질과 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있는 임의의 분자이며, 이는 직접 또는 간접적으로 측정가능한, 검출 가능한 신호를 만든다. 많은 이러한 표지가 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 앞서 개시된 방법에서 사용하기에 적합한 검출 표지의 예들은 방사성 활성 동위원소, 형광 분자, 인광 분자, 효소, 항체 및 리간드이다.
적합한 형광 표지의 예들은 플루오레세인 아이소싸이오시아네이트(FITC), 5,6-카복시메틸 플루오레세인, 텍사스 레드(Texas red), 나이트로벤즈-2-옥사-1,3- 다이아졸-4-일(NBD), 쿠마린, 단실 염화물, 로다민, 아미노-메틸 쿠마린(AMCA), 에오신, 에리트로신, BODIPY(등록상표), 케스케이드 블루(Cascade Blue)(등록상표), 오레곤 그린(Oregon Green)(등록상표), 피렌, 리사민, 크산텐, 아크리딘, 옥사진, 피코에리트린, 양자 염료(상표명)와 같은 란탄계 이온의 매크로사이클릭 킬레이트, 싸이아졸 오렌지-에티듐 헤테로다이머와 같은 형광 에너지 전달 염료, 및 사이아닌 염료들 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7을 포함한다. 다른 구체적인 형광 표지의 예들은 3-하이드록시피렌 5,8,10-트라이설폰산, 5-하이드록시트립타민(5-HT), 산 푸시신, 알리자린 컴플렉손, 알리자린 레드, 알로피코사이아닌, 아미노쿠마린, 안트로일 스테아레이트, 아스트라존 브릴리언트 레드 4G, 아스트라존 오렌지 R, 아스트라존 레드 6B, 아스트라존 옐로우 7 GLL, 애타브린, 오라민, 오로포스핀, 오로포스핀 G, BAO 9(비스아미노페닐옥사다이아졸), BCECF, 황산 베르베린, 비스벤자미드, 블랑코포어 FFG 용액, 블랑코포어 SV, 보디피 F1, 브릴리언트 설포플라빈 FF, 칼시엔 블루, 칼슘 그린, 칼코플루오르 RW 용액, 칼코플루오르 화이트, 칼코포어 화이트 ABT 용액, 칼코포어 화이트 표준 용액, 카보스티릴, 캐스케이드 옐로우, 카테콜아민, 친나크린, 코리포스핀 O, 쿠마린-팔로이딘, CY3.1 8, CY5.1 8, CY7, 단스(Dans)(1-다이메틸 아미노 나팔린 5 설폰산), 단사(Dansa)(다이아미노 나프틸 설폰산), 단실 NH-CH3, 다이아미노페닐 옥시다이아졸(DAO), 다이메틸아미노-5-설폰산, 다이피로 메텐보론 이불화물, 다이페닐 브릴리언트 플라빈 7 GFF, 도파민, 에리트로신 ITC, 유크리신, FIF(폼알데하이드 유도 형광), 플라조 오렌지, 플루오 3, 플루오레스카민, 푸라-2, 제나크릴 브릴리언트 레드 B, 제나크릴 브릴리언트 옐로 우 10GF, 제나크릴 핑크 3G, 제나크릴 옐로우 5GF, 글록살산, 그래뉼라 블루, 헤마토포피린, 인도-1, 인트라화이트 Cf 리퀴드, 류코포어 PAF, 류코포어 SF, 류코포어 WS, 리사민로다민 B200(RD200), 루시퍼 옐로우 CH, 루시퍼 옐로우 VS, 마그달라 레드, 마리나 블루, 맥실론 브릴리언트 플라빈 10GFF, 맥실론 브릴리언트 플라빈 8GFF, MPS(메틸그린 피로닌 스틸벤), 미트라마이신, NBD 아민, 나이트로벤족사디돌, 노르아드레날린, 뉴클리어 패스트 레드, 뉴클리어 옐로우, 니로산 브릴리언트 플라빈 E8G, 옥사다이아졸, 퍼시픽 블루, 파라로스아닐린(포일겐 반응), 포휘트 AR 용액, 포휘트 BKL, 포휘트 Rev, 포휘트 RPA, 포스핀 3R, 프탈로사이아닌, 피코에리트린 R, 폴리아자인다센 폰토크롬 블루 블랙, 포피린, 프리물린, 프로시온 옐로우, 피로닌, 피로닌 B, 피로잘 브릴리언트 플라빈 7GF, 퀴나크린 머스타드, 로다민 123, 로다민 5 GLD, 로다민 6G, 로다민 B, 로다민 B 200, 로다민 B 엑스트라, 로다민 BB, 로다민 GB, 로다민 WT, 세로토닌, 세브론 브릴리언트 레드 2b, 세브론 브릴리언트 레드 4G, 세브론 브릴리언트 레드 B, 세브론 오렌지, 세브론 옐로우 L, SITS(프리물린), SITS(스틸벤이소싸이오설폰산), 스틸벤, 스나프 1, 설포로다민 B 칸 C, 설포로다민 G 엑스트라, 테트라사이클린, 싸이아진 레드 R, 싸이오플라빈 S, 싸이오플라빈 TCN, 싸이오플라빈 5, 싸이올라이트, 싸이오졸 오렌지, 티노폴 CBS, 트루 블루, 울트라라이트, 유라닌 B, 유비텍스 SFC, 자일렌 오렌지 및 XRITC을 포함한다.
유용한 형광 표지는 플루오레세인(5-카복시플루오레세인-N-하이드록시숙신이미드에스터), 로다민(5,6-테트라메틸 로다민), 및 사이아닌 염료들인 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7이다. 이들 형광의 흡수 및 방출의 최대값은 각각, FITC(490nm; 520nm), Cy3(554nm; 568nm), Cy3.5(581nm; 588nm), Cy5(652nm; 672nm), Cy5.5(682nm; 703nm) 및 Cy7(755nm; 778nm)이며, 따라서 이들의 동시 검출이 가능하다. 플루오레세인 염료의 다른 예들은 6-카복시플루오레세인(6-FAM), 2',4',1,4-테트라클로로플루오레세인(TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-다이메톡시-4',5'-다이클로로-6-카복시로다민(JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합 페닐1,4-다이클로로-6-카복시플루오레세인(NED) 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-다이클로로-6-카복시플루오레세인(VIC)을 포함한다. 형광 표지는 애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)(뉴저지 피츠버그 소재); 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)(오레곤 유진 소재); 및 리서치 오가닉스(Research Organics)(오하이오 클리블랜드 소재)를 포함하는 많은 상업적 공급원으로부터 입수될 수 있다.
해당 추가의 표지는, 이들이 결합된 프로브가 표적 분자와 특이적으로 결합되었을 때만 신호를 제공하는 것들을 포함하는 데, 이러한 표지들은, 티아기(Tyagi) 및 크라머(Kramer)의 문헌 [Nature Biotechnology (1996) 14:303] 및 유럽 특허 제0070685 B1호에 설명된 "분자 비콘"을 포함한다. 해당 다른 표지들은 미국 특허 5,563,037; 국제특허출원 공개 제WO 97/17471호 및 제WO 97/17076호에 설명된다.
표지된 뉴클레오타이드가 합성 동안 발현된 핵산에 직접 통합되는데 유용한 형태의 검출 표지이다. 핵산에 통합될 수 있는 검출 표지의 예는 뉴클레오타이드 유사체 예컨대 BrdUrd(5-브로모데옥시우리딘, 호이(Hoy) 및 쉬니케(Schinike)의 문헌 [Mutation Research 290:217-230(1993)]), 아미노알릴데옥시우리딘(헤네가리우(Henegariu) 등의 문헌 [Nature Biotechnology 18:345348(2000)]), 5-메틸시토신(사노(Sano) 등의 문헌 [Biochim. Biophys. Acta 951:157-165(1988)]), 브로모우리딘(완식(Wansick) 등의 문헌 [J. Cell Biology 122:283-293(1993)]) 및 바이오틴(란거(Langer) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sd. USA 78:6633(1981)]) 또는 디곡시게닌과 같은 적합한 햅텐(커크호프(Kerkhof)의 문헌 [Anal. Biochem. 205:359-364(1992)])으로 변경된 뉴클레오타이드를 포함한다. 적합한 형광-표지 뉴클레오타이드는 플루오레세인-아이소싸이오시아네이트-dUTP, 사이아닌-3-dUTP 및 사이아닌-5dUTP이다(유(Yu) 등의 문헌 [Nucleic Acids Res. 22:3226 -3232(1994)]). DNA를 위한 바람직한 뉴클레오타이드 유사체 검출 표지는 BrdUrd(브로모데옥시우리딘, BrdUrd, BrdU, BUdR, 시그마-알드리치)이다. DNA에 검출 표지를 통합하는데 유용한 다른 뉴클레오타이드 유사체는 AA-dUTP(아미노알릴데옥시우리딘 트라이포스페이트, 시그마-알드리치), 및 5메틸-dCTP(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))이다. RNA에 검출 표지를 통합하는데 유용한 뉴클레오타이드 유사체는 바이오틴-16-UTP(바이오틴-16-우리딘-5'-트라이포스페이트, 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)이다. 플루오레세인, Cy3, 및 Cy5는 dUTP에 연결되어 직접 표지화될 수 있다. Cy3.5 및 Cy7은 바이오틴-또는 디곡시게닌-표지 프로브의 2차 검출을 위한 아비딘 또는 항-디곡시게닌 콘쥬게이트로서 이용할 수 있다.
바이오틴과 같이 핵산 내에 혼입되는 검출 표지는 후속적으로 본 분야에 잘 공지된 감지법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 바이오틴은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 콘쥬게이트(트로픽스 인코포레이티드(Tropix, Inc.))를 이용하여 검출될 수 있는데, 이는 바이오틴에 결합된 다음 적합한 기질(예컨대, 화학발광성 기질 CSPD: 다이소듐 3-(4-메톡시스피로-[1,2-다이옥세테인-3-2'-(5'-클로로)트리사이클로[3.3.1.13.7]데케인]-4-일)페닐 포스페이트; 트로픽스 인코포레이티드)의 화학발광에 의해 검출된다. 또한, 표지는 알칼리성 포스파타제, 대두 퍼옥시다제, 양고추냉이 퍼옥시다제 및 중합효소와 같은 효소일 수 있으며, 이들은 예컨대 화학적 신호 증폭을 이용하거나, 또는 빛(예컨대, 화학발광성 1,2-다이옥세테인 기질) 또는 형광 신호를 생성하는 효소에 대한 기질을 이용하여 검출될 수 있다.
또한, 이들 검출 표지가 2개 이상 조합된 분자가 검출 표지로서 고려된다. 공지된 검출 표지 중 임의의 것이라도 개시된 프로브, 택, 분자, 및 활성화 또는 불활성화 라이보스위치 또는 개시된 방법으로 생성된 핵산 또는 단백질을 표지하고 검출하는 방법과 함께 사용될 수 있다. 또한, 검출 표지에 의해 발생된 신호를 검출하고 측정하는 방법도 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 방사성 활성 동위원소는 섬광방출 계수 또는 직접 시각화에 의해서 검출될 수 있고; 형광 분자는 형광 분광광도계로 검출될 수 있고; 인광 분자는 분광광도계를 이용하거나 또는 카메라를 사용하여 직접 시각화함으로써 검출될 수 있고; 효소는 효소에 의해서 촉매되는 반응의 산물을 검출하거나 시각화함으로써 검출될 수 있고; 그리고 항체는 항체에 결합된 2차 검출 표지를 검출함으로써 검출될 수 있다. 본 발명 에 사용된 바와 같은, 검출 분자는 검출될 화합물 또는 조성물과 상호작용하고, 하나 이상의 검출 표지가 결합된 분자이다.
I. 서열 유사성
본 발명에서 논의된 바, 상동성 및 동일성이란 용어의 사용은 유사성과 동일한 것을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 예컨대 2개의 서열(예컨대, 비-천연 서열) 사이에서 상동성이란 단어가 사용된다면, 이 단어는 반드시 이들 2개의 서열 사이의 진화적 관계를 나타내는 것은 아니며, 오히려 이들 핵산 서열 사이의 유사성 또는 관련성을 고찰하고 있는 것임이 이해된다. 2개의 진화적으로 관련된 분자들 사이의 상동성을 측정하기 위한 많은 방법이, 이들이 진화적으로 관련 있는 지와 무관하게 서열 유사성을 측정하기 위해서 임의의 둘 이상의 핵산 또는 단백질에 통상적으로 적용된다.
일반적으로, 본원에 개시된 라이보스위치, 압타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질의 임의 공지의 변이체 및 유도체 또는 발생할 가능성이 있는 것들을 정의하기 위한 한 방식은, 특정 기지 서열에 대한 상동성의 측면에서 변이체 및 유도체를 정의하는 것임이 이해된다. 본원에 개시된 특정한 서열들의 이 동일성은 또한 본 발명의 다른 곳에서도 논의되고 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 라이보스위치, 압타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질의 변이체는, 언급된 서열 또는 모 서열에 대해 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 상동성을 가진다. 당해 분야의 숙련자는 유전자와 같은, 2개의 단백질 또는 핵산의 상동성을 어떻게 측정하는 지 쉽게 알 수 있다. 예를 들면, 최고 수준의 상동성으로 2개의 서열을 정렬한 후에 상동성이 계산될 수 있다.
상동성을 계산하는 다른 방식은 공개된 알고리즘에 의해서 수행될 수 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 로컬 상동성 알고리즘(스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)의 문헌 [Adv. Appl. Math. 2:482(1981)]), 상동성 정렬 알고리즘(니들만(Needleman) 및 운츠(Wunsch)의 문헌 J. Mol. Biol. 48:443(1970)]), 유사성 탐색법(피어손(Pearson) 및 리프만(Lipman)의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444(1988)]), 이들 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 위스콘신 지네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 575 Science Dr., 위스콘신 매디슨 소재), 또는 정밀조사에 의해 수행될 수 있다.
예를 들면, 적어도 핵산 정렬에 관련된 물질에 대한 참고자료로 본 발명에 포함되는 주커(Zuker)의 문헌 [M. Science 244:4852, 1989], 자에거(Jaeger) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989], 자에거 등의 문헌 [Methods Enzymol. 183:281-306, 1989]에 개시된 알고리즘에 의해서 핵산에 대한 동일한 종류의 상동성이 얻어질 수 있다. 이 방법들 중 임의의 것이 전형적으로 사용될 수 있으며, 임의의 예에서는 이들 다양한 방법의 결과가 다를 수 있다는 것이 이해되지만, 이들 방법 중 적어도 하나를 사용하여 동일성을 찾은 경우, 그 서열은 언급된 동일성을 가진다고 말할 수 있음을 당해 분야의 숙련자는 이해한다.
예를 들면, 본 발명에 사용된 바와 같은, 다른 서열에 대해 특정한 상동성 퍼센트를 가진다고 말한 서열은 앞서 설명된 계산법 중 어느 하나 이상에 의해 계산된 상동성을 갖는 서열을 지칭한다. 예를 들면, 주커(Zuker) 계산법을 이용하여 제 1 서열이 제 2 서열에 대해 80% 상동성을 가진다고 계산된 경우에, 제 1 서열은 제 2 서열에 대해 본 발명에서 정의된 80% 상동성을 가지며, 이는 심지어 다른 계산법들 중 어느 것에 의해서 계산하였을 때 제 1 서열이 제 2 서열에 대해 80% 상동성을 갖지 않는 경우에도 그러하다. 다른 예로서, 주커 계산법과 피어손(Pearson) 및 리프만(Lipman) 계산법을 모두 이용하여 제 1 서열이 제 2 서열에 대해 80% 상동성을 가진다고 계산된 경우에, 제 1 서열은 제 2 서열에 대해 본 발명에서 정의된 80% 상동성을 가지며, 심지어 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman) 계산법, 니들만(Needleman) 및 운츠(Wunsch) 계산법, 자에거(Jaeger) 계산법, 또는 임의의 다른 계산법에 의해서 계산하였을 때 제 1 서열이 제 2 서열에 대해 80% 상동성을 갖지 않는 경우에도 그러하다. 또 다른 예로서, 각 계산법을 이용하여 제 1 서열이 제 2 서열에 대해 80% 상동성을 가진다고 계산된 경우에, 제 1 서열은 제 2 서열에 대해 본 발명에서 정의된 80% 상동성을 가진다(그렇지만 실제로는 상이한 계산법은 대체로 달리 계산된 상동성 퍼센트를 가져올 것이다).
J. 혼성화 및 선택적 혼성화
용어 혼성화는 전형적으로, 프라이머 또는 프로브와 라이보스위치 또는 유전자와 같은, 적어도 2개 핵산 분자 사이의 서열 유래 상호작용을 의미한다. 서열 유래 상호작용은 2개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 유도체들 사이에서 뉴클레오타이드 특이적 방식으로 일어나는 상호작용을 의미한다. 예를 들면, C와 상호작용하는 G 또는 T와 상호작용하는 A가 서열 유래 상호작용이다. 전형적으로, 서열 유래 상호작용은 뉴클레오타이드의 왓슨-크릭 면 또는 호그스틴 면에서 일어난다. 2개의 핵산의 혼성화는 당해 분야의 숙련자에게 알려진 많은 조건 및 파라미터에 의해 영향을 받는다. 예를 들면, 염 농도, pH 및 반응 온도가 모두 2개의 핵산 분자가 혼성화할 것인지에 영향을 미친다.
2개의 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화에 대한 파라미터는 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 선택적 혼성화 조건은 긴축 혼성화 조건으로서 정의될 수 있다. 예를 들면, 혼성화의 긴축도는 혼성화 단계 및 세척 단계 중 어느 한 단계 또는 2개의 단계 모두에서 온도 및 염 농도 모두에 의해 제어된다. 예를 들면, 선택적 혼성화를 달성하기 위한 혼성화 조건은, Tm(분자의 반이 그들의 혼성화 파트너로부터 해리되는 용융 온도)보다 약 12 내지 25℃ 낮은 온도에서 고 이온 강도 용액(6X SSC 또는 6X SSPE) 중에서의 혼성화 후, 세척 온도가 Tm 보다 약 5℃ 내지 20℃ 낮게 선택된 온도와 염 농도의 조합에서 세척하는 것을 포함한다. 온도 및 염 농도는, 필터 상에 고정된 기준 DNA 샘플을 해당하는 표지된 핵산과 혼성화한 후, 상이한 긴축도의 조건에서 세척하는 예비 실험에서 실험에 의해 쉽게 결정된다. 혼성화 온도는 전형적으로 DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화에서 더 높다. 긴축도는 앞서 설명된 조건을 사용하여 달성할 수도 있고, 또는 본 분야에 공지된 대로 할 수도 있다(샘브룩(Sambrook) 등의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]; 쿤켈(Kunkel) 등의 문헌 [Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987], 이들은 핵산의 혼성화에 적어도 관련된 물질에 대한 참고자료로 본 발명에 포함된다). DNA:DNA 혼성화에 바람직한 긴축 혼성화 조건은 약 68℃에서(수성 용액 중에서) 6X SSC 또는 6X SSPE 중에서 혼성화한 후, 68℃에서 세척하는 것이다. 필요하다면, 혼성화 및 세척 긴축도는 원하는 상보성 정도가 감소함에 따라 감소될 수 있고, 더욱이 변이성이 탐색되는 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 풍부성에 따라 감소될 수도 있다. 유사하게, 바람직한 경우, 혼성화 및 세척 긴축도는 원하는 상동성이 증가함에 따라 증가할 수 있고, 더욱이 높은 상동성이 바람직한 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 풍부성에 따라 증가할 수도 있으며, 이들 모두는 본 분야에 자명한 사항이다.
선택적 혼성화를 정의하는 다른 방식은 다른 핵산에 결합된 핵산들 중 하나의 양(퍼센트)을 고찰하는 것이다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 선택적 혼성화 조건은 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 제한적 핵산이 비-제한적 핵산에 결합되는 경우일 것이다. 전형적으로, 비-제한적 핵산은 예컨대 10배 또는 100배 또는 1000배 과량으로 사용된다. 이 종류의 분석은, 제한적 핵산과 비-제한적 핵산 모두 예컨대 그들의 kd보다 10배 또는 100배 또는 1000배 이하이거나, 또는 핵산 분자 중 오직 하나만이 10배 또는 100배 또는 1000배이거나, 또는 한쪽 핵산 분자나 양쪽 핵산 분자가 모두 그들의 kd 이상인 조건 하에서 수행될 수 있다.
선택적 혼성화를 정의하는 다른 방식은 혼성화가 원하는 효소 조작을 촉진하기 위해서 필요한 조건에서 효소 조작되는 핵산의 퍼센트를 고찰하는 것이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 선택적 혼성화 조건은 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 핵산이 효소 조작을 촉진하는 조건 하에서 효소 조작되는 경우, 예컨대 효소 조작이 DNA 연장부이면, 선택적 혼성화 조건은 적어도 핵산 분자의 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%로 연장되는 경우일 것이다. 또한, 바람직한 조건은 제조자에 의해 제안되거나, 또는 조작이 수행되는 효소에 적합하다고 본 분야에 알려진 것들을 포함한다.
상동성과 같이, 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화 수준을 측정하기 위한 다양한 방법이 본원에 개시된 것을 알 수 있다. 이들 방법 및 조건은 2개의 핵산 분자간 상이한 혼성화 퍼센트를 제공할 수는 있지만, 달리 언급되지 않는다면, 어느 한 방법의 파라미터를 만족하는 것으로 충분할 것이다. 예를 들면, 만일 80% 혼성화가 필요하고, 혼성화가 이들 방법 중 어느 하나에서 필요한 파라미터 범위에서 일어난다면, 이는 본원에 개시된 것으로 고려된다.
조성물 또는 방법이 전체적으로 또는 단독으로 혼성화를 측정하기 위한 기준들 중 어느 하나를 만족한다면, 이는 본원에 개시된 조성물 또는 방법이라는 것을 당해 분야의 숙련자는 이해한다.
K. 핵산
예를 들면, 라이보스위치, 압타머, 및 라이보스위치 및 압타머를 암호화하는 핵산을 포함하는, 본원에 개시된 다양한 분자들은 핵산에 기초한다. 개시된 핵산은 예컨대 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 뉴클레오타이드 치환기로 구성될 수 있다. 이들 및 다른 분자들의 비-제한적 예들이 본원에 개시되고 있다. 예를 들면, 세포에서 벡터가 발현될 때, 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G, 및 U로 구성된다는 점이 이해된다. 유사하게, 핵산 분자가 예컨대 외인성 송달을 통해 세포 또는 세포 환경에 도입된다면, 핵산 분자는 세포 환경에서 핵산 분자의 변성을 감소시키는 뉴클레오타이드 유사체로 구성되는 것이 유리하다는 점이 이해된다.
이들의 관련된 기능이 유지되는 한, 라이보스위치, 압타머, 발현 플랫폼 및 임의의 다른 올리고뉴클레오타이드 및 핵산은 변경된 뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 유사체)로 구성되거나 또는 이를 포함할 수 있다. 많은 변경된 뉴클레오타이드가 공지되어 있으며, 올리고뉴클레오타이드 및 핵산에서 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 염기, 당, 또는 인산염 부분에 대한 임의의 종류의 변경을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 염기 부분에 대한 변경은 A, C, G, 및/또는 T/U 뿐만 아니라 우라실-5-일, 하이포잔틴-9-일(I), 및 아미노아데닌-9-일과 같은 상이한 퓨린 또는 피리미딘 염기의 천연적 및 합성적 변경을 포함할 것이다. 변경된 염기는, 이에 국한되지 않지만, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-싸이오우라실, 2-싸이오 티민 및 2-싸이오시토신, 5-할로 우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-싸이오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-싸이올, 8-싸이오알킬, 8-하이드록시 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 4-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-다이아자구아닌 및 7-다이아자아데닌 및 3-다이아자구아닌 및 3-다이아자아데닌을 포함한다. 추가 염기 변경은 예컨대 미국 특허 제3,687,808호, 잉글리츠(Englisch) 등의 문헌 [Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613], 및 상그비(Sanghvi, Y. S.)의 문헌 [Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302], 크루케(Crooke, S. T.) 및 레블로(Lebleu, B.)의 문헌 [ed, CRC Press, 1993]에서 찾을 수 있다. 특정 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린은 듀플렉스(duplex) 형성의 안정성을 증가시킬 수 있다. 다른 변경된 염기는 보편적인 염기로서 기능하는 것들이다. 보편적 염기는 3-나이트로피롤 및 5-나이트로인돌을 포함한다. 보편적 염기는 정상 염기 대신 치환될 수 있지만 염기쌍화의 경향은 갖지 않는다. 즉, 보편적 염기는 임의의 다른 염기와 염기쌍을 이룰 수 있다. 염기 변경은 대체로 예컨대 2'-O-메톡시에틸과 같은 당 변경과 조합될 수 있으며, 이로 인해 증가된 듀플렉스 안정성과 같은 독특한 특성을 달성한다. 많은 미국 특허 예컨대 미국 특허 제4,845,205호, 제5,130,302호, 제5,134,066호, 제5,175,273호, 제5,367,066호, 제5,432,272호, 제 5,457,187호, 제5,459,255호, 제5,484,908호, 제5,502,177호, 제5,525,711호, 제5,552,540호, 제5,587,469호, 제5,594,121호, 제5,596,091호, 제5,614,617호 및 제5,681,941호에 염기 변경의 범위가 상세히 설명된다. 이들 특허는 각각 그 전문이 본 발명에 참고자료로 포함되며, 구체적으로 염기 변경, 그 합성, 그 사용, 및 올리고뉴클레오타이드 및 핵산과의 통합에 대해서 참고된다.
또한, 뉴클레오타이드 유사체는 당 부분의 변경을 포함할 수 있다. 당 부분에 대한 변경은 라이보스 및 다이옥시라이보스의 천연적인 변경뿐만 아니라 합성적인 변경을 포함할 것이다. 당 변경은, 이에 국한되지 않지만, 2' 위치에서의 다음의 변경을 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알켄일; O-, S-또는 N-알킨일; 또는 O-알킬-0-알킬, 이때 알킬, 알켄일 및 알킨일은 치환 또는 비치환 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알켄일 및 알킨일일 수 있다. 또한, 2' 당 변경은, 이에 국한되지 않지만, -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)n-CH3, -O(CH2)nONH2 및 -O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하며, 이때 n 및 m은 1 내지 약 10이다.
2' 위치에서의 다른 변경은, 이에 국한되는 것은 아니지만, C1 내지 C1O 저급 알킬, 치환 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터 칼레이터, 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 개선하는 기, 또는 올리고뉴클레오타이드의 약역학적 특성을 개선하는 기, 및 유사한 특성들을 갖는 다른 치환기들을 포함한다. 또한, 당의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 또는 2'-5' 연결 올리고뉴클레오타이드 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 유사한 변경이 만들어질 수 있다. 또한, 변경된 당은 CH2 및 S와 같은 다리 고리 산소에서의 변경을 함유하는 것들을 포함할 것이다. 뉴클레오타이드 당 유사체는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로뷰틸 부분과 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 많은 미국 특허 예컨대 미국 특허 제4,981,957호, 제5,118,800호, 제5,319,080호, 제5,359,044호, 제5,393,878호, 제5,446,137호, 제5,466,786호, 제5,514,785호, 제5,519,134호, 제5,567,811호, 제5,576,427호, 제5,591,722호, 제5,597,909호, 제5,610,300호, 제5,627,053호, 제5,639,873호, 제5,646,265호, 제5,658,873호, 제5,670,633호 및 제5,700,920호에 이러한 변경된 당 구조의 제조가 교시되어 있으며, 이들 특허는 그 전문이 본 발명에 참고자료로 포함되며, 구체적으로 변경된 당 구조, 그 합성, 그 사용, 및 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 핵산과의 통합에 대한 설명이 참고된다.
또한, 뉴클레오타이드 유사체는 인산염 부분에서 변경될 수 있다. 변경된 인산염 부분은, 이에 국한되지 않지만, 2개의 뉴클레오타이드 사이의 결합이 포스포로싸이오에이트, 키랄 포스포로싸이오에이트, 포스포로디싸이오에이트, 포스포트리 에스터, 아미노알킬포스포트리에스터, 3'-알킬렌 포스폰에이트 및 키랄 포스폰에이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스폰에이트, 포스핀에이트, 3'-아미노포스 포라미데이트및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 싸이오노포스포라미데이트, 싸이오노알킬포스폰에이트, 싸이오노알킬포스포트리에스터, 및 보라 노포스페이트를 함유하도록 변경될 수 있는 것들을 포함한다. 2개의 뉴클레오타이드 사이의 이들 인산염 또는 변경된 인산염 결합이 3'-5' 결합 또는 2'-5' 결합을 통해서 있을 수 있으며, 이 결합은 3'-5'에서 5'-3'으로 또는 2'5'에서 5'-2'로와 같이, 반전된 극성을 함유할 수 있다는 것이 이해된다. 다양한 염, 혼합 염 및 자유 산 형태가 또한 포함될 수 있다. 다수의 미국 특허에는 변경된 인산염을 함유하는 뉴클레오타이드를 어떻게 만들고 사용하는 지가 교시되어 있으며, 상기 미국 특허는 미국 특허 제3,687,808호, 제4,469,863호, 제4,476,301호, 제5,023,243호, 제5,177,196호, 제5,188,897호, 제5,264,423호, 제5,276,019호, 제5,278,302호, 제5,286,717호, 제5,321,131호, 제5,399,676호, 제5,405,939호, 제5,453,496호, 제5,455,233호, 제5,466,677호, 제5,476,925호, 제5,519,126호, 제5,536,821호, 제5,541,306호, 제5,550,111호, 제5,563,253호, 제5,571,799호, 제5,587,361호 및 제5,625,050호를 포함하나 이들로 국한되지 않으며, 이들 특허는 각각 그 전문이 본 발명에 도입되고, 구체적으로 변경된 인산염, 그 합성, 그 사용, 및 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 핵산과의 통합에 대한 설명을 제공한다.
뉴클레오타이드 유사체는 단일 변경을 반드시 함유할 필요가 있지만, 또한 유사체 중 하나에 또는 다른 유사체들 사이에 다수의 변경을 함유할 수도 있는 것으로 이해된다.
뉴클레오타이드 치환기는 뉴클레오타이드와 유사한 기능적 특성을 갖지만, 펩타이드 핵산(PNA)과 같은 인산염 부분은 함유하지 않는 분자이다. 뉴클레오타이드 치환기는 왓슨 -크릭 또는 호그스틴 방식으로 상보성 핵산을 인식하여 이와 혼성화되며(에 대한 염기쌍), 인산염 부분 이외의 다른 부분을 통해서 함께 연결되는 분자이다. 뉴클레오타이드 치환기는 적합한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중나선 유형 구조와 합치될 수 있다.
뉴클레오타이드 치환기는 인산염 부분 및/또는 당 부분이 치환된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체이다. 뉴클레오타이드 치환기는 표준 인 원자를 함유하지 않는다. 인산염을 대신하는 치환기는 예컨대 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 사이의 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 사이의 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로고리 뉴클레오사이드 사이의 결합일 수 있다. 이들은 모폴리노 결합(뉴클레오사이드의 당 부분으로 일부 형성된); 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 폼아세틸 및 싸이오폼아세틸 골격; 메틸렌 폼아세틸 및 싸이오폼아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설팜에이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격; 아마이드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타 여러 가지를 갖는 것들을 포함한다. 많은 미국 특허가 이들 종류의 인산염 치환을 어떻게 만들고 이용하는가에 대해 개시하고 있으며, 상기 미국 특허는 미국 특허 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,185,444호, 제5,214,134호, 제5,216,141호, 제5,235,033호, 제5,264,562호, 제5,264,564호, 제5,405,938호, 제5,434,257 호, 제5,466,677호, 제5,470,967호, 제5,489,677호, 제5,541,307호, 제5,561,225호, 제5,596,086호, 제5,602,240호, 제5,610,289호, 제5,602,240호, 제5,608,046호, 제5,610,289호, 제5,618,704호, 제5,623,070호, 제5,663,312호, 제5,633,360호, 제5,677,437호 및 제5,677,439호를 포함하나 이들로 국한되지 않고, 이들 특허는 각각 그 전문이 본 발명에 참고로 도입되며, 구체적으로 인산염 치환기, 그 합성, 그 사용, 및 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 핵산과의 통합에 대한 설명을 제공한다.
또한, 뉴클레오타이드 치환기에서 예컨대 아마이드 유형 결합(아미노에틸글리신)에 의해 뉴클레오타이드의 당 부분과 인산염 부분이 모두 치환될 수 있다는 것이 이해된다(PNA). 미국 특허 제5,539,082호, 제5,714,331호 및 제5,719,262호가 PNA 분자를 어떻게 만들고 이용하는가에 대해 교시하고 있으며, 이들 특허는 각각 본 발명에 참고자료로 포함된다(또한, 닐센(Nielsen) 등의 문헌 [Science 254:1497-1500(1991)] 참조).
올리고뉴클레오타이드 및 핵산은 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있고, 상이한 종류의 뉴클레오타이드 또는 같은 종류의 뉴클레오타이드들로 구성될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드에 있는 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 리보뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드의 혼합물일 수 있고; 뉴클레오타이드의 약 10% 내지 약 50%가 리보뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드의 혼합물 일 수 있고; 뉴클레오타이드 중 약 50% 이 상이 리보뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드의 혼합물 일 수 있고; 또는 뉴클레오타이드가 전부 리보뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드의 혼합물 일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 및 핵산은 키메라 올리고뉴클레오타이드 및 키메라 핵산이라고 언급될 수 있다.
L. 고체 지지체
고체 지지체는 분자(트리거 분자와 같은) 및 리보 스위치(또는 개시된 방법에서 사용되거나 또는 개시된 방법에 의해 생성된 다른 성분들)가 결합될 수 있는 고체-상태 기질 또는 지지체이다. 라이보스위치 및 다른 분자들은 고체 지지체에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들면, 분석물질(예컨대, 트리거 분자, 시험 화합물)이 고체 지지체 표면에 결합되거나, 또는 고체 지지체 상에 고정된 포착제(예컨대, 분석물질과 결합하는 화합물 또는 분자)를 이용하여 결합될 수 있다. 다른 예로서, 라이보스위치는 고체 지지체 표면에 결합되거나, 또는 고체 지지체 상에 고정된 프로브를 이용하여 결합될 수 있다. 어레이는 다수의 라이보스위치, 프로브 또는 다른 분자들이 일렬로, 격자모양으로, 또는 다른 구조적인 패턴으로 결합된 고체 지지체이다.
고체 지지체에 사용되는 고체-상태 기질은 성분들이 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있는 임의의 고체 물질를 포함할 수 있다. 이는 아크릴아마이드, 아가로스, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 유리, 금, 폴리스타이렌, 폴리에틸렌 옥사이 드, 폴리실리케이트, 폴리카보네이트, 테플론, 플루오로카본, 나일론, 실리콘 러버, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리오르토에스터, 작용기화된 실레인, 폴리프로필푸메레이트, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 및 폴리아미노산과 같은 물질들을 포함한다. 고체-상태 기질은 박막, 막, 병, 접시, 섬유, 직포, 성형 폴리머, 입자, 비드, 미세입자 또는 조합을 포함하는 임의의 유용한 형태를 가질 수 있다. 고체-상태 기질 또는 고체 지지체는 다공성이거나 비-다공성일 수 있다. 칩은 물질의 직사각형 또는 정사각형의 작은 조각이다. 고체-상태 기질의 바람직한 형태는 박막, 비드 또는 칩이다. 고체-상태 기판의 유용한 형태는 마이크로리터 접시이다. 일부 실시양태에서는 멀티-웰 유리 슬라이드가 사용될 수 있다.
어레이는 고체 지지체 상의 확인된 또는 정해진 위치에 고정된 다수의 라이보스위치, 트리거 분자, 다른 분자, 화합물 또는 프로브를 포함할 수 있다. 고체 지지체 상의 각각의 정해진 위치는 일반적으로 한 종류의 성분만을 가질 것이다(즉, 그 위치에 있는 모든 성분은 같은 것이다). 다르게는, 여러 종류의 성분이 고체 지지체 상의 같은 정해진 위치에 고정될 수도 있다. 각 위치는 소정의 성분의 다수의 카피를 가질 것이다. 고체 지지체 상에서 상이한 성분들의 공간적 분리는 분리된 검출 및 확인을 가능하게 한다.
고체 지지체가 유용하나 반드시 단일 유닛 또는 구조일 필요는 없다. 한 세트의 라이보스위치, 트리거 분자, 다른 분자, 화합물 및/또는 프로브가 임의의 수의 고체 지지체에 걸쳐 분포될 수 있다. 예를 들면, 한 극도의 상황에서, 각 성분은 분리된 반응관 또는 반응용기 내에 고정되거나, 또는 분리된 비드 또는 미세입 자 상에 고정될 수 있다.
고체-상태 기질에 올리고뉴클레오타이드를 고정하는 방법은 잘 확립되어 있다. 어드레스 프로브 및 검출 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 확립된 커플링 방법을 이용하여 기질에 커플링될 수 있다. 예를 들면, 적합한 부착법이 페아세(Pease) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sd. USA 91(11):5022-5026(1994)], 및 크라프코(Khrapko) 등의 문헌 [Mol. Biol. (Mosk)(USSR) 25:718-730(1991)]에 설명된다. 카세인-코팅 슬라이드 상에 3'-아민 올리고뉴클레오티를 고정하는 방법은 스팀프손(Stimpson) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Scl. USA 92:6379-6383(1995)]에 설명된다. 고체-상태 기질에 올리고뉴클레오타이드를 부착하는 유용한 방법은 구오(Guo) 등의 문헌 [Nucleic Acids Res. 22:5456-5465(1994)]에 설명된다.
고체 지지체 상에 고정된 각 성분(예컨대, 라이보스위치, 트리거 분자 또는 다른 분자들)은 고체 지지체의 서로 다른 정해진 영역에 위치될 수 있다. 상이한 위치는 상이한 반응 챔버일 수 있다. 서로 다른 정해진 영역 각각은 서로 물리적으로 분리될 수 있다. 고체 지지체의 상이한 정해진 영역들 사이의 거리는 고정될 수도 있고 가변적일 수도 있다. 예를 들면, 어레이에서, 각 성분은 서로 고정된 거리만큼 떨어져 배열될 수 있는 반면, 비드와 결합된 성분은 고정된 공간적 관계에 놓이지 않을 것이다. 특히, 다수 고체 지지체 유닛(예컨대, 다수의 비드)의 사용은 거리의 변화를 초래할 것이다.
성분들은 임의의 밀도로 고체 지지체 상에 결합되거나 또는 고정될 수 있다. 성분들은 세제곱 센티미터 당 400개의 상이한 성분을 초과하는 밀도로 고체 지지체에 고정될 수 있다. 성분의 어레이는 임의의 수의 성분들을 가질 수 있다. 예를 들면, 어레이는 고체 지지체 상에 고정된 1,000개 이상의 상이한 성분, 고체 지지체 상에 고정된 10,000개 이상의 상이한 성분, 고체 지지체 상에 고정된 100,000개 이상의 상이한 성분, 또는 고체 지지체 상에 고정된 1,000,000개 이상의 상이한 성분을 가질 수 있다.
M. 키트
앞서 설명된 물질뿐만 아니라 다른 물질들은 개시된 방법을 수행하거나 또는 개시된 방법의 수행을 보조하는데 유용한 키트로서 임의의 적합한 조합으로 함께 패키지될 수 있다. 소정의 키트 내의 키트 성분들이 개시된 방법과 함께 사용하는데 적합하게 디자인되고 개조된다면 유용하다. 예를 들면, 화합물을 검출하기 위한 키트가 개시되는데, 이 키트는 하나 이상의 바이오센서 라이보스위치를 포함한다. 또한, 이 키트는 라이보스위치의 활성화를 검출하기 위한 시약 및 표지를 함유할 수도 있다.
N. 혼합물
앞서 개시된 방법을 수행하거나, 또는 앞서 개시된 방법을 수행하도록 준비하는데 있어서 형성된 혼합물이 개시되고 있다. 예를 들면, 라이보스위치와 트리거 분자를 포함하는 혼합물이 개시되고 있다.
본 방법이 조성물 또는 성분 또는 시약들을 혼합하거나 이들과 접촉하는 것을 포함할 때는 언제나 본 방법을 수행함으로써 여러 개의 상이한 혼합물이 만들어 진다. 예를 들면, 본 방법이 3개의 혼합 단계를 포함한다면, 그 단계들이 개별적으로 수행된다면, 각 단계 후에는 유일하게 존재하는 혼합물이 형성된다. 게다가, 임의의 단계가 수행되었는 지에 관계없이 모든 단계의 완료시에도 혼합물이 형성된다. 본 명세서는 앞서 개시된 방법의 수행에 의해 얻어진 혼합물들뿐만 아니라 예컨대 본 발명에 개시된, 임의의 개시된 시약, 조성물 또는 성분을 함유하는 혼합물도 고려한다.
O. 시스템
앞서 개시된 방법을 수행하거나, 또는 그 수행을 보조하는데 유용한 시스템이 개시되고 있다. 시스템은 일반적으로 구조, 기계, 장치 등의 제조 품목과 조성물, 화합물, 물질 등의 조합을 포함한다. 본 명세서에서 개시되거나 또는 이로부터 명백한 이러한 조합이 고려된다. 예를 들면, 바이오센서 라이보스위치, 고체 지지체 및 신호-판독 장치를 포함하는 시스템이 개시되고 고려된다.
P. 데이터 구조 및 컴퓨터 제어
앞서 개시된 방법에서 사용되거나, 이에 의해 발생되거나, 또는 이로부터 발생된 데이터 구조가 개시되고 있다. 데이터 구조는 일반적으로 조성물 또는 배지에서 수집, 조직화, 저장 및/또는 구체화된 임의의 형태의 데이터, 정보 및/또는 객체이다. RAM 또는 저장 디스크와 같은 전자 형태로 저장된 라이보스위치 구조 및 활성화 측정치가 데이터 구조의 한 종류이다.
앞서 개시된 방법, 또는 이의 임의의 부분, 또는 준비는 컴퓨터 제어에 의해서 제어, 관리 또는 보조될 수 있다. 이러한 컴퓨터 제어는 컴퓨터 제어 과정 또 는 방법에 의해 달성될 수 있고, 데이터 구조를 이용 및/또는 발생시킬 수 있고, 그리고 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 컴퓨터 제어, 컴퓨터 제어 과정, 데이터 구조, 및 컴퓨터 프로그램이 고찰되며, 본 발명에 개시된 것으로 이해되어야 한다.
방법
라이보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단 방법이 개시되고 있다. 이 방법은 예컨대 라이보스위치와 라이보스위치를 활성화할 수 있거나, 불활성화할 수 있거나, 또는 차단할 수 있는 화합물 또는 트리거 분자를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 라이보스위치는 트리거 분자의 결합이나 제거를 통해서 유전자 발현을 제어하는 기능을 한다. 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물이 사용될 수 있다. 라이보스위치 트리거 분자(뿐만 아니라 다른 활성화 화합물들)를 사용해서는 라이보스위치를 활성화할 수 있다. 트리거 분자 이외의 다른 화합물들을 사용해서는 일반적으로 라이보스위치를 불활성화할 수 있거나 차단할 수 있다. 또한, 라이보스위치는 예컨대 라이보스위치에 존재하는 트리거 분자를 제거함으로써 불활성화될 수 있다. 따라서, 개시된 라이보스위치 불활성화 방법은 예컨대 라이보스위치에 존재하거나 또는 라이보스위치와 접촉하고 있는 트리거 분자(또는 다른 활성화 화합물)을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 라이보스위치는 예컨대 라이보스위치를 활성화하지 않는 트리거 분자 유사체의 결합에 의해서 차단될 수 있다.
또한, 화합물과 RNA 분자를 접촉시킴으로써 RNA 분자, 또는 RNA 분자 암호화 유전자의 발현을 변경하는 방법이 개시되며, 이때 RNA 분자는 라이보스위치를 포함한다. 라이보스위치는 트리거 분자의 결합이나 제거를 통해서 유전자 발현을 제어하는 기능을 한다. 따라서, 라이보스위치를 포함하는 해당 RNA 분자를 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 조건에 놓으면 RNA 발현이 변경될 수 있다. 예를 들면, 전사 종결, 또는 RNA와 리보솜 결합의 차단의 결과로서 발현이 변경될 수 있다. 라이보스위치의 성질에 따라서, 트리거 분자의 결합은 RNA 분자의 발현을 감소 또는 방지하거나, 또는 RNA 분자의 발현을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.
또한, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단함으로써 라이보스위치를 함유하는 천연 발생 유전자나 RNA의 발현을 조절하는 방법이 개시되고 있다. 만일 그 유전자가 이를 은닉하는 세포나 유기체의 생존에 필수적이라면, 라이보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단은 세포 또는 유기체의 사망, 정지 또는 약화를 초래할 수 있다. 예를 들면, 미생물의 생존에 필수적인 천연 발생 유전자에 있는 천연 발생 라이보스위치를 활성화하면 미생물의 사망을 초래할 수 있다(라이보스위치의 활성화가 발현을 멈추거나 억제하는 경우). 이것이 개시된 화합물 및 방법을 항미생물 및 항생제 효과를 위해 사용하는 것의 한 근거이다. 이들 항미생물 효과를 갖는 화합물은 정균 또는 살균이 있는 것으로 간주된다.
또한, 라이보스위치를 활성화할 수 있거나, 불활성화할 수 있거나, 또는 차단할 수 있는 화합물을 선택 및 확인하는 방법이 개시되고 있다. 라이보스위치의 활성화는 트리거 분자의 결합에 의한 라이보스위치 상태의 변화를 지칭한다. 라이 보스위치는 트리거 분자 이외의 다른 화합물에 의해 그리고 트리거 분자를 결합시키는 것 이외의 다른 방식으로 활성화될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 트리거 분자는 라이보스위치를 활성화할 수 있는 분자 및 화합물을 지칭한다. 이는 라이보스위치의 천연 또는 정상 트리거 분자 및 라이보스위치를 활성화할 수 있는 다른 화합물들을 포함한다. 천연 또는 정상 트리거 분자는 천연 상태에서 소정의 라이보스위치에 대한 트리거 분자이거나, 또는 임의의 비-천연 라이보스위치의 경우에는, 라이보스위치가 디자인된 트리거 분자, 또는 라이보스위치가 선택된 트리거 분자이다(예컨대, 시험관 내 선택이나 시험관 내 진화 기술에서와 같이). 비-천연 트리거 분자는 비-천연 트리거 분자로서 언급될 수 있다.
또한, 시험 화합물로 라이보스위치 원자 구조를 모델링하는 단계; 및 시험 화합물과 라이보스위치의 상호작용 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 라이보스위치와 상호작용하는 화합물의 확인 방법이 개시되고 있다. 시험 화합물과 라이보스위치의 상호작용 여부의 확인은 예컨대 라이보스위치 모델 내의 시험 화합물에 대한, 예상된 최소 상호작용 에너지, 예상된 결합 상수, 예상된 해리 상수 또는 이들의 조합을 측정함으로써 달성될 수 있으며, 이는 본 발명의 다른 곳에서도 설명된다. 시험 화합물과 라이보스위치의 상호작용 여부의 확인은 예컨대 라이보스위치 모델로 시험 화합물의 하나 이상의 예상된 결합, 하나 이상의 예상된 상호작용 또는 이들의 조합을 측정함으로써 달성될 수 있다. 예상된 상호작용은 예컨대 앞서 설명된 반데르발스 상호작용, 수소 결합, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 한 예에서 라이보스위치는 구 아닌 라이보스위치이다.
원자적 접촉은 라이보스위치와의 상호작용을 측정한 경우 측정될 수 있으며, 이로 인해 시험 화합물과 라이보스위치의 상호작용이 측정된다. 시험 화합물의 유사체가 확인될 수 있으며, 이는 시험 화합물의 유사체가 라이보스위치와 상호작용하는 경우에 측정될 수 있다.
또한, 박테리아를 본원에 개시된 화합물 또는 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 박테리아를 사멸시키고 박테리아의 생장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 라이보스위치를 활성화하는 화합물은 시험 화합물과 라이보스위치를 접촉시키고, 라이보스위치의 활성을 평가함으로써 확인될 수 있다. 만일 라이보스위치가 활성화된다면, 시험 화합물은 라이보스위치를 활성화하는 화합물로서 확인된다. 라이보스위치의 활성화는 임의의 적합한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 라이보스위치가 리포터 RNA에 연결될 수 있고, 시험 화합물의 존재 하에 리포터 RNA의 발현, 발현 수준, 또는 발현 수준의 변화가 측정될 수 있다. 다른 예로서, 라이보스위치는 라이보스위치의 활성화 상태에 따라서 신호가 변하는 입체구조 의존성 표지를 포함할 수 있다. 이러한 라이보스위치는 바람직하게는 천연 발생 라이보스위치로부터의 또는 이로부터 유래된 압타머 도메인을 이용한다. 볼 수 있는 바와 같이, 라이보스위치 활성화의 평가는 대조군 분석이나 측정을 이용하거나, 또는 대조군 분석이나 측정을 이용하지 않고 도 수행될 수 있다. 라이보스위치를 불활성화하는 화합물을 확인하는 방법도 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
본원에 개시된 방법과 더불어, 라이보스위치를 차단하는 화합물의 확인이 임의의 적합한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 라이보스위치를 활성화 또는 불활성화한다고 알려진 화합물의 존재 하에 그리고 시험 화합물의 존재 하에 라이보스위치의 활성화 또는 불활성화를 평가하는 분석이 수행될 수 있다. 만일 시험 화합물의 부재 하에 관찰된 것과 같은 활성화 또는 불활성화가 관찰되지 않는다면, 이 시험 화합물은 라이보스위치의 활성화 또는 불활성화를 차단하는 화합물로서 확인된다.
또한, 바이오센서 라이보스위치를 이용하여 화합물을 검출하는 방법이 개시되고 있다. 이 방법은 시험 화합물과 바이오센서 라이보스위치를 접촉시키는 단계, 및 바이오센서 라이보스위치의 활성화를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 바이오센서 라이보스위치의 활성화는 시험 샘플에 바이오센서 라이보스위치의 트리거 분자가 존재함을 나타낸다. 바이오센서 라이보스위치는 이의 동족 트리거 분자의 존재 하에 검출 가능한 신호를 생성하도록 유전자 조작된 라이보스위치이다. 유용한 바이오센서 라이보스위치는 트리거 분자의 역치 수준에서 또는 그 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 라이보스위치는 생체 내 또는 시험관 내 사용에 적합하게 디자인될 수 있다. 예를 들면, 신호로서 사용되거나 또는 신호를 생성하는데 연루되는 단백질을 암호화하는 리포터 RNA에 작동 가능하게 연결된 바이오센서 라이보스위치가 이 라이보스위치/리포터 RNA를 암호화하는 핵산 구축물을 은닉하는 세포나 유기체를 유전자 조작함으로써 생체 내에서 사용될 수 있다. 시험관 내에서 사용되는 바이오센서 라이보스위치의 예는 라이보스위치의 활성화 상태에 따라 신호가 변하는 입체구조 의존성 표지를 포함하는 glmS 라이보스위치이다. 이러한 바이오센서 라이보스위치는 바람직하게는 천연 발생 glmS 라이보스위치로부터의 또는 이로부터 유래된 압타머 도메인을 이용한다.
또한, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물을 확인하고, 확인된 화합물을 제조함에 의해 제조된 화합물이 개시되고 있다. 이는 예컨대 본원에 개시된 화합물 확인 방법과 확인된 화합물의 제조 방법을 조합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물과 라이보스위치를 접촉시키는 단계, 라이보스위치의 활성화를 평가하는 단계, 및 라이보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된 경우, 라이보스위치를 활성화하는 시험 화합물을 화합물로서 제조하는 단계에 의해서 화합물이 제조될 수 있다.
또한, 화합물에 의한 라이보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단을 조사하고, 조사된 화합물을 제조함에 의해서 제조된 화합물이 개시되고 있다. 이는 예컨대 본원에 개시된 화합물의 활성화, 불활성화 또는 차단 평가 방법과 조사된 화합물의 제조 방법을 조합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물과 라이보스위치를 접촉시키는 단계, 라이보스위치의 활성화를 평가하는 단계, 및 라이보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된 경우, 라이보스위치를 활성화하는 시험 화합물을 화합물로서 제조하는 단계에 의해서 화합물이 제조될 수 있다. 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 능력에 대해 화합물을 조사하 는 것은, 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단한다는 것이, 종래에는 알려지지 않았던 화합물을 확인하고, 그 화합물이 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단한다고 이미 알려진 경우에는 라이보스위치를 활성화하거나, 불활성화하거나, 또는 차단하는 화합물의 능력을 평가하는 것 모두를 지칭한다.
샘플과 glmS 라이보스위치를 접촉시키는 것을 포함하는 해당 화합물을 검출하는 방법이 개시되며, 이때 라이보스위치는 해당 화합물에 의해 활성화되고, 해당 화합물에 의해 활성화되었을 때 라이보스위치는 신호를 생성하고, 샘플이 해당 화합물을 함유할 때 라이보스위치는 신호를 생성한다. 해당 화합물에 의해 활성화되었을 때 라이보스위치의 입체구조가 변할 수 있고, 이때 입체구조의 변화가 입체구조 의존성 표지에 의한 신호를 생성한다. 해당 화합물에 의해 활성화되었을 때 라이보스위치의 입체구조가 변할 수 있고, 이때 입체구조의 변화는 라이보스위치에 연결된 RNA의 발현에 변화를 일으키고, 발현에서의 변화는 신호를 생성한다. 신호는 라이보스위치에 연결된 RNA로부터 발현된 리포터 단백질에 의해 신호생성될 수 있다.
본원은, (a) 라이보스위치 포함 RNA를 암호화하는 유전자의 라이보스위치에 의한 억제에 대해 화합물을 시험하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 유전자 발현을 억제하는 화합물과 라이보스위치 포함 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 유전자 발현을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 화합물은 라이보스위치와 결합함으로써 유전자의 발현을 억제하는, 방법을 제공한 다.
A. 항미생물 화합물의 확인
라이보스위치는 작은 유기 분자와 결합시키려는 목적으로 고안된 신규 부류의 구조적 RNA이다. 라이보스위치의 천연 결합 포켓은 대사산물 유사체로, 또는 천연 대사산물의 모양-공간을 모방하는 화합물에 의해 표적화될 수 있다. 라이보스위치의 소분자 리간드는 약물 후보를 만들기 위한 유용한 유도체화 부위를 제공한다. 임의의 라이보스위치들의 분포가 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 표 1에 도시된다. 일단 라이보스위치의 부류(예컨대, glmS 라이보스위치)가 확인되고, 이의 약물 표적으로서의 가능성이 평가되었다면, 후보 분자가 확인될 수 있다.
박테리아의 약물-내성 균주의 출현은 새로운 부류의 항생제의 확인에 대한 필요를 강조한다. 항-라이보스위치 약물은 항미생물 작용의 양태를 나타내는데, 이는 다음과 같은 이유로 인해 상당한 관심을 끌고 있다. 보스위치는 기본적 대사 과정에서 중요한 유전자들의 발현을 제어한다. 따라서, 이들 유전자 제어 요소의 조작은 새로운 항생제를 제공한다. 또한, 라이보스위치는 대사산물과 선택적으로 결합하도록 고안된 RNA 구조를 지니므로, 이들 RNA 수용체는 단백질 효소와 수용체와 유사하게 우수한 약물 표적이 된다. 더욱이, 2개의 항미생물 화합물(앞서 논의된)은 RNA 표적의 돌연변이를 통해서 출현하는 항생물질 내성을 불활성화함으로써 박테리아를 죽이는 것으로 밝혀졌다.
본원에 개시된 바와 같이, glmS 라이보스위치에 대한 원자-분해 구조가 밝혀 졌는데(문헌 [Cochrane 2007], 이는 glmS 리보자임 구조와 관련된 이의 교시내용을 위해 본원에 참고로 인용하고 있다), 이로 인해 라이보스위치-결합 화합물을 만들기 위한 구조에 기초한 디자인 방법의 사용이 가능해 졌다. 구체적으로, glmS 라이보스위치의 결합 부위 모델은 리간드 변경을 허용하는 2개의 채널이 존재하는 것으로 나타난다(도 2). GlcN6P 유사체가 본원에 개시된 특정 위치에서의 화학적 변경에 의해 발생되었으며, 지금까지 시험된 거의 모는 것이 나노몰랄 이하의 해리 상수로 라이보스위치와 결합한다. 도 2는 변경된 화학 구조로 합성된 GlcN6P 유사체의 구조를 묘사한다. 이들 화합물의 대부분은 결합 부위 모델의 분자 인식 "블라인드 스팟(blind spot)"이거나, 또는 압타머 도메인은 glmS 라이보스위치를 형성한다. 성공적인 화합물을 스캐폴드(scaffold)로서 사용할 수 있으며, 이때 더 이상의 화학적 변이를 도입하여서, 비-독성, 생체이용성, 고 친화성, 항-라이보스위치 화합물을 만들어 낼 수 있다.
실시예 1에서 알 수 있는 바와 같이, glmS 리보자임의 분자 인지 특성은, 바실루스 세레우스로부터의 200-뉴클레오타이드 glmS 리보자임 구축물의 자가-절단 활성에 대한 GlcN6P 및 다양한 GlcN6P 유사체의 효과를 측정함으로써 밝혀졌다(도 1). 각 리간드에 대한 KD 값은 리간드 농도에 대한 리보자임 속도 상수를 플로팅함으로써 측정하였다. 유사 방법들을 사용하는 종래 연구들에서는, GlcN6P의 포스페이트 부분(도 1b; 1a)가 리간드와 glmS 리보자임 사이의 최대 친화성에 요구되는 것으로 드러났다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]). 또한, 리간드의 아민 기는 리보자임 기능에 필수적인 것으로 알려져 있다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]). 그러나, 선형 아민-함유 화합물은 가장 온화한 리보자임 활성을 유도할 수 있으며(문헌 [McCarthy 2005]), 이는 GlcN6P의 비사이클릭(도 1b) 또는 대안적 아노머 형태(도 1c)가 활성적일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 일련의 유사체는 GlcN6P의 구조적 변경 및 피라노스 고리 상의 개별 작용기의 중요성을 탐침하기 위해 시험되었다(도 2).
생리학적 조건 하에서, GlcN6P는 비사이클릭 형태(도 1b)와 2개의 사이클릭 β-(도 1a) 및 α-아노머(도 1c) 형태(도 1b) 사이를 평형시킨다(문헌 [Schray 1978]). 1a와 1b 사이의 상대적인 양은 D2O 중의 1H NMR에 의해 25℃에서 측정할 때 60:40이고, 이때 비사이클릭 형태에서 1% 미만이다(문헌 [Schray 1978]). 각각의 콘포머(conformer)는 GlmS 단백질에 대해 관찰된 것과 유사한 리보자임 활성 및 RNA 결합 친화성에서의 차이를 나타낸다(문헌 [Teplyakov 1998]).
다른 라이보스위치 부류의 분자 인지 특성의 종래 연구에서는, 고도의 분자 식별이 천연 리간드-결합 RNA에 의해 달성될 수 있는 것으로 드러났다(문헌 [Lim 2006]). 정상적 세포 기능을 붕괴시킬 수 있는 병원균 내의 GlmS 대사 효소의 발현을 붕괴시키기 위해서, glmS 리보자임 절단을 효과적이고 선택적으로 개시하는 유사체가 사용될 수 있다.
소정의 화합물의 활성을 평가하기 위해, 표준물로서 다음의 예가 사용될 수 있다. glmS 요소의 천연 서열이 단분자 시스-절단 리보자임을 형성할 지라도, 활 성 glmS 리보자임은 또한 생체분자 시스-작용 리보자임으로서 구성될 수 있다. 이 포맷에서, 기질로서 지칭되는 절단된 가닥은 쌍 요소 1(P1)의 1/2 및 보존된 뉴클레오타이드 업스트림 P1을 형성하는 5' 염기쌍을 포함한다. 비-절단된 리보자임 가닥은 P1의 3' 1/2 및 glmS 요소의 잔존 서열을 포함한다. 이 생체분자 포맷을 사용하면, 16-뉴클레오타이드 기질 가닥은 3' 및 5' 말단에서 각각 형광 프로브 플루오레세인(F1) 및 cy3으로 표지되었다. 비절단된 기질 RNA에서, 여기 상태의 플루오레세인의 방출은 cy3 켄처(quencher)의 향상된 근접(proximity)에 의해 켄칭된다. Gln6P 시스템의 존재 하의 절단에 따라, glmS 라이보스위치에 대한 Gln6P(또는 관련 유도체)의 결합은 표준 고출력 기술을 사용하여 신속하게 스크리닝될 수 있다.
최소 10시간 동안 항온처리한 후, 플루오레세인의 형광 세기는 약 160μM 글루코사민-6-포스페이트의 존재 하에서 약 4배 증가한 반면, Gln6P의 부재 하에서 관찰 가능한 변화가 검출되지 않았다. 예를 들면, 화합물은, 라이보스위치를 활성시키는 것으로 확인될 수 있거나, 또는 라이보스위치 분석에서의 신호가, 화합물의 부재 하에서의 동일한 라이보스위치 분석과 비교할 때, 화합물의 존재 하에서 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500%까지 증가된다면, 라이보스위치 활성을 갖는 것으로 확인될 수 있다(즉, 대조 분석과 비교됨). 라이보스위치 분석은 임의의 적합한 라이보스위치 구축물을 사용하여 실시될 수 있다. 라이보스위치 활성화 분석에 특히 유용한 라이보스위치 구축물은 본원의 다른 곳에 기재되고 있다. 하나 이상의 특정 라 이보스위치, 라이보스위치 구축물 또는 일군의 라이보스위치에 대해서, 화합물은 라이보스위치를 활성화하는 것으로 확인되거나 라이보스위치 활성화 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 편의상, glmS 라이보스위치를 활성화하는 것으로 확인되거나 glmS 라이보스위치에 대해 라이보스위치 활성화 활성을 갖는 것으로 확인된 화합물은, 특정 glmS 라이보스위치, 예컨대 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바실루스 섭틸리스, 써모아나에로박터 텡콘젠시스 또는 스타필로코쿠스 아우레우스에서 발견된 glmS 라이보스위치에 대해 확인될 수 있다. 고출력 방법으로 스크리닝하는 경우, 0.01% 소듐 도데실설페이트의 포함은 완전한 리보자임 활성에 필수적이었으며, 이는 낮은 농도의 RNA가 플라스틱 튜브 및 플레이트에 접착되는 것을 방지하기 위해 이 세제의 이용에 대한 종래 입증과 일관되는 것이다. 이 검출 시스템의 식별 한계를 추가로 조사하기 위해, 16개의 Gln6P 유도체의 라이브러리가 또한 스크리닝되었다. 생성된 glmS 결합 활성은 겔 전기영동 방법에 의해 독립적으로 측정된 결합 활성에 상응하는 것이다(표 1).
Figure 112009020170115-PCT00003
Figure 112009020170115-PCT00004
B. 항미생물 화합물의 사용 방법
본원에는 생체 내 및 실험관 내 항균 방법들이 개시된다. "항균"은 박테리아 생장을 억제 또는 예방하거나, 박테리아를 사멸시키거나, 또는 박테리아의 수를 감소시키는 것을 의미한다. 따라서, 박테리아를 본원에 개시된 하나 이상의 화합물을 효과량으로 접촉하는 것을 포함하는, 박테리아 생장을 억제 또는 예방하는 방법이 개시되고 있다. 앞서 개시된 화합물에 대한 추가의 구축물이 본원에 제공되고 있다.
또한 본원은, 세포, 예컨대 개체 내에 존재하는 박테리아 세포의 생장을 억제하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 효과량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이로 인해 화합물이 세포와 접촉하게 된다. 개체는 예컨대 박테리아로 감염될 수 있으며, 상기 박테리아 세포는 상기 화합물에 의해 억제될 수 있다. 박테리아는 임의의 박테리아, 예컨대 바실루스 속 또는 스타필로코쿠스 속으로부터의 박테리아일 수 있다. 이와 관련하여, 박테리아 생장은 또한 박테리아가 발견되는 장소에서 억제될 수 있다. 예를 들면, 유체 중, 바이오필름 중 및 표면 상에서의 박테리아 생장이 억제될 수 있다. 본원에 개시된 화합물은 임의의 다른 화합물 또는 조성물과 조합 투여 또는 사용될 수 있다. 예를 들면, 앞서 개시된 화합물은 다른 항미생물 화합물과 조합 투여 또는 사용될 수 있다.
"박테리아 생장을 억제하는" 것은 단일 박테리아가 딸 세포들로 분열되는 능력을 감소시키거나, 또는 박테리아의 집단이 딸 세포들을 형성하려는 능력을 감소키는 것으로 규정된다. 박테리아가 재생산되려는 능력은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 100% 또는 그 이상까지 감소될 수 있다.
또한 본원은 박테리아를 앞서 본원에 개시 및 기재된 하나 이상의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 박테리아 또는 박테리아의 집단을 사멸시키는 방법을 제공한다.
"박테리아를 사멸시키는" 것은 단일 박테리아의 사망을 초래하거나, 또는 복수의 박테리아, 예컨대 콜로니 내의 것의 수를 감소시키는 것으로 규정된다. 박테리아가 복수 형태로 지칭되는 경우, "박테리아를 사멸시키는" 것은 집단의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이하의 비율에서의 소정 집단의 박테리아의 세포 사망으로서 규정된다.
본원에 개시된 화합물 및 조성물은 시험관 내 또는 생체 내 항균 활성을 가지며, 살균성일 수도 있는 다른 화합물 또는 조성물과 조합 사용될 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이, 화합물의 "치료 효과량"이라는 용어는 무독성이지만 하나 이상의 증상에서의 목적하는 감소를 제공하기에 충분한 양의 화합물을 의미한다. 이하 표시되는 바와 같이, 필요한 화합물의 정확한 양은 개체의 종류, 연령 및 일반적인 상태, 치료되는 질환의 심각성, 사용되는 특정 화합물, 이의 투여 방식 등에 의존하여 개체에 따라 변할 것이다. 따라서, 정확한 "효과량"을 특정할 수는 없다. 그러나, 적절한 효과량은 당해 분야의 숙련자에 의해 단지 관례적인 실험을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 화합물은 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 생체 내에 투여될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한"이라는 것은 생물학적 또는 달리 바람직한 물질, 즉 임의의 원하지 않은 생물학적 효과를 초래하지 않거나, 또는 그 안에 함유된 약학 조성물의 다른 성분들 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 담체는 천연적으로 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 개체에게서 임의의 부정적인 부작용을 최소화하도록 선택된다.
본원에 개시된 조성물 또는 화합물은 국소 비강 투여 또는 흡입에 의한 투여를 비롯해 경구, 비경구(예컨대, 정맥 내), 근육 내 주입, 복강 내 주입, 피하, 체외, 국소 등으로 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "국소 비강 투여"는 코 및 콧구멍 중 하나 또는 둘다를 통한 비강 통로 내에 조성물을 전달하는 것을 의미하며, 분무 메커니즘 또는 소적 메커니즘에 의한 전달, 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한 전달을 포함할 수 있다. 흡입에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 소적 메커니즘에 의한 전달을 통해 코 또는 입을 통과할 수 있다. 또한, 삽관을 통해 호흡계의 임의의 구역(예컨대, 허파)에 직접 전달할 수 있다. 필요한 조성물의 정확한 양은 개체의 종류, 연령 및 일반적인 상태, 치료되는 알러지 질환의 심각성, 사용되는 특정 핵산 또는 벡터, 이의 투여 방식 등에 의존하여 개체에 따라 변할 것이다. 따라서, 각 조성물에 대한 정확한 양을 특정할 수는 없다. 그러나, 적절한 양은 당해 분야의 숙련자에 의해 단지 본원의 교시내용에서 제시된 관례적인 실험을 사용하여 결정할 수 있다.
조성물 또는 화합물의 비경구 투여는 사용된다면 일반적으로 주입을 특징으로 한다. 주입 가능한 것은 통상적인 형태, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주입 전 액체 중의 현탁액의 용액에 적합한 고체 형태로서, 또는 유화액으로서 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 더 최근에 수정된 접근법은 일정한 투여량이 유지되도록 완속 방출 또는 지속 방출 시스템의 사용을 포함한다. 예를 들면, 본원에 참고로 인용하고 있는 미국 특허 제3,610,795호를 참고한다.
본원에 개시된 조성물 및 화합물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 치료적으로 사용될 수 있다. 적합한 담체 및 이들의 제형은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995]에 기재되어 있다. 전형적으로, 적절한 양의 약학적으로 허용 가능한 염이 제형이 등장성이 되도록 제형 내에 사용된다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 상기 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가 담체는 시속 방출 제조물, 예컨대 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반영구적 매트릭스(이때, 매트릭스는 형상화된 제품, 예컨대 필름, 리포솜 또는 미세입자의 형태로 존재한다)를 포함한다. 당해 분야의 숙련자라면, 특정 담체가 예컨대 투여 경로 및 투여 조성물의 농도에 따라 달라지는 것이 더 바람직하다는 것을 알 것이다.
약학 담체는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 이들 대부분은 멸균수, 염수 및 생리학적 pH의 완충 용액과 같은 용액을 비롯해 인간에게 약물 투여를 위한 표준 담체이어야 한다. 상기 조성물은 근육 내 또는 피하 투여될 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 사용되는 표준 절차들에 따라 다른 화합물들이 투여될 것이다.
약학 조성물은 분자 선택과 더불어 담체, 비후제(thickener), 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 하나 이상의 활성 성분, 예컨대 항미생물제, 소염제, 마취제 등을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 국소 또는 전신계 치료가 요구되는 지에 따라 및 치료되는 구역에 따라 여러 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예컨대, 안구 내, 질 내, 직장 내, 비강), 경구, 흡인, 또는 비경구, 예컨대 정맥 내 드립(drip), 피하, 복강 내 또는 근육 내 주입에 의해 실시될 수 있다. 앞서 개시된 항체는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 강 내 또는 경피로 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제조물은 멸균 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 예컨대 올리브유, 및 주입 가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용액, 유화액 또는 현탁액, 예컨대 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 비히클은 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로서 및 염화 나트륨, 락테이트화된 링거 또는 고정유를 포함한다. 정매 내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스에 기초한 것) 등을 포함한다. 본존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.
국소 투여를 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌제, 분무제, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학 담체, 수성, 분말 또는 오일 염기, 비후제 등이 필수적 또는 요구될 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사세제 또는 정제를 포함한다. 비후제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 요구될 수 있다.
잠재적으로 일부 조성물은, 무기 산(예: 염산, 브롬화수소산, 과염산, 질산, 싸이오사이안산, 황산 및 인산) 및 유기 산(예: 폼산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산 및 푸마르산)과의 반응, 또는 무기 염기(예: 수산화 나트륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼륨) 및 유기 염기(예: 모노알킬, 다이알킬, 트라이알킬 및 아릴 아민) 및 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된, 약학적으로 허용 가능한 산- 또는 염기-부가 염으로서 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 치료 조성물은 또한 화합물 분자와 커플링되는 개별 담체로서 단핵성 항체의 사용에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 또한 표적 가능한 약물 담체로서 가용성 중합체과 커플링될 수 있다. 이러한 중합체는 폴리바이닐-피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필메트아크릴-아마이드페놀, 폴리하이드록시에틸아스파트아마이드페놀, 또는 팔미토일 부분로 치환된 폴리에틸-에네옥사이드폴리라이신을 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 더욱이, 본 발명의 치료 조성물은 약물의 조절된 방출을 달성하는데 유용한 생체분해 가능한 중합체 부류, 예컨대 폴리아세트산, 폴리엡실론 카프롤락톤, 폴리하이드록시 뷰티르산, 폴리오르쏘에스터, 폴리아세탈, 폴리다이하이드로-피란, 폴리사이아노아크릴레이트 및 하이드록겔의 가교결합된 또는 양쪽성 블록 공중합체와 커플링될 수 있다.
박테리아 감염의 바람직하게는 적어도 약 3%, 더 바람직하게는 약 10%, 더 바람직하게는 약 20%, 더 바람직하게는 약 30%, 더 바람직하게는 약 50%, 더 바람직하게는 75% 및 더욱더 바람직하게는 약 100%가 화합물의 투여로 인해 감소된다. 감염에서의 감소는 감소된 백혈구 세포 수, 감소된 열병, 감소된 염증, 감소된 박테리아 수, 또는 박테리아 감염의 다른 표시자에서의 감소와 같은 파라미터에 의해 확인된다. 박테리아 감염 감소의 백분율을 증가시키기 위해, 투여량은 개체에 대한 비독성인 것으로 잔존하는 가장 효과적인 수준으로 증가시킬 수 있다.
본원에 전반적으로 사용되는 바와 같이, "개체"는 개별 유기체를 지칭한다. 바람직하게는, 개체는 포유동물, 예컨대 인간 이외의 포유동물 또는 유인원, 더 바람직하게는 인간이다. "개체"은 가축화된 동물(예컨대, 고양이, 개 등), 가축(예컨대, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험용 동물(예컨대, 마우스, 토끼, 랫, 기니 피그 등) 및 어류이다.
"박테리아로 감염된"은 개체 또는 샘플 중의 박테리아의 존재로서 정의된다. 이러한 박테리아는 개체 또는 샘플 내 또는 그 위에 천연 발생 박테리아가 생장할 수 있거나, 외부 생명체의 침투에 기인할 수 있다.
본원에 개시된 화합물은 항생제와 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 항생제는 당해 분야에 잘 확립되어 있다. 이들 사용의 일례로는 동물 치료가 포함된다. 필요한 경우, 앞서 개시된 화합물은 주입을 통해 또는 먹이 또는 물을 통해 통상적으로 수의사 또는 영양사의 전문적 안내로 동물에게 투여될 수 있다. 이들은 질환 심각성 및 동물 종류와 같은 상황에 따라 동물에게 개별적으로 또는 군으로 전달된다. 전체 떼 또는 군의 치료 및 보호는 모든 동물이 유사한 면역 상태로 존재하고 모두가 동일한 질환-유발 미생물에 노출되는 경우 요구될 수 있다.
상기 화합물에 대한 사용의 다른 예로는, 미생물 감염된 수중 동물을 선택하는 단계, 앞서 개시된 화합물, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, TRIENE을 포함하는 항미생물 용액을 제공하는 단계, 상기 용액에 pH 완충제를 첨가하는 단계, 및 이의 pH를 약 7.0 내지 약 9.0의 값으로 조정하는 단계, 수중 동물을 용액 중에 침지시키는 단계, 동물의 미생물 부담(burden)을 감소시키는데 효과적인 기간 동안 그 안에 수중 동물을 잔류시키는 단계, 용액으로부터 수중 동물을 제거하는 단계, 및 상기 동물을 상기 용액이 포함되지 않은 물로 복귀시키는 단계를 포함하는, 수중 동물의 미생물 감염을 감소시키는 것이 포함된다. EDTA, 앞서 개시된 화합물, TRIENE 및 pH 완충제가 함유된 용액 중에의 수중 동물의 침지는 동물의 미생물 부담이 제거될 때까지 반복 실시될 수 있다(미국 특허 제6,518,252호).
본원에 개시된 화합물의 다른 용도는 치과 치료 및 물 정화를 포함하지만 이에 국한되지 않는다(이는 도시 급수, 하수도 처리 시스템, 음용수 및 비음용수 공급, 및 부화장 등을 포함할 수 있다).
특정 실시양태
본원은, 유전자 발현을 억제하는 방법으로서, (a) 화합물을 세포와 접촉시키되, (b) 상기 화합물은, 글루코사민-6-포스페이트가 아닌, 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 생리학적으로 가수분해 가능한 및 허용 가능한 에스터, 또는 둘 다이고, 상기 세포는 glmS 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하고, 상기 화합물은 상기 glmS 라이보스위치에 결합시킴으로써 상기 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
화학식 I
Figure 112009020170115-PCT00005
상기 식에서,
R1은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R2는 NH-R6이고, 이때 R6은 H, CH3, C2H5, n-프로필, C(O)CH3, C(O)C2H5, C(O)n-프로필, C(O)아이소-프로필, C(O)OCH3, C(O)OC2H5, C(O)NH2 또는 NH2이고,
R3은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R4는 수소 결합 공여체이고,
R5는 수소 결합 수용체이다.
또한, 본원은 화학식 I의 화합물을, glmS-반응성 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포와 접촉시킴을 포함하는, 상기 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 화합물은 상기 glmS-반응성 라이보스위치에 결합함으로써 상기 유전자의 발현을 억제한다. 세포는 예컨대 박테리아 세포일 수 있으며, 상기 화합물은 상기 박테리아 세포를 사멸시키거나 박테리아 세포의 생장을 억제할 수 있다. 상기 세포는 glmS 라이보스위치를 함유할 수 있다. 상기 세포는 바실루스 또는 스타필로코쿠스일 수 있다.
또한, 세포 내의 유전자 발현을 억제하는 방법, 및/또는 화합물을 개체에게 투여함으로써 상기 세포와 화합물을 접촉시킴으로써 상기 세포를 함유하는 개체 내의 세포 생장을 억제하는 방법이 개시되고 있다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 글루코사민-6-포스페이트를 기질로서 사용하는 개체의 효소에 대한 기질이 아니다. 화합물은, 효소가 이의 주요 기질의 80% 이상을 변경 또는 이화시키는 조건 하에서 일정 기간 동안 효소에 의해 화합물의 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 미만이 변경되거나 물질대사되는 경우 효소의 기질이 아니다. 효소를 위한 주요 기질은 효소가 최고 효소 활성을 가짐에 따라 효소를 위한 정상적인 생물학적 기질이다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 글루코사민-6-포스페이트를 이화시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아니다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 글루코사민-6-포스페이트를 이화시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아니다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 세포는 개체 내의 박테리아 세포이고, 이때 상기 화합물은 상기 박테리아 세포를 사멸시키거나 박테리아 세포의 생장을 억제한다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 개체는 박테리아로 감염되어 있다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 또 다른 항미생물 화합물과 조합 투여된다. 상기 방법의 일부 형태에서, 상기 화합물은 바이오필름 내의 박테리아 생장을 억제한다.
본원은 글루코사민-6-포스페이트가 아닌 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 생리학적으로 가수분해 가능한 및 허용 가능한 에스터, 또는 둘 다인 화합물을 제공한다:
화학식 I
Figure 112009020170115-PCT00006
상기 식에서,
R1은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R2는 NH-R6이고, 이때 R6은 H, CH3, C2H5, n-프로필, C(O)CH3, C(O)C2H5, C(O)n-프로필, C(O)아이소-프로필, C(O)OCH3, C(O)OC2H5, C(O)NH2 또는 NH2이고,
R3은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
R4는 수소 결합 공여체이고,
R5는 수소 결합 수용체이다.
또한, R4가 OH, SH, NH2, NH3 +, CH2OH, CH(OH)CH3, CH2CH2OH, CH2SH, CH(SH)CH3, CH2CH2SH, CH2NH2, CH(NH2)CH3, CH2CH2NH3, CO2H, CONH2, CONH알킬, =NH, =NOH, =NSH, =NCO2H, =CH2, CH=NH, CH=NOH, CH=NSH, CH=NCO2H, OCH2OH, OCH2CH2OH, PhOH, NH알킬, NHNH2, NHNH알킬, NHCO알킬, NHCO2알킬, NHCONH2, NHSO2알킬 또는 NHO알킬인 화합물을 제공한다. 또한, R1이 H 또는 OH이고 R2가 NH2 또는 NHCH3인 경우, R4가 OH가 아닌 화합물을 제공한다. 또한, R5가 OP(O)(OH)2, OP(S)(OH)2, OP(O)OHSH, OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인 화합물을 제공한다. 또한, R5가 OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인 화합물을 제공한다. 더욱이, R5는 음으로 하전될 수 있다. 또한, R5가 =O, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, 이때 R9가 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인 화합물을 제공한다. 또한, R5가 =O, OH, OR9, COR9, CN, NO2, 테트라졸, SOR9, N(R9)2, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, R9가 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인 화합물을 제공한다. 또한, R4가 NH2, NH3 +, OH, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인 화합물을 제공한다. 또한, R4가 NH2, NH3 +, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인 화합물을 제공한다. 한 예에서, 세포는 유전자 발현의 억제가 필요한 것으로서 확인된 세포이다. 상기 세포는 박테리아 세포일 수 있으며, 상기 화합물은 상기 박테리아 세포를 사멸시키거나 박테리아의 생장을 억제할 수 있다. 상기 화합물은 glmS 라이보스위치에 결합할 수 있다. 상기 화합물은 glmS 라이보스위치에 결합할 수 있다. 상기 화합물은 glmS 라이보스위치를 활성화할 수 있다.
또한 본원은, 암호화 영역에 작동 가능하게 연결된 glmS 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조절 가능한 유전자 발현 구축물 및 앞서 기재된 화합물을 포함하는 조성물로서, 이때 glmS 라이보스위치가 RNA의 발현을 조절하고, glmS 라이보스위치 및 암호화 영역이 이종성을 나타내는, 조성물을 제공한다. 상기 glmS 라이보스위치는 상기 화합물에 의해 활성화된 경우 신호를 생성할 수 있다. 예를 들면, 라이보스위치는 상기 화합물에 의해 활성화된 경우 라이보스위치의 입체구조를 변화시킬 수 있고, 입체구조의 변화는 입체구조 의존성 표지를 통해 신호를 생성할 수 있다. 더욱이, 라이보스위치는 상기 화합물에 의해 활성화된 경우 라이보스위치의 입체구조를 변화시킬 수 있고, 이때 입체구조의 변화는 라이보스위치에 연결된 암호화 영역의 발현에 변화를 일으키고, 발현에서의 변화는 신호를 생성한다. 상기 신호는 라이보스위치에 연결된 암호화 영역으로부터 발현된 리포터 단백질에 의해 생성될 수 있다.
또한 본원은, (a) glmS 라이보스위치를 통해 일어나는, glmS 라이보스위치가 포함된 RNA를 암호화하는 유전자의 억제에 대해 앞서 기재된 바와 같은 화합물을 시험하는 단계; 및 (b) glmS 라이보스위치가 포함된 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를, 상기 단계 (a)에서 유전자 발현을 억제하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 유전자 발현을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 화합물은 glmS 라이보스위치와 결합함으로써 유전자의 발현을 억제하는, 방법을 제공한다.
또한 본원은, 표 2에 열거된 원자 배위를 포함하는 원자 구조를 포함하는 천연 glmS-반응성 라이보스위치의 원자 구조를 제공한다. 또한, 본원은 도 9에서 표시된 바와 같은 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 구조, 및 표 2 내에 포함되는 도 9에서 표시된 활성 부위 및 결합 포켓의 원자 배위를 포함하는 천연 glmS-반응성 라이보스위치의 원자 구조를 제공한다.
또한 본원은, glmS 라이보스위치의 원자 구조를 시험 화합물로 모델링하고, 상기 시험 화합물이 상기 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 단계를 포함하는, 라이보스위치와 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 더욱이, 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 것은, 라이보스위치의 모델에서 시험 화합물에 대한 예상된 최소 상호작용 에너지, 예상된 결합 상수, 예상된 해리 상수 또는 이들의 조합을 측정함을 포함할 수 있다. 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 것은, 라이보스위치의 모델로 시험 화합물의 하나 이상의 예상된 결합, 하나 이상의 예상된 상호작용 또는 이들의 조합을 측정함을 포함할 수 있다. 원자적 접촉을 통해 라이보스위치와의 상호작용을 확인함으로써 시험 화합물과 라이보스위치의 상호작용을 확인한다. 라이보스위치와 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법은 시험 화합물의 유사체를 확인하고, 시험 화합물의 유사체가 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인함을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본원은, 앞서 개시된 방법에 의해 확인된 화합물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하는, 박테리아를 사멸시키거나 박테리아의 생장을 억제하는 방법을 제공한다. 또한 본원은, 앞서 개시된 방법에 의해 확인된 화합물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하는 박테리아의 사멸 방법을 제공한다. 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하기 위해 겔-기초 분석 또는 칩-기초 분석을 이용할 수 있다. 시험 화합물은 반데르발스 상호작용, 수소 결합, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 상호작용할 수 있다. 라이보스위치는 예컨대 RNA 절단 리보자임을 포함할 수 있다. 켄칭 부분을 포함하는 핵산이 절단되는 경우, 형광 신호가 생성될 수 있다. 분자 비콘 기술을 이용하여 형광 신호를 생성할 수 있다. 본원에 개시된 방법들은 고출력 스크린을 이용하여 실시될 수 있다.
또한 본원은, 세포, 예컨대 개체 내에 존재하는 박테리아 세포의 생장을 억제하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 효과량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이로 인해 화합물이 세포와 접촉하게 된다. 개체는 예컨대 박테리아로 감염될 수 있으며, 상기 박테리아 세포는 상기 화합물에 의해 억제될 수 있다. 박테리아는 임의의 박테리아, 예컨대 바실루스 속 또는 스타필로코쿠스 속으로부터의 박테리아일 수 있다. 이와 관련하여, 박테리아 생장은 또한 박테리아가 발견되는 장소에서 억제될 수 있다. 예를 들면, 유체 중, 바이오필름 내 및 표면 상에서의 박테리아 생장이 억제될 수 있다. 본원에 개시된 화합물은 임의의 다른 화합물 또는 조성물과 조합 투여 또는 사용될 수 있다. 예를 들면, 앞서 개시된 화합물은 다른 항미생물 화합물과 조합 투여 또는 사용될 수 있다.
A. 실시예 1: glmS 자가-절단 리보자임에 의한 리간드 인지의 특성
바실루스 세레우스로부터의 glmS 리보자임(문헌 [Winkler 2004}; 문헌 [Barrick 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]; 문헌 [Wilkinson 2005]; 문헌 [Soukup 2006]; 문헌 [Roth 2006]; 문헌 [Jansen 2006])은, 구성원들이 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)에 결합될 때 가속화된 속도 상수로 자가-절단을 경험하는 대표적인 독특한 라이보스위치(문헌 [Mandal 2004]; 문헌 [Winkler 2005]) 부류이다. 이들 대사산물-감지 리보자임은 이들이 glmS 유전자의 발현을 제어하는 다수의 그람-양성 박테리아에서 발견된다. glmS 유전자 생성물(글루타민-프럭토스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼라제)은 리보자임에 결합되고 내부 포스포에스터 전달(문헌 [Winkler 2004])에 의해 자가-절단을 개시하는 GlcN6P(문헌 [Badet-Denisot 1993]; 문헌 [Milewski 2002])을 생성시킨다. 리보자임은 glmS 메신저 RNA의 5'-미번역된 영역(UTR) 내에 매립되고, 자가-절단은 glmS 단백질 생산을 방지하며, 이로 인해 GlcN6P의 농도가 감소된다. 분자 감지, 자가-절단 및 유전자 제어 기능의 조합은 이 작은 RNA를 리보자임으로서 및 라이보스위치로서 모두 작동하도록 허용한다.
바실루스 세레우스로부터의 glmS 리보자임 및 바실루스 섭틸리스로부터의 동 종 리보자임은 약 200μM의 겉보기 해리 상수(KD)를 갖는 GlcN6P에 대응하는 것으로 알려져 있다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]; 문헌 [Roth 2006]). 이 KD 값이 대부분의 다른 천연 라이보스위치에 대해 측정된 것보다 클지라도, glmS 리보자임은 고도의 분자 인지 특수성을 나타낸다. 예를 들면, 글루코사민-6-설페이트는 GlcN6P와 동일한 정도까지 리보자임 활성을 유도하지만, 약 100배 높은 농도에서 존재할 경우도 있다. 반면, GlcN6P의 2-아민 기가 하이드록실 기로 대체되는 글루코스-6-포스페이트는 리보자임 활성을 개시하는데 완전하게 실패한다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]).
라이보스위치는 대사 유전자의 원하지 않는 조절을 방지하기 위해 이의 천연 리간드와 관련된 화합물에 대해 식별할 수 있어야 한다. 그러나, 라이신(문헌 [Sudarsan 2003]) 및 싸이아민 피로포스페이트(문헌 [Sudarsan 2006])에 정상적으로 대응하는 라이보스위치에 대해 입증되어 온 바와 같이, 라이보스위치 기능을 개시하고 박테리아 생장을 억제하는 유사체를 생성시킬 수 있다. glmS 단백질의 적절한 발현은 박테리아 생존을 위해 중요하며(문헌 [Badet-Denisot 1993]; 문헌 [Milewski 2002]), glmS 리보자임 활성을 개시함으로써 정상 유전자 발현을 간섭할 수 있는 GlcN6P의 유사체는 새로운 유형의 항미생물제로서 작용할 수 있게 된다. 따라서, glmS 리보자임의 분자 인지 특성에 대한 이해의 증가가 추구되어 왔다.
glmS 리보자임의 분자 인지 특성은, 바실루스 세레우스로부터의 200-뉴클레오타이드 glmS 리보자임 구축물의 자가-절단 활성에 대한 GlcN6P 및 다양한 GlcN6P 유사체의 효과를 측정함으로써 밝혀졌다(도 1). 각 리간드에 대한 KD 값은 리간드 농도에 대한 리보자임 속도 상수를 플로팅함으로써 측정하였다. 유사 방법들을 사용하는 종래 연구들에서는, GlcN6P의 포스페이트 부분(도 1b; 1a)가 리간드와 glmS 리보자임 사이의 최대 친화성에 요구되는 것으로 드러났다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]). 또한, 리간드의 아민 기는 리보자임 기능에 필수적인 것으로 알려져 있다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]). 그러나, 선형 아민-함유 화합물은 가장 온화한 리보자임 활성을 유도할 수 있으며(문헌 [McCarthy 2005]), 이는 GlcN6P의 비사이클릭(도 1b) 또는 대안적 아노머 형태(도 1c)가 활성적일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 일련의 유사체는 GlcN6P의 구조적 변경 및 피라노스 고리 상의 개별 작용기의 중요성을 탐침하기 위해 시험되었다(도 2).
생리학적 조건 하에서, GlcN6P는 비사이클릭 형태(도 1b)와 2개의 사이클릭 β-(도 1a) 및 α-아노머(도 1c) 형태(도 1b) 사이를 평형시킨다(문헌 [Schray 1978]). 1a와 1b 사이의 상대적인 양은 D2O 중의 1H NMR에 의해 25℃에서 측정할 때 60:40이되, 비사이클릭 형태에서 1% 미만이다(문헌 [Schray 1978]). 각각의 콘포머(conformer)는 glmS 단백질에 대해 관찰된 것과 유사한 리보자임 활성 및 RNA 결합 친화성에서의 차이를 나타낸다(문헌 [Teplyakov 1998]).
작은 분자, 예컨대 세리놀 및 에탄올아민은 리보자임 활성을 촉진시키지만, 이들은 GlcN6P보다 덜 효과적이다(문헌 [McCarthy 2005]). 유사하게, 비아크릴릭 유사체(3)는 현 연구에 사용된 분석 조건 하에서 검출 가능한 활성을 갖지 않는다 (도 2b, 실험 섹션). 반면, 위치 1에서 하이드록실 기가 부족한 사이클릭 유사체(8)는 GlcN6P에 의해 나타내는 활성의 약 1/70배까지 리보자임 자가-절단을 활성화한다(도 2c, 도 3). 이들 결과는 리라노스 고리의 위치 1에서 화학 구조의 변경이 리보자임 활성에 대한 가장 온화한 효과만을 갖지만 이 위치에서의 고리의 개환(3에서와 같고 가장 유사하게는 1b에서와 같음)은 더 유해하다는 것을 입증한다.
1b가 리보자임의 정상적 기능에 적절하지 않기 때문에, GlcN6P의 아노머 중 하나 또는 둘 다는 활성화제로서 제공해야 한다. 1a(5) 및 1c(6)의 유사체가 시헙되었으며, 이때 상기 유사체의 입체화학은 1 위치에서 산소 원자의 메틸화에 의해 유지된다. 현 결과에서는, 리보자임이 유사체 결합을 배제하는 1 위치에 근접한 긴밀한 결합 포켓을 형성하는 것으로 나타난다. 8이 리보자임 절단을 실질적으로 활성화할 수 있기 때문에, 위치 1에서의 변경은 단지 리간드와 리보자임 사이의 분자적 상호작용을 가장 온화하게 붕괴시킨다. 다르게는, 2-아민 기의 pKD에 대한 1-하이드록실 기의 영향은 또한 8의 활성에서의 담소에 대한 원인이 될 수 있다. 예를 들면, 에틸아민(pKa = 10.7)은 에탄올아민(pKa = 9.50)보다 높은 pKa를 가지며, 이는 인접하는 하이드록실 기가 하나 초과의 단위체에 의해 아민의 염기성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다(문헌 [Lide 1994]). 따라서, 1-하이드록실 기의 부재에 의해 초래된 pKa에서의 변화가 리간드 결합 또는 리보자임 촉매를 붕괴시킬 수 있었다.
화합물(2 및 13)은 리보자임 활성화를 위한 3- 및 4-하이드록실 기의 중요성 을 측정하기 위해 조사되었다. 13이 GlcN6P와 유사한 활성을 나타내는 반면, 2는 사용된 분석 조건 하에서 활성을 유도하지 못한다(도 2b 및 2c). 이들 결과는 4-하이드록실 기가 결합에 중요하다는 것을 내포한다. 반면, 3-하이드록실 기는 단지 결합에 대해 가장 온화한 충격을 가지거나, 또는 달리 2-아민 기에 대한 유도적 효과를 통해 반응성에 영향을 미칠 수 없다.
포스페이트 기를 설페이트로 대체하는 것은 리간드에 대한 친화성을 약 100배까지 감소시킨다(문헌 [Winkler 2004]). 그러나, 포스페이트 기의 제거(글루코사민)는 리간드 친화성을 더욱더 제거할 수 있다. 포스페이트 산소 원자의 중요성을 추가로 평가하기 위해, 포스포로싸이올레이트 유사체(4)가 생성되었다. 이로 인해 또한 1과 비교하여 약 2배까지 리보자임 절단의 속도 상수가 감소된다. 그러나, GlcN6P는 글루코사민보다 1000배 더 긴밀하게 리보자임에 의해 결합된다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]; 문헌 [Lide 1994]; 문헌 [Mayer 2006]). 시험된 포스페이트 변경은 리간드와 리보자임 사이의 단일 상호작용을 단지 부분적으로 붕괴시킬 수 있지만, 하나 초과의 결합 상호작용이 리간드의 이 부분에서 일어나기 쉽다.
2-아민 기, 또는 유사 아민이 리보자임 활성을 유도하는 모든 화합물 중에 존재한다(문헌 [Winkler 2004]; 문헌 [McCarthy 2005]). 따라서, 1의 일련의 구조적 및 입체화학적 이성질체가 시험되며, 이때 이 작용기는 변경되었다. 7에서의 1-하이드록실과 2-아민 기의 상호작용은 리보자임 절단을 지지하지 않으며, 이는 2-아민 기의 위치가 활성에 대해 중요함을 암시한다. 메틸 기에 의해 초래되는 입 체적 장애에도 불구하고, 리보자임은 9에 의해 활성화되지만 단지 GlcN6P에 비해 효율 면에서 가장 온화하게 감소한다. 반면, 10 및 11은 비활성적이며, 이는 결합 또는 촉매를 위해 양성자를 수용 또는 공여하려는 아민의 능력이 필수적임을 나타낸다.
화합물(12)은 대향 입체화학적 구조형태로 2 위치에서 아민 기를 가지며, 놀랍게도 천연 리간드의 1/35배까지의 절단을 유도한다. GlcN6P를 결합시키는데 사용되는 동일 접촉들을 사용하여 12가 결합할 수 있지만,이 포켓 내의 아민 기의 재배치(relocation)는 양성자-전달-매개된 촉매에서 결합 또는 이에 참여하려는 이의 능력을 단지 약간 제거한다.
이들 발견에 기초하여, GlcN6P 결합을 위한 일련의 분자적 인지 결정자들이 결정해 왔다(도 4). 6-포스페이트 및 4-하이드록실 기는 수소-결합 공여체 및 수용체 부위로서 제공할 수 있다. 포스페이트 기의 비결합 산소 원자들이 구체-내부 정합을 통해 금속 이온들과 상호작용할 수 있지만, 이는 Mg2+ 이온이 코발트 헥사민과 대체되는 경우 리보자임이 완전 활성을 달성할 수 있기 때문에 이 RNA에서 용이하지 않다. 코발트 헥사민은 완전-수화된 Mg2+ 이온을 자극하며, 단지 인접 포스페이트와의 수소 결합을 형성할 수 있다.
8에 대한 감소된 활성은 아민의 pKa에서의 예상된 증가에 기인할 수 있으며, 이는 양성자 전달 반응에서 기능하는 이의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 8에서 관 찰된 활성의 소실은 아민 pKa에서의 이동에 기인하거나, 또는 분자적 인지 접촉의 붕괴에 적어도 부분적으로 기인할 수 있다. GlcN6P는 RNA 절단을 위한 조인자(cofactor)(문헌 [Winkler 2004])로서, 및 종래 확인된 양성자 전달에 아마도 조력하는 것으로 추측되는 작은 분자를 사용하는 핵산 효소로서 기능할 수 있다. RNA에서의 리간드-유도 형상 변화의 부재(문헌 [Roth 1998]), 및 다양한 리간드 유사에의 사용에 의해 초래된 pH 프로파일 변화(문헌 [McCarthy 2005]) 모두는 GlcN6P가 반응의 화학 단계에 직접 참여하는 것으로 나타난다.
GlcN6P의 아민 기가 리보자임 활성 부위에서 주요 부분이다면, 데이터에 대한 가장 간단한 설명은 리간드가 일반 염기 촉매로서 작용한다는 것이다. pH가 증가하면 리보자임 활성에 대한 kobs의 대수는 1의 기울기로 선형으로 증가한다. 더욱이, 아민 기에 대한 더 높은 pKa 값을 나타내는 GlcN6P 유사체는 리보자임 활성의 덜 효과적인 유도제(8)이거나, 또는 최대의 1/2 리보자임 활성에 도달하는데 요구되는 pH에서의 증가를 나타낸다(문헌 [McCarthy 2005]). 다른 더 복잡한 메커니즘이 가능할지라도, 리보자임은 불안정한 인터뉴클레오타이드(internucleotide) 연결부에서 2'-하이드록실 기의 탈양성자화를 조력하는데 GlcN6P를 사용할 수 있다(문헌 [Roth 2006]).
다른 라이보스위치 부류의 분자적 인지 특성의 종래 연구에서는, 높은 수준의 분자적 식별이 천연 리간드-결합 RNA에 의해 달성될 수 있는 것으로 드러났다(문헌 [Lim 2006]). 병원균 내의 glmS 대사 효소의 발현을 붕괴시키기 위해서, glmS 리보자임 절단을 효율적이고 선택적으로 개시하는 유사체가 사용될 수 있으며, 이는 이들의 정상적 세포 기능을 붕괴시킬 수 있다.
실험
바실루스 세레우스로부터의 glmS 리보자임(도 1a)을 종래 기재된 바와 같이 시험관 내 잔사에 의해 생성시키며(문헌 [Roth 2006]), 5'-32P-방사선표지되고(Lim 2006), PAGE에 의해 정제되었다. 종래 기재된 것과 유사한 방법 및 반응 조건을 사용하여 속도 상수를 구축하되(문헌 [Roth 2006]), 반응 혼합물은 Tris-HCl 완충액 대신 50 mM HEPES 완충액(23℃에서 pH 7.5)을 함유하였다. 사용된 리간드 농도 및 항온처리 시간은 각 분석에 대해 규정한다. 리보자임 활성은 타이푼 이미저(Typhoon imager)(애머샴 바이오사이언스즈(Amersham Biosciences))를 사용하여 절단 및 미절단된 RNA의 양을 정량화함으로써 구축되었다.
일반 방법: 상업적 공급자들로부터 획득된 시약들을 달리 언급이 없는 한 추가 정제 없이 사용하였다. 융점은 전열 모세관 융점 기구(Electrothermal capillary melting point apparatus)를 사용하여 측정하고, 기록된 값들은 수정하지 않는다. D2O(1H에 대해 4.79 ppm) 또는 CDCl3(1H에 대해 7.27 ppm 및 13C에 대해 77.0 ppm)을 참조하여, 표시된 바와 같이 NMR(1H, 13C 및 31P) 스펙트럼을 기록한다(브루커(Bruker) AMX-400 MHz 또는 브루커 어드밴스(Bruker Advance) DRX-500 MHz). 이 머크(E. Merck) 실리카 겔 60 F254 플레이트를 사용하여 분석 박막 크로 마토그래피를 실시하였다. 닌하이드린(ninhydrin) 용액 중에 플레이트를 침직시키고 가열함으로써 UV-비활성 화합물들을 가시화하였다. 합성 DNA를 예일대에서 HHMI 케크 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터(HHMI Keck Foundation Biotechnology Resource Center)(미국 코넥티컷주 뉴 헤븐 소재)로부터 구입하였다.
재료: 이하 화합물들 또는 시약들은 표시된 공급원으로부터 시판되고 있다: 사크로미세스 세레비시아에(Sacchromyces cerevisiae)로부터의 D-(+)-글루코사민 하이드로클로라이드, D-글루코스 6-포스페이트, 헥소키나제(시그마); N-아세틸-D-글루코사민 6-포스페이트, D-만노스아민 하이드로클로라이드, D-갈락토스아민 하이드로클로라이드, 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노스 1,3,4,6-테트라아세테이트, 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-글루코피라노실 클로라이드, 포스포릴 클로라이드, 싸이오포스포릴 클로라이드, 아데노신 5'-트라이포스페이트(알드리치); 1,3,4,6-테트라-0-아세틸-2-아미노-2-데스옥시-β-D-글루코피라노스 하이드로클로라이드(오크우드(Oakwood)); 2-데옥시-2-(트라이메틸암모니오)-D-글루코스(팀테크(Timtec)). 이하 기재되는 바와 같이 이 연구를 위해 합성된 화합물은 2-아미노-2-데옥시-D-글루시톨-6-포스페이트(문헌 [Bearne 1996]), 2-아미노-2-데옥시-D-만노스 6-포스페이트(문헌 [Liu 2001]), 2- 데옥시-2-아미노-D-알로스(문헌 [Jeanioz 1957]), 2-데옥시-2-메틸아미노-D-글루코스(문헌 [Gorin 1971]), 2- 아미노-1,5-언하이드로-2-데옥시글루시톨 하이드로클로라이드(문헌 [Schaefer 1998]), 메틸 2-아미노-2-데옥시-α-D-글루코스 6-포스페이트(문헌 [Ohno 1981]), 메틸 2-아미노-2- 데옥시-β-D-글루코스 6-포스페이트(문헌 [Ohno 1981]) 및 2-아미노-2-데옥시-D-갈락토스 6-포스페이트(문헌 [Distler 1958])를 포함한다.
2-아미노-2- 데옥시 -1,3,4,6- 테트라 -0-( 트라이메틸실릴 )-α-D- 글루코피라노스: 2-아미노-2-데옥시-1,3,4,6-테트라-O-(트라이메틸실릴)-α-D-글루코피라노스를 가우테론(Gautheron)(문헌 [Auge 1998])의 절차의 변경된 절차에 의해 제조하고, D-글루코사민 하이드로클로라이드(1.0 g, 4.64 밀리몰)를 피리딘 45 mL 중에 용해시키고, 헥사메틸다이실라제인 7.0 mL(33.39 밀리몰) 및 클로로트라이메틸실레인 3.5 mL(27.82 밀리몰)로 처리하였다. 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 가열하고 여과하였다. 여액을 n-헥세인과 물 사이로 분할시키고, 유기 상을 분리시켰다. 수성 상을 n-헥세인으로 추출하고, 합쳐진 유기 상을 1 N HCl로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 목적하는 생성물을 노란빛 백색 고체로서 수득하였다. 100% 수율; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 5.10 (d, 1 H, J = 3.2 Hz, 1-H), 3.68 (m, 3H, 3-, 4-, 및 5-H), 3.49 (m, 2H, 6-H), 2.51 (dd, 1H, 2-H), 0.0 - 0.2 (s, 36H, 4 (CH3)3Si); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 95.0, 77.9, 73.3, 72.4, 62.4, 57.8, 1.7, 1.2, 0.3, 0.1; IR (순수, cm-1); MS (ESI) m/e 468.0 ([M+H]+, C18H45NO5Si4 467.9).
Figure 112009020170115-PCT00007
2-아미노-2- 데옥시 -D- 글루코스 6- 싸이오포스페이트: 톨루엔 2 mL 및 피리딘 140 μL(1.68 밀리몰) 중의 2-아미노-2-데옥시-1,3,4,6-테트라-O-(트라이메틸실릴)-α-D-글루코피라노스(357 mg, 0.76 밀리몰)의 혼합물에 싸이오포스포릴 클로라이드(158 μL, 1.53 밀리몰)를 첨가하고, 반응 혼합물을 30℃로 16시간 동안 가열하였다. 혼합물을 농축시키고, 에탄올 중에 용해시킨 후, 진공 하에서 동시 증발시켰다. 조질의 혼합물을 물로 처리하고, 60℃로 16시간 동안 가열한 후, 농축시켰다. 잔류물을 물로 3회 동시 증발시켰다. 에탄올 및 다이에틸에터로 결정화시켜 목적하는 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. mp 185-187℃; 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ; 13C NMR (D2O, 125 MHz) δ; 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ41.9; IR (순수, cm-1) 3363, 1028, 722; MS (ESI) m/e 275.1 ([M+H]+, C6H14NO7PS 275.2).
사카로미세스 세레비시아에( Saccharomyces cerevisiae ) 헥소키나제에 의한 효소 포스포릴화를 위한 일반 절차: 절차는 본질적으로 문헌 [Liu and Lee (2001)]에 기초하며, 헥소스아민 하이드로클로라이드(2.00 밀리몰), 마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트(1.40 밀리몰) 및 아데노신 5'-트라이포스페이트(2.20 밀리몰)를 증류스 54 mL 중에 용해시켰다. 용액을 pH 7.5까지 0.5 NKOH로 조정하고, 물 1.0 mL 중에 용해된 헥소키나제(1320 U)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 계속적으로 2 내지 3시간 동안 주변 온도에서 교반하였다. 반응 동안, 용액의 pH를 이럿이 안정될 때까지 30분마다 0.5 N KOH를 첨가함으로써 7.5에서 유지하였다. TLC(2:1: 1 n-BuOH-HOAc-H2O)에서는 출발 물질이 완전히 사라지고 새로운 화합물이 닌하이드린-양성 UV-음성 스팟으로서 나타났다. 그 다음, 혼합물을 농축 염산을 첨가하여 pH 2.0로 조정하고, 1/3 부분을 다우엑스(Dowex) 50W x 8 (200 내지 400 메시(mesh)로부터의 H+) 양이온 교환 수지(2.5 x 25 cm)의 칼럼 상에 적재하였다. 상기 칼럼을 물로 용리시키고, 주요 음이온이 곧바로 용리된 후, 헥소스아민 6-포스페이트가 용리되었다. 목적하는 생성물이 함유된 단편들을 모으고, 45℃ 미만에서 회전 증발기로 농축시킨 후, 동결건조시켜 생성물을 수득하였다.
Figure 112009020170115-PCT00008
2-아미노-1,5-언하이드로-2-데옥시글루시톨 6-포스페이트: 2-데옥시-1,5-언하이드로-2-데옥시글루시톨 6-포스페이트를 문헌 [Liu and Lee (2001)]의 절차에 의해 제조하였다. mp 185-187℃; 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 4.07 (dd, 1H, H-1), 3.72 (dd, 1H, H-6), 3.64 (dd, 1H, H-6), 3.50 (dd, 1H, HS), 3.41 (dd, 1H, H-1), 3.29 (m, 2H, H4 & H-5), 3.15 (m, 1H, H-2); 13C NMR (D2O, 125 MHz) (581.0, 74.6, 70.2, 66.4, 61.1, 51.9; 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ 4.10; MS (ESI) m/e 243.4 ([M+H]+, C6H14NO7P 243.2).
Figure 112009020170115-PCT00009
2-메틸아미노-2-데옥시글루코스 6-포스페이트: 2-메틸아미노-2-데옥시글루코스 6-포스페이트를 문헌 [Liu and Lee (2001)]의 절차에 의해 제조하였다. mp 185-187℃; 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ5.21 (d, 1H, H-1), 4.05 (d, 3H, CH3), 3.67 (m, 3H, 3-H, 4-H & 5-H) 3.34 (m, 2H, 6-H), 3.09 (m, 1H, H-2); 13C NMR (D2O, 125 MHz) δ93.2, 89.6, 72.2, 71.1, 69.5, 64.1, 54.6; 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ4.59; MS (ESI) m/e 273.4 ([M+H]+, C7H16NO8P 273.2).
Figure 112009020170115-PCT00010
2-아미노-2-데옥시알로스 6-포스페이트: 2-아미노-2-데옥시알로스 6-포스페이트를 문헌 [Liu and Lee.][2]의 절차에 의해 제조하였다. mp 185-187℃; 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ5.27 (d, 1H, H-1 β), 4.85 (d, 1H, H-1a), 4.04 (m, 3H, H-3, H-4 & H-5), 3.50 (m, 2H, H-6), 3.23 (dd, 1H, H- 2); 13C NMR (D2O, 125 MHz) δ 91.2, 88.6, 70.5, 68.5, 63.4, 58.1; 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ 4.38; MS (ESI) m/e 259.1 ([M+H]+, C6H14NO8P 259.2).
Figure 112009020170115-PCT00011
2-(트라이메틸암모니오)-2-데옥시글루코스 6-포스페이트: 2-(트라이메틸암모니오)-2-데옥시- 글루코스 6-포스페이트를 문헌 [Distler (1958)]의 절차에 의해 제조하였다. mp 185-187℃; 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 5.24 (s, 1H, H-1), 3.55 (m, 3H, H-3, H-4 & H-5), 3.50 (s, 9H, N(CHi)3), 3.14 (s, 2H, H-6); 13C NMR (D2O, 125 MHz) δ 95.6, 91.8, 75.5, 74.0, 71.2, 69.4; 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ 3.40; MS (ESI) m/e 303.1 ([M+H]+, C9H21NO8P 302.2).
Figure 112009020170115-PCT00012
1-아미노-1-데옥시 6-포스페이트: 1-아미노-1-데옥시글루코스 6-포스페이트를 갤럽(Gallop )(문헌 [Vetter 1995])의 절차의 변경된 절차에 의해 제조하였다. 포화된 수성 암모늄 카보네이트 중의 D-글루코스 6-포스페이트의 용액을 실온에서 5일 동안 교반하였다. 고체 암모늄 카보네이트를 포화를 확인하기 위한 반응 절차 동안 단편으로 첨가하였다. 혼합물을 다우엑스 50W x 8 (200 내지 400 메시로부터의 H+) 양이온 교환 수지(2.5 x 25 cm)의 칼럼 상에 적재하였다. 상기 칼럼을 물로 용리시키고, 주요 음이온이 곧바로 용리된 후, 헥소스아민 6-포스페이트가 용리되었다. 목적하는 생성물이 함유된 단편들을 모으고, 45℃ 미만에서 회전 증발기로 농축시킨 후, 동결건조시켜 생성물을 수득하였다. mp 185-187℃; 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 5.27 (d, 1H, H-1β), 4.85 (d, 1H, H-1a), 4.04 (m, 3H, H-3, H-4 & H-5), 3.50 (m, 2H, H-6), 3.23 (dd, 1H, H-2); 13C NMR (D2O, 125 MHz) δ 95.6, 91.8, 75.5, 74.0, 71.2, 69.4; 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ 3.40; MS (ESI) m/e 259.1 ([M+H]+, C6H14NO8P 259.2).
Figure 112009020170115-PCT00013
Figure 112009020170115-PCT00014
Figure 112009020170115-PCT00015
Figure 112009020170115-PCT00016
Figure 112009020170115-PCT00017
Figure 112009020170115-PCT00018
Figure 112009020170115-PCT00019
Figure 112009020170115-PCT00020
Figure 112009020170115-PCT00021
Figure 112009020170115-PCT00022
Figure 112009020170115-PCT00023
Figure 112009020170115-PCT00024
Figure 112009020170115-PCT00025
Figure 112009020170115-PCT00026
Figure 112009020170115-PCT00027
Figure 112009020170115-PCT00028
Figure 112009020170115-PCT00029
Figure 112009020170115-PCT00030
Figure 112009020170115-PCT00031
Figure 112009020170115-PCT00032
Figure 112009020170115-PCT00033
Figure 112009020170115-PCT00034
Figure 112009020170115-PCT00035
Figure 112009020170115-PCT00036
Figure 112009020170115-PCT00037
Figure 112009020170115-PCT00038
Figure 112009020170115-PCT00039
Figure 112009020170115-PCT00040
Figure 112009020170115-PCT00041
Figure 112009020170115-PCT00042
Figure 112009020170115-PCT00043
Figure 112009020170115-PCT00044
Figure 112009020170115-PCT00045
Figure 112009020170115-PCT00046
Figure 112009020170115-PCT00047
Figure 112009020170115-PCT00048
Figure 112009020170115-PCT00049
Figure 112009020170115-PCT00050
Figure 112009020170115-PCT00051
Figure 112009020170115-PCT00052
Figure 112009020170115-PCT00053
Figure 112009020170115-PCT00054
Figure 112009020170115-PCT00055
Figure 112009020170115-PCT00056
Figure 112009020170115-PCT00057
Figure 112009020170115-PCT00058
Figure 112009020170115-PCT00059
Figure 112009020170115-PCT00060
Figure 112009020170115-PCT00061
Figure 112009020170115-PCT00062
Figure 112009020170115-PCT00063
Figure 112009020170115-PCT00064
Figure 112009020170115-PCT00065
Figure 112009020170115-PCT00066
Figure 112009020170115-PCT00067
Figure 112009020170115-PCT00068
Figure 112009020170115-PCT00069
Figure 112009020170115-PCT00070
Figure 112009020170115-PCT00071
Figure 112009020170115-PCT00072
Figure 112009020170115-PCT00073
Figure 112009020170115-PCT00074
Figure 112009020170115-PCT00075
Figure 112009020170115-PCT00077
Figure 112009020170115-PCT00078
Figure 112009020170115-PCT00079
Figure 112009020170115-PCT00080
Figure 112009020170115-PCT00081
Figure 112009020170115-PCT00082
Figure 112009020170115-PCT00083
Figure 112009020170115-PCT00084
Figure 112009020170115-PCT00085
Figure 112009020170115-PCT00086
Figure 112009020170115-PCT00087
Figure 112009020170115-PCT00088
Figure 112009020170115-PCT00089
Figure 112009020170115-PCT00090
Figure 112009020170115-PCT00091
Figure 112009020170115-PCT00092
Figure 112009020170115-PCT00093
Figure 112009020170115-PCT00094
Figure 112009020170115-PCT00095
Figure 112009020170115-PCT00096
Figure 112009020170115-PCT00097
Figure 112009020170115-PCT00098
Figure 112009020170115-PCT00099
Figure 112009020170115-PCT00100
Figure 112009020170115-PCT00101
Figure 112009020170115-PCT00102
Figure 112009020170115-PCT00103
Figure 112009020170115-PCT00104
Figure 112009020170115-PCT00105
Figure 112009020170115-PCT00106
Figure 112009020170115-PCT00107
Figure 112009020170115-PCT00108
Figure 112009020170115-PCT00109
Figure 112009020170115-PCT00110
Figure 112009020170115-PCT00111
Figure 112009020170115-PCT00112
Figure 112009020170115-PCT00113
Figure 112009020170115-PCT00114
Figure 112009020170115-PCT00115
Figure 112009020170115-PCT00116
Figure 112009020170115-PCT00117
Figure 112009020170115-PCT00118
Figure 112009020170115-PCT00119
Figure 112009020170115-PCT00120
Figure 112009020170115-PCT00121
Figure 112009020170115-PCT00122
Figure 112009020170115-PCT00123
Figure 112009020170115-PCT00124
Figure 112009020170115-PCT00125
Figure 112009020170115-PCT00126
Figure 112009020170115-PCT00127
Figure 112009020170115-PCT00128
Figure 112009020170115-PCT00129
Figure 112009020170115-PCT00130
Figure 112009020170115-PCT00131
Figure 112009020170115-PCT00132
Figure 112009020170115-PCT00133
Figure 112009020170115-PCT00134
Figure 112009020170115-PCT00135
Figure 112009020170115-PCT00136
Figure 112009020170115-PCT00137
Figure 112009020170115-PCT00138
Figure 112009020170115-PCT00139
Figure 112009020170115-PCT00140
Figure 112009020170115-PCT00141
Figure 112009020170115-PCT00142
Figure 112009020170115-PCT00143
Figure 112009020170115-PCT00144
Figure 112009020170115-PCT00145
Figure 112009020170115-PCT00146
Figure 112009020170115-PCT00147
Figure 112009020170115-PCT00148
Figure 112009020170115-PCT00149
Figure 112009020170115-PCT00150
Figure 112009020170115-PCT00151
Figure 112009020170115-PCT00152
Figure 112009020170115-PCT00153
Figure 112009020170115-PCT00154
Figure 112009020170115-PCT00155
Figure 112009020170115-PCT00156
Figure 112009020170115-PCT00157
Figure 112009020170115-PCT00158
Figure 112009020170115-PCT00159
Figure 112009020170115-PCT00160
Figure 112009020170115-PCT00161
Figure 112009020170115-PCT00162
Figure 112009020170115-PCT00163
Figure 112009020170115-PCT00164
Figure 112009020170115-PCT00165
Figure 112009020170115-PCT00166
Figure 112009020170115-PCT00167
Figure 112009020170115-PCT00168
Figure 112009020170115-PCT00169
Figure 112009020170115-PCT00170
Figure 112009020170115-PCT00171
Figure 112009020170115-PCT00172
Figure 112009020170115-PCT00173
Figure 112009020170115-PCT00174
Figure 112009020170115-PCT00175
Figure 112009020170115-PCT00176
Figure 112009020170115-PCT00177
Figure 112009020170115-PCT00178
Figure 112009020170115-PCT00179
Figure 112009020170115-PCT00180
Figure 112009020170115-PCT00181
Figure 112009020170115-PCT00182
Figure 112009020170115-PCT00183
Figure 112009020170115-PCT00184
Figure 112009020170115-PCT00185
Figure 112009020170115-PCT00186
Figure 112009020170115-PCT00187
Figure 112009020170115-PCT00188
Figure 112009020170115-PCT00189
Figure 112009020170115-PCT00190
Figure 112009020170115-PCT00191
Figure 112009020170115-PCT00192
Figure 112009020170115-PCT00193
Figure 112009020170115-PCT00194
Figure 112009020170115-PCT00195
Figure 112009020170115-PCT00196
Figure 112009020170115-PCT00198
Figure 112009020170115-PCT00199
Figure 112009020170115-PCT00200
Figure 112009020170115-PCT00201
Figure 112009020170115-PCT00202
Figure 112009020170115-PCT00203
Figure 112009020170115-PCT00204
Figure 112009020170115-PCT00205
Figure 112009020170115-PCT00206
Figure 112009020170115-PCT00207
Figure 112009020170115-PCT00208
Figure 112009020170115-PCT00209
Figure 112009020170115-PCT00210
Figure 112009020170115-PCT00211
Figure 112009020170115-PCT00212
Figure 112009020170115-PCT00213
Figure 112009020170115-PCT00214
Figure 112009020170115-PCT00215
Figure 112009020170115-PCT00216
Figure 112009020170115-PCT00217
Figure 112009020170115-PCT00218
Figure 112009020170115-PCT00219
Figure 112009020170115-PCT00220
Figure 112009020170115-PCT00221
Figure 112009020170115-PCT00222
Figure 112009020170115-PCT00223
Figure 112009020170115-PCT00224
Figure 112009020170115-PCT00225
Figure 112009020170115-PCT00226
Figure 112009020170115-PCT00227
Figure 112009020170115-PCT00228
Figure 112009020170115-PCT00229
Figure 112009020170115-PCT00230
Figure 112009020170115-PCT00231
Figure 112009020170115-PCT00232
Figure 112009020170115-PCT00233
Figure 112009020170115-PCT00234
Figure 112009020170115-PCT00235
Figure 112009020170115-PCT00236
Figure 112009020170115-PCT00237
Figure 112009020170115-PCT00238
Figure 112009020170115-PCT00239
Figure 112009020170115-PCT00240
Figure 112009020170115-PCT00241
Figure 112009020170115-PCT00242
Figure 112009020170115-PCT00243
Figure 112009020170115-PCT00244
Figure 112009020170115-PCT00245
Figure 112009020170115-PCT00246
Figure 112009020170115-PCT00247
Figure 112009020170115-PCT00248
Figure 112009020170115-PCT00249
Figure 112009020170115-PCT00250
Figure 112009020170115-PCT00251
Figure 112009020170115-PCT00252
Figure 112009020170115-PCT00253
Figure 112009020170115-PCT00254
Figure 112009020170115-PCT00255
Figure 112009020170115-PCT00256
Figure 112009020170115-PCT00257
Figure 112009020170115-PCT00258
Figure 112009020170115-PCT00259
Figure 112009020170115-PCT00260
Figure 112009020170115-PCT00261
Figure 112009020170115-PCT00262
Figure 112009020170115-PCT00263
Figure 112009020170115-PCT00264
Figure 112009020170115-PCT00265
Figure 112009020170115-PCT00266
Figure 112009020170115-PCT00267
Figure 112009020170115-PCT00268
Figure 112009020170115-PCT00269
Figure 112009020170115-PCT00270
Figure 112009020170115-PCT00271
Figure 112009020170115-PCT00272
Figure 112009020170115-PCT00273
Figure 112009020170115-PCT00274
Figure 112009020170115-PCT00275
Figure 112009020170115-PCT00276
Figure 112009020170115-PCT00277
Figure 112009020170115-PCT00278
Figure 112009020170115-PCT00279
Figure 112009020170115-PCT00280
Figure 112009020170115-PCT00281
Figure 112009020170115-PCT00282
Figure 112009020170115-PCT00283
Figure 112009020170115-PCT00284
Figure 112009020170115-PCT00285
Figure 112009020170115-PCT00286
Figure 112009020170115-PCT00287
Figure 112009020170115-PCT00288
Figure 112009020170115-PCT00289
Figure 112009020170115-PCT00290
Figure 112009020170115-PCT00291
Figure 112009020170115-PCT00292
Figure 112009020170115-PCT00293
Figure 112009020170115-PCT00294
Figure 112009020170115-PCT00295
Figure 112009020170115-PCT00296
Figure 112009020170115-PCT00297
Figure 112009020170115-PCT00298
Figure 112009020170115-PCT00299
Figure 112009020170115-PCT00300
Figure 112009020170115-PCT00301
Figure 112009020170115-PCT00302
Figure 112009020170115-PCT00303
Figure 112009020170115-PCT00304
Figure 112009020170115-PCT00305
앞서 개시된 방법 및 조성물은 달라질 수도 있는 것으로 설명된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약에 국한되지 않는다는 것으로 이해된다. 또한 본 발명에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 설명할 목적으로 제공된 것이며, 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않았음이 인지되어야 한다.
본 발명에서 사용되는 것과 같이, 그리고 첨부된 청구의 범위에서 단수 형태로 지칭되는 용어들은 문맥에서 분명하게 달리 언급되지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 따라서 예컨대 "라이보스위치"에 대한 언급은 복수의 라이보스위치를 포함하고, "라이보스위치들"에 대한 언급은 하나 이상의 라이보스위치 및 당해 분야의 숙련자들에게 공지되는 이들의 동등물에 대한 언급이다.
"임의의" 또는 "임의적으로"는 계속해서 설명되는 사건, 상황, 또는 물질이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있으면 존재할 수 있음을 의미하고, 이러한 설명은 사건, 상황, 또는 물질이 일어나거나 존재하는 경우와 그 것들이 일어나지 않거나 존재하지 않는 경우를 포함한다.
범위는 "약"으로 수식된 한 특정 값으로부터, 및/또는 "약"으로 수식된 다른 하나의 특정 값으로서 표현될 수 있다. 그런 범위가 표시될 때, 또한 구체적으로 고려되고 간주될 때, 개시되는 것은 문맥이 구체적으로 다른 것을 표시하지 않는 한 한 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값에 걸쳐 있다. 유사하게, 값들이 값 앞에 "약"을 사용하여 대략적으로 표시될 때, 특정 값은 문맥이 구체적으로 다른 것을 나타내지 않는 한 개시된 것으로 간주되어야 하는 구체적이고 다르게 고려되는 실시양태를 형성한다는 것으로 이해될 것이다. 더욱이, 각 범위의 종점은 문맥이 구체적으로 다른 것을 나타내지 않는 한 다른 종점과의 관계에서, 그리고 다른 종점과 무관한 경우에도 모두 중요한 것으로 이해될 것이다. 결국, 분명하게 개시된 범위 내에 있는 개별적인 모든 값과 값들의 하위-범위는 또한 문맥이 구체적으로 다른 것을 나타내지 않는 한 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 한다. 전술한 것은 특별한 경우에 일부의 또는 전부의 이들 실시양태가 분명하게 개시되는 지의 여부와 관계없이 적용된다.
달리 규정되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 개시된 방법 및 조성물이 속하는 당해 분야의 숙련자들에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있긴 하지만, 특별히 유용한 방법, 장치, 및 물질은 기술된 것과 같다. 본 발명에서 인용되는 공보 및 공보에서 인용하고 있는 물질은 본 발명에 참조로 삽입된다. 본 발명에는 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시내용보다 앞섰다고 말할 수 없는 것으로 인정받을 만한 것으로 해석할 것이 없다. 임의의 참고문헌이 선행 기술을 구성한다고 허락받지 않았다. 참고문헌의 논의는 그 문헌들의 저자가 주장한 것을 진술한 것이고, 본 출원인은 인용된 문헌들의 정확성과 적절성에 도전할 권리를 유보하였다. 많은 공보물이 본 발명에서 언급되지만, 이러한 참고 문헌은 이들 문헌 중 어느 것도 당해 분야의 공통적인 일반적 지식의 부분을 형성한다는 승인을 얻지는 않았다.
본 명세서의 설명 및 청구의 범위 전체를 통해, 단어 "포함한다"와 그 단어를 변용한 것, 예컨대 "포함하는"과 "포함"은 "포함하지만 이들에 국한되지는 않는" 것을 의미하고, 예컨대 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않았다.
당해 분야의 숙련자들은 기본적인 실험만을 사용하여도 본원에 개시된 방법 및 조성물의 구체적인 실시양태에 대한 많은 동등물이 있음을 인지하거나 확신할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 첨부되는 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
참고문헌
Figure 112009020170115-PCT00306

Claims (59)

  1. (a) 글루코사민-6-포스페이트가 아닌 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 생리학적으로 가수분해 가능한 또는 허용 가능한 에스터, 또는 둘 다를, glmS 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 세포는 glmS 라이보스위치에 결합함으로써 상기 유전자의 발현을 억제하는, 방법:
    화학식 I
    Figure 112009020170115-PCT00307
    상기 식에서,
    R1은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
    R2는 NH-R6이고, 이때 R6은 H, CH3, C2H5, n-프로필, C(O)CH3, C(O)C2H5, C(O)n-프로필, C(O)아이소-프로필, C(O)OCH3, C(O)OC2H5, C(O)NH2 또는 NH2이고,
    R3은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
    R4는 수소 결합 공여체이고,
    R5는 수소 결합 수용체이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R4가 OH, SH, NH2, NH3 +, CH2OH, CH(OH)CH3, CH2CH2OH, CH2SH, CH(SH)CH3, CH2CH2SH, CH2NH2, CH(NH2)CH3, CH2CH2NH3, CO2H, CONH2, CONH알킬, =NH, =NOH, =NSH, =NCO2H, =CH2, CH=NH, CH=NOH, CH=NSH, CH=NCO2H, OCH2OH, OCH2CH2OH, PhOH, NH알킬, NHNH2, NHNH알킬, NHCO알킬, NHCO2알킬, NHCONH2, NHSO2알킬 또는 NHO알킬인, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    R1이 H 또는 OH이고 R2가 NH2 또는 NHCH3인 경우, R4가 OH가 아닌, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 OP(O)(OH)2, OP(S)(OH)2, OP(O)OHSH, OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 음으로 하전되어 있는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 =O, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, 이때 R9가 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 =O, OH, OR9, COR9, CN, NO2, 테트라졸, SOR9, N(R9)2, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, 이때 R9가 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R4가 NH2, NH3 +, OH, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R4가 NH2, NH3 +, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 유전자 발현의 억제를 필요로 하는 세포로서 확인된 것인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 박테리아 세포인, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 박테리아 세포를 사멸시키거나 박테리아 세포의 생장을 억제하는, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물을 개체(subject)에게 투여함으로써 상기 화합물을 상기 세포와 접촉시키는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    화합물이 글루코사민-6-포스페이트를 기질로서 사용하는 개체의 효소에 대한 기질이 아닌, 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    화합물이 글루코사민-6-포스페이트를 변경시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아닌, 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 글루코사민-6-포스페이트를 물질대사시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아닌, 방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 글루코사민-6-포스페이트를 이화시키는 개체의 효소에 대한 기질이 아닌, 방법.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 개체 내의 박테리아 세포이고, 화합물이 상기 박테리아 세포를 사멸시키거나 박테리아 세포의 생장을 억제하는, 방법.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 박테리아로 감염되어 있는, 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 glmS 라이보스위치를 함유하는, 방법.
  22. 제 12 항, 제 13 항 및 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아가 바실루스(Bacillus) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)인, 방법.
  23. 제 14 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 또 다른 항미생물 화합물과 조합 투여되는, 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물이 바이오필름 내의 박테리아 생장을 억제하는, 방법.
  25. 글루코사민-6-포스페이트가 아닌 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 생리학적으로 가수분해 가능한 또는 허용 가능한 에스터, 또는 둘 다:
    화학식 I
    Figure 112009020170115-PCT00308
    상기 식에서,
    R1은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
    R2는 NH-R6이고, 이때 R6은 H, CH3, C2H5, n-프로필, C(O)CH3, C(O)C2H5, C(O)n-프로필, C(O)아이소-프로필, C(O)OCH3, C(O)OC2H5, C(O)NH2 또는 NH2이고,
    R3은 H, OH, SH, NH2 또는 CH3이고,
    R4는 수소 결합 공여체이고,
    R5는 수소 결합 수용체이다.
  26. 제 25 항에 있어서,
    R4가 OH, SH, NH2, NH3 +, CH2OH, CH(OH)CH3, CH2CH2OH, CH2SH, CH(SH)CH3, CH2CH2SH, CH2NH2, CH(NH2)CH3, CH2CH2NH3, CO2H, CONH2, CONH알킬, =NH, =NOH, =NSH, =NCO2H, =CH2, CH=NH, CH=NOH, CH=NSH, CH=NCO2H, OCH2OH, OCH2CH2OH, PhOH, NH알킬, NHNH2, NHNH알킬, NHCO알킬, NHCO2알킬, NHCONH2, NHSO2알킬 또는 NHO알킬인, 화합물.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    R1이 H 또는 OH이고 R2가 NH2 또는 NHCH3인 경우, R4가 OH가 아닌, 화합물.
  28. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 OP(O)(OH)2, OP(S)(OH)2, OP(O)OHSH, OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인, 화합물.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 OS(O)2OH 또는 OS(O)2SH인, 화합물.
  30. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 음으로 하전되어 있는, 화합물.
  31. 제 25 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 =O, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, 이때 R9는 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인, 화합물.
  32. 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R5가 =O, OH, OR9, COR9, CN, NO2, 테트라졸, SOR9, N(R9)2, CO2R9, OCO2R9, OCH2OR9, OC2H5OR9, OCH2CH2OH, OCONHR9, OCON(R9)2, CONHR9, CON(R9)2, CONHCH3OCH3, CONHSO2OH, CONHSO2R9, SO2R9, SO3H, SO2NHR9, SO2N(R9)2, PO(R9)2, PO2(R9)2, PO(OR9)2, PO2(OH)R9, PO2R9N(R9)2, NHCH(NR9)2, NHCOR9, NHCO2R9, NHCONHR9, NHCON(R9)2, NHCONHR9, N(COR9)2, N(CO2R9)2, NHSO2R9, NR9SO2R9, NHSO2NHR9, NR9SO2NH2, NHPO(R9)2, NR9PO(R9)2, NHPO2OR9 또는 B(OH2)2이고, 이때 R9가 -H, -CH3, -C2H5, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)3CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2(CH3), -C(CH3)3 또는 -CF3인, 화합물.
  33. 제 25 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R4가 NH2, NH3 +, OH, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인, 화합물.
  34. 제 25 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R4가 NH2, NH3 +, SH, NOH, NHNH2, NHNH3 +, CO2H, SO2OH, B(OH)2 또는 이미다졸륨인, 화합물.
  35. 제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    glmS 라이보스위치에 결합하는 화합물.
  36. 제 25 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    glmS 라이보스위치를 활성화하는 화합물.
  37. 제 25 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    glmS 라이보스위치에 결합하는 화합물.
  38. 제 25 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 화합물, 및
    암호화 영역에 작동 가능하게 연결된 glmS 라이보스위치를 포함하는 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조절 가능한 유전자 발현 구축물(construct)을 포함하는 조성물로서, 이때 glmS 라이보스위치가 RNA의 발현을 조절하고, glmS 라이보스위치 및 암호화 영역이 이종성을 나타내는, 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서,
    glmS 라이보스위치가 화합물에 의해 활성화된 경우 신호를 생성하는, 조성물.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서,
    라이보스위치가 화합물에 의해 활성화된 경우 입체구조를 변화시키고, 이때 입체구조의 변화가 입체구조 의존성 표지를 통해 신호를 생성하는, 조성물.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    라이보스위치가 화합물에 의해 활성화된 경우 입체구조를 변화시키고, 이때 입체구조의 변화가 라이보스위치에 연결된 암호화 영역의 발현에서의 변화를 일으키며, 상기 발현에서의 변화가 신호를 생성하는, 조성물.
  42. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호가 라이보스위치에 연결된 암호화 영역으로부터 발현된 리포터(reporter) 단백질에 의해 생성되는, 조성물.
  43. (a) glmS 라이보스위치를 통해 일어나는, glmS 라이보스위치가 포함된 RNA를 암호화하는 유전자의 유전자 발현의 억제에 대해 제 25 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항의 화합물을 시험하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 유전자 발현을 억제하는 화합물을, glmS 라이보스위치가 포함된 RNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포와 접촉시켜 유전자 발현을 억제하는 단계
    를 포함하는 방법으로서, 이때 상기 화합물은 glmS 라이보스위치에 결합함으로써 상기 유전자의 발현을 억제하는, 방법.
  44. 표 2에 열거된 원자 배위를 포함하는 원자 구조를 포함하는, 천연 glmS-반응성 라이보스위치의 원자 구조.
  45. 결합 포켓 원자 구조를 포함하는 원자 구조를 포함하는, 천연 glmS-반응성 라이보스위치의 원자 구조.
  46. (a) 제 44 항 또는 제 45 항의 원자 구조를 시험 화합물로 모델링하는 단계; 및
    (b) 상기 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 단계
    를 포함하는, 라이보스위치와 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    단계 (b)가 라이보스위치 모델에서 시험 화합물에 대한, 예상된 최소 상호작용 에너지, 예상된 결합 상수, 예상된 해리 상수 또는 이들의 조합을 측정함을 포함하는, 방법.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
    단계 (b)가 라이보스위치 모델로 시험 화합물의 하나 이상의 예상된 결합, 하나 이상의 예상된 상호작용 또는 이들의 조합을 측정함을 포함하는, 방법.
  49. 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)에서 원자적 접촉을 측정하여 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    (c) 시험 화합물의 유사체를 확인하는 단계; 및
    (d) 시험 화합물의 유사체가 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제 50 항의 방법에 의해 확인된 유사체를 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하는, 박테리아를 사멸시키거나 박테리아의 생장을 억제하는 방법.
  52. 제 46 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 화합물을 박테리아와 접촉시키는 단계를 포함하는, 박테리아를 사멸시키거나 박테리아의 생장을 억제하는 방법.
  53. 제 46 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    겔-기초 분석을 이용하여 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 방법.
  54. 제 46 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    칩(chip)-기초 분석을 이용하여 시험 화합물이 라이보스위치와 상호작용하는 지를 확인하는 방법.
  55. 제 46 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시험 화합물이 반데르발스 상호작용, 수소 결합, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 상호작용하는, 방법.
  56. 제 46 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    라이보스위치가 RNA 절단 리보자임을 포함하는, 방법.
  57. 제 46 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    켄칭(quenching) 부분을 포함하는 핵산이 절단된 경우 형광 신호가 생성되는, 방법.
  58. 제 46 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분자 비콘 기술(molecular beacon technology)을 이용하여 형광 신호를 생성하는 방법.
  59. 제 46 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    고출력 스크린을 사용하여 실시하는 방법.
KR1020097006868A 2006-09-06 2007-09-06 Ｇｌｍｓ 라이보스위치, ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용한 구조-기초 화합물 디자인, 및 ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용하는 방법 및 조성물 KR20090073131A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84287006P 2006-09-06 2006-09-06
US60/842,870 2006-09-06
US84484406P 2006-09-16 2006-09-16
US60/844,844 2006-09-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20090073131A true KR20090073131A (ko) 2009-07-02

Family

ID=39536867

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097006868A KR20090073131A (ko) 2006-09-06 2007-09-06 Ｇｌｍｓ 라이보스위치, ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용한 구조-기초 화합물 디자인, 및 ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용하는 방법 및 조성물

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20100324123A1 (ko)
EP (1) EP2061480A4 (ko)
JP (1) JP2010503619A (ko)
KR (1) KR20090073131A (ko)
AU (1) AU2007334618A1 (ko)
CA (1) CA2662506A1 (ko)
MX (1) MX2009002402A (ko)
SG (1) SG175549A1 (ko)
WO (1) WO2008076156A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004027035A2 (en) 2002-09-20 2004-04-01 Yale University Riboswitches, methods for their use, and compositions for use with riboswitches.
WO2007100412A2 (en) 2005-12-21 2007-09-07 Yale University Methods and compositions related to the modulation of riboswitches
CN107760643B (zh) * 2017-11-15 2020-10-09 江南大学 一种提高枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007100412A2 (en) * 2005-12-21 2007-09-07 Yale University Methods and compositions related to the modulation of riboswitches

Also Published As

Publication number Publication date
SG175549A1 (en) 2011-11-28
EP2061480A4 (en) 2011-07-13
CA2662506A1 (en) 2008-06-26
WO2008076156A2 (en) 2008-06-26
MX2009002402A (es) 2009-04-02
AU2007334618A1 (en) 2008-06-26
JP2010503619A (ja) 2010-02-04
WO2008076156A3 (en) 2009-04-16
US20100324123A1 (en) 2010-12-23
EP2061480A2 (en) 2009-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2012065661A (ja) リボスイッチ、リボスイッチによる、構造を基礎とする化合物設計、ならびにリボスイッチの使用方法およびリボスイッチを伴う組成物
Guan et al. Recent advances in developing small molecules targeting RNA
Zhang et al. Ribozymes and riboswitches: modulation of RNA function by small molecules
Wang et al. Binding of neomycin to the TAR element of HIV-1 RNA induces dissociation of Tat protein by an allosteric mechanism
KR20100017905A (ko) 리보스위치, 리보스위치의 사용 방법 및 리보스위치를 함유하는 조성물
JP2017527277A (ja) 修飾オリゴヌクレオチドおよびそれらの合成のための方法
JP2012183068A (ja) リボスイッチ、その使用方法、ならびにリボスイッチとともに用いるための組成物
US20130143955A1 (en) Cyclic di-GMP-II Riboswitches, Motifs, and Compounds, and Methods for Their Use
Onizuka et al. Short interfering RNA guide strand modifiers from computational screening
Fei et al. Phosphatase-inert glucosamine 6-phosphate mimics serve as actuators of the glmS riboswitch
Brooks et al. Rapid steps in the glmS ribozyme catalytic pathway: cation and ligand requirements
US20130012527A1 (en) Preq1 riboswitches and methods and compositions for use of and with preq1 riboswitches
AU2005294211B2 (en) Glycine riboswitches, methods for their use, and compositions for use with glycine riboswitches
Jones et al. Calculations of p K a values for a series of naturally occurring modified nucleobases
SG182365A1 (en) Structured rna motifs and compounds and methods for their use
Yamada et al. Structurally constrained phosphonate internucleotide linkage impacts oligonucleotide-enzyme interaction, and modulates siRNA activity and allele specificity
KR20090073131A (ko) Ｇｌｍｓ 라이보스위치, ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용한 구조-기초 화합물 디자인, 및 ｇｌｍｓ 라이보스위치를 사용하는 방법 및 조성물
US20120107331A1 (en) Gemm riboswitches, structure-based compound design with gemm riboswitches, and methods and compositions for use of and with gemm riboswitches
Mlotkowski et al. Calculated p K a values for a series of Aza-and Deaza-modified nucleobases
JP2010502752A (ja) リシンリボスイッチ、リシンリボスイッチを用いた構造に基づく化合物設計、ならびにリシンリボスイッチを用いた使用のための方法および組成物
Seitz et al. Atomic Mutagenesis of N 6-Methyladenosine Reveals Distinct Recognition Modes by Human m6A Reader and Eraser Proteins
Liu et al. Recent Development of Glucosamine‐6‐phosphate Derivatives as Potential Antibacterial Agents
Silkenath et al. Phosphonate and Thiasugar Analogues of Glucosamine-6-phosphate: Activation of the glmS Riboswitch and Antibiotic Activity
Class et al. Patent application title: RIBOSWITCHES AND METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE OF AND WITH RIBOSWITCHES Inventors: Ronald R. Breaker (Guilford, CT, US) Zasha Weinberg (New Haven, CT, US) Narasimhan Sudarsan (New Haven, CT, US) Narasimhan Sudarsan (New Haven, CT, US) Joy Xin Wang (New Haven, CT, US) Michelle M. Meyer (Hamden, CT, US) Adam Roth (Guilford, CT, US) Elizabeth E. Regulski (Novi, MI, US) Assignees: YALE UNIVERSITY

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application