KR20100017893A - 택일적 스플라이싱 및 ｒｎａ 프로세싱을 조절하는 리보스위치와 관련된 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

택일적 스플라이싱(alternative splicing)을 조절하는 리보스위치(riboswitch)와 관련된 방법 및 조성물이 개시되어 있다.

Description

택일적 스플라이싱 및 ＲＮＡ 프로세싱을 조절하는 리보스위치와 관련된 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO RIBOSWITCHES THAT CONTROL ALTERNATIVE SPLICING AND RNA PROCESSING}

개시된 본 발명은 일반적으로 유전자 발현 분야, 구체적으로 유전자 발현의 조절 분야에 관한 것이다.

관련된 출원의 상호-참조

본원은 2007년 5월 29일자로 출원된 미국 가출원 제60/932,164호를 우선권 주장한다. 상기 가출원은 전체가 본원에 참고로 도입된다.

연방정부 지원 연구에 관한 선언

본 발명은 미국국립보건원(NIH)에 의해 부여된 승인번호 GM 068819, GM 07223 및 DK 070270 하 및 미국국립과학재단(NSF)에 의해 부여된 승인번호 MCB-0236210 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.

배경기술

정확한 유전적 조절은 생체 시스템의 본질적인 특징인데, 이는 세포가 유전적 발현 패턴을 변화시켜 무수한 생화학적 신호 및 환경적 신호에 반응해야 하기 때문이다. 유전적 조절의 대부분의 공지된 기작(mechanism)은 화학적 또는 물리적 자극을 감지한 후 관련 DNA 또는 전령 RNA(messenger RNA; mRNA) 서열과 선별적으로 상호작용함으로써 유전자 발현을 조절하는 단백질 인자들의 사용을 수반한다. 단백질은 복잡한 형태를 채택할 수 있고 생체 시스템이 그의 화학적 환경 및 물리적 환경을 정확히 감지하게 하는 다양한 기능을 수행할 수 있다. 대사물질(metabolite)에 반응하는 단백질 인자는 전형적으로 DNA에 결합하여 전사 개시를 조절하는 작용을 하거나(예를 들어, lac 억제자(represser) 단백질; 문헌[Matthews, K.S., and Nichols, J.C., 1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164]), 또는 RNA에 결합하여 전사 종결(예를 들어, PyrR 단백질; 문헌[Switzer, R.L., et al., 1999, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367]) 또는 번역(예를 들어, TRAP 단백질; 문헌[Babitzke, P., and Gollnick, P., 2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802])을 조절하는 작용을 한다. 단백질 인자는 알로스테릭(allosteric) 조절 또는 번역 후(post-translational) 변경과 같은 다양한 기작에 의해 환경적 자극에 반응하고 상기 기작들을 활용하는 데 능통하여 고도의 반응성 유전적 스위치로서 작용한다(예를 들어, 문헌[Ptashne, M., and Gann, A. (2002). Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조).

유전적 조절에 있어서 단백질 인자의 광범위한 참여 이외에, RNA도 유전적 조절에 있어서 능동적인 역할을 수행할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 최근 연구는 파괴할 mRNA를 선별적으로 표적화하여 유전자 발현을 하향-조절하는 데 있어서 작은 비-코딩 RNA가 수행하는 실질적인 역할을 밝혀내기 시작하였다(예를 들어, 문헌[Hannon, G.J. 2002, Nature 418, 244-251] 및 이 문헌에서 언급된 참고문헌 참조). 이러한 RNA 간섭 과정은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 원하는 mRNA 표적을 선별적으로 인식하는 짧은 RNA의 능력의 이점을 이용하는데, 상기 인식 후 결합된 mRNA는 단백질의 작용에 의해 파괴된다. RNA는 이 시스템에서 분자 인식을 위한 이상적인 물질인데, 이는 신규하되 고도로 특이적인 RNA 결합 부위를 갖는 단백질 인자를 생성하는 것보다는 진화적 과정을 통해 신규한 표적-특이적 RNA 인자를 생성하는 것이 훨씬 더 용이하기 때문이다.

단백질이 효소, 수용체 및 구조적 기능에 대해 생물학적 면에서 요구되는 대부분의 요건을 충족시키지만, RNA 또한 이러한 능력들을 가질 수 있다. 예를 들어, RNA는 상당한 효소적 능력 및 정확한 분자 인식을 보이는 다수의 리보자임 도메인(문헌[Cech and Golden, Building a catalytic active site using only RNA. In: The RNA World R. F. Gesteland, T. R. Cech, J. F. Atkins, eds., pp.321-350 (1998); Breaker, In vitro selection of catalytic polynucleotides. Chem. Rev. 97, 371-390 (1997)]) 및 수용체 도메인(문헌[Osborne and Ellington, Nucleic acid selection and the challenge of combinatorial chemistry. Chem. Rev. 97, 349-370 (1997); Hermann and Patel, Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 287, 820-825 (2000)])을 형성하기에 충분한 구조적 유연성을 갖는다. 나아가, 이 활성들은 조합되어 효과기(effector) 분자에 의해 선별적으로 조절되는 알로스테릭 리보자임을 생성할 수 있다(문헌[Soukup and Breaker, Engineering precision RNA molecular switches. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3584-3589 (1999); Seetharaman et al, Immobilized riboswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures. Nature Biotechnol. 19, 336-341 (2001)]).

택일적 스플라이싱(alternative splicing)은 mRNA 전구체 상의 스플라이스 부위의 선별적 사용을 수반하는 과정이다. 택일적 스플라이싱은 단일 유전자로부터 많은 단백질이 생산될 수 있게 함으로써 상이한 기능을 갖는 단백질의 생성을 가능하게 한다. 택일적 스플라이싱은 엑손 스킵핑(exon skipping), 상호 배타적 엑손의 사용 및 5' 및/또는 3' 스플라이스 부위의 차등적 선별을 포함하는 다양한 방법을 통해 일어날 수 있다. 많은 유전자들(예를 들어, 호메오진(homeogene), 온코진(oncogene), 뉴로펩티드, 세포외 매트릭스 단백질, 근육 수축 단백질)의 경우, 택일적 스플라이싱은 발생학적 또는 조직-특이적 방식으로 조절된다. 따라서, 택일적 스플라이싱은 유전자 발현에 있어서 결정적인 역할을 수행한다. 최근 연구는 복잡한 유기체의 발현 방식에 있어서 택일적 스플라이싱의 중요성을 밝혀내었다.

mRNA 전구체(전구-mRNA)의 택일적 스플라이싱은 포유동물 유전자 발현의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 택일적 스플라이싱의 조절은 다양한 계통의 세포 내에서 일어나고 다수의 유전자의 발현 프로그램의 일부이다. 최근에, 택일적 스플라이싱이 종종 완전히 상이한 기능을 갖는 단백질 아이소폼(isoform)의 생 성을 조절함이 명백해졌다. 세포 형질전환에 대해 상이하고 종종 길항적인 성질을 나타내는 온코진 및 프로토-온코진 단백질 아이소폼은 택일적 스플라이싱을 통해 생성된다. 이러한 종류의 예는 문헌[Makela, T. P. et al. 1992, Science 256:373; Yen, J. et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5077; Mumberg, D. et al. 1991, Genes Dev. 5:1212; Foulkes, N. S. and Sassone-Corsi, P. 1992, Cell 68:411]에서 발견된다. 또한, 택일적 스플라이싱은 종종 계획된(programmed) 세포 사멸에 관여하는 단백질, 예컨대, Fas, Bcl-2, Bax 및 Ced-4의 생성을 조절하는 데 사용된다(문헌[Jiang, Z. H. and Wu J. Y., 1999, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 220: 64]). 전구-mRNA의 택일적 스플라이싱은 억제자 단백질을 생성할 수 있지만, 활성화제는 상이한 조건 하에서 동일한 전구-mRNA로부터 생성될 수도 있다(문헌[Black D. L. 2000, Cell 103:367; Graveley, B. R. 2001, Trends Genet. 17:100]). 당업계에서 요구되는 것은 리보스위치(riboswitch)를 통해 택일적 스플라이싱을 조절하는 데 사용될 수 있는 방법 및 조성물이다.

발명의 개요

본 명세서에는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조절가능한 유전자 발현 구축물이 개시되어 있는데, 상기 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 조절하고, 상기 리보스위치 및 상기 코딩 영역은 이종(heterologous) 영역이며, 상기 스플라이싱의 조절은 RNA의 프로세싱에 영향을 미친다. 상기 리보스위치는 상기 RNA의 택일적 스플라이싱을 조절 할 수 있다. 상기 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼(platform) 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인은 이종 도메인이다. 상기 RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 3' 비번역된 영역(untranslated region; UTR) 내에 존재할 수 있다. 인트론은 RNA의 3' UTR 내에 존재할 수 있다. RNA 프로세싱 부위는 인트론 내에 존재할 수 있다. 인트론의 스플라이싱은 RNA로부터 RNA 프로세싱 부위를 제거하여 RNA의 프로세싱에 영향을 미칠 수 있다. RNA의 프로세싱에 대한 영향은 RNA 프로세싱 부위에 의해 매개된 RNA의 프로세싱의 배제를 포함할 수 있다. RNA 프로세싱에 대한 영향은 전사 종결에서의 변경을 포함할 수 있다. RNA 프로세싱에 대한 영향은 RNA의 퇴화의 증가를 포함할 수 있다. RNA 프로세싱에 대한 영향은 RNA의 턴오버(turnover)의 증가를 포함할 수 있다. 리보스위치는 인트론의 3' 스플라이스 접합부(splice junction)에 중첩될 수 있다. 인트론의 스플라이싱은 활성화될 리보스위치의 능력을 감소시키거나 배제할 수 있다. 스플라이스 접합부는 5' 스플라이스 접합부일 수 있다. 리보스위치는 RNA의 인트론 내에 존재할 수 있다. 또한, RNA 프로세싱은 스플라이싱에의 관련과 무관하게 또는 스플라이싱에의 관련 없이 조절되거나 영향을 받을 수 있다.

발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에 스플라이스 접합부를 포함할 수 있다. 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론의 말단에서 스플라이스 접합부(즉, 5' 스플라이스 접합부 또는 3' 스플라이스 접합부)를 포함할 수 있다. RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에 분지 부위를 포함한다. 스플라이스 접합부는 리보스위치가 활성화될 때 활성 상태일 수 있다. 스플라이스 접합부는 리보스위치가 활성화되지 않을 때 활성 상태일 수 있다. 리보스위치는 티아민 피로포스페이트(TPP)와 같은 유발 분자에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 억제할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경할 수 있다. 상기 RNA는 분지된 구조를 가질 수 있다. 상기 RNA는 전구-mRNA일 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P4 및 P5 줄기(stem) 내에 위치할 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프(loop) 5 내에서도 발견될 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P2 줄기 내에서도 발견될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 발현 플랫폼 도메인은 P4 서열 및 P5 서열, 루프 5 서열 및/또는 P2 서열과 상호작용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 앱타머 서열은 유발 분자가 앱타머 도메인에 결합되지 않은 경우에만 발현 플랫폼 도메인과의 상호작용에 이용될 수 있다. 스플라이스 부위 및/또는 분지 부위는 예를 들어, 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -130 내지 -160의 위치에 위치할 수 있다. RNA는 제2 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 제2 인트론의 3' 스플라이스 부위는 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -220 내지 -270의 위치에 위치한다.

또한, 본 명세서에는 리보스위치를 포함하는 구축물을 RNA 내로 도입하는 단계를 포함하는 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는 방법이 개시되어 있는데, 이때 상기 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있고, 상기 RNA는 인트론을 포함하 고, 상기 스플라이싱의 조절이 RNA의 프로세싱에 영향을 미친다. 상기 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있고, 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인은 이종 도메인이다. 리보스위치는 RNA의 인트론 내에 존재할 수 있다. 리보스위치는 TPP와 같은 유발 분자에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 억제할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경할 수 있다. 스플라이싱은 비-천연적으로 발생할 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프 5 내에서 발견될 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P2 줄기 내에서도 발견될 수 있다. 스플라이스 부위는 예를 들어, 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -130 내지 -160의 위치에 위치할 수 있다. 구축물은 인트론을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 명세서에는 (a) 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 구축물을 포함하는 세포와 (b) 효과량의 상기 리보스위치용 유발 분자를 접촉시켜 유전자 발현에 영향을 미치는 단계를 포함하는 유전자 발현에 영향을 미치는 방법이 개시되어 있는데, 이때 상기 리보스위치가 RNA의 스플라이싱을 조절하고, 상기 리보스위치 및 상기 코딩 영역이 이종 영역이며, 상기 스플라이싱의 조절이 RNA의 프로세싱에 영향을 미친다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 유발 분자는 티아민 또는 TPP일 수 있다.

개시된 방법 및 조성물의 추가 이점은 부분적으로는 하기 상세한 설명에 기 재될 것이고 부분적으로는 상세한 설명으로부터 이해되거나 또는 개시된 방법 및 조성물의 실시를 통해 인식될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물의 이점은 첨부된 청구의 범위에서 구체적으로 언급되어 있는 요소 및 조합을 통해 인식되고 달성될 것이다. 상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 예시 및 설명을 위한 것일 뿐 청구된 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.

본 명세서에 도입되어 있고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 방법 및 조성물의 여러 실시양태를 예시하고 본 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 방법 및 조성물의 원리를 설명하기 위한 것이다.

도 1은 TPP 앱타머가 식물 종에 보존되고 널리 퍼져있음을 보여준다. 도 1a는 다양한 식물 종으로부터의 TPP 앱타머 서열의 정렬이 고도로 보존된 서열 및 구조를 나타냄을 보여준다. 줄기 P1 내지 P5를 형성하는 뉴클레오티드는 상이한 음영으로 두드러지게 표시되었고 별표는 모든 예들 사이에 보존된 뉴클레오티드를 동정하는 것이다. 서열은 다음으로부터 유래되었다: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(Ath, NC003071; 서열번호 1), 브라시카 사티바(Brassica sativa)(Bsa, EF588038; 서열번호 2), 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea)(Bol, BH250462, 서열번호 3), 보에케라 스트릭타(Boechera stricta)(Bst, DU681973; 서열번호 4), 카리카 파파야(Carica papaya)(Cpa, DX471004; 서열번호 5), 시트루스 시넨시스(Citrus sinesis)(Csi, DY305604; 서열 번호 6), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)(Nta, EF588039; 서열번호 7), 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)(Nbe, EF588040; 서열번호 8), 포풀루스 트리코카파(Populus trichocarpa)(Ptr, JGI, 포풀루스 게놈, LG_IX: 7897690-7897807; 서열번호 9), 로투스 자포니쿠스(Lotus japonicus)(Lja, AG247551; 서열번호 10), 라이코퍼시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)(Les, EF588041; 서열번호 11), 솔라눔 투버로숨(Solanum tuberosum)((Stu, DN941010; 서열번호 12), 오시뭄 바실리쿰(Ocimum basilicum)(Oba, EF588042; 서열번호 13), 이포모에아 닐(Ipomoea nil)(Ini, BJ566897; 서열번호 14), 비티스 비니페라(Vitis vinifera)(Vvi, AM442795; 서열번호 15), 오리자 사티바(Oryza sativa)(Osa, NC008396; 서열번호 16), 포아 세쿤다(Poa secunda)(Pse, AF264021; 서열번호 17), 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)(Tae, CD879967; 서열번호 18), 호데움 불가레(Hordeum vulgare)(Hvu, BM374959; 서열번호 19), 소굼 비콜로(Sorghum bicolor)(Sbi, CW250951; 서열번호 20), 피누스 타에다(Pinus taeda)(Pta, CCGB, Contig116729 RTDS2_8_E12.g1_A021: 551-686; 서열번호 21), 및 파이스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)(Ppa, gnl｜ti｜856901678(서열번호 22), gnl｜ti｜893553357(서열번호 23), gnl｜ti｜876297717(서열번호 24)(Lang et al., 2005). 이포모에아 닐에 대한 서열은 cDNA로부터 유래된 스플라이스 변이체를 나타내고 따라서 앱타머의 5' 말단이 없다. 이들 서열에 대한 좌측 P1 서열은 GCGCC인 Ppa2 서열 및 Ini 서열을 제외하고는 GCACC이다. 이들 서열에 대한 우측 P1 서열은 GAGUGC인 Lja 서열 및 GCGUGC인 Les 서열을 제외하고는 GUGUGC이다. 도 1b 및 1c 는 식물(도 1b; 서열번호 25 및 26) 또는 세균 및 고세균 종(도 1c; 서열번호 27 내지 29)으로부터 유래된 모든 대표종에 기초한 TPP 리보스위치 앱타머의 공통 서열(consensus sequence) 및 2차 구조 모델은 유사하다. 상호 정보는 상자표시 내의 염기쌍의 출현 확률을 반영한다. p 값은 상단으로부터 기부로 P5 줄기 내에서 상자표시 내의 염기쌍에 대해 0.1, 0.1, 0.01, 0.01 및 0.01이다. p 값은 상단으로부터 기부로 P4 줄기 내에서 상자표시 내의 염기쌍에 대해 0.01, 0.01 및 0.1이다. p 값은 P1 및 P3a 줄기 내에서 상자표시 내의 염기쌍에 대해 0.01이다. p 값은 좌측으로부터 우측으로 P3 줄기 내에서 상자표시 내의 염기쌍에 대해 0.1, 0.01, 0.01, 0.01, 0.01 및 0.01이다.

도 2는 THIC 3' UTR의 구조가 보존됨을 보여준다. 도 2a는 THIC 유전자의 3' 영역 및 유도된 전사체(transcript) 유형의 구성은 유사하다. 첫번째 상자표시는 정지 코돈 UAA가 도시된 코딩 영역의 마지막 엑손을 나타낸다. 정지 코돈 다음에 인트론이 존재하며(인트론이 정지 코돈 바로 앞에 위치하는 라이코퍼시콘 에스쿨렌툼은 제외), 이는 모든 전사체 유형(I, II, III)에서 전형적으로 스플라이싱된다. GU 및 AG 표시는 각각 5' 및 3' 스플라이스 부위로 동정된다. 1 내지 6으로 번호매겨진 두꺼운 선은 RNA 전사체의 6개 영역을 지정하며 그 길이는 도 2b에 기술된 바와 같이 분석된다. 점선은 스플라이싱 경우를 나타내고 다이아몬드 기호는 전사체 프로세싱 부위를 나타낸다. 도 2b는 도 2a에서 정의된 영역 내의 뉴클레오티드의 수가 7종의 식물 종에서 유사함을 보여준다. 영역 6에 대해 적층된 막대는 상이한 길이의 전사체의 동정을 나타낸다. 도 2c는 폴리T 프라이머를 사용하여 생 성된 cDNA로부터 THIC 3' UTR의 PCR 증폭은 검사된 모든 종에서 유형 II RNA만을 생성함을 보여준다. 역전사 및 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분리되고 에티듐 브로마이드 염색 및 자외선 조사에 의해 가시화된다. "M"은 100개 염기쌍씩 증가하는 DNA를 함유하는 마커(marker) 레인이다. 도 2d는 RT-PCR 분석이 유형 I 및 III RNA의 3' UTR에 대해 특이적인 프라이머 조합으로 도 2c에서 사용된 바와 동일한 cDNA를 사용하여 수행되었음을 보여준다. 도 2e는 상이한 RT 프라이머를 사용하여 생성된 아라비돕시스 탈리아나 cDNA로부터 유래된 유형 I 및 III RNA로부터 3' UTR의 RT-PCR 생성물을 보여준다. RT에 대해 사용된 프라이머는 표시된 바와 같이 폴리T, 랜덤 헥사머, 또는 THIC의 주석이 달린 말단(앱타머의 말단의 221개 뉴클레오티드 하류(downstream); "+221 nts") 또는 더욱 하류(앱타머의 말단의 882개 뉴클레오티드 하류; "+882 nts") 근처에 결합하는 서열 특이적 프라이머이었다. "no RT"는 주형 공급원(template source)으로서 역전사 없이 RNA를 사용하는 대조 반응을 나타낸다.

도 3은 THIC 전사체 유형이 아라비돕시스 탈리아나에서 티아민 수준의 변화에 상이하게 반응함을 보여준다. 도 3a는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR) 분석을 0, 0.1 및 1 mM 티아민이 보충된 배지 상에서 14일동안 생장시킨 아라비돕시스 탈리아나 묘목으로부터의 THIC 전사체에 대해 수행하였음을 보여준다. 전체 THIC 전사체 및 별도로 유형 I, II 및 III의 RNA를 상이한 프라이머 조합을 사용하여 검출하였다. 유형 I RNA의 검출용 폴리T 프라이머 또는 랜덤 헥사머를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 각각의 프라이머 조합에 대한 발현을 티아민 보충이 전혀 없는 배지(빈 막 대)를 사용하여 측정한 값으로 표준화하였다. 상기 값은 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균이고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 3b는 도 3a에 기재된 바와 동일한 샘플로부터의 THIC 전사체의 노던 블롯 분석을 보여준다. 레인당 부하량은 20 μg의 전체 RNA이었고 THIC의 코딩 영역, 유형 I 및 III RNA의 연장된 3' UTR, 또는 대조 전사체 EIF4A1에 결합하는 프로브를 사용하여 분석하였다. THIC 프로브의 신호는 2 내지 3 kb의 크기로 나타났다. 3' UTR 프로브는 약한 신호를 생성하였고 노출 시간은 다른 프로브의 경우 1일 노출에 비해 3일로 연장되었다. 도 3c는 아라비돕시스 탈리아나로부터 THIC 전사체에 대한 티아민 처리의 시간-의존적 효과의 qRT-PCR 분석을 보여준다. 묘목을 티아민 부재 배지 상에서 14일동안 생장시킨 후 50 μM 티아민 및 0.25 mg/ml 트윈 80으로 분무하였다. 대조 묘목을 트윈 80만을 함유한 용액으로 처리하였다. 샘플을 4시간 및 26시간 후 수집하고 qRT-PCR 분석하였다. THIC 전사체의 양을 폴리T 프라이머를 사용하여 생성된 cDNA로부터 분석하고 티아민 적용 없는 대조 샘플(빈 막대)의 값으로 표준화하였다. 상기 값은 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균이고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 3d는 야생형(WT) 및 티아민 피로포스포키나제 이중 녹아웃(TPK-KO) 아라비돕시스 탈리아나 식물에서 THIC 전사체 유형의 수준의 상대적 변화를 보여준다. 묘목을 티아민 부재 배지 상에서 12일동안 생장시키고 THIC 전사체 유형의 양을 qRT-PCR에 의해 분석하였다. 데이터는 WT 샘플에 대한 값으로 표준화되고 3회의 복제 실험으로부터의 평균을 나타내며 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.

도 4는 THIC의 긴 3' UTR이 앱타머 기능에 무관하게 감소된 유전자 발현을 야기함을 보여준다. 도 4a는 아라비돕시스 탈리아나로부터 THIC 유형 III RNA에서 스플라이싱 후 생성된 TPP 앱타머의 2차 구조 모델(서열번호 30 및 31)을 나타낸다. 줄기 P1 및 P2에서 회색 음영으로 표시된 뉴클레오티드는 본래 스플라이싱되지 않은 앱타머에 비교된 뉴클레오염기 변화로 동정된다. 흑색 상자표시된 뉴클레오티드는 도시된 바와 같이 변경되어 TPP에 결합하지 않는 돌연변이체 M1 및 M2를 생성한다. 도 4b는 도 4a에 도시된 스플라이싱된 앱타머에 의한 TPP 결합의 인-라인 프로빙(in-line probing) 분석을 보여준다. 레인은 반응 부재 후(NR), RNase T1을 사용한 부분적 절단 후(T1), 또는 알칼리를 사용한 부분적 절단 후(^-OH) 부하된 RNA를 포함한다. 부위 1 및 2를 정량화하여 도 4c에 도시된 바와 같은 K_D를 확립하였다. 도 4c는 자연발생적으로 절단된 RNA의 표준화된 분율 대 도 4b에 도시된 부위 1 및 2에 대한 TPP의 농도의 로그를 작도한 도면이다. 도 4d는 반딧불이 루시퍼라제(LUC)의 코딩 영역의 3' 말단에 융합된 아라비돕시스 탈리아나 유형 II 또는 III RNA의 3' UTR 을 함유하는 레포터(reporter) 구축물의 생체내(in vivo) 발현 분석을 나타낸다. 구축물 M1 및 M2는 유형 III RNA의 3' UTR에 기초한 것이지만 도 4a에 도시된 돌연변이를 함유한다. LUC-III M1'은 구축물 LUC-III M1의 역 3' UTR 서열을 함유한다. 레포터 구축물은 일시적 니코티아나 벤타미아나 발현 분석으로 분석되고 값은 레닐라(Renilla)로부터 유래된 공발현된(coexpressed) 루시퍼라제 유전자로 표준화되었다. 발현은 유형 II RNA의 3' UTR을 함유하는 융합 구축물로 표준화되었다. 도시된 데이터는 3회의 독립적인 실 험의 평균 값이고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 4e는 일시적 발현 분석에서 발현 후 아라비돕시스 탈리아나(At) 또는 니코티아나 벤타미아나(Nb)로부터의 THIC 유형 II 또는 III RNA의 3' UTR을 함유하는 EGFP 레포터 융합의 qRT-PCR 분석을 나타낸다. 발현은 공발현된 DsRED 레포터 유전자로 표준화되고 유형 II 3' UTR을 함유하는 구축물로 표준화되었다. 도시된 데이터는 2회의 대표적인 실험의 평균 값이고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.

도 5는 리보스위치 기능의 생체내 분석을 보여준다. 도 5a는 EGFP의 3' 말단에 융합된 AtTHIC의 완전한 3' 영역의 레포터 융합을 발현하는 안정하게 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 계통으로부터의 잎(leaf)이 이탈되고 물 또는 0.02% 티아민이 보충된 물 중에서 잎자루(petiole)를 사용하여 배양되었음을 나타낸다. EGFP 형광은 처리 개시 후 0시간, 48시간 및 72시간에 평가되었다. 3회 반복하여 얻은 데이터의 한 대표적 세트가 도시되어 있고 수치는 한 유전자전이 계통으로부터의 다양한 잎으로 동정된다. 도 5b는 3개 시점에서 도 5a에 도시된 잎의 EGFP 형광의 정량화를 나타낸다. 데이터는 각 잎에 대한 평균 형광 강도 및 표준 편차를 나타낸다. 또한 WT 잎의 평균 배경 형광을 도시한다. 도 5c는 물 또는 0.02% 티아민 중에서 72시간동안 배양된 잎으로부터 전체 EGFP 및 THIC 전사체의 qRT-PCR 분석을 나타낸다. 전사체 양은 내부 기준 전사체로 표준화되고 물 처리된 샘플 중에서 전사체 존재도로 표준화되었다. 값은 상이한 유전자전이 계통을 사용한 4회의 독립적인 실험으로부터의 평균이고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 5d 및 5e는 외래 티아민의 부재 하에 생장된 아라비돕시스 탈리아나 레포터 형질전환 체로부터 유래된 EGFP 및 THIC 전사체 유형의 상이한 3' UTR의 RT-PCR 분석을 나타낸다. cDNA 생성을 위해 폴리T 프라이머, 랜덤 헥사머 또는 2개의 상이한 유전자 특이적 프라이머(앱타머의 말단의 221개 또는 882개 뉴클레오티드 하류에 결합하는)를 표시된 바와 같이 사용하였다. 전방 프라이머(forward primer)는 EGFP(좌측) 또는 THIC(우측)의 코딩 영역의 마지막 엑손의 말단에 특이적인 반면, 후방 프라이머(reverse primer)는 폴리T 프라이머이거나(도 5d) 앱타머의 말단의 221개 뉴클레오티드 하류 영역에 상동성이었다(도 5e). RT-PCR 생성물은 도 2의 설명에 기술된 바와 같이 분리되고 가시화되었다. M은 100개 염기쌍씩 증가하는 DNA를 함유하는 마커 레인을 나타낸다. no RT는 주형 공급원으로서 역전사 없이 RNA를 사용하는 대조 반응을 나타낸다. I-1 및 I-2는 각각 스플라이싱되지 않은 또는 스플라이싱된 정지 코돈 다음의 상류(upstream) 인트론을 갖는 유형 I의 RNA를 나타낸다. 도 5e에서 폴리T 반응에서 최저 밴드는 RT 반응으로부터 남은 폴리T 프라이머를 갖는 THIC 유형 II RNA의 증폭으로부터 생성된다. 부가적인 표지되지 않은 밴드는 모든 RT-PCR 생성물의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 확인된 바와 같이 비특이적 증폭에 상응한다.

도 6은 리보스위치 기능에 대한 앱타머 돌연변이의 효과를 보여준다. 도 6a는 아라비돕시스 탈리아나 게놈 서열로부터 유래되고 EGFP에 융합된 THIC의 3' 영역에 위치한 WT TPP 앱타머의 2차 구조 모델 및 서열(서열번호 32 및 33)을 나타낸다. 흑색의 상자표시된 뉴클레오티드는 표시된 바와 같이 변경되어 손상된 TPP 결합을 갖는 돌연변이체 M2, M3 및 M4를 생성한다. 도 6b는 WT 앱타머 서열 또는 돌 연변이체 M2, M3 및 M4를 함유하는 레포터 구축물을 발현하는 아라비돕시스 탈리아나 형질전환체로부터의 잎에서의 EGFP 형광의 정량화를 나타낸다. 잎은 절제되어 형광 분석 전 72시간동안 물 또는 0.02% 티아민 중에서 잎자루를 사용하여 배양되었다. 값은 상이한 유전자전이 계통을 사용한 3회 이상의 독립적인 실험으로부터의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 6c는 도 6b에 기재된 아라비돕시스 탈리아나 형질전환체 중의 EGFP 및 THIC 전사체 양의 qRT-PCR 분석을 나타낸다. 전사체 양(기준 전사체를 사용하여 표준화됨)을 물 처리된 샘플 중에서 전사체 존재도로 표준화하였다. 값은 상이한 유전자전이 계통을 사용한 2 내지 4회의 독립적인 실험으로부터의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 6d 및 6e는 돌연변이 M2 또는 M3을 갖는 아라비돕시스 탈리아나 형질전환체로부터의 EGFP 및 THIC 전사체의 3' UTR의 RT-PCR 분석을 나타낸다. RT-PCR 분석은 도 5d 및 5e의 설명에 기술된 바와 같이 수행하였다. 전방 프라이머는 EGFP 또는 THIC의 코딩 영역의 마지막 엑손의 말단에 상동성인 반면, 후방 프라이머는 폴리T 프라이머이거나(도 6d) 앱타머의 말단의 221개 뉴클레오티드 하류 영역에 상보적이었다(도 6e). Kbp는 킬로베이스 쌍을 나타낸다.

도 7은 식물에서 리보스위치 기능의 기작을 보여준다. 도 7a는 TPP가 THIC 유형 III RNA의 형성에 중요한 5' 스플라이스 부위 근처의 RNA 구조의 변화를 야기함을 나타낸다. 인-라인 프로빙에서, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 TPP 앱타머의 3' 말단으로 확장되는 5' 스플라이스 부위(+1)의 5' ³²P-표지된 RNA 출발 14개 뉴클레오티드 상류(-14번 뉴클레오티드부터 -261번 뉴클레오티드까지; "-14-261")를 10μM TPP의 부재(-) 또는 존재(+) 하에 배양하고 생성되는 자연발생적 절단 생성물을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 마커는 RNase T1(T1) 또는 알칼리(^-OH)에 의해 부분적으로 분해된 RNA이다. 그래프는 표시된 레인에서의 상대적인 밴드 강도를 도시한다. 도 7b는 TPP 앱타머의 5' 스플라이스 부위 영역과 P4-P5 줄기 사이의 염기쌍 형성 가능성을 나타낸다(서열번호 34 내지 47; 상보적인 뉴클레오티드는 음영으로 표시되어 있다). 상보적인 뉴클레오티드의 신장부(stretch)는 또한 입수가능한 모든 다른 식물 THIC mRNA 서열에 존재한다. 도 7c는 식물에서 THIC TPP 리보스위치 기능의 모델이 전사체의 스플라이싱 및 택일적인 3' 말단 프로세싱의 조절을 포함함을 나타낸다. TPP 농도가 낮을 때(좌측) 줄기 P4 및 P5의 부분은 5' 스플라이스 부위와 상호작용하여 스플라이싱을 방해한다. 5' 스플라이스 부위와 TPP 앱타머 사이에 위치한 전사체 프로세싱 부위는 보유되고 그 사용 결과 높은 발현효율을 허용하는 짧은 3' UTR을 갖는 전사체가 형성된다. 증가된 TPP 농도의 존재 하에(우측) TPP는 앱타머에 공전사적으로(cotranscriptionally) 결합하여 5' 스플라이스 부위와의 상호작용을 방해하는 구조적 변화를 초래한다. 스플라이싱이 일어나고 전사체 프로세싱 부위를 제거한다. 전사가 계속되고 연장된 3' UTR에서 택일적인 프로세싱 부위가 THIC 유형 III RNA를 야기한다. 긴 3' UTR은 증가된 RNA 퇴화를 초래하여 THIC의 감소된 발현을 야기한다.

도 8은 상이한 식물 종으로부터의 THIC 유전자에서 TPP 리보스위치의 게놈 DNA 서열 내용을 보여준다(서열번호 48 내지 54).

는 THIC 개방 판독 틀(open reading frame; ORF)의 정지 코돈을 나타내고,

및

는 제1 인트론의 5' 및 3' 스플라이스 부위를 나타낸다(이탤릭체로 표시됨).

및

는 유형 III RNA의 생성에 사용된 스플라이스 부위를 나타낸다. 유형 II RNA의 3' UTR은 밑줄쳐있고, 앱타머 서열은 진하게 밑줄쳐있다. 서열의 표시된 3' 말단은 아라비돕시스 탈리아나 및 오리자 사티바에 대한 유전자 주석에 상응한다. 다른 식물 종에 대해서 표시된 서열은 RT-PCR에 의해 동정된 3' 말단에 부합하는 것이다.

도 9는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 THIC 프로모터가 티아민 보충 후 THIC 발현의 하향-조절을 담당하지 않음을 보여준다. 아라비돕시스 탈리아나로부터의 THIC 프로모터의 1595 bp 단편으로 구성된 구축물을 레포터 유전자 β-글루쿠로니다제(GUS)에 융합시키고 아라비돕시스 탈리아나 내로 형질전환하였다. GUS 및 THIS 전사체의 양을 qRT-PCR로 분석하고 티아민이 없는 또는 100 μM 티아민이 보충된 배지 상에서 생장된 9일령 묘목 내에서 기준 전사체 eEF -1α의 발현으로 표준화하였다. 데이터는 3개의 상이한 유전자전이 계통으로부터 및 3회의 독립적인 실험으로부터의 평균 값이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.

도 10은 THIC의 일주기성 발현을 보여준다. 도 10a는 연속적인 광 하에 48시간동안 배양된 식물로부터의 전체 THIC 전사체의 qRT-PCR 분석을 나타낸다. 식 물을 티아민이 없는 또는 100 μM 티아민이 보충된 배지 상에서 명/암 주기(16/8시간)로 11일동안 생장시켰다. 12일째 아침에 식물을 연속적인 광 하에 옮기고 샘플을 3시간마다 취하였다. 발현을 티아민 부재 배지 상에서 생장된 식물로부터 0의 시점에서 샘플의 값으로 표준화하였다. 오차 막대는 3벌 qRT-PCR 분석의 표준 편차를 나타낸다. 오차 막대의 부재는 데이터 점의 직경보다 작음을 나타낸다. 도 10b는 THIC 유형 III RNA의 qRT-PCR 분석을 나타낸다. 식물 물질 및 데이터 표준화는 도 10a에 기재된 바와 같다.

도 11은 레포터 유전자 발현에 대한 THIC 전사체의 상이한 유형의 3' UTR의 효과를 보여준다. 도 11a는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 THIC-II 또는 THIC-III RNA의 3' UTR 및 EGFP로 구성된 레포터 융합 구축물이 일시적 잎 침윤분석을 사용하여 발현되었고 형광이 48시간 및 96시간 후 측정되었음을 나타낸다. 결과는 루시퍼라제 레포터 구축물을 사용하여 관찰된 결과와 유사하였다. 일시적 발현 시스템이 전사 후(post-transcriptional) 유전자 사일런싱(PTGS)을 초래할 수 있음이 공지되어 있다(Johansen and Carrington, 2001; Voinnet et al., 2003). PTGS의 가능한 효과를 평가하기 위해 2개의 3' UTR 변이체의 상대적 발현을 유전자 사일런싱의 공지된 억제제(suppressor)인 P19의 부재("no P19") 또는 존재("+ P19") 하에 측정하였다. 형광을 THIC-II의 3' UTR을 함유하는 구축물의 값에 대해 표준화하였다. 데이터는 4회의 독립적인 실험으로부터의 평균이고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 2개 구축물의 활성의 비는 P19의 공발현 후 변하지 않고 유지되었는데, 이는 PTGS가 관찰된 차이에 관련되지 않음을 시사한다. 도 11b는 잎 침윤 분석에 서 발현 후 니코티아나 벤타미아나 THIC 유형 II 및 III RNA로부터의 3' UTR을 함유하는 EGFP 레포터 구축물의 상대적인 형광을 나타낸다. 발현을 THIC 유형 II RNA의 3' UTR을 함유하는 구축물의 값에 대해 표준화하였다. 값은 2회의 독립적인 실험으로부터의 평균이고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 결과는 아도롭시스 탈리아나로부터의 3' UTR을 기준으로 하는 구축물을 사용하여 관찰된 결과와 동등하다.

도 12는 앱타머의 5' 플랭킹(flanking) 서열의 TPP 유도된 조절을 보여준다. 5' 스플라이스 부위의 14개 뉴클레오티드 상류에서 출발하여 앱타머의 말단까지 연장된 RNA(-14-261)가 생체내 전사 및 ³²P로 표지된 5' 말단에 의해 생성되었다. 10 μM TPP의 부재 또는 존재 하에 인-라인 프로빙 반응을 수행한 후 절단 생성물을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분리하였다. 마커를 RNase T1 처리(T1) 또는 부분적인 알칼리 분해(^-OH)에 의해 생성하였다. 5' 스플라이스 부위의 G 잔기는 위치 1로 정의되고 앱타머는 146 내지 256 뉴클레오티드에 걸쳐있다. 앱타머 외부의 TPP 의존적 조절은 주로 5' 스플라이스 부위 다음 영역에서 관찰된다. 그러나, 부가적 구조 변화는 5' 플랭크에서 리간드 의존적 조절이 5' 스플라이스 부위 구조의 조절에 중요할 수 있는 것으로 나타났다.

본 명세서에 개시된 본 방법 및 조성물은 구체적인 실시양태에 대한 하기 상세한 설명 및 그에 포함된 실시예, 및 도면 및 도면에 대한 상기 설명 및 하기 설명을 참조함으로써 더 용이하게 이해될 수 있다.

mRNA는 전형적으로 번역 과정 동안에 단백질- 또는 작은 RNA-조절 인자 및 리보좀이 작용하는 유전정보의 수동 운반체로서 여겨진다. 특정 mRNA는 천연 앱타머 도메인을 보유하고 이 RNA 도메인과 특정 대사물질의 직접적 결합은 유전자 발현의 조절을 초래함이 밝혀져 있다. 천연 리보스위치는 전형적으로 천연 RNA와 관련되어 있지 않은 2가지 놀라운 기능을 나타낸다. 첫째, mRNA 요소는 상이한 구조적 상태를 채택할 수 있는데, 이때 한 구조는 그의 표적 대사물질에 대한 정확한 결합 포켓(pocket)으로서 작용한다. 둘째, 구조적 상태 사이에서 대사물질에 의해 유도된 알로스테릭 상호전환은 여러 상이한 기작 중 한 기작에 의해 유전자 발현의 수준 변화를 야기한다. 리보스위치는 전형적으로 2개의 분리된 도메인, 즉 표적에 선별적으로 결합하는 도메인(앱타머 도메인)과 유전적 조절에 영향을 미치는 도메인(발현 플랫폼 도메인)으로 절단될 수 있다. 유전자 발현의 대사물질-의존적 알로스테릭 조절을 야기하는 것은 상기 2개 도메인 사이의 동적 상호작용이다.

리보스위치의 다양한 부류가 동정되어 있고 활성화 화합물(본원에서 유발 분자로서 지칭됨)을 선별적으로 인식하는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 조효소 B₁₂, 글라이신, TPP 및 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)는 상기 화합물의 대사 경로 또는 수송 경로에서 핵심 효소를 코딩하는 유전자에 존재하는 리보스위치를 활성화시킨다. 각 리보스위치 부류의 앱타머 도메인은 고도로 보존된 공통 서열 및 구조를 따른다. 따라서, 서열 상동성 검색은 관련된 리보스위치 도메인들을 동정하는 데 이용될 수 있다. 리보스위치 도메인은 다양한 세균계, 고세균계 및 진핵생물계 유기체에서 발견되어 왔다.

10가지 상이한 대사물질을 감지하는 리보스위치의 12가지 초과의 구조적 부류가 진정세균(eubacteria)에서 보고되어 있다(Mandal 2004; Winkler 2005; Breaker 2006; Fuchs 2006; Roth). 쿠에유오신(queuosine) 전구체 preQ₁에 대해 선별적인 진정세균 리보스위치는 드물게 작은 앱타머 도메인을 함유하고(Nat. Struct. Mol. Biol. (2007)), 무수한 다른 부류는 현재 특징규명중이다. 각 리보스위치의 앱타머 도메인은 관련성이 먼 유기체 사이에서조차도 고도로 보존된 상태로 유지되어 있는 그의 뉴클레오티드 서열(Rodionov 2002; Vitreschak 2002; Vitreschak 2003) 및 폴딩된 구조(Nahvi 2004; Batey 2004; Serganov 2004; Montange 2006; Thore 2006; Serganov 2006; Edwards 2006)에 의해 구별된다. 리보스위치는 발현 플랫폼이 서열, 구조 및 조절 기작에 있어서 상당히 상이할 수 있다 하더라도 통상적으로 앱타머에 의한 대사물질 결합에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 발현 플랫폼을 포함한다.

이례적인 앱타머 보존 수준은 생체정보의 이용이 다양한 유기체에서 대표적인 유사한 리보스위치들을 동정할 수 있게 한다. 현재, TPP 리보스위치 앱타머 공통 서열에 부합하는 서열들만이 모든 3가지 도메인 생명체로부터 유래된 유기체에서 동정되어 있다(Sudarsan, 2003). 진균(Sudarsan, 2003; Galagan, 2005)(도 5) 및 식물로부터의 일부 예측된 진핵 TPP 앱타머는 TPP에 결합하는 것으로 밝혀져 있지만(Sudarsan 2003 Yamauchi), 대사물질 결합이 유전자 발현을 조절하는 정확한 기작은 알려져 있지 않다. 진균에서, 각 TPP 앱타머는 mRNA의 5' UTR 내의 인트론 또는 단백질 코딩 영역 내에 존재하는데, 이는 mRNA 스플라이싱이 대사물질 결합에 의해 조절됨을 암시한다(Sudarsan, 2003; Kubodera, 2003). 식물에서, 각각의 TPP 앱타머는 3' UTR 또는 mRNA의 단백질 코딩 영역 내에 존재한다. 식물 TPP-반응성 리보스위치가 이들이 존재하는 RNA의 프로세싱에 영향을 미침이 발견되어 있다.

A. 리보스위치 RNA 의 일반적인 구성

세균의 리보스위치 RNA는 특정 mRNA의 주 코딩 영역의 5' UTR 내에 주로 위치한 유전적 조절 요소이다. 구조적 프로빙 연구(이하, 더 논의됨)는 리보스위치 요소가 일반적으로 2개의 도메인, 즉 리간드-결합 도메인으로서 작용하는 천연 앱타머(T. Hermann, D. J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763), 및 유전자 발현에 관여하는 RNA 요소와 상호접촉하는 "발현 플랫폼"(예를 들어, 샤인-달가노(SD) 요소; 전사 종결자(terminator) 줄기)으로 구성되어 있다. 이 결론은 시험관내(in vitro)에서 합성된 앱타머 도메인이 발현 플랫폼의 부재 하에서 적절한 리간드에 결합한다는 관찰로부터 도출되었다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2, 3 및 6 참조). 뿐만 아니라, 구조적 프로빙 연구는 대부분의 리보스위치의 앱타머 도메인이 독립적으로 조사된 경우 특정 2차- 및 3차-구조 폴드(fold)(전체 5' 선도자(leader) RNA 면에서 조사되었을 때 앱타머 구조와 본질적으로 동일함)를 채택함을 시사한다. 이것은 많은 경우 앱타머 도메인이 발현 플랫폼과 무관하게 폴딩하는 모듈 단위(modular unit)임을 의미한다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2, 3 및 6 참조).

궁극적으로, 앱타머 도메인의 리간드-결합된 또는 비결합된 상태는 유전자 발현에 대한 영향 발휘를 담당하는 발현 플랫폼을 통해 해석된다. 리보스위치를 모듈 요소로서 보는 것은 앱타머 도메인이 다양한 유기체 사이에서 고도로 보존되어 있다는 점(심지어 계(kingdom) 사이에서도 TPP 리보스위치에 대해 관찰됨)에 의해 더 지지되지만(N. Sudarsan, et al., RNA 2003, 9, 644), 발현 플랫폼은 서열, 구조, 및 첨부된 개방 판독 틀의 발현이 조절되는 기작 면에서 다양하다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 tenA mRNA의 TPP 리보스위치에 결합하는 리간드는 전사 종결을 야기한다(A. S. Mironov et al., Cell 2002, 111, 747). 이 발현 플랫폼은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)의 thiM mRNA 내의 TPP 리보스위치의 발현 플랫폼과 비교될 때 서열 및 구조 면에서 상이하고, 이때 TPP 결합은 SD 차단 기작에 의해 번역 억제를 야기한다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2 참조). TPP 앱타머 도메인은 용이하게 인식될 수 있고 상기 2개의 전사 단위 사이에 거의 동일한 기능적 특성을 갖지만, 유전적 조절 기작 및 이를 수행하는 발현 플랫폼은 매우 상이하다.

리보스위치 RNA에 대한 앱타머 도메인은 전형적으로 그 길이가 약 70 내지 170 뉴클레오티드이다(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 도 11). 이 관찰은 시험관내 진화 실험이 길이 면에서 상당히 더 짧고 구조적 복잡성 면에서 상당히 더 단순한 매우 다양한 소분자-결합 앱타머를 동정시켜주기 때문에 다소 예측되지 않은 결과이다(T. Hermann, D. J. Patel, Science 2000, 287, 820; L. Gold et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763; M. Famulok, Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, 324). 인공 앱타머와 비교할 때 천연 앱타머 서열의 복잡성 및 정보 내용에 있어서의 상당한 증가에 대한 이유가 입증되어 있지만, 이 복잡성은 높은 친화성 및 선별성으로 작용하는 RNA 수용체를 형성하는 데 필요한 것으로 여겨진다. 리간드-리보스위치 복합체에 대한 겉보기 K_D 값은 낮은 nM 내지 낮은 μM이다. 첨부된 발현 플랫폼으로부터 단리된 일부 앱타머 도메인들이 완전한 리보스위치에 비해 표적 리간드에 대한 개선된 친화성(약 10배 내지 100배)(미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 실시예 2 참조)을 나타낸다는 사실도 주목할만하다. 추정컨대, 완전한 리보스위치 RNA는 다수의 상이한 RNA 구조를 샘플링하는 데 있어서 에너지를 필요로 하고, 이것이 리간드 친화성의 손실로 반영된다. 앱타머 도메인은 분자 스위치로서 작용해야 하기 때문에, 이것은 천연 앱타머의 보다 정교한 구조를 재구성하는 것을 보조해야 한다는 기능적 요구를 천연 앱타머에 부가할 수도 있다.

B. TPP 리보스위치

조효소 TPP는 단백질이 촉매로서 작용하는 많은 반응에서 필수적인 참여자인 비타민 B₁의 활성 형태이다. 세균, 식물 및 진균을 포함하는, 모든 3가지 도메인의 생명체로부터 유래된 유기체는 TPP-감지 리보스위치를 사용하여 티아민 및 그의 인산화된 유도체의 이입 또는 합성을 담당하는 유전자를 조절하므로, 이 리보스위치 부류는 대사물질-감지 RNA 조절 시스템의 가장 널리 분포된 구성원이다. 이 구조는, 1개의 서브도메인이 TPP의 4-아미노-5-하이드록시메틸-2-메틸피리미딘 잔기에 대한 삽입 포켓을 형성하는 반면 또 다른 서브도메인이 리간드의 피로포스페이트 잔기에의 가교 접촉을 만들기 위해 2가 금속 이온 및 물 분자를 사용하는 보다 넓은 포켓을 형성하는 폴딩된 RNA를 보여준다. 상기 2개의 포켓은 연장된 구조에서 TPP를 인식하는 분자 측정 장치로서 작용하도록 배치된다. 중심 티아졸 잔기는 RNA에 의해 인식되지 않는데, 이것은 항균 화합물인 피리티아민 피로포스페이트가 이 리보스위치를 표적화하여 티아민 대사 유전자의 발현을 하향-조절하는 이유이다. 천연 리간드 및 이의 약물-유사 동족체는 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 합성을 조절하기 위해 리보스위치에 의해 이용되는 2차 및 3차 구조 요소들을 안정화시킨다. 또한, 이 구조는 폴딩된 RNA가 단백질 유전적 인자에 의해 형성된 결합 포켓과 경쟁하는 정밀한 결합 포켓을 어떻게 형성할 수 있는지를 알 수 있게 한다.

3가지 TPP 리보스위치가 섬사상(filamentous) 진균 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 조사되었고, 상기 3가지 TPP 리보스위치들 중 하나는 mRNA 스플라이싱을 조절함으로써 유전자 발현을 활성화시키고 나머지 둘은 유전자 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Cheah, 2007). 리보스위치-매개된 염기쌍 형성 변화 및 택일적 스플라이싱 조절을 수반하는 상세한 기작은 TPP 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 전구체 NMT1 mRNA에 대해 밝혀졌다(Cheah, 2007). 이 결과는 진핵세포가 대사물질-결합 RNA를 이용하여 핵심적인 생화학적 과정의 조절에 중요한 RNA 스플라이싱을 조절함을 입증한다.

TPP 리보스위치는 검사된 모든 식물 종의 티아민 생합성 유전자 THIC의 3' UTR 내에 존재함이 발견되었다. THIC TPP 리보스위치는 택일적인 3' UTR 길이를 갖는 전사체의 형성을 조절하고, 이는 mRNA 안정성 및 단백질 생성에 영향을 미친다. 택일적인 3' 말단 프로세싱의 리보스위치-매개된 조절이 THIC 발현의 TPP-의존적 피드백 조절에 결정적임이 입증되었다. 데이터는 RNA 폴딩의 대사물질-의존적 변경이 mRNA의 스플라이싱 및 택일적인 3' 말단 프로세싱을 조절하는 기작을 나타낸다.

TPP 리보스위치는 다양한 식물 종에서 티아민 대사 유전자 THIC의 3' UTR 내에 존재한다. 택일적인 3' UTR 길이를 갖는 THIC 전사체의 형성은 리보스위치 기능에 의존적이고 세포 TPP 수준의 변화에 응답하여 THIC 발현의 피드백 조절을 매개한다. 데이터는 3' UTR 길이가 전사 안정성과 상관관계가 있어 택일적인 3' 말단 프로세싱에 의한 유전자 조절에 대한 기초를 확립함을 시사한다. 식물에서 TPP 리보스위치 기능에 대한 상세한 기작이 제시되어 있고(실시예 1), 이는 THIC mRNA의 스플라이싱 및 차등적 3' 말단 프로세싱의 앱타머 매개된 조절을 포함한다.

식물 종 아라비돕시스 탈리아나, 오리자 사티바 및 포아 세쿤다로부터의 THIC 유전자의 3' UTR 내에 고도로 보존된 TPP-결합 앱타머의 존재가 종래 보고되었다(Sudarsan et al., 2003). 식물 TPP 앱타머 대표예의 수집은 부가적인 식물 종으로부터의 THIC 유전자의 시퀀싱 및 TPP 앱타머 공통 서열에 부합하는 뉴클레오티드 서열에 대한 데이터베이스 검색에 의해 확장되었다. cDNA 서열을 얻은 후 각 종의 게놈 DNA로부터의 상응하는 영역을 클로닝하고 시퀀싱하여(세부사항은 실험 과정 참조) 초기 및 프로세싱된 mRNA 분자 둘다의 서열을 제공하였다.

식물로부터의 모든 입수가능한 TPP 앱타머 서열의 정렬은 고도로 보존된 뉴클레오티드 서열 및 줄기 P1 내지 P5로 구성된 2차 구조를 나타낸다(도 1a). 식물로부터의 진핵 TPP 리보스위치 앱타머(도 1b)와 세균 및 고세균 대응부(도 1c)(Winkler et al., 2002; Rodionov et al., 2002)에 비교된 섬사상 진균류(Cheah et al., 2007) 사이의 주요 차이는 세균류 대표예에 종종 존재하는 P3a 줄기의 일관된 부재 및 진핵생물에서의 P3 줄기의 다양한 길이이다. 어떠한 영역도 TPP 결합에 관련되지 않으며(Edwards and Ferre-D'Amare, 2006; Serganov et al., 2006; Thore et al., 2006; Cheah et al., 2007), 따라서 이들 차이가 리간드 결합 특이성에 영향을 미치지 않는다.

TPP 앱타머는 단자엽, 쌍자엽 및 침엽수 피누스 타에다로부터의 모든 공지된 THIC 예의 3' UTR 내에서 발견된다. 흥미롭게도, 이끼 사이코미트렐라 파텐스에서 TPP 앱타머는 THIC의 3' UTR 내에 존재하고(Ppa1) 또한 티아민 생합성 유전자 THI4에 상동성인 2개 유전자의 3' 영역 내에 존재한다(Ppa2, Ppa3). 후자의 관찰 및 진균류가 또한 다중의 상이한 유전자와 연관있는 TPP 앱타머를 갖는다는 관찰(Cheah et al., 2007)은 진핵생물이 마찬가지로 핵심 대사물질의 농도 변화에 응답하여 다중 유전자를 조절하는 데 동일한 리보스위치 부류의 변이체를 사용함을 시사한다.

식물로부터의 TPP 앱타머의 놀라운 특징은 뉴클레오티드 서열 보존도가 높다는 것이다. 약 80%의 뉴클레오티드(P3 줄기 제외)가 모든 식물 예에서 보존되었다. 대조적으로, 40% 미만이 섬사상 진균류에서 보존되었다. 식물 TPP 앱타머 중 대부분의 차이가 P3 줄기에서 발견되었는데, 그 길이 및 서열 둘다에서 다양하다. 또한, P3 줄기의 길이는 사이코미트렐라 파텐스에서 관찰되는 바와 같이 동일 종에서 TPP 앱타머 대표예 사이에서 다양하다(도 1a). THIC에서 연장된 P3 줄기 및 THI4에서 매우 짧은 P3 줄기 둘다의 존재는 이러한 앱타머의 구성요소에 대한 종-특이적 요건이 없음을 시사한다.

식물에서 TPP 리보스위치 조절은 mRNA 전사체의 스플라이싱 및 택일적인 3' 말단 프로세싱의 대사물질-매개된 조절을 포함한다(도 7c). 세포 중 TPP 농도가 낮을 때, 앱타머는 5' 스플라이스 부위와 상호작용하여 스플라이싱을 방해한다. 이러한 인트론은 전사 절단 및 폴리아데닐화를 허용하는 주요 프로세싱 부위를 보유한다. 이러한 부위로부터의 프로세싱은 짧은 3' UTR을 보유하고 THIC 유전자의 발현효율이 높은 THIC-II 전사체를 생성한다.

TPP 농도가 높을 때, 앱타머에 대한 TPP 결합은 5' 스플라이스 부위에 대한 쌍 형성을 방해한다. 결과적으로, 5' 스플라이스 부위가 접근가능하고 주요 프로세싱 부위를 제거하는 스플라이싱에 사용된다. 전사는 후속적으로 1 kb까지 연장되고 하류에 위치한 프로세싱 부위의 사용은 훨씬 긴 3' UTR을 보유하는 THIC-III RNA를 생성한다. 긴 3' UTR은 증가된 전사 퇴화를 야기하고 THIC 발현이 감소된다. 종래 연구는 연장된 전사가 전사 프로세싱의 부재 하에 발생하여 이들 프로세스의 상호연결성을 나타내는 것임을 보여주었다(Buratowski, 2005; Proudfoot, 2004; Proudfoot et al., 2002).

TPP 리보스위치는 그 전체가 본원에 참고로 도입되고 특히 TPP 리보스위치 구조, 기능 및 용도의 설명이 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호에도 기재되어 있다. 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 임의의 보호대상 및 설명, 특히 TPP 리보스위치 구조, 기능 및 용도에 대한 임의의 설명이 본 명세서에 개시된 다른 보호대상에 구체적으로 포함될 수 있거나 본 명세서에 개시된 다른 보호대상으로부터 배제될 수 있음을 특히 고려해야 한다.

본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 달리 명시하지 않은 한 특정 합성 방법, 특정 분석 기법 또는 특정 시약으로 한정되지 않고 따라서 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.

재료

본 명세서에 개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 상기 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있거나, 상기 방법 및 조성물의 제조에 사용될 수 있거나 상기 방법 및 조성물의 생성물인 재료, 조성물 및 성분이 개시되어 있다. 이 재료들 및 다른 재료들은 본 명세서에 개시되어 있고, 상기 재료의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되어 있는 경우, 상기 화합물들의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 치환 각각에 대한 구체적 언급이 명시적으로 개시되어 있지 않더라도 각각이 본 명세서에 구체적으로 고려되고 개시되어 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 리보스위치 또는 앱타머 도메인이 개시되고 논의되어 있으며 리보스위치 또는 앱타머 도메인을 포함한 다수의 분자에 부가할 수 있는 다수의 변경이 논의되어 있는 경우, 리보스위치 또는 앱타머 도메인의 각각 및 모든 조합 및 치환 및 가능한 변경은 달리 명시되어 있지 않은 한 구체적으로 고려된다. 따라서, 분자 A, B 및 C의 부류뿐만 아니라 분자 D, E 및 F의 부류가 개시되어 있고 조합 분자의 예 A-D가 개시되어 있는 경우, 심지어 각각이 개별적으로 개시되어 있지 않더라도 각각은 개별적으로 및 총체적으로 고려된다. 따라서, 이 예에서, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F가 각각 구체적으로 고려되고 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적 조합 A-D의 개시로부터 개시된 것으로 간주되어야 한다. 마찬가지로, 임의의 하위세트 또는 이의 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 하위군이 구체적으로 고려되고 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적 조합 A-D의 개시로부터 개시된 것으로 간주되어야 한다. 이 개념은 본 명세서에 개시된 조성물의 제조 방법 및 사용 방법에서 수반되는 단계를 포함하나 이로 한정되지 않는 본원의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 존재하는 경우, 이 추가 단계는 본 명세서에 개시된 방법의 임의의 구체적 실시양태 또는 실시양태들의 조합을 이용하여 각각 수행할 수 있고, 이러한 조합은 각각 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 함을 이해해야 한다.

A. 리보스위치

리보스위치는, 발현될 RNA 분자의 일부이면서 유발 분자와 결합하였을 때 상태를 변화시키는 발현 조절 요소이다. 리보스위치는 전형적으로 2개의 분리된 도메인, 즉 표적에 선별적으로 결합하는 도메인(앱타머 도메인)과 유전적 조절에 영향을 미치는 또 다른 도메인(발현 플랫폼 도메인)으로 절단될 수 있다. 유전자 발현의 대사물질-의존적 알로스테릭 조절을 야기하는 것은 상기 2개의 도메인 사이의 동적 상호작용이다. 단리된 리보스위치 및 재조합 리보스위치, 이러한 리보스위치를 함유하는 재조합 구축물, 상기 리보스위치에 작동가능하게 연결되어 있는 이종 서열, 및 상기 리보스위치, 리보스위치 재조합 구축물, 및 상기 이종 서열에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 보유하는 세포 및 유전자전이 유기체가 개시되어 있다. 이종 서열은 예를 들어, 레포터 단백질 또는 펩티드를 포함하는 원하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열일 수 있다. 바람직한 리보스위치는 천연발생적 리보스위치이거나 천연발생적 리보스위치로부터 유도된다. 예를 들어, 앱타머 도메인은 천연발생적 리보스위치의 앱타머 도메인일 수 있거나 천연발생적 리보스위치의 앱타머 도메인으로부터 유도될 수 있다. 리보스위치는 인공 앱타머를 포함할 수 있거나 경우에 따라 인공 앱타머를 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 인공 앱타머는 시험관내 진화 및/또는 시험관내 선별을 통해 디자인되거나 선별된 앱타머를 포함한다. 리보스위치는 천연발생적 리보스위치의 공통 서열을 포함할 수 있다. 다양한 리보스위치의 공통 서열은 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호, 예컨대, 도 11에 개시되어 있다. 식물 TPP-반응성 리보스위치의 공통 서열이 도 1B에 도시되어 있고 구체적 예가 도 1A에 도시되어 있다.

본 명세서에는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조절가능한 유전자 발현 구축물이 개시되어 있는데, 상기 리보스위치는 상기 RNA의 스플라이싱을 조절하고, 상기 리보스위치 및 상기 코딩 영역은 이종 영역이고, 상기 스플라이싱의 조절은 RNA의 프로세싱에 영향을 미친다. 리보스위치는 RNA의 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인은 이종 도메인이다. RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 3' UTR 내에 존재할 수 있다. 인트론은 RNA의 3' UTR 내에 존재할 수 있다. RNA 프로세싱 부위는 인트론 내에 존재할 수 있다. 인트론의 스플라이싱은 RNA로부터 RNA 프로세싱 부위를 제거하여 RNA의 프로세싱에 영향을 미칠 수 있다. RNA의 프로세싱에 대한 영향은 RNA 프로세싱 부위에 의해 매개된 RNA의 프로세싱의 배제를 포함할 수 있다. RNA 프로세싱에 대한 영향은 전사 종결에서의 변경을 포함할 수 있다. RNA 프로세싱에 대한 영향은 RNA의 퇴화의 증가를 포함할 수 있다. RNA 프로세싱에 대한 영향은 RNA의 턴오버의 증가를 포함할 수 있다. 리보스위치는 인트론의 3' 스플라이스 접합부에 중첩될 수 있다. 인트론의 스플라이싱은 활성화될 리보스위치의 능력을 감소시키거나 배제할 수 있다. 스플라이스 접합부는 5' 스플라이스 접합부일 수 있다. 리보스위치는 RNA의 인트론 내에 존재할 수 있다. 또한, RNA 프로세싱은 스플라이싱에의 관련과 무관하게 또는 스플라이싱에의 관련 없이 조절되거나 영향을 받을 수 있다.

발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에 스플라이스 접합부를 포함할 수 있다. 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론의 말단에서 스플라이스 접합부(즉, 5' 스플라이스 접합부 또는 3' 스플라이스 접합부)를 포함할 수 있다. RNA는 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 발현 플랫폼 도메인은 상기 인트론 내에 분지 부위를 포함한다. 스플라이스 접합부는 리보스위치가 활성화될 때 활성 상태일 수 있다. 스플라이스 접합부는 리보스위치가 활성화되지 않을 때 활성 상태일 수 있다. 리보스위치는 TPP와 같은 유발 분자에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 억제할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경할 수 있다. 상기 RNA는 분지된 구조를 가질 수 있다. 상기 RNA는 전구-mRNA일 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P4 및 P5 줄기 내에 위치할 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프 5 내에서도 발견될 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P2 줄기 내에서도 발견될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 발현 플랫폼 도메인은 P4 서열 및 P5 서열, 루프 5 서열 및/또는 P2 서열과 상호작용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 앱타머 서열은 유발 분자가 앱타머 도메인에 결합되지 않은 경우에만 발현 플랫폼 도메인과의 상호작용에 이용될 수 있다. 스플라이스 부위 및/또는 분지 부위는 예를 들어, 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -130 내지 -160의 위치에 위치할 수 있다. RNA는 제2 인트론을 추가로 포함할 수 있고, 이때 제2 인트론의 3' 스플라이스 부위는 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -220 내지 -270의 위치에 위치한다.

또한, 본 명세서에는 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있는 리보스위치를 포함하는 구축물을 RNA 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA의 프로세싱에 영향을 미치는 방법도 개시되어 있는데, 이때 RNA는 인트론을 포함하고 스플라이싱의 조절이 RNA의 프로세싱에 영향을 미친다. 상기 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있고, 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인은 이종 도메인이다. 리보스위치는 RNA의 인트론 내에 존재할 수 있다. 리보스위치는 TPP와 같은 유발 분자에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위치는 스플라이싱을 억제할 수 있다. 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경할 수 있다. 스플라이싱은 비-천연적으로 발생할 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프 5 내에서 발견될 수 있다. 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, P2 줄기 내에서도 발견될 수 있다. 스플라이스 부위는 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -130 내지 -160의 위치에 위치할 수 있다. 구축물은 인트론을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 명세서에는 (a) 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 구축물을 포함하는 세포(이때, 상기 리보스위치가 RNA의 스플라이싱을 조절하고, 상기 리보스위치 및 상기 코딩 영역이 이종성이며, 상기 스플라이싱의 조절이 RNA의 프로세싱에 영향을 미침) 및 (b) 효과량의 상기 리보스위치용 유발 분자를 접촉시켜 유전자 발현에 영향을 미치는 단계를 포함하는, 유전자 발현에 영향을 미치는 방법도 개시되어 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 유발 분자는 티아민 또는 TPP일 수 있다.

리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 변경할 수 있다. 예를 들어, 리보스위치의 활성화는 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있거나, 택일적 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있거나, 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 택일적 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 또는 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있다. 다른 예로서, 불활성 리보스위치 또는 리보스위치의 불활성화는 택일적 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있거나, 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 택일적 스플라이싱을 방해하거나 감소시킬 수 있거나, 또는 스플라이싱 또는 우세한 스플라이싱을 허용하거나 촉진할 수 있다. 일반적으로, 스플라이싱 조절의 형태는 RNA 분자 내에서 리보스위치와 스플라이스 접합부, 택일적 스플라이스 접합부 및 분지 부위의 물리적 관계에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 리보스위치의 활성화/불활성화는 일반적으로 RNA 내에서의 택일적 2차 구조(예를 들어, 염기쌍이 형성된 줄기)의 형성 및/또는 파괴를 수반하고, 이러한 구조적 변화는 기능적 RNA 서열을 감추거나 노출시키는 데 이용될 수 있다. 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인은 일반적으로 상기 기능적 RNA 서열을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 리보스위치가 활성화되거나 불활성화되었을 때 또는 리보스위치가 불활성화되거나 활성화되었을 때 스플라이스 접합부 또는 분지 부위가 택일적으로 감춰지거나 노출되는 방식으로 스플라이스 접합부 또는 분지 부위를 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인 내에 포함시킴으로써, RNA의 스플라이싱을 조절하거나 RNA의 스플라이싱에 영향을 미칠 수 있다.

스플라이싱의 조절은 스플라이싱이 조절된 RNA의 프로세싱에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, RNA 내의 인트론은 RNA 프로세싱 신호 또는 부위를 포함할 수 있다. RNA의 스플라이싱은 프로세싱 신호 또는 부위의 제거를 초래할 수 있다. 예를 들면, mRNA의 3' UTR에서의 전사 종결 신호 또는 RNA 절단 부위가 RNA로부터 스플라이싱되어 나오는 인트론 내에 존재하는 경우 RNA로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 리보스위치에 의한 인트론의 스플라이싱의 조절은 RNA의 프로세싱에 영향을 미칠 수 있다. 다른 예로서, RNA 프로세싱 신호 또는 부위는 RNA 프로세싱 시스템의 인트론 또는 상이한 요소의 스플라이싱을 통해 생성될 수 있고 신호 또는 부위는 인트론의 스플라이싱에 의해 작동가능한 배열을 야기하거나 이로부터 취해질 수 있다. 다른 예로서, RNA 프로세싱 신호 또는 부위는 RNA의 다른 요소와의 작동가능한 근접성을 야기하거나 이로부터 취해질 수 있다.

RNA 프로세싱은 또한 스플라이싱의 조절에 의한 매개 없이 리보스위치에 직접적으로 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, RNA 프로세싱 신호 또는 부위는 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인 내에 존재할 수 있다. 이런 방식으로, 리보스위치의 활성화에 의한 발현 플랫폼의(및 따라서 RNA 프로세싱 신호 또는 부위의) 구조적 관계의 변경이 RNA 프로세싱 신호 또는 부위의 작동 능력에 영향을 미침으로써 프로세싱에 영향을 미칠 수 있다.

리보스위치는 RNA 프로세싱에 영향을 미칠 수 있다. "RNA 프로세싱에 영향을 미친다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어 스플라이싱의 조절을 통해) 작용하여 RNA 프로세싱이 일어나게 허용하거나 자극하거나 감소시키거나 방해할 수 있음을 의미한다. 이것은 예를 들어, 임의의 프로세싱이 일어날 수 있게 허용하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 프로세싱 횟수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상까지 프로세싱을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

RNA 프로세싱은 예를 들면 전사 종결, RNA의 3' 말단 형성, 폴리아데닐화 및 RNA의 퇴화 또는 전환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 RNA 프로세싱 신호 또는 부위는 RNA 프로세싱 사건 또는 조건을 매개하거나 신호하거나 이에 요구되는 RNA 내의 서열, 구조 또는 위치이다. 예를 들면, 특정 서열 또는 구조는 전사 종결, RNA 절단 또는 폴리아데닐화를 신호할 수 있다.

리보스위치는 스플라이싱을 활성화시키거나 억제할 수 있다. "스플라이싱을 활성화시킨다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 스플라이싱이 일어나게 할 수 있음을 의미한다. 이것은 예를 들어, 임의의 스플라이싱이 일어날 수 있게 하는 것(예컨대, 스플라이싱이 일어나지 않는 것과 비교하여 스플라이싱이 한번 일어날 수 있게 하는 것) 또는 택일적 스플라이싱이 일어날 수 있게 하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 스플라이싱 횟수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상까지 스플라이싱을 증가시킬 수 있다.

"스플라이싱을 억제한다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 스플라이싱을 억제할 수 있음을 의미한다. 이것은 예를 들어, 임의의 스플라이싱이 일어나는 것을 방해하거나 감소시키는 것(예컨대, 스플라이싱이 한번 일어나는 것과 비교하여 스플라이싱이 전혀 일어나지 않는 것) 또는 택일적 스플라이싱이 일어나는 것을 방해하거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 택일적 스플라이싱의 횟수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 택일적 스플라이싱을 감소시킬 수 있다.

리보스위치는 택일적 스플라이싱을 활성화시키거나 억제할 수 있다. "택일적 스플라이싱을 활성화시킨다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 택일적 스플라이싱이 일어날 수 있게 허용함을 의미한다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 택일적 스플라이싱 횟수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상까지 택일적 스플라이싱을 증가시킬 수 있다.

"택일적 스플라이싱을 억제한다"는 것은 리보스위치가 RNA에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여 택일적 스플라이싱을 억제할 수 있음을 의미한다. 이것은 리보스위치가 없는 경우 일어날 택일적 스플라이싱의 횟수와 비교할 때 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 택일적 스플라이싱을 감소시킬 수 있다.

리보스위치는 RNA에 의해 코딩된 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 스플라이싱 또는 택일적 스플라이싱의 조절은 번역될 RNA의 능력에 영향을 미칠 수 있거나, 코딩 영역을 변경할 수 있거나, 또는 번역 개시 또는 종결을 변경할 수 있다. 택일적 스플라이싱은 예를 들어, 개시 코돈 또는 정지 코돈(또는 이들 둘다)이 통상적으로 프로세싱된 전사체에 존재하지 않는 프로세싱된 전사체에서 나타나게 할 수 있다. 또 다른 예로서, 택일적 스플라이싱은 통상적인 개시 코돈 또는 정지 코돈이 프로세싱된 전사체로부터 제거되게 할 수 있다. RNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 조절하기 위해 리보스위치-조절된 스플라싱을 이용하는 데 있어서 유용한 한 방법은 리보스위치를 RNA의 5' UTR 내의 인트론 내에 도입하고 상기 인트론 내의 개시 코돈이 택일적으로 스플라이싱된 RNA 내에서 제1 개시 코돈이 되도록 상기 인트론 내의 개시 코돈을 포함하거나 이용하는 것이다. RNA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 조절하기 위해 리보스위치-조절된 스플라이싱을 이용하는 데 있어서 유용한 또 다른 방법은 리보스위치를 상기 RNA의 5' UTR 내의 인트론 내에 도입하고 상기 인트론 내의 짧은 개방 판독 틀이 택일적으로 스플라이싱된 RNA 내에서 가장 먼저 나타나도록 상기 개방 판독 틀을 포함하거나 이용하는 것이다.

RNA 분자는 분지된 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 진균류 TPP 리보스위치(Cheah, 2007)에 있어서, TPP 농도가 낮은 경우, 새롭게 전사된 mRNA는 스플라이싱에서 이용가능한 분지 부위를 남기면서 제2의 5' 스플라이스 부위를 차단하는 구조를 채택한다. 제1의 5' 스플라이스 부위로부터의 전구-mRNA 스플라이싱은 I-3 형태의 mRNA의 생성 및 NMT1 단백질의 발현을 야기한다. TPP 농도가 높은 경우, TPP 앱타머와 리간드의 결합은 RNA 폴딩의 알로스테릭 변화가 5' 스플라이스 부위 근처에서 구조적 유연성을 증가시키고 분지 부위 근처에 있는 뉴클레오티드를 차단하게 한다.

천연발생적 리보스위치 및 신생(de novo) 디자인된 리보스위치를 포함하는 개시된 리보스위치(이의 유도체 및 재조합 형태를 포함함)는 일반적으로 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 리보스위치들은 이들이 택일적 스플라이싱을 조절하는 것으로 확인되기만 하면 개시된 본 방법에서 또는 본 방법에 따라 사용될 수 있다. 그러나, 다양한 종류의 리보스위치가 정의될 수 있고, 이러한 하위 종류들 중 일부는 특정 방법(일반적으로 본 명세서의 모든 곳에 기재되어 있음)에서 또는 본 방법에 따라 유용할 수 있다. 리보스위치의 종류에는 예를 들어, 천연발생적 리보스위치, 천연발생적 리보스위치의 유도체 및 변경된 형태, 키메라 리보스위치 및 재조합 리보스위치가 포함된다. 천연발생적 리보스위치는 천연 상태로 발견되는 리보스위치의 서열을 갖는 리보스위치이다. 이러한 천연발생적 리보스위치는 천연 상태로 발생되기 때문에 천연발생적 리보스위치의 단리된 또는 재조합 형태일 수 있다. 즉, 리보스위치는 동일한 1차 구조를 가질 수 있되 새로운 유전적 면에서 또는 핵산 면에서 단리되어 있거나 개조되어 존재할 수 있다. 키메라 리보스위치는 예를 들어, 임의의 부류 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치 또는 특정 부류 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치의 일부, 및 동일한 부류 또는 종류의 리보스위치에 속하는 상이한 리보스위치 또는 임의의 상이한 부류 또는 종류의 리보스위치에 속하는 상이한 리보스위치의 일부; 또는 임의의 부류 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치 또는 특정 부류 또는 종류의 리보스위치에 속하는 리보스위치의 일부, 및 임의의 비-리보스위치 서열 또는 요소로 구성될 수 있다. 재조합 리보스위치는 새로운 유전적 면에서 또는 핵산 면에서 단리되어 있거나 개조되어 있는 리보스위치이다.

리보스위치는 단일 또는 다중 앱타머 도메인을 가질 수 있다. 다중 앱타머 도메인을 갖는 리보스위치 내의 앱타머 도메인들은 유발 분자의 상호협동적 결합을 보일 수 있거나 유발 분자의 상호협동적 결합을 보이지 않을 수 있다(즉, 앱타머들은 상호협동적 결합을 보일 필요가 없음). 엡타머 도메인들이 상호협동적 결합을 보이지 않는 경우, 앱타머 도메인들은 독립적 결합제인 것으로 지칭될 수 있다. 다중 앱터머를 갖는 리보스위치는 단일 또는 다중 발현 플랫폼 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, 유발 분자의 상호협동적 결합을 보이는 2개의 앱타머 도메인을 갖는 리보스위치는 상기 2개의 앱타머 도메인에 의해 조절되는 단일 발현 플랫폼 도메인에 연결될 수 있다. 다중 앱타머를 갖는 리보스위치는 연결자(linker)를 통해 연결된 1개 이상의 앱타머를 가질 수 있다. 이러한 앱타머가 유발 분자의 상호협동적 결합을 보이는 경우, 연결자는 상호협동적 연결자일 수 있다.

앱타머 도메인들은 이들이 x와 x-1 사이에서 힐(Hill) 계수를 갖는 경우 상호협동적 결합을 보인다고 기재될 수 있고, 이때 x는 상호협동적 결합에 대해 분석될 앱타머 도메인의 수(또는 앱타머 도메인 상의 결합 부위의 수)이다. 따라서, 예를 들어, 2개의 앱타머 도메인(예컨대, 글라이신-반응성 리보스위치)을 갖는 리보스위치는 이 리보스위치가 2와 1 사이의 힐 계수를 갖는 경우 상호협동적 결합을 보인다고 기재될 수 있다. 사용된 x의 값은 상호협동적 결합에 대해 분석될 앱타머 도메인의 수(그러나, 반드시 리보스위치 내에 존재하는 앱타머 도메인의 수는 아님)에 좌우됨을 이해해야 한다. 이것은 리보스위치가 다중 앱타머 도메인을 가질 수 있고, 이때 일부 앱타머 도메인들만이 상호협동적 결합을 보이기 때문인 것으로 이해된다.

본 명세서에는 이종 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함하는 키메라 리보스위치가 개시되어 있다. 즉, 키메라 리보스위치는 한 공급원으로부터 유래된 앱타머 도메인 및 또 다른 공급원으로부터 유래된 발현 플랫폼 도메인으로 구성될 수 있다. 이종 공급원은 예를 들어, 상이한 특정 리보스위치, 상이한 종류의 리보스위치 또는 상이한 부류의 리보스위치일 수 있다. 또한, 이종 앱타머는 비-리보스위치 앱타머로부터 유래될 수 있다. 이종 발현 플랫폼 도메인은 비-리보스위치 공급원으로부터 유래될 수도 있다.

변경된 리보스위치 또는 유도체 리보스위치는 시험관내 선별 및 진화 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 리보스위치에 적용되는 시험관내 진화 기법은 리보스위치 서열의 일부가 변경되어 있지만 리보스위치의 나머지 부분이 변경되지 않은 상태로 유지되어 있는 변이체 리보스위치 세트를 제조하는 단계를 포함한다. 그 다음, 변이체 리보스위치 세트의 활성화, 불활성화 또는 차단(또는 다른 기능적 또는 구조적 기준)을 평가할 수 있고, 원하는 기준을 충족시키는 변이체 리보스위치를 사용 또는 추가 진화 순환을 위해 선별할 수 있다. 변이체의 발생에 유용한 염기 리보스위치는 본 명세서에 개시된 특정 또는 공통 리보스위치이다. 공통 리보스위치는 시험관내 선별 및 진화를 위해 리보스위치의 어느 부분을 변경하여야 할지를 알아내는 데 사용될 수 있다. 식물 TPP-반응성 리보스위치의 공통 서열은 도 1b에 도시되어 있다.

본 명세서에는 조절이 변경된 변형된 리보스위치도 개시되어 있다. 리보스위치의 조절은 앱타머 도메인을 리보스위치(키메라 리보스위치)의 발현 플랫폼 도메인에 작동가능하게 연결함으로써 변경할 수 있다. 이어서, 앱타머 도메인은 예를 들어, 상기 앱타머 도메인의 유발 분자의 작용을 통해 리보스위치의 조절을 매개할 수 있다. 앱타머 도메인은 예를 들어, 리보스위치의 정상 또는 천연 앱타머 도메인을 신규 앱타머 도메인으로 치환시키는 방법을 포함하는 임의의 적당한 방법으로 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인에 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 일반적으로, 앱타머 도메인의 출처인 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 임의의 화합물 또는 조건은 키메라 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에는 불활성화된 리보스위치도 개시되어 있다. 리보스위치는 리보스위치를 공유결합적으로 변경함으로써(예를 들어, 리보스위치의 일부를 가교결합시키거나 화합물을 리보스위치에 커플링시킴으로써) 불활성화시킬 수 있다. 이러한 방식의 리보스위치 불활성화는 예를 들어, 유발 분자가 리보스위치에 결합하는 것을 방해하거나, 유발 분자의 결합 시 리보스위치의 상태 변화를 방해하거나, 또는 유발 분자의 결합 시 리보스위치의 발현 플랫폼 도메인이 발현에 영향을 미치는 것을 방해하는 변경으로부터 비롯될 수 있다.

또한, 본 명세서에는 바이오센서 리보스위치가 개시되어 있다. 바이오센서 리보스위치는 그의 동족 유발 분자의 존재 하에서 검출가능한 신호를 발생시키는 개조된 리보스위치이다. 유용한 바이오센서 리보스위치는 유발 분자의 역치 수준 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 리보스위치는 생체내 또는 시험관내에서 사용되도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 신호로서 작용하는 단백질 또는 신호를 발생시키는 데 관여하는 단백질을 코딩하는 레포터 RNA에 작동가능하게 연결된 바이오센서 리보스위치는 리보스위치/레포터 RNA를 코딩하는 핵산 구축물을 보유하도록 세포 또는 유기체를 개조함으로써 생체 내에서 사용할 수 있다. 시험관내에서 사용되는 바이오센서 리보스위치의 일례는 리보스위치의 활성화 상태에 의존하는 변화를 표시하는 신호인 구조-의존적 표지를 포함하는 리보스위치이다. 이러한 바이오센서 리보스위치는 바람직하게는 천연발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연발생적 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다. 바이오센서 리보스위치는 다양한 상황 및 플랫폼에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이오센서 리보스위치는 고체 지지체, 예컨대, 플레이트, 칩, 스트립 및 웰과 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에는 새로운 유발 분자를 인식하는 변경된 리보스위치 또는 유도체 리보스위치가 개시되어 있다. 새로운 유발 분자를 인식하는 새로운 리보스위치 및/또는 새로운 앱타머는 공지된 리보스위치에 대해 선별될 수 있거나, 공지된 리보스위치로부터 디자인될 수 있거나, 또는 공지된 리보스위치로부터 유도될 수 있다. 이것은 예를 들어, 리보스위치 내의 앱타머 변이체 세트를 생성하는 단계, 원하는 화합물의 존재 하에서 변이체 리보스위치의 활성화를 평가하는 단계, 활성화된 변이체 리보스위치(또는, 예를 들어, 가장 고도로 또는 가장 선별적으로 활성화된 리보스위치)를 선별하는 단계, 및 원하는 활성, 특이성, 활성과 특이성의 조합 또는 성질들의 다른 조합을 갖는 변이체 리보스위치를 수득할 때까지 상기 단계들을 반복하는 단계에 의해 달성될 수 있다.

일반적으로, 임의의 앱타머 도메인은 발현 플랫폼 도메인 내의 조절된 가닥이 앱타머 도메인의 대조군 가닥에 상보적이도록 설계하거나 개조함으로써 임의의 발현 플랫폼 도메인과 함께 사용되도록 개조될 수 있다. 별법으로, 앱타머의 서열 및 앱타머 도메인의 대조군 가닥의 서열은 상기 대조군 가닥이 발현 플랫폼 내의 기능적으로 유의한 서열에 상보적이도록 개조될 수 있다.

본 명세서에는 이종 리보스위치 및 코딩 영역을 포함하는 RNA 분자도 개시되어 있다. 즉, 상기 RNA 분자는 한 공급원으로부터의 리보스위치 및 또 다른 공급원으로부터의 코딩 영역으로 구성된다. 상기 이종 공급원은 예를 들어, 상이한 RNA 분자, 상이한 전사체, 상이한 유전자로부터의 RNA 또는 전사체, 상이한 세포로부터의 RNA 또는 전사체, 상이한 유기체로부터의 RNA 또는 전사체, 상이한 종으로부터의 RNA 또는 전사체, 천연 서열 및 인공 또는 개조된 서열, 특정 리보스위치, 상이한 종류의 리보스위치 또는 상이한 부류의 리보스위치일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "코딩 영역"은 아미노산을 코딩하는 핵산의 임의의 영역을 지칭한다. 이것은 코돈 또는 코돈에 대한 주형을 포함하는 핵산 가닥, 이중가닥 핵산 분자의 경우 상기 핵산 가닥의 상보체 둘다를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 아닌 핵산의 영역은 비-코딩 영역으로 지칭될 수 있다. 전형적으로 전사되는 mRNA 분자는 5' 말단 및 3' 말단 둘다에서 비-코딩 영역을 포함한다. 진핵 mRNA 분자는 내부 비-코딩 영역, 예컨대, 인트론도 포함할 수 있다. 특정 종류의 RNA 분자는 기능성 코딩 영역, 예컨대, tRNA 및 rRNA 분자를 포함하지 않는다.

1. 앱타머 도메인

앱타머는 특정 화합물 및 특정 부류의 화합물에 선별적으로 결합할 수 있는 핵산 분절 및 구조체이다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 시 상기 리보스위치의 상태 또는 구조를 변화시키는 앱타머 도메인을 갖는다. 기능적 리보스위치에서, 앱타머 도메인에 연결된 발현 플랫폼 도메인의 상태 또는 구조는 유발 분자가 상기 앱타머 도메인에 결합할 때 변한다. 리보스위치의 앱타머 도메인은 예를 들어, 리보스위치의 천연 앱타머 도메인, 인공 앱타머, 개조된, 선별된, 진화된 또는 유도된 앱타머 또는 앱타머 도메인을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 리보스위치 내의 앱타머는 일반적으로 예컨대, 줄기 구조를 형성함으로써 상기 연결된 발현 플랫폼 도메인의 일부와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 부분을 갖는다. 상기 줄기 구조는 유발 분자의 결합 시 형성되거나 파괴될 것이다.

다양한 천연 리보스위치의 공통 앱타머 도메인은 미국 특허출원 공개 제2005-0053951호의 도 11 및 본 명세서의 임의의 부분에 나타나 있다. 상기 앱타머 도메인(이의 모든 직접적인 변이체를 포함함)은 리보스위치 내에서 사용될 수 있다. 공통 서열 및 구조는 서열 및 구조 내의 변이를 표시한다. 표시된 변이 내에 있는 앱타머 도메인은 본 명세서에서 직접적 변이체로서 지칭된다. 상기 앱타머 도메인은 변형된 또는 변이체 앱타머 도메인을 생성하도록 변형될 수 있다. 보존적 변형은 염기쌍 내의 뉴클레오티드가 상보적인 상태를 유지하도록 염기쌍이 형성된 뉴클레오티드에서의 임의의 변화를 포함한다. 중등도(moderate) 변경은 표시된 길이 범위의 20% 이하의 줄기 또는 루프(이에 대한 길이 또는 길이 범위는 표시되어 있음)의 길이의 변화를 포함한다. 루프 및 줄기 길이는 공통 구조가 특정 길이의 줄기 또는 루프를 보여주는 경우 또는 길이 범위가 기재되어 있거나 도시되어 있는 경우 "표시된" 것으로 간주된다. 중등도 변경은 표시된 길이 범위의 40% 이하의 줄기 또는 루프(이에 대한 길이 또는 길이 범위는 표시되어 있지 않음)의 길이의 변화를 포함한다. 중등도 변경은 앱타머 도메인의 비-특정된 부분의 기능적 변이체도 포함한다.

개시된 리보스위치의 앱타머 도메인은 임의의 다른 목적을 위해 사용될 수도 있고 임의의 다른 내용에서 앱타머로서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 앱타머는 구조 변화가 RNA의 기능에 영향을 미칠 수 있는 경우 리보자임, 다른 분자 스위치 및 임의의 RNA 분자를 조절하는 데 사용될 수 있다.

2. 발현 플랫폼 도메인

발현 플랫폼 도메인은 리보스위치를 포함하는 RNA 분자의 발현에 영향을 미치는 리보스위치의 일부이다. 발현 플랫폼 도메인은 일반적으로, 예컨대, 줄기 구조를 형성함으로써 그 자신에 연결된 앱타머 도메인의 일부와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 부위를 갖는다. 이 줄기 구조는 유발 분자의 결합 시 형성되거나 파괴될 것이다. 상기 줄기 구조는 일반적으로 발현 조절 구조이거나 발현 조절 구조의 형성을 방해한다. 발현 조절 구조는 상기 구조를 보유하는 RNA 분자의 발현을 허용하거나, 방해하거나, 상승시키거나 또는 억제하는 구조이다. 그 예로는 샤인-달가노 서열, 개시 코돈, 전사 종결자, 안정성 신호, 및 프로세싱 신호, 예컨대, RNA 스플라이싱 접합부 및 조절 요소 또는 폴리아데닐화 신호 및 3' 말단 신호가 포함된다. 스플라이싱 조절의 경우, 스플라이스 접합부, 택일적 스플라이스 접합부, 및/또는 발현 플랫폼 도메인 내의 인트론의 분지 부위를 포함하는 것이 유용하다. 상기 발현 플랫폼 도메인과 리보스위치의 앱타머 도메인 내의 서열의 상호작용은 발현 플랫폼 도메인과 앱타머 도메인 사이의 상보적 서열에 의해 매개될 수 있다.

B. 조절된 구축물

본원에 기재된 바와 같이, 리보스위치는 RNA 분자의 발현을 조절하고 이에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다. 발현 플랫폼 도메인은 작동가능하게 연결되어 이러한 조절 및 제어를 허용하거나 매개하거나 촉진할 수 있다. 이것은 발현 플랫폼 도메인 서열 내에, 부근에 또는 이와 함께 특정 서열 및 구조를 조합하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 개시된 TPP 리보스위치는 RNA의 3' UTR 내에 및 3' UTR 내의 인트론과 연관되어 존재할 수 있다. 이들 조합된 서열은 리보스위치 조절된 구축물 또는 조절된 구축물로서 지칭될 수 있다. 여기서, 조절된 구축물은 리보스위치(앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인으로 이루어진), 조절된 인트론(발현 플랫폼 도메인 및 앱타머 도메인 부분을 포함할 수 있음) 및 다른 엑손 3' UTR 서열을 포함할 수 있다. 엑손 3' UTR 서열은 리보스위치로부터의 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이것은 예를 들면 리보스위치 및 조절된 구축물의 디자인, 인트론의 스플라이싱의 발생 유무, 또는 RNA 프로세싱이 영향을 받는 방법에 좌우될 수 있다. 편의상, 선택사항 중 하나, 즉 RNA의 활성 및/또는 우세한 형태의 3' UTR 서열이 활성 3' UTR 서열로 지칭될 수 있다. 예로서, THIC RNA의 II 형태의 3' UTR 서열은 이들 RNA의 활성 3' UTR 서열이다. 개시된 리보스위치 및 구축물은 RNA 프로세싱을 조절하고 이에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 조절된 구축물은 또한 리보스위치, 인트론 또는 활성 3' UTR 서열의 부분이 아닌 다른 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 개시된 THIC RNA는 활성 3' UTR 서열의 3' 말단 서열과 리보스위치의 앱타머 도메인 사이에 서열을 포함한다(도 8 참조). 이러한 서열은 이격자(spacer) 3' UTR 서열로 지칭될 수 있다.

개시된 구축물 및 RNA는 리보스위치, 인트론, 활성 3' UTR 서열 및 이격자 3' UTR 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 이들 요소 및 서열의 일부는 중첩될 수 있다. 이러한 구축물의 예는 실시예 1에 기재되어 있고 도 8에 도시되어 있다. 도 8은 이러한 조절된 구축물의 천연발생적 형태의 예를 도시한다. 동일한 천연발생적 조절된 구축물로부터의 리보스위치, 인트론, 활성 3' UTR 서열 및 이격자 3' UTR 서열을 사용하는 것이 유용하다. 따라서, 예를 들면, 천연발생적 유전자 내에서 리보스위치의 정지 코돈으로부터 3' 말단까지 전체 영역은 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절된 구축물 내에 함께 사용될 수 있다. 이러한 구축물의 예는 실시예 1에 기재되어 있다. 별법으로, 상이한 조절된 구축물로부터의 상이한 서열은 치환될 수 있거나 상이한 또는 유도체 리보스위치 또는 앱타머 도메인은 다른 인트론, 활성 3' UTR 서열 및/또는 이격자 3' UTR 서열과 조합될 수 있다. 예를 들면, 공통 또는 유도체 앱타머 도메인이 조절된 구축물 내에 사용될 수 있다.

C. 유발 분자

유발 분자는 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 분자 및 화합물이다. 이것은 리보스위치에 대한 천연 또는 정상 유발 분자 및 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 다른 화합물을 포함한다. 천연 또는 정상 유발 분자는 천연 상태의 소정의 리보스위치에 대한 유발 분자이거나, 또는 일부 비-천연 리보스위치의 경우 리보스위치의 디자인 또는 리보스위치의 선별(예컨대, 시험관내 선별 또는 시험관내 진화 기법에 의한 선별)에서 사용되는 유발 분자이다.

D. 화합물

본 명세서에는 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 화합물, 및 상기 화합물을 함유하는 조성물도 개시되어 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 화합물은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 데 사용될 수 있다. 리보스위치에 대한 유발 분자(및 다른 활성화 화합물)는 리보스위치를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 상기 유발 분자 이외의 화합물은 일반적으로 리보스위치를 불활성화시키거나 차단하는 데 사용될 수 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치의 존재 하에서 유발 분자를 제거함에 의해 불활성화될 수도 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키지 않는 유발 분자의 유사체의 결합에 의해 차단될 수 있다.

본 명세서에는 RNA 분자의 발현을 변경하거나(예를 들어 RNA의 스플라이싱 또는 프로세싱을 변경함으로써) 또는 RNA 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 변경하는 화합물도 개시되어 있는데, 이때 상기 RNA 분자는 리보스위치를 포함한다. 이것은 화합물을 RNA 분자와 접촉시켜 달성할 수 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 따라서, 리보스위치를 포함하는 원하는 RNA 분자를 상기 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 조건으로 처리함으로써 RNA의 발현을 변경(예를 들어 RNA의 스플라이싱 또는 프로세싱을 변경함으로써)할 수 있다. 발현은 예를 들어, 전사의 종결 또는 리보좀과 RNA의 결합 차단의 결과로서 변경될 수 있다. 유발 분자의 결합은 리보스위치의 성질에 따라 RNA 분자의 발현을 감소시키거나 방해하거나, 또는 RNA 분자의 발현을 촉진하거나 증가시킬 수 있다.

본 명세서에는 RNA 분자의 발현, 또는 RNA 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 화합물도 개시되어 있다. 또한, 본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단함으로써 리보스위치를 함유하는 천연발생적 유전자 또는 RNA의 발현을 조절하는 화합물이 개시되어 있다. 상기 유전자가 이 유전자를 보유하는 세포 또는 유기체의 생존에 필수적인 경우, 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단은 상기 세포 또는 유기체의 사망, 생장 정지 또는 약화를 초래할 수 있다.

본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단함으로써 상기 리보스위치를 포함하는 단리된, 개조된 또는 재조합 유전자 또는 RNA의 발현을 조절하는 화합물도 개시되어 있다. 본 명세서에 개시된 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 조절하기 때문에, 상기 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단은 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 이러한 조절을 위한 1차 조절로서의 리보스위치의 이점은 리보스위치 유발 분자가 작은 비-항원성 분자일 수 있다는 점이다.

본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하는 방법도 개시되어 있다. 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키는 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고 리보스위치의 활성화를 평가함으로써 동정할 수 있다. 리보스위치가 활성화되는 경우, 시험 화합물은 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정된다. 리보스위치의 활성화는 임의의 적절한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 리보스위치는 레포터 RNA에 연결될 수 있고, 상기 레포터 RNA의 발현, 발현 수준 또는 발현 수준 변화가 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 측정될 수 있다. 또 다른 예로서, 리보스위치는 리보스위치의 활성화 상태에 의존하는 변화를 표시하는 신호인 구조-의존적 표지를 포함할 수 있다. 이러한 리보스위치는 바람직하게는 천연발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연발생적 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 리보스위치의 활성화 평가는 대조군 분석 또는 측정을 이용하거나 이용하지 않고 수행될 수 있다. 리보스위치를 불활성화시키는 화합물의 동정 방법은 유사한 방식으로 수행될 수 있다.

리보스위치를 차단하는 화합물의 동정은 임의의 적당한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 분석은 리보스위치를 활성화시키거나 불활성화시키는 것으로 공지되어 있는 화합물의 존재 및 시험 화합물의 존재 하에서 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 활성화 또는 불활성화가 시험 화합물의 부재 하에서 관찰되는 것처럼 관찰되지 않는 경우, 시험 화합물은 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 차단하는 화합물로서 동정된다.

본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하고 동정된 화합물을 제조함으로써 수득된 화합물도 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서의 임의의 부분에 개시되어 있는 화합물 동정 방법을 동정된 화합물의 제조 방법과 조합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고, 리보스위치의 활성화를 평가하고, 리보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화되는 경우, 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득될 수 있다.

또한, 본 명세서에는 화합물에 의한 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단을 조사하고 조사된 화합물을 제조함으로써 수득된 화합물도 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서의 임의의 부분에 개시된 화합물 활성화, 불활성화 또는 차단 평가 방법과 조사된 화합물의 제조 방법을 조합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고, 리보스위치의 활성화를 평가하고, 리보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화되는 경우, 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득될 수 있다. 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물의 능력에 대해 화합물을 조사하는 것은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이전에 공지되지 않은 화합물을 동정하는 것, 및 화합물이 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이미 공지되어 있는 경우 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단화하는 화합물의 능력을 평가하는 것 둘다를 의미한다.

본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키는 데 사용될 수 있는 구체적인 화합물들도 개시되어 있다. TPP-반응성 리보스위치에서 유용한 화합물은 TPP-반응성 리보스위치 또는 이의 유도체에 결합할 수 있는 하기 화학식 I의 화합물을 포함한다:

상기 식에서,

R₁은 양으로 하전되어 있고,

R₂ 및 R₃은 서로 독립적으로 C, O 또는 S이고,

R₄는 CH₃, NH₂, OH, SH 또는 H이거나 존재하지 않고,

R₅는 CH₃, NH₂, OH, SH 또는 H이고,

R₆은 C 또는 N이며,

는 서로 독립적으로 단일 또는 이중 결합을 표시한다.

R₁이 포스페이트, 다이포스페이트 또는 트라이포스페이트인 상기 정의된 화합물도 고려된다.

상기 정의 내에 있는 모든 화합물은 본 명세서에 구체적으로 개시되도록 의도되고 본 명세서에 구체적으로 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 또한, 상기 정의 내에서 확인될 수 있는 모든 하위군은 본 명세서에 구체적으로 개시되도록 의도되고 본 명세서에 구체적으로 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 임의의 화합물 또는 화합물의 하위군은 화합물의 사용에 구체적으로 포함될 수 있거나 사용으로부터 배제될 수 있거나, 또는 화합물의 목록에 포함될 수 있거나 화합물의 목록으로부터 배제될 수 있다. 예를 들어, 한 방법으로서 일군의 화합물은 각 화합물이 상기 정의된 바와 같되 TPP, TP 또는 티아민이 아닌 경우 고려된다. 또 다른 예로서, 일군의 화합물은 각 화합물이 상기 정의된 바와 같고 TPP-반응성 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 경우 고려된다. TPP는 TPP-반응성 리보스위치용 유발 분자이고 TPP-반응성 리보스위치를 활성화시킬 수 있다. 피리티아민 피로포스페이트는 TPP-반응성 리보스위치를 활성화시킬 수 있다. 피리티아민 및 피리티아민 피로포스페이트는 본 명세서에 개시된 화합물, 유발 분자 및 방법에 독립적으로 및 구체적으로 포함될 수 있거나 본 명세서에 개시된 화합물, 유발 분자 및 방법으로부터 독립적으로 및 구체적으로 배제될 수 있다.

E. 구축물, 벡터 및 발현 시스템

개시된 리보스위치는 임의의 적절한 발현 시스템과 함께 사용될 수 있다. 재조합 발현은 벡터, 예컨대, 플라스미드를 사용하여 유용하게 달성한다. 상기 벡터는 발현될 리보스위치-코딩 서열 및 RNA(예컨대, 단백질 코딩 RNA)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 전사 및 번역에 필요한 다른 요소들도 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 벡터는 외래 DNA를 함유하는 임의의 운반체를 지칭한다. 따라서, 벡터는 외래 핵산을 분해 없이 세포 내로 수송하는 물질이고 핵산이 전달되는 세포 내에서 핵산을 발현시키는 프로모터를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 핵산, 바이러스, 파지 핵산, 파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 리보스위치-조절된 구축물을 운반하기에 적합한 다양한 원핵 발현 벡터 및 진핵 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 예를 들어, pET, pET3d, pCR2.1, pBAD, pUC 및 효모 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 예를 들어, 다양한 생체내 및 시험관내 조건 하에서 사용될 수 있다.

바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 향신경성 바이러스, 신드비스(Sindbis) 및 다른 RNA 바이러스(HIV 골격을 갖는 바이러스를 포함함)를 포함한다. 벡터로서 사용되기에 적합하게 만드는 바이러스의 성질을 공유하는 임의의 바 이러스 패밀리도 유용하다. 버마(Verma)(1995)에 기재된 레트로바이러스 벡터는 뮤린 말로니 백혈병 바이러스(MMLV), 및 벡터로서의 MMLV의 바람직한 성질을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비-구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소(polymerase) III 전사체, 복제 및 캡시드화에 필수적인 도립된 말단 반복부, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 조절하는 프로모터를 함유한다. 바이러스가 벡터로서 개조된 경우, 전형적으로 바이러스의 초기 유전자들 중 1가지 이상은 제거되고, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈 내로 삽입된다.

"프로모터"는 일반적으로 전사 개시 부위에 대해 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. "프로모터"는 RNA 중합효소 및 전사 인자의 기본 상호작용에 필요한 핵심 요소를 함유하고 상류 요소 및 반응 요소를 함유할 수 있다.

"증강자"(enhancer)는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 기능하는 DNA의 서열을 의미하고 전사 단위에 대해 5'(Laimins, 1981) 또는 3'(Lusky et al., 1983) 방향에 존재할 수 있다. 나아가, 증강자는 인트론 내에 존재할 수 있을 뿐만 아니라(Banerji et al., 1983) 코딩 서열 자체 내에도 존재할 수 있다(Osborne et al., 1984). 증강자의 길이는 통상 10 내지 300 bp이고, 증강자는 시스(cis)로 작용한다. 증강자는 근처에 있는 프로모터로부터의 전사를 증가시키는 작용을 한다. 프로모터처럼 증강자도 종종 전사 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 증강자는 종종 발현의 조절을 결정한다.

진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사 종결에 필요한 서열을 함유할 수도 있다. 이 영역은 조직 인자 단백질을 코딩하는 mRNA의 비-번역 부분 내에 있는 폴리아데닐화된 분절로서 전사된다. 3' UTR은 전사 종결 부위도 포함한다. 전사 단위는 폴리아데닐화 영역도 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 이점은 상기 영역이, 전사된 단위가 mRNA처럼 프로세싱되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 점이다. 발현 구축물 내의 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용은 잘 확립되어 있다. 전이유전자 구축물 내의 동종 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것이 바람직하다.

벡터는 마커 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포로 전달되고 일단 전달되면 발현되는지를 확인하는 데 사용된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 에스케리치아 콜라이 lacZ 유전자이다.

일부 실시양태에서, 마커는 선별가능한 마커일 수 있다. 이러한 선별가능한 마커가 숙주 세포 내로 성공적으로 전달된 경우, 형질전환된 숙주 세포는 선별 압력 하에 놓였을 때 생존할 수 있다. 널리 이용되는 2가지 상이한 선별 방법이 있다. 첫 번째 방법은 세포 대사, 및 보충된 배지와 무관하게 생장하는 능력을 결여하는 돌연변이체 세포주(cell line)의 사용에 기초한 방법이다. 두 번째 방법은 임의의 세포 종류에서 이용되며 돌연변이체 세포주의 사용을 필요로 하지 않는 선별 방법을 의미하는 우성 선별이다. 상기 방법은 전형적으로 숙주 세포의 생장을 정지시키기 위한 약물을 사용한다. 신규 유전자를 갖는 세포는 약물 내성을 전달하는 단백질을 발현할 것이고 선별에서 생존할 것이다. 상기 우성 선별의 예는 네오마이신(Southern and Berg, 1982), 마이코페놀산(Mulligan and Berg, 1980) 또는 하이그로마이신(Sugden et al., 1985)을 사용한다.

유전자 전달은 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 유전 물질의 직접적인 전달, 또는 세포 또는 담체, 예컨대, 양이온성 리포좀 내의 유전 물질의 전달을 통해 달성될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있도록 용이하게 개조될 수 있다. 전달 벡터는 유전자를 세포 내로 전달하는 데 사용되는 임의의 뉴클레오티드 구축물(예컨대, 플라스미드)일 수 있거나, 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적 수단의 일부, 예컨대, 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 일부일 수 있다(문헌[Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)]). 바이러스 벡터, 화학적 형질감염체, 또는 물리-기계적 방법, 예컨대, 전기천공 및 DNA의 직접적 확산을 비롯한, 형질감염에 적합한 수단은 예를 들어, 문헌[Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990)] 및 [Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)]에 기재되어 있다.

1. 바이러스 벡터

바람직한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 향신경성 바이러스, 신드비스 및 다른 RNA 바이러스(HIV 골격을 갖는 바이러스를 포함함)이다. 벡 터로서 사용되기에 적합하게 만드는 바이러스의 성질을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리도 바람직하다. 바람직한 레트로바이러스는 MMLV, 및 벡터로서의 MMLV의 바람직한 성질을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 큰 유전적 적재물, 즉 전이유전자 또는 마커 유전자를 운반할 수 있고 이러한 이유로 통상적으로 사용되는 벡터이다. 그러나, 레트로바이러스 벡터는 비-증식 세포에서는 유용하지 않다. 아데노바이러스 벡터는 비교적 안정하고 다루기 용이하며 높은 역가를 갖고 에어로졸 제제로 전달될 수 있고 비-분열 세포를 형질감염시킬 수 있다. 폭스 바이러스 벡터는 유전자를 삽입하기 위한 여러 부위를 갖기 때문에 열적 안정성을 나타내며 실온에서 저장될 수 있다. 바람직한 실시양태는 바이러스 항원에 의해 유발되는 숙주 유기체의 면역 반응을 억제하도록 개조된 바이러스 벡터이다. 이러한 종류의 바람직한 벡터는 인터루킨 8 또는 10에 대한 코딩 영역을 운반할 것이다.

바이러스 벡터는 유전자를 세포 내로 도입하는 대부분의 화학적 또는 물리적 방법보다 더 높은 처리능력(유전자 도입 능력)을 갖는다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비-구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 캡시드화에 필요한 도립된 말단 반복부, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 조절하는 프로모터를 함유한다. 바이러스가 벡터로서 개조된 경우, 전형적으로 바이러스의 초기 유전자들 중 1가지 이상의 초기 유전자가 제거되어 있고 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈 내로 삽입되어 있다. 이러한 종류의 구축물은 약 8 kb 이하의 외래 유전 물질을 운반할 수 있다. 제거된 초기 유전자의 필수적 기능은 전형적으로 상기 초기 유전자의 유전자 생성물을 트랜스(trans)로 발현하도록 개조된 세포주에 의해 공급된다.

i. 레트로바이러스 벡터

레트로바이러스는 임의의 종류, 하위패밀리, 속 또는 주성을 비롯한 레트로비리대의 바이러스 패밀리에 속하는 동물 바이러스이다. 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)]에 기재되어 있다. 유전자 요법을 위해 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법의 예는 그 교시가 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,868,116호 및 제4,980,286호, 국제특허출원 공개 제WO 90/02806호 및 제WO 89/07136호, 및 문헌[Mulligan, Science 260:926-932 (1993)]에 기재되어 있다.

레트로바이러스는 본질적으로 핵산 적재물로 채워진 팩키지이다. 핵산 적재물은 복제된 딸분자가 팩키지 코트 내에 효율적으로 팩키징되게 하는 팩키징 신호를 보유한다. 팩키징 신호 이외에, 복제 및 복제된 바이러스의 팩키징을 위해 시스로 요구되는 다수의 분자가 존재한다. 전형적으로, 레트로바이러스 게놈은 단백질 코트의 제조에 관여하는 gag, pol 및 env 유전자를 함유한다. 표적 세포로 전달되는 외래 DNA에 의해 전형적으로 치환되는 유전자는 gag, pol 및 env 유전자이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 팩키지 코트 내로의 도입을 위한 팩키징 신호; gag 전사 단위의 시작 부위임을 알려주는 서열; 역전사의 tRNA 프라이머와 결합하는 프라이머 결합 부위를 포함하는 역전사에 필요한 요소; DNA 합성 과정 동 안에 RNA 가닥의 전환을 안내하는 말단 반복부 서열; DNA 합성의 제2 가닥의 합성을 위한 프라이밍 부위로서 작용하는 5' 방향으로부터 3' 방향으로의 퓨린 풍부 서열 LTR; 및 DNA 상태의 레트로바이러스가 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있게 하는, LTR의 말단 근처에 있는 특정 서열을 함유한다. gag, pol 및 env 유전자의 제거는 약 8 kb의 외래 서열이 바이러스 게놈 내로 삽입되어 역전사될 수 있게 하고 복제 시 새로운 레트로바이러스 입자 내로 팩키징될 수 있게 한다. 이러한 양의 핵산은 각 전사체의 크기에 따라 1개 유전자 내지 많은 수의 유전자의 전달에 충분하다. 다른 유전자들과 함께 양성 또는 음성 선별가능한 마커를 삽입체 내에 포함시키는 것이 바람직하다.

대부분의 레트로바이러스 벡터 내의 복제 기구 및 팩키징 단백질(gag, pol 및 env)은 제거되어 있기 때문에, 벡터는 전형적으로 상기 벡터를 팩키징 세포주 내에 도입함으로써 발생된다. 팩키징 세포주는 복제 및 팩키징 기구를 함유하나 임의의 팩키징 신호를 갖지 않은 레트로바이러스로 형질감염되거나 형질전환된 세포주이다. 선택된 DNA를 운반하는 벡터가 상기 세포주 내로 형질감염되는 경우, 원하는 유전자를 함유하는 벡터는 헬퍼(helper) 세포에 의해 시스로 제공된 기구에 의해 복제되어 새로운 레트로바이러스 입자 내로 팩키징된다. 상기 기구에 대한 게놈은 상기 게놈이 필수적인 신호를 결여하고 있기 때문에 팩키징되지 않는다.

ii . 아데노바이러스 벡터

복제-결손 아데노바이러스의 구축은 문헌[Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj- Ahmad et al., J. Virology 51:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)]에 기재되어 있다. 벡터로서의 상기 바이러스 사용의 이점은 상기 바이러스가 초기 감염된 세포 내에서 복제할 수 있되 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없기 때문에 다른 세포 종류로 퍼질 수 있는 정도에 있어서 한계가 있다는 점이다. 재조합 아데노바이러스는 기도 상피, 간세포, 혈관 상피, 중추신경계(CNS) 실질조직 및 다수의 다른 조직 부위로의 직접적인 생체내 전달 후 높은 효율의 유전자 전달을 달성하는 것으로 밝혀져 있다(Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). 재조합 아데노바이러스는 이 바이러스가 특정 세포 표면 수용체에 결합한 후 상기 바이러스가 야생형과 동일한 방식 또는 복제-결손 아데노바이러스와 동일한 방식으로 수용체-매개된 세포내이입에 의해 내부이입됨으로써 유전자 형질도입을 달성한다(Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).

바람직한 바이러스 벡터는 E1 유전자가 제거되어 있는 아데노바이러스를 기초로 한 바이러스 벡터이고, 이 비리온은 인간 293 세포주와 같은 세포주 내에서 발생된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, E1 유전자 및 E3 유전자 둘다 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다.

바이러스 벡터의 또 다른 종류는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 기초로 한 것이다. 이 결손 파보바이러스는 이것이 많은 종류의 세포를 감염시킬 수 있고 인간에 대해 비-병원성을 나타내기 때문에 바람직한 벡터이다. AAV 유형 벡터는 약 4 내지 5 kb를 수송할 수 있고, 야생형 AAV는 19번 염색체 내로 안정하게 삽입되는 것으로 공지되어 있다. 이 부위 특이적 삽입 성질을 갖는 벡터가 바람직하다. 이러한 종류의 벡터의 특히 바람직한 실시양태는 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코에 소재하는 아비겐(Avigen)에 의해 제조된 P4.1 C 벡터인데, 이 벡터는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 유전자인 HSV-tk 및/또는 마커 유전자, 예컨대, 녹색 형광 단백질인 GFP를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있다.

바이러스 및 레트로바이러스 내에 삽입된 유전자는 통상 프로모터, 및/또는 원하는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 데 도움을 주는 증강자를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 개시 부위에 대해 상대적으로 고정된 위치에 존재하는 경우 작용하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소와 전사 인자의 기본 상호작용에 필요한 핵심 요소를 함유하고 상류 요소 및 반응 요소를 함유할 수 있다.

2. 바이러스 프로모터 및 증강자

포유동물 숙주 세포 내에서 벡터로부터의 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들어, 폴리오마, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득될 수 있거나, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터로부터 수득될 수 있다. SV40 바이러스의 초기 프로모터 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다(Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다(Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). 물론, 숙주 세포 또는 관련된 종으로부터 유래된 프로모터도 본원에서 유용하다.

증강자는, 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 작용하고 전사 단위에 대해 5' 방향(Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) 또는 3' 방향(Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983))으로 존재할 수 있는 DNA의 서열을 의미한다. 나아가, 증강자는 한 인트론 내에 존재할 수 있을 뿐만 아니라(Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)) 코딩 서열 자체 내에서도 존재할 수 있다(Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)). 증강자의 길이는 통상 10 내지 300 bp이고 증강자는 시스로 작용한다. 증강자는 근처에 있는 프로모터로부터의 전사를 증가시키는 작용을 한다. 또한, 증강자는 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 종종 함유한다. 프로모터 또한 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 함유할 수 있다. 증강자는 종종 유전자의 발현의 조절을 결정한다. 현재 많은 증강자 서열이 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있지만, 전형적으로 진핵 세포 바이러스로부터 유래된 증강자가 사용될 것이다. 바람직한 예는 복제 기점의 후측 상에 존재하는 SV40 증강자(100 내지 270 bp), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 증강자, 복제 기점의 후측 상에 존재하는 폴리오마 증강자 및 아데노바이러스 증강자이다.

프로모터 및/또는 증강자는 이들의 작용을 유발하는 광 또는 특정 화학적 사건에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 조사, 예컨대, 감마 조사 또는 알킬화 화학요법 약물에의 노출을 통해 바이러스 벡터 유전자 발현을 상승시키는 방법도 있다.

프로모터 및/또는 증강자 영역은 모든 종류의 진핵 세포에서 활성을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 종류의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터(650개 염기)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(전장 프로모터) 및 레트로바이러스 벡터 LTF이다.

모든 특이적 조절 요소가 클로닝되어 특정 종류의 세포, 예컨대, 흑색종 세 포 내에서 선별적으로 발현되는 발현 벡터를 구축하는 데 사용될 수 있다. 신경교원섬유 아세트산 단백질(GFAP) 프로모터가 신경교원 유래의 세포 내에서 유전자를 선별적으로 발현하는 데 사용되어 왔다.

진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사 종결에 필요한 서열도 함유할 수 있다. 이 영역은 조직 인자 단백질을 코딩하는 mRNA의 비-번역 부분 내에 있는 폴리아데닐화된 분절로서 전사된다. 3' UTR은 전사 종결 부위도 포함한다. 전사 단위는 폴리아데닐화 영역도 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 이점은 상기 영역이, 전사된 단위가 mRNA처럼 프로세싱되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 점이다. 발현 구축물 내의 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용은 잘 확립되어 있다. 전이유전자 구축물 내의 동종 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것이 바람직하다. 전사 단위의 바람직한 실시양태에서, 폴리아데닐화 영역은 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유래되고 약 400개의 염기로 구성된다. 또한, 전사된 단위는 다른 표준 서열만을 함유하거나 상기 서열과 함께 구축물의 발현 또는 안정성을 개선시키는 것이 바람직하다.

3. 마커

벡터는 마커 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포로 전달되고 일단 전달되면 발현되는지를 확인하는 데 사용된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 에스케리치아 콜라이 lacZ 유전자이다.

일부 실시양태에서, 마커는 선별가능한 마커일 수 있다. 포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 하이그로마이신 및 퓨로마이신이다. 이러한 선별가능한 마커가 포유동물 숙주 세포 내로 성공적으로 전달된 경우, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선별 압력 하에 놓였을 때 생존할 수 있다. 널리 이용되는 2가지 상이한 선별 방법이 있다. 첫 번째 방법은 세포 대사, 및 보충된 배지와 무관하게 생장하는 능력을 결여하는 돌연변이체 세포주의 사용에 기초한 방법이다. 이의 두 가지 예는 CHO DHFR^- 세포 및 마우스 LTK^- 세포이다. 상기 세포들은 티미딘 또는 하이포잔틴과 같은 영양분을 첨가하지 않은 상태에서 생장하는 능력을 결여하고 있다. 상기 세포들이 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필수적인 특정 유전자를 결여하고 있기 때문에, 상기 세포들은 빠진 뉴클레오티드가 보충된 배지 중에 제공되어 있지 않은 한 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 다른 방법은 완전한 DHFR 또는 TK 유전자를 이 유전자가 결여된 세포 내로 도입하여 상기 세포의 생장 요건을 변경하는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 개개의 세포는 비-보충된 배지 중에서 생존할 수 없을 것이다.

두 번째 방법은 임의의 세포 종류에서 이용되며 돌연변이체 세포주의 사용을 필요로 하지 않는 선별 방법을 의미하는 우성 선별이다. 이 방법은 전형적으로 숙주 세포의 생장을 정지시키기 위한 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 갖는 세포는 약물 내성을 전달하는 단백질을 발현할 것이고 선별에서 생존할 것이다. 상기 우성 선별의 예는 네오마이신(Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1 : 327 (1982)), 마이코페놀산(Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) 또는 하이그로마이신(Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))을 사용한다. 이 3가지 예는 적절한 약물인 G418 또는 네오마이신(제네티신), xgpt(마이코페놀산) 또는 하이그로마이신에 대한 내성을 전달하기 위해 진핵 조절 하에서 세균 유전자를 사용한다. 다른 예로는 네오마이신 유사체인 G418 및 퓨로마이신이 있다.

F. 바이오센서 리보스위치

또한, 본 명세서에는 바이오센서 리보스위치가 개시되어 있다. 바이오센서 리보스위치는 그의 동족 유발 분자의 존재 하에서 검출가능한 신호를 발생시키는 개조된 리보스위치이다. 유용한 바이오센서 리보스위치는 유발 분자의 역치 수준 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 리보스위치는 생체내에서 또는 시험관내에서 사용되도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절하는 바이오센서 리보스위치는 신호로서 작용하는 단백질 또는 신호를 발생시키는 데 관여하는 단백질을 코딩하는 레포터 RNA에 작동가능하게 연결될 수 있고 상기 리보스위치를 코딩하는 핵산 구축물을 보유하도록 세포 또는 유기체를 개조함으로써 생체내에서 사용될 수 있다. 시험관내에서 사용되는 바이오센서 리보스위치의 일례는 리보스위치의 활성화 상태에 의존하는 변화를 표시하는 신호인 구조-의존적 표지를 포함하는 리보스위치이다. 이러한 바이오센서 리보스위치는 바람직하게는 천연발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연발생적 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다.

G. 레포터 단백질 및 펩티드

리보스위치 또는 바이오센서 리보스위치의 활성화 평가를 위해 레포터 단백질 또는 펩티드를 사용할 수 있다. 레포터 단백질 또는 펩티드는 리보스위치에 의해 조절되는 발현을 보이는 RNA에 의해 코딩될 수 있다. 본 실시예는 일부 특정 레포터 단백질의 사용을 개시하고 있다. 레포터 단백질 및 펩티드의 사용은 잘 공지되어 있고 리보스위치와 함께 사용될 수 있도록 용이하게 개조될 수 있다. 레포터 단백질은 검출될 수 있거나 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 단백질 또는 펩티드의 존재는 표준 기법(예를 들어, 방사선면역분석, 방사선-표지, 면역분석, 효소 활성 분석, 흡광도, 형광도, 발광도 및 웨스턴 블롯)을 이용하여 검출될 수 있다. 보다 바람직하게는, 레포터 단백질의 수준은 낮은 수준에서조차도 표준 기법에 의해 용이하게 정량화될 수 있다. 유용한 레포터 단백질은 루시퍼라제, GFP 및 이들의 유도체, 예컨대, 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)로부터의 반딧불이 루시퍼라제(FL) 및 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)로부터의 레닐라 루시퍼라제(RL)를 포함한다.

H. 구조-의존적 표지

구조-의존적 표지는 표지와 결합되어 있는 분자 또는 화합물(예컨대, 리보스위치)의 형태 또는 구조의 변화를 기초로 한 형광 강도 또는 파장의 변화를 발생시키는 모든 표지를 지칭한다. 프로브 및 프라이머 면에서 사용되는 구조-의존적 표지의 예는 분자 비콘(beacon), 앰플리플루오르(Amplifluor), FRET 프로브, 절단가 능한 FRET 프로브, TaqMan 프로브, 스코르피온(scorpion) 프라이머, 형광 삼중 올리고(삼중 분자 비콘 또는 삼중 FRET 프로브를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 형광 수용성 접합 중합체, 펩티드 핵산(PNA) 프로브 및 QPNA 프로브를 포함한다. 이러한 표지 및 특히 이의 작용 원리는 리보스위치와 함께 사용될 수 있도록 개조될 수 있다. 여러 종류의 구조-의존적 표지가 문헌(Schweitzer and Kingsmore, Curr. Opin. Biotech. 12:21-27 (2001))에 기재되어 있다.

구조-의존적 표지의 한 형태인 줄기 켄칭된(stem quenched) 표지는 줄기 구조가 켄칭 부분을 형성하는 경우 상기 표지로부터의 형광이 켄칭되도록 인접하여 존재할 수 있게끔 핵산 상에 위치한 형광 표지이다. 줄기가 파괴되는 경우(예컨대, 표지를 함유하는 리보스위치가 활성화되는 경우), 켄칭 부분은 더 이상 형광 표지에 인접하여 존재하지 않고 형광도는 증가한다. 이 효과의 예는 분자 비콘, 형광 삼중 올리고, 삼중 분자 비콘, 삼중 FRET 프로브 및 QPNA 프로브에서 발견될 수 있고, 이들의 작용 원리는 리보스위치와 함께 사용될 수 있도록 개조될 수 있다.

구조-의존적 표지의 한 형태인 줄기 활성화된 표지는 형광도가 줄기 구조의 형성에 의해 증가되거나 변경된 경우 표지 또는 표지 쌍이다. 줄기 활성화된 표지는 (상기 표지를 함유하는 핵산 가닥이 줄기 구조를 형성하는 경우) 수용체 형광 표지 및 공여체 부분이 인접하여 존재할 때 공여체 부분으로부터 수용체 형광 표지로의 형광 공명 에너지 전달이 수용체로 하여금 형광을 발휘하도록 상기 수용체 형광 표지 및 공여체 부분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 줄기 활성화된 표지는 줄 기 구조가 핵산 분자 내에서 형성되는 경우 상기 수용체 형광 표지 및 공여체 부분이 인접하여 존재하도록 핵산 분자(예컨대, 리보스위치) 상에 위치한 표지 쌍이다. 줄기 활성화된 표지의 공여체 부분 자체가 형광 표지인 경우, 상기 공여체 부분은 수용체와 인접하여 존재하지 않는 경우(즉, 줄기 구조가 형성되지 않은 경우) (전형적으로 수용체 형광 표지의 형광과 상이한 파장에서) 에너지를 형광으로서 방출할 수 있다. 줄기 구조가 형성된 경우, 전체적인 효과는 공여체 형광도의 감소 및 수용체 형광도의 증가일 것이다. FRET 프로브는 줄기 활성화된 표지 사용의 일례이고, 이의 작용 원리는 리보스위치와 함께 사용되도록 개조될 수 있다.

I. 검출 표지

리보스위치 활성화, 불활성화 또는 차단의 검출 및 정량화, 또는 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단 시 일어나는 핵산 또는 단백질의 발현의 검출 및 정량화를 돕기 위해, 검출 표지를 검출 프로브 또는 검출 분자 내로 도입할 수 있거나 발현된 핵산 또는 단백질 내로 직접 도입할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 검출 표지는 핵산 또는 단백질과 직접적으로 또는 간접적으로 결합하여 측정가능하고 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 발생시키는 임의의 분자이다. 이러한 많은 분자들이 당업자에게 공지되어 있다. 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되기에 적합한 검출 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광 분자, 인광 분자, 효소, 항체 및 리간드이다.

적절한 형광 표지의 예는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC), 5,6-카복시메틸 플루오레세인, 텍사스 레드, 니트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일(NBD), 쿠마린, 댄실 클로라이드, 로다민, 아미노-메틸 쿠마린(AMCA), 에오신, 에리쓰로신, 보다이피(BODIPY, 등록상표), 캐스캐이드 블루(Cascade Blue, 등록상표), 오레곤 그린(Oregon Green, 등록상표), 피렌, 리사민, 잔텐, 아크리딘, 옥사진, 피코에리쓰린, 란타나이드 이온의 거대환형 킬레이트, 예컨대, 양자 염료(quantum dye, 상표), 형광 에너지 전달 염료, 예컨대, 티아졸 오랜지-에티듐 이종이량체, 및 시아닌 염료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7을 포함한다. 다른 구체적인 형광 표지의 예는 3-하이드록시피렌 5,8,10-트라이설폰산, 5-하이드록시 트립타민(5-HT), 산 푸치신, 알리자린 콤플렉손, 알리자린 레드, 알로피코시아닌, 아미노쿠마린, 안쓰로일 스테아레이트, 아스트라존 브릴리안트 레드 4G, 아스트라존 오랜지 R, 아스트라존 레드 6B, 아스트라존 옐로우 7 GLL, 아타브린, 아우라민, 아우로포스핀, 아우로포스핀 G, BAO 9(비스아미노페닐옥사다이아졸), BCECF, 버베린 설페이트, 비스벤즈아마이드, 블란코포르 FFG 솔루션, 블란코포르 SV, 보다이피 F1, 브릴리안트 설포플라빈 FF, 칼시엔 블루, 칼슘 그린, 칼코플루오르 RW 솔루션, 칼코플루오르 화이트, 칼코포르 화이트 ABT 솔루션, 칼코포르 화이트 스탠다드 솔루션, 카보스티릴, 캐스캐이드 옐로우, 카테콜아민, 키나크린, 코리포스핀 O, 쿠마린-팔로이딘, CY3.1 8, CY5.1 8, CY7, 단스(1-다이메틸 아미노 나팔린 5 설폰산), 댄사(다이아미노 나프틸 설폰산), 댄실 NH-CH3, 다이아미노 페닐 옥시다이아졸(DAO), 다이메틸아미노-5-설폰산, 다이피로메텐보론 다이플루오라이드, 다이페닐 브릴리안트 플라빈 7GFF, 도파민, 에리쓰로신 ITC, 유크리신, FIF(포름알데하이드 유도된 형광), 플라조 오랜지, 플루오 3, 플루오레스카민, 푸라-2, 제나크릴 브릴리안트 레드 B, 제나 크릴 브릴리안트 옐로우 10GF, 제나크릴 핑크 3G, 제나크릴 옐로우 5GF, 글록살산, 그래뉼라 블루, 해마토포피린, 인도-1, 인트라화이트 Cf 리퀴드, 류코포르 PAF, 류코포르 SF, 류코포르 WS, 리사민 로다민 B200(RD200), 루시퍼 옐로우 CH, 루시퍼 옐로우 VS, 마그달라 레드, 마리나 블루, 맥실론 브릴리안트 플라빈 10 GFF, 맥실론 브릴리안트 플라빈 8 GFF, MPS(메틸 그린 피로닌 스틸벤), 미쓰라마이신, NBD 아민, 니트로벤족사다이돌, 노르아드레날린, 뉴클리어 패스트 레드, 뉴클리어 옐로우, 나일로산 브릴리안트 플라빈 E8G, 옥사다이아졸, 파시픽 블루, 파라로사닐린(페울겐), 포르와이트 AR 솔루션, 포르와이트 BKL, 포르와이트 Rev, 포르와이트 RPA, 포스핀 3R, 프탈로시아닌, 피코에리쓰린 R, 폴리아자인다센 폰토크롬 블루 블랙, 포피린, 프리뮬린, 프로시온 옐로우, 피로닌, 피로닌 B, 피로잘 브릴리안트 플라빈 7GF, 퀴나크린 무스타드, 로다민 123, 로다민 5 GLD, 로다민 6G, 로다민 B, 로다민 B 200, 로다민 B 엑스트라, 로다민 BB, 로다민 BG, 로다민 WT, 세로토닌, 세브론 브릴리안트 레드 2B, 세브론 브릴리안트 레드 4G, 세브론 브릴리안트 레드 B, 세브론 오랜지, 세브론 옐로우 L, SITS(프리뮬린), SITS(스틸벤 아이소티오설폰산), 스틸벤, Snarf 1, 설포 로다민 B Can C, 설포 로다민 G 엑스트라, 테트라사이클린, 티아진 레드 R, 티오플라빈 S, 티오플라빈 TCN, 티오플라빈 5, 티올라이트, 티오졸 오랜지, 티노폴 CBS, 트루 블루, 울트라라이트, 유라닌 B, 유비텍스 SFC, 크실렌 오랜지 및 XRITC를 포함한다.

유용한 형광 표지는 플루오레세인(5-카복시플루오레세인-N-하이드록시석신이미드 에스터), 로다민(5,6-테트라메틸 로다민), 및 시아닌 염료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7이다. 이 형광 표지들에 대한 흡수 및 방출 최대 파장은 각각 다음과 같으므로 이들의 동시적인 검출이 가능하다: FITC(490 nm; 520 nm), Cy3(554 nm; 568 nm), Cy3.5(581 nm; 588 nm), Cy5(652 nm: 672 nm), Cy5.5(682 nm; 703 nm) 및 Cy7(755 nm; 778 nm). 형광 염료의 다른 예는 6-카복시플루오레세인(6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인(TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-다이메톡시-4',5'-다이클로로-6-카복시로다민(JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-다이클로로-6-카복시플루오레세인(NED), 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-다이클로로-6-카복시플루오레세인(VIC)을 포함한다. 형광 표지는 아머샴 파마샤 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes; 미국 오레곤주 유진 소재) 및 리서치 오가닉스(Research Organics; 미국 오하이오주 클리블랜드 소재)를 비롯한 다양한 시판 공급처로부터 구입할 수 있다.

흥미로운 다른 표지는 표지와 결합된 프로브가 표적 분자에 특이적으로 결합된 경우에만 신호를 방출하는 표지이고, 이때 상기 표지는 문헌[Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology (1996) 14:303] 및 유럽 특허 제0 070 685 B1호에 기재된 "분자 비콘"을 포함한다. 흥미로운 다른 표지는 미국 특허 제5,563,037호, 및 국제특허출원 공개 제WO 97/17471호 및 제WO 97/17076호에 기재된 표지를 포함한다.

표지된 뉴클레오티드는 합성 과정 동안에 발현된 핵산 내로 직접 도입되는 검출 표지의 유용한 형태이다. 핵산 내로 도입될 수 있는 검출 표지의 예는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대, BrdUrd(5-브로모데옥시유리딘, Hoy and Schimke, Mutation Research 290:217-230 (1993)), 아미노알릴데옥시유리딘(Henegariu et al., Nature Biotechnology 18:345-348 (2000)), 5-메틸사이토신(Sano et al., Biochim. Biophys. Acta 951:157-165 (1988)), 브로모유리딘(Wansick et al., J. Cell Biology 122:283-293 (1993)), 및 바이오틴(Langer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633 (1981)) 또는 적절한 햅텐(예컨대, 디곡시제닌)(Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364 (1992))으로 변경된 뉴클레오티드를 포함한다. 적절한 형광-표지된 뉴클레오티드는 플루오레세인-아이소티오시아네이트-dUTP, 시아닌-3-dUTP 및 시아닌-5-dUTP(Yu et al., Nucleic Acids Res., 22:3226-3232 (1994))이다. DNA에 도입하기에 바람직한 뉴클레오티드 유사체 검출 표지는 BrdUrd(브로모데옥시유리딘, BrdUrd, BrdU, BUdR, 시그마-알드리치 캄파니(Sigma-Aldrich Co.))이다. 검출 표지를 DNA 내로 도입하는 데 유용한 다른 뉴클레오티드 유사체는 AA-dUTP(아미노알릴-데옥시유리딘 트라이포스페이트, 시그마-알드리치 캄파니) 및 5-메틸-dCTP(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))이다. 검출 표지를 RNA 내로 도입하는 데 유용한 뉴클레오티드 유사체는 바이오틴-16-UTP(바이오틴-16-유리딘-5'-트라이포스페이트, 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)이다. 플루오레세인, Cy3 및 Cy5는 직접적인 표지를 위해 dUTP에 연결될 수 있다. Cy3.5 및 Cy7은 바이오틴- 또는 디곡시제닌-표지된 프로브의 2차 검출을 위한 아비딘 또는 항-디곡시제닌 접합체로서 사용될 수 있다.

핵산 내로 도입되는 검출 표지, 예컨대, 바이오틴은 당업계에 잘 공지되어 있는 민감한 방법들을 이용하여 추후에 검출될 수 있다. 예를 들어, 바이오틴은 바이오틴에 결합된 후 적절한 기질(예를 들어, 화학발광 기질 CSPD: 다이소듐, 3-(4-메톡시스피로-[1,2-다이옥세탄-3-2'-(5'-클로로)트라이사이클로[3.3.1.1³'⁷]데칸]-4-일)페닐 포스페이트: 트로픽스 인코포레이티드(Tropix, Inc.))의 화학발광에 의해 검출되는 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 접합체(트로픽스 인코포레이티드)를 사용하여 검출될 수 있다. 표지는 예를 들어, 화학 신호 증폭을 이용하거나 광(예를 들어, 화학발광 1,2-다이옥세탄 기질) 또는 형광 신호를 발생시키는 효소에 대한 기질을 사용하여 검출할 수 있는 효소, 예컨대, 알칼리 포스파타제, 대두 퍼옥시다제, 호스라디쉬 퍼옥시다제 및 중합효소일 수도 있다.

이 검출 표지들 중 둘 이상을 겸비하는 분자도 검출 표지로서 간주된다. 공지된 검출 표지들 중 임의의 검출 표지는 개시된 프로브, 태그, 분자 및 방법과 함께 사용되어 활성화된 또는 불활성화된 리보스위치, 또는 개시된 방법에서 생성된 핵산 또는 단백질을 검출할 수 있다. 검출 표지에 의해 발생된 신호를 검출하고 측정하는 방법도 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 방사성 동위원소는 신틸레이션 계수 또는 직접적 가시화로 검출될 수 있고, 형광 분자는 형광 분광계로 검출될 수 있으며, 인광 분자는 분광계로 검출될 수 있거나 카메라로 직접적으로 가시화될 수 있고, 효소는 이 효소에 의해 촉진된 반응의 생성물의 검출 또는 가시화를 통해 검출될 수 있으며, 항체는 이 항체에 커플링된 2차 검출 표지를 검출함으로써 검출될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 검출 분자는 1가지 이상의 검출 표지에 커플링되어 검출될 화합물 또는 조성물과 상호작용하는 분자이다.

J. 서열 유사성

본 명세서에 개시된 바와 같이 용어 "상동성" 및 "동일성"의 사용은 유사성과 동일한 것을 의미함을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "상동성"이 2개의 서열(예컨대, 비-천연 서열) 사이에서 사용되는 경우, 이것은 반드시 상기 2개의 서열 사이의 진화적 관계를 의미하는 것이라기보다는 오히려 그들의 핵산 서열 사이의 유사성 또는 관련성에 관한 것임을 이해해야 한다. 2개의 진화적으로 관련된 분자들 사이의 상동성을 측정하는 방법들 중 대부분의 방법이 상기 2개의 서열들이 진화적으로 관련되어 있는지 여부와 관계없이 서열 유사성을 측정하기 위한 목적으로 임의의 2개 이상의 핵산 또는 단백질에 관용적으로 적용된다.

일반적으로, 본 명세서에 개시된 리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질의 임의의 공지된 변이체 및 유도체, 또는 본 명세서에 개시된 리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질로부터 유래될 수 있는 변이체 및 유도체를 정의하는 한 방법은 특정 공지된 서열들에 대한 상동성 면에서 상기 변이체 및 유도체를 정의하는 것임을 이해해야 한다. 본 명세서에 개시된 특정 서열들의 동일성도 본 명세서의 모든 부분에서 논의되어 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼, 유전자 및 단백질의 변이체는 전형적으로 언급된 서열 또는 천연 서열에 대해 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 나타낸다. 당업자라면 2가지 단백질 또는 핵산, 예컨대, 유전자의 상동성을 측정하는 방법을 용이하게 이 해한다. 예를 들어, 상동성은 상동성이 최고 수준에 있도록 2개의 서열을 정렬한 후 계산될 수 있다.

상동성을 계산하는 또 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교할 서열들의 최적 정렬은 문헌[Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국지적 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 상기 알고리즘들의 전산화된 실시(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 제네틱스 컴퓨터 그룹)) 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.

핵산의 경우 동일한 종류의 상동성이 예를 들어, 문헌[Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989](적어도 핵산 정렬에 관련된 물질에 대해 참고로 본원에 도입되어 있음)에 개시된 알고리즘에 의해 수득될 수 있다. 상기 방법들 중 임의의 방법이 이용될 수 있고 일부 경우 이 다양한 방법들의 결과는 상이할 수 있음을 이해해야 하지만, 당업자라면 상기 방법들 중 1가지 이상의 방법에서 동일성이 발견되면 서열들이 언급된 동일성을 나타낸다고 기재될 수 있음을 이해할 것이다.

예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 또 다른 서열에 대해 특정 비율의 상동성을 나타낸다고 언급된 서열은 전술한 계산 방법들 중 임의의 1가지 이 상의 방법에 의해 계산된 경우 언급된 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 제1 서열이 주커(Zuker) 문헌에 기재된 계산 방법을 이용하였을 때 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타낸다고 계산된 경우 심지어 상기 제1 서열이 나머지 다른 임의의 계산 방법에 의해 계산되었을 때 상기 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타내지 않는 경우조차도 상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 제1 서열이 주커 문헌에 기재된 계산 방법 및 피어슨(Pearson) 및 립만(Lipman)의 문헌에 기재된 계산 방법을 이용하였을 때 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타낸다고 계산된 경우 심지어 상기 제1 서열이 스미스(Smith) 및 와터만(Waterman) 문헌에 기재된 계산 방법, 니들만(Needleman) 및 분슈(Wunsch) 문헌에 기재된 계산 방법, 재거(Jaeger) 문헌에 기재된 계산 방법 또는 임의의 다른 계산 방법에 의해 계산되었을 때 상기 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타내지 않는 경우조차도 상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 제1 서열이 모든 계산 방법들 각각을 이용하였을 때(비록, 실제로 다양한 계산 방법들이 다양한 계산된 상동성 비율을 산출할지라도) 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타낸다고 계산된 경우 상기 제1 서열은 상기 제2 서열에 대해 80%의 상동성을 나타낸다.

K. 혼성화 및 선별적 혼성화

용어 "혼성화"는 전형적으로 2가지 이상의 핵산 분자, 예컨대, 프라이머 또는 프로브와 리보스위치 또는 유전자 사이의 서열-매개된 상호작용을 의미한다. 서열-매개된 상호작용은 2가지 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 유도체 사이에 뉴클레오티드 특이적 방식으로 일어나는 상호작용을 의미한다. 예를 들어, C와 상호작용하는 G, 또는 T와 상호작용하는 A는 서열-매개된 상호작용이다. 전형적으로 서열-매개된 상호작용은 뉴클레오티드의 왓슨-크릭 면 또는 호오그스틴(Hoogsteen) 면에서 일어난다. 2가지 핵산의 혼성화는 당업자에게 공지되어 있는 다수의 조건 및 파라미터에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 염 농도, pH 및 반응 온도 모두가 2가지 핵산 분자가 혼성화할지에 대해 영향을 미친다.

2가지 핵산 분자 사이의 선별적 혼성화를 위한 파라미터는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 선별적 혼성화 조건은 엄격한 혼성화 조건으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격도는 혼성화 단계 및 세척 단계 중 하나 또는 이들 단계 둘다의 온도 및 염 농도 둘다에 의해 조절된다. 예를 들어, 선별적 혼성화를 달성하는 혼성화 조건은 Tm(분자의 절반이 그들의 혼성화 파트너로부터 해리되는 용융 온도)보다 약 12 내지 25℃ 낮은 온도에서 높은 이온 강도 용액(6X SSC 또는 6X SSPE) 중에서의 혼성화에 이어서 세척 온도가 Tm보다 약 5 내지 20℃ 더 낮도록 선택된 온도와 염 농도의 조합 조건에서 세척하는 것을 포함할 수 있다. 상기 온도 및 염 조건은 필터 상에 고정된 기준 DNA 샘플이 원하는 표지된 핵산에 혼성화된 후 엄격도가 상이한 조건 하에서 세척되는 예비 실험에서 실험적으로 용이하게 결정된다. 혼성화 온도는 전형적으로 DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화의 경우 더 높다. 상기 조건들은 엄격도를 달성하기 위해 전술한 바와 같이 이용될 수 있거나 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 이용될 수 있 다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Kunkel et al., Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987); 적어도 핵산의 혼성화에 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 도입되어 있음). DNA:DNA 혼성화에 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 약 68℃의 (수용액 상태의) 6X SSC 또는 6X SSPE 중에서의 혼성화 후 68℃에서의 세척일 수 있다. 필요에 따라 혼성화 및 세척의 엄격도는 원하는 상보성 정도가 감소됨에 따라 상응하게 감소될 수 있고 가변성이 검색되는 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 존재도에 따라 감소될 수 있다. 마찬가지로, 필요에 따라 혼성화 및 세척의 엄격도는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 원하는 상동성이 증가됨에 따라 상응하게 증가될 수 있고, 또한 높은 상동성이 필요한 임의의 구역의 G-C 또는 A-T 존재도에 따라 증가될 수 있다.

선별적 혼성화를 정의하는 또 다른 방법은 핵산들 중 한 핵산에 결합된 다른 핵산의 양(비율)을 측정하는 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 선별적 혼성화 조건은 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상의 제한 핵산이 비-제한 핵산에 결합된 경우 선별적 혼성화가 일어날 것이다. 전형적으로, 비-제한 핵산은 예를 들어, 10, 100 또는 1000배 과량으로 존재한다. 이러한 종류의 분석은 제한 핵산 및 비-제한 핵산 둘다가 예를 들어, 그들의 K_D보다 10배, 100배 또는 1000배 더 적은 조건, 상기 핵산 분자들 중 하나만이 그들의 K_D보 다 10배, 100배 또는 1000배 더 적은 조건, 또는 상기 핵산 분자들 중 하나 또는 둘다가 그들의 K_D를 초과하는 조건 하에서 수행될 수 있다.

선별적 혼성화를 정의하는 또 다른 방법은 원하는 효소적 개조를 촉진하기 위해 요구되는 혼성화 조건 하에서 효소적으로 개조된 핵산의 비율을 측정하는 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 선별적 혼성화 조건은 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 핵산이 효소적 개조를 촉진하는 조건 하에서 효소적으로 개조된 경우의 혼성화 조건일 것이고, 예를 들어, 효소적 개조가 DNA 연장인 경우, 선별적 혼성화 조건은 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 핵산 분자가 연장된 경우의 혼성화 조건일 것이다. 바람직한 조건은 제조사에 의해 제시된 조건, 또는 개조를 수행하는 효소에 적합한 것으로서 당업계에 공지되어 있는 조건을 포함한다.

상동성과 마찬가지로, 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화 수준을 측정하는, 본 명세서에 개시된 다양한 방법들이 있음을 이해해야 한다. 상기 방법 및 조건은 2개의 핵산 분자 사이에 상이한 혼성화 비율을 제공할 수 있지만, 달리 명시하지 않은 한 상기 방법들 중 임의의 방법의 파라미터를 충족시키는 것만으로 충분할 것임을 이해해야 한다. 예를 들어, 80% 혼성화가 필요한 경우 혼성화가 상기 방법들 중 어느 한 방법에서 요구되는 파라미터 내에서 일어나기만 하면 80% 혼성화는 본 명세서에 개시된 것으로 간주된다.

당업자라면 조성물 또는 방법이 총체적으로 또는 단독으로 혼성화를 측정하기 위한 상기 기준들 중 어느 하나를 충족시키는 경우, 상기 조성물 또는 방법이 본 명세서에 개시된 조성물 또는 방법임을 이해할 것이다.

L. 핵산

예를 들어, 리보스위치, 앱타머, 및 리보스위치 및 앱타머를 코딩하는 핵산을 비롯하여, 본 명세서에 개시된 다양한 핵산-기재 분자들이 존재한다. 상기 개시된 핵산들은 예를 들어, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 대체물로 구성될 수 있다. 이 분자들 및 다른 분자들의 비-제한적 예는 본 명세서에 기재되어 있다. 예를 들어, 벡터가 세포 내에서 발현되는 경우 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G 및 U로 구성될 것임을 이해해야 한다. 마찬가지로, 핵산 분자가 예를 들어, 외래 전달을 통해 세포 또는 세포 환경 내로 도입되는 경우, 핵산 분자는 세포 환경 내에서 상기 핵산 분자의 분해를 감소시키는 뉴클레오티드 유사체로 구성되는 것이 유리할 수 있음을 이해해야 한다.

리보스위치, 앱타머, 발현 플랫폼 및 임의의 다른 올리고뉴클레오티드 및 핵산은 이들의 관련 기능이 유지되는 한 변경된 뉴클레오티드(뉴클레오티드 유사체)로 구성될 수 있거나 변경된 뉴클레오티드(뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다. 많은 변경된 뉴클레오티드들이 공지되어 있고 올리고뉴클레오티드 및 핵산에서 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 또는 포스페이트 부분에 대한 일부 종류의 변경을 갖는 뉴클레오티드이다. 염기 부분에 대한 변경은 A, C, G 및 T/U의 천연 또는 합성 변경뿐만 아니라 다른 퓨린 또는 피리미딘 염기, 예컨대, 우라실-5-일, 하이포잔틴-9-일(I) 및 2-아미노아데닌-9-일의 천연 또는 합성 변경도 포함한다. 변경된 염기는 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 유도체 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 염기 변경은 예를 들어, 미국 특허 제3,687,808호, 및 문헌[Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993]에서 찾을 수 있다. 일부 뉴클레오티드 유사체, 예컨대, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐사이토신 및 5-메틸사이토신을 비롯한 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린은 이중가닥 형성의 안정성을 증가시킬 수 있다. 다른 변경된 염기는 보편적인 염기로서 작용하는 염기이다. 보편적인 염기는 3-니트로피롤 및 5-니트로인돌을 포함한다. 보편적인 염 기는 정상 염기를 치환시키지만 염기쌍 형성에 있어서 편향되지 않는다. 즉, 보편적인 염기는 임의의 다른 염기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 염기 변경은 종종 예를 들어, 당 변경, 예컨대, 2'-O-메톡시에틸과 조합되어 증가된 이중가닥 안정성과 같은 독특한 성질을 제공할 수 있다. 염기 변경의 범위를 상세히 기술하는 다수의 미국 특허, 예컨대, 미국 특허 제4,845,205호, 제5,130,302호, 제5,134,066호, 제5,175,273호, 제5,367,066호, 제5,432,272호, 제5,457,187호, 제5,459,255호, 제5,484,908호, 제5,502,177호, 제5,525,711호, 제5,552,540호, 제5,587,469호, 제5,594,121호, 제5,596,091호, 제5,614,617호 및 제5,681,941호가 있다. 상기 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 염기 변경, 이의 합성, 이의 용도, 및 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 염기 변경의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입된다.

뉴클레오티드 유사체는 당 부분의 변경도 포함할 수 있다. 당 부분에 대한 변경은 리보스 및 데옥시리보스의 천연 변경 및 합성 변경을 포함한다. 당 변경은 2' 위치에서의 하기 변경들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-0-알킬(이때, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 비-치환된 C1 내지 C10 알킬, 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 2' 당 변경은 -O[(CH₂)_nO]_mCH₃, -O(CH₂)_nOCH₃, -O(CH₂)_nNH₂, -O(CH₂)_nCH₃, -O(CH₂)_n-ONH₂ 및 -O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂도 포함하나 이들로 한정되지 않고, 이때 n 및 m은 1 내지 약 10이다.

2' 위치에서의 다른 변경은 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 레포터 기, 삽입기, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선시키는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 성질을 개선시키는 기, 및 유사한 성질을 갖는 다른 치환기를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 유사한 변경을, 당의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2'-5' 결합된 올리고뉴클레오티드의 당의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 만들 수도 있다. 변경된 당은 가교 고리 산소에서 변경, 예컨대, CH₂ 및 S를 갖는 당도 포함할 것이다. 뉴클레오티드 당 유사체는 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 부분과 같은 당 모사체도 가질 수 있다. 이러한 변경된 당 구조의 제조를 교시하는 다수의 미국 특허, 예컨대, 미국 특허 제4,981,957호, 제5,118,800호, 제5,319,080호, 제5,359,044호, 제5,393,878호, 제5,446,137호, 제5,466,786호, 제5,514,785호, 제5,519,134호, 제5,567,811호, 제5,576,427호, 제5,591,722호, 제5,597,909호, 제5,610,300호, 제5,627,053호, 제5,639,873호, 제5,646,265호, 제5,658,873호, 제5,670,633호 및 제5,700,920호가 있다(상기 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 변경된 당 구조, 이의 합성, 이의 용도, 및 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 변경된 당 구조의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입됨).

뉴클레오티드 유사체는 포스페이트 부분에서도 변경될 수 있다. 변경된 포스페이트 부분은 2개의 뉴클레오티드 사이의 결합이 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함함), 포스피네이트, 포스포르아미데이트(3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함함), 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스터, 및 보라노포스페이트를 갖도록 변경될 수 있는 포스페이트 부분을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 2개의 뉴클레오티드 사이의 상기 포스페이트 또는 변경된 포스페이트 결합이 3'-5' 결합 또는 2'-5' 결합을 통해 형성될 수 있고 상기 결합이 도립된 극성, 예컨대, 3'-5'로부터 5'-3', 또는 2'-5'로부터 5'-2'를 가질 수 있음을 이해해야 한다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태도 포함된다. 다수의 미국 특허가 변경된 포스페이트를 갖는 뉴클레오티드를 제조하고 사용하는 방법을 교시하고 상기 미국 특허는 미국 특허 제3,687,808호, 제4,469,863호, 제4,476,301호, 제5,023,243호, 제5,177,196호, 제5,188,897호, 제5,264,423호, 제5,276,019호, 제5,278,302호, 제5,286,717호, 제5,321,131호, 제5,399,676호, 제5,405,939호, 제5,453,496호, 제5,455,233호, 제5,466,677호, 제5,476,925호, 제5,519,126호, 제5,536,821호, 제5,541,306호, 제5,550,111호, 제5,563,253호, 제5,571,799호, 제5,587,361호 및 제5,625,050호를 포함하나 이들로 한정되지 않는다(상기 미국 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 변경된 포스페이트, 이의 합성, 이의 용도, 및 뉴클레오티드, 올리 고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 변경된 포스페이트의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입됨).

뉴클레오티드 유사체는 단일 변경뿐만 아니라 한 부분 내에서 또는 상이한 부분 사이에서 다수의 변경도 가질 수 있음을 이해해야 한다.

뉴클레오티드 대체물은 뉴클레오티드와 유사한 기능적 성질을 갖되 포스페이트 부분을 갖지 않는 분자, 예컨대, PNA이다. 뉴클레오티드 대체물은 왓슨-크릭 또는 호오그스틴 방식으로 상보적인 핵산을 인식하여 상기 상보적인 핵산에 혼성화하되(염기쌍을 형성하되) 포스페이트 부분 이외의 다른 부분을 통해 서로 연결되어 있는 분자이다. 뉴클레오티드 대체물은 적절한 표적 핵산과 상호작용하는 경우 이중 나선형 구조를 따를 수 있다.

뉴클레오티드 대체물은 포스페이트 부분 및/또는 당 부분이 치환되어 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체이다. 뉴클레오티드 대체물은 표준 인 원자를 갖지 않는다. 포스페이트에 대한 대체물은 예를 들어, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 결합, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 인터뉴클레오시드 결합일 수 있다. 이들은 (부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 결합을 갖는 것; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격; 아마이드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 골격들을 포함한다. 다수의 미국 특허가 이러한 종류의 포스페이트 대체물들을 제조하고 사용하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 미국 특허는 미국 특허 제5,034,506호, 제5,166,315호, 제5,185,444호, 제5,214,134호, 제5,216,141호, 제5,235,033호, 제5,264,562호, 제5,264,564호, 제5,405,938호, 제5,434,257호, 제5,466,677호, 제5,470,967호, 제5,489,677호, 제5,541,307호, 제5,561,225호, 제5,596,086호, 제5,602,240호, 제5,610,289호, 제5,602,240호, 제5,608,046호, 제5,610,289호, 제5,618,704호, 제5,623,070호, 제5,663,312호, 제5,633,360호, 제5,677,437호 및 제5,677,439호를 포함하나 이들로 한정되지 않는다(상기 미국 특허들 각각은 그 전체, 구체적으로 포스페이트 대체물, 이의 합성, 이의 용도, 및 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내로의 상기 포스페이트 대체물의 도입에 대한 설명이 본원에 참고로 도입됨).

또한, 뉴클레오티드 대체물에서 뉴클레오티드의 당 부분 및 포스페이트 부분은 예를 들어, 아마이드 유형 결합(아미노에틸글라이신)(PNA)으로 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 미국 특허 제5,539,082호, 제5,714,331호 및 제5,719,262호는 PNA 분자의 제조 및 사용 방법을 교시하고 있으며, 상기 특허들 각각은 본원에 참고로 도입된다(문헌[Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)] 또한 참조).

올리고뉴클레오티드 및 핵산은 뉴클레오티드로 구성될 수 있고 상이한 종류의 뉴클레오티드 또는 동일한 종류의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내의 1개 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물 일 수 있고, 약 10 내지 약 50%의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있고, 약 50% 이상의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있고, 모든 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 또는 리보뉴클레오티드와 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 및 핵산은 키메라 올리고뉴클레오티드 및 키메라 핵산으로서 지칭될 수 있다.

M. 고체 지지체

고체 지지체는 분자(예컨대, 유발 분자) 및 리보스위치(또는 개시된 방법에서 사용되거나 개시된 방법에 의해 제조된 다른 성분들)가 결합될 수 있는 고체-상태 기판 또는 지지체이다. 리보스위치 및 다른 분자는 고체 지지체와 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 피분석물(예컨대, 유발 분자, 시험 화합물)은 고체 지지체의 표면에 결합될 수 있거나 고체 지지체 상에 고정된 포획제(예를 들어, 피분석물에 결합하는 화합물 또는 분자)와 결합될 수 있다. 또 다른 예로서, 리보스위치는 고체 지지체의 표면에 결합될 수 있거나 고체 지지체 상에 고정된 프로브와 결합될 수 있다. 어레이는 다수의 리보스위치, 프로브 또는 다른 분자가 어레이, 격자 또는 다른 조직화된 패턴으로 결합되어 있는 고체 지지체이다.

고체 지지체에서 사용되는 고체-상태 기판은 성분들이 직접적으로 또는 간접 적으로 결합될 수 있는 임의의 고체 물질을 포함할 수 있다. 이것은 아크릴아마이드, 아가로스, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 유리, 금, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리실리케이트, 폴리카보네이트, 테플론, 플루오로카본, 나일론, 실리콘 고무, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 폴리아세트산, 폴리오르토에스터, 작용기화된 실란, 폴리프로필푸메레이트, 콜라겐, 글리코스아미노글리칸 및 폴리아미노산을 포함한다. 고체-상태 기판은 박막, 막, 병, 접시, 섬유, 직조 섬유, 성형된 중합체, 입자, 비드, 마이크로입자 또는 조합물을 포함하는 임의의 유용한 형태를 가질 수 있다. 고체-상태 기판 및 고체 지지체는 다공성 또는 비-다공성 기판 및 지지체일 수 있다. 칩은 직사각형 또는 정사각형의 작은 물질 조각이다. 고체-상태 기판에 있어서 바람직한 형태는 박막, 비드 또는 칩이다. 고체-상태 기판에 있어서 유용한 형태는 마이크로타이터 접시이다. 일부 실시양태에서, 다중웰 유리 슬라이드가 사용될 수 있다.

어레이는 고체 지지체 상의 확인된 위치 또는 소정의 위치에 고정되어 있는 복수의 리보스위치, 유발 분자, 다른 분자, 화합물 또는 프로브를 포함할 수 있다. 고체 지지체 상의 소정의 위치는 일반적으로 한 가지 종류의 성분을 각각 갖는다(즉, 상기 위치에서 모든 성분이 동일하다). 별법으로, 다수의 종류의 성분들이 고체 지지체 상의 상기 소정의 위치에 고정될 수 있다. 각 위치는 주어진 성분들의 다수의 복제본을 가질 것이다. 고체 지지체 상에서의 다양한 성분들의 공간적 분리는 분리된 검출 및 확인을 가능하게 한다.

유용할지라도 고체 지지체가 단일 단위 또는 구조일 필요는 없다. 리보스위치, 유발 분자, 다른 분자, 화합물 및/또는 프로브로 구성된 한 세트가 임의의 수의 고체 지지체 상에 분포될 수 있다. 예를 들어, 극단적으로, 각 성분은 분리된 반응 튜브 또는 용기 내에, 또는 분리된 비드 또는 마이크로입자 상에 고정될 수 있다.

올리고뉴클레오티드를 고체-상태 기판에 고정시키는 방법은 잘 확립되어 있다. 어드레스(address) 프로브 및 검출 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 확립된 커플링 방법을 이용하여 기판에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 적절한 부착 방법은 문헌[Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026 (1994)] 및 [Khrapko et al., Mol. Biol. (Mosk) (USSR) 25:718-730 (1991)]에 기재되어 있다. 카세인-코팅된 슬라이드 상에 3'-아민 올리고뉴클레오티드를 고정시키는 방법은 문헌[Stimpson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383 (1995)]에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드를 고체-상태 기판에 부착시키는 유용한 방법은 문헌[Guo et al, Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994)]에 기재되어 있다.

고체 지지체 상에 고정된 성분들 각각(예를 들어, 리보스위치, 유발 분자 또는 다른 분자)은 고체 지지체의 다양한 소정의 영역 내에 위치할 수 있다. 다양한 위치들은 다양한 반응 챔버일 수 있다. 상기 다양한 소정의 영역들은 각각 서로 물리적으로 분리되어 존재할 수 있다. 고체 지지체의 다양한 소정의 영역들 사이의 거리는 고정될 수 있거나 변동될 수 있다. 예를 들어, 어레이에서 성분들은 각 각 서로로부터 고정된 거리를 두고 정렬될 수 있지만, 비드와 결합된 성분들은 고정된 공간적 관계에 있지 않을 것이다. 특히, 다수의 고체 지지체 단위(예를 들어, 다수의 비드)의 사용은 변동가능한 거리를 제공할 것이다.

성분들은 임의의 밀도로 고체 지지체 상에 결합될 수 있거나 고정될 수 있다. 성분들은 400가지 상이한 성분들/㎤를 초과하는 밀도로 고체 지지체에 고정될 수 있다. 성분들의 어레이는 임의의 수의 성분들을 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이는 고체 지지체 상에 고정된 1,000가지 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있거나, 고체 지지체 상에 고정된 10,000가지 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있거나, 고체 지지체 상에 고정된 100,000가지 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있거나, 또는 고체 지지체 상에 고정된 1,000,000가지 이상의 다양한 성분들을 가질 수 있다.

N. 키트

상기 물질들 및 다른 물질들은 개시된 본 방법의 실시 또는 실시 보조에 유용한 키트로서 임의의 적절한 조합물 형태로 함께 팩키징될 수 있다. 이것은 소정의 키트 내의 키트 성분들이 개시된 본 방법에서 함께 사용되도록 디자인되고 개조된 경우 유용하다. 예를 들어, 1가지 이상의 바이오센서 리보스위치를 포함하는, 화합물을 검출하기 위한 키트가 개시되어 있다. 상기 키트는 리보스위치의 활성화를 검출하기 위한 시약 및 표지도 함유할 수 있다.

O. 혼합물

본 명세서에는 개시된 본 방법을 수행함으로써 형성된 혼합물, 또는 개시된 본 방법을 수행하기 위해 제조함으로써 형성된 혼합물이 개시되어 있다. 예를 들 어, 리보스위치 및 유발 분자를 포함하는 혼합물이 개시되어 있다.

본 방법이 조성물, 성분 또는 시약을 혼합하거나 접촉시키는 단계를 포함할 때마다, 본 방법의 수행은 많은 다양한 혼합물을 발생시킨다. 예를 들어, 본 방법이 3개의 혼합 단계를 포함하는 경우, 이 단계들이 따로 수행되는 경우 상기 단계들 각각을 수행한 후 독특한 혼합물이 형성된다. 또한, 혼합물은 단계들이 수행되는 방법과 무관하게 단계들 모두의 완결 시 형성된다. 본 개시내용은 개시된 본 방법의 수행에 의해 수득된 혼합물, 및 임의의 개시된 시약, 조성물 또는 성분, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 시약, 조성물 또는 성분을 함유하는 혼합물도 고려한다.

P. 시스템

본 명세서에는 개시된 본 방법의 수행 또는 개시된 본 방법의 수행 보조에 유용한 시스템이 개시되어 있다. 시스템은 일반적으로 제품, 예컨대, 구조체, 기구, 장치 등과 조성물, 화합물, 물질 등의 조합물을 포함한다. 개시되어 있거나 개시내용으로부터 자명한 상기 조합물이 고려된다. 예를 들어, 바이오센서 리보스위치, 고체 지지체 및 신호-판독 장치를 포함하는 시스템이 개시되어 있고 고려된다.

Q. 데이터 구조 및 컴퓨터 제어

본 명세서에는 개시된 본 방법에서 사용되거나, 개시된 본 방법에 의해 발생되거나, 또는 개시된 본 방법으로부터 발생된 데이터 구조가 개시되어 있다. 데이터 구조는 일반적으로 조성물 또는 매질 형태로 수집되고/되거나, 조직화되고/되거 나, 저장되고/되거나 구현된 임의의 형태의 데이터, 정보 및/또는 물체이다. 전자적 형태, 예컨대, RAM 형태로 저장되거나 저장 디스크 상에 저장된 리보스위치 구조 및 활성화 측정치는 데이터 구조의 한 종류이다.

개시된 본 방법, 또는 이의 일부 또는 이를 위한 제제는 컴퓨터 제어에 의해 제어될 수 있거나, 관리될 수 있거나 또는 보조될 수 있다. 이러한 컴퓨터 제어는 컴퓨터 제어된 프로세스 또는 방법에 의해 달성될 수 있고, 데이터 구조를 사용하고/하거나 발생시킬 수 있으며, 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 상기 컴퓨터 제어, 컴퓨터 제어된 프로세스, 데이터 구조 및 컴퓨터 프로그램이 고려되고 본 명세서에 개시된 것으로 이해되어야 한다.

방법

본 명세서에는 리보스위치를 포함하는 구축물을 RNA 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA의 프로세싱에 영향을 미치는 방법이 개시되어 있는데, 이때 상기 리보스위치는 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있고, 상기 스플라이싱의 조절이 RNA의 프로세싱에 영향을 미친다. 리보스위치는 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치는 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함할 수 있고, 이때 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인은 이종 도메인이다. 리보스위치는 RNA의 인트론 내에 존재할 수 있다. 리보스위치는 유발 분자, 예컨대, TPP에 의해 활성화될 수 있다. 리보스위치는 TPP-반응성 리보스위치일 수 있다. 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 활성화시킬 수 있다. 리보스위치는 택일적 스플라이싱을 억제할 수 있다. 스플라이싱은 비-천연적으로 일어날 수 있다. 택일적 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 루프 5에서 발견될 수 있다. 택일적 스플라이싱을 조절하는 앱타머의 영역은 예를 들어, 줄기 P2에서 발견될 수도 있다. 스플라이스 부위는 예를 들어, 앱타머의 5' 말단을 기준으로 -130 내지 -160 사이의 위치에 위치할 수 있다.

"RNA의 스플라이싱을 조절하는"은 RNA의 스플라이싱을 조절하여 상이한 mRNA 분자가 형성되어 잠재적으로 상이한 단백질이 형성되게 하는(언제나 상이한 단백질이 형성되게 하는 것은 아님) 리보스위치를 의미한다. 리보스위치는 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. "RNA의 프로세싱에 영향을 미침"은 RNA의 프로세싱에 영향을 미쳐 상이한 mRNA 분자가 형성되게 하고 RNA의 발현을 변경(언제나 RNA의 발현을 변경하는 것은 아님)할 수 있는 리보스위치를 의미한다. 리보스위치는 예를 들면 전사 종결, RNA의 3' 말단 형성 또는 RNA의 폴리아데닐화를 조절할 수 있다.

또한, 본 명세서에는 RNA의 스플라이싱을 조절하고/하거나 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 예를 들어, 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 화합물 또는 유발 분자를 리보스위치와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 화합물은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 차단하는 데 사용될 수 있다. 리보스위치에 대한 유발 분자(및 다른 활성화 화합물)를 사용하여 리보스위치를 활성화시킬 수 있다. 일반적으로, 유발 분자 이외의 화합물(예컨대, TPP)을 사용하여 리보스위치를 불활성화시킬 수 있거나 차단할 수 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치의 존재로부터 유발 분자를 제거함으로써 불활성화시킬 수도 있다. 따라서, 리보스위치를 불활성화시키는 개시된 방법은 예를 들어, 리보스위치의 존재로부터 또는 리보스위치와의 접촉으로부터 유발 분자(또는 다른 활성화 화합물)를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 리보스위치는 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키지 않는 유발 분자의 유사체의 결합에 의해 차단될 수 있다.

또한, 본 명세서에는 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 포함하는 RNA 분자와 화합물을 접촉시켜 상기 RNA 분자의 발현 또는 상기 RNA 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 변경하는 방법이 개시되어 있다. 리보스위치는 예를 들어, RNA 분자의 택일적 스플라이싱을 조절하고/하거나 RNA의 프로세싱에 영향을 미칠 수 있다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 따라서, 리보스위치를 포함하는 원하는 RNA 분자를, 상기 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 조건 하에 둠으로써 RNA의 발현을 변경할 수 있다. 발현은 예를 들어, 전사 종결의 결과로서 변경될 수 있거나 또는 리보좀과 RNA의 결합 차단의 결과로서 변경될 수 있다. 유발 분자의 결합은 리보스위치의 성질 및 일어나는 스플라이싱 또는 프로세싱의 종류에 따라 RNA 분자의 발현을 감소시키거나 방해할 수 있거나, 또는 RNA 분자의 발현을 촉진하거나 증가시킬 수 있다.

본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단함 으로써 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 포함하는 천연발생적 유전자 또는 RNA의 발현을 조절하는 방법도 개시되어 있다. 리보스위치는 예를 들어, RNA의 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 상기 유전자가 이것을 보유하는 세포 또는 유기체의 생존에 필수적인 경우, 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단은 세포 또는 유기체의 사멸, 생장 저지 또는 약화를 초래할 수 있다. 예를 들어, 미생물의 생존에 필수적인 천연발생적 유전자 내의 천연발생적 리보스위치를 활성화시키면 상기 미생물이 사멸할 수 있다(상기 리보스위치의 활성화가 택일적 스플라이싱을 조절하고/하거나 RNA의 프로세싱에 영향을 미치고, 택일적 스플라이싱 및/또는 RNA의 프로세싱이 핵심적인 단백질을 상향-조절하거나 하향-조절하는 경우).

또한, 본 명세서에는 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 활성화시킬 수 있거나, 불활성화시킬 수 있거나 또는 차단할 수 있는 화합물을 선별하고 동정하는 방법이 개시되어 있다. 리보스위치는 예를 들어, 택일적 스플라이싱을 조절할 수 있다. 리보스위치의 활성화는 유발 분자의 결합 시 리보스위치의 상태 변화를 의미한다. 리보스위치는 유발 분자의 결합 이외의 방법으로 유발 분자 이외의 화합물에 의해 활성화될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유발 분자"는 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 분자 및 화합물을 지칭하는 데 사용된다. 이것은 리보스위치에 대한 천연 또는 정상 유발 분자, 및 리보스위치를 활성화시킬 수 있는 다른 화합물을 포함한다. 천연 또는 정상 유발 분자는 천연 상태의 소정의 리보스위치에 대한 유발 분자이거나, 또는 일부 비-천연 리보스위치의 경우, 리보스위치를 디자인하는 데 사용되거나 리보스위치를 선별하는 데(예를 들어, 시험관내 선별 또는 시험관내 진화 기법에서 선별하는 데) 사용된 유발 분자이다. 비-천연 유발 분자는 비-천연 유발 분자로서 지칭될 수 있다.

본 명세서에는 스플라이싱을 조절하고/하거나 RNA 프로세싱에 영향을 미치는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하는 방법도 개시되어 있다. 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키는 화합물은, 시험 화합물을 리보스위치와 접촉시키고 RNA의 스플라이싱 및/또는 프로세싱을 측정하거나 스플라이싱 및/또는 프로세싱의 결과로서 발현된 단백질의 차등 발현 수준을 측정하여 상기 리보스위치의 활성화를 평가함으로써 동정될 수 있다. 리보스위치가 활성화되는 경우, 시험 화합물은 상기 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정된다. 리보스위치의 활성화는 임의의 적절한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 리보스위치는 레포터 RNA에 연결될 수 있고, 상기 레포터 RNA의 발현, 발현 수준 또는 발현 수준의 변화는 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 측정될 수 있다. 또 다른 예로서, 리보스위치는 구조-의존적 표지를 포함할 수 있고, 이 표지로부터의 신호는 상기 리보스위치의 활성화 상태에 따라 변한다. 이러한 리보스위치는 바람직하게는 천연발생적 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연발생적 리보스위치로부터 유래된 앱타머 도메인을 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 리보스위치의 활성화 평가는 대조군 분석 또는 측정을 이용하거나 이용하지 않고 수행될 수 있다. 리보스위치를 불활성화시키는 화합물을 동정하는 방법도 유사한 방식으로 수행될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법들 이외에, 스플라이싱을 조절하고/하거나 RNA 프로 세싱에 영향을 미치는 리보스위치를 차단하는 화합물의 동정은 임의의 적절한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 리보스위치를 활성화시키거나 불활성화시키는 것으로 공지된 화합물의 존재 및 시험 화합물의 존재 하에서 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 평가하는 분석을 수행할 수 있다. 활성화 또는 불활성화가 시험 화합물의 부재 하에서 관찰되는 것처럼 관찰되지 않는 경우, 상기 시험 화합물은 리보스위치의 활성화 또는 불활성화를 차단하는 화합물로서 동정된다.

본 명세서에는 택일적 스플라이싱을 조절하는 바이오센서 리보스위치를 사용하여 화합물을 검출하는 방법도 개시되어 있다. 상기 방법은 시험 화합물과 바이오센서 리보스위치를 접촉시키는 단계, 및 상기 바이오센서 리보스위치의 활성화를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 바이오센서 리보스위치의 활성화는 시험 샘플 중에 바이오센서 리보스위치에 대한 유발 분자가 존재함을 시사한다. 바이오센서 리보스위치는 그의 동족 유발 분자의 존재 하에서 검출가능한 신호를 발생시키는 개조된 리보스위치이다. 유용한 바이오센서 리보스위치는 유발 분자의 역치 수준 이상에서 유발될 수 있다. 바이오센서 리보스위치는 생체내에서 또는 시험관내에서 사용될 수 있도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 택일적 결합을 조절하는 바이오센서 리보스위치는 리보스위치/레포터 RNA를 코딩하는 핵산 구축물을 보유하는 세포 또는 유기체를 개조함으로써 생체내에서 사용될 수 있는 신호로서 작용하거나 상기 신호를 발생시키는 데 관여하는 단백질을 코딩하는 레포터 RNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 시험관내에서 사용되는 바이오센서 리보스위치의 일례는 구조-의존적 표지를 포함하는 리보스위치이고, 상기 표지로부터의 신호는 상기 리보스 위치의 활성화 상태에 따라 변한다. 이러한 바이오센서 리보스위치는 바람직하게는 천연발생적 TPP 리보스위치의 앱타머 도메인 또는 천연발생적 TPP 리보스위치로부터 유도된 앱타머 도메인을 사용한다.

또한, 본 명세서에는 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물을 동정하고 동정된 화합물을 제조함으로써 수득되는 화합물이 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물 동정 방법을 동정된 화합물의 제조 방법과 조합하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 시험 화합물과 리보스위치를 접촉시키고, 상기 리보스위치의 활성화를 평가하고, 상기 리보스위치가 상기 시험 화합물에 의해 활성화되는 경우, 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득될 수 있다.

또한, 본 명세서에는 화합물에 의한 리보스위치의 활성화, 불활성화 또는 차단을 조사하고 조사된 화합물을 제조함으로써 수득되는 화합물이 개시되어 있다. 이것은 예를 들어, 본 명세서에 개시된 화합물 활성화, 불활성화 또는 차단 평가 방법을 조사된 화합물의 제조 방법과 조합하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 시험 화합물을 리보스위치와 접촉시키고, 상기 리보스위치의 활성화를 평가하고, 상기 리보스위치가 시험 화합물에 의해 활성화된 경우 리보스위치를 활성화시키는 시험 화합물을 상기 화합물로서 제조함으로써 수득될 수 있다. 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 능력에 대해 화합물을 조사하는 것은 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이전에 공지되지 않은 화합물을 동정하는 것, 및 화합물이 리보스위치를 활성화시키거 나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 것으로 이미 공지되어 있는 경우 상기 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나 또는 차단하는 화합물의 능력을 평가하는 것 둘다를 의미한다.

화합물은 리보스위치 분석에서의 신호가 상기 화합물의 부재 하에서의 동일한 리보스위치 분석(즉, 대조군 분석)에 비해 상기 화합물의 존재 하에서 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500% 이상 증가되는 경우 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정될 수 있거나 리보스위치 활성화 활성을 나타내는 화합물로서 동정될 수 있다. 리보스위치 분석은 임의의 적절한 리보스위치 구축물을 사용하여 수행될 수 있다. 리보스위치 활성화 분석에 특히 유용한 리보스위치 구축물은 본 명세서에 기재되어 있다. 리보스위치를 활성화시키는 화합물 또는 리보스위치 활성화 활성을 나타내는 화합물의 동정은 1가지 이상의 특정 리보스위치, 리보스위치 구축물 또는 리보스위치 부류의 관점에서 수행될 수 있다. 편의상, 택일적 스플라이싱을 조절하는 리보스위치를 활성화시키는 화합물로서 동정된 화합물은 특정 리보스위치에 대해서도 그와 같은 활성이 확인될 수 있다.

실시예 1: mRNA 의 택일적 3' 말단 프로세싱에 의한 식물에서 유전자 발현의 리보스위치 조절

모든 3가지 도메인 생명체로부터 유기체 내에서 발견되는 가장 만연된 리보 스위치 부류는 비타민 B₁의 유도체인 조효소 TPP에 반응성이다. TPP 리보스위치는 검사된 모든 식물 종의 티아민 생합성 유전자 THIC의 3' UTR 내에 존재하는 것으로 발견되었다. THIC TPP 리보스위치는 mRNA 안정성 및 단백질 형성에 영향을 미치는 택일적 3' UTR 길이를 갖는 전사체의 형성을 조절한다. 택일적 3' 말단 프로세싱의 리보스위치-매개된 조절은 THIC 발현의 TPP-의존적 피드백 조절에 결정적인 것으로 입증되었다. 데이터는 RNA 폴딩의 대사물질-의존적 변경이 mRNA의 스플라이싱 및 택일적 3' 말단 프로세싱을 조절하는 기작을 밝혀내었다. 이러한 발견은 식물에서의 리보스위치에 의한 대사물질 감지의 중요성을 두드러지게 하며 나아가 진핵생물에서 유전자 조절의 기작으로서 택일적 3' 말단 프로세싱의 유의성을 밝혀내었다.

리보스위치는 전형적으로 mRNA의 비-코딩 부분에 위치한 대사물질-감지 유전자 조절 요소이다. 현재까지 세균류에서 리보스위치의 12개 구조적 부류가 조효소, 아미노산 및 뉴클레오티드 염기(Mandal and Breaker, 2004; Soukup and Soukup, 2004; Winkler and Breaker, 2005; Fuchs et al., 2006; Roth et al., 2007) 또는 마그네슘 이온(Cromie et al., 2006)을 비롯한 작은 유기 화합물을 감지하는 것으로 특성화되어 있다. 대부분의 경우에, 리보스위치는 각각 리간드 결합 및 유전자 조절을 담당하는 2개의 기능적으로 뚜렷하게 구별되지만 통상적으로 물리적으로 중첩되는 도메인을 나타내는 앱타머 및 발현 플랫폼 영역으로 나누어질 수 있다.

앱타머에 의해 형성된 구조의 복잡성 및 이의 리간드 인식의 기작은 구아닌 및 아데닌(Batey et al., 2004; Serganov et al., 2004), S-아데노실메티오닌(Montange and Batey, 2006), TPP(Edwards and Ferre-D'Amare, 2006; Serganov et al., 2006; Thore et al., 2006) 및 글루코사민-6-포스페이트(Kline and Ferre-D'Amare, 2006; Cochrane et al., 2007)에 결합하는 것을 비롯하여 수개의 리보스위치 부류에 대해 X-선 결정학에 의해 밝혀진 원자-해상 모델의 검사 시 명백하다. 각 앱타머 부류의 리간드-결합 코어의 뉴클레오티드 서열 및 지지 구조는 단지 4개의 뉴클레오티드 유형을 사용한 특정 리간드에 대한 정확한 수용체를 형성하는 데 필요한 결과로서 상이한 종 사이에 고도로 보존된다. 대조적으로, 리보스위치에 대한 발현 플랫폼은 종 사이에서 또는 심지어 단일 유기체 내에서 리보스위치 부류의 다중 대표예 사이에서 크게 달라질 수 있다.

앱타머 보존도가 높으면 연구자들이 생체정보학 방법을 이용하여 새로운 리보스위치 후보를 동정(예: Grundy and Henkin, 1998; Gelfand et al., 1999; Barrick et al., 2004; Corbino et al., 2005; Weinberg et al., 2007)하고 다양한 유기체 내에서 공지의 리보스위치 부류의 분포를 결정(예: Rodinov et al., 2002; Vitreschak et al., 2003; Nahvi et al., 2004; Abreu-Goodger and Merino, 2005)할 수 있다. 현재까지 이들 연구 결과는 TPP-감지 리보스위치 부류의 유일한 구성원이 모든 3가지 도메인 생명체에 존재한다는 것을 밝혔다(Sudarsan et al., 2003). 진핵생물에서, TPP 앱타머가 식물 및 섬사상 진균류로부터의 티아민 대사 유전자 내에서 발견되었지만, 리보스위치 기능의 기작은 확실치 않은 것으로 남아 있다(Kubodera et al., 2003; Sudarsan et al., 2003). 진균류 뉴로스포라 크라사에서, TPP 앱타머는 NMT1 mRNA의 5' 영역 내의 인트론에 존재하고 최근에는 앱타머에 의한 TPP 결합이 택일적 스플라이싱을 조절함으로써 NMT1 유전자 발현을 조절하는 것임이 증명되었다(Cheah et al., 2007). 구체적으로, 리보스위치에 의한 TPP 결합은 주(major) ORF의 발현을 막는 상류 개방 판독 틀(uORF)을 보유하는 인트론 서열의 제거를 방해한다.

여기서, TPP 리보스위치는 다양한 식물 종에서 티아민 대사 유전자 THIC의 3' UTR 내에 존재하는 것이 보고되었다. 택일적 3' UTR 길이를 갖는 THIC 전사체의 형성은 리보스위치 기능에 의존적이고 세포성 TPP 수준의 변화에 응답하여 THIC 발현의 피드백 조절을 매개한다. 데이터는 3' UTR 길이가 전사 안정성에 상관관계가 있어 택일적 3' 말단 프로세싱에 의한 유전자 조절의 기초를 확립함을 시사한다. THIC mRNA의 스플라이싱 및 차등적 3' 말단 프로세싱의 앱타머 매개된 조절을 포함하는, 식물에서의 TPP 리보스위치 기능에 대한 상세한 기작이 제시되어 있다. 이 연구는 또한 상이한 도메인 생명체로부터의 유기체 내의 리보스위치 조절의 다양성을 밝혀내고 진핵 유전자 조절의 종래 공지되지 않은 양태에 대한 지식을 확장시킨다.

1. 결과 및 논의

i. TPP 앱타머는 식물 종에 널리 분포되어 있다.

식물 종 아라비돕시스 탈리아나, 오리자 사티바 및 포아 세쿤다로부터의 THIC 유전자의 3' UTR 내에 고도로 보존된 TPP-결합 앱타머의 존재가 종래 보고되 었다(Sudarsan et al., 2003). 식물 TPP 앱타머 대표예의 수집은 부가적인 식물 종으로부터의 THIC 유전자의 시퀀싱 및 TPP 앱타머 공통 서열에 부합하는 뉴클레오티드 서열에 대한 데이터베이스 검색에 의해 확장되었다. cDNA 서열을 얻은 후 각 종의 게놈 DNA로부터의 상응하는 영역을 클로닝하고 시퀀싱하여(세부사항은 실험 과정 참조) 초기 및 프로세싱된 mRNA 분자 둘다의 서열을 제공하였다.

식물로부터의 모든 입수가능한 TPP 앱타머 서열의 정렬은 고도로 보존된 뉴클레오티드 서열 및 줄기 P1 내지 P5로 구성된 2차 구조를 밝혀내었다(도 1a). 식물로부터의 진핵 TPP 리보스위치 앱타머(도 1b)와 세균 및 고세균 대응부(도 1c)(Winkler et al., 2002; Rodionov et al., 2002)에 비교된 섬사상 진균류(Cheah et al., 2007) 사이의 주요 차이는 세균 대표예에 종종 존재하는 P3a 줄기의 일관된 부재 및 진핵생물에서의 P3 줄기의 다양한 길이이다. 어떠한 영역도 TPP 결합에 관련되지 않으며(Edwards and Ferre-D'Amare, 2006; Serganov et al., 2006; Thore et al., 2006; Cheah et al., 2007) 따라서 이들 차이가 리간드 결합 특이성에 영향을 미치지 않는다.

TPP 앱타머는 단자엽, 쌍자엽 및 침엽수 피누스 타에다로부터의 모든 공지된 THIC 예의 3' UTR 내에서 발견된다. 흥미롭게도, 이끼 사이코미트렐라 파텐스에서 TPP 앱타머는 THIC의 3' UTR 내에 존재하고(Ppa1) 또한 티아민 생합성 유전자 THI4에 상동성인 2개 유전자의 3' 영역 내에 존재한다(Ppa2, Ppa3). 후자의 관찰 및 진균류가 또한 다중의 상이한 유전자와 연관있는 TPP 앱타머를 갖는다는 관찰(Cheah et al., 2007)은 진핵류가 마찬가지로 핵심 대사물질의 농도 변화에 응답 하여 다중 유전자를 조절하는 데 동일한 리보스위치 부류의 변이체를 사용함을 시사한다.

식물로부터의 TPP 앱타머의 놀라운 특징은 뉴클레오티드 서열 보존도가 높다는 것이다. 약 80%의 뉴클레오티드(P3 줄기 제외)가 모든 식물 예에서 보존되었다. 대조적으로, 40% 미만이 섬사상 진균류에서 보존되었다. 식물 TPP 앱타머 중 대부분의 차이가 P3 줄기에서 발견되었는데, 그 길이 및 서열 둘다에서 다양하다. 또한, P3 줄기의 길이는 사이코미트렐라 파텐스에서 관찰되는 바와 같이 동일 종에서 TPP 앱타머 사이에서 다양하다(도 1a). THIC에서 연장된 P3 줄기 및 THI4에서 매우 짧은 P3 줄기 둘다의 존재는 이러한 앱타머의 구성요소에 대한 종-특이적 요건이 없음을 시사한다.

ii . THIC 3' UTR 은 길이 및 서열이 다양하다.

6개 식물 종으로부터 클로닝된 또는 진뱅크(GenBank)로부터 수득된(오리자 사티바) THIC mRNA의 3' 영역의 뉴클레오티드 서열을 분석하였다(도 8; 또한 세부사항은 실험 과정 참조). 흥미롭게도, THIC 유전자의 3' 영역의 게놈 편성은 이들 7종 중에 보존되고 다양한 3' UTR 길이를 갖는 프로세싱된 RNA 전사체의 3개 주요 유형의 형성이 항상 관찰된다(도 2a). 통상적으로는 THIC ORF에 대한 정지 코돈 다음에 모든 3가지 RNA 유형에서 전형적으로 스플라이싱되는 인트론이 온다. 유형 I(THIC-I) RNA는 완전한 앱타머를 보유하고 그 3' 말단에서 가변 길이로 연장될 수 있다. 유형 III(THIC-III) RNA는 TPP 앱타머의 일부를 제거하는 다른 인트론의 스플라이싱 후의 유형 I에 상응하는 반면, 유형 II(THIC-II) RNA는 앱타머의 상류를 종결한다.

이들 종의 THIC 3' UTR 내의 다양한 영역(1 내지 6으로 지정됨)의 길이의 정량화 결과 일부 영역(2 내지 5)이 UTR 내에서 핵심 특징을 가교하는 뉴클레오티드의 수의 상당한 보존을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 2b). 대조적으로, THIC-I 및 THIC-III의 제1 인트론의 길이(영역 1) 및 3'의 대부분의 길이(영역 6)는 매우 가변적이다. 예를 들면, THIC-I 및 THIC-III은 그 3' 말단에서 1 kb 초과만큼 연장될 수 있다. 특정 3' UTR 특징부들 사이의 거리의 보존은 TPP-매개된 유전자 조절에 중요할 수 있다.

역전사 및 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 THIC 전사체 유형의 양을 정량화하였다. 폴리T 프라이머 및 THIC ORF에 특이적인 프라이머(모든 THIC 전사체 유형을 증폭시킴)를 사용한 RT-PCR 결과 THIC-II의 증폭이 우세한 것으로 나타났다(도 2c). 이것은 짧은 전사체 형태가 검사된 모든 종에서 가장 풍부하게 존재함을 입증한다. 또한, THIC mRNA의 코딩 영역에 결합하는 프로브를 사용한 노던 블롯 분석 결과 아도롭시스 탈리아나로부터의 THIC-II의 크기에 상응하는 하나의 주요 신호가 생성되었다(하기 추가의 논의 참조).

THIC-I 및 THIC-III을 연장된 3' 영역에 특이적이고 THIC-II RNA를 인식하지 않는 후방 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 검출하였다(도 2d). 각 종에 대한 최저 PCR 생성물 밴드는 THIC-III에 상응하는 반면, 부가적인 밴드는 3' UTR의 하나 또는 둘다의 인트론을 아직 보유하는 THIC-I로부터 유래된 생성물을 나타내거나 부(minor) 스플라이싱 변이체를 나타낸다. 아도롭시스 탈리아나로부터의 THIC-I 및 THIC-III의 3' UTR에 특이적인 프로브를 사용하여 노던 블롯 분석한 결과 이들 전사체 유형이 낮은 복제수로 존재함이 확인되었고(하기 추가의 논의 참조) 또한 전사체 길이의 이질성이 나타났다.

3' 말단 프로세싱이 아도롭시스 탈리아나에서 다양한 전사체 유형에 대해 차이가 있는지 평가하기 위해, 전사체의 영역에 특이적인 증폭을 허용하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 폴리T 또는 랜덤 헥사머 프라이머를 사용하여 생성된 cDNA는 THIC-II(데이터는 나타내지 않음) 및 THIC-III(도 2e)의 증폭의 차이를 보이지 않았다. 그러나, THIC-I PCR 생성물의 상대적으로 풍부한 존재도는 폴리T 유도된 cDNA에 비해 랜덤 헥사머 프라이머를 사용하여 생성된 cDNA로부터의 증폭 후 매우 증가되었다(도 2e). 이것은 대부분의 THIC-I RNA가 폴리아데닐화되지 않았고 따라서 프로세싱되지 않은 THIC 전구체 전사체를 나타냄을 시사한다. 또한, 앱타머 서열의 먼 하류에 결합하는 프라이머를 사용하여 생성된 cDNA는 PCR 증폭 생성물을 생성하였고(도 2e), 이는 THIC-I 및 THIC-III이 아도롭시스 탈리아나에서 THIC의 주석달린 말단의 1 kb 초과의 하류로 연장될 수 있음을 시사한다. 매우 긴 3' UTR을 갖는 필적하는 THIC mRNA가 또한 진뱅크에서 전장의 cDNA 주석에 따른 오리자 사티바(AK068703, AK065235, AK120238)에 대해 관찰되었다. 긴 3' UTR을 갖는 mRNA의 형성은 3' 말단 프로세싱 및 전사 종결의 손상의 척도이다.

iii . 티아민은 THIC 전사체 수준에 영향을 미친다.

전사체 수준이 증가된 티아민 농도에 반응하는지를 평가하기 위해, THIC 전 사체의 양을 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 사용하여 확립하였다. 아도롭시스 탈리아나 묘목에 다양한 양의 티아민을 보충하고 상이한 THIC 전사체 유형을 특이적 프라이머 조합을 사용하여 검출하였다. 또한 THIC-II를 증폭시키는 프라이머 조합이 제1 3' UTR 인트론의 스플라이싱을 수행한 THIC-I RNA의 하위세트에 결합할 수 있다. 그러나, 후자의 증폭 생성물의 기여가 덜한데, 그 이유는 cDNA가 폴리T 프라이머를 사용하여 생성될 때 THIC-I 전사체가 훨씬 덜 풍부하고 거의 검출될 수 없기 때문이다(도 2e).

1 mM 티아민을 함유하는 배지 상에서 묘목을 생장시킨 후 THIC 전사체의 총량은 묘목이 티아민 보충 없이 생장되었을 때 측정된 값의 약 20%로 감소된다(도 3a). THIC-II 전사체는 동등한 감소를 나타내지만 THIC-I 및 THIC-III 전사체 둘다 복제수를 거의 또는 전혀 변화시키지 않는 것으로 나타났다. 동일한 샘플의 노던 블롯 분석을 사용하여 THIC-II 수준이 감소되었고 THIC-I 및 THIC-III RNA 수준의 양을 비교적 변화시키지 않으면 비교적 변화되지 않고 유지됨을 확인하였다(도 3b).

전사체 수준의 티아민-매개된 변화가 일어나는 시간 간격을, 티아민 용액으로 아도롭시스 탈리아나 묘목을 분무한 후 수개의 시점에서 THIC 전사체의 qRT-PCR을 수행함으로써 평가하였다(도 3c). 티아민을 적용한 지 4시간 후 전체 THIC RNA 및 THIC-II 양은 티아민의 첨가 없이 측정된 값의 50%로 감소되었다. 26시간 후에는 이러한 수준이 더욱 더 감소되었다. 흥미롭게도, 티아민이 배지에 첨가되었을 때(도 3a) 이 분석에서 관찰된 THIC-III의 최적의 증가는 반응의 초기 상에서 더욱 현저하였다. 상이한 전사체 유형은 티아민 처리에 반대의 응답을 보이기 때문에, 조절 기작은 대부분 RNA 프로세싱을 수반하는 것 같고 피드백 기작이 프로모터 조절 수준에서 작용하는 것 같지 않다. 실제로, 유전자전이 주에서 아도롭시스 탈리아나로부터의 THIC 프로모터에 의해 구동된 레포터 유전자의 발현이 티아민 보충 후 변경되지 않았다(도 9).

세포에 의해 취해진 티아민의 대부분은 연속적인 포스포릴화 반응에 의해 TPP로 전환되어 포스포릴화되지 않은 비타민의 농도보다 훨씬 더 높은 이 조효소의 농도를 생성하는 것으로 예상된다(Ajjawi et al., in prep). 따라서, 전체 THIC RNA 수준의 관찰된 감소는 증가된 TPP 농도에 대한 리보스위치-매개된 반응을 가장 가능성있게 반영하는 바, 식물 앱타머에 대한 TPP 결합이 일어나는 것으로 공지되어 있다(Sudarsan et al., 2003; Thore et al., 2006). 이 경우, 티아민 보충 없이 배지 상에서 생장된 식물에 존재하는 것에 비해 TPP 농도가 감소될 때 반대 효과가 일어난다(리보스위치에 대한 동적 범위가 이러한 TPP 농도 범위에 걸쳐 있는 것으로 가정함).

야생형(WT) 아도롭시스 탈리아나 식물에서 THIC 발현을 티아민 피로포스포키나제(TPK)의 이중 녹아웃을 보유한 것과 비교함으로써 시험하였다. 이들 돌연변이체는 아도롭시스 탈리아나에 존재하는 TPK 이소폼 둘다가 결핍되어 있고 따라서 티아민을 TPP로 전환할 수 없다(Ajjawi et al., in prep). TPK 이중 녹아웃(TPK-KO) 식물은 발아 후 2주 내의 묘목에 저장된 TPP를 대부분 고갈시키고 식물은 그 생활 주기를 완성하는 데 있어서 TPP 보충에 의존적임이 밝혀졌다(Ajjawi et al., in prep). 예견된 바와 같이, 12일령 TPK-KO 묘목으로부터의 THIC RNA의 qRT-PCR 분석 결과 WT에 비해 THIC-II의 양의 증가 및 THIC-III의 현저한 감소를 나타내었다(도 3d).

묘목에서 THIC 발현은 식물을 전형적인 명암 주기로부터 연속적인 광 하로 옮긴 후 보유되는 일주기 리듬을 따른다는 것이 또한 주목할만하다(도 10). 전체 THIC RNA 및 THIC-III 둘다에 대해 동일한 리듬 상이 관찰되었고, 이는 리보스위치 매개된 피드백 조절이 THIC 발현의 일주기 리듬에 영향을 미치지 않음을 입증한다.

iv . 3' UTR 길이는 유전자 발현 수준을 한정한다.

상이한 THIC RNA 유형의 존재 및 티아민 수준을 달리함에 따른 이들의 존재도의 변화는 TPP 앱타머가 RNA 프로세싱을 조절할 수 있고 상이한 3' UTR을 갖는 전사체가 차등적으로 발현될 수 있음을 시사한다. 아도롭시스 탈리아나로부터의 전장의 앱타머가 겉보기 해리 상수(K_D) 약 50 nM로 TPP에 결합한다는 것(Sudarsan et al., 2003) 및 그 3차 구조(Thore et al., 2006)가 세균 TPP 앱타머의 구조(Edwards and Ferre-D'Amare, 2006; Serganov et al., 2006)와 유사하다는 것이 종래 밝혀져 있다. 전구체 RNA인 THIC-I은 완전한 앱타머를 보유하고 따라서 TPP에 결합하는 것으로 예상된다.

대조적으로, THIC-III은 대부분의 공통 TPP 앱타머 서열을 포함하지만, 그 5' 말단에서 제1의 7개 뉴클레오티드가 3' UTR 내의 제2 인트론의 스플라이싱으로 인해 제거되고 상이한 뉴클레오티드로 대체된다(도 4a, 회색 음영으로 표시된 서 열). 인-라인 프로빙(Sokoup and Breaker, 1999)을 사용하여 변경된 앱타머가 TPP 결합 활성을 보유하는지 여부를 결정하였다. 이 분석은 대사물질 결합 시 자연발생적 RNA 퇴화의 변경된 패턴을 모니터링함으로써 TPP 앱타머의 구조적 변화(Sudarsan et al., 2003; Winkler et al., 2002)를 밝히는데 종래 사용되어 왔다. TPP에 대한 변경된 앱타머의 겉보기 K_D는 약 60 μM(도 4b 및 4c)이고 이는 리간드-결합 친화도의 3 초과의 크기의 손실이다. 또한, 티아민은 변경된 앱타머에 결합하지 않고(데이터는 나타내지 않음), 다른 티아민 유도체는 이 앱타머에 의해 결합될 수 없는 것으로 보이는데, 이는 스플라이싱 시 교환되는 앱타머의 영역이 리간드 인식에 직접적으로 관여하지 않기 때문이다(Edwards and Ferre-D'Amare, 2006; Serganov et al., 2006; Thore et al., 2006). 이러한 발견은 3' UTR의 제2 인트론의 스플라이싱이 일단 일어나면 THIC-III에서의 TPP 앱타머의 나머지가 더 이상 기능적이지 않음을 시사한다.

유전자 발현에 대한 2개 주요 THIC 3' UTR 형태의 가능한 영향을 평가하기 위해, 아도롭시스 탈리아나로부터의 THIC-II(188개 뉴클레오티드) 및 THIC-III(408개 뉴클레오티드)으로부터 3' UTR 서열을 루시퍼라제(LUC)의 코딩 영역에 융합하고 이 구축물을 구성적 프로모터 및 종결자 요소의 조절 하에 식물에서 발현시켰다. THIC-III은 3' 말단에서 가변 길이로 연장될 수 있지만, 가장 풍부하게 존재하는 가장 짧은 것(진뱅크 NM179804에 상응하는 것)을 발현 분석에 사용하였다. THIC-III으로부터의 3' UTR을 함유하는 융합 구축물은 THIC-II로부터의 3' UTR을 보유하 는 구축물에 비해 LUC 활성의 단지 약 10%를 초래하였다(도 4d). 유형 III 구축물에서 변경된 TPP 앱타머의 가능한 관련성은 TPP 결합을 완전히 파괴하지만 LUC 발현을 저하시키지 않는 돌연변이 M1 및 M2를 도입함으로써 배제되었다. 또한, THIC-III 3' UTR 서열의 역 보완 서열을 사용한 경우 LUC 활성을 유의하게 변화시키지 않았다. 이 데이터는 연장된 길이 및 변경되지 않은 TPP 앱타머가 유형 III RNA로부터의 3' UTR을 함유하는 구축물의 발현억제에서 역할을 함을 시사한다. LUC 대신에 레포터 유전자 EGFP를 함유하는 구축물을 사용한 경우 동등한 결과가 수득되었고 사일런싱 억제제 P19의 공발현은 관찰된 차이가 레포터 시스템에서 사일런싱 효과에 기인한다는 가능성을 배제하였다(도 11).

레포터 활성의 차이가 또한 전사체 양에 반영되는지 여부를 평가하였다. qRT-PCR을 사용하여 아도롭시스 탈리아나 또는 니코티아나 벤타미아나로부터의 THIC-II 또는 THIC-III으로부터 3' UTR을 함유하는 레포터 전사체의 상대적 양을 결정하였다(도 4e). 둘다의 종으로부터의 유형 III RNA의 긴 3' UTR을 보유하는 구축물은 짧은 유형 II 3' UTR을 보유한 것에 비해 더 낮은 존재도로 존재하였다. 모든 레포터 구축물은 구성적 프로모터 및 종결자의 조절 하에 발현되었으므로, 전사 개시 및 종결은 모든 구축물에 대해 동일함에 틀림없다.

이러한 발견은 긴 3' UTR이 증가된 전사체 턴오버를 야기함을 시사한다. 따라서, 연장된 3' UTR을 갖는 mRNA의 생성을 선호하는 RNA 프로세싱의 리보스위치-매개된 재배향은 THIC 발현을 감소시킨다. 이러한 가설은 긴 3' UTR이 효모(Muhlard and Parker, 1999) 및 식물(Kertesz et al., 2006)에서 넌센스-매개된 붕괴(nonsense-mediated decay; NMD)를 유도함을 보여주는 종래 연구와 일치한다. 후자의 연구에서, 200개 초과의 뉴클레오티드의 3' UTR 길이를 갖는 mRNA의 존재도의 감소를 관찰한 바, 3' UTR 길이와 NMD 효율 사이에 상관관계가 있었다. 더욱이, 이러한 결과는 이 기작이 mRNA 품질 감시(Fasken and Corbett, 2005)에 관련될 뿐만 아니라 식물에서 유전자 발현의 조절에 역할을 함을 시사한다.

v. 리보스위치는 티아민 피드백 반응에서 기능한다 .

스플라이스-변경된 TPP 앱타머는 프로세싱된 THIC-III RNA의 발현에 영향을 미치지 않지만, 변경되지 않은 TPP 앱타머는 단독으로 THIC mRNA 전사체의 프로세싱을 조절하여 상이한 3' UTR 길이를 갖는 RNA를 생성할 수 있는 리보스위치의 부분일 수도 있다. 이것은 안정하게 형질전환된 아도롭시스 탈리아나 식물에서 THIC의 완전한 게놈 3' 영역(정지 코돈의 약 2.2 kb 하류)과 융합된 EGFP를 함유하는 레포터 구축물의 발현을 분석함으로써 조사되었다. 티아민 증폭은 로제트 단계로부터의 잎에서 감소된 EGFP 형광을 초래하였다(도 5a 및 5b). qRT-PCR 분석을 사용하여 EGFP 및 내인성 THIC 전사체 둘다의 양이 티아민 공급 후 대조 수준의 약 20%로 감소되었음이 발견되었고(도 5c), 이는 아도롭시스 탈리아나 묘목에 대해 관찰된 것과 유사하다(도 3).

형질전환체로부터의 EGFP 융합 및 THIC 전사체의 3' UTR 서열을 RT-PCR을 사용하여 증폭시키고(도 5d 및 5e) 클로닝하고 시퀀싱하였다. 서열 분석 결과 EGFP 및 THIC에 대해 동등한 전사체 프로세싱 유형이 형성됨이 확인되었다(또한 도 2 참조). THIC 및 EGFP의 전체 전사체 양의 차이는 전이유전자의 조절에 강한 프로모 터를 사용함으로써 설명될 수 있다. 레포터 유전자 구축물과 THIC 사이의 티아민 반응 및 프로세싱된 RNA가 동일하기 때문에, EGFP에 융합된 영역의 부가적인 상류 서열이 유전자 조절 기작에 관여하지 않는 것으로 결론지어졌다.

티아민 조절의 효과가 TPP 리보스위치를 통해 매개되는지 여부를 결정하기 위해, 돌연변이 M2, M3 및 M4를 TPP 결합 친화도를 감소시키는 앱타머(도 6a) 내로 도입하였다. M2 및 M4 돌연변이는 각각 TPP 앱타머의 줄기 P5 및 P2의 형성을 방해한다. M3에 의해, TPP의 피리미딘 잔기와의 직접적인 상호작용에 관여하는 것으로 공지된 3개의 뉴클레오티드(Edwards and Ferre-D'Amare, 2006; Serganov et al., 2006; Thore et al., 2006)가 돌연변이화되었다. 이들 변이체를 보유하는 THIC의 3' 영역을 EGFP로 융합하고 아도롭시스 탈리아나 식물 내로 안정하게 형질전환하였다.

예상된 바와 같이, 돌연변이체 앱타머를 보유한 레포터 유전자 구축물을 함유하는 식물은 WT 구축물에 비해 감소된(M2) 또는 완전 손실된(M3 및 M4) 티아민 적용에 대한 반응성을 나타내었다(도 6b). 이러한 발견은 qRT-PCR을 사용한 전사체의 상대적인 수준을 측정함으로써 확인되었다(도 6c). 부가적으로, P2의 형성을 회복(이로써 TPP 결합을 회복)하는 보상적 돌연변이를 함유하는 M4의 레포터 구축물 변이체는 WT에 유사한 활성을 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 앱타머에 의한 TPP 결합이 세포 내의 TPP 수준을 변화시키는 반응을 매개하는데 필수적임을 시사한다. 그러나, M2 구축물에 의해 나타난 최적의 티아민 반응성은 이 돌연변이체가 단지 TPP에 대한 앱타머의 친화도를 감소시키는 것 이외에는 리보 스위치 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다(하기 추가의 논의 참조).

EGFP-리보스위치 융합으로부터 생성된 mRNA의 3' 말단의 RT-PCR 분석 결과 돌연변이체 구축물이 유형 II RNA의 높은 수준의 발현을 유지함(도 6d)이 밝혀졌고, 이는 WT 구축물의 전형이다. 그러나, 돌연변이체와 WT 리보스위치 사이의 유형 I 및 III RNA의 2개 주요 차이점이 명백하다. 첫째, 유형 III RNA의 양은 M2 구축물에서 실질적으로 감소되었고 M3 구축물로부터 검출되지 않았다(도 6e). 둘째, 앱타머의 먼 하류로 연장되는 전사체의 상당한 감소가 둘다의 돌연변이체에 대해 관찰되었다(도 6e, 882개 뉴클레오티드 레인, 또한 도 5e에서 WT 참조). 이로써, 적절한 리보스위치 기능이 상이한 3' UTR 서열 및 길이를 갖는 mRNA의 생성에 필요하고, 이는 유전자 발현의 티아민-의존적 하향-조절을 초래하는 것으로 밝혀졌다.

vi . 리보스위치 기능의 기작

인-라인 프로빙을 사용하여 TPP 리보스위치가 아도롭시스 탈리아나로부터의 THIC mRNA의 3' 말단 프로세싱을 조절하는 방법을 조사하였다. 제2의 3' UTR 인트론에 특이적인 5' 스플라이스 부위의 14개 뉴클레오티드 상류를 포함하는 앱타머 구축물은 스플라이스 부위의 바로 상류의 8개 뉴클레오티드의 TPP-의존적 구조 조절을 나타내었다(도 7a). 구체적으로, TPP 첨가는 5' 스플라이스 부위 근처의 뉴클레오티드의 구조적 유연성의 증가를 야기한다. 따라서, 리간드 결합은 스플라이스 부위의 스플라이스오좀으로의 접근성을 증가시켜 인트론의 제거를 허용할 수 있다.

수개의 식물 종으로부터 5' 스플라이스 부위 뉴클레오티드를 조절하는 서열과 THIC 유전자의 앱타머 뉴클레오티드 사이의 염기쌍 형성 가능성을 조사하였다. 검사된 모든 종에서, P4-P5 줄기의 5' 측면은 5' 스플라이스 부위의 바로 상류의 뉴클레오티드에 상보적이다(일부 경우는 이 뉴클레오티드를 포함한다)(도 7b). 이러한 염기쌍 형성 가능성의 보존은 낮은 TPP 농도 하에서 5' 스플라이스 부위를 차단하거나 높은 TPP 농도 하에서 스플라이스 부위를 노출하는 구조의 상호배타적 형성에 의해 리보스위치가 스플라이싱을 조절함을 시사한다(도 7c).

이 모델은 M2 변이체에 의해 관찰된 부분적인 티아민 반응성을 비롯하여 현재 연구에서 생성된 시험관내 및 생체내 데이터와 일치한다. M2는 앱타머의 P5 줄기를 파괴하는 2개 돌연변이(도 6a)를 보유하는데 이는 TPP와의 상호작용을 약화시키고 티아민 반응성을 파괴한다. 그러나, 이러한 돌연변이는 또한 5' 스플라이스 부위 영역과의 염기쌍 형성을 약화시키고, 이는 예상된 TPP 친화도의 감소에도 불구하고 TPP 결합이 이러한 택일적 염기쌍 형성과 효과적으로 경쟁하게 할 수도 있다. 식물 TPP 리보스위치의 하나의 현저한 특징은 리보스위치 조절 하의 5' 스플라이스 부위가 TPP 앱타머의 상보적 영역의 200개 초과의 뉴클레오티드의 상류에 위치한다는 것이다(도 2a). 상보적 영역들 사이의 서열의 복잡한 구조적 편성(도 12)은 이들 부위를 공간에서 함께 밀접하게 하여 그 상호작용을 용이하게 하는데 중요할 수 있고, 이는 또한 다양한 식물로부터의 THIC UTR의 특징부들 사이에서 길이의 보존을 설명할 수 있다(도 2a).

흥미롭게도, TPP 리보스위치는 또한 5' 스플라이스 부위 근처의 뉴클레오티 드와 점유되지 않은 TPP 앱타머의 P4-P5 영역 사이의 리간드-조절된 염기쌍 형성에 의해 부분적으로 진균류의 NMT1 유전자의 택일적 스플라이싱을 조절한다(Cheah et al., 2007). 이들 진핵류 예와 대조적으로, 세균류는 전형적으로 P1 줄기 내의 뉴클레오티드를 사용하여 앱타머의 하류에 위치한 발현 플랫폼과 상호접촉한다(Sudarsan et al., 2005; Winkler et al., 2002). 리간드 결합 시 TPP 앱타머의 구조에 실질적인 변화가 있으면, 놀랍게도, P1 및 P4-P5 줄기의 일부만이 현재까지 연구된 TPP 리보스위치에서 발현 플랫폼 기능을 조절하는 데 사용된다. 이러한 이유 중의 하나는 신속한 리간드 감지화를 촉진하기 위해 특정 앱타머 하위구조의 예편이 필요한 것일 수 있다.

vii . 식물에서 TPP 리보스위치 기능에 대한 모델

초기 연구는 세균류에서 발견된 것과 유사한 전사 종결자가 또한 진핵류에 존재할 수도 있음을 시사하였다(Proudfoot, 1989). 흥미롭게도, 식물에서 모든 공지된 TPP 리보스위치 내의 앱타머 바로 다음에 폴리-유리딘 트랙트가 오고(도 8 참조), 이 요소는 세균류에서 내재성 전사 종결자에 유사한 중합효소 방출에 관여할 수도 있다(Yarnell and Roberts, 1999; Gusarov and Nudler, 1999). 그러나, 진정세균 유사 전사 종결이 일어난 경우 예상되는 생성물과 일치하는 RNA 전사체가 전혀 동정되지 않았다.

mRNA 전사체의 스플라이싱 및 택일적 3' 말단 프로세싱의 대사물질-매개된 조절을 수행하는 식물에서 TPP 리보스위치 조절에 대해 상이한 모델이 제안되었다(도 7c). 세포 중 TPP 농도가 낮을 때 앱타머는 5' 스플라이스 부위와 상호작용하 여 스플라이싱을 방해한다. 이 인트론은 전사 절단 및 폴리아데닐화를 허용하는 주요 프로세싱 부위를 보유한다. 이 부위로부터의 프로세싱은 짧은 3' UTR을 보유하고 THIC 유전자의 발현효율이 높은 THIC-II 전사체를 생성한다.

TPP 농도가 높을 때 앱타머에 대한 TPP 결합은 5' 스플라이스 부위에 대한 쌍 형성을 방해한다. 그 결과, 5' 스플라이스 부위는 접근가능하게 되고 주요 프로세싱 부위를 제거하는 스플라이싱에 사용된다. 전사는 후속적으로 1 kb까지 연장되어 하류에 위치한 프로세싱 부위의 사용이 훨씬 더 긴 3' UTR을 보유하는 THIC-III RNA를 생성한다. 긴 3' UTR은 증가된 전사체 퇴화를 야기하고 THIC 발현이 감소된다. 종래 연구는 연장된 전사가 전사체 프로세싱의 부재 하에 일어남을 증명하고, 이로써 이들 프로세스의 상호연결성을 밝혔다(Buratowski, 2005; Proudfoot, 2004; Proudfoot et al., 2002).

진핵류에서 전사체 프로세싱 및 전사 종결이 커플링되는 방법에 대해 2개의 상이한 모델이 제안되었다. "항종결자"(antiterminator) 모델은 종결 부위의 전사가 종결을 초래하는 전사 복합체의 배좌 변화를 생성함을 시사한다(Logan et al., 1987). 대조적으로, "토페도"(torpedo) 모델은 절단이 전사 종결의 필수조건임을 시사한다(Connelly and Manley, 1988). 다른 전사 종결 기작도 존재할 수 있다. 최근의 보고는 일부 유전자의 프로세싱 부위의 하류를 발생하는 부가적인 공전사 절단이 종결을 조절하는 데 역할을 할 수 있음을 시사한다(Dye and Proudfoot, 2001; Proudfoot, 2004; Proudfoot et al., 2002). 더욱이, 자체촉매작용 RNA 절단이 전사체 3' 말단 형성에 관여할 수 있음이 입증되었다(Teixeira et al., 2004; Vader et al., 1999). 다른 기작이 배제될 수 없지만, 전사 종결을 조절하기 위한 THIC TPP 리보스위치 조절 스플라이싱 및 프로세싱 부위 접근이 토페도 모델과 일치함이 관찰되었다.

viii . 결론

상기 발견은 TPP-감지 리보스위치가 식물에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 방법 및 피드백 조절이 TPP 수준을 유지하는 방법에 대한 기작을 밝힌다. 또한, 이 연구는 리보스위치가 유전자 발현을 조절하는 데 사용되는 기작의 공지된 다양성을 추가로 확장시킨다. 아도롭시스 탈리아나에서의 TPP 리보스위치는 대사물질 결합을 이용하여 RNA 스플라이싱을 조절하고, 이는 택일적 3' 말단 프로세싱 운명을 결정하고 궁극적으로 mRNA의 안정성을 한정한다. 다양한 식물의 THIC 유전자 내에서 서열, 구조적 요소 및 핵심 3' UTR 특징부들 사이의 이격의 광대한 보존은 이 리보스위치 기작이 다양한 식물 종에서 유지됨을 시사한다. 리보스위치-매개된 조절과 독립적으로, 택일적 3' 말단 프로세싱을 조절함으로써 유전자 조절에 대한 가능성이 큰 것으로 보이고, 따라서 이 일반적인 기작은 진핵류에서 훨씬 더 널리 퍼져 있을 수 있다.

예비적인 발견은 THIC 과발현(overexpression)이 식물에서 불리한 효과를 야기함을 시사한다. 이것은 식물에서 티아민 생산의 조절의 중요성을 두드러지게 하며, 또한 식물 질병 저항의 활성화제로서의 최근에 발견된 역할과 연결될 수도 있다(Ahn et al., 2005; Ahn et al., 2007; Wang et al., 2006). 식물에서 티아민 생합성의 조절의 더 깊은 이해가 대사물질 개조 목적에 유용할 수도 있는 바, 식물 은 비타민 B₁의 1차적인 영양 공급원으로 작용하기 때문이다.

진균류 및 세균류에서의 위치에 비교 시 식물 유전자의 3' 영역에서 TPP 리보스위치의 독특한 위치는 상이한 유기체의 특이적 조절 요구로의 개조를 반영할 수 있다. 거의 모든 공지된 리보스위치는 세균류의 5' UTR(Mandal and Breaker, 2004; Soukup and Soukup, 2004; Winkler and Breaker, 2005) 또는 진균류의 5' UTR 또는 코딩 영역의 인트론(Cheah et al., 2007) 내에 존재하고 종종 유전자 발현을 거의 완전히 억제할 수 있다. 그러나, 리보스위치 조절의 보다 미묘한 수준이 식물에서 관찰된다. 식물은 티아민을 효율적으로 흡수할 수 있지만, 대부분의 요구는 내인성 합성에 의해 공급됨에 틀림없다. 식물의 자가영양 생활양식과 대조적으로, 진균류 및 세균류는 종종 이입에 의해 티아민과 같은 화합물에 대한 전체 요건을 만족시키도록 하는 풍부한 조건 하에 생장되어 상이한 도메인 생명체로부터의 유기체에서 발견되는 상이한 정도의 조절에 일부 원리를 제공한다.

2. 실험 과정

i. 식물 및 식물 조직

아도롭시스 탈리아나 생태형 콜럼비아-0 식물을 달리 지정되지 않는 한 60% 습도를 갖는 16/8시간(명/암) 광주기 하의 생장실에서 23℃에서 토양을 사용하여 생장시켰다. 묘목 실험을 위해, 식물을 달리 지정되지 않는 한 연속적인 광 하에 2% 수크로스 및 다양한 농도의 티아민이 보충된 기본 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962) 상에서 생장시켰다. 잎 침윤 분석을 위해 니코티아나 벤타미아나 식물을 연속적인 광 하에 3 내지 5주동안 토양 상에서 생장시켰다. 다른 종으로부터의 식물 물질은 시판 종자로부터 생장된 묘목으로부터 유래하였다.

ii . RNA 단리 및 RT - PCR 분석

제조사의 지시에 따라 알엔이지 플랜트 미니 키트(RNeasy Plant Mini Kit; 퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 동결된 식물 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 2 내지 5 μg을 DNase로 처리한 후 제조사의 지시에 따라 수퍼스크립트(SuperScript, 상표) II 역전사효소(인비트로겐(Invitrogen))를 사용하여 역전사시켰다. cDNA 생성을 위해, 유전자 특이적 프라이머 또는 (달리 언급되지 않는 경우) 폴리T 프라이머(DNA1)를 사용하였다. cDNA를 THIC 및 EGFP 레포터 전사체의 PCR 증폭용 주형으로서 사용하였다. 수득된 모든 생성물을 TOPO-TA 클로닝 벡터(인비트로겐) 내로 클로닝하고 시퀀싱에 의해 분석하였다(예일 유니버시티 에이치에이치엠아이 켁 파운데이션 바이오테크놀로지 리소스 센터(HHMI Keck Foundation Biotechnology Resource Center at Yale University)).

어플라이드 바이오시스템즈 7500 리얼 타임 피씨알 시스템 및 파워 에스와이비알 그린 마스터 믹스(Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System and Power SYBR Green Master Mix; 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 주형의 연차적 희석을 수행하여 모든 프라이머 조합에 대한 프라이머 효율을 결정하였다. 각 반응을 3중으로 수행하고 증폭 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 용융 곡선 분석으로 검사하였다. 데이터를 상대적인 표준 곡선 방법을 사용하 여 분석하고 표적 전사체의 존재도를 유전자 AT1G13320(PP2A 촉매 소단위), AT5G60390(EF-1α) 및 At1G13440(GAPDH)으로부터의 종래 보고된 기준 전사체(Czechowski et al., 2005)로 표준화하였다.

iii . 식물로부터의 THIC 전사체 및 게놈 서열의 증폭

THIC-II RNA로부터의 3' UTR을 정지 코돈 근처의 코딩 서열의 보존된 부분을 표적으로 하는 퇴화 프라이머 및 폴리T 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 클로닝하였다. THIC-III 전사체의 경우, 특이적 프라이머 조합을 사용하여 폴리T 생성된 cDNA로부터 3' UTR을 2개 단편으로 증폭시켰다. 각각의 3' UTR의 5' 부분을, TPP 앱타머를 표적으로 하는 프라이머 및 코딩 영역을 표적으로 하는 퇴화 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 각각의 3' UTR의 3' 부분을, 앱타머를 표적으로 하는 프라이머 및 폴리T 프라이머를 사용하여 수득하였다. PCR 생성물을 클로닝하고(TOPO-TA) 수개의 독립적인 클론을 시퀀싱하였다. 조합된 서열 정보를 사용하여 상응하는 게놈 서열의 증폭용 프라이머 쌍을 디자인하였다. 게놈 DNA를 제조사의 지시에 따라 플랜트 디엔아졸 시약(Plant DNAzol Reagent; 집코비알엘(GibcoBRL))을 사용하여 단리하고 생성되는 PCR 생성물을 클로닝하고 시퀀싱하였다.

iv . 노던 블롯 분석

아도롭시스 탈리아나 묘목으로부터의 전사체를 종래 기술된 바와 같이 노던 블롯 분석으로 분석하였다(Newman et al., 1993). 프로브는 THIC의 코딩 영역, THIC 유형 I 및 III RNA의 연장된 3' UTR, 또는 대조 전사체 EIF4A1 내의 영역에 대해 특이적이었다.

v. 아그로박테륨 ( Agrobacterium )- 매개된 잎 침윤 분석

일시적 유전자 발현 분석에 있어서, 니코티아나 벤타미아나 잎을 종래 기술된 바와 같이 잎 침윤 분석에 의해 형질전환하였다(Cazzonelli and Velten, 2006). 다양한 레포터 구축물을 함유한 아그로박테륨 주를 LB 배지에서 하룻밤 생장시키고 원심분리하고 펠릿화된 세포를 H₂O에 재현탁하였다. OD₆₀₀을 상이한 구축물을 함유한 세포에 대해 동일한 값(약 0.8)으로 조정하고 아그로박테륨을 구축물의 공형질전환(cotransformation)에 대해 동일한 양으로 혼합하였다. 반딧불이(포티누스 피랄리스) 또는 해양팬지(레닐라 레니포르미스)로부터의 루시퍼라제 또는 형광 단백질 EGFP 및 DsRed2를 레포터 단백질로서 사용하였다.

루시퍼라제 활성을 이중 루시퍼라제 레포터 분석 시스템(프로메가(Promega))을 사용하여 측정하였다. 잎 물질을 전형적으로 침윤 후 60시간에 수확하고 액체 질소(샘플당 약 100 mg)에서 동결시켰다. 분쇄 후, 100 μl의 1 X 수동적 용균 완충액(Passive Lysis Buffer; 프로메가)을 첨가하고 샘플과 격렬하게 혼합하였다. 샘플을 빙상에서 1시간동안 배양한 후 13,000 g에서 20분동안 원심분리하였다. 생성되는 현탁액을 1:40으로 희석하고 루시퍼라제 활성을 플레이트-판독 루미노미터(왈락(Wallac)에서 이중 루시퍼라제 분석 완충액을 후속적으로 첨가하여 측정하였다. 반딧불이 루시퍼라제 활성을 해양팬지로부터의 공발현된 루시퍼라제의 활성으로(또는 그 반대로) 또는 브래드포드 단백질 분석(Bradford Protein Assay)(바이오래드(BioRad))에 의해 결정된 전체 단백질 양에 대해 표준화하였다.

형광 정량화를 위해, 타이푼 트라이오(Typhoon Trio+) 레이저 스캐너(아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))를 사용하여 침윤 후 수개의 시점에서 잎을 스캐닝하였다. EGFP에 대해 488 nm에서 여기 및 520 nm BP 40에서 검출로 세팅하였다. DsRed2를 532 nm에서 여기하고 580 nm BP 30에서 검출하였다. 잎은 스캐닝에 의해 유의적으로 손상되지 않았고 절제 후 H₂O에서 잎자루를 사용하여 배양하였다.

vi . 플로랄 딥( Floral Dip ) 방법에 의한 아도롭시스 탈리아나의 안정한 형질전환

종래 기술된 플로랄 딥 방법을 사용하여 아도롭시스 탈리아나를 형질전환하였다(Clough and Bent, 1998). 형질전환 후, 종자를 멸균 조건 하에 형질전환체용으로 선별하기 위해 50 μg/ml의 카나마이신 및 세균 생장을 방해하기 위해 200 μg/ml의 세포탁심을 함유하는 배지 상에서 생장시켰다. 생존 식물을 토양으로 2 내지 3주 후 옮기고 전이유전자용 발현을 추가의 생장 후 결정하였다.

vii . DNA 구축물의 클로닝

모든 레포터 구축물은 구성적 CaMV 35S 프로모터를 함유하는 플라스미드 pBinAR(Hofgen and Willmitzer, 1992)에 기초한 것이었다. 포티누스 피랄리스(반딧불이)로부터의 루시퍼라제의 코딩 서열을 프라이머 DNA44 및 DNA45를 사용하여 증폭시키고, 제한효소 BamHI 및 SalI로 처리한 후 pBinAR의 적절한 부위 내로 클로닝하여 pBinARFLUC를 수득하였다. pBinARFLUC에서, 루시퍼라제의 C-말단에서 퍼옥시좀 표적화 서열을 아미노산 서열 "IAV"로 대체시켜 퍼옥시좀 국소화를 방해하였 다. pBinARRiLUC를 제조하기 위해, 해양팬지 레닐라 레니포르미스로부터의 루시퍼라제의 인트론 함유 버전(Cazzonelli and Velten, 2003)을 프라이머 DNA46 및 DNA47을 사용하여 증폭시키고 제한효소로 처리한 후 pBinAR의 BamHI/SalI 부위 내로 클로닝하였다. 레포터로서 형광 단백질을 함유하는 플라스미드를 제조하기 위해, EGFP 및 DsRed2의 코딩 서열을 각각 프라이머 DNA48/49 및 DNA50/51을 사용하여 증폭시켰다. 제한효소 BamHI/SalI로 처리한 후, 생성물을 pBinAR의 적절한 부위 내로 클로닝하였다.

아도롭시스 탈리아나 THIC 유형 II 및 III RNA로부터의 3' UTR 서열을 각각 프라이머 DNA2/52 및 DNA2/3을 사용하여 증폭시키고 pBinAR 레포터 플라스미드의 SalI 부위 내로 클로닝하였다. 니코티아나 벤타미아나로부터의 THIC 서열에 기초한 상응하는 구축물의 클로닝을 위해, 유형 II 및 III RNA로부터의 3' UTR을 각각 프라이머 DNA53/54 및 DNA53/55를 사용하여 증폭시켰다. 레포터 융합 구축물에서 THIC 3' UTR의 서열 및 배향을 시퀀싱에 의해 확인하였다.

앱타머 돌연변이체 M1 및 M2의 생성을 위해(유형 III RNA와 관련하여), 아도롭시스 탈리아나로부터의 THIC-III의 야생형 3' UTR 서열을 DNA2 및 DNA3을 사용하여 증폭시키고 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 사용하여 클로닝하였다. PCR 돌연변이유발을 TOPO TA 벡터에서 THIC-III 3' UTR에 대해 수행하였고 뉴클레오티드 변화를 시퀀싱에 의해 확인하였다. 후속적으로, 3' UTR 서열을 제한효소 SalI로 처리하여 벡터로부터 방출시키고 레포터 플라스미드의 적절한 부위 내로 클로닝하였다.

게놈과 관련하여 리보스위치를 함유하는 구축물을 제조하기 위해, THIC의 번역 정지 코돈으로부터 출발하여 2242 bp 단편을 프라이머 DNA60 및 DNA61을 사용하여 아도롭시스 탈리아나 게놈 DNA로부터 증폭시키고 TOPO TA 벡터 내로 클로닝하였다. pBinAR은 리보스위치 기능을 방해할 수도 있는 아그로박테륨 유도된 옥토핀 신타제(OCS) 종결자를 함유하므로 OCS 서열을 제한효소 SalI 및 HindIII으로 처리하여 제거하고 적절한 제한 부위를 갖는 2개의 상보적 올리고뉴클레오티드(DNA62 및 DNA63)로 구성된 연결기를 사용하여 벡터를 재결찰시켜 벡터 pBinAR-term을 생성하였다. 종결자 서열이 없는 이 벡터를 사용하여 후속 클로닝하였다. EGFP의 코딩 서열을 프라이머 DNA48 및 DNA49를 사용하여 증폭시키고 제한효소 BamHI 및 SalI로 처리한 후 pBinAR-term의 적절한 부위 내로 클로닝하였다. 제2 단계에서, 게놈 THIC 단편을 SalI 분해에 의해 TOPO TA 벡터로부터 방출시키고 pBinAREGFP-term의 SalI 부위 내로 클로닝하였다. THIC 단편의 서열 및 배향을 시퀀싱에 의해 확인하였다. 앱타머 돌연변이체 M2, M3 및 M4의 생성을 위해, PCR 돌연변이유발을 THIC 3' 단편을 함유하는 TOPO TA 플라스미드 상에서 수행하였고 서열 확인 후 SalI 단편을 pBinAREGFP-term의 적절한 부위 내로 클로닝하였다. 다시 THIC 단편의 서열 및 배향을 시퀀싱에 의해 확인하였다.

viii . RNA 의 인-라인 프로빙

인-라인 프로빙 분석을 본질적으로 종래 기술된 바와 같이 수행하였다(Sudarsan et al., 2003; Winkler et al., 2002). 시험관내 전사용 DNA 주형을 cDNA로부터의 PCR 증폭에 의해 수득하고 T7 프로모터를 전방 프라이머에서의 포함 에 의해 도입하였다. 시험관내 전사에서, PAGE 변성 및 RNA의 5' ³²P-표지화에 의해 종래 기술된 바와 같이 RNA 정제를 수행하였다(Seetharaman et al., 2001). 인-라인 프로빙 분석에 있어서, 표지된 RNA를 실온에서 40시간동안 50 mM This-HCl(23℃에서 pH 8.3), 20 mM MgCl₂, 및 100 mM KCl 중에서 다양한 농도의 TPP의 부재 또는 존재 하에 배양하였다. 절단 생성물을 10% PAGE 변성에 의해 분석하고 포스포이미저(PhosphorImager)(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에 의해 가시화하고 이미지콴트(ImageQuant) 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. RNA 구조를 최대한의 절반으로 조절하는 데 필요한 TPP 농도를 반영하는 겉보기 K_D 값을 TPP 농도의 로그 대 절단된 RNA의 표준화된 분율을 도시함으로써 결정하였다.

개시된 방법 및 조성물은 변경될 수 있으므로 본 명세서에 기재된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것일 뿐, 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명시하지 않은 한 단수형은 복수형의 언급을 포함함을 인식해야 한다. 따라서, 예를 들어, "리보스위치"라 함은 복수의 리보스위치를 포함하고, "리보스위치"에 대한 언급은 1가지 이상의 리보스위치 및 당업자에게 공지된 리보스위치의 등가물 등에 대한 언급이다.

"임의적" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기재되는 사건, 조건 또는 물질이 일어나거나 존재할 수 있거나 일어나지 않거나 존재하지 않을 수 있음을 의미하고, 이러한 기재는 상기 사건, 조건 또는 물질이 존재하는 경우, 및 상기 사건, 조건 또는 물질이 일어나지 않거나 존재하지 않는 경우를 포함한다.

본 명세서에서 범위는 "약"으로 시작되는 하나의 구체적인 값 내지 "약"으로 시작되는 또 다른 구체적인 값으로서 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시되는 경우, 문맥상 달리 명시하지 않은 한, 상기 하나의 구체적인 값, 나머지 다른 구체적인 값, 및/또는 상기 하나의 구체적인 값 내지 나머지 다른 구체적인 값이 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주된다. 유사하게, 값이 근사치로서 표시된 경우, "약"의 사용은 문맥상 달리 명시하지 않은 한 특정 값이 개시된 것으로 간주되어야 하는 또 다른 구체적으로 고려되는 실시양태를 형성함을 이해할 것이다. 또한, 문맥상 달리 구체적으로 기재하지 않은 한, 각 범위의 한계 값은 다른 한계 값과 관련하여 유의할 뿐만 아니라 다른 한계 값과 무관하게 유의함을 이해할 것이다. 마지막으로, 문맥상 달리 구체적으로 기재하지 않은 한, 개개의 값 및 명시된 범위 내에 포함되는 값들의 하위범위 전부도 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 함을 이해해야 한다. 상술한 것은 일부 경우 실시양태들의 일부 또는 전부가 명시적으로 개시되어 있는지와 관계없이 적용된다.

달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물이 속하는 분야에서 숙련된 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특히 유용한 방법, 장치 및 물질이 기재되어 있다. 본 명세서에서 인용된 공개문헌 및 이 공개문헌에서 인용된 참조문헌은 본원에 참고로 구체적으로 도입되어 있다. 이러한 문헌의 인용은 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 개시내용을 예상할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 임의의 인용문헌이 선행 기술을 구성함을 인정하는 것도 아니다. 인용문헌의 논의는 상기 문헌의 저자가 주장하는 것을 설명하는 것이고, 출원인은 인용된 문헌의 정확성 및 타당성을 조사할 권리를 유보한다. 다수의 공개문헌이 본 명세서에서 언급되어 있지만, 이러한 언급은 상기 문헌들 중 임의의 문헌이 당업계의 통상의 일반적인 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것은 아니다.

본 명세서의 상세한 설명 및 청구의 범위 전체에 걸쳐, "포함한다" 및 이의 어미변화, 예컨대, "포함하는" 및 "포함하고"는 "포함하지만 이로 한정되지 않는"을 의미하고 예를 들어, 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하기 위한 것이 아니다.

당업자라면 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 특정 실시양태들의 많은 등가물을 인식할 것이고 상기 등가물을 과도한 실험 없이 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함된다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Yale Univeristy <120> METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO RIBOSWITCHES THAT CONTROL ALTERNATIVE SPLICING AND RNA PROCESSING <130> 24519.2.9001 <140> PCT/US2008/065112 <141> 2008-05-29 <150> US 60/932,164 <151> 2007-05-29 <160> 132 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(111) <400> 1 gcaccagggg ugcuugaacc aggauagccu gcgaaaaggc gggcuauccg ggaccaggcu 60 gagaaagucc cuuugaaccu gaacagggua augccugcgc agggagugug c 111 <210> 2 <211> 112 <212> RNA <213> Brassica sativa <220> <221> stem_loop <222> (1)..(112) <220> <221> stem_loop <222> (1)..(112) <400> 2 gcaccagggg ugcuugaacc aggcuagccu gcuaaagagc gggcuauccu gggaacaggc 60 ugagaaaguc ccuuugaacc ugaacagggu aaugccugcg cagggagugu gc 112 <210> 3 <211> 112 <212> RNA <213> Brassica oleracea <220> <221> stem_loop <222> (1)..(112) <400> 3 gcaccagggg ugcuugaacc aggcuagccu gcuaaaaagc gggguagccu gggaacaggc 60 ugagaaaguc ccuuugaacc ugaacagggu aaugccugcg cagggagugu gc 112 <210> 4 <211> 111 <212> RNA <213> Boechera stricta <220> <221> stem_loop <222> (1)..(111) <400> 4 gcaccagggg ugcuugaacc aggcuagccc gugaaagagc gggcuaucug ggaccaggcu 60 gagaaagucc cuuugaaccu gaacagggua augccugcgc agggagugug c 111 <210> 5 <211> 121 <212> RNA <213> Carica papaya <220> <221> stem_loop <222> (1)..(121) <400> 5 gcaccagggg ugccuguauc ugccaagcaa uagcuuuuaa uuaauggcua cggugaaagc 60 agaucaggcu gagaaagucc cuuugaaccu gaacaggaua augccugcgu agggagugug 120 c 121 <210> 6 <211> 116 <212> RNA <213> Citrus sinensis <220> <221> stem_loop <222> (1)..(116) <400> 6 gcaccagggg ugccuguauc ugcuuuaaca cuagccaauu ggccaggaua cgggcagagc 60 aggcugagaa agucccuuug aaccugaaca gguuaaugcc ugcguaggga gugugc 116 <210> 7 <211> 123 <212> RNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(123) <400> 7 gcaccagggg ugccuguguc agcuucaaaa accuggccuu auuagccagg uuauacgcug 60 acugaacagg cugagaaagu cccuuugaac cugaacagga uaauuccugc guagggagug 120 ugc 123 <210> 8 <211> 123 <212> RNA <213> Nicotiana benthamiana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(123) <400> 8 gcaccagggg ugccuguguc agcuucaaaa accuggccuu auuagccagg uuauaugcug 60 acugaacagg cugagaaagu cccuuugaac cugaacagga uaauuccugc guagggagug 120 ugc 123 <210> 9 <211> 118 <212> RNA <213> Populus trichocarpa <220> <221> stem_loop <222> (1)..(118) <400> 9 gcaccagggg ugccugcguc cugcuucaaa acuggccauc uggcuagagg aggcagcugg 60 ccaggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggauaaug ccugcguagg gagugugc 118 <210> 10 <211> 116 <212> RNA <213> Lotus japonicus <220> <221> stem_loop <222> (1)..(116) <400> 10 gcaccagggg ugccugaauc ugcuugagcu uuggcuaaua agcuggaaag cuagcagauc 60 aggcugagac agucccuuug aaccugauca gggugaugcc ugcguaggga gagugc 116 <210> 11 <211> 97 <212> RNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(97) <400> 11 gcaccggggg ugucuguguc agcuucaaau gcugacugau caggcugaga aagucccuuu 60 gaaccugaac gggauaauuc cugcguaggg agcgugc 97 <210> 12 <211> 97 <212> RNA <213> Solanum tuberosum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(97) <400> 12 gcaccggggg ugucuguguc agcuucaaau gcugacugau caggcugaga aagucccuuu 60 gaaccugaac gggauaauuc cugcguaggg agugugc 97 <210> 13 <211> 95 <212> RNA <213> Ocimum basilicum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(95) <400> 13 gcaccggggg ugucuguauc cgcuccgucg gggcggugca ggcugagaaa gucccuuuga 60 accugaacag gauaaugccu gcguagggag ugugc 95 <210> 14 <211> 110 <212> RNA <213> Ipomoea nil <220> <221> stem_loop <222> (1)..(110) <400> 14 gggugucugu aucugcucca gcccuggcuc ccucggccag gaugcuggcu gaaacaggcu 60 gagaaagucc cuucgaaccu gaacaggaua augccugcgu aggagcgugc 110 <210> 15 <211> 117 <212> RNA <213> Vitis vinifera <220> <221> stem_loop <222> (1)..(117) <400> 15 gcaccagggg ugucugcauc ugcuuuugca cuggcaauuu ggccaaggau gcaagcagau 60 caggcugaga aagucccuuc gaaccugaac aggauaaugc cugcguaggg agugugc 117 <210> 16 <211> 118 <212> RNA <213> Oryza sativa <220> <221> stem_loop <222> (1)..(118) <400> 16 gcaccagggg ugccuguauu cucaacgauc ugaaggccuc uuggccugga uuguugugaa 60 uugggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggauaaug ccugcgaagg gagugugc 118 <210> 17 <211> 118 <212> RNA <213> Poa secunda <220> <221> stem_loop <222> (1)..(118) <400> 17 gcaccagggg ugccuguauu cucaacaauc ugaagggccc uuggccugga uuguugugau 60 augggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggauaaug ccugcguagg gagugugc 118 <210> 18 <211> 118 <212> RNA <213> Triticum aestivum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(118) <400> 18 gcaccagggg ugcuuguauu cccaacgauc uuaaggcccc uuggccugga uuguugcgau 60 augggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggauaaug ccugcgaagg gagugugc 118 <210> 19 <211> 118 <212> RNA <213> Hordeum vulgare <220> <221> stem_loop <222> (1)..(118) <400> 19 gcaccagggg ugcuuguauu cccaacgauc ugaaggcccc uuagccugga ucguugcgau 60 augggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggauaaug ccugcgaagg gagugugc 118 <210> 20 <211> 118 <212> RNA <213> Sorghum bicolor <220> <221> stem_loop <222> (1)..(118) <400> 20 gcaccagggg ugccuguguu cucaacaguc ugagagccuc uuagccugga cuguugugag 60 augggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggauaaug ccugcgaagg gagugugc 118 <210> 21 <211> 115 <212> RNA <213> Pinus taeda <220> <221> stem_loop <222> (1)..(115) <400> 21 gcaccagggg ugcuugcccu guuuacaccg cuagcgaagc ugggguuguu gacaggagca 60 ggcugagaaa gucccuuuga accugagcag gauaaugccu gcguagggag ugugc 115 <210> 22 <211> 114 <212> RNA <213> Physcomitrella patens <220> <221> stem_loop <222> (1)..(114) <400> 22 gcaccagggg ugcuugcaug augaagcagc gcaaucuauu ugcgucgauu aucaaugcag 60 gcugagagag ucccuucgca ccugaacagg uuaauaccug cguagggagc gugc 114 <210> 23 <211> 80 <212> RNA <213> Physcomitrella patens <220> <221> stem_loop <222> (1)..(80) <400> 23 gcgccggggg ugcuugcauc uagcaggcug agagaguccc uuaaaaccug aucaggguaa 60 uaccugcgaa gggagugugc 80 <210> 24 <211> 80 <212> RNA <213> Physcomitrella patens <220> <221> stem_loop <222> (1)..(80) <400> 24 gcaccggggg ugcuugcuuu gagcaggcug agagaguccc uuaaaaccug aucaggauaa 60 uaccugcgaa gggagugugc 80 <210> 25 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of TPP riboswitch aptamers <220> <221> stem_loop <222> (1)..(17) <400> 25 gcaccrgggg ugyyugy 17 <210> 26 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of TPP riboswitch aptamers <220> <221> stem_loop <222> (1)..(58) <223> n can be any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or u <400> 26 ncaggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggruaaur ccugcgyagg gagugugc 58 <210> 27 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of TPP riboswitch aptamer <220> <221> stem_loop <222> (1)..(17) <223> n can be any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (15)..(17) <223> n is a, c, g, or u <400> 27 nnnnnngggg ngcynnn 17 <210> 28 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of TPP riboswitch aptamers <220> <221> stem_loop <222> (1)..(16) <223> n can be any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (12)..(16) <223> n is a, c, g, or u <400> 28 nnnrgcugag annnnn 16 <210> 29 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of TPP riboswitch aptamers <220> <221> stem_loop <222> (1)..(49) <223> n can be any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (45)..(49) <223> n is a, c, g, or u <400> 29 nnnnnnaccc nynraaccug aucyrgnura urcyrgcgna ggrannnnn 49 <210> 30 <211> 17 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(17) <400> 30 gcaccagggg ugcuuga 17 <210> 31 <211> 58 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(58) <400> 31 ccaggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggguaaug ccugcgcagg gagugugc 58 <210> 32 <211> 17 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(17) <400> 32 gcaccagggg ugcuuga 17 <210> 33 <211> 58 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(58) <400> 33 ccaggcugag aaagucccuu ugaaccugaa caggguaaug ccugcgcagg gagugugc 58 <210> 34 <211> 8 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_signal <222> (1)..(8) <223> splice site <400> 34 cuguuggu 8 <210> 35 <211> 7 <212> RNA <213> Brassica sativa <220> <221> misc_signal <222> (1)..(7) <223> splice site <400> 35 uguuggu 7 <210> 36 <211> 8 <212> RNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> misc_signal <222> (1)..(8) <223> splice site <400> 36 uguuaggu 8 <210> 37 <211> 8 <212> RNA <213> Nicotiana benthamiana <220> <221> misc_signal <222> (1)..(8) <223> splice site <400> 37 uguuaggu 8 <210> 38 <211> 7 <212> RNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> misc_signal <222> (1)..(7) <223> splice site <400> 38 guuaggu 7 <210> 39 <211> 18 <212> RNA <213> Oryza sativa <220> <221> misc_signal <222> (1)..(18) <223> splice site <400> 39 ccuauguuag gagguggu 18 <210> 40 <211> 9 <212> RNA <213> Ocimum basilicum <220> <221> misc_signal <222> (1)..(9) <400> 40 ugcauuggu 9 <210> 41 <211> 10 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(10) <400> 41 gacaagucca 10 <210> 42 <211> 9 <212> RNA <213> Brassica sativa <220> <221> stem_loop <222> (1)..(9) <400> 42 acaagucca 9 <210> 43 <211> 9 <212> RNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(9) <400> 43 acaagucca 9 <210> 44 <211> 9 <212> RNA <213> Nicotiana benthamiana <220> <221> stem_loop <222> (1)..(9) <400> 44 acaagucca 9 <210> 45 <211> 8 <212> RNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(8) <400> 45 caagucca 8 <210> 46 <211> 11 <212> RNA <213> Oryza sativa <220> <221> stem_loop <222> (1)..(11) <400> 46 ggacaagucc a 11 <210> 47 <211> 9 <212> RNA <213> Ocimum basilicum <220> <221> stem_loop <222> (1)..(9) <400> 47 acaagucca 9 <210> 48 <211> 758 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> Unsure <222> (1)..(758) <223> genomic DNA <400> 48 agctgctcag aaataaaagg tcagtatgtt tagactgtta gtcgttgctt tctcaacaaa 60 catgttagtt actgcatgct agtataaaat cattcaggtt tataatcttt tcttaaatct 120 gcaacatatg gtcaactctt aaatgagtcc ttactgtgat ctttgttttt tatcgtgttt 180 ctttttcttc tgctgcatca ggcaaatgtt ttaaacaaga ccttgcttac ccaagtcttg 240 gtgcctgttg gactatacct ggataaaggc acaaactgtt ggtaagctta gtagtctcta 300 tgtcatgtta cttttagaac tatctatgtt gtctgttcat ttgagtcaga gtcagcaata 360 aagacaatct aagttgatgt ttcaatactt ttttgtgtga tttggttggt gaattgacat 420 gcaaaagcac caggggtgct tgaaccagga tagcctgcga aaaggcgggc tatccgggac 480 caggctgaga aagtcccttt gaacctgaac agggtaatgc ctgcgcaggg agtgtgcagt 540 tttttttttt tcctgtagct ttctaaagga gaagaagcta ctgttgccgc tcgagtctcg 600 ttccacggtt ttcaacagtt agtttcttat gagctaagag attcagctta attggcttac 660 agccataaaa gaagtcttta actgatgcac taagtcacta acagtaggga ataattcaat 720 caaaaaatca tccagattga taaaaatgca tttgcacc 758 <210> 49 <211> 555 <212> DNA <213> Brassica sativa <220> <221> Unsure <222> (1)..(555) <223> genomic DNA from Brassica sativa <400> 49 gccagagagc tatgtcaagg ctgctaagaa gtaaaaaggt cagtatcctt agtggttatt 60 acttatacaa acatgttagt tactcacata tggtcaaaat gtgtcttttt ctgtgagctc 120 tgcctgttgt catctttctt ttgcttatgc ttccttaggg aaagggtggg aacaagacct 180 cgcttacaca agtcttggtg cctgttggac tatacctgaa taaggcacaa aatgttggta 240 agctttagta gtctctctgt ctgttaaact ttagaactat ctatggttta tgtttcttct 300 gtttgttcct ttgagtctga gtcagtaata aaaaagacaa actgagttga tgttttaaat 360 actttacatg tgatttggat tgtgaattga catagaaagc accaggggtg cttgaaccag 420 gctagcctgc taaagagcgg gctatcctgg gaacaggctg agaaagtccc tttgaacctg 480 aacagggtaa tgcctgcgca gggagtgtgc agttttcttt tttttctttt ctataggaga 540 tgaagctttt ctgct 555 <210> 50 <211> 1197 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> Unsure <222> (1)..(1197) <223> genomic DNA <400> 50 accggaaaat tacatcaact ctatgaaaag ctaaaggtga gtgttacatt ggattttctc 60 ttgacattgt tgtttttgca agaaggggag ccttggcgta actggtaaag ttgttgtcat 120 gtgaccagga ggtcacgggt tcgagccgcg caaacaacct cttgtagaaa tgcagggtaa 180 ggctgcgtac agtagaccct tgtggtccgg cccttcccta gacaccgcac atagcgggaa 240 cttagtgcat cgggctgccc tttattattg tttctgcaag ttctttaaag gtagagatat 300 gttatatcca aaaaatgatt acctctgtta acctgcaact taactcaaca aacactctat 360 tttcgactaa ctctatttaa atctaaaata agaaaatttc tcatcactta gattatacaa 420 ataagtggta ggagatgaaa gcatggttat ctaatagagg gcttcttttt tgcaaacatg 480 ttcttttctc gacgtcgggt tatccaatag gagttgttgt agttttcgta gttgcaggaa 540 cctttttttt ccctccgcaa cgtgttacct tactgaatgc aattgcagga cttcatagat 600 tgaaaactgg atcaagagct gtctgaagtg atcacgctcc atcggccagt caagaaagga 660 gggtgtagga gcttcattat caagtgttag gtaagtatct aggtttggta tgtttaataa 720 cttgaaaaca acagccttgt tcagaaaagt actccttatc agtaataaga aatcacgtat 780 tttattgtat tctgtctctt atatctttga caatttattg acacgagaaa gcaccagggg 840 tgcctgtgtc agcttcaaaa acctggcctt attagccagg ttatacgctg actgaacagg 900 ctgagaaagt ccctttgaac ctgaacagga taattcctgc gtagggagtg tgcatttttt 960 tgttgcttgc acagggatgg agattcttcc atggttcaaa ttaagctgat cctgcccttt 1020 gctaggacca gttatacatt atattcaaga tcaggggtgt attcagtagt agagttatgg 1080 gttcatttga agttttgaac ttaactttta gcctgaattt atctgtgtta ggcgcatggc 1140 ctttcttcgg attaggtccg gggcacattt cgggcgtgta caatttttga ccactgc 1197 <210> 51 <211> 1175 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <220> <221> unsure <222> (1)..(1175) <223> genomic DNA <400> 51 gccaaagttt tgttctatga agataactga agatataagg aagtatgctg aaactcacgg 60 ttatggaagt gcagaggaag caatcctccg cggcatggat gctatgagtg cagaatttca 120 agctgcaaag aaaaccatta gcggggaaca acatggtgag gttggtggtg aaatctactt 180 gccggaaaat tacatcaact ctttgaagag ctaaaggtga gcgttcaatc ggattttctc 240 ttgacattgt tgtttctgca agttctttaa aggtagagat atatccaaga aattattacc 300 tttgtgaacc tgcaacttaa ctcaacaaac tctctatttc cgactaccta tatttaaatc 360 taaataagaa aatttcccat catttagata gagtatacaa taaagtggtc ggagatgaaa 420 gcatgggtta ttcaatagag ggcttctttt ttgcaaacat gttcttttct cgacgtcagg 480 ttatccaata ggagttgttg tacttttcat agttgcaaga tttttccccc ctccacaacg 540 tcttacctta ctgaatgcaa ttgcaggact tcatagatgg aaaactggat caagagctgt 600 ctgaagtgat cacgctccat cggccagtca agaaaggagg gtgtaggagc ttcattatca 660 agtgttaggt aagtatctag gtttggtatg ttaaataact tgaaaacaac agccttgttc 720 aaagaaatta ctcttcttat cagtaataag aaatcgcgtt ttttattgta ttctgtcttt 780 tatatcttca acaatttgtt gacacgagaa agcaccaggg gtgcctgtgt cagcttcaaa 840 aacctggcct tattagccag gttatatgct gactgaacag gctgagaaag tccctttgaa 900 cctgaacagg ataattcctg cgtagggagt gtgcattttt ttttttgttg cttgcacagg 960 gatggagatt cttccatgct tcaaattaag ctgatcctgc cctttgccag gaccagtaat 1020 acattatatt caagatcagg ggtgtattca gtagtagagt tatgggttca tttgaagttt 1080 tgaactcata acttttagcc tgaatttatt tgttaggcgc atggcctttc ttcggattag 1140 gtccggggac tgtgtgtccg gggcacattt cgggc 1175 <210> 52 <211> 922 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> Unsure <222> (1)..(922) <223> genomic DNA <400> 52 gccagagaat tacatcaact ctttgaagag ccaaaggtga gtattacatt ctgcaagtcc 60 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(28) <400> 105 agctgtcgac ctacaggaac aggtggtg 28 <210> 106 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(34) <400> 106 agctgtcgac attgaaacat caacttagat tgtc 34 <210> 107 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(30) <400> 107 agctgtcgac aggacttcat agatggaaaa 30 <210> 108 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(32) <400> 108 agctgtcgac taaaaaacgc gatttcttat ta 32 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(27) <400> 109 agctgtcgac gcccgaaatg tgccccg 27 <210> 110 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(32) <400> 110 tccgggacca ggctgtcaaa gtccctttga ac 32 <210> 111 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(32) <400> 111 gttcaaaggg actttgacag cctggtcccg ga 32 <210> 112 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(31) <400> 112 cctttgaacc tgaactcggt aatgcctgcg c 31 <210> 113 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(31) <400> 113 gcgcaggcat taccgagttc aggttcaaag g 31 <210> 114 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(35) <400> 114 agctgtcgac aaggtcagta tgtttagact gttag 35 <210> 115 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(34) <400> 115 agctgtcgac ctctccacct aaactcagat tttg 34 <210> 116 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(38) <400> 116 agctgtcgac accggtgagc tcactagtaa gcttagct 38 <210> 117 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(38) <400> 117 agctaagctt actagtgagc tcaccggtgt cgacagct 38 <210> 118 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(32) <400> 118 tccgggacca ggctctctaa gtccctttga ac 32 <210> 119 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(32) <400> 119 gttcaaaggg acttagagag cctggtcccg ga 32 <210> 120 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(19) <400> 120 gcaccagccg tgcttgaac 19 <210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(19) <400> 121 gttcaagcac ggctggtgc 19 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(22) <400> 122 cacccttctc cttctagtga at 22 <210> 123 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(18) <400> 123 agctggagac aaacgaaa 18 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(21) <400> 124 atgtgcaggt gatgaatgaa g 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(21) <400> 125 caaaggacca agggtgtaga a 21 <210> 126 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(17) <400> 126 tggagtggtg taacgag 17 <210> 127 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(18) <400> 127 gcgtcaatgt aatgttct 18 <210> 128 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(19) <400> 128 tctctgccgt ttccaaatc 19 <210> 129 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(17) <400> 129 gatgtgctgt gcctgaa 17 <210> 130 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(19) <400> 130 gagcccaagt ttttgaaga 19 <210> 131 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(19) <400> 131 ctaacagcga aacgtccca 19 <210> 132 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> unsure <222> (1)..(16) <400> 132 ccccaaccaa gcccat 16

Claims (67)

1. 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 리보스위치(riboswitch)를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조절가능한 유전자 발현 구축물(construct)로서,

   상기 리보스위치가 RNA의 스플라이싱(splicing)을 조절하고, 상기 리보스위치 및 상기 코딩 영역이 이종 영역이고, 상기 스플라이싱의 조절이 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
2. 제1항에 있어서,

   리보스위치가 택일적 스플라이싱(alternative splicing)을 조절하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   리보스위치가 앱타머(aptamer) 도메인 및 발현 플랫폼(platform) 도메인을 포함하고, 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인이 이종 도메인인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   RNA가 추가로 인트론을 포함하고, 발현 플랫폼 도메인이 스플라이스 접합부(splice junction)를 포함하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
5. 제4항에 있어서,

   스플라이스 접합부가 인트론 내에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서,

   스플라이스 접합부가 택일적 스플라이스 접합부인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
7. 제4항에 있어서,

   스플라이스 접합부가 인트론의 말단에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   스플라이스 접합부가, 리보스위치가 활성화되었을 때 활성을 나타내는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
9. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   스플라이스 접합부가, 리보스위치가 활성화되지 않았을 때 활성을 나타내는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 유발(trigger) 분자에 의해 활성화되는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
11. 제10항에 있어서,

    유발 분자가 티아민 피로포스페이트(TPP)인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 TPP-반응성 리보스위치인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 인트론의 스플라이싱을 활성화시키는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 활성화시키는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 인트론의 스플라이싱을 억제하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 억제하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA가 분지된 구조를 갖는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA가 전구-mRNA인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 RNA의 3' 비번역된 영역(UTR) 내에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
20. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,

    인트론이 RNA의 3' UTR 내에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
21. 제4항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA 프로세싱 부위가 인트론 내에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
22. 제21항에 있어서,

    인트론의 스플라이싱이 RNA로부터 RNA 프로세싱 부위를 제거하여 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
23. 제22항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 RNA 프로세싱 부위에 의해 매개된 RNA의 프로세싱의 배제를 포함하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 전사 종결의 변경을 포함하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 RNA의 퇴화의 증가를 포함하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
26. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 RNA의 턴오버의 증가를 포함하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
27. 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 인트론의 3' 스플라이스 접합부를 중첩시키는, 조절가능한 유전자 발 현 구축물.
28. 제27항에 있어서,

    인트론의 스플라이싱이 활성화될 리보스위치의 능력을 감소시키거나 배제하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
29. 제3항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 P4 및 P5 줄기(stem) 내에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
30. 제29항에 있어서,

    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 루프(loop) 5 내에도 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
31. 제29항 또는 제30항에 있어서,

    스플라이싱을 조절하는 앱터머 도메인의 영역이 P2 줄기 내에도 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
32. 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이스 부위가 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -130 내지 -160 위치에 위 치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
33. 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA가 추가로 제2 인트론을 포함하고, 제2 인트론의 3' 스플라이스 부위가 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -220 내지 -270 위치에 위치하는, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
34. 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이스 접합부가 5' 스플라이스 접합부인, 조절가능한 유전자 발현 구축물.
35. 리보스위치를 포함하는 구축물을 RNA 내로 도입함을 포함하는 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는 방법으로서,

    상기 리보스위치가 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있고, 상기 RNA가 인트론을 포함하며, 상기 스플라이싱의 조절이 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는, 방법.
36. 제35항에 있어서,

    리보스위치가 앱타머 도메인 및 발현 플랫폼 도메인을 포함하고, 상기 앱타머 도메인 및 상기 발현 플랫폼 도메인이 이종 도메인인, 방법.
37. 제36항에 있어서,

    발현 플랫폼 도메인이 스플라이스 접합부를 포함하는, 방법.
38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이스 접합부가 인트론 내에 위치하는, 방법.
39. 제37항 또는 제38항에 있어서,

    스플라이스 접합부가 택일적 스플라이스 접합부인, 방법.
40. 제37항에 있어서,

    스플라이스 접합부가 인트론의 말단에 위치하는, 방법.
41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이스 접합부가, 리보스위치가 활성화되었을 때 활성을 나타내는, 방법.
42. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이스 접합부가, 리보스위치가 활성화되지 않았을 때 활성을 나타내는, 방법.
43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 유발 분자에 의해 활성화되는, 방법.
44. 제43항에 있어서,

    유발 분자가 TPP인, 방법.
45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 TPP-반응성 리보스위치인, 방법.
46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 스플라이싱을 활성화시키는, 방법.
47. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 활성화시키는, 방법.
48. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 스플라이싱을 억제하는, 방법.
49. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 택일적 스플라이싱을 억제하는, 방법.
50. 제35항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이싱이 천연적으로 발생하지 않는, 방법.
51. 제36항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 루프 5 내에 위치하는, 방법.
52. 제35항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,

    구축물이 추가로 인트론을 포함하는, 방법.
53. 제35항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 RNA의 3' UTR 내에 위치하는, 방법.
54. 제35항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,

    인트론이 RNA의 3' UTR 내에 위치하는, 방법.
55. 제35항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA 프로세싱 부위가 인트론 내에 위치하는, 방법.
56. 제55항에 있어서,

    인트론의 스플라이싱이 RNA로부터 RNA 프로세싱 부위를 제거하여 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는, 방법.
57. 제56항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 RNA 프로세싱 부위에 의해 매개된 RNA의 프로세싱의 배제를 포함하는, 방법.
58. 제56항 또는 제57항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 전사 종결의 변경을 포함하는, 방법.
59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 RNA의 퇴화의 증가를 포함하는, 방법.
60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA의 프로세싱에 대한 영향이 RNA의 턴오버의 증가를 포함하는, 방법.
61. 제37항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,

    리보스위치가 인트론의 3' 스플라이스 접합부를 중첩시키는, 방법.
62. 제61항에 있어서,

    인트론의 스플라이싱이 활성화될 리보스위치의 능력을 감소시키거나 배제하는, 방법.
63. 제36항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이싱을 조절하는 앱타머 도메인의 영역이 P2 줄기 내에 위치하는, 방법.
64. 제36항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이스 부위가 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -130 내지 -160 위치에 위치하는, 방법.
65. 제36항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,

    RNA가 추가로 제2 인트론을 포함하고, 제2 인트론의 3' 스플라이스 부위가 앱타머 도메인의 5' 말단을 기준으로 -220 내지 -270 위치에 위치하는, 방법.
66. 제36항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,

    스플라이스 접합부가 5' 스플라이스 접합부인, 방법.
67. 제35항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,

    추가로 리보스위치용 유발 분자와 접촉시키는 단계를 포함하여 RNA의 프로세싱에 영향을 미치는, 방법.

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