JP6871174B2 - 選択的スプライシングのアプタマー媒介性調節による遺伝子発現の調節 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年２月２日に出願された米国特許出願第６２／１１０，９１９号に対する優先権を主張するものであり、それを全体が参照により本明細書中に援用される。
本発明の分野

本発明は、プラットフォーム、そして、小分子への曝露を使用して標的遺伝子の発現を調節するために該プラットフォームを使用する方法を提供する。該プラットフォームは、標的遺伝子内に配置され、且つ、５’イントロン−選択的エクソン−３’イントロンに関連して配置された合成リボスイッチを含む、ポリヌクレオチドカセットを特徴とする。該リボスイッチは、エフェクター領域と、リガンド（例えば、小分子）を結合し、そして、リガンドへの曝露によって標的遺伝子発現の制御を提供するアプタマーとを含む。

スプライシングとは、それによって新生プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）からイントロン配列が取り除かれ、エクソン同士が一つに結合されて、ｍＲＮＡを形成するプロセスを指す。スプライス部位は、エクソンとイントロンの間の連結点にあり、イントロンの５’末端と３’末端の異なったコンセンサス配列によって規定される（すなわち、それぞれスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位）。選択的プレｍＲＮＡスプライシング、又は選択的スプライシングは、複数のエクソンを含むヒト遺伝子の大部分で起こる広範囲のプロセスである。それは、スプライソソームと呼ばれる多くの多成分系の構造物によって実施され、そしてそれは、小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）及び多種多様な補助タンパク質の集合体である。様々なｃｉｓ調節配列を認識することによって、スプライソソームは、エクソン／イントロン境界を規定し、イントロン配列を取り除いて、そして、エクソンを最終的な翻訳可能メッセージ（すなわち、ｍＲＮＡ）にスプライスする。選択的スプライシングの場合では、最終的にコードするメッセージを変えるために、特定のエクソンが含まれ得るか又は除かれ得ることがあり、それによって、得られる発現タンパク質を変化させる。

標的遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ））の発現の調節がさまざまな状況で必要である。遺伝子の治療的発現の文脈において、導入遺伝子の調節発現を可能にする技術は、発現レベルとそのタイミングを調節することによって安全性を高める可能性を有する。タンパク質発現を制御するための調節されたシステムは実用的であり、場合によっては、安全、且つ、有効な治療への適用のために極めて重要な役割を担っている。

一態様において、本発明は、（ａ）リボスイッチと（ｂ）５’イントロンと３’イントロンに隣接する、選択的にスプライスされるエクソンとを含む、標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットであって、ここで、該リボスイッチが（ｉ）３’イントロンの５’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域及び（ｉｉ）アプタマーを含み、ここで、該選択的にスプライスされるエクソンが標的遺伝子ｍＲＮＡへスプライスされたとき、該選択的にスプライスされるエクソンが標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含むものを提供する。一実施形態において、アプタマーは、小分子リガンドに特異的に結合する。

一実施形態において、標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチド（「遺伝子調節カセット」「調節カセット」又は「ポリヌクレオチドカセット」）は、標的遺伝子からの内在性イントロンに由来する５’及び３’イントロンを含む。一実施形態において、５’及び３’イントロンは、標的遺伝子にとって外来性である。一実施形態において、５’及び３’イントロンは、ヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する。一実施形態において、５’イントロンは、標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含む。一実施形態において、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立に、長さが約５０〜約３００ヌクレオチドである。一実施形態において、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立に、長さが約１２５〜約２４０ヌクレオチドである。一実施形態において、５’及び／又は３’イントロンは、イントロンスプライスエンハンサー、イントロンスプライスエンハンサー、５’スプライス部位、３’スプライス部位、若しくは分岐点配列を含むか、又はその配列を変更するように改変された。

一実施形態において、リボスイッチのエフェクター領域ステムは、長さが約７〜約２０塩基対である。一実施形態において、エフェクター領域ステムは、長さが８〜１１塩基対である。

一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）のエクソン２、変異ヒトＷｉｌｍｓ腫瘍１エクソン５、マウスカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタエクソン１６、又はＳＩＲＴ１エクソン６に由来する。一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、配列番号１５からの改変ＤＨＦＲエクソン２である。一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、エクソンスプライスサイレンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスエンハンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスエンハンサーを加えること、及びエクソンスプライスドナーを加えることから成る群のうちの１若しくは複数で改変された。一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、合成されたものである（すなわち、天然に存在するエクソンに由来しない）。

別の態様において、本発明は、（ａ）標的遺伝子内に（例えば、上記及び本明細書中に記載の）本発明のポリヌクレオチドカセットを挿入し、（ｂ）細胞内にポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子を導入し、そして（ｃ）標的遺伝子の発現の誘導に有効な量でアプタマーに特異的に結合する小分子リガンドに該細胞を晒すこと、を含む標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。

一実施形態において、標的遺伝子の発現は、小分子リガンドが不存在であるときの発現レベルに比べて、小分子リガンドが存在しているときに、約５倍より高い。一実施形態において、標的遺伝子の発現は、小分子リガンドが不存在であるときの発現レベルに比べて、小分子リガンドが存在しているときに、約１０倍より高い。

一実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子のタンパク質コード領域内に挿入される。一実施形態において、２以上のポリヌクレオチドカセットが、標的遺伝子内に挿入される。一実施形態において、２以上のポリヌクレオチドカセットが、異なった小分子リガンドに特異的に結合する異なったアプタマーを含む。別の実施形態において、２以上のポリヌクレオチドカセットが、同じリガンドに特異的に結合する同じアプタマー又は異なったアプタマーを含む。

一実施形態において、ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子は、標的遺伝子の発現のためにベクターに組み込まれる。一実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。更なる実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターから成る群から選択される。

別の態様において、本発明は、哺乳動物の眼内の標的遺伝子の発現を調節する方法であって、（ａ）（ｉ）リボスイッチ及び（ｉｉ）５’イントロン及び３’イントロンに隣接する選択的にスプライスされるエクソンを含むポリヌクレオチドカセットを包含する標的遺伝子を含むベクターを眼内に導入し、ここで、該合成リボスイッチは、３’イントロンの５’スプライス部位を含むステムを含むエフェクター領域、及びリガンドに特異的に結合するアプタマーを含み、ここで、該選択的にスプライスされるエクソンは、その選択的にスプライスされるエクソンが標的遺伝子ｍＲＮＡへスプライスされるとき、標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含み；そして、（ｂ）標的遺伝子の発現の誘導に有効な量でリガンドを該哺乳動物に提供すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、リガンドは小分子である。

一実施形態において、ベクターは、眼内注射によって眼内に導入される。一実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターから成る群から選択される。

一実施形態において、眼内の標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドは、標的遺伝子からの内在性イントロンに由来する５’及び３’イントロンを含む。一実施形態において、５’及び３’イントロンは、標的遺伝子にとって外来性である。一実施形態において、５’及び３’イントロンは、ヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する。一実施形態において、５’イントロンは、標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含む。一実施形態において、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立に、長さが約５０〜約３００ヌクレオチドである。一実施形態において、５’及び３’イントロンはそれぞれ独立に、長さが約１２５〜約２４０ヌクレオチドである。一実施形態において、５’及び／又は３’イントロンは、イントロンスプライスエンハンサー、イントロンスプライスエンハンサー、５’スプライス部位、３’スプライス部位、又は分岐点配列を含むか、又はその配列を変更するように改変された。一実施形態において、リボスイッチのエフェクター領域ステムは、長さが約７〜約２０塩基対である。一実施形態において、エフェクター領域ステムは、長さが８〜１１塩基対である。一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）のエクソン２、変異ヒトＷｉｌｍｓ腫瘍１エクソン５、マウスカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタエクソン１６、又はＳＩＲＴ１エクソン６に由来する。一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、配列番号１５からの改変されたＤＨＦＲエクソン２、ヒトＤＨＦＲからの改変されたエクソン２である。一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、エクソンスプライスサイレンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスエンハンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスエンハンサーを加えること、エクソンスプライスドナーを加えることから成る群の１若しくは複数によって改変された。一実施形態において、選択的にスプライスされるエクソンは、合成されたものである（すなわち、天然に存在するエクソンに由来しない）。

一態様において、本発明は、（例えば、先に記載した）標的遺伝子の調節発現のためのポリヌクレオチドカセットを包含する標的遺伝子を含む組み換えポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子のタンパク質コード配列内に配置される。

一態様において、本発明は、（例えば、先に記載した）標的遺伝子の調節発現のためのポリヌクレオチドカセットを包含する標的遺伝子を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターから成る群から選択される。

ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列内に挿入された切断ヒトβ−グロビンイントロン２（ＩＶＳ２Δ）を有するスプライシング構築物「Ｃｏｎ１」の概略図。名称「Ｌｕｃｉ Ｅｘｏｎ １」及び「Ｌｕｃｉ Ｅｘｏｎ ２」は、５’及び３’コード配列へのルシフェラーゼ遺伝子の分割を指す。挿入イントロン配列ＩＶＳ２Δのスプライシングが、完全長のタンパク質に翻訳される完全長のｍＲＮＡをもたらす。 ルシフェラーゼ発現に対するイントロン挿入とスプライス部位配列の効果。Ｃｏｎ１からＣｏｎ７は、異なったイントロンスプライス部位を有する（表１を参照のこと）。Ｃｏｎ１は、その本来のＩＶＳ２ ５’スプライス部位及び３’スプライス部位（それぞれ「５’ｓｓ」及び「３’ｓｓ」）を有するＩＶＳ２Δを有する。Ｃｏｎ２からＣｏｎ７は、ＩＶＳ２Δが挿入されているが、表１で列挙したように異なる５’ｓｓ及び３’ｓｓ配列を有する。Ｃｏｎ８には、ＩＶＳ２Δイントロンを有さない。Ｃｏｎ１からＣｏｎ３は、イントロン挿入のないルシフェラーゼ対照（Ｃｏｎ８）と比較して、ルシフェラーゼ発現に対してイントロン挿入による効果がないことが実証された。より弱いスプライス部位を有する、Ｃｏｎ４からＣｏｎ７は、低減されたルシフェラーゼ発現を示した。 示されるエクソン包含（Ｉ）及び排除（ＩＩ）スプライシングパターンを有するイントロン−エクソン−イントロンカセットの概略図。星印（◆）はＤＨＦＲエクソン２内の終止コドンを意味する。選択的ＤＨＦＲエクソンがスプライシングによって標的遺伝子（ルシフェラーゼ）ｍＲＮＡ内に含まれるとき（Ｉ）、得られた転写産物は、インフレーム終止コドンを包含し、そしてその終止コドンは、ルシフェラーゼ遺伝子発現を妨げる。終止コドン包含選択的ＤＨＦＲエクソンが、最終的なｍＲＮＡから排除されたときだけ、標的遺伝子が発現される（ＩＩ）。 ルシフェラーゼ遺伝子の発現に対するＤＨＦＲ選択的エクソンの包含又は排除の効果。図２ａに示したイントロン−エクソン−イントロンカセットを包含する様々なルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に対して、ルシフェラーゼアッセイが実施された。野生型スプライス部位配列を有するＤＨＦＲエクソン２（ＤＨＦＲ＿ｗｔ）を、５’ｓｓに変異を包含するか（ＤＨＦＲ＿ｗｔ５ｓｓＣ）若しくはより強力なＣｏｎ１ ５’ｓｓで置換した天然５’ｓｓを有するか（ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓ）、又はＣｏｎ４由来の弱い５’ｓｓを有する（ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ４５ｓｓ）ＤＨＦＲエクソンと比較した。２ｂ及び２ｃのレーン１で使用される構築物は、Ｃｏｎ１であり、そしてそれは、図１及び実施例１に示されている。ルシフェラーゼｍＲＮＡ内へのＤＨＦＲエクソン２の挿入は、ルシフェラーゼ発現の減少を引き起こしたが、それは、ＤＨＦＲエクソン２の５’ｓｓ（すなわち、スプライスドナー）が（ＤＨＦＲ＿ｗｔをＤＨＦＲ＿ｗｔ５ｓｓＣと比較して）変異したときには、起こらなかった。ＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓがＣｏｎ１からより強力な５’ｓｓに置換されたとき（構築物ＤＨＦＲ−Ｃｏｎ１ ５’ｓｓ）、ＤＨＦＲエクソンの包含が促進され、そして、Ｃｏｎ１と比べて５４５分の一の低いルシフェラーゼ発現につながった。野生型５’ｓｓを置換するのに（実施例１のＣｏｎ４からの）弱い５’ｓｓを使用したとき、この部位の低減されたスプライシングが、ＤＨＦＲエクソン包含を妨げ、それによって、増強されたルシフェラーゼ発現を可能にした。 ＤＨＦＲエクソン配列内のエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）又はサプレッサー（ＥＳＳ）エレメントは、選択的ＤＨＲＦエクソンのスプライシングに影響を及ぼし、そして、標的遺伝子の発現を調節する。ＤＨＦＲエクソン２内のＳＲｐ４０結合部位の変異は、ルシフェラーゼ発現の激減をもたらした：ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０発現とＣｏｎ１の発現とで２，９８２倍の違いがあった（図２ｃ ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０；表２）。より強力なＳＣ３５結合部位（表２、ＳｔｒＳＣ３５）を作り出すための、スプライシングエンハンサーＳＣ３５の推定結合部位の変異は、Ｃｏｎ１（図２ｃ、ＤＨＦＲ＿ｗｔＳｔｒＳＣ３５）と比較して、ルシフェラーゼ発現を更に減少させた（１３９分の一）、それはおそらく、ＤＨＦＲエクソンの包含の増強された効率のためである。スプライシングエンハンサーＳＣ３５の結合部位をスプライシングインヒビターｈｎＲＮＰ Ａ１（表２、ＳＣ３５ｈｎＲＮＰ Ａ１）の結合部位で置換することは、野性型ＤＨＦＲエクソン２と比較して、ルシフェラーゼ発現の４．３倍の増大につながった（図２ｃ、ＤＨＦＲ＿ｗｔ ＳＣ３５ｈｎＲＮＰ Ａ１）。 選択的ＤＨＦＲエクソン２の５’ｓｓにヘアピン構造を含むイントロン−エクソン−イントロンカセットの概略図。ＤＨＦＲ ５’ｓｓがヘアピン構造内に埋め込まれているとき、ＤＨＦＲエクソンは転写産物には含まれず、よって、ルシフェラーゼが発現されることができる（×は、ヘアピン内に埋められたＤＨＦＲエクソン５’ｓｓを表す）。 図３ａで例示されたイントロン−エクソン−イントロンカセットで試験された４種類の異なったヘアピンの配列と構造。 標的遺伝子発現に対するＤＨＦＲエクソン２の５’ｓｓにおけるヘアピン構造の効果。Ｃｏｎ１ ５’ｓｓ配列を有するＤＨＦＲエクソンを包含する構築物は、スプライスされたｍＲＮＡ内へのＤＨＦＲエクソンの包含により、ルシフェラーゼ発現を効率的に抑制する（ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓ、図３ｃ）。しかしながら、ヘアピン構造内へのＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓの埋め込みは、ＤＨＦＲエクソンの包含を効率的に妨げ、そして、ルシフェラーゼ発現を可能にする（ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１ ５ｓｓ＿ＨＰ１５ 図３ｃ）。破壊されたステムを有するヘアピン配列は、ルシフェラーゼ発現を回復しない（図３ｃ．ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓ＿ＨＰ１５ｘ）。ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０構築物（実施例２）は、ＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓがヘアピン構造で安定して隔離されない限り、ルシフェラーゼを発現しない（ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０＿ＨＰ１５）。ヘアピンの不安定化は、強いスプライシング活性を有する変異体ＳＲｐ４０結合部位に関連して一層ルシフェラーゼの発現を妨げる（ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０＿ＨＰ１５ｘ）。 合成リボスイッチを包含するイントロン−エクソン−イントロン調節カセットによる遺伝子調節の概略図。アプタマー／リガンド結合の不存在下、アプタマー配列がヘアピンステム形成を妨害し、ＤＨＦＲエクソン５’ｓｓを利用可能なままにし、ＤＨＦＲエクソンの包含につながり、これにより、翻訳を妨げ、タンパク質の発現を妨害する（図４ａ）。アプタマー／リガンド結合が起こるとき、アプタマーにおけるリガンド依存性構造変化がステム形成を安定させ、ＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓを隔離して、ＤＨＦＲエクソン排除及びルシフェラーゼ遺伝子発現をもたらす（図４ｂ）。 異なる接続ステム長を有するヘアピンステム及びテオフィリンアプタマーの形状。テオフィリンアプタマーのステムは、ＤＨＦＲエクソン５’ｓｓを隔離するヘアピンのステムに直接連結され、２０ｂｐの合成ステムを作り出す。ステム配列は切断され、異なったステム長を有する一連のヘアピンを作り出す。それぞれ２０ｂｐ、９ｂｐ、８ｂｐ、及び７ｂｐのステム長を有するＤＨＦＲ＿Ｔｈｅｏ１、１２、１３及び１４のステム構造を示す。テオフィリンは（▲）として記号化される。 テオフィリンの存在及び不存在下での標的遺伝子発現に対する、テオフィリンアプタマーを使用した様々なステム長の効果。実施例４に記載のとおり製造された調節カセットを含むテオフィリンアプタマーによって調節したルシフェラーゼ発現を示すグラフ（図４ｃ）。２０ｂｐから下は９ｂｐまでのステム長を有する構築物Ｔｈｅｏ１から１２では、ヘアピンステムは、アプタマー／リガンド結合の不存在下では、安定構造を形成するのに十分な長さのものであった。ＤＨＦＲ＿Ｔｈｅｏ１３は、リガンドの不存在下でも安定したヘアピンステムを形成せず、これにより、ＤＨＦＲエクソン５’ｓｓが隠されずに、ＤＨＦＲエクソンの包含をもたらし、ルシフェラーゼ発現を妨げた。テオフィリンの存在下、ヘアピンは安定しているため、ＤＨＦＲエクソン５’ｓｓはスプライシング機構にとって利用不可能である。このことは、ＤＨＦＲエクソンの排除をもたらし、そして、ルシフェラーゼ発現を可能にする。３ｍＭのテオフィリンの存在下、ＤＨＦＲ＿Ｔｈｅｏ＿１３は、発現の非誘導ベースラインレベルを上回る４３倍の誘導を実証する。ＤＨＦＲ＿Ｔｈｅｏ＿１４は、テオフィリンありでも、又はテオフィリンなしでもルシフェラーゼ発現を示さず、この７ｂｐのステムが、アプタマーがそのリガンドに結合したときでさえ、短すぎて、安定したヘアピンを形成することができないことを示唆している。結果として、ＤＨＦＲエクソンは転写産物へとスプライスされ、そして、ルシフェラーゼ発現が妨げられる。 ヘアピンステムとアプタマーＰＩステムの連続切断によって作り出したｘｐｔ−グアニンアプタマー及びＤＨＦＲエクソン５’ｓｓ配列を接続する合成ステムの配列。グアニンは（●）として記号化される。 ヘアピンステムとアプタマーＰＩステムの連続切断によって作り出したｘｐｔ−グアニンアプタマー及びＤＨＦＲエクソン５’ｓｓ配列を接続する合成ステムの配列。グアニンは（●）として記号化される。 アプタマーリガンド結合に対応してルシフェラーゼ発現を調節するリボスイッチの能力に対するステム長の効果。異なるステム長の１８種類のリボスイッチが、調節カセット内に挿入され、そして、その構築物が、ＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトされ、５００μΜのグアニンの存在又は不存在下で培養された。グアニンの不存在下、構築物Ｇ１４からＧ１８では、無調節Ｃｏｎ１対照と比較して、ルシフェラーゼ発現の低減を実証する。グアニン存在下では、ルシフェラーゼ発現は、程度が変化するまで回復した。 アプタマーリガンド結合に対応してルシフェラーゼ発現を調節するリボスイッチの能力に対するステム長の効果の更なる分析。構築物Ｇ１１からＧ１８を、ルシフェラーゼアッセイを使用して確認した。 図５ｄは、Ｃｏｎ１と相対的なルシフェラーゼのベース及び誘導レベルを示す。グアニンの不存在下、構築物Ｇ１４からＧ１７は、アプタマーリガンド（この場合グアニン）によるルシフェラーゼ発現の明らかな調節を実証する。グアニンの不存在下、ルシフェラーゼ発現レベルは低い。グアニンの存在下、ルシフェラーゼ発現は、有意に活性化された。図５ｄは、グアニンを用いた誘導に対してこれらの調節された構築物に関して、達成されたＣｏｎ１対照発現に対する％を示す。 ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを包含する調節カセットは、数多くの異なった哺乳動物細胞型においてリガンドに対応した遺伝子発現調節を可能にした。ＤＨＦＲ＿Ｇ１７をＨｅｐＧ２、ＡＭＬ１２、ＲＤ及びＣ２Ｃ１２細胞株にトランスフェクトし、グアニンを用いた処理に対する誘導ルシフェラーゼ発現についてアッセイした。グアニンが細胞培養液に加えられていない非誘導ベースライン発現レベルと比較した、細胞をリガンド存在下で培養したときのルシフェラーゼ発現の誘導倍率を示す。 ウイルスベクターに関連するｘｐｔ−Ｇ１７包含調節カセットによるルシフェラーゼの調節。ｘｐｔ−Ｇ１７調節カセットを包含するルシフェラーゼ遺伝子を有する構築物を、ＡＡＶベクター骨格に移入し、細胞をトランスフェクトするために使用した。細胞を、グアニンの存在又は不存在下で培養した。グアニン存在下でのルシフェラーゼの誘導倍率が示され、発現の１６８７倍の誘導が、グアニンを用いた処理において見られた。 アプタマー結合リガンドに対応した調節カセットによる抗体の調節。ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを有するイントロン−エクソン−イントロン調節カセットを、抗ＫＤＲ抗体配列のリーダーペプチド配列内に挿入し、そして、得られた構築物を、ＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトした。ＥＬＩＳＡによってアッセイした場合、未処理細胞と比較して、リガンドでのトランスフェクト細胞の処理によって抗体タンパク質発現の８０倍の誘導があった。誘導された発現レベルは、Ｃｏｎ１イントロン配列を包含する対照構築物の約４０％に達した。 アプタマー／リガンド結合に対応した調節カセットによる分泌エリスロポイエチンタンパク質（ＥＰＯ）の調節。ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを有するイントロン−エクソン−イントロン調節カセットを、マウスエリスロポエチン（Ｅｐｏ）遺伝子内に挿入し、そして、得られた構築物をＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトした。ＥＬＩＳＡによってアッセイした場合、低レベルのＥＰＯ発現が、グアニン不存在下で観察された。グアニン存在下、ＥＰＯ発現の１４０倍の誘導が観察された。 様々なプリンリボスイッチステムの構築物を、調節カセットで試験した。プリンは●として記号化される。 図６ｂ−６ｅ。異なったアプタマーベースのリボスイッチ（図６ａで例示したリボスイッチステム）を包含する調節カセットを用いた構築物の用量応答。図６ｂは、グアニンに対するグアニンアプタマー包含調節カセットの応答である。 図６ｃは、グアノシンに対するグアニンアプタマー包含調節カセットの応答である。 図６ｄは、２’ｄＧに対するグアニンアプタマー包含調節カセットの応答である。 図６ｅは、アデニンに対するアデニンアプタマー包含調節カセットの応答である。 グアニンによるｘｐｔ−Ｇ１７包含調節カセットを用いたＥＧＦＰの誘導。ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを有するイントロン−エクソン−イントロンカセットを、ＥＧＦＰ遺伝子内にクローニングした。構築物で安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、５００μΜのグアニンで処理し、処理の６時間後にＧＦＰ発現をフローサイトメトリー分析によってアッセイした。グアニン処理は、ＥＧＦＰ発現の増強をもたらした、図７ａ、（Ｂ）。 リガンドの存在又は不存在に対応した標的遺伝子発現。ｘｐｔ−Ｇ１７を包含するリボスイッチを含むイントロン−エクソン−イントロンカセットを有するＥＧＦＰを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、５００μΜのグアニンで３日間処理し、そして、２４時間毎に３日間、フローサイトメトリー分析によってアッセイした。グアニン含有培地を細胞から洗い流し、そして、更に１０日間、グアニン処理なしでそれらを培養し続け、そして、ＥＧＦＰ発現を観察した。細胞培地中にグアニンが存在したとき、ＥＧＦＰ発現は増大した。グアニンＥＧＦＰの使用中止により、発現は失われた。 ２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５包含調節カセットによって調節されたルシフェラーゼ発現。グラフは、標的遺伝子内に挿入された単独のｘｐｔ−Ｇ１７又はｘｐｔ−Ｇ１５を包含する調節カセットを有する構築物、及び２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５を包含する調節カセットを有する構築物のグアニン用量応答を示す（ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル）。 異なった調節カセットによって調節された組織培養細胞内のＥＧＦＰ発現。１コピーのｘｐｔ−Ｇ１７を包含するカセット（ＥＧＦＰ−ｘｐｔ−Ｇ１７）は、低い非誘導ベースライン発現をもたらし（Ａ）、ＥＧＦＰ−ｘｐｔ−Ｇ１５構築物を含む細胞と比較して、低い誘導レベルの発現に達する（Ｄ）。１コピーのｘｐｔ−Ｇ１５包含カセット（ＥＧＦＰ−ｘｐｔ−Ｇ１５）では、より高い非誘導ベースライン発現（Ｂ）並びにより高い誘導発現（Ｅ）を得た。２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５を包含するカセット（ＥＧＦＰ−ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル）を包含する構築物により、誘導発現レベルを低減することなく（Ｆ）、バックグラウンド非誘導発現が低減され（Ｃ）、これにより、誘導倍率は増強された。細胞をグアニンで処理し、そして、処理の２４時間後に撮像した。 ｘｐｔ−Ｇ１５及びｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを包含する調節カセットは、グアニン及びグアノシンの両方に応答した。ＥＧＦＰ発現の定量化（平均蛍光強度）を、フローサイトメトリーによって分析し、そして、誘導倍率を、グアニン又はグアノシン処理で得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）を処理なしで得られたＭＦＩで割ることで計算した。グアニン及びグアノシンでの処理で、同様のレベル及び誘導倍率を得た。 １コピーのＹｄｈｌ−Ａ５を包含する調節カセットに加え１コピーのｘｐｔ−Ｇ１７を包含する調節カセットを含む構築物からのルシフェラーゼ発現。この構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、グアニン若しくはアデニン、又はその両方で処理した。ルシフェラーゼの最も高い誘導は、それらの最高濃度での両リガンドの併用で見られた。 ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを含むイントロン−エクソン−イントロン調節カセットによって調節されたルシフェラーゼ発現に対するイントロン切断の効果。図９ａは、誘導倍率を示し、及び図９ｂは、Ｃｏｎ１と比較した、ルシフェラーゼ発現率を示す。 ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを含むイントロン−エクソン−イントロン調節カセットによって調節されたルシフェラーゼ発現に対するイントロン切断の効果。図９ａは、誘導倍率を示し、及び図９ｂは、Ｃｏｎ１と比較した、ルシフェラーゼ発現率を示す。 イントロン−エクソン−イントロン調節構築物ＤＨＦＲ＿Ｇ１７から欠失された配列の略図。欠失配列は、白抜きの棒線によって示され、残留配列は塗りつぶした横棒によって示される。 図９ｃで示された、遺伝子調節に対する様々なイントロン欠失の効果。選択的ＤＦＩＦＲエクソンに隣接するイントロン内の配列が、エクソンのスプライシング及び相対遺伝子調節を改変した。例えば、ＤＨＦＲ−Ｇ１７＿２ＩＲ＿３は、標的遺伝子発現の倍率の有意な増大をもたらすイントロン欠失を示す。図９ｄは、誘導倍率を示し、それに対して、図９ｅは、Ｃｏｎ１対照に対するタンパク質発現の絶対レベルを示す。 図９ｃで示された、遺伝子調節に対する様々なイントロン欠失の効果。選択的ＤＦＩＦＲエクソンに隣接するイントロン内の配列が、エクソンのスプライシング及び相対遺伝子調節を改変した。例えば、ＤＨＦＲ−Ｇ１７＿２ＩＲ＿３は、標的遺伝子発現の倍率の有意な増大をもたらすイントロン欠失を示す。図９ｄは、誘導倍率を示し、それに対して、図９ｅは、Ｃｏｎ１対照に対するタンパク質発現の絶対レベルを示す。 様々なエクソンが、遺伝子発現を調節するためのイントロン−エクソン−イントロン調節カセットにおいて選択的エクソンとして機能し得る。図１０ａは、様々なエクソンを有する構築物が、様々な非誘導ベースライン及びルシフェラーゼ発現の誘導（５００μΜのグアニン）レベルを有することを示す。 図１０ｂは、これらの構築物を用いた誘導倍率を示し、そして、ＣａＭＫＩＩｄ−ｅ１６により、ＳＲｐ４０活性化変異を伴ったＤＨＦＲエクソン（ｍｔＤＨＦＲ）と同等な誘導倍率を生じた。 マウスでのｉｎ ｖｉｖｏにおけるルシフェラーゼ発現の調節。２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５調節カセットを包含する構築物（ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル、実施例８、図８ａ）を、水圧注入によってマウスの肝臓に送達した。マウスには、様々な用量のグアノシンを、ＤＮＡ送達の２時間及び１２時間後に経口的に投与し、その後、撮像した。リガンドの経口服用は、マウス肝臓において調節された標的遺伝子の発現の用量依存的な活性化をもたらした（図１１ａ及び図１１ｂ）。 マウスでのｉｎ ｖｉｖｏにおけるルシフェラーゼ発現の調節。２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５調節カセットを包含する構築物（ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル、実施例８、図８ａ）を、水圧注入によってマウスの肝臓に送達した。マウスには、様々な用量のグアノシンを、ＤＮＡ送達の２時間及び１２時間後に経口的に投与し、その後、撮像した。リガンドの経口服用は、マウス肝臓において調節された標的遺伝子の発現の用量依存的な活性化をもたらした（図１１ａ及び図１１ｂ）。 別の実験では、グアノシンが腹膜内に投与された（図１１ｃ）。像は、１００ｍｇ／ｋｇ又は３００ｍｇ／ｋｇ投与量のいずれかを用いたグアノシン処理前後のルシフェラーゼ発現を示す。 グラフ（図１１ｄ）では、ルシフェラーゼ活性を、平均光子／秒／ｍｍ²±ｓ.ｄ. （ｎ＝５）として表した。 マウス網膜におけるリボスイッチベースのＡＡＶベクターによって媒介されたＥＧＦＰ導入遺伝子発現。網膜下注射の８日後の、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７によって媒介された網膜におけるＥＧＦＰ導入遺伝子発現を示す蛍光眼底写真（露出時間：３０秒）。 経時的な網膜におけるＥＧＦＰ導入遺伝子発現のバリエーションを示す、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７を網膜下に注射した単一のマウス眼内の代表的な眼底像。Ａ〜Ｅ：ベクター注射２、８、９、１０及び１２日後に２００ｍｓの露出時間で白色光照射下にて撮影された像。円は、定量化のためのＲＯＩとみなした瞳孔を通して見える網膜領域を示す。Ｆ〜Ｊ：３０秒の露出時間で４７５±２５ｎｍの光照射下で撮影した像であり、ベクター注射２、８、９、１０及び１２日後にてｅＧＦＰ蛍光を示している。Ｋ〜Ｏ：ベクター注射２、８、９、１０及び１２日後に３０秒の露出時間を用いて４７５±２５ｎｍの光照射下で撮影した像であり、ＲＯＩ（円）内で強度閾値５０を超えたピクセルを強調表示した。 図１３ｂは、誘導前（Ａ）及び後（Ｂ）の高解像度像を示す。 ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７の網膜下注射後に経時的に定量化されたマウス網膜におけるＥＧＦＰ導入遺伝子発現。蛍光眼底写真を、次の時点：ＡＡＶ２／８ＧＴＸ７の網膜下注射の２、８、９、１０及び１２日後、にて撮影した。露出時間：３０秒、分析のためのピクセル強度閾値：５０。腹腔内誘導を、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７の網膜下注射の８、９及び１０日後における撮像後に実施した。加えて、硝子体内誘導を、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７の網膜下注射の１１日後に実施した。Ｄｕｎｎｅｔｔの補正及び対照点としての注射８日後を用いた一元配置ＡＮＯＶＡに基づいて示された統計的有意性。 ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ５（陽性対照）の網膜下注射後に経時的に定量化されたマウス網膜におけるＥＧＦＰ導入遺伝子発現。蛍光眼底写真を、次の時点：ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ５の網膜下注射の２、８、９、１０及び１２日後、にて撮像した。露出時間：１０秒、分析のためのピクセル強度閾値：１９０。グアノシンの腹腔内投与を、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ５の網膜下注射の８、９及び１０日後の撮像後に実施した。加えて、グアノシンの硝子体投与を、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ５の網膜下注射の１１日後に実施した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を伴った一元配置ＡＮＯＶＡを適用し、そして、グアノシンを用いた処理に対して、ＥＧＦＰの発現において統計的に有意な相違がないことが分かった。

発明の詳細な説明
本発明は、５’イントロン−選択的エクソン−３’イントロンに関連するリボスイッチを含む遺伝子調節カセットを提供する。遺伝子調節カセットとは、標的遺伝子のＤＮＡ内に組み込まれると、得られたプレｍＲＮＡのアプタマー／リガンド媒介性選択的スプライシングによって標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する組み換えＤＮＡ構築物を指す。本発明に関連するリボスイッチは、小分子リガンドの存在を感知し、そして、選択的エクソンのスプライシングを変更することに一緒に関与するセンサー領域（例えば、アプタマー）及びエフェクター領域を包含する。一実施形態において、目的遺伝子の発現は、アプタマーリガンドが存在するときに増強され、そして、リガンドが存在しないときに低減される。

リボスイッチ

「リボスイッチ」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡポリヌクレオチドの調節セグメントを指す。本発明に関連するリボスイッチは、リガンド（例えば、小分子）の存在を感知し、そして、選択的エクソンのスプライシングを変更することに一緒に関与するセンサー領域（例えば、アプタマー）及びエフェクター領域を包含する。一実施形態において、リボスイッチは、遺伝子組み換えによるものであり、２以上の起源由来のポリヌクレオチドを利用する。「合成の（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）」という用語は、リボスイッチに関連して本明細書中で使用される場合、天然に存在しないリボスイッチを指す。一実施形態において、センサー及びエフェクター領域は、ポリヌクレオチドリンカーによって連結される。一実施形態において、ポリヌクレオチドリンカーは、ＲＮＡステム（すなわち、二本鎖であるＲＮＡポリヌクレオチド領域）を形成する。

エフェクター領域

一実施形態において、エフェクター領域は、３’イントロンの５’スプライス部位（「５’ｓｓ」）配列（すなわち、選択的エクソンの３’間近に存在するイントロンスプライス部位配列）を含む。エフェクター領域は、３’イントロンの５’ｓｓ配列、及び３’イントロンの５’ｓｓ配列と相補的な配列を含む。アプタマーがそのリガンドに結合したとき、エフェクター領域が、ステムを形成し、これにより、選択的エクソンの３’末端のスプライスドナー部位に対するスプライシングが妨げられる（例えば、図４ｂを参照のこと）。特定の条件下（例えば、アプタマーがそのリガンドに結合しないとき）、エフェクター領域は、選択的エクソンの３’末端にあるスプライスドナー部位を利用する機会を提供する状況で、標的遺伝子ｍＲＮＡ内への選択的エクソンの包含に導く（例えば、図４ａを参照のこと）。

エフェクター領域のステム部分は、アプタマーのリガンド結合により、選択的エクソンの選択的スプライシングを実質的に妨げるのに十分な長さ（及びＧＣ含量）のものでなければならず、一方で、リガンドが十分な量で存在しないときには、スプライス部位を利用することを可能にもする。本発明の実施形態において、エフェクター領域のステム部分は、３’イントロンの５’ｓｓ配列及びその相補的配列に加えて、ステム配列を含む。本発明の実施形態において、この追加のステム配列は、アプタマーステムからの配列を含む。ステム部分の長さと配列は、リガンドが存在しないときには、許容し得る標的遺伝子のバックグラウンド発現を可能にし、且つ、リガンドが存在するときには、許容し得る標的遺伝子の発現レベルを可能にするステムを同定するために、既知の技術を使用して改変できる（例えば、実施例４及び５、並びに図４ｃ及び４ｄ、５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄを参照のこと）。例えば、ステムが長過ぎる場合、それは、リガンドの存在又は不存在下で、３’イントロンの５’ｓｓ配列を利用する機会から遠ざけ得る。ステムが短すぎる場合、それは、３’イントロンの５’ｓｓ配列を隔離できる安定したステムを形成できず、その場合、選択的エクソンは、リガンドの存在又は不存在下で、標的遺伝子メッセージにスプライスされる。一実施形態において、エフェクター領域ステムの全長は、約７塩基対〜約２０塩基対である。いくつかの実施形態において、ステムの長さは、約８塩基対〜約１１塩基対である。いくつかの実施形態において、ステムの長さは、８塩基対〜１１塩基対である。ステムの長さに加えて、ステムのＧＣ塩基対含量が、ステムの安定性を改変するために変更できる。

アプタマー／リガンド

「アプタマー」という用語は、本明細書中で使用される場合、リガンドに特異的に結合するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。「リガンド」という用語は、アプタマーによって特異的に結合される分子を指す。一実施形態において、リガンドは、例えば、脂質、単糖、セカンドメッセンジャー、他の天然物及び代謝産物、核酸、並びにほとんどの治療薬を含む低分子量（約１，０００ダルトン未満）分子である。一実施形態において、リガンドは、２以上のヌクレオチド塩基を有するポリヌクレオチドである。

アプタマーは結合領域を有し、そしてそれは、意図された標的分子（すなわち、リガンド）と複合体を形成することができる。結合の特異性は、無関係な分子に対するアプタマーの解離定数と比較した場合に、そのリガンドに対するアプタマーの相対的な解離定数（Ｋｄ）の点から規定され得る。これにより、リガンドは、無関係な材料より高い親和性でアプタマーに結合する分子である。一般的に、そのリガンドに関するアプタマーのＫｄは、無関係な分子とアプタマーのＫｄに比べて、少なくとも約１０倍低い。他の実施形態において、Ｋｄは、少なくとも約２０倍低い、少なくとも約５０倍低い、少なくとも約１００倍低い、及び少なくとも約２００倍低い。アプタマーは一般的に、長さが約１５〜約２００ヌクレオチドである。より一般的に、アプタマーは、長さが約３０〜約１００ヌクレオチドである。

リボスイッチの一部として組み込まれ得るアプタマーは、天然のアプタマー、若しくはその修飾物、或いはｄｅ ｎｏｖｏで設計されたアプタマーか又は指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化法（ＳＥＬＥＸ）によって合成的にスクリーニングされたアプタマーである。小分子リガンドに結合するアプタマーの例としては、これだけに限定されるものではないが、テオフィリン、ドーパミン、スルホロダミンＢ、及びセロビオースカナマイシンＡ、リビドマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、バイオマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、サイトカイン、細胞表面分子、及び代謝産物が挙げられる。小分子を認識するアプタマーの総説に関しては、例えば、Famulok, Science 9:324-9 (1999) and McKeague, M. & DeRosa, M.C. J. Nuc. Aci. 2012を参照のこと。別の実施形態において、アプタマーは相補的なポリヌクレオチドである。

一実施形態において、アプタマーは、特定の小分子リガンドに結合するように設計されている。アプタマーを設計する方法としては、例えばＳＥＬＥＸが挙げられる。ＳＥＬＥＸを使用した、小分子に選択的に結合するアプタマーを設計する方法は、例えば米国特許第５,４７５,０９６号、同第５，２７０,１６３号、及びAbdullah Ozer, et al. Nuc. Aci. 2014に開示されており、そしてそれらを参照により本明細書に援用する。ＳＥＬＥＸプロセスの変法は、米国特許第５,５８０，７３７号及び同第５,５６７,５８８号に記載されており、そしてそれらを参照により本明細書に援用する。

アプタマーを同定するための選択技術は、一般的に、無作為化されるか又は変異誘導された領域を含む所望の長さのＤＮＡ又はＲＮＡ分子の大量のプールを調製することを伴う。例えば、アプタマー選択のためのオリゴヌクレオチドプールは、約１５〜２５ヌクレオチドの長さがあり、且つ、ＰＣＲプライマーの結合に有用な特定配列領域が隣接する無作為化された２０〜１００ヌクレオチドの領域を含んでもよい。オリゴヌクレオチドプールは、標準的なＰＣＲ技術、又は選択された核酸配列の増幅を可能にする他の手段を使用して増幅される。ＤＮＡプールは、ＲＮＡアプタマーが所望されるときには、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されて、ＲＮＡ転写物のプールを作製し得る。次に、ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドのプールは、所望のリガンドに特異的に結合するそれらの能力に基づいて選択にかけられる。選択技術としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、他の分子に特異的に結合するそれらの能力に基づく核酸の選択を可能にする任意のプロトコールが使用され得る。小分子に結合し、細胞内で機能するアプタマーを同定するための選択技術は、細胞ベースのスクリーニング法を伴ってもよい。アフィニティークロマトグラフィーの場合では、オリゴヌクレオチドを、カラム内の基材上又は磁性ビーズ上に固定された標的リガンドと接触させる。オリゴヌクレオチドは、通常の生理的条件を模倣した塩濃度、温度、及び他の条件の存在下でのリガンド結合に関して好ましくは選択される。プール内のリガンドに結合するオリゴヌクレオチドは、カラム又はビーズ上に保持され、そして、非結合配列は洗い流される。次に、リガンドに結合するオリゴヌクレオチドは、（ＲＮＡ転写物を利用する場合には、逆転写後に）（通常、溶出後に）ＰＣＲによって増幅される。選択過程は、合計で選別手順の約３〜１０反復ラウンドにわたって選択配列に対して繰り返される。次に、得られたオリゴヌクレオチドは、増幅され、クローニングされ、そして、標的リガンドに結合することができるオリゴヌクレオチドの配列を同定するために標準的な手順を使用して配列決定される。アプタマー配列がいったん同定されると、アプタマーは、変異誘導したアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから開始する選択の追加ラウンドを実施することによって、更に最適化され得る。

ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアプタマースクリーニングは、次の１若しくは複数のラウンドから成るｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（例えば、ＳＥＬＥＸ）を使用してもよい。例えば、Konig, J.ら（RNA. 2007, 13 (4): 614-622、参照により本明細書に援用する）は、アプタマーのｉｎ ｖｉｖｏ選択のための連結ＳＥＬＥＸ及び酵母３−ハイブリッドシステムについて記載する。

選択的エクソン

本発明の遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットの一部である選択的エクソンは、プレｍＲＮＡに転写され、標的遺伝子のｍＲＮＡ内に選択的にスプラスされることができる任意のポリヌクレオチド配列であり得る。本発明の遺伝子調節カセットの一部である選択的エクソンは、選択的エクソンが標的遺伝子ｍＲＮＡ内に包含されたとき、そのｍＲＮＡからの標的遺伝子の発現を妨げるか又は低減するように、翻訳を阻害する少なくとも１つの配列を含む。好ましい実施形態において、選択的エクソンは、該選択的エクソンがスプライシングによって標的遺伝子ｍＲＮＡ内に含まれる場合に、標的遺伝子とインフレームの終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）を含む。実施形態において、選択的エクソンは、終止コドンに加えて、又は終止コドンに代わるものとして、例えば、ｍＲＮＡの分解につながるマイクロＲＮＡ結合部位を含む、該選択的エクソンがスプライシングによって標的遺伝子ｍＲＮＡ内に包含された場合に、翻訳を低減するか、又は実質的に妨げる他の配列を含む。一実施形態において、選択的エクソンは、ｍＲＮＡの分解をもたらすｍｉＲＮＡ結合配列を含む。一実施形態において、選択的エクソンは、このポリペプチド配列を包含するタンパク質の安定性を低減するポリペプチド配列をコードする。一実施形態において、選択的エクソンは、分解のためにこのポリペプチド配列を包含するタンパク質を指示するポリペプチド配列をコードする。

選択的エクソンのスプライシングのベースレベル又はバックグラウンドレベルは、エクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）配列及びエクソンスプライスサプレッサー（ＥＳＳ）配列を変更することによって、及び／又は選択的エクソン内にＥＳＥ又はＥＳＳ配列を導入することによって最適化され得る。選択的エクソンの配列に対するそのような変化は、これだけに限定されるものではないが、部位特異的変異誘導（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を含めた、当該技術分野で知られている方法を使用して達成され得る。あるいは、（例えば、選択的エクソンのすべて又は一部を含む）所望の配列のオリゴヌクレオチドは、商業的供給元から得られ、そして、遺伝子調節カセット内にクローニングされ得る。ＥＳＳ及びＥＳＥ配列の同定は、例えば、ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ３．０（Cartegni, L. et al. ESEfinder: a web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acid Research, 2003, 31(13): 3568-3571）及び／又は他の利用可能な供給元を含めた、当該技術分野で知られている方法によって達成され得る。

一実施形態において、選択的エクソンは、標的遺伝子にとって外来性であるが、標的遺伝子が発現される生物体に起因する配列に由来し得る。一実施形態において、選択的エクソンは、合成配列である（実施例１０を参照のこと）。

一実施形態において、選択的エクソンは、天然のエクソンである（実施例１０を参照のこと）。別の実施形態において、選択的エクソンは、既知のエクソンのすべて又は一部に由来する（実施例１０を参照のこと）。この文脈において、「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、天然のエクソン又はその一部に対して実質的に相同であるが、例えば、標的遺伝子配列とインフレームの終止コドンを導入若しくは削除するか、又はエクソンスプライスエンハンサーを導入若しくは削除する、及び／又はエクソンスプライスサプレッサーの導入若しくは削除するために、様々な変異を含み得る配列を包含する選択的エクソンを指す。一実施形態において、選択的エクソンは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）のエクソン２、変異ヒトＷｉｌｍｓ腫瘍１エクソン５、マウスカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタエクソン１６、又はＳＩＲＴ１エクソン６に由来する。

５’及び３’イントロン配列

選択的エクソンは、５’及び３’イントロン配列に隣接する。本発明の遺伝子調節カセットで使用できる５’及び３’イントロン配列は、標的遺伝子をスプライスアウトでき、アプタマーを結合するリガンドの存在又は不存在によって、標的遺伝子ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ内に選択的エクソンを含む標的遺伝子のいずれかを作り出す任意の配列であり得る。５’及び３’イントロンはそれぞれ、スプライシングが起こるのに必要な配列、すなわち、スプライスドナー、スプライスアクセプター、分岐点配列を有する。一実施形態において、遺伝子調節カセットの５’及び３’イントロン配列は、１若しくは複数の天然イントロン又はその一部に由来する。一実施形態において、５’及び３’イントロン配列は、切断ヒトβ−グロビンイントロン２（ＩＶＳ２Δ）に由来する。他の実施形態において、５’及び３’イントロン配列は、ＳＶ４０ｍＲＮＡイントロン（Clonetech製のｐＣＭＶ−ＬａｃＺベクターで使用される）、ヒトトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子のイントロン６（Nott Ajit, et al. RNA. 2003, 9:6070617）、又はヒト第ＩＸ因子からのイントロン（Sumiko Kurachi et al. J. Bio. Chem. 1995, 270(10), 5276）、標的遺伝子それ自体の内在性イントロン、或いは調節されるスプライシングに十分な要素を含む（Thomas A. Cooper, Methods 2005 (37):331）任意のゲノムフラグメント又は合成イントロン（Yi Lai, et al. Hum Gene Ther. 2006: 17(10): 1036）に由来する。

一実施形態において、本発明の選択的エクソン及びリボスイッチは、標的遺伝子の内在性イントロン内に存在するように設計される。すなわち、イントロン（又は実質的に同様のイントロン配列）は、標的遺伝子のその位置に天然に生じる。この場合、選択的エクソンのすぐ上流のイントロン配列は、５’イントロン又は５’イントロン配列とも呼ばれ、選択的エクソンのすぐ下流のイントロン配列は、３’イントロン又は３’イントロン配列とも呼ばれる。この場合、内在性イントロンは、選択的エクソンの５’末端及び３’末端に隣接するスプライスアクセプター配列及びスプライスドナー配列を含むように改変される。

本発明の遺伝子調節カセット内のスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位は、強化又は弱化されるように改変されてもよい。すなわち、スプライス部位は、標準的なクローニング法、部位特異的変異誘導などによるスプライスドナー又はアクセプターのコンセンサスにより近づくように改変されてもよい。スプライスコンセンサスにより類似したスプライス部位は、スプライシングを促進する傾向があって、これにより強化される。スプライスコンセンサスとそれほど類似していないスプライス部位は、スプライシングを妨げる傾向があって、これにより弱化される。イントロンの最も一般的な種類のスプライスドナーのコンセンサス（Ｕ２）は、Ａ／Ｃ Ａ Ｇ || Ｇ Ｔ Ａ／Ｇ Ａ Ｇ Ｔ（ここで、||は、エクソン／イントロン境界を意味する）である。スプライスアクセプターのコンセンサスは、Ｃ Ａ Ｇ || Ｇ（ここで、||は、エクソン／イントロン境界を意味する）である。スプライスドナー及びアクセプター部位における特定のヌクレオチドの頻度は、当該技術分野で記載されている（例えば、Zhang, M.Q., Hum Mol Genet. 1988. 7(5):919-932を参照のこと）。５’ｓｓ及び３’スプライス部位の強さは、選択的エクソンのスプライシングを調節するように調整され得る。

遺伝子調節カセット内の５’及び３’イントロンに対する追加の改変は、イントロンスプライシングエンハンサーエレメント及び／又はイントロンスプライシングサプレッサーエレメントを改変、削除及び／又は付加すること、及び／又は分岐部位配列を改変することを含めて、スプライシングを改変するようにおこなわれ得る。

一実施形態において、５’イントロンは、標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含むように改変された。５’及び３’イントロン配列はまた、隠れたスプライス部位を取り除くように改変されてもよく、そしてそれは、公的に利用可能なソフトウェアを用いて同定され得る（例えば、Kapustin, Y. et al. Nucl. Acids Res. 2011. 1-8を参照のこと）。５’及び３’イントロン配列の長さは、例えば、ウイルス発現構築物のサイズ要件を満たすように調節されてもよい。一実施形態において、５’及び３’イントロン配列は独立に、長さが約５０〜約３００ヌクレオチドである。一実施形態において、５’及び３’イントロン配列は独立に、長さが約１２５〜約２４０ヌクレオチドである。

標的遺伝子

本発明の遺伝子調節カセットは、標的細胞、組織又は生物体で発現され得る任意の標的遺伝子の発現を調節するために使用できるプラットフォームである。「標的遺伝子」という用語は、細胞内に導入され、ＲＮＡに転写され、そして、適当な条件下で翻訳及び／又は発現されることができるポリヌクレオチドを指す。あるいは、標的遺伝子は、標的細胞にとって内在性であり、そして、本発明の遺伝子調節カセットは、標的遺伝子内（例えば、内在性標的遺伝子の既存のイントロン内）に配置される。標的遺伝子の例は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一実施形態において、標的遺伝子が本発明の遺伝子調節カセットを使用して発現されるとき、該標的遺伝子は、選択的エクソンを含む融合タンパク質として発現されない。選択的エクソンの包含は、例えば、選択的エクソンを含むメッセージの分解を引き起こすことによってｍＲＮＡの翻訳を最小化する、又はそうでなければ、例えば、その未熟な切断により、機能的な標的遺伝子の発現を妨げる。一実施形態において、標的遺伝子は、組み換えＤＮＡ構築物が転写されるべき細胞にとって外来性である。別の実施形態において、標的遺伝子は、組み換えＤＮＡ構築物が転写されるべき細胞にとって内在性である。一実施形態において、選択的エクソンは、標的遺伝子のコード配列とインフレームの終止コドンを包含してもよい。他の実施形態において、選択的エクソンは、標的遺伝子の転写産物分解を駆動する及び／又は翻訳を遮断する他の配列を包含してもよい。

本発明の標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であっても、又は非タンパク質コーディングＲＮＡをコードする配列であってもよい。例えば、標的遺伝子は、構造タンパク質、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、ジンクフィンガータンパク質、ホルモン、輸送タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、受容体分子、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、翻訳機構、チャネルタンパク質、モータータンパク質、細胞接着分子、ミトコンドリアタンパク質、代謝酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、交換因子、シャペロンタンパク質、及びこれらのいずれのモジュレーターをコードする遺伝子であってもよい。実施形態において、標的遺伝子は、エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ヒトインスリン、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｃａｓ９）、又は例えば、治療用抗体を含む免疫グロブリン（又はその一部）をコードする。

発現構築物

本発明は、標的遺伝子をコードし、且つ、本発明の遺伝子調節カセットを包含するポリヌクレオチドを、標的細胞内に導入するための組み換えベクターの使用を企図する。多くの実施形態において、本願発明の組み換えＤＮＡ構築物は、宿主細胞におけるＤＮＡの複製、及びその細胞における適正なレベルでの標的遺伝子の発現をもたらすＤＮＡセグメントを含む追加のＤＮＡエレメントを含む。発現制御配列（プロモーター、エンハンサーなど）が、標的細胞における標的遺伝子の発現を促進するそれらの能力に基づいて選択されることを、当業者は理解している。「ベクター」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて宿主細胞内に送達されるべきポリヌクレオチドを含む組み換えプラスミド、酵母、人工染色体（ＹＡＣ）、ミニクロモソーム、ＤＮＡミニサークル又は（ウイルス由来配列を含む）ウイルスを意味する。一実施形態において、組み換えベクターは、ウイルスベクター又は複数のウイルスベクターの組み合わせである。

標的細胞、組織、又は生物体における標的遺伝子の発現のためのウイルスベクターは、当該技術分野で知られており、アデノウイルス（ＡＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター、並びに単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ベクターが挙げられる。

アデノウイルスベクターとしては、例えばＥ１及びＥ３領域の欠失によって複製不全にしたヒトアデノウイルス２型及びヒトアデノウイルス５型ベースのベクターを含む。転写カセットがＥ１領域に挿入され、そして、組み換えＥ１／Ｅ３欠失ＡＶベクターを得る。また、アデノウイルスベクターは、（大容量の「中身のない（gutless）」又は「中身を抜かれた（gutted）」ベクターとしても知られている）ヘルパー依存性大容量アデノウイルスベクターを含むが、それは、ウイルス性コード配列を含まない。これらのベクターは、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要とされるシス作用性エレメント、主に末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及びパッケージングシグナル（Ψ）を包含する。これらのヘルパー依存性ＡＶベクターゲノムは、数１００塩基対から最大で約３６ｋｂの外来ＤＮＡを担持するポテンシャルを有する。

組み換えアデノ随伴ウイルス「ｒＡＡＶ」ベクターとしては、これだけに限定されるものではないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０などを含めた、任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来する任意のベクターが挙げられる。ｒＡＡＶベクターは、全体又は一部削除されたＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはＲｅｐ及び／又はＣａｐの遺伝子の一個以上を有するが、機能的な隣接するＩＴＲ配列を保有する。機能性ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムのレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）、複製、パッケージング、及び潜在的染色体組込みのために保有される。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はないので、その配列が機能的なレスキュー、複製、及びパッケージングをもたらす限り、（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって）変更されてもよい。

あるいは、レンチウイルスベクターなどの他のシステムが、本発明の実施形態に使用され得る。レンチウイルスベースのシステムは、非分裂細胞並びに分裂細胞に形質導入し、そしてそれらを、例えばＣＮＳの非分裂細胞、を標的化する適用を有用にする。レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス及びそのようなウイルスに由来し、宿主ゲノム内に組み込まれ、非常に長期間にわたる遺伝子発現の可能性を提供する。

遺伝子調節カセットを包含する標的遺伝子を担持するプラスミド、ＹＡＣ、ミニクロモソーム、及びミニサークルを含めたポリヌクレオチドはまた、例えば、担体として陽イオン性脂質、ポリマー、又はその両方を使用した非ウイルスベクターシステムによって細胞又は生物体内に導入され得る。コンジュゲートしたポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）ポリマー及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーシステムもまた、ベクターを細胞内に送達するのに使用できる。細胞にベクターを送達するための他の方法としては、細胞培養物と生物体の両方に対し、水圧注射（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びエレクトロポレーションおよび超音波の使用が挙げられる。遺伝子送達のためのウイルス及び非ウイルス送達システムの総説に関しては、Nayerossadat, N. et al.（Adv Biomed Res. 2012; 1 :27）（参照により本明細書に援用する）を参照のこと。

標的遺伝子の発現を調節する方法

一態様において、本願発明は、（ａ）本発明の遺伝子調節カセットを標的遺伝子内に挿入し；（ｂ）遺伝子調節カセットを含む標的遺伝子を細胞内に導入し；そして、（ｃ）該細胞を、アプタマーに結合するリガンドに晒すことによって標的遺伝子（例えば、治療遺伝子）の発現を調節する方法を提供する。一実施形態において、リガンドは小分子である。態様において、標的細胞における標的遺伝子の発現は、それが導入された細胞に所望の特性を与えるか、又はそうでなければ、所望の治療帰結に導く。

好ましい実施形態において、遺伝子調節カセットは、（５’又は３’非翻訳領域よりも）標的遺伝子のタンパク質コード配列に挿入される。一実施形態において、単一遺伝子調節カセットは標的遺伝子内に挿入される。他の実施形態において、２、３、４又はそれより多くの遺伝子調節カセットが標的遺伝子に挿入される。一実施形態において、２つの遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入される。複数の遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入されるとき、それらはそれぞれ、単独のリガンドが、複数のカセットで選択的スプライシングを調節し、それによって、標的遺伝子発現を調節するのに使用され得るように、同じアプタマーを含み得る。他の実施形態において、複数の遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入され、それぞれが、複数の異なった小分子リガンドへの曝露が標的遺伝子発現を調節するように、異なったアプタマーを含み得る。他の実施形態において、複数の遺伝子調節カセットが標的遺伝子内に挿入され、そしてそれぞれ、別個の５’イントロン、選択的エクソン、及び３’イントロン配列を含む。これは、組換えを削減し、そして、ウイルスベクター内への取り込みの容易さを改良するのに有用であり得る。

治療の方法と医薬組成物

本発明の一態様は、遺伝子治療によって送達された治療用タンパク質のレベルを調節する方法を提供する。この実施形態において、「標的遺伝子」は、治療用タンパク質をコードし得る。「標的遺伝子」は、細胞にとって内在性又は外来性であるタンパク質をコードし得る。

アプタマー駆動リボスイッチを有する調節カセットを包含する治療用遺伝子配列が、例えば、ベクターによって、体内の標的細胞に送達される。「標的遺伝子」の細胞特異性は、ベクター内のプロモーター又は他のエレメントによって制御され得る。標的遺伝子を包含するベクター構築物の送達、及び調節された標的遺伝子の安定的なトランスフェクションをもたらす標的組織のトランスフェクションは、治療用タンパク質を産生する第１ステップである。

しかしながら、標的遺伝子配列内の調節カセットの存在のため、標的遺伝子は有意なレベルで発現されない、すなわち、それは、調節カセットリボスイッチ内に包含されるアプタマーに結合する特異的リガンドの不存在下、「オフ状態」である。アプタマー特異的リガンドが投与されたときにだけ、標的遺伝子発現を活性化する。

標的遺伝子を包含するベクター構築物の送達と活性化リガンドの送達は、一般的に、時間が離れている。活性化リガンドの送達は、標的遺伝子が発現される時期、並びにタンパク質の発現レベルを制御する。リガンドは、これだけに限定されるものではないが、経口的、筋肉内（ＥＶＩ）、静脈内（ＩＶ）、眼内、又は局所的を含めた数多くの経路によって送達され得る。

リガンドの送達のタイミングは、標的遺伝子の活性化のための要件に依存する。例えば、標的遺伝子によってコードされた治療用タンパク質が常に必要とされる場合、経口の小分子リガンドが毎日又は一日複回、送達されて、標的遺伝子の連続的な活性化とそしてこれによる、治療用タンパク質の連続的発現を確実にする。標的遺伝子に長時間の作用効果がある場合、誘導リガンドは、より低い頻度で投与され得る。

本願発明は、調節カセット内のアプタマーに特異的なリガンドの一時的な投薬によって決定される様式で、治療用導入遺伝子の発現が時間的に制御されることを可能にする。リガンド投与に対するだけの治療用導入遺伝子の発現は、リガンドの不存在下で標的遺伝子がオフにできることで、遺伝子治療処理の安全を高める。

異なったリガンドが標的遺伝子を活性化することを可能にするために、異なったアプタマーを使用できる。本発明の特定の実施形態において、調節カセットを包含する各治療遺伝子は、特定の小分子によって活性化されるカセット内の特定のアプタマーを有する。これは、各治療遺伝子が、その中に収容されているアプタマーに特異的なリガンドによってのみ活性化されることを意味する。これらの実施形態において、各リガンドは、１種類の治療遺伝子しか活性化しない。このことは、いくつかの別々の「標的遺伝子」が、一個体に送達され得ること、及びそれぞれが各標的遺伝子内に収容された調節カセット内に包含されたアプタマーに特異的なリガンドの送達によって活性化される可能性をもたらす。

本願発明は、その遺伝子が身体に送達され得る任意の治療用タンパク質（エリスロポイエチン（ＥＰＯ）又は治療用抗体など）が、活性化リガンドを送達したときに、身体によって産生されることを可能にする。治療薬タンパク質送達のこの方法は、その後、注射されるか又は注入される、斯かる治療用タンパク質、例えば、癌に使用されるか、又は炎症性疾患若しくは自己免疫疾患を遮断するための抗体、の体外での製造に置き換わり得る。調節された標的遺伝子を包含する身体が生物製剤を製造する工場になり、そしてそれは、遺伝子特異的リガンドが投与されたときに、スイッチが入る。

治療用タンパク質の投薬の投与量レベルとタイミングは、治療効果に重要であり得る。例えば、癌に向けたＡＶＡＳＴＩＮＲ（抗ＶＥＧＦ抗体）の送達においてである。本発明は、治療用タンパク質のレベル及び効果に関する観察に対応した投薬の容易さを高める。

一実施形態において、標的タンパク質は、特定のＤＮＡ配列を標的化及び編集し得るヌクレアーゼであってもよい。斯かるヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、ジンクフィンガー含有ヌクレアーゼ、又はＴＡＬＥＮが挙げられる。これらのヌクレアーゼの場合には、ヌクレアーゼタンパク質は、標的内在性遺伝子を編集するために十分な短期間しか必要としない可能性がある。しかしながら、無調節ヌクレアーゼ遺伝子が身体に送達される場合、このタンパク質は、細胞の残りの寿命の間存在する可能性がある。ヌクレアーゼの場合には、より長い間ヌクレアーゼが存在すれば、オフターゲット編集の高い危険性が存在する。斯かるタンパク質の発現調節には、有意な安全上の利点がある。この場合、調節カセットを包含するヌクレアーゼ標的遺伝子を包含するベクターを、体内の適当な細胞に送達できる。標的遺伝子は、カセット特異的リガンドの不存在下で「オフ」状態にあり、そのため、ヌクレアーゼは産生されない。活性化リガンドが投与されたときにだけ、ヌクレアーゼが産生される。十分な編集が起こるのを可能にするのに十分な時間が経過したとき、リガンドは、取り去られ、再投与されない。これにより、ヌクレアーゼ遺伝子は、その後「オフ」状態になり、更なるヌクレアーゼが産生されず、編集が停止する。このアプローチは、ＣＥＰ２９０内の変異群によって引き起こされるＬＣＡ１０及びＡＢＣＡ４内の変異群によって引き起こされるシュタルガルト疾患などの多くの遺伝性網膜障害を含め、遺伝子状態を補正するのに使用され得る。

特異的リガンド投与によってのみ活性化される治療用タンパク質をコードする調節された標的遺伝子の投与が、多くの異なったタイプの疾患、例えば、治療用抗体を用いた癌、免疫調節性タンパク質又は抗体を用いた免疫障害、代謝性疾患、調節された遺伝子として抗Ｃ５抗体又は抗体フラグメントを用いたＰＮＨ、或いは、治療用抗体を用いた目の血管新生、並びに免疫調節性タンパク質を用いた乾燥ＡＭＤなどの奇病、を処置するための治療遺伝子を調節するのに使用され得る。

さまざまな特定の疾患及び病状の処理を可能にする、さまざまな特定の標的遺伝子が、本発明の使用に好適である。例えば、インスリン又はインシュリン類似物（好ましくはヒトインスリン又はヒトインスリンの類似体）が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、又はメタボリックシンドロームを治療するための標的遺伝子として使用されてもよく；ヒト成長ホルモンが、成長異常に罹患している小児又は成長ホルモン欠乏の成人を治療するための標的遺伝子として使用されてもよく；エリスロポイエチン（好ましくはヒトエリスロポイエチン）が、慢性腎臓病による貧血、骨髄形成異常による貧血、又は癌化学療法による貧血を治療するための標的遺伝子として使用されてもよい。

本発明は、例えば、嚢胞性線維症、血友病、筋ジストロフィー症、サラセミア、又は鎌状赤血球貧血などの単一遺伝子欠陥によって引き起こされる疾患を治療するのに特に好適であり得る。よって、ヒトβ−、γ−、δ−、又はζ−グロビンが、β−サラセミア又は鎌状赤血球貧血を治療するための標的遺伝子として使用されてもよく；ヒト第八因子又は第九因子が、血友病Ａ又は血友病Ｂを治療するための標的遺伝子として使用されてもよい。

本発明に使用されるリガンドは、一般的に、患者への投与に好適な医薬組成物を形成するために１若しくは複数の医薬的に許容し得る担体と組み合わせられる。医薬的に許容し得る担体としては、一般的に医薬技術分野で使用される、溶媒、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、及び吸収遅延化剤などが挙げられる。医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチなどの形態であり得、そして、それらの意図された投与経路に適合できるように処方される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、経口、吸入、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸が挙げられる。

リガンドを含む医薬組成物が、標的遺伝子を好ましく調節できるのに十分なリガンドの量が患者に送達されるような服薬スケジュールで患者に投与される。リガンドが小分子であり、且つ、投薬形態が、錠剤、丸薬、又は同様のものであるとき、好ましくは、医薬組成物は、０．１ｍｇ〜１０ｇのリガンド；０．５ｍｇ〜５ｇのリガンド；１ｍｇ〜１ｇのリガンド；２ｍｇ〜７５０ｍｇのリガンド；５ｍｇ〜５００ｍｇのリガンド；又は１０ｍｇ〜２５０ｍｇのリガンドを含む。

医薬組成物は、１日１回投与されても、又は１日に複数回（例えば、１日に２、３、４、５回若しくはそれ以上）投与されてもよい。あるいは、医薬組成物は、１日１回より低い頻度、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日毎に１回、又は１カ月に１回若しくは数カ月毎に１回、投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、一回、二回、三回といったわずかな回数だけ、患者に投与され得る。

本発明は、標的遺伝子によってコードされた治療用タンパク質の発現増加を必要としている患者を治療する方法を提供し、該方法は、アプタマーのためのリガンドを含む医薬組成物を患者に投与することを含み、ここで、該患者は、標的遺伝子を含む組み換えＤＮＡを以前に投与されたことがあり、ここで、該標的遺伝子は、標的遺伝子のプレｍＲＮＡを選択的スプライシングし、それによって、治療用タンパク質の発現を増強することによって、アプタマーのリガンドにより標的遺伝子の発現を調節する能力を提供する本発明の遺伝子調節カセットを包含する、方法である。

製品とキット

本明細書中に記載した方法において使用するためのキット又は製品もまた提供する。態様において、キットは、好適な包装中に（例えば、遺伝子調節カセットを包含する標的遺伝子を含むベクターの送達のための組成物のための）本明細書中に記載した組成物を含む。（注射のための眼組成物などの）本明細書中に記載した組成物のための好適な包装は、当該技術分野で既知であり、例えば（血管、アンプル）が瓶に入れるバイアル（密閉バイアルなど）、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密閉Ｍｙｌａｒ又はポリ袋）などが挙げられる。これらの製品は、更に滅菌及び／又は密封されてもよい。

本発明はまた、本明細書中に記載した組成物を含むキットも提供し、そして、本明細書中に記載した用途など、該組成物を使用する方法に対する取扱説明書を更に含んでもよい。本明細書中に記載したキットは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び例えば、本明細書中に記載した任意の方法で投与をおこなうための取扱説明書を伴った添付文書を含めた、商業的観点及びユーザーの観点から望ましいその他の物品を更に含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、本発明の遺伝子調節カセットを含む標的遺伝子の発現のためのｒＡＡＶ、注射に好適な医薬的に許容し得る担体、並びに次の：バッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び注射をおこなうための取扱説明書を伴った添付文書、のうちの１以上を含む。いくつかの実施形態において、キットは、眼内注射、筋肉内注射、静脈内注射などに好適である。

「相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」及び「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、本明細書中で使用される場合、２つのポリヌクレオチド配列又は２つのポリペプチド配列の間の同一性の割合を指す。一方の配列と他方の配列との間の一致は、当該技術分野において既知の技術によって決定できる。例えば、相同性は、配列情報をアラインし、そして、容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することによって２つのポリペプチド分子の直接比較により決定できる。あるいは、相同性は、相同領域間で安定した二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、それに続く、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた消化、そして、消化した断片の大きさの決定によって決定できる。２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して測定した場合に、適切な挿入又は欠失を用いて最適にアラインされた後、それぞれ、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、及び少なくとも約９５％のヌクレオチド又はアミノ酸が、規定の分子長にわたって一致すつとき、互いに「実質的に相同である」。

基準ポリペプチド又は核酸配列に関する「配列同一性の割合」は、配列のアライン及び必要に応じて、配列同一性の最大の割合を達成するためのギャップ導入後に、基準ポリペプチド又は核酸配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一の候補配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アミノ酸又は核酸配列同一性の割合を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含めた、公的に入手可能なコンピューターソフトウェアプログラムを使用して、当業者に既知の方法によって達成できる。

「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、本明細書中で使用される場合、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれか、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。よって、この用語としては、これだけに限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、多重らせんＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、或いは他の天然、化学的に若しくは生化学的に改変された、非天然、又は誘導体化ヌクレオチド塩基が挙げられる。

「異種の（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」又は「外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」とは、それが比較されるか又はそれが組み込まれるその他の実体とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異種細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞性配列（例えば、遺伝子又はその一部）は、そのベクターに対する異種ヌクレオチド配列である。

本明細書中に開示した発明の原理におけるバリエーションが当業者によって行われる可能性があり、且つ、斯かる修飾が本発明の範囲内に含まれるはずであることが意図されることを理解及び想定すべきである。以下の実施例は、本発明を更に例示するものであるが、どのような形であれ本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。本明細書中に引用されたすべての参照文献をそれらの全体として、参照によって本明細書中に援用する。

実施例１．調節遺伝子の発現に対するスプライス部位強度の効果

実験手順

プラスミド構築物：Ｌｕｃｉ−ＢｓａＩ−アクセプター：ＣＭＶプロモーターを含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩによってｐＨＡＧＥ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ−Ｗ（Harvard University）ベクターから切り離し、この断片をＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＨＤＭ−Ｇ（Harvard University）ベクター内にクローニングした。得られたベクター内のＳＶ４０ Ｏｒｉ配列を包含する断片を、ＢｓｍＩ及びＢｓｔＸＩで消化することによって欠失させ、３’オーバーハングを取り除き、そして、連結した。その後のベクターを、部位特異的変異誘導（Agilent）に供し、ＡｍｐＲ遺伝子内のＢｓａＩ部位を欠失させた。得られたベクターを、次に、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＮｏｔＩ−ＢｓａＩ−ＢａｍＨＩ部位を包含する断片に連結して、最終的なＬｕｃｉ−ＢｓａＩ−アクセプターベクターを作り出した。ｐＨＤＭ−Ｇを、スプライシングに重要でないと思われる中間部分の欠失を包含するヒトβ−グロビンイントロン２（「ＩＶＳ２Δ」）の鋳型として使用した（表５、配列番号１を参照のこと）。ｐＧＬ３−プロモーター（Promega）をホタルルシフェラーゼ遺伝子の鋳型として使用した。構築物８：ルシフェラーゼ遺伝子を、プライマーＬｕｃ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ及びＬｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩを使用して、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢｓａＩで消化し、ＢｓａＩで消化したＬｕｃｉ−ＢｓａＩ−アクセプターベクター内にクローニングした。イントロン配列の各末端に異なった５’ｓｓ及び３’ｓｓを有するイントロンＩＶＳ２Δを挿入したルシフェラーゼ遺伝子を発現するスプライシング構築物１〜７（Ｃｏｎ１〜７、配列番号１〜７）を、３つのＢｓａＩによって消化したＰＣＲ産物をＢｓａＩ消化したＬｕｃｉ−ＢｓａＩ−アクセプター内に連結することによって作製した。ｐＧＬ３−プロモーターベクターを、ルシフェラーゼ鋳型として使用し、そして、ｐＨＤＭ−Ｇを、ＩＶＳ２Δの鋳型として使用した。Ｃｏｎ１〜７のＰＣＲ断片を増幅するのに使用したプライマー対は、以下のとおりである： Ｃｏｎ１：Ｌｕｃｉ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ／Ｌｕｃｉ−スプライス−Ｒｅｖ＿１、ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｆｏｒ／ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｒｅｖ＿１及びＬｕｃｉ−スプライス−Ｆｏｒ＿１／Ｌｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩ；Ｃｏｎ２：Ｌｕｃｉ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ／Ｌｕｃｉ−スプライス−Ｒｅｖ＿２、ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｆｏｒ／ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｒｅｖ＿２、及びＬｕｃｉ−スプライス−Ｆｏｒ＿２／Ｌｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩ；Ｃｏｎ３：Ｌｕｃｉ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ／Ｌｕｃｉ−スプライス−Ｒｅｖ＿３、ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｆｏｒ／ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｒｅｖ＿３、及びＬｕｃｉ−スプライス−Ｆｏｒ＿３／Ｌｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩ；Ｃｏｎ４：Ｌｕｃｉ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ／Ｌｕｃｉ−スプライス−Ｒｅｖ＿４、ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｆｏｒ／ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｒｅｖ＿１、及びＬｕｃｉ−スプライス−Ｆｏｒ＿４／Ｌｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩ；Ｃｏｎ５：Ｌｕｃｉ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ／Ｌｕｃｉ−スプライス−Ｒｅｖ＿１、ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｆｏｒ／ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｒｅｖ＿１及びＬｕｃｉ−スプライス−Ｆｏｒ＿５／Ｌｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩ；Ｃｏｎ６：Ｌｕｃｉ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ／Ｌｕｃｉ−スプライス−Ｒｅｖ＿１、ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｆｏｒ／ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｒｅｖ＿１及びＬｕｃｉ−スプライス−Ｆｏｒ６１／Ｌｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩ；Ｃｏｎ７：Ｌｕｃｉ−Ｆｏｒ−ＢｓａＩ／Ｌｕｃｉ−スプライス−Ｒｅｖ＿１、ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｆｏｒ／ＩＶＳ２−ＢｓａＩ−Ｒｅｖ＿１及びＬｕｃｉ−スプライス−Ｆｏｒ７１／Ｌｕｃｉ−Ｒｅｖ−ＢｓａＩ。すべての構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
表１．スプライシング構築物（Ｃｏｎ１〜７）のスプライス部位。イントロン／エクソン境界を||で記した。

トランスフェクション：３．５×１０＾４個のＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクション前日に９６ウェル−平底プレート内で平板培養した。プラスミドＤＮＡ（５００ｎｇ）を、チューブ又は９６ウェル−底プレートに加えた。別々に、ＴｒａｎｓＩＴ−２９３試薬（Mirus；１．４μＬ）を、５０μＬのＯｐｔｉ−ｍｅｍＩ培地（Life Technologies）に加え、そして、室温（ＲＴ）にて５分間静置した。次に、５０μＬのこの希釈したトランスフェクション試薬を、ＤＮＡに加え、混合し、そして、室温（「ＲＴ」）にて２０分間インキュベートした。最終的に、７μＬのこの溶液を、９６ウェルプレート内の細胞のウェルに加えた。

培養細胞のホタルルシフェラーゼアッセイ：培地交換の２４時間後、プレートを、インキュベータから取り出し、研究室ベンチ内で数分間、ＲＴと平衡にさせ、次に、吸引した。Ｇｌｏ−溶解バッファー（Promega、１００μＬ、ＲＴ）を加え、プレートを少なくとも５分間ＲＴのままにした。次に、ウェル内容物を、５０μＬの粉砕によって混合し、そして、２０μＬのそれぞれのサンプルを、ｇｌｏ−溶解バッファーで１０％に希釈した２０μＬの透明なｇｌｏ試薬（Promega）と混合した。９６ウェルを乳白色の３８４ウェルプレート上に間隔をおいて配置した。ＲＴにて５分間のインキュベーションに続いて、発光を、５００ｍＳｅｃの読取り時間を用いてTecan機器を使用して計測した。ルシフェラーゼ活性を、平均相対光単位（ＲＬＵ）±標準偏差として表した。

結果

スプライシングベースの遺伝子調節プラットフォームを構築するために、発明者らは最初に、（ｉ）目的の遺伝子、この場合、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、のコード配列（ＣＤＳ）内にイントロンを挿入する効果（図１ａ）、及び（ｉｉ）遺伝子発現に対する様々な５’ｓｓ及び３’ｓｓの効果を試験した。各末端に様々な５’ｓｓ及び３’ｓｓを有する切断ヒトβ−グロビンイントロン２（ＩＶＳ２Δ）を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード配列内に挿入して、スプライシング効率を試験した。構築物Ｃｏｎ８にはＩＶＳ２Δイントロンが無く、そして、Ｃｏｎ１（配列番号１）には、その本来のＩＶＳ２ ５’及び３’ｓｓ配列を有するＩＶＳ２Δがある。構築物Ｃｏｎ２〜Ｃｏｎ７（配列番号２〜７）は、表１で列挙した様々な５’及び３’ｓｓ配列を伴ったＩＶＳ２Δを有する。図１ｂに示されるように、ルシフェラーゼ遺伝子内への天然ＩＶＳ２スプライス部位を伴ったＩＶＳ２Δの挿入は、遺伝子発現に影響しなかった（Ｃｏｎ１対Ｃｏｎ８を比較する）。しかしながら、様々な強度を有するスプライス部位配列でのＩＶＳ２ΔのＩＶＳ２スプライス部位の置換は、ルシフェラーゼ発現を有意に減少させた。図１ｂに示されるように、変更された５’ｓｓを有するＣｏｎ２及びＣｏｎ３は、Ｃｏｎ１及びＣｏｎ８と同様の発現レベルを有したが、しかしながら、Ｃｏｎ４における５’ｓｓの変化及びＣｏｎ５からＣｏｎ７までの３’ｓｓ変化は、ルシフェラーゼ発現を有意に低減した（Ｃｏｎ４〜Ｃｏｎ７をＣｏｎ８と比較する）。そのため、スプライス部位の相違は、標的遺伝子発現に影響する。Ｃｏｎ１をさらなる開発のために使用した。

実施例２．イントロン−エクソン−イントロンカセット、および、標的遺伝子発現の修飾におけるスプライシングに対するｃｉｓ−エレメントの効果

実験手順

推定上のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）配列を、ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ３．０を使用して予測した。天然５’ｓｓ（ＤＨＦＲ−ｗｔ；（表２）；配列番号４７）、Ｃに変異させた４つのヌクレオチドを有する天然５’ｓｓ（ＤＨＦＲ−ｗｔ５ｓｓＣ；（表２）；配列番号４８）、Ｃｏｎ１（ＤＨＦＲ−Ｃｏｎ１５ｓｓ；表２；配列番号４９）又はＣｏｎ４（配列番号ＤＨＦＲ−Ｃｏｎ４５ｓｓ、配列番号５０）からの５’ｓｓ配列のいずれかを伴った、イントロンフランキング配列を伴った野性型ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）エクソン２を合成した（ＩＤＴ）。ＤＨＦＲエクソン２内のＥＳＥ及びエクソンスプライスサプレッサー（ＥＳＳ）配列の効果を試験するために、様々なＤＨＦＲエクソン２変異体を合成した（表２に列挙した）。

これらの様々なＤＨＦＲエクソン２配列のすべてを、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングストラテジー（NEB）を使用してＣｏｎ１構築物内のＩＶＳ２Δイントロンのほぼ中央にクローニングした。

構築物を、ＤＮＡ配列決定（Genewiz）によって確認した。ＤＮＡを、実施例１に記載のとおりＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトし、そして、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
表２．ＤＨＦＲエクソン２を包含する改変スプライス調節配列。下線を引いた配列は、ＤＨＦＲエクソン２内の改変スプライス調節配列を示す。

結果

野性型ヒトＤＨＦＲエクソン２及び隣接したイントロン配列（配列番号８）を、Ｃｏｎ１構築物内のＩＶＳ２Δイントロンのほぼ中央に挿入した。この形状は、そこで、標的遺伝子のイントロン配列内の外来性エクソンが、選択的エクソンスプライシングを改変することによって標的遺伝子の発現が調節されることを可能にする選択的エクソンとしての役割を果たし得るプラットフォームを作り出す。この形態において（図２ａ）、スプライシング事象は、おそらく、標的遺伝子の５’部分とＤＨＦＲエクソンとの間、並びにＤＨＦＲエクソンと標的遺伝子の３’部分との間に起こり、標的遺伝子ｍＲＮＡ内へのＤＨＦＲエクソンの包含をもたらす。ＤＨＦＲエクソンがｍＲＮＡ内に含まれたときに、選択的ＤＨＦＲエクソンがインフレームで存在する未成熟終止コドンを含むので、それによって、ルシフェラーゼ遺伝子発現が低減する。しかしながら、選択的ＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓ（すなわち、３’イントロンの５末端のスプライスドナー部位）が変異するか又は利用不可能になり、この部位でのスプライシングを妨げるとき、ＤＨＦＲエクソンがｍＲＮＡから除かれるので、ｍＲＮＡが効率的に翻訳され、そして、標的遺伝子タンパク質が発現される（図２ａ）。

発明者らは最初に、変更していないその天然シスエレメント、並びに５’ｓｓ配列が強化又は弱化された他の様々なバージョンを用いてＤＨＦＲエクソン２のスプライシングを試験した。ＤＨＦＲ＿ｗｔ作製するためのＣｏｎ１のイントロン配列内への、天然５’ｓｓ及び３’ｓｓを伴ったＤＨＦＲエクソン（配列番号８）の挿入は、選択的ＤＨＦＲエクソンを含まないＣｏｎ１と比較して、ルシフェラーゼ発現を有意に減少させた。ＤＨＦＲ＿ｗｔ構築物からの発現は、Ｃｏｎ１に比べて１１６分の一である（図２ｂ）。

ＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓが、非機能性配列（ＤＨＦＲ＿ｗｔ５ｓｓＣ；配列番号４８）に変異するとき、ＤＨＦＲエクソンの包含が妨げられ、そして、ルシフェラーゼ発現は、Ｃｏｎ１のレベルに回復した（図２ａＩＩ、２ｂ、２ｃ）。

ＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓがより強力な５’ｓｓ、この場合、Ｃｏｎ１から５’ｓｓ（ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１ ５ｓｓ；配列番号４９）で置換されたとき、ＤＨＦＲエクソンの包含が増強され、Ｃｏｎ１と比べて、ルシフェラーゼ遺伝子発現の５４５分の１への減少につながった（図２ｂ）。しかしながら、Ｃｏｎ４から弱い５’ｓｓを使用したとき（ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ４ ５ｓｓ；配列番号５０）、ＤＨＦＲエクソンは含まれず、そして、ルシフェラーゼ発現は増強される（図２ｂ）。

エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）又はサプレッサー（ＥＳＳ）エレメントは、スプライシングにおいて決定的役割を担っており、そして、それらの機能は状況に依存することが多い。ＤＨＦＲエクソン内に配置された推定上のスプライシング調節配列の効果を試験した。推定上のスプライシングエンハンサー、ＤＨＦＲエクソン内に位置しているＳＲｐ４０結合部位が変異したとき（表２、ＤＨＦＲ＿ｍｔＳＲｐ４０；配列番号５１）、ＤＨＦＲエクソンの包含は劇的に高められ、Ｃｏｎ１と比較して、ルシフェラーゼ発現の２９８２分の一の減少をもたらした（図２ｃ、ＤＨＦＲ＿ｗｔおよびＤＨＦＲ＿ｍｔＳＲｐ４０）。

別のスプライシングエンハンサー、（ＥＳＥファインダーによって予測した）ＤＨＦＲエクソン内のＳＣ３５結合部位が、より強力なＳＣ３５結合配列（表２、ＤＨＦＲ＿ＳｔｒＳＣ３５、配列番号５２）へと変異したとき、ＤＨＦＲエクソンの包含が高められ、Ｃｏｎ１と比較して、１３９分の一にルシフェラーゼ発現を減少させた（図２ｃ、ＤＨＦＲ＿ｗｔＳｔｒＳＣ３５）。これは、天然ＤＨＦＲエクソン（ＤＨＦＲ＿ｗｔ、図２ｂ）を包含する構築物を用いて見られたものよりもわずかに大きい減少である。

スプライシングエンハンサー、ＳＣ３５結合部位がスプライシングインヒビター（ｈｎＲＮＰ Ａ１結合部位）（表２、ＤＨＦＲ＿ｗｔＳＣ３５ｈｎＲＮＰＡ１、配列番号５３）に変異したとき、ＤＨＦＲエクソンの包含は、増強したルシフェラーゼ発現を導く効果が低かった（図２ｃ、ＤＨＦＲ＿ｗｔとＤＨＦＲ＿ｗｔＳＣ３５ｈｎＲＮＰＡ１）。

標的遺伝子、この場合はルシフェラーゼの発現を、選択的エクソン、この場合インフレームで存在する終止コドンを包含する選択的ＤＨＦＲエクソン、の包含又は排除によって、オンかオフに切り換えられるイントロン−エクソン−イントロンカセットを作製した。選択的エクソンの包含をもたらすスプライシングが、遺伝子発現を低減する一方で、スプライシングが選択的エクソンを排除したとき、遺伝子発現は増強された。選択的エクソン５’ｓｓ、又はスプライシングを改変するエクソン内の配列の強さ又は弱さが、外来性エクソンの包含又は排除に対するそれらの影響を介して、標的発現のレベルを変化させる。

実施例３．標的遺伝子発現の調節に対する選択的エクソン５’スプライス部位におけるヘアピン形成の効果

実験手順

５’ｓｓがヘアピン構造内に埋め込まれた、天然３’及び５’ｓｓ配列を伴ったＤＨＦＲエクソン２を包含する配列を合成し（ＩＤＴ）、そして、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングストラテジー（NEB）を使用して、示したベクター内にクローニングニングした。実施例１に記載のとおり、構築物をＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトし、そして、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。

結果

発明者らは、ヘアピンステム構造内へのＤＨＦＲエクソンの５’ｓｓの埋め込みが、スプライシング及び選択的ＤＨＦＲエクソンの包含に対して影響する可能性があるか、そして、これにより標的遺伝子発現が変化するか否かを試験した（図３ａに例示した）。

Ｃｏｎ１ ５’スプライス部位（ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓ；配列番号４９）配列を伴った選択的ＤＨＦＲエクソンの包含は、Ｃｏｎ１（図３ｃ、ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓ）と比較して、ルシフェラーゼ発現を無効にした。５’ｓｓの全配列を埋め込んだ１５塩基対（ｂｐ）のヘアピン構造を、ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ １５ｓｓ内に設計して、ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ １５ｓｓ＿ＨＰ１５（配列番号５４）を作製した（図３ａ）。１５ｂｐのヘアピン構造の存在が、Ｃｏｎ１レベルまでルシフェラーゼ発現を完全に回復し、ヘアピンが５’ｓｓのアクセシビリティを無効にし、それによって、選択的ＤＨＦＲエクソンの包含を無効にした（図３ｃ、Ｃｏｎ１、ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓとＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓ＿ＨＰ１５）。

対照的に、「壊れたステム（ｂｒｏｋｅｎ ｓｔｅｍ）」を有する１５ｂｐのヘアピン（図３ｂ、Ｃｏｎ１５ｓｓ＿１５ＨＰｘ、配列番号５５）は、ルシフェラーゼ発現を回復できず（図３ｃ、ＤＨＦＲ＿Ｃｏｎ１５ｓｓ＿ＨＰ１５ｘ）、完全なステムが、５’スプライス部位のアクセシビリティを調節し、それによって、選択的エクソンの包含又は排除を決定する際のＲＮＡの二次構造に重要な成分であることを示唆している。

同じ実験を、増強されたスプライシング効率を有する変異ＳＲｐ４０結合部位を伴ったＤＨＦＲエクソンを含む構築物を使用して実施した（ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０、実施例２を参照のこと）。ヘアピン内へ５’ｓｓを埋め込むことで、ルシフェラーゼ発現は回復したが、その一方で、ヘアピンを壊すことは、ルシフェラーゼ発現をブロックした（図３ｃ、ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０、ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０Ｈ＿Ｐ１５、及びＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０＿ＨＰ１５ｘ）

よって、ヘアピン構造内への選択的エクソンの５’ｓｓの埋め込みは、その５’ｓｓのアクセシビリティを妨げ、それによって、ｍＲＮＡ内への選択的エクソンの包含を妨げ、そして、標的遺伝子タンパク質の発現を可能にすることによって標的遺伝子発現を回復させることができる。標的遺伝子タンパク質の発現が、二次ＲＮＡ構造を介して外来性選択的エクソンの５’ｓｓの利用可能性を変更することによって調節することができる、遺伝子発現プラットフォームを作製した。

構築物ＤＨＦＲ＿ｗｔｍｔＳＲｐ４０（配列番号５８）（以降、「ｍｔＤＨＦＲ」とも呼ぶ）を、更なるリボスイッチ開発のために使用した。

実施例４．選択的スプライシングを介して標的遺伝子発現を調節するためのテオフィリンアプタマーの使用

実験手順

様々な長さを有するヘアピンステムに結合したアプタマー配列のクローニングを容易にするために、ＤＨＦＲ−アクセプターベクターを構築した。使用したテオフィリンアプタマー配列は：ggcgatacCAGCCGAAAGGCCCTTGgcagcgtc（配列番号９）であった。５’末端に４ヌクレオチドのオーバーハングを有するテオフィリンアプタマーオリゴヌクレオチド（「ｏｌｉｇｏｓ」）を合成し（ＩＤＴ）、アニーリングし、ＢｓａＩで消化したＤＨＦＲ−アクセプターベクターに連結した。実施例１に記載のとおり、テオフィリンアプタマーを包含する調節カセット伴ったルシフェラーゼレポーター構築物で、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に、培地を吸引し、そして、３ｍＭのテオフィリンを含む又は含まない新しい培地を加え、そして、テオフィリン処理の２０〜２４時間後に、ルシフェラーゼをアッセイした。誘導倍率を、アプタマーリガンド存在下で得られたルシフェラーゼ活性をアプタマーリガンド不存在下で得られた値で割った商として表した。ルシフェラーゼ活性のレベルを、ルシフェラーゼ遺伝子のＣＤＳ内にＩＶＳ２ΔイントロンがないＣｏｎ１構築物によって産生されたルシフェラーゼ活性のレベル（最大発現と見なされる）のパーセントとして表した。

結果

終止コドン包含選択的エクソンの５’スプライス部位のアクセシビリティを調節し、それによって、標的遺伝子タンパク質の発現を調節するために、アプタマー配列を、ＤＨＦＲ５’ｓｓのイントロン部分及びその相補配列を埋め込んだヘアピン構造のステムに取り付けた。この形態において、アプタマー配列の挿入は、ヘアピンステムの形成を妨げ、ＤＨＦＲ５’ｓｓをアクセス可能なままにし、これにより、選択的ＤＨＦＲエクソンの包含をもたらし、そして、標的遺伝子タンパク質の発現を妨げる（図４ａ）。図４ｂで示したように、アプタマー／リガンド結合が起こるとき、リガンド結合によって引き起こされるアプタマーの構造変化が、安定したステム形成のためにＤＨＦＲ５’ｓｓとその相補的配列がまとまり、これにより、ＤＨＦＲ５’ｓｓを隠し、ＤＨＦＲエクソンを排除し、そして、標的遺伝子タンパク質の発現をもたらす。

テオフィリンアプタマーの弱いステムをヘアピンステムに直接連結することによって、テオフィリンアプタマーを試験した（図４ｃ、ＤＨＦＲ＿Ｔｈｅｏ１）。ステムが長過ぎる場合、それは、アプタマー／リガンド結合の不存在下で安定した構造を形成し得るが、それに対して、短すぎる場合、それは、リガンドの存在下であっても、安定したステムを決して形成しない。そのため、安定した二次構造がアプタマー／リガンド結合に対してのみ形成されるように、ステムの長さが最適化される必要がある。リガンドの存在下ではステム形成を可能にするが、リガンドの不存在では形成されない、最適なステム長を決定するために、テオフィリンアプタマーをｍｔＤＨＦＲ（実施例２の表２に記載）内にクローニングし、一連のステムの切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を実施した、多くの構築物を作製した。図４ｃは、この一連の切断の４種類の構築物を示す。

図４ｄは、テオフィリンの存在又は不存在下、この欠失シリーズの構築物からのルシフェラーゼの発現を示す。２０ｂｐから下は９ｂｐまでのステム長を有するテオフィリン１からテオフィリン１２までの構築物では、ステム長は、アプタマー／リガンド結合の不存在下でさえ安定した二次構造を形成するのに十分であった。これにより、ルシフェラーゼ発現が、テオフィリンの存在下及び不存在下の両方で、Ｃｏｎ１と同様のレベルが見られた。

構築物ＤＨＦＲ＿Ｔｈｅｏ１３では、ルシフェラーゼ発現は、テオフィリンの不存在下で抑制された。これは、選択的ＤＨＦＲエクソンの包含及び遺伝子発現の抑制につながる、ｍｔＤＨＦＲエクソン５’ｓｓの利用可能性を示す。しかしながら、テオフィリンの存在下、ルシフェラーゼ発現がオンに切り替えられ、テオフィリンを用いない発現レベルの４３倍、及びＣｏｎ１対照ベクターによって発現されるルシフェラーゼレベルの約５６％の誘導をもたらした。そのため、アプタマーリガンド、テオフィリンの存在下で標的遺伝子タンパク質の発現を有効にする、哺乳類のオン−リボスイッチが作製された。

実施例５．選択的スプライシングを介して標的遺伝子発現を調節するためのｘｐｔグアニンアプタマーの使用

実験手順

以下の配列：
cactcatataatCGCGTGGATATGGCACGCAAGTTTCTACCGGGCACCGTAAATGTCcgactatgggtg（配列番号１０）
を有するＸｐｔ−グアニンアプタマーを、リボスイッチを構築するのに使用した。グアニンアプタマー及び４ヌクレオチドの５’オーバーハングを有するヘアピンステムの配列を含むＯｌｉｇｏｓを合成し（ＩＤＴ）、アニーリングし、次に、ＢｓａＩで消化したＤＨＦＲ−アクセプターベクターに連結した。実施例１に記載のとおり、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に、培地を吸引し、５００μΜのグアニンを含む又は含まない新しい培地を加えた。グアニン処理の２０〜２４時間後に、実施例１及び実施例４に記載のとおり、ルシフェラーゼ発現をアッセイした。ＨｅｐＧ２、ＡＭＬ１２、ＲＤ、及びＣ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ）を、ＡＴＣＣによって推薦されたプロトコールを使用して培養した。ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチ（配列番号１５）を包含するイントロン−エクソン−イントロンカセットを、Ｇｉｂｓｏｎクローニングストラテジー（NEB）を使用して、抗ＫＤＲ抗体遺伝子のリーダーペプチド配列及びマウスエリスロポエチン遺伝子内のＳｔｕＩ部位内に挿入した。マウスエリスロポイエチン（Ｅｐｏ）又は抗ＫＤＲ抗体を含む構築物を、ＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に、培地を吸引し、５００μΜのグアニンを含む又は含まない新しい培地を加えた。上清を、抗ＫＤＲ抗体の産生又はマウスＥｐｏの産生のいずれかに関するＥＬＩＳＡアッセイ（R&D Systems）に供した。

結果

選択的スプライシングのアプタマー媒介性調節によって標的遺伝子発現を制御するための追加のアプタマー／リガンドの使用を、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のｘｐｔ−グアニンアプタマーをステムＰＩからヘアピンステムまで取り付けることによって試験した（図５ａ、ＤＨＦＲ＿Ｇ１）。実施例４と同様に、１８種類の構築物を、
接続ステムの一連の切断によって作製し（図５ａ及び５ｂ、ＤＨＦＲ−Ｇ１〜Ｇ１８、調節カセットを包含したｘｐｔ−Ｇ１〜Ｇ１８とも呼ばれる）、グアニンアプタマーに関して最適な長さのヘアピンステムを得、これにより、アプタマー／リガンド結合の連絡が５’ｓｓアクセシビリティとエクソンスプライシングを可能にした。図５ｂに示されるように、２４ｂｐから下は１２ｂｐまでのステム長を有する、構築物ＤＨＦＲＧ１〜Ｇ１３によると、ルシフェラーゼ発現は、アプタマーリガンドであるグアニンの存在又は不存在下、選択的ＤＨＦＲエクソン及びｘｐｔ−グアニンアプタマーの挿入の影響を受けない。このことは、ステムの長さが、リガンドの不存在下と存在下の両方で安定した構造を形成するのに十分であり、ｍＲＮＡ内への選択的エクソンの包含を妨げること示唆する。しかしながら、構築物ＤＨＦＲ＿Ｇ１４〜ＤＨＦＲ＿Ｇ１８では、ルシフェラーゼ発現は、追加グアニンの不存在下で抑制された。μΜのグアニンを加えたとき、これらの構築物からのルシフェラーゼ発現が誘導された（図５ｂ）。

構築物Ｇ１１〜Ｇ１８の更なる厳格な確証は、グアニン処理によるルシフェラーゼ発現の明らかな調節を再び示した（図５ｃ）。ｘｐｔ−Ｇ１７（配列番号１５）（図５ａ）を包含するＤＨＦＲ＿Ｇ１７構築物は、発現の２０００倍の誘導を示し、Ｃｏｎ１（最大発現と見なされる）によって発現されたルシフェラーゼレベルの約６５％をもたらした。誘導のこの高いダイナミックレンジは、リガンドの不存在下での非常に低い非誘導ベースラインレベルの発現の活性化からもたらされた。構築物ＤＨＦＲ＿Ｇ１６（図５ａ）は、非誘導ベースライン発現に対して約８００倍の誘導を生じ、最大発現の８３％のレベルであった（図５ｃと５ｄ）。加えて、構築物ＤＨＦＲ＿Ｇ１４及びＧ１５は、ルシフェラーゼのより高い非誘導ベースライン発現により低い誘導倍率で、最大発現の約１００％を示した。

イントロン−エクソン−イントロンカセット内の合成リボスイッチの全般的な機能性及び適用可能性を試験するために、発明者らは、構築物（ＤＨＦＲ＿Ｇ１７）を包含するｘｐｔ−Ｇ１７を複数のヒト及びマウス細胞株にトランスフェクトした。これらの様々な細胞株では、グアニン処理は、ＨｅｐＧ２細胞では５００倍超の誘導で、他の細胞株では低い誘導倍率で、遺伝子発現の有意な誘導を生じた（図５ｅ）。様々な細胞株における様々な誘導倍率は、トランスフェクション効率、並びに細胞型に特有のスプライシング調節物質の発現プロファイルの違いを反映している可能性がある。更に、ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチ（ＤＨＦＲ＿Ｇ１７）を包含する調節カセットを伴うルシフェラーゼ遺伝子は、ＡＡＶ骨格に移入されたとき（図５ｆ）、同じレベルの誘導を得、遺伝子調節効果がベクター骨格に依存していないことを示した。

ルシフェラーゼ遺伝子の調節に加えて、ｘｐｔ−Ｇ１７包含調節カセットはまた、分泌タンパク質、抗ＫＤＲ抗体及びエリスロポイエチン（Ｅｐｏ）調節においても試験した。ｘｐｔ−Ｇ１７包含調節カセットを、抗ＫＤＲ抗体及びエリスロポイエチンのコード配列内に挿入した。図５ｇ及び５ｈに示されているように、グアニン処理は、リガンド不存在下の細胞からのそれぞれの分子の産生と比較して、抗のＫＤＲ抗体産生における８０倍の誘導及びＥｐｏ産生における１４０倍の誘導をもたらした。

これらの結果は、ＡＡＶ介在性遺伝子送達における潜在的治療標的遺伝子のタンパク質発現調節、及びこの遺伝子調節カセットの適用における全般的な機能性及び適用可能性を実証する。これにより、発明者らは、哺乳動物細胞内でのアプタマー特異的リガンドの存在に対応した標的遺伝子タンパク質発現に対してスイッチングが可能である合成哺乳類「オン」−リボスイッチを作り出した。

実施例６．様々なプリンアプタマーを、選択的スプライシングを介して標的遺伝子発現を調節するのに使用し得る。

実験手順

表３で列挙した以下のアプタマー配列を、リボスイッチを構築するのに使用した：
表３

結果

発明者らの遺伝子調節システムにおいて追加アプタマーを試験するために、発明者らは、様々なグアニン及びアデニンアプタマーをイントロン−ｍｔＤＨＦＲ−イントロンカセットに連結することによって複数のグアニン及びアデニン応答性リボスイッチを作り出すために、先の実施例に記載と同じストラテジー及び方法を使用した（図６ａ）。試験したグアニンリボスイッチは、グアニンに対応してルシフェラーゼ遺伝子の発現を効率的に調節した（図６ｂ）。更に、発明者らは、これらのグアニンリボスイッチが、グアニン（図６ｂ）だけではなく、グアノシン（図６ｃ）、及び２デオキシグアノシン（２’ｄＧ）（図６ｄ）にも応答して標的遺伝子の発現を調節したことを発見した。

多数のアデニンリボスイッチ（図６ａ）を作り出し、そしてまた、遺伝子調節機能性も実証した（図６ｅ）。

試験した構築物を包含する様々なアプタマーの遺伝子発現調節における相違は、５’ｓｓのアクセシビリティ、選択的エクソンの包含、そのため、標的遺伝子発現に影響し得るアプタマー／リガンド結合親和性及びアプタマー二次構造における相違を反映している可能性がある。イントロン−エクソン−イントロン遺伝子調節カセットは、所望のレベルの遺伝子調節を達成するためにアプタマー配列を変更することによって最適化できる。

実施例７．哺乳類のグアニンリボスイッチによって調節される標的遺伝子発現のオン／オフの状況

実験手順

イントロン−ｍｔＤＨＦＲ−アプタマー−イントロンカセットを、ＰＣＲ増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングストラテジー（NEB）を使用してｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター内にクローニングした。リボスイッチを用いてＥＧＦＰを安定して発現する細胞株を入手するために、ＨＥＫ−２９３細胞を、２０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いてエレクトポレーション処理した。エレクトロポレーションの４８時間後に、細胞培養物を、カセットを安定して発現する細胞について、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて２週間選別した。細胞をトリプシン処理し、そして、細胞懸濁液を、Guava EasyCyte 8HT機器を使用してＧＦＰ蛍光強度のフローサイトメトリー解析に供した。得られたデータを、GuavaSoft2.2.2を使用して分析した。

結果

発明者らのイントロン−エクソン−イントロン調節カセットを包含する標的遺伝子の発現が、リボスイッチ内に包含されたアプタマーに特異的なリガンドへの曝露によって調節できることを更に実証するために、ｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチ（配列番号１５）を含むイントロン−ｍｔＤＨＦＲ−イントロンカセットを、ＥＧＦＰ遺伝子内に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞を安定的にトランスフェクトした。グアニンの存在下、ＥＧＦＰ発現はオンに切り替えられた（図７ａ）。蛍光は、グアニン処理後６時間にはもう検出され、３日間のグアニン処理を通じて増加し、そして、未処理細胞と比較して、３００倍近い誘導に達し（図７ｂ）、そして、アプタマーリガンドの存在下で標的遺伝子発現の「オン」状態を示した。グアニンが細胞培養から取り除かれたとき、ＥＧＦＰ発現は減少し、そして、アプタマー特異的リガンドの不存在下での標的遺伝子発現の「オフ」状態を示した（図７ｂ）。これにより、発明者らは、それによって哺乳動物細胞内における標的遺伝子の発現が、特異的アプタマーリガンドの存在又は不存在によって調節される、合成リボスイッチを包含するイントロン−エクソン−イントロンカセットを含んだ遺伝子調節プラットフォームを作製した。

実施例８．標的遺伝子発現の調節に対する複数の調節カセットの効果

実験手順

Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングストラテジー（NEB）を使用して、構築物を作製した。ＨＥＫ２９３細胞を示した構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションの４時間後に、５００μΜのグアニン又は１ｍＭのグアノシン（Sigma）で処理した。ルシフェラーゼ活性を、実施例５に記載のとおりアッセイした。

結果

調節カセット（ＤＨＦＲ＿Ｇ１５、実施例５）を包含するｘｐｔ−Ｇ１５（配列番号４６）を伴った構築物は、非誘導のベース発現レベルと比較して、グアニン処理に応答してルシフェラーゼ発現の６０倍の誘導を示し、そして、Ｃｏｎ１によるルシフェラーゼ発現のレベルの約１００％に達した（図８ａ）。これは、高レベルで必要とされる治療用タンパク質を調節するときに、有用な特徴である。

対照的に、調節カセット（ＤＨＦＲ＿Ｇ１７）を包含するｘｐｔ−Ｇ１７を伴った構築物は、低い非誘導ベースライン発現のせいで、２１８１倍のかなり高い誘導倍率を有したが、Ｃｏｎ１と比較して、誘導による最大発現レベルはかなり低かった（図８ａ）。

２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５を包含する調節カセット（ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル；配列番号６４）が、誘導による最大ルシフェラーゼの最大発現レベルを下げることなく、発現の基礎レベルを低減できるか否かを試験するために、２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５を包含する調節カセットをルシフェラーゼ遺伝子内に埋め込み、各コピーを該遺伝子配列内の別の場所に埋め込んだ。２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５を包含する調節カセットが存在するとき、非誘導ベースライン発現は減少し、最大発現レベルを下げることなく、かなり高い誘導倍率（６０倍〜１００８倍）をもたらした（図８ａ）。

ｘｐｔ−Ｇ１５ダブルカセット（ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル；配列番号６４）に関するグアニンのＥＣ５０は、単一コピーのよりストリンジェントなｘｐｔ−Ｇ１７包含カセットを包含する構築物に関するグアニンのＥＣ５０と比べて、５分の一であり（４３μΜ対２０６μΜ）、これにより、リガンド応答の感度は増強された（図８ａ）。

誘導倍率及び最大誘導遺伝子発現を高めるために、２コピーの低ストリンジェント調節カセットを使用するストラテジーを、ＥＧＦＰ遺伝子にも適用した。図８ｂ及び８ｃに示されるように、ルシフェラーゼ調節の結果と一致して（図８ａ）、ＥＧＦＰ遺伝子（ＥＧＦＰ−ｘｐｔ−Ｇ１５）内の単一コピーのｘｐｔ−Ｇ１５調節カセットは、構築物（ＥＧＦＰ−ｘｐｔ−Ｇ１７）を包含するｘｐｔ−Ｇ１７調節カセットと比較したときに、ＥＧＦＰ発現のより高い非誘導ベースラインレベルを作り出した。しかしながら、２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５調節カセットを、別の配置にてＥＧＦＰ遺伝子内に挿入したとき（ＥＧＦＰ−ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル）、非誘導ベースライン発現レベルは、ｘｐｔ−Ｇ１７のレベルまで減少し、同時に、ＥＧＦＰの誘導レベルは、Ｃｏｎ１−ＥＧＦＰ対照より高くさえあった（図８ｃ）。

更に、１コピーのｘｐｔ−Ｇ１７を包含する調節カセットと１コピーのＹｄｈｌ−Ａ５アデニンリボスイッチを包含する調節カセットを、ルシフェラーゼ遺伝子内に埋め込んだ。ルシフェラーゼ発現は、アデニンの添加（２５倍）又はグアニンの添加（１２０倍）のいずれか単独で誘導されたが、しかしながら、有意に高いレベルの誘導は、それぞれそれらが使用した最高濃度でのアデニンとグアニンの併用を用いて達成された（最高２９６６倍）（図８ｄ）。これらの結果は、標的遺伝子発現の調節における選択的スプライシングベースのリボスイッチのモジュール性を実証する。

遺伝子組み換えを減らし、且つ、２以上の調節カセットを包含するウイルスベクターの製造の容易さを高めるために、様々なイントロン及びエクソン配列を伴った調節カセットを、単一の標的遺伝子に使用され得るので、これらは、同一又は異なるガンド応答性アプタマーを含み得る。

実施例９．アプタマー媒介性選択的スプライシングを介した標的遺伝子発現調節に対するイントロンサイズ及び配列の効果

実験手順

Ｃｏｎ１構築物を、上流又は下流イントロン欠失のいずれかを有するイントロン断片のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。単一のイントロン欠失を有する構築物を作り出すために、ＰＣＲ産物を、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングストラテジー（NEB）を使用してｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを包含する構築物内にクローニングした。上流及び下流イントロン欠失の両方を有する構築物を作り出すために、下流イントロン配列内に単一の欠失を有する構築物からＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩによって切り離した断片を、上流イントロン配列内に単一の欠失を有するＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した構築物内にクローニングした。

結果

イントロンは、エクソンスプライシングを促進し得る（イントロンスプライシングエンハンサー、ＩＳＥ）又は抑制し得る（イントロンスプライシングサプレッサー、ＩＳＳ）エレメントを包含する。発明者らが作り出したすべてのリボスイッチの中で、ｘｐｔ−Ｇ１７が、誘導倍率及び誘導された遺伝子発現レベルの両方に関して最高の調節能力を実証した。イントロン−エクソン−イントロンカセットでｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチを使用して、発明者らは、システムを更に最適化するために、イントロン配列及びイントロンの長さ、並びにスプライス部位において一連の修飾をおこなった。

最初に、イントロン修飾の効果を、ｍｔＤＨＦＲエクソンの上流又は下流のいずれかのイントロン配列内に単一の欠失を導入することによって試験した（図９ａ、９ｂ）。リボスイッチを包含するｘｐｔ−Ｇ１７を伴った１６種類の構築物、ｘｐｔ−Ｇ１７−ＩＲ−１〜ｘｐｔ−Ｇ１７−ＩＲ−１６（これらの構築物のうちの１３個の配列を表５、配列番号１６〜２８に示す）を作製した。次に、図９ｃで示したように、上流及び下流イントロン欠失を組み合わせて、より大きいイントロン欠失を作り出した。図９ｄ及び９ｅに示されるように、２つのイントロン欠失（２ＩＲ）で作製した１６種類の構築物、構築物２ＩＲ−１〜２ＩＲ−１０（配列番号２９〜３８）は、ルシフェラーゼの誘導発現レベルを下げることなく、有意に高い誘導倍率を示し、２ＩＲ−３に誘導倍率の最大の改善があった（４７４４倍）。加えて、発明者らはまた、ｍｔＤＨＦＲエクソンの上流に変異３’ｓｓを有する構築物も作製し、そしてまた、下流イントロンのサイズも減少させた。図９ｄ及び９ｅ（構築物ＤＨＦＲ＿３ｓｓＣ＿１〜５）に示されるように、これらの改変は、相対誘導倍率を更に改良したが、それにもかかわらず、この場合、誘導された発現のレベルの低減が観察された（３ｓｓＣ＿３に関して６４％から３２％へ）。

これらの結果は、イントロン−エクソンアプタマー−イントロンカセットの遺伝子調節能力が、所望のレベルの遺伝子調節を達成するために選択的エクソンに隣接したイントロン配列を改変することによって最適化され得ることを示す。

実施例１０．遺伝子調節カセットにおける複数の天然エクソン並びに合成エクソンの使用

実験手順

変異ヒトＷｉｌｍｓ腫瘍１エクソン５（ｍｕｔＷＴ１−ｅ５、配列番号６１）、ＳＩＲＴ１エクソン６（ＳＩＲＴ１−ｅ６、配列番号６２）、マウスカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタエクソン１６、又は１７（Ｃａｍｋ２ｄ−ｅ１６又はｅ１７、配列番号５９、６０）、及び合成エクソンＥＮＥＥＥ（配列番号６３）の配列を合成し（ＩＤＴ）、Ｇｉｂｓｏｎクローニングキット（NEB）を使用して、ＤＨＦＲエクソンの代わりにＤＨＦＲ−Ｇ１７ベクター内にクローニングした。プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトし、５００μΜのグアニンによって処理し、そして、ルシフェラーゼアッセイを、実施例１に記載の通り行った。５’及び３’スプライス部位を有するそれぞれのエクソンの配列は、大文字のエクソン配列と共に示されている（表５、配列番号５９〜６３）。

結果

発明者らのイントロン−エクソン−アプタマー−イントロンカセットの調節機能が特定のエクソン配列に制限されないことを確認するために、発明者らは、グアニンｘｐｔ−Ｇ１７リボスイッチ（ＤＨＦＲ−ｘｐｔ−Ｇ１７）を包含する構築物内のｍｔＤＨＦＲエクソンを、複数の様々な天然及び変異エクソン、並びに既知のエクソンスプライスエンハンサー配列（ＥＳＥ）を包含する合成エクソンで置換した。図１０に示されているとおり、ＣａｍｋＩＩｄ−ｅ１６エクソンを伴った調節カセットは、ＤＨＦＲ−ｘｐｔ−Ｇ１７と比較して、ほとんど同等な誘導倍率を生じたが、ベース及び誘導ルシフェラーゼ発現の両方で低レベルであった。他のエクソンを包含するカセットもまた、ベース及び誘導ルシフェラーゼ発現の両方で変わりやすいレベルを示した。これにより、アプタマー媒介性選択的スプライシング遺伝子調節カセットは、エクソン特異的でなく、またｍＤＨＦＲ−ｅ２エクソンに限定されない。

効果的な選択的スプライシング事象を作り出すことができるエクソンは、アプタマー介在性遺伝子調節カセットに好適である。これらの結果は、このイントロン−エクソンアプタマー−イントロンカセットの遺伝子調節能力が、選択的エクソン内の配列、並びに周囲のイントロン配列、例えば、選択的エクソンの５’ｓｓ及び３’ｓｓ配列のスプライシング強度、並びに本明細書中に記載の選択的エクソン内のＥＳＥ及びＥＳＳ配列、を改変することによって最適化できることを更に示す。

実施例１１．マウスのｉｎ ｖｉｖｏにおけるアプタマー媒介性選択的スプライシングによる標的遺伝子発現の調節

実験手順

水圧ＤＮＡ送達（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）と薬物療法：生理的食塩水（Qiagen Endofreeキット）中に希釈した、２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５を包含する調節カセット（ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル、配列番号６４、実施例８、図８ａ）を伴ったルシフェラーゼ遺伝子を包含するエンドトキシン不含プラスミドＤＮＡ５μｇ又は１０μｇを、６〜７週齢のＣＤ−１雌マウスに５〜１０秒かけて１０％体重の体積で尾静脈を通して注射した。グアノシン（Sigma）を、水中の０．５％のメチルセルロース／０．２５％のＴｗｅｅｎ８０（Sigma）中に新たに懸濁し、そして、ＤＮＡ注射後２時間又は１２時間に経口投与されるか、又はＤＮＡ送達後、５時間、１２時間、１６時間、及び２４時間に腹腔内注射（ＩＰ）によって送達された。

非侵襲性の生きた動物の生物発光造影：造影前に、マウスを、２％のイソフルランで麻酔し、１５０ｇｍ／ｋｇ体重のルシフェリンを注射し、そして、ルシフェリン注射後２〜５分以内に、ＤＮＡ注射後の示された時点にてBruker Xtremeシステムを使用して像を撮影した。ルシフェラーゼ活性を平均光子／秒±ｓ．ｄとして表した。誘導倍率を、グアノシンで処理したマウスで得られた光子／秒を、グアノシン処理なしのマウスで得られた値で割った商として計算した。

結果

発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてマウスにおけるイントロン−エクソン−イントロン調節カセットの遺伝子調節機能を評価した。ルシフェラーゼ遺伝子内に２コピーのｘｐｔ−Ｇ１５リボスイッチを包含する構築物（ｘｐｔ−Ｇ１５ダブル）のエンドトキシン不含プラスミドＤＮＡを、水圧注射によってマウスの肝臓に送達し、そして、グアノシンを腹腔内に投与した。発明者らは、グアノシン送達の２つの経路を試験した。１つの実験（図１１ａ及び１１ｂ）では、マウスに、ＤＮＡ送達後２時間と１２時間で様々な用量のグアノシンを経口的に投与し、次に、撮影した。図１１ａに示されるように、グアノシンによって処理したマウスは、ＤＮＡ後９時間により高いルシフェラーゼ発現を示した。グアノシン処理したマウスにおけるルシフェラーゼ発現は、徐々に増加し、そして、ＤＮＡ注射後４８時間に最高レベルに達し、その後、発現は減少した。

別々の実験で（図１１ｃ及び図１１ｄ）、グアノシンを腹腔内に投与した。ＤＮＡ注射（Ｐ．Ｉ．）の４時間後、及び、グアノシン処理前に、各群のマウスは同様のレベルのベースのルシフェラーゼ活性を示した（図１１）。次に、マウスを、対照としてのビヒクル又はグアノシンのいずれかによって処理した。Ｐ.Ｉ.の１１時間で、すべてのマウスでルシフェラーゼ活性が増加し、ルシフェラーゼ遺伝子発現は、肝臓におけるＤＮＡ水圧注射後１２時間でピークに達するという報告と一致した。しかしながら、グアノシンによって処理したマウスでは、未処理のマウスのそれと比較して、有意に高いレベルのルシフェラーゼ発現があり、非誘導ベースライン発現と比較して、４．７倍及び１６．２倍の誘導が、それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び３００ｍｇ／ｋｇのグアノシンによって見られた。

これにより、スプライシングベースの遺伝子調節カセットは、調節カセット内に包含されたアプタマーに特異的なリガンドの投与に対応して、用量依存様式で、動物体内のｉｎ ｖｉｖｏにおいて遺伝子発現を調節することが示された。

実施例１２．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介したマウス網膜へのリボスイッチ構築物の送達

実験手順

ＡＡＶプラスミド構築物：（以下の表に記載の）２つのリボスイッチ発現構築物を、ＡＡＶゲノムとしてパッケージできる形式に分子クローニングによって適合させた。
表４

ＥＧＦＰ導入遺伝子を中心にベースとした発現構築物（ＧＴＸ５〜７）を、制限酵素ＭｆｅＩとＮｈｅＩで消化し、リボスイッチ誘導性エレメント及びＥＧＦＰ導入遺伝子を包含する〜１４００ｂｐのＤＮＡ断片を切り離した。ｐＤ１０ ＡＡＶゲノムプラスミドもまた、ＭｆｅＩとＮｈｅＩで消化し、ＡＡＶ ＩＴＲｓ、ＣＭＶプロモーター、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを包含する４４７５ｂｐの断片を切り離した。２つの断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結し、ＡＡＶ２ゲノムとしてパッケージされることが可能である、以下の構造：
［ＩＴＲ］−［ＣＭＶ］−［５’ＥＧＦＰ］−［リボスイッチエレメント］−［３’ＥＧＦＰ］−［ＳＶ４０］−［ＩＴＲ］
を有するプラスミド包含配列をもたらす。

得られたプラスミド構築物すべてを、ＤＮＡ配列決定によって確認し、そして、以下の規則に従って命名した：ｐＤ１０−ＧＴＸ＃

ＡＡＶベクター製造と力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、３つのプラスミドを用いたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによってｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて製造した。
（ｉ）ｐＤ１０骨格ベースのウイルスゲノムプラスミド。
（ｉｉ）ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８遺伝子及びウイルスカプシド遺伝子を包含するＡＡＶパッケージングプラスミド。多くの様々なＡＡＶ血清型が、カプシド遺伝子配列を変更することによって作製され得るが、本ケースの場合、ＡＡＶ８カプシドを使用した。
（ｉｉｉ）ヘルパープラスミド（ｐＨＧＴＩ−Ａｄｅｎｏ１）。このプラスミドは、ＡＡＶがパッケージ及びアッセンブルを必要とするアデノウイルス遺伝子のほぼ最小限のセットを提供する。

これらのプラスミドを、１：１：３の比でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内にトランスフェクトし、１５０ｃｍ²プレートの８０〜９０％コンフルエントあたり、合計５０μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。典型的な製造作業は、斯かるプレート２０枚から行った。使用したトランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、２．２５：１（ｗ／ｗ）のＰＥＩ対ＤＮＡ比であった。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を、プレートから物理的に剥がし、遠心分離によってペレットにし；得られた細胞ペレットを、２０ｍＬのＴＲＩＳ密度バッファー中に再懸濁した。次に、ペレットを、反復凍結／解凍／ボルテックスサイクルによって溶解させ、そして、溶解物中に残っている任意のパッケージされていないＤＮＡをベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）消化によって破壊した。次に、溶解物を、５０ｍＬの全量まで希釈する前に、デッドエンド濾過及び遠心分離によって浄化した。

次に、浄化した溶解物を、事前にプログラムされたプロトコールに従って作動するAKTA Pure装置のＡＶＢカラム（両方GE Healthcare）を使用して、親和性ベースのＦＰＬＣ手順を介して精製した。ＦＰＬＣカラムからの最終的なＡＡＶ包含溶出液を、１０,０００ＭＷ排除Vivaspin4遠心濃縮器（GE Healthcare）中の５０００×ｇでの遠心分離によって〜２００μＬの体積まで濃縮し、（高塩類溶出緩衝液を希釈するために）２ｍＬのＰＢＳ−ＭＫを加え、そして、溶出液を、同じ濃縮器を使用して〜２００μＬまで再濃縮した。この材料は、精製したＡＡＶウイルスを構成し、そして、適切な場合には、アリコートに分け、そして、−８０℃にて保存した。

ベクター力価を、精製したベクターのサンプルに直接（ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに対して標的化した）ｑＰＣＲを使用して確立した。得られたサイクル閾値を、既知の検量線と比較して、１ｍＬあたりのベクターゲノムの数を計算した。

リボスイッチＡＡＶベクターを、以下の規則に従って命名した：
ＡＡＶ２／［カプシド 血清型＃］−ＧＴＸ＃

マウスの網膜下注射：網膜下腔内へのベクターの注射を、５μＬのハミルトンシリンジに装着した、手引書に指示された１０ｍｍ、３４ゲージ針を使用して、全身麻酔下のマウスに対して実施した。針チップを、手術用顕微鏡を介した網膜観察によって注射位置に誘導した。ベクターを導入するすべての眼において、２×２μＬの注射を実施し、一方の注射は眼の上半球に配置し、他方を下半球に配置した。注射後、得られた網膜剥離の特質及び注射した材料の何らかの逆流を記録した。

蛍光眼底写真：網膜下注射に続いて、ＥＧＦＰ導入遺伝子発現を、取り付けられたライカＤＣ５００デジタルカメラを有するスリットランプ（SC16、Keeler）を使用したＦｕｎｄｕｓ写真によって定期的に評価した。動物を、全身麻酔下におき、それらの瞳孔を、１％の局所トロピカミドで散大させた。接触媒質溶液（Viscotears）で被覆した角膜上にカバーガラスを置くことによって、角膜の屈折力を中和した。明るい白色光の下、器具を調整し、及び動物を配置した。網膜が鮮明なフォーカス下にあり、及び視神経円板を視界の中心に置き、次に、明視野像を２００ｍｓの露出時間を使用して撮像した。導入遺伝子（ＥＧＦＰ）蛍光を、光源のフィルタリング（４７５±２５ｎｍ）によって評価し、そして、１０〜３０秒の露出時間で２枚の更なる像を撮像した。

結果

リボスイッチ構築物（表４）は、連結産物のＤＮＡ配列決定によって示されたとおりＡＡＶゲノムとしてパッケージされることができるフォーマットにうまくクローニングされた。得られた構築物から、ｐｄ１０−ＧＴＸ７及びｐｄ１０−ＧＴＸ５を、ＡＡＶ２／８ウイルスベクターとして更に製造した。製造したベクターは、ｑＰＣＲによって次の力価を有することを示した：
ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７：１．１７×１０¹³ベクターゲノム／ｍＬ
ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ５：１．７３ｘ１０¹³ベクターゲノム／ｍＬ

次に、これらの２つのベクターを、網膜下に注射し、そして、蛍光眼底写真によって発現を評価する前に、ＥＧＦＰ導入遺伝子発現が発症するように８日間放置した。図１２は、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７が注射された網膜でＥＧＦＰが発現したことを示す。導入遺伝子発現は低いが、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７からの実質的な発現は、（加えられなかった）リガンドに応答したアプタマー媒介性選択的スプライシングを介した誘導後において、予想されたもののみである。

実施例１３．ＡＡＶ送達後の、マウス網膜におけるｉｎ ｖｉｖｏでの調節カセット媒介性選択的スプライシングによる標的遺伝子発現の調節

手順

蛍光眼底写真（ＥＧＦＰシグナル）の定量化：すべての操作及び像の分析を、GNU Image Manipulation Program（ＧＩＭＰ、オープンソース）を使用しておこなった。先に記載したように、それぞれの網膜の３つの像を、造影の各時点で撮像した：白色光（２００ｍｓ）、４７５±２５ｎｍ（１０秒）、及び４７５±２５ｎｍ（３０秒）。最初に、これらの３つの像を、層として重ね、そして、ガイドとして白色光像を使用して、着目の領域（ＲＯＩ）を、瞳孔を通して見える網膜全体を網羅するように規定した。２つ４７５±２５ｎｍ（ＥＧＦＰ蛍光）像に対して、閾値ツールを使用して、規定した閾値を超える強度値を有するピクセルだけを強調した。閾値は、バックグラウンドからのＥＧＦＰシグナルの明確な分離を規定することに基づいて、及び分析のために適当なダイナミックレンジを提供するために選択した。ＲＯＩ内の閾値を超えたピクセル数を、各像について記録した。眼の間で見える網膜領域のばらつきにつながる瞳孔の変動する散大を補正するために、閾値を超えたピクセル数を、ＲＯＩ内のピクセルの総数で割った。

誘導：標的遺伝子発現のリボスイッチ媒介性誘導を、次に記載した２つの投与経路を介して実施した：

腹腔内注射（Ｉ.Ｐ.）：１００μＬの体積の［水中の７５ｍｇ／ｍｌのグアノシン＋０．５％ ｗ／ｖのメチルセルロース＋０．２５％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ８０］を、１３ｍｍ、３０ゲージの針を使用して、腹腔内腔に注射した。これは、２５ｇの体重の成体マウスにおいて３００ｍｇ／ｋｇのグアノシン用量と一致する。

硝子体内注射（Ｉ−Ｖｉｔ.）：２μＬの体積の［ＰＢＳ−ＭＫ中のＩｍＭのグアノシン＋２．５％のＤＭＳＯ］を、手引書に指示された１０ｍｍ、３４ゲージの針を使用して硝子体内に注射した。注射時の針チップ位置は、視神経円板の真上の水晶体の下であり、手術用顕微鏡を介した網膜観察によってこの位置に誘導した。

結果

００日目に、合計９つの眼に、次のように実施例１２に記載のとおり網膜下注射した：
−６つの眼にＡＡＶ２／８−ＧＴＸ７（Ｇ１５リボスイッチエレメントによって調節されるＣＭＶプロモーターからのＥＧＦＰ導入遺伝子発現）
−３つの眼に、ＡＡＶ２／８−ＧＴＸ５（陽性対照構築物、ＣＭＶプロモーターからの無調節ＥＧＦＰ導入遺伝子発現）

実施例１２に記載の蛍光眼底写真撮影を、０２、０８、０９、１０及び１２日目におこなった。

０８、０９及び１０日目の蛍光眼底写真後に、すべての眼が腹腔内注射を介した誘導を受けた。すべての眼が、１１日目の硝子体内注射を介して誘導を受けた。蛍光シグナルを、先に記載したように定量化し、そして、実例となる像を図１３ａに示す。

ＡＡＶ２／８からの遺伝子発現は、最大になるまで７日間かかることが知られているので、ベクター注射後の最初の８日間は、誘導をおこなわなかった。そのため、８日目の発現レベルを、誘導前のベースラインとみなした。２ラウンドのＩ.Ｐ.誘導後のベクター注射後１０日目に、導入遺伝子発現は、図１３ｃ及び図１３ａ（Ｌ対Ｎ）に示されているように、このベースラインと比較して、〜３．５×（Ｐ≦０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔｓ）に増加した。

ベクター注射後１２日目、硝子体内誘導の２４時間後、及び最後のＩ.Ｐ.誘導の４８時間後、導入遺伝子発現は、図１３ｃ及び図１３ａ（Ｌ対Ｏ）に示されているように、ベースラインと比較して、〜９×（Ｐ≦０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔｓ）に増加した。硝子体内誘導後のこれだけ大きな誘導は、この誘導経路が腹腔内注射より効果的であろうことを意味している（しかし、明確に示されていない）。

誘導前後のＥＧＦＰ導入遺伝子発現における差異を示すより高解像度の像を、図１３ｂに示す。

同じ期間及び同じ誘導処方計画にわたって、無調節対照ベクターＡＡＶ２／８−ＧＴＸ５によって媒介されたＥＧＦＰ発現レベルは、有意に変化することなく（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）、図１３ｄに示されているように、ほぼ一定量を維持した。ＧＴＸ７対ＧＴＸ５によって媒介された発現レベルの大きな違いのため、それぞれの像のセットは、異なる露出時間（それぞれ３０秒と１０秒）及び閾値（それぞれ５０と１９０）を必要とした。

このデータは、ＧＴＸ７構築物ベースのＧ１５からの導入遺伝子発現が、マウス網膜においてアプタマー媒介性選択的スプライシングを介して調節されたことを明確に示す。ＧＴＸ７から誘導された最大の導入遺伝子発現レベルは、誘導不可能な陽性対照構築物ＧＴＸ５によって媒介されたものより低かった。

表５．説明と関連配列。特に明記しない限り、エクソン配列は大文字で示し、そして、イントロン配列は小文字で示す。

Claims (43)

1. 標的遺伝子の発現を調節するためのポリヌクレオチドカセットであって、
   ａ．リボスイッチ、
   ｂ．５’イントロンと３’イントロンに隣接する、選択的にスプライスされるエクソンを含み、
   ここで、前記リボスイッチが、（ｉ）前記３’イントロンの５’スプライス部位配列を含む７〜２０塩基対を有するステムを含むエフェクター領域、及び（ｉｉ）アプタマーを含み、
   ここで、前記選択的にスプライスされるエクソンが、標的遺伝子ｍＲＮＡへスプライスされるとき、前記選択的にスプライスされるエクソンが、標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含む、ポリヌクレオチドカセット。
2. 前記アプタマーが、小分子リガンドに結合する、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
3. 前記５’及び３’イントロンが、前記標的遺伝子からの内在性イントロンに由来する、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
4. 前記５’及び３’イントロンが、前記標的遺伝子にとって外来性である、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
5. 前記５’及び３’イントロンが、ヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
6. 前記５’イントロンが、前記標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
7. 前記５’及び３’イントロンが、それぞれ独立に、５０〜３００ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
8. 前記５’及び３’イントロンがそれぞれ独立に、１２５〜２４０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
9. 前記エフェクター領域ステムが、８〜１１塩基対の長さである、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
10. 前記選択的にスプライスされるエクソンが、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のエクソン２、変異ヒトＷｉｌｍｓ腫瘍１エクソン５、マウスカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタエクソン１６、又はＳＩＲＴ１エクソン６から成る群に由来する、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
11. 前記選択的にスプライスされるエクソンが、配列番号１５のヒトＤＨＦＲからの改変エクソン２である、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
12. 前記選択的にスプライスされるエクソンが、合成されたものである、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
13. 前記選択的にスプライスされるエクソンが、エクソンスプライスエンハンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスサイレンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスエンハンサーを加えること、及びエクソンスプライスサイレンサーを加えることから成る群の１若しくは複数によって改変された、請求項１に記載のポリヌクレオチドカセット。
14. 標的遺伝子の発現を調節する方法で使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドカセットあって、前記方法が、
    ａ．標的遺伝子内に前記ポリヌクレオチドカセットを挿入し、
    ｂ．細胞内にポリヌクレオチドカセットを含む前記標的遺伝子を導入し、そして
    ｃ．前記標的遺伝子の発現の誘導に有効な量でアプタマーに特異的に結合する小分子リガンドに前記細胞を晒すこと、
    を含む、ポリヌクレオチドカセット。
15. 前記ポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子のタンパク質コード領域内に挿入される、請求項１４に記載のポリヌクレオチドカセット。
16. 前記標的遺伝子の発現が、前記小分子リガンドが不存在であるときの発現レベルに比べて、前記小分子リガンドが存在しているときに、５倍よりも高い、請求項１４に記載のポリヌクレオチドカセット。
17. 前記標的遺伝子の発現が、前記小分子リガンドが不存在であるときの発現レベルに比べて、前記小分子リガンドが存在しているときに、１０倍よりも高い、請求項１４に記載のポリヌクレオチドカセット。
18. ２以上のポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子内に挿入される、請求項１４に記載のポリヌクレオチドカセット。
19. 前記２以上のポリヌクレオチドカセットが、異なった小分子リガンドに特異的に結合する異なるアプタマーを含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチドカセット。
20. 前記２以上のポリヌクレオチドカセットが、同じアプタマーを含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチドカセット。
21. 前記ポリヌクレオチドカセットを含む前記標的遺伝子が、前記標的遺伝子の発現のためにベクターに組み込まれる、請求項１４に記載のポリヌクレオチドカセット。
22. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２１に記載のポリヌクレオチドカセット。
23. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターから成る群から選択される、請求項２２に記載のポリヌクレオチドカセット。
24. 哺乳動物の眼内において標的遺伝子の発現を調節する方法に使用するためのポリヌクレオチドカセットを包含する標的遺伝子を含むベクターであって、
    （ｉ）リボスイッチ及び（ｉｉ）５’イントロン及び３’イントロンに隣接する選択的にスプライスされるエクソンを含むポリヌクレオチドカセット、を包含する標的遺伝子を含み、ここで、前記リボスイッチが、７〜２０塩基対を有し、前記３’イントロンの５’スプライス部位配列を含むステムを含むエフェクター領域と、小分子リガンドに結合するアプタマーとを含み、ここで、前記選択的にスプライスされるエクソンが、前記標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含む、ベクター。
25. 前記ベクターが、眼内注射によって眼内に導入される、請求項２４に記載のベクター。
26. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２４に記載のベクター。
27. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターから成る群から選択される、請求項２６に記載のベクター。
28. 前記ポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子のタンパク質コード配列内に配置される、請求項２４に記載のベクター。
29. 前記５’及び３’イントロンが、前記標的遺伝子からの内在性イントロンに由来する、請求項２４に記載のベクター。
30. 前記５’及び３’イントロンが、前記標的遺伝子にとって外来性である、請求項２４に記載のベクター。
31. 前記５’及び３’イントロンが、ヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する、請求項２４に記載のベクター。
32. 前記５’イントロンが、前記標的遺伝子とインフレームの終止コドンを含む、請求項２４に記載のベクター。
33. 前記５’及び３’イントロンが、それぞれ独立に、５０〜３００ヌクレオチドの長さである、請求項２５に記載のベクター。
34. 前記５’及び３’イントロンが、それぞれ独立に、１２５〜２４０ヌクレオチドの長さである、請求項２４に記載のベクター。
35. 前記エフェクター領域ステムが、８〜１１塩基対の長さである、請求項２４に記載のベクター。
36. 前記選択的にスプライスされるエクソンが、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のエクソン２、変異ヒトＷｉｌｍｓ腫瘍１エクソン５、マウスカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼＩＩデルタエクソン１６、又はＳＩＲＴ１エクソン６に由来する、請求項２４に記載のベクター。
37. 前記選択的にスプライスされるエクソンが、エクソンスプライスエンハンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスサイレンサーの配列を変更すること、エクソンスプライスエンハンサーを加えること、エクソンスプライスサイレンサーを加えること、から成る群のうちの１若しくは複数によって改変された、請求項２４に記載のベクター。
38. 前記選択的にスプライスされるエクソンが、配列番号１５からの改変ＤＨＦＲエクソン２である、請求項２４に記載のベクター。
39. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドカセットを包含する標的遺伝子を含む組み換えポリヌクレオチド。
40. 前記ポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子のタンパク質コード配列内に配置される、請求項３９に記載の組み換えポリヌクレオチド。
41. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドカセットを包含する標的遺伝子を含むベクター。
42. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４１に記載のベクター。
43. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターから成る群から選択される、請求項４２に記載のベクター。

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