EA037120B1 - Регулирование экспрессии генов посредством аптамер-опосредованного модулирования альтернативного сплайсинга - Google Patents

Регулирование экспрессии генов посредством аптамер-опосредованного модулирования альтернативного сплайсинга Download PDF

Info

Publication number
EA037120B1
EA037120B1 EA201791751A EA201791751A EA037120B1 EA 037120 B1 EA037120 B1 EA 037120B1 EA 201791751 A EA201791751 A EA 201791751A EA 201791751 A EA201791751 A EA 201791751A EA 037120 B1 EA037120 B1 EA 037120B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
exon
target gene
expression
intron
gene
Prior art date
Application number
EA201791751A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791751A1 (ru
Inventor
Алекс Р. Бойн
Ф. Оливье Дэйнос
Дж. Майкл Воллес
Сюэцуй Го
Original Assignee
МЕИРЭДжТиЭкс ЮКей II ЛИМИТЕД
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by МЕИРЭДжТиЭкс ЮКей II ЛИМИТЕД filed Critical МЕИРЭДжТиЭкс ЮКей II ЛИМИТЕД
Publication of EA201791751A1 publication Critical patent/EA201791751A1/ru
Publication of EA037120B1 publication Critical patent/EA037120B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C12N9/003—Dihydrofolate reductase [DHFR] (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/002—Vectors comprising a special translation-regulating system controllable or inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

В изобретении предлагаются платформа и способы применения платформы для регулирования экспрессии целевого гена с применением воздействия лиганда (например, низкомолекулярного), связывающегося с аптамером. Платформа имеет полинуклеотидную кассету для регулирования генов, которую помещают в целевой ген, и содержит синтетический рибосвитч, расположенный в области 5'-интрон - альтернативный экзон - 3'-интрон. Рибосвитч содержит эффекторную область и сенсорную область (например, аптамер, который связывается с низкомолекулярным лигандом), вследствие чего альтернативный экзон сплайсируется в мРНК целевого гена при отсутствии лиганда, тем самым предотвращая экспрессию целевого гена. При наличии лиганда альтернативный экзон не сплайсируется в мРНК целевого гена, тем самым обеспечивая экспрессию целевого гена.

Description

(54) РЕГУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПОСРЕДСТВОМ АПТАМЕРОПОСРЕДОВАННОГО МОДУЛИРОВАНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА
(31) 62/110,919 (32) 2015.02.02 (33) US (43) 2018.02.28 (86) PCT/US2016/016234 (87) WO 2016/126747 2016.08.11 (71 )(73) Заявитель и патентовладелец: МЕИРЭДЖТИЭКС ЮКей II ЛИМИТЕД (GB) (56) US-A1-20100221821 US-A1-20130291226 US-A1-20100223694 US-A1-20110111411
(72) Изобретатель: Бойн Алекс Р., Дэйнос Ф. Оливье, Воллее Дж. Майкл, Го Сюэцуй (US)
(74) Представитель: Медведев В.Н. (RU)
037120 В1
037120 Bl (57) В изобретении предлагаются платформа и способы применения платформы для регулирования экспрессии целевого гена с применением воздействия лиганда (например, низкомолекулярного), связывающегося с аптамером. Платформа имеет полинуклеотидную кассету для регулирования генов, которую помещают в целевой ген, и содержит синтетический рибосвитч, расположенный в области 5'-интрон - альтернативный экзон - З'-интрон. Рибосвитч содержит эффекторную область и сенсорную область (например, аптамер, который связывается с низкомолекулярным лигандом), вследствие чего альтернативный экзон сплайсируется в мРНК целевого гена при отсутствии лиганда, тем самым предотвращая экспрессию целевого гена. При наличии лиганда альтернативный экзон не сплайсируется в мРНК целевого гена, тем самым обеспечивая экспрессию целевого гена.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет по заявке на патент США № 62/110919, поданной 2 февраля 2015 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
Область техники
В данном изобретении предлагается платформа и способы применения платформы для регулирования экспрессии целевого гена с применением воздействия низкомолекулярного соединения. Платформа имеет полинуклеотидную кассету, которую помещают в целевой ген, и при этом содержит синтетический рибосвитч, расположенный в области 5'-интрон-альтернативный экзон-3'-интрон. Рибосвитч содержит эффекторную область и аптамер, который связывается с лигандом (например, низкомолекулярным) и обеспечивает контроль экспрессии целевого гена под воздействием лиганда.
Уровень техники
Сплайсинг означает процесс, с помощью которого интронная последовательность удаляется из зарождающейся пред-матричной РНК (пре-мРНК), а экзоны объединяются вместе, образуя мРНК. Участки сплайсинга представляют собой соединения между экзонами и интронами и определяются различными консенсусными последовательностями на 5'- и 3'-концах интрона (т.е. участок донора сплайсинга и участок акцептора сплайсинга соответственно). Альтернативный сплайсинг пре-мРНК или альтернативный сплайсинг представляет собой широко распространенный процесс, происходящий в большинстве генов человека, содержащих множество экзонов. Процесс осуществляется с помощью большой многокомпонентной структуры, называемой сплайсингосомой, которая представляет собой набор малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNP) и разнообразный массив вспомогательных белков. Распознавая различные цис-регуляторные последовательности, сплайсингосома определяет границы экзона/интрона, удаляет интронные последовательности и объединяет экзоны в конечную транслируемую матрицу (т.е. мРНК). В случае альтернативного сплайсинга некоторые экзоны могут быть включены или исключены для изменения конечной кодируемой матрицы, тем самым изменяя полученный экспрессированный белок.
Регулирование экспрессии целевого гена (например, терапевтического трансгена) необходимо в самых разных ситуациях. В контексте терапевтической экспрессии генов методы, которые позволяют регулировать экспрессию трансгенов, могут повысить безопасность посредством регулирования уровня экспрессии и времени ее осуществления. Регулируемая система контроля экспрессии белка играет практическую и в некоторых случаях основную роль для безопасного и эффективного терапевтического применения.
Краткое описание сущности изобретения
В одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотидная кассета для регулирования экспрессии целевого гена, содержащая (а) рибосвитч и (b) альтернативно сплайсированный экзон, граничащий с 5'-интроном и 3'-интроном, при этом рибосвитч содержит (i) эффекторную область, содержащую стебель, который включает 5'-участок сплайсинга 3'-интрона, и (ii) аптамер, причем альтернативно сплайсированный экзон содержит стоп-кодон, который находится внутри рамки с целевым геном, когда альтернативно сплайсированный экзон сплайсирован в мРНК целевого гена. В одном варианте реализации изобретения аптамер специфически связывается с низкомолекулярным лигандом.
В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид для регулирования экспрессии целевого гена (кассета регулирования гена, регуляторная кассета или полинуклеотидная кассета) содержит 5'- и 3'-интроны, которые получены из эндогенного интрона из целевого гена. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интроны являются экзогенными для целевого гена. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интроны получают из интрона 2 гена β-глобина человека. В одном варианте реализации изобретения 5'-интрон содержит стоп-кодон в рамке с целевым геном. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, содержат от около 50 до около 300 нуклеотидов в длину. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, содержат от около 125 до около 240 нуклеотидов в длину. В одном варианте реализации изобретения 5'- и/или 3'-интроны модифицированы для включения или изменения последовательности интронного энхансера сплайсинга, интронного энхансера сплайсинга, 5'-участка сплайсинга, 3'-участка сплайсинга или последовательности точек разветвления.
В одном варианте реализации изобретения стебель эффекторной области рибосвитча содержит от около 7 до около 20 пар оснований в длину. В одном варианте реализации изобретения стебель эффекторной области содержит от 8 до 11 пар оснований в длину.
В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон получают из экзона 2 гена дигидрофолатредуктазы человека (DHFR), экзона 5 мутантной опухоли Вильмса 1, дельта экзона 16 кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы II мыши, или экзона 6 SIRT1. В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон представляет собой модифицированный экзон 2 DHFR из SEQ ID NO 15. В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон модифицирован в одной или более групп, состоящих из изменения последовательности экзонного сайленсера сплайсинга, изменения последовательности экзонного энхансера сплайсинга, добавления экзонного энхансера сплайсинга и добавления экзонного донора сплайсинга. В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон является синтетическим (т.е. получен- 1 037120 ным не из природного экзона).
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ модулирования экспрессии целевого гена, включающий (а) вставку полинуклеотидной кассеты по данному изобретению (как, например, описано выше и далее в тексте данного документе) в целевой ген, (b) введение целевого гена, содержащего полинуклеотидную кассету, в клетку, и (c) воздействие на клетку низкомолекулярным лигандом, который специфически связывается с аптамером в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии целевого гена.
В одном варианте реализации изобретения уровень экспрессии целевого гена при наличии низкомолекулярного лиганда выше примерно в 5 раз по сравнению с уровнями экспрессии при отсутствии низкомолекулярного лиганда. В одном варианте реализации изобретения уровень экспрессии целевого гена при наличии низкомолекулярного лиганда выше примерно в 10 раз по сравнению с уровнями экспрессии при отсутствии низкомолекулярного лиганда.
В одном варианте реализации изобретения полинуклеотидную кассету вводят в область целевого гена, кодирующую белок. В одном варианте реализации изобретения в целевой ген вводят две или более полинуклеотидные кассеты. В одном варианте реализации изобретения две или более полинуклеотидные кассеты содержат различные аптамеры, которые специфически связываются с различными низкомолекулярными лигандами. В другом варианте реализации изобретения две или более полинуклеотидные кассеты содержат один и тот же аптамер различных аптамеров, которые специфически связываются с одним и тем же лигандом.
В одном варианте реализации изобретения целевой ген, содержащий полинуклеотидную кассету, вводят в вектор для экспрессии целевого гена. В одном варианте реализации изобретения вектор представляет собой вирусный вектор. В других вариантах реализации изобретения вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, вектора аденоассоциированного вируса и лентивирусного вектора.
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ модулирования экспрессии целевого гена в глазу млекопитающего, включающий (а) введение в глаз вектора, содержащего целевой ген, который содержит полинуклеотидную кассету, содержащую (i) рибосвитч и (ii) альтернативно сплайсированный экзон, граничащий с 5'-интроном и 3'-интроном, при этом синтетический рибосвитч содержит эффекторную область, содержащую стебель, который включает 5'-участок сплайсинга 3'-интрона, и аптамер, который специфически связывается с лигандом, причем альтернативно сплайсированный экзон содержит стоп-кодон, который находится внутри рамки с целевым геном, когда альтернативно сплайсированный экзон сплайсирован в мРНК целевого гена; и (b) введение млекопитающему лиганда в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии целевого гена. В одном варианте реализации изобретения лиганд представляет собой низкомолекулярное соединение.
В одном варианте реализации изобретения вектор вводят в глаз путем внутриглазной инъекции. В одном варианте реализации изобретения вектор представляет собой вирусный вектор. В одном варианте реализации изобретения вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, вектора аденоассоциированного вируса и лентивирусного вектора.
В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид для регулирования экспрессии целевого гена в глазу содержит 5'- и 3'-интроны, которые получены из эндогенного интрона из целевого гена. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интроны являются экзогенными для целевого гена. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интроны получают из интрона 2 гена β-глобина человека. В одном варианте реализации изобретения 5'-интрон содержит стоп-кодон в рамке с целевым геном. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, содержат от около 50 до около 300 нуклеотидов в длину. В одном варианте реализации изобретения 5'-и 3'-интроны, каждый независимо, содержат от около 125 до около 240 нуклеотидов в длину. В одном варианте реализации изобретения 5'- и/или 3'-интроны модифицированы для включения или изменения последовательности интронного энхансера сплайсинга, интронного энхансера сплайсинга, 5'-участка сплайсинга, 3'-участка сплайсинга или последовательности точек разветвления. В одном варианте реализации изобретения стебель эффекторной области рибосвитча содержит от около 7 до около 20 пар оснований в длину. В одном варианте реализации изобретения стебель эффекторной области содержит от 8 до 11 пар оснований в длину. В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон получают из экзона 2 гена дигидрофолатредуктазы человека (DHFR), экзона 5 мутантной опухоли Вильмса 1, дельта экзона 16 кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы II мыши, или экзона 6 SIRT1. В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон представляет собой модифицированный экзон 2 DHFR из SEQ ID NO 15, модифицированный экзон 2 из DHFR человека. В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон модифицирован в одной или более групп, состоящих из изменения последовательности экзонного сайленсера сплайсинга, изменения последовательности экзонного энхансера сплайсинга, добавления экзонного энхансера сплайсинга и добавления экзонного донора сплайсинга. В одном варианте реализации изобретения альтернативно сплайсированный экзон является синтетическим (т.е. полученным не из природного экзона).
- 2 037120
В одном аспекте данного изобретения предлагается рекомбинантный полинуклеотид, содержащий целевой ген, который содержит полинуклеотидную кассету для регулирования экспрессии целевого гена (как, например, описано выше). В одном варианте реализации изобретения полинуклеотидную кассету помещают в кодирующую белок последовательность целевого гена.
В одном аспекте данного изобретения предлагается вектор, содержащий целевой ген, который содержит полинуклеотидную кассету для регулирования экспрессии целевого гена (как, например, описано выше). В одном варианте реализации изобретения вектор представляет собой вирусный вектор. В одном варианте реализации изобретения вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, вектора аденоассоциированного вируса и лентивирусного вектора.
Описание графических материалов
Фиг. 1а. Схематическое изображение конструкции сплайсинга Con 1 с усеченным интроном 2 бета-глобина человека (IVS2Δ), вставленным в кодирующую последовательность гена люциферазы. Обозначения Luci экзон 1 и Luci экзон 2 относятся к делению гена люциферазы на 5'- и 3'-кодирующие последовательности. Сплайсинг вставленной интронной последовательности IVS2Δ приводит к образованию полноразмерной мРНК, которая транслируется в полноразмерный белок.
Фиг. 1b. Влияние интронной вставки и последовательности участка сплайсинга на экспрессию люциферазы. Конструкции от Con 1 по Con 7 содержат разные интронные участки сплайсинга (см. табл. 1). Конструкция Con 1 содержит IVS2Δ со своим исходным IVS2 5'-участком сплайсинга и 3'-участком сплайсинга (5'ss и 3'ss соответственно). Конструкции от Con 2 по Con 7 содержат IVS2Δ, но с отличающимися последовательностями 5'ss и 3'ss, как указано в табл. 1. Конструкция Con 8 не содержит интрона IVS2Δ. Конструкции от Con 1 по Con 3 не продемонстрировал какого-либо влияния с интронной вставкой на экспрессию люциферазы по сравнению с контролем люциферазы без интронной вставки (Con 8). Конструкции от Con 4 по Con 7 с участками более слабого сплайсинга, демонстрировали сниженный уровень экспрессии люциферазы.
Фиг. 2а. Схематическое изображение кассеты интрон-экзон-интрон с профилями сплайсинга с включением экзона (I) и исключением экзона (II). Звездочка (+) обозначает стоп-кодон в экзоне 2 DHFR. Если альтернативный экзон DHFR включен в мРНК целевого гена (люциферазы) путем сплайсинга (I), полученный транскрипт содержит внутрирамочный стоп-кодон, который блокирует экспрессию гена люциферазы. Целевой ген экспрессируется только в тех случаях, когда альтернативный экзон DHFR, содержащий стоп-кодон, исключается из конечной мРНК (II).
Фиг. 2b. Влияние включения или исключения альтернативного экзона DHFR на экспрессию гена люциферазы. Анализ люциферазы проводили на клетках HEK 293, трансфицированных различными репортерными конструкциями люциферазы, содержащими кассету интрон-экзон-интрон, как показано на фиг. 2а. Экзон 2 DHFR с последовательностями участков сплайсинга дикого типа (DHFR_wt) сравнивали с мутантами, содержащими экзоны DHFR в 5'ss (DHFR_wt5ssC), или с нативными 5'ss, замененными более сильной Con 1 5'ss (DHFR_Con15ss) или слабой 5'ss из Con 4 (DHFR_Con45ss). Конструкция, используемая в полосе 1 в фиг. 2b и 2с, представляет собой Con 1, которая показана на фиг. 1 и описана в примере 1. Вставка экзона 2 DHFR в мРНК люциферазы обусловливала снижение экспрессии люциферазы, которое не происходило, если 5'ss (т.е. донор сплайсинга) экзона 2 DHFR подвергали мутации (сравните DHFR_wt с DHFR_wt5ssC). Когда 5'ss в экзоне DHFR заменяли более сильными 5'ss из Con 1 (конструкция DHFR-Con1 5'ss), включение экзона DHFR усиливалось, что обусловливало уровень экспрессии люциферазы в 545 раз ниже по сравнению с Con 1. Когда слабый 5'ss (из Con 4 в примере 1) применяли для замены 5'ss дикого типа, сниженный уровень сплайсинга на этом участке предотвращал включение экзона DHFR, тем самым усиливая экспрессию люциферазы.
Фиг. 2с. Экзонный энхансер (ESE) или супрессор (ESS) сплайсинга в последовательности экзонов DHFR влияют на сплайсинг альтернативного экзона DHFR и модулируют экспрессию гена-мишени. Мутация участка связывания SRp40 в экзоне 2 DHFR приводила к резкому снижению экспрессии люциферазы: в 2982 раз по сравнению с экспрессией DHFR_wtmtSRp40 и экспрессией из Con 1 (фиг. 2с DHFR_wtmtSRp40; табл. 2). Мутация предполагаемого участка связывания для энхансера сплайсинга SC35 с целью создания более сильного участка связывания SC35 (табл. 2, StrSC35) дополнительно уменьшала экспрессию люциферазы (в 139 раз) по сравнению с Con 1 (фиг. 2с, DHFR_wtStrSC35), повидимому, из-за повышенной эффективности включения экзона DHFR. Замена участка связывания для енхансера сплайсинга SC35 с эффектом ингибитора сплайсинга hnRNP A1 (табл. 2, SC35hnRNPA1) обусловливала повышение экспрессии люциферазы в 4,3 раза по сравнению с экзоном 2 DHFR дикого типа (фиг. 2с, DHFR_wt SC35hnRNPA1).
Фиг. 3 a Схематическое изображение кассеты интрон-экзон-интрон, содержащей шпилькообразную структуру в участке 5'ss альтернативного экзона 2 DHFR. Когда участок 5'ss DHFR внедряют в шпилькообразную структуру, экзон DHFR не включается в транскрипт, что позволяет экспрессировать люциферазу (x представляет участок 5'ss экзона DHFR, погруженный в шпильку).
Фиг. 3b. Последовательности и структуры четырех разных шпилек, протестированные в кассете интрон-экзон-интрон, проиллюстрированы на фиг. 3a.
- 3 037120
Фиг. 3c. Влияние шпилькообразной структуры на участке 5'ss экзона 2 DHFR на экспрессию целевого гена. Конструкция, содержащая экзон DHFR с последовательностью 5'ss Con 1, эффективно подавляет экспрессию люциферазы за счет включения экзона DHFR в сплайсированную мРНК (DHFR_Con15ss, фиг. 3c). Однако встраивание 5'ss экзона DHFR в шпилькообразную структуру эффективно предотвращает включение экзона DHFR, что позволяет осуществляться экспрессии люциферазы (DHFR_Con15ss_HP15 фиг. 3c). Последовательность шпильки с поврежденным стеблем не восстанавливает экспрессию люциферазы (фиг. 3c. DHFR_Con15ss_HP15x). Конструкция DHFR_wtmtSRp40 (Пример 2) не экспрессирует люциферазу, если участок 5'ss экзона DHFR стабильно секвестрирован в шпилькообразной структуре (DHFR_wtmtSRp40_HP15). Дестабилизация шпильки предотвращает экспрессию люциферазы даже при наличии мутантного участка связывания SRp40 с сильной активностью сплайсинга (DHFR_wtmtSRp40_HP15x).
Фиг. 4а и фиг. 4b. Схематическое изображение процесса регуляции гена с помощью регуляторной кассеты интрон-экзон-интрон, содержащей синтетический рибосвитч. В отсутствие связывания аптамер/лиганд, аптамерная последовательность разрушает образование стебля шпильки, оставляя участок 5'ss экзона DHFR доступным и обусловливая включение экзона DHFR, тем самым предотвращая трансляцию и блокируя экспрессию белка (фиг. 4а). Когда происходит связывание аптамер/лиганд, зависимые от лиганда конформационные изменения в аптамере стабилизируют образование стебля, секвестрируя участок 5'ss экзона DHFR, что приводит к исключению экзона DHFR и экспрессии гена люциферазы (фиг. 4b).
Фиг. 4с. Стебель шпильки и теофиллиновые аптамерные конфигурации с разной длиной соединительного стебля. Стебель теофиллинового аптамера непосредственно связывали со стеблем шпильки, секвестрирующей участок 5'ss экзона DHFR, создавая синтетический стебель из 20 п.о. Последовательность стебля усекали, создавая ряд шпилек с различной длиной стебля. Показаны структуры стебля для DHFR_Theo1, 12, 13 и 14 с длиной стебля 20 п.о., 9 п.о., 8 п.о. и 7 п.о. соответственно. Теофиллин обозначен как (▲).
Фиг. 4d. Влияние различных длин стебля с применением теофиллинового аптамера на экспрессию целевого гена при наличии и в отсутствие теофиллина. Диаграмма, иллюстрирующая экспрессию люциферазы, регулируемую регуляторными кассетами, содержащими теофиллиновые аптамеры, которые были получены, как описано в Примере 4 (фиг. 4с). В конструкциях от Theo 1 до Theo 12 с длиной стебля от 20 до 9 п.о., стебель шпильки имел достаточную длину, чтобы сформировать устойчивую структуру в отсутствие связывания аптамер/лиганд. DHFR_Theo13 не образует стабильного стебля шпильки в отсутствие лиганда, поэтому участок 5'ss экзона DHFR не скрыт, что приводит к включению экзона DHFR, блокируя экспрессию люциферазы. При наличии теофиллина шпилька стабилизируется, и участок 5'ss экзона DHFR оказывается недоступен для процесса сплайсинга. Это приводит к исключению экзона DHFR, обеспечивающего экспрессию люциферазы. При наличии 3 мМ теофиллина, DHFR_Theo_13 демонстрирует 43-кратную индукцию по сравнению с неиндуцированным исходным уровнем экспрессии. DHFR_Theo_14 не проявляет экспрессии люциферазы при наличии или в отсутствие теофиллина, что указывает на то, что этот стебель из 7 п.о. слишком короткий, чтобы сформировать стабильную шпильку, даже когда аптамер связывается со своим лигандом. В результате экзон DHFR соединяется с транскриптом, и экспрессия люциферазы блокируется.
Фиг. 5а. Последовательности синтетических стеблей, соединяющих xpt-гуаниновый аптамер и последовательность 5'ss экзона DHFR, создают последовательным усечением стебля шпильки и стебля аптамера Р1. Гуанин обозначен как (•).
Фиг. 5b. Влияние длины стебля на способность рибосвитча регулировать экспрессию люциферазы в ответ на связывание аптамера с лигандом. В регуляторную кассету вставляли восемнадцать рибосвитчей со стеблями различной длины, и конструкции трансфицировали в клетки HEK 293, которые выращивали при наличии или в отсутствие 500 мкМ гуанина. В отсутствие гуанина конструкции G14-G18 демонстрируют снижение экспрессии люциферазы по сравнению с нерегулируемым контролем Con 1. При наличии гуанина экспрессия люциферазы восстанавливалась в различной степени.
Фиг. 5с и 5d. Дополнительный анализ влияния длины стебля на способность рибосвитча регулировать экспрессию люциферазы в ответ на связывание аптамера с лигандом. Конструкции от G11 до G18 оценивали с помощью анализа люциферазы. Фиг. 5d иллюстрирует исходный и индуцированный уровень люциферазы относительно Con1. В отсутствие гуанина, конструкции от G14 до G17 демонстрируют четкую регуляцию экспрессии люциферазы посредством соединения аптамер/лиганд (в данном случае гуаниновый аптомер). В отсутствие гуанина уровни экспрессии люциферазы определяются низкими. При наличии гуанина экспрессия люциферазы значительно активируется. Фиг. 5d демонстрирует % экспрессии контрольной конструкции Con 1, полученный для этих регулируемых конструкций при индукции гуанином.
Фиг. 5е. Регуляторная кассета, содержащая рибосвитч xpt-G17, дает возможность регулировать экспрессию генов в ответ на лиганд в ряде различных типов клеток млекопитающих. DHFR_G17 трансфицировали в клеточные линии HepG2, AML12, RD и С2С12 и анализировали на предмет индуцированной экспрессии люциферазы при воздействии гуанином. Приведены показатели кратности индукции экс- 4 037120 прессии люциферазы для случаев, когда клетки выращивались при наличии лиганда, по сравнению с неиндуцированным исходным уровнем экспрессии, когда гуанин не добавляли в среду для культивирования клеток.
Фиг. 5f. Регулирование люциферазы с помощью регуляторной кассеты, содержащей xpt-G17, с применением вирусного вектора. Конструкцию с геном люциферазы, содержащую регуляторную кассету xpt-G17, переносили в основу вектора AAV и применяли для трансфицирования клеток. Клетки выращивали при наличии и в отсутствие гуанина. Приведены показатели кратности индукции люциферазы в присутствии гуанина; при воздействии гуанином регистрировали 1687-кратную индукцию экспрессии.
Фиг. 5g. Регулирование антител с помощью регулирующей кассеты в ответ на связывание аптамера с лигандом. Регуляторную кассету интрон-экзон-интрон с рибосвитчем xpt-G17 вставляли в лидерную пептидную последовательность последовательности антитела анти-KDR и полученную конструкцию трансфицировали в клетки HEK 293. По результатам анализа ELISA, регистрировали 80-кратную индукцию экспрессии белка антитела после воздействия лигандом на трансфицированные клетки по сравнению с необработанными клетками. Индуцированный уровень экспрессии составил около 40% от контрольной конструкции, содержащей интронную последовательности Con 1.
Фиг. 5h. Регулирование секретируемого белка эритропоэтина (ЕРО) с помощью регуляторной кассеты в ответ на связывание аптамера лигандом. Регуляторную кассету интрон-экзон-интрон с рибосвитчем xpt-G17 вставляли в ген эритропоэтина (Еро) мыши и полученную конструкцию трансфицировали в клетки HEK 293. По результатам анализа ELISA, в отсутствие гуанина регистрировали низкий уровень экспрессии ЕРО. При наличии гуанина наблюдалась 140-кратная индукция экспрессии ЕРО.
Фиг. 6а Структуры различных пуриновых стеблей рибосвитча, анализируемых в регуляторной кассете. Пурин обозначен как •.
Фиг. 6b-6e. Эффект дозы конструкций с регуляторными кассетами, содержащими рибосвитчи на основе различных аптамеров (стебли рибосвитчей проиллюстрированы на фиг. 6a).
Фиг. 6b. Ответ регуляторных кассет, содержащих гуаниновый аптамер, на гуанин.
Фиг. 6с. Ответ регуляторных кассет, содержащих гуаниновый аптамер, на гуанозин.
Фиг. 6d. Ответ регуляторных кассет, содержащих гуаниновый аптамер, на 2'dG.
Фиг. 6e. Ответ регуляторных кассет, содержащих адениновый аптамер, на аденин.
Фиг. 7а. Индукция EGFP с помощью регуляторной кассеты, содержащей xpt-G17, с применением гуанина. Регуляторную кассету интрон-экзон-интрон с рибосвитчем xpt-G17 клонировали в ген EGFP. Клетки HEK 293, стабильно трансфицированные конструкцией, обрабатывали гуанином 500 мкМ и анализировали методом проточной цитометрии на предмет экспрессии GFP через 6 ч после обработки. Обработка гуанином приводила к повышению уровня экспрессии EGFP, фиг. 7а, (В).
Фиг. 7b. Влияние наличия или отсутствия лиганда на экспрессию целевого гена. Клетки HEK 293, стабильно трансфицированные EGFP с помощью кассеты интрон-экзон-интрон, содержащей рибосвитч xpt-G17, обрабатывали в течение 3 дней гуанином 500 мкМ и анализировали методом проточной цитометрии каждые 24 ч в течение 3 дней. Гуанинсодержащие среды вымывали из клеток, а сами клетки продолжали выращивать без воздействия гуанина еще в течение 10 дней, при этом осуществляя мониторинг экспрессии EGFP. Экспрессия EGFP повышалась, когда гуанин присутствовал в среде для культивирования клеток. Без воздействия гуанина экспрессия EGFP прекращалась.
Фиг. 8а. Экспрессию люциферазы регулировали двумя копиями регуляторной кассеты, содержащей xpt-G15. На графике продемонстрирован зависимый от дозы гуанина ответ конструкций с одной регуляторной кассетой, содержащей xpt-G17 или xpt-G15, вставленной в целевой ген, и конструкции с двумя копиями регуляторной кассеты, содержащей xpt-G15 (двойной xpt-G15).
Фиг. 8b. Экспрессия EGFP в клетках культуры тканей, регулируемая различными регуляторными кассетами. Одна копия кассеты, содержащей xpt-G17 (EGFP-xpt-G17), обусловливает низкий уровень неиндуцированной исходной экспрессии (А) и достигает более низкого индуцированного уровня экспрессии по сравнению с клетками, содержащими конструкцию EGFP-xpt-G15 (D). Одна копия кассеты, содержащей xpt-G15 (EGFP-xpt-G15), обусловливает более высокий уровень неиндуцированной исходной экспрессии (В), а также более высокий уровень индуцированной экспрессии (Е). С конструкцией, содержащей две копии кассет, содержащих xpt-G15 (двойной EGFP-xpt-G15), фоновая неиндуцированная экспрессия снижается (С), не уменьшая индуцированный уровень экспрессии (F), в результате чего показатель кратности индукции увеличивается. Клетки обрабатывали гуанином и визуализировали через 24 ч после обработки.
Фиг. 8с. Регуляторные кассеты, содержащие рибосвитчи xpt-G15 и xpt-G17, отвечают как на гуанин, так и на гуанозин. Количественную оценку экспрессии EGFP (средняя интенсивность флуоресценции) осуществляли с помощью проточной цитометрии и показатель кратности индукции рассчитывали как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), полученную при обработке гуанином или гуанозином, деленную на MFI, полученную без обработки. В результате обработки гуанином и гуанозином получали аналогичные уровни и показатели кратности индукции.
Фиг. 8d. Экспрессия люциферазы в конструкции, содержащей одну копию регуляторной кассеты, содержащей xpt-G17, в дополнение к одной копии регуляторной кассеты, содержащей Ydhl-A5. Клетки
- 5 037120
HEK 293, трансфицированные этой конструкцией, обрабатывали либо гуанином, либо аденином, либо и тем, и другим. Самые высокие показатели индукции люциферазы регистрировали при комбинированном применении обоих лигандов в самых высоких концентрациях.
Фиг. 9а и 9b. Влияние усечений интронов на экспрессию люциферазы, регулируемую регуляторной кассетой интрон-экзон-интрон, содержащей рибосвитч xpt-G17. Фиг. 9а демонстрирует показатели кратности индукции, а фиг. 9b демонстрирует процент экспрессии люциферазы по сравнению с Con 1.
Фиг. 9с. Схематическое изображение последовательностей, удаленных из регуляторной конструкции DHFR_G17 интрон-экзон-интрон. Удаленная последовательность изображена незаштрихованной полоской, оставшаяся последовательность изображена заштрихованной полоской.
Фиг. 9d и 9е. Влияние делеций различных интронов, изображенных на фиг. 9с, на регуляцию генов. Последовательности внутри интронов, расположенные рядом с альтернативным экзоном DHFR, модифицировали сплайсинг экзонов и относительное регулирование генов. Например, DHFR-G17_2IR_3 демонстрирует делеции интронов, которые приводят к значительному повышению показателя кратности экспрессии целевого гена. Фиг. 9d демонстрирует показатель кратности индукции, тогда как фиг. 9е демонстрирует абсолютный уровень экспрессии белка по сравнению с контролем Con 1.
Фиг. 10а и 10b. Различные экзоны могут функционировать как альтернативный экзон в регуляторной кассете интрон-экзон-интрон для регулирования экспрессии генов. Фиг. 10а демонстрирует, что конструкции с различными экзонами имеют различные неиндуцированные исходные и индуцированные (гуанин 500 мкМ) уровни экспрессии люциферазы. Фиг. 10b демонстрирует показатели кратности индукции с этими конструкциями, с CaMKIId-e16, генерирующим эквивалентные показатели кратности индукции с экзоном DHFR с активирующей мутацией SRp40 (mtHFR).
Фиг. 11а-11с. Регулирование экспрессии люциферазы in vivo у мышей. Конструкцию, содержащую две копии регуляторной кассеты xpt-G15 (двойной xpt-G15, пример 8, фиг. 8а), вводили в печень мышей с помощью гидродинамической инъекции. Мышам перорально вводили различные дозы гуанозина через 2 ч и 12 ч после введения ДНК, а затем осуществляли визуализацию. Пероральное введение лиганда приводило к дозозависимой активации экспрессии регулируемого целевого гена в печени мышей (фиг. 11а и фиг. 11b). В другом эксперименте гуанозин вводили внутрибрюшинно (фиг. 11с). Изображения демонстрируют экспрессию люциферазы до и после введения гуанозина в дозе либо 100 мг/кг, либо 300 мг/кг. На графике (фиг. 11d) активность люциферазы выражена как среднее значение фотон/с/мм2 ± с. о. (n=5).
Фиг. 12. Трансгенная экспрессия EGFP, опосредованная векторами AAV на основе рибосвитча, в сетчатке мыши. Флуоресцентная фотография глазного дна, иллюстрирующая трансгенную экспрессию EGFP в сетчатке, опосредованную AAV2/8-GTX7, через 8 дней после субретинальной инъекции (время экспозиции: 30 с).
Фиг. 13а и 13b. Репрезентативные изображения глазного дна одного мышиного глаза, в который субретинально вводили AAV2/8-GTX7, иллюстрирующие изменение трансгенной экспрессии EGFP в сетчатке в динамике. А-Е: Изображения, сделанные под освещением белым светом, с временем экспозиции 200 мс на 2, 8, 9, 10 и 12 день после введения вектора. Кругом обведена область сетчатки, видимая через зрачок, которая была взята за область интереса (ОИ) для количественной оценки. F-J: Изображения, сделанные под освещением белым светом 475±25 нм, с временем экспозиции 30 с, демонстрирующие флуоресценцию eGFP на 2, 8, 9, 10 и 12 день после введения вектора. K-O: Изображения, сделанные под освещением белым светом 475±25 нм с временем экспозиции 30 с на 2, 8, 9, 10 и 12 день после введения вектора, с подсвеченными пикселями выше порога интенсивности 50 в пределах ОИ (обведено кругом). Фиг. 13b демонстрирует изображения с высоким разрешением до (А) и после (В) индукции.
Фиг. 13с. Трансгенная экспрессия EGFP в сетчатке мыши, количественно определяемая в динамике после субретинальной инъекции AAV2/8-GTX7. Флуоресцентные изображения глазного дна были сделаны в следующие моменты времени: на 2, 8, 9, 10 и 12 день после субретинальной инъекции AAV2/8GTX7. Экспозиция: 30 с, порог интенсивности пикселей для анализа: 50. Внутрибрюшинную индукцию осуществляли после визуализации на 8, 9 и 10 день после субретинальной инъекции AAV2/8-GTX7. Кроме того, на 11 день после субретинальной инъекции AAV2/8-GTX7 проводили интравитреальную индукцию. Статистическую значимость рассчитывали на основе однофакторного анализа ANOVA с коррекцией Даннетта с учетом 8 дня после инъекции в качестве контрольной точки.
Фиг. 13d. Трансгенная экспрессия EGFP в сетчатке мыши, количественно определяемая в динамике после субретинальной инъекции AAV2/8-GTX5 (положительный контроль). Флуоресцентные изображения глазного дна были сделаны в следующие моменты времени: на 2, 8, 9, 10 и 12 день после субретинальной инъекции ААУ2/8-6ТХ5. Экспозиция: 10 с, порог интенсивности пикселей для анализа: 190. Внутрибрюшинное введение гуанозина проводили после визуализации на 8, 9 и 10 день после субретинальной инъекции AAV2/8-GTX5. Кроме того, на 11 день после субретинальной инъекции AAV2/8GTX5 гуанозин вводили интравитреально. Применяли однофакторный анализ ANOVA с коррекцией Бонферрони, при этом статистически значимых различий в экспрессии EGFP при обработке гуанозином не обнаружено.
- 6 037120
Подробное описание сущности изобретения
В данном изобретении предлагается кассета для регулирования гена, которая содержит рибосвитч, расположенный в области 5' интрон - альтернативный экзон - 3' интрон. Кассета для регулирования гена относится к конструкции рекомбинантной ДНК, которая, когда включена в ДНК целевого гена, обеспечивает возможность регулировать экспрессию целевого гена посредством аптамер/лигандопосредованного альтернативного сплайсинга полученной пре-мРНК. Рибосвитч в контексте данного изобретения содержит сенсорную область (например, аптамер) и эффекторную область, которые вместе ответственны за обнаружение наличия низкомолекулярного лиганда и изменение сплайсинга с альтернативным экзоном. В одном варианте реализации изобретения уровень экспрессии целевого гена повышается при наличии соединения лиганд/аптамер и снижается при отсутствии лиганда.
Рибосвитч.
В данном контексте термин рибосвитч относится к регуляторному сегменту полинуклеотида РНК. Рибосвитч в контексте данного изобретения содержит сенсорную область (например, аптамер) и эффекторную область, которые вместе ответственны за обнаружение наличия лиганда (например, низкомолекулярного лиганда) и изменение сплайсинга с альтернативным экзоном. В одном варианте реализации изобретения рибосвитч является рекомбинантным и содержит полинуклеотиды из двух или более источников. В данном контексте термин синтетический, применительно к рибосвитчу, относится к рибосвитчу, который не встречается в природе. В одном варианте реализации изобретения сенсорные и эффекторные области соединены с помощью полинуклеотидного линкера. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотидный линкер образует стебель РНК (т.е. область полинуклеотида РНК, который является двухцепочечным).
Эффекторная область.
В одном варианте реализации изобретения эффекторная область содержит последовательность 5'-участка сплайсинга (5'ss) 3'-интрона (т.е. последовательность участка сплайсинга интрона, которая является непосредственно 3'-альтернативным экзоном). Эффекторная область содержит последовательность участка 5'ss 3'-интрона и последовательность, комплементарную последовательности участка 5'ss 3'-интрона. Когда аптамер связывается со своим лигандом, эффекторная область образует стебель и, таким образом, предотвращает сплайсинг с участком донора сплайсинга на 3'-конце альтернативного экзона (см., например, фиг. 4b). При определенных условиях (например, когда аптамер не связан со своим лигандом), эффекторная область находится в таком месте, которое обеспечивает доступ к участку донора сплайсинга на 3'-конце альтернативного экзона, что приводит к включению альтернативного экзона в мРНК целевого гена (см., например, фиг. 4а).
Стеблевая часть эффекторной области должна иметь достаточную длину (и содержание GC), чтобы по существу предотвращать альтернативный сплайсинг альтернативного экзона при наличии соединения лиганд/аптамер, а также предоставлять доступ к участку сплайсинга, если количество лиганд является недостаточным. В вариантах реализации изобретения стеблевая часть эффекторной области содержит последовательность стебля в дополнение к последовательности участка 5'ss 3'-интрона и его комплементарной последовательности. В вариантах реализации изобретения эта дополнительная последовательность стебля содержит последовательность из стебля аптамера. Длину и последовательность стеблевой части можно модифицировать с помощью известных методов для идентификации стеблей, которые обеспечивают приемлемую фоновую экспрессию целевого гена, когда лиганд отсутствует, и приемлемые уровни экспрессии целевого гена, когда лиганд является в наличии (см., например, примеры 4 и 5 и фиг. 4с и 4d, 5а-5d). Если стебель, например, слишком длинный, он может прикрывать доступ к последовательности участка 5'ss 3'-интрона при наличии или в отсутствие лиганда. Если длина стебля слишком короткая, может не сформироваться стабильный стебель, способный секвестрировать последовательность участка 5'ss 3'-интрона, и в этом случае альтернативный экзон будет подвергаться сплайсингу в матрицу целевого гена при наличии или в отсутствие лиганда. В одном варианте реализации изобретения общая длина стебля эффекторной области составляет от около 7 пар оснований до около 20 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения длина стебля составляет около от около 8 пар оснований до около 11 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения длина стебля составляет около от 8 пар оснований до 11 пар оснований. Кроме длины стебля, можно изменить содержание пар оснований GC с целью модификации стабильности стебля.
Аптамер/лиганд.
В данном контексте термин аптамер относится к полинуклеотиду РНК, который специфически связывается с лигандом. Термин лиганд относится к молекуле, которая специфически связывается аптамером. В одном варианте реализации изобретения лиганд представляет собой молекулу с низким молекулярным весом (менее около 1000 Да), включающую, например, липиды, моносахариды, вторичные мессенджеры, другие природные продукты и метаболиты, нуклеиновые кислоты, а также, в большинстве случаев, терапевтические препараты. В одном варианте реализации изобретения лиганд представляет собой полинуклеотид с 2 или более основаниями нуклеотидов.
Аптамеры имеют связывающие области, которые способны образовывать комплексы с заданной целевой молекулой (т.е. лигандом). Специфичность связывания может быть определена по показателям
- 7 037120 сравнительных констант диссоциации (Kd) аптамера применительно к его лиганду по сравнению с константой диссоциации аптамера применительно к молекулам, не имеющих к нему отношения. Таким образом, лиганд представляет собой молекулу, которая связывается с аптамером с большей аффинностью, чем с неродственным материалом. Как правило, Kd для аптамера по отношению к его лиганду будет по меньшей мере в около 10 раз меньше, чем Kd для аптамера по отношению к неродственным молекулам. В некоторых вариантах реализации изобретения Kd будет по меньшей мере в около 20 раз меньше, по меньшей мере в около 50 раз меньше, по меньшей мере в около 100 раз меньше и по меньшей мере в около 200 раз меньше. Аптамер, как правило, будет содержать от около 15 до около 200 нуклеотидов в длину. Чаще всего аптамер будет содержать от около 30 до около 100 нуклеотидов в длину.
Аптамеры, которые можно включать в состав рибосвитча, могут быть аптамерами естественного происхождения или их модификациями или аптамерами, которые были разработаны de novo, или синтетическими скринированными посредством систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX). Примеры аптамеров, которые связывают низкомолекулярные лиганды, включают, но не ограничиваются ими, теофиллин, допамин, сульфородамин-В, целлобиозу, канамицин А, ливидомицин, тобрамицин, неомицин В, биомицин, хлорамфеникол, стрептомицин, цитокины, молекулы клеточной поверхности и метаболиты. Для обзора аптамеров, распознающих малые молекулы, см., например, Famulok, Science 9:324-9 (1999) and McKeague, M. & DeRosa, М.С. J. Nuc. Aci. 2012. В другом варианте реализации изобретения аптамер представляет собой комплементарный полинуклеотид.
В одном варианте реализации изобретения аптамер предназначен для связывания конкретного низкомолекулярного лиганда. Способы конструирования аптамеров включают, например, SELEX. Способы конструирования аптамеров, которые избирательно связывают низкомолекулярные соединения с помощью SELEX, описаны, например, в патентах США № 5475096, 5270163 и в работе Abdullah Ozer, et al. Nuc. Aci. 2014, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Модификации процесса SELEX описаны в патентах США № 5580737 и 5567588, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.
Методики отбора для идентификации аптамеров обычно включают подготовку большого пула молекул ДНК или РНК желаемой длины, которые содержат область, являющуюся рандомизированной или мутагенизированной. Например, пул олигонуклеотидов для отбора аптамеров может содержать область из 20-100 рандомизированных нуклеотидов, граничащих с областями определенной последовательности, которые составляют около 15-25 нуклеотидов в длину и пригодны для связывания праймеров для ПЦР. Пул олигонуклеотидов амплифицируют с помощью стандартных методов ПЦР или других способов, которые позволяют амплифицировать выбранные последовательности нуклеиновых кислот. Пул ДНК можно транскрибировать in vitro, чтобы получить пул транскриптов РНК, если необходим аптамер РНК. Затем пул олигонуклеотидов РНК или ДНК подвергают отбору, основанному на их способности специфически связываться с желаемым лигандом. Методики отбора включают, например, аффинную хроматографию, хотя можно применять любой протокол, с помощью которого можно выбрать нуклеиновые кислоты на основе их способности специфически связываться с другой молекулой. Методики отбора для идентификации аптамеров, которые связывают низкомолекулярные структуры и функционируют внутри клетки, могут включать методы скрининга клеток. В случае применения аффинной хроматографии олигонуклеотиды контактируют с целевым лигандом, который был иммобилизован на подложке в колонке или на магнитных частицах. Олигонуклеотид предпочтительно выбирают для связывания лиганда при концентрациях соли, температурах и других условиях, которые имитируют нормальные физиологические условия. Олигонуклеотиды в пуле, которые связываются с лигандом, сохраняются на колонке или магнитных частицах, а несвязанные последовательности вымываются. Затем олигонуклеотиды, которые связывают лиганд, амплифицируют (после обратной транскрипции, если применяются транскрипты РНК) с помощью ПЦР (обычно после элюирования). Процесс отбора повторяют на выбранных последовательностях в течение в общей сложности от трех до десяти повторяющихся циклов процедуры отбора. Полученные олигонуклеотиды затем амплифицируют, клонируют и секвенируют с применением стандартных процедур для идентификации последовательностей олигонуклеотидов, которые способны связывать целевой лиганд. Сразу после идентификации последовательности аптамера аптамер можно дополнительно оптимизировать путем осуществления дополнительных циклов отбора, начиная с пула олигонуклеотидов, содержащих мутагенизированную последовательность аптамера.
Скрининг аптамера in vivo можно применять после одного или более циклов отбора in vitro (например, SELEX). Например, в работе Barouch et al. (RNA. 2007, 13(4):614-622, включенной в настоящий документ посредством ссылки) описана комбинация SELEX и дрожжевой трехгибридной системы для отбора аптамера in vivo.
Альтернативный экзон.
Альтернативный экзон, который является частью полинуклеотидной кассеты для регулирования гена по данному изобретению, может представлять собой любую полинуклеотидную последовательность, которая может быть транскрибирована до пре-мРНК и альтернативно сплайсирована в мРНК целевого гена. Альтернативный экзон, который является частью кассеты для регулирования гена по данному изобретению, содержит по меньшей мере одну последовательность, которая ингибирует трансляцию, так
- 8 037120 что, когда альтернативный экзон включен в мРНК целевого гена, экспрессия целевого гена из этой мРНК предотвращается или снижается. В предпочтительном варианте реализации изобретения альтернативный экзон содержит стоп-кодон (TGA, TAA, TAG), который находится в рамке с целевым геном, когда альтернативный экзон включен в мРНК целевого гена с помощью сплайсинга. В вариантах реализации изобретения альтернативный экзон содержит в дополнение к стоп-кодону или в качестве альтернативы стопкодону другую последовательность, которая уменьшает или по существу предотвращает трансляцию, когда альтернативный экзон включен с помощью сплайсинга в мРНК целевого гена, включая, например, участок связывания микроРНК, который обусловливает расщепление мРНК. В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон содержит последовательность связывания микроРНК, которая приводит к расщеплению мРНК. В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон кодирует полипептидную последовательность, которая снижает стабильность белка, содержащего эту полипептидную последовательность. В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон кодирует полипептидную последовательность, которая направляет белок, содержащий эту полипептидную последовательность, для расщепления.
Исходный или фоновый уровень сплайсинга альтернативного экзона можно оптимизировать путем изменения последовательностей экзонного энхансера сплайсинга (ESE) и последовательностей экзонного супрессора сплайсинга (ESS) и/или путем введения последовательностей ESE или ESS в альтернативный экзон. Такие изменения в последовательности альтернативного экзона могут быть выполнены с применением способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, сайтнаправленный мутагенез. В альтернативном варианте олигонуклеотиды желаемой последовательности (например, содержащие весь или часть альтернативного экзона) могут быть получены из коммерческих источников и клонированы в кассету регулирования генов. Идентификацию последовательностей ESS и ESE можно осуществить с помощью известных в данной области техники способов, включая, например, применение ESE finder 3.0 (Cartegni, L. et al. ESE finder: веб-ресурс для идентификации экзонных энхансеров сплайсинга. Nucleic Acid Research, 2003, 31(13):3568-3571) и/или других доступных ресурсов.
В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон является экзогенным для целевого гена, хотя он может быть получен из последовательности, происходящей из организма, в котором будет экспрессирован целевой ген. В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон представляет собой синтетическую последовательность (см. пример 10).
В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон является природным экзоном (см. пример 10). В другом варианте реализации изобретения альтернативный экзон получают из всего или части известного экзона (см. пример 10). В этом контексте термин производный относится к альтернативной последовательности, содержащей экзон, которая по существу гомологична экзону естественного происхождения или его части, но может содержать различные мутации, например, для введения стопкодона, который будет находиться в рамке с последовательностью целевого гена, или для введения или удаления экзонного энхансера сплайсинга и/или введения или удаления экзонного супрессора сплайсинга. В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон получают из экзона 2 гена дигидрофолатредуктазы человека (DHFR), экзона 5 мутантной опухоли Вильмса 1, дельта экзона 16 кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы II мыши, или экзона 6 SIRT1.
5'- и 3'-интронные последовательности.
Альтернативный экзон граничит из 5'- и 3'-интронными последовательностями. 5'- и 3'-интронные последовательности, которые могут применяться в кассете для регулирования гена по данному изобретению, могут представлять собой любую последовательность, которая может быть сплайсирована из целевого гена, образовывая при этом либо мРНК целевого гена, либо целевой ген, содержащий альтернативный экзон в мРНК, в зависимости от наличия или отсутствия лиганда, связывающегося с аптамером. Каждый из 5'- и 3'-интронов имеет последовательности, необходимые для осуществления процесса сплайсинга, например последовательности донора сплайсинга, акцептора сплайсинга и последовательности точек разветвления. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интронные последовательности кассеты для регулирования гена получают из одного или более интронов естественного происхождения или их части. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интронные последовательности получают из укороченного интрона 2 бета-глобина человека (IVS2Δ). В других вариантах реализации изобретения 5'- и 3'-интронные последовательности получают из интрона мРНК SV40 (применяемого в векторе pCMV-LacZ от компании Clonetech), интрона 6 гена триозофосфатизомеразы человека (TPI) (Nott Ajit, et al. RNA. 2003, 9:6070617) или интрона из фактора IX человека (Sumiko Kurachi et al. J. Bio. Chem. 1995, 270 (10), 5276), собственного эндогенного интрона целевого гена или любого геномного фрагмента или синтетических интронов (Yi Lai, et al. Hum Gene Ther. 2006, 17(10):1036), которые содержат элементы, необходимые для регулируемого сплайсинга (Thomas A. Cooper, Methods, 2005, (37):331).
В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон и рибосвитч по данному изобретению сконструированы таким образом, чтобы содержаться в эндогенном интроне целевого гена. Это означает, что интрон (или по существу подобная интронная последовательность) встречается в естественных условиях в этом положении целевого гена. В этом случае интронная последовательность непосредственно перед альтернативным экзоном называется 5'-интронной последовательностью или после- 9 037120 довательностью 5'-интрона, а интронная последовательность непосредственно после альтернативного экзона называется З'-интронной последовательностью или последовательностью З'-интрона. В этом случае эндогенный интрон модифицируют таким образом, чтобы он содержал последовательность акцептора сплайсинга и последовательность донора, граничащие с 5'- и 3'-концами альтернативного экзона.
Участки донора сплайсинга и акцептора сплайсинга в кассете регулирования гена по данному изобретению могут быть модифицированы с целью усиления или ослабления их функций. Это означает, что участки сплайсинга можно модифицировать таким образом, чтобы они были более подобны с консенсусной последовательностью донора или акцептора сплайсинга, применяя с этой целью стандартные методики клонирования, сайт-направленный мутагенез и т.п. Участки сплайсинга, которые в большей степени подобны с консенсусной последовательностью донора или акцептора сплайсинга, как правило, способствуют процессу сплайсинга и, таким образом, укрепляются. Участки сплайсинга, которые в меньшей степени подобны с консенсусной последовательностью донора или акцептора сплайсинга, как правило, тормозят процесс сплайсинга и, таким образом, ослабевают. Консенсусной последовательностью для донора сплайсинга наиболее распространенного класса интронов (U2) является А/С A G || G T A/G A G Т (где || обозначает границу экзона/интрона). Консенсусной последовательностью для акцептора сплайсинга является С A G || G (где || обозначает границу экзона/интрона). Частота конкретных нуклеотидов на участках донора сплайсинга и акцептора сплайсинга известна в данной области техники (см., например., Zhang, M.Q., Hum Mol Genet. 1988. 7(5):919-932). Силу 5'ss- и 3'-участков сплайсинга можно скорректировать с целью модулирования сплайсинга альтернативного экзона.
Дополнительные модификации 5'- и 3'-интронов в кассете для регулирования гена можно осуществить с целью модулирования сплайсинга, включая модификацию, удаление и/или добавление элементов интронного энхансера сплайсинга и/или элементов интронного супрессора сплайсинга и/или модификацию последовательности участка разветвления.
В одном варианте реализации изобретения 5'-интрон модифицирован с той целью, чтобы содержать стоп-кодон, который будет находиться в рамке с целевым геном. 5'- и 3'-интронные последовательности также можно модифицировать с целью удаления криптических участков сплайсинга, которые можно идентифицировать с помощью общедоступного программного обеспечения (см., например, Kapustin, Y. et al. Nucl. Acids Res. 2011. 1-8). Длину 5'- и 3'-интронных последовательностей можно отрегулировать с целью, например, соответствия требованиям к размерам для конструкций вирусной экспрессии. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интронные последовательности, каждая независимо, содержат от около 50 до около 300 нуклеотидов в длину. В одном варианте реализации изобретения 5'- и 3'-интронные последовательности, каждая независимо, содержат от около 125 до около 240 нуклеотидов в длину.
Целевые гены.
Кассета для регулирования гена по данному изобретению представляет собой платформу, которую можно применять для регулирования экспрессии любого целевого гена, который может быть экспрессирован в целевой клетке, ткани или организме. Термин целевой ген относится к полинуклеотиду, который вводится в клетку и способен транскрибироваться в РНК и транслироваться и/или экспрессироваться в соответствующих условиях. В альтернативном варианте, целевой ген является эндогенным по отношению к целевой клетке, а кассета для регулирования гена по данному изобретению помещается в целевой ген (например, в существующий интрон эндогенного целевого гена). Примером целевого гена является полинуклеотид, кодирующий терапевтический полипептид. В одном варианте реализации изобретения, когда целевой ген экспрессируется с применением кассеты для регулирования гена по данному изобретению, целевой ген не экспрессируется в виде химерного белка, содержащего альтернативный экзон. Включение альтернативного экзона сводит к минимуму трансляцию мРНК, например вызывая расщепление матрицы, содержащей альтернативный экзон, или иным образом предотвращает экспрессию функционального целевого гена, посредством, например, его преждевременного усечения. В одном варианте реализации изобретения целевой ген является экзогенным для клетки, в которой будет транскрибироваться конструкция рекомбинантной ДНК. В другом варианте реализации изобретения целевой ген является эндогенным для клетки, в которой будет транскрибироваться конструкция рекомбинантной ДНК. В одном варианте реализации изобретения альтернативный экзон может содержать стоп-кодон в рамке с кодирующей последовательностью целевого гена. В других вариантах реализации изобретения альтернативный экзон может содержать другие последовательности, которые приводят к расщеплению транскрипта и/или блокированию трансляции целевого гена.
Целевой ген по данному изобретению может представлять собой ген, кодирующий белок, или последовательность, кодирующую РНК, не кодирующую белок. Целевым геном может быть, например, ген, кодирующий структурный белок, фермент, белок сигнальной системы клетки, митохондриальный белок, белок цинковый пальцы, гормон, транспортный белок, фактор роста, цитокин, внутриклеточный белок, внеклеточный белок, трансмембранный белок, цитоплазматический белок, ядерный белок, рецепторную молекулу, РНК-связывающий белок, ДНК-связывающий белок, транскрипционный фактор, трансляционный элемент, канальный белок, моторный белок, молекулу адгезии клеток, митохондриальный белок, метаболический фермент, киназу, фосфатазу, факторы обмена, шапероновый белок и модуля- 10 037120 торы любого из вышеперечисленных веществ. В вариантах реализации изобретения целевой ген кодирует эритропоэтин (Еро), гормон роста человека (hGH), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), инсулин человека, ассоциированный с CRISPR белок 9 (cas9) или иммуноглобулин (или его часть), включая, например, терапевтическое антитело.
Конструкции экспрессии.
В данном изобретении рассматривается применение рекомбинантного вектора для введения в целевые клетки полинуклеотида, кодирующего целевой ген и содержащего кассету для регулирования гена по данному изобретению. Во многих вариантах реализации изобретения конструкция рекомбинантной ДНК по данному изобретению включает дополнительные элементы ДНК, включая сегменты ДНК, которые обеспечивают репликацию ДНК в клетке-хозяине и экспрессию целевого гена в этой клетке на соответствующих уровнях. Обычному квалифицированному специалисту в данной области техники известно, что последовательности регулирования экспрессии (промоторы, энхансеры и т. п.) выбирают исходя из их способности стимулировать экспрессию целевого гена в целевой клетке. Термин вектор означает рекомбинантную плазмиду, дрожжевую искусственную хромосому (YAC), мини-хромосому, миникольцо ДНК или вирус (включая последовательности, полученные из вирусов), которые включают полинуклеотид, который должен быть доставлен в клетку-хозяин либо in vitro, либо in vivo. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантный вектор представляет собой вирусный вектор или комбинацию множества вирусных векторов.
Вирусные векторы для экспрессии целевого гена в целевой клетке, ткани или организме известны в данной области техники и включают векторы аденовируса (AV), аденоассоциированного вируса (AAV), ретровируса, лентивируса и вируса простого герпеса 1 типа (HSV1).
Аденовирусные векторы включают, например, векторы на основе аденовируса человека 2 типа и аденовируса человека 5 типа, характеризующиеся дефективной репликацией из-за делеций в областях Е1 и E3. Транскрипционная кассета может быть вставлена в область Е1, в результате чего получают рекомбинантный AV-вектор с Е1/E3-делецией. Аденовирусные векторы также включают хелпер-зависимые высокоэффективные аденовирусные векторы (также известные как высокоэффективные, выпотрошенные или опустошенные векторы), которые не содержат вирусных кодирующих последовательностей. Эти векторы содержат цис-активные элементы, необходимые для репликации и упаковки вирусной ДНК, в основном последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) и сигнал упаковки (Ψ). Эти хелпер-зависимые геномы AV-векторов могут переносить от нескольких сотен пар оснований до около 36 т. п.о. чужеродной ДНК.
Рекомбинантные векторы аденоассоциированного вируса rAAV включают любой вектор, полученный из любого серотипа аденоассоциированного вируса, включая, без ограничения, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 и AAV-8, AAV-9, AAV-10 и т. п. rAAV-векторы могут иметь один или более генов дикого типа AAV, удаленных полностью или частично, предпочтительно генов Rep и/или Сар, но которые при этом сохраняют функциональные фланкирующие последовательности ITR. Функциональные последовательности ITR сохраняются для освобождения, репликации, упаковки и возможной хромосомной интеграции генома AAV. Последовательности ITR необязательно должны быть нуклеотидными последовательностями дикого типа и могут быть изменены (например, путем вставки, делеции или замещения нуклеотидов) при условии, что последовательности обеспечивают функциональное облегчение, репликацию и упаковку.
В альтернативных вариантах реализации изобретения можно применять другие системы, такие как лентивирусные векторы. Системы на основе лентивирусов могут трансдуцировать неделящиеся, а также делящиеся клетки, что делает их пригодными для целевых применений, например неделящиеся клетки ЦНС. Лентивирусные векторы получают из вируса иммунодефицита человека; при этом векторы, подобно вирусу иммунодефицита человека, интегрируются в геном хозяина, обеспечивая возможность очень долговременной экспрессии генов.
Полинуклеотиды, включая плазмиды, YAC, мини-хромосомы и мини-кольца, несущие целевой ген, содержащий кассету для регулирования гена, также можно вводить в клетку или в организм с помощью невирусных векторных систем посредством, например, катионных липидов, полимеров или и тех и других носителей. Конъюгированные поли-Ь-лизиновые (PLL) и полиэтилениминовые (PEI) полимерные системы также можно применять для доставки вектора в клетки. Другие способы доставки вектора в клетки включают гидродинамическую инъекцию и электропорацию и применение ультразвука как для клеточной культуры, так и для организмов. Для обзора вирусных и невирусных систем доставки для доставки генов см. работу Nayerossadat, N. et al. (Adv Biomed Res. 2012; 1:27), включенную в настоящий документ посредством ссылки.
Способы модулирования экспрессии целевого гена.
В одном аспекте данного изобретения предлагается способ модулирования экспрессии целевого гена (например, терапевтического гена), включающий (а) вставку кассеты для регулирования гена по данному изобретению в целевой ген, (b) введение целевого гена, содержащего кассету для регулирования гена, в клетку и (с) воздействие на клетку лигандом, который связывается с аптамером. В одном варианте реализации изобретения лиганд представляет собой низкомолекулярное соединение. В аспектах изобре- 11 037120 тения экспрессия целевого гена в целевых клетках придает желаемое свойство клетке, в которую ген был введен, или иным образом приводит к желаемому терапевтическому результату.
В предпочтительном варианте реализации изобретения кассету для регулирования гена вводят в кодирующую белок последовательность целевого гена (а не в 5'- или 3'-нетранслируемые области). В одном варианте реализации изобретения в целевой ген вводят одну кассету для регулирования гена. В других вариантах реализации изобретения в целевой ген вводят 2, 3, 4 или более кассет для регулирования гена. В одном варианте реализации изобретения в целевой ген вводят две кассеты для регулирования гена. Если в целевой ген вводят множество кассет для регулирования гена, каждая из них может содержать один и тот же аптамер, вследствие чего один лиганд можно применять для модулирования альтернативного сплайсинга на множестве кассет и, тем самым, модулировать экспрессию целевого гена. В других вариантах реализации изобретения в целевой ген вводят множество кассет для регулирования гена, при этом каждая из кассет может содержать отличающийся аптамер, вследствие чего посредством воздействия множества различных низкомолекулярных лигандов модулируется экспрессия целевого гена. В других вариантах реализации изобретения в целевой ген вводят множество кассет для регулирования гена, при этом каждая из кассет содержит последовательности 5'-интрона, альтернативного экзона и 3'-интрона. Это может быть полезно для снижения рекомбинации и улучшения удобства включения в вирусные векторы.
Способы лечения и фармацевтические композиции.
В одном аспекте данного изобретения предлагается способ регулирования уровня терапевтического белка, применяемого в рамках генной терапии. В этом варианте реализации изобретения целевой ген может кодировать терапевтический белок. Целевой ген может кодировать белок, который является эндогенным или экзогенным для клетки.
Последовательность терапевтического гена, содержащая регуляторную кассету с рибосвитчем, приводимым в действие аптамером, доставляется в целевые клетки в организме, например, с помощью вектора. Специфичность клеток целевого гена можно контролировать с помощью промотора или других элементов внутри вектора. Первым этапом получения терапевтического белка является доставка векторной конструкции, содержащей целевой ген, и трансфекция целевых тканей, приводящая к устойчивой трансфекции регулируемого целевого гена.
Однако из-за наличия регуляторной кассеты в последовательности целевого гена существенных уровней экспрессии целевого гена не наблюдается, т.е. ген находится в выключенном состоянии в отсутствие специфического лиганда, который связывается с аптамером, содержащимся в рибосвитче регуляторной кассеты. Экспрессия целевого гена активируется только тогда, когда вводят лиганд, являющийся специфическим к аптамеру.
Доставку векторной конструкции, содержащей целевой ген, и доставку активирующего лиганда, как правило, разделяют во времени. Посредством доставки активирующего лиганда можно будет контролировать периоды экспрессии целевого гена, а также уровни экспрессии белка. Лиганд можно вводить с помощью нескольких путей введения, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный, внутримышечный (в/м), внутривенный (в/в), внутриглазной или топический.
Выбор времени для введения лиганда будет зависеть от необходимости активации целевого гена. Например, если терапевтический белок, кодируемый целевым геном, требуется постоянно, пероральный низкомолекулярный лиганд можно вводить ежедневно или несколько раз в день для обеспечения непрерывной активации целевого гена и, соответственно, непрерывной экспрессии терапевтического белка. Если целевой ген обладает эффектом длительного действия, индуцирующий лиганд можно вводить с меньшей частотой.
Данное изобретение позволяет регулировать экспрессию терапевтического трансгена во времени посредством способа, определяемого временными интервалами введения лиганда, специфичного для аптамера, в регуляторной кассете. Экспрессия терапевтического трансгена только при введении лиганда повышает безопасность лечения с применением генной терапии, обеспечивая возможность целевому гену отключиться в отсутствие лиганда.
С целью обеспечения возможности различным лигандам активировать целевые гены можно применять различные аптамеры. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый терапевтический ген, содержащий регуляторную кассету, будет иметь специфический аптамер в кассете, который будет активироваться специфическим низкомолекулярным веществом. Это означает, что каждый терапевтический ген может быть активирован только лигандом, специфичным для аптамера, размещенного внутри него. В этих вариантах реализации изобретения каждый лиганд активирует только один терапевтический ген. Это допускает возможность того, что несколько разных целевых генов могут быть введены одному человеку и каждый из них будет активироваться при введении специфического лиганда для аптамера, содержащегося в регуляторной кассете, размещенной в каждом целевом гене.
Данное изобретение позволяет любому терапевтическому белку, ген которого может быть введен в организм (например, эритропоэтину (Еро) или терапевтическому антителу), продуцироваться в организме при введении активирующего лиганда. Этот способ доставки терапевтического белка может заменить изготовление таких терапевтических белков вне организма, которые затем вводят путем инъекции или
- 12 037120 инфузии, например антител, применяемых в лечении рака, или антител, которые останавливают развитие воспалительного или аутоиммунного заболевания. Организм, содержащий регулируемый целевой ген, становится фабрикой по изготовлению биологических препаратов, которая начитает работать тогда, когда вводят лиганд, специфический для гена.
Уровни доз и временные характеристики введения терапевтического белка могут иметь решающее значение для терапевтического эффекта, например, при введении препарата АВАСТИН® (антитело анти-VEGF) при лечении рака. Данное изобретение повышает простоту подбора схемы введения в ответ на мониторинг уровней и эффектов терапевтического белка.
В одном варианте реализации изобретения целевой белок может представлять собой нуклеазу, которая может нацеливаться на конкретную последовательность ДНК и редактировать ее. Такие нуклеазы включают Cas9, нуклеазы, содержащие цинковые пальцы, или TALEN. В случае с этими нуклеазами нуклеазный белок может потребоваться в течение всего лишь короткого периода времени, достаточного для редактирования целевых эндогенных генов. Однако, если нерегулируемый ген нуклеазы вводят в организм, нуклеазный белок может присутствовать в клетке на протяжении всей ее жизни. В случае с нуклеазами риск редактирования вне целевого фрагмента возрастает параллельно с продлением периода существования нуклеазы в клетке. Регулирование экспрессии таких белков имеет значительное преимущество в плане безопасности. В этом случае вектор, содержащий целевой ген нуклеазы, содержащий регуляторную кассету, может быть введен в соответствующие клетки организма. В отсутствие лиганда, специфического для кассеты, целевой ген находится в выключенном состоянии, поэтому нуклеаза не образуется. Нуклеаза образуется только тогда, когда вводят активирующий лиганд. По истечении достаточного времени для надлежащего редактирования лиганд извлекают и повторно не вводят. Таким образом, ген нуклеазы после этого находится в выключенном состоянии, дополнительной нуклеазы не образуется и редактирование прекращается. Этот принцип можно применять для коррекции генетических патологических состояний, включая ряд унаследованных ретинопатий, таких как врожденный амавроз Лебера 10 типа (LCA10), обусловленный мутациями в СЕР290, и болезнь Штаргардта, обусловленная мутациями в АВСА4.
Введение регулируемого целевого гена, кодирующего терапевтический белок, который активируется только при введении специфического лиганда, может применяться для регулирования терапевтических генов при лечении множества различных заболеваний, например рака с применением терапевтических антител, иммунных нарушений с применением иммуномодулирующих белков или антител, метаболических заболеваний, редких заболеваний, таких как пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH) с применением антител анти-С5 или фрагментов антител в качестве регулируемого гена, или при лечении нарушений глазного ангиогенеза с применением терапевтических антител и сухой возрастной дегенерации макулы (AMD) с применением иммуномодулирующих белков.
Для применения в данном изобретении пригодно большое количество специфических целевых генов, назначаемых в лечении широкого спектра специфических заболеваний и патологических состояний. Например, инсулин или аналог инсулина (предпочтительно инсулин человека или аналог инсулина человека) можно применять в качестве целевого гена для лечения диабета I типа, диабета II типа или метаболического синдрома; гормон роста человека можно применять в качестве целевого гена для лечения детей с задержкой роста или взрослых с недостаточностью гормона роста; эритропоэтин (предпочтительно эритропоэтин человека) можно применять в качестве целевого гена для лечения анемии при хроническом заболевании почек, анемии при миелодисплазии или анемии при проведении химиотерапии рака.
Данное изобретение может быть особенно пригодным при лечении заболеваний, обусловленных дефектами одного гена, таких как кистозный фиброз, гемофилия, мышечная дистрофия, талассемия или серповидноклеточная анемия. Таким образом, β-, γ-, δ- или ζ-глобин человека может применяться в качестве целевого гена для лечения β-талассемии или серповидноклеточной анемии; фактор VIII или фактор IX человека может применяться в качестве целевого гена для лечения гемофилии А или гемофилии В.
Лиганды, применяемые в данном изобретении, обычно комбинируют с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями для образования фармацевтических композиций, пригодных для введения пациенту. Фармацевтически приемлемые носители включают растворители, связующие вещества, разбавители, разрыхлители, смазывающие вещества, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, задерживающие абсорбцию, и тому подобные вещества, обычно применяемые в фармацевтике. Фармацевтические композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, капсул, пастилок и то.п. и составлены так, чтобы быть совместимыми с предполагаемым путями их введения. Примеры путей введения включают парентеральный, например внутривенный, внутрикожный, интраназальный, подкожный, пероральный, ингаляционный, трансдермальный (топический), трансмукозальный и ректальный пути.
Фармацевтические композиции, содержащие лиганды, вводят пациенту согласно схеме применения, обеспечивающей получение пациентом количества лиганда, достаточного для желаемого регулирования целевого гена. Если лиганд представляет собой низкомолекулярную структуру, а лекарственная форма представляет собой таблетку, пилюлю или т.п., предпочтительно фармацевтическая композиция
- 13 037120 содержит от 0,1 мг до 10 г лиганда; от 0,5 мг до 5 г лиганда; от 1 мг до 1 г лиганда; от 2 до 750 мг лиганда; от 5 до 500 мг лиганда или от 10 до 250 мг лиганда.
Фармацевтические композиции можно вводить один раз в сутки или несколько раз в сутки (например, 2, 3, 4, 5 или более раз в сутки). В альтернативном варианте фармацевтические композиции можно вводить реже чем один раз в сутки, например один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, или один раз в месяц, или один раз в несколько месяцев. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции можно вводить пациенту только небольшое количество раз, например один, два, три раза и т.д.
В данном изобретении предлагается способ лечения пациента, имеющего показания для повышения экспрессии терапевтического белка, кодируемого целевым геном, при этом способ включает введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей лиганд для аптамера, причем пациент ранее получал рекомбинантную ДНК, содержащую целевой ген, при этом целевой ген содержит кассету для регулирования гена по данному изобретению, которая обеспечивает возможность регулировать экспрессию целевого гена посредством аптамер/лиганд-опосредованного альтернативного сплайсинга пре-мРНК целевого гена, тем самым повышая уровень экспрессии терапевтического белка.
Г отовые изделия и наборы.
В данном изобретении также предлагаются наборы или готовые изделия для применения согласно описанным способам. В аспектах данного изобретения наборы включают композиции, описанные в данном документе (например, композиции для доставки вектора, содержащего целевой ген, который, в свою очередь, содержит кассету для регулирования гена), в пригодной упаковке. Пригодная упаковка для композиций (таких как композиции для инъекций в глаз), описанные в данном документе, известны в данной области техники и включают, например, флаконы (например, герметичные флаконы), сосуды, ампулы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные пакеты из пленки Майлар или пластиковые пакеты) и т.п. Эти готовые изделия могут быть дополнительно стерилизованы и/или герметизированы.
В данном изобретении также предлагаются наборы, содержащие композиции, описанные в данном документе, и могут дополнительно содержать инструкцию(и) по способах применения композиции, таких как применение, описанное в данном документе. Наборы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листки-вкладыши в упаковку с инструкциями относительно введения, включая, например, любые способы, описанные в данном документе. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения указанный набор содержит rAAV для экспрессии целевого гена, содержащего кассету для регулирования гена по данному изобретению, фармацевтически приемлемый носитель, пригодный для инъекций, и один или более из элементов: буфер, разбавитель, фильтр, иглу, шприц и листок-вкладыш в упаковку с инструкциями относительно выполнения инъекций. В некоторых вариантах реализации изобретения набор пригоден для внутриглазной инъекции, внутримышечной инъекции, внутривенной инъекции и т.п.
В данном контексте термины гомология и гомологичный относятся к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидными последовательностями. Соответствие между двумя последовательностями можно определить с помощью способов, известных в данной области техники. Например, степень гомологии можно определить путем прямого сравнения двух полипептидных молекул при выравнивании информации последовательности с применением общедоступных компьютерных программ. В альтернативном варианте степень гомологии можно определить путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, которые образуют стабильные дуплексы между гомологичными областями, с последующим расщеплением одноцепочечной специфической нуклеазой(ами) и определением размера расщепленных фрагментов. Две полинуклеотидные или две полипептидные последовательности являются по существу гомологичными одна с другой, если после оптимального выравнивания с соответствующими вставками или делециями по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90% и по меньшей мере около 95% нуклеотидов или аминокислот соответственно совпадают по длине молекул, что определяется с помощью вышеописанных способов.
Процент идентичности последовательности по отношению к эталонной последовательности полипептидов или нуклеиновых кислот определяется как процентное содержание аминокислотных остатков или нуклеотидов в кандидатной последовательности, идентичных аминокислотным остаткам или нуклеотидам в эталонной последовательности полипептидов или нуклеиновых кислот после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения разрывов с целью достижения максимальной процентной идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процентной идентичности последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот можно осуществить различными способами, известными специалистам в данной области техники, например используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, включая программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR).
В данном контексте термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Таким обра- 14 037120 зом, этот термин включает, но не ограничиваясь этим, одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания, или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания.
Термин гетерологичный или экзогенный описывает объект, полученный из объекта, генотипически отличного от остальной части объекта, с которой объект сравнивают или в которую объект вводят или включают. Например, полинуклеотид, вводимый с помощью методов генной инженерии в другой тип клеток, является гетерологичным полинуклеотидом (и, если он экспрессируется, может кодировать гетерологичный полипептид). Аналогичным образом, клеточная последовательность (например, ген или его часть), которая включена в вирусный вектор, является гетерологичной нуклеотидной последовательностью по отношению к вектору.
Необходимо понимать и ожидать, что специалисты в данной области техники могут осуществить изменения в принципах изобретения, описанных в данном документе, при этом предполагается, что такие изменения должны быть включены в объем данного изобретения. Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение и не должны рассматриваться как ограничивающие объем данного изобретения каким-либо образом. Все источники, цитируемые в данном документе, включены в данный документ в полном объеме посредством ссылок.
Примеры
Пример 1. Влияние силы участка сплайсинга на экспрессию регулируемых генов.
Экспериментальные методики.
Конструкции плазмид: Luci-BsaI-акцептор: Фрагмент ДНК, содержащий промотор CMV, высвобождали из вектора PVG-CMV-eGFP-W (Гарвардский университет) с помощью рестрикционных ферментов SpeI и NotI и клонировали этот фрагмент в вектор pHDM-G (Гарвардский университет), расщепленный с помощью ферментов SpeI и NotI. Фрагмент, содержащий последовательность SV40 Ori в полученном векторе, удаляли путем расщепления с помощью ферментов BsmI и BstXI, удаляя 3'-нависающий конец и лигируя. Последующий вектор подвергали сайт-направленному мутагенезу (Agilent) для удаления участка BsaI в гене AmpR. Полученный вектор затем расщепляли с помощью ферментов NotI и BamHI и лигировали с фрагментом, содержащим участки NotI-BsaI-BamHI, для получения конечного Luci-BsaI-акцепторного вектора. pHDM-G применяли в качестве матрицы для интрона 2 бета-глобина человека (IVS2Δ), содержащего делецию средней части, не являющейся основной для сплайсинга (см. табл. 5, SEQ ID NO: 1). pGL3-промотор (Promega) применяли в качестве матрицы для гена люциферазы светлячков.
Конструкция 8: Ген люциферазы амплифицировали с помощью ПЦР с применением праймеров Luc-For-BsaI и Luci-Rev-BsaI. Продукты ПЦР-расщепляли с помощью BsaI и клонировали в BsaIрасщепленный Luci-BsaI-акцепторный вектор. Конструкции сплайсинга 1-7 (Con 1-7, SEQ ID NO: 1-7), экспрессирующие ген люциферазы, вставленный в интрон IVS2Δ, который имеет разные участки 5'ss и 3'ss на каждом конце интронной последовательности, получали путем лигирования 3 BsaI-расщепленных продуктов ПЦР с BsaI-расщепленным Luci-BsaI-акцептором. pGL3-nромоторный вектор применяли в качестве матрицы люциферазы, a pHDM-G применяли в качестве матрицы для IVS2Δ. Праймерные пары, применяемые для амплификации фрагментов ПЦР для Con 1-7, были следующими:
Con 1: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_1, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_1 и Luci-Splice-For_1/LuciRev-BsaI;
Con 2: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_2, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_2, и Luci-Splice-For_2/LuciRev-BsaI;
Con 3: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_3, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_3, и Luci-Splice-For_3/LuciRev-BsaI;
Con 4: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_4, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_1, и Luci-Splice-For_4/LuciRev-BsaI;
Con 5: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_1, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_1 и Luci-Splice-For_5/LuciRev-BsaI;
Con 6: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_1, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_1 и Luci-Splice-For61/LuciRev-BsaI;
Con 7: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_1, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_1 и Luci-Splice-For71/LuciRev-BsaI.
Все конструкции были проверены секвенированием ДНК.
- 15 037120
Таблица 1
Участки сплайсинга в конструкциях сплайсинга (Con 1-7). Границы интрона/экзона отмечены ||
Конструкция 5'-участок сплайсинга З'-участок сплайсинга
Con 1 AGG GTGAGT TCTTATCTTCCTCCCACAG |C
Con 2 AAA|IGTAAGC TCTTATCTTCCTCCCACAG |C
Con 3 GCA IGTAAGT TCTTATCTTCCTCCCACAG||C
Con 4 GAG GTGTGG TCTTATCTTCCTCCCACAG||C
Con 5 AGG GTGAGT CTTTACTTCTATGACTGTAG |C
Con 6 AGG GTGAGT GTGACTGTGTGTATGCACAG||C
Con 7 AGG GTGAGT ATTGTGATCGCAGCCAATAG||C
Трансфицирование: Клетки HEK 293 в количестве 3,5х104 высевали на 96-луночный планшет с плоским дном лунок за день до трансфицирования. Плазмидную ДНК (500 нг) добавляли в пробирку или на 96-луночный планшет с U-подобным дном лунок. Отдельно добавляли реагент TransIT-293 (Mirus, 1,4 мкл) в 50 мкл среды Optimem I (Life Technologies) и оставляли на 5 мин при комнатной температуре (КТ). Затем 50 мкл этого разбавленного трансфекционного реагента добавляли к ДНК, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре (КТ) в течение 20 мин. Наконец, 7 мкл этого раствора добавляли в лунку к клеткам в 96-луночном планшете.
Анализ культивируемых клеток с применением люциферазы светлячков: Через 24 ч после замены среды планшеты извлекали из инкубатора и уравновешивали до КТ в течение нескольких минут на лабораторном столе, а затем аспирировали. Добавляли буфер Glo-lysis (Promega, 100 мкл, КТ) и оставляли планшеты при КТ в течение по меньшей мере 5 мин. Затем содержимое лунки смешивали с 50 мкл путем измельчения до порошкообразного состояния и 20 мкл каждого образца смешивали с 20 мкл реагента bright-glo (Promega), который разбавляли до 10% в буфере glo-lysis. 96 лунок размещали на непрозрачном белом 384-луночном планшете. После 5-минутной инкубации при КТ измеряли уровень люминесценции с помощью устройства Тесап с временем считывания 500 мс. Активность люциферазы выражали как среднюю относительная световая единица (RLU) ± С. О.
Результаты.
Чтобы сконструировать платформу для регулирования гена на основе сплайсинга, сначала проанализировали (i) эффект вставки интрона в кодирующую последовательность (CDS) представляющего интерес гена, в этом случае гена люциферазы светлячков (фиг. 1а), и (ii) эффекты различных участков 5'ss и 3 'ss на экспрессию генов. С целью оценки эффективности сплайсинга усеченный интрон 2 бета-глобина человека (IVS2Δ) с различными участками 5'ss и 3'ss на каждом конце вставляли в кодирующую последовательность гена люциферазы светлячков. Конструкция Con 8 не содержит интрона IVS2Δ, a Con 1 (SEQ ID NO: 1) имеет IVS2Δ с его исходными последовательностями IVS2 5 'и 3'ss. Конструкции от Con 2 до Con 7 (SEQ ID No.: 2-7) имеют IVS2Δ с различными последовательностями 5' и 3'ss, перечисленными в табл. 1. Как проиллюстрировано на фиг. 1b, вставка IVS2Δ с нативными участками сплайсинга IVS2 в ген люциферазы не влияла на экспрессию гена (сравните Con 1 и Con 8). Однако замена участков сплайсинга IVS2 в IVS2Δ последовательностями участков сплайсинга, имеющих различную силу, значительно снижала экспрессию люциферазы. Как проиллюстрировано на фиг. 1b, Con 2 и Con 3 с измененными участками 5'ss имеют уровни экспрессии, аналогичные уровням Con 1 и Con 8, однако изменения 5'ss в Con 4 и изменения 3'ss в конструкциях от Con 5 до Con 7 значительно снижали экспрессию люциферазы (ср. конструкции от Con 4 до Con 7 с конструкцией Con 8). Таким образом, различия в участках сплайсинга влияют на экспрессию целевого гена. Con 1 применяли для дальнейшего изучения.
Пример 2. Кассета интрон-экзон-интрон и влияние цис-элементов на сплайсинг при модулирующей экспрессии целевого гена.
Экспериментальные методики.
Предполагаемые последовательности экзонного энхансера сплайсинга (ESE) были спрогнозированы с помощью ESE finder 3.0. Синтезировали (IDT) экзон 2 человеческой дигидрофолатредуктазы (DHFR) дикого типа с интронными фланкирующими последовательностями либо с нативным 5'ss (DHFR-wt; (табл. 2); SEQ ID NO: 47), либо с нативным 5'ss с четырьмя нуклеотидами, мутированными до С (DHFR-wt5ssC (табл. 2); SEQ ID NO: 48), 5'ss-последовательностями из Con 1 (DHFR-Con 15ss; табл. 2 SEQ ID NO: 49) или Con4 (DHFR-Con45ss, SEQ ID NO: 50). С целью оценки влияния последовательностей ESE и экзонного супрессора сплайсинга (ESS) в экзоне 2 DHFR синтезировали различные мутанты экзона 2 DHFR (перечисленные в табл. 2).
Все эти различные последовательности экзона 2 DHFR клонировали в приблизительный центр интрона IVS2Δ в конструкции Con 1, применяя стратегию клонирования Golden Gate (NEB).
- 16 037120
Конструкции проверяли секвенированием ДНК (Genewiz). ДНК трансфицировали в клетки HEK
293 и анализировали на активность люциферазы, как описано в примере 1.
Таблица 2
Экзон 2 DHFR, содержащий модифицированные регуляторные последовательности сплайсинга. Подчеркнутая последовательность означает модифицированные регуляторные последовательности сплайсинга
в экзоне 2 DHFR
DHFR-wt GAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAG
mtSRp40 GAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAG
StrSC35 GAATGGCCCCTGATATTTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAG
SC35hnRNPAl GAAT GTAGGGAGATATT TСCAGAGAAT GACCACAACCTСTT CAGTAGAAG
Результаты.
Экзон 2 человеческой DHFR дикого типа и примыкающие интронные последовательности (SEQ ID NO: 8) вставляли в приблизительный центр интрона IVS2Δ в конструкции Con 1. Эта конфигурация генерирует платформу, в которой экзогенный экзон в интронной последовательности целевого гена может функционировать как альтернативный экзон, который обеспечивает возможность регулирования экспрессии целевого гена посредством модулирования сплайсинга альтернативного экзона. В этой конфигурации (фиг. 2а) предположительно возникают явления сплайсинга между 5'-частью целевого гена и экзоном DHFR, а также между экзоном DHFR и 3'-частью целевого гена, что приводит к включению экзона DHFR в мРНК целевого гена. В силу того, что альтернативный экзон DHFR содержит внутрирамочный преждевременный стоп-кодон, когда экзон DHFR включен в мРНК, уровень экспрессию гена люциферазы в этих случаях снижается. Однако, когда участок 5'ss альтернативного экзона DHFR (т.е. участок донора сплайсинга на 5'-конце 3'-интрона) мутирован или недоступен, что предотвращает сплайсинг на этом участке, экзон DHFR исключается из мРНК, мРНК эффективно транслируется, а белок целевого гена экспрессируется (фиг. 2а).
На первом этапе проанализировали сплайсинг экзона 2 DHFR с его неизменными нативными цисэлементами, а также различными другими версиями, в которых последовательности 5'ss были либо усилены, либо ослаблены. Вставка экзона DHFR с нативными 5'ss и 3'ss (SEQ ID NO: 8) в интронную последовательность в Con 1 для создания DHFR_wt, значительно снижала экспрессию люциферазы по сравнению с Con1, которая не содержит альтернативного экзона DHFR. Уровень экспрессии в конструкции DHFR_wt в 116 раз ниже, чем в Con 1 (фиг. 2b).
Когда 5'ss экзона DHFR мутирован до нефункциональной последовательности (DHFR_wt5ssC; SEQ ID NO: 48), включение экзона DHFR блокируется и экспрессия люциферазы восстанавливается до уровня Con 1 (фиг. 2aII, 2b, 2c)
Если участок 5'ss экзона DHFR заменяют более сильным участком 5'ss, в этом случае 5'ss из Con 1 (DHFR_Con1 5ss; SEQ ID NO: 49), включение экзона DHFR повышается, что приводит к 545-кратному снижению уровня экспрессии гена люциферазы по сравнению с Con 1 (фиг. 2b). Однако, при применении слабого участка 5'ss из Con 4 (DHFR_Con4 5ss; SEQ ID NO: 50) экзон DHFR не включается и уровень экспрессии люциферазы повышается (фиг. 2b).
Элементы экзонного энхансера сплайсинга (ESE) или экзонного супрессора сплайсинга (ESS) играют решающую роль в процессе сплайсинга, а их функции часто являются контекстно-зависимыми. Проанализировано влияние предполагаемых регуляторных последовательностей сплайсинга, расположенных в экзоне DHFR. Когда предполагаемый энхансер сплайсинга, участок связывания SRp40, расположенный в экзоне DHFR, подвергали мутации (табл. 2, DHFR_mtSRp40; SEQ ID NO: 51), включение экзона DHFR существенно повышалось, что приводило к снижению уровня экспрессии люциферазы в 2982 раза по сравнению с Con 1 (фиг. 2с, DHFR_wt и DHFR_mtSRp40).
При применении другого энхансера сплайсинга, когда участок связывания SC35 в экзоне DHFR (спрогнозированный с помощью ESEfinder) подвергали мутации с получением в результате более сильной последовательности, связывающей SC35 (табл. 2, DHFR_StrSC35; SEQ ID NO52), включение экзона DHFR повышалось, уменьшая экспрессию люциферазы в 139 раз по сравнению с Con1 (фиг. 2с, DHFR_wtStrSC35). Это уменьшение было немного больше, чем наблюдаемое в конструкции, содержащей нативный экзон DHFR (DHFR_wt фиг. 2b)
При применении энхансера сплайсинга, когда участок связывания SC35 подвергали мутации с получением в результате ингибитора сплайсинга (участок связывания hnRNP A1) (табл. 2, DHFR_wtSC35hnRNPA1; SEQ ID NO53) включение экзона DHFR было менее эффективным, что приводило к повышению уровня экспрессии люциферазы (фиг. 2с, DHFR_wt и DHFR_wtSC35hnRNPA1).
Была создана кассета интрон-экзон-интрон, в которой экспрессия целевого гена, в данном случае люциферазы, может быть включена или выключена в зависимости от включения или исключения аль
- 17 037120 тернативного экзона, в этом случае альтернативного экзона DHFR, содержащего внутрирамочный стопкодон. Процесс сплайсинга, который приводит к включению альтернативного экзона, снижает уровень экспрессии генов, при том что уровень экспрессии генов возрастает, когда сплайсинг исключает альтернативный экзон. Сила или ослабление участков 5'ss альтернативных экзонов, а также последовательности в экзоне, которые модулируют сплайсинг, изменяют уровень целевой экспрессии посредством их влияния на включение или исключение экзогенного экзона.
Пример 3. Влияние шпилькообразной структуры на участке сплайсинга 5' альтернативного экзона на регулирование экспрессии целевого гена.
Экспериментальные методики.
Синтезировали (IDT) последовательности, содержащие экзон 2 DHFR с нативными 3'- и 5'ssпоследовательностями, в которых 5'ss были встроены в шпилькообразную структуру и клонированы в указанный вектор с применением стратегии клонирования Golden Gate (NEB). Конструкции трансфицировали в клетки HEK 293 и анализировали на активность люциферазы, как описано в примере 1.
Результаты.
Авторы изобретения анализировали, может ли включение участка 5'ss экзона DHFR в структуру стебля шпильки повлиять на сплайсинг и включение альтернативного экзона DHFR и таким образом изменить экспрессию целевого гена (см. фиг. 3a).
Включение альтернативного экзона DHFR с последовательностями участка сплайсинга 5' конструкции Con 1 (DHFR_Con15ss; SEQ ID NO: 49) блокировало экспрессию люциферазы по сравнению с Con 1 (фиг. 3c, DHFR_Con15ss). Шпилькообразная структура из 15 пар оснований (п.о.), встроенная во всю последовательность участка 5'ss, была сконструирована в DHFR_Con 15ss для создания DHFR_Con 15ss_HP15 (SEQ ID NO: 54) (фиг. 3a). Наличие шпилькообразной структуры из 15 п.о. полностью восстанавливает экспрессию люциферазы до уровня Con 1, свидетельствуя о том, что шпилька блокирует доступность участка 5'ss и тем самым препятствует включению альтернативного экзона DHFR. (фиг. 3с, Con 1, DHFR_Con15ss и DHFR_Con15ss_HP15).
Напротив, шпилька из 15 п.о. со сломанным стеблем (фиг. 3b, Con15ss_15HPx; SEQ ID NO: 55) не имела возможности восстанавливать экспрессию люциферазы (фиг. 3c, DHFR_Con15ss_HP15x), указывая на то, что неповрежденный стебель является важным компонентом вторичной структуры РНК, регулирующей доступность 5'-участка сплайсинга, и тем самым определяет включение или исключение альтернативного экзона.
Аналогичные эксперименты проводили с применением конструкции, содержащей экзон DHFR с мутантным участком связывания SRp40, который усиливал эффективность сплайсинга (DHFR_wtmtSRp40, см. Пример 2). Встраивание 5'ss в шпильку восстанавливало экспрессию люциферазы, тогда как нарушение шпильки блокировало экспрессию люциферазы (фиг. 3c, DHFR_wtmtSRp40, DHFR_wtmtSRp40_НР15 и DHFR_wtmtSRp40_HP15x).
Таким образом, встраивание участка 5'ss альтернативного экзона в шпилькообразную структуру может восстанавливать экспрессию целевого гена, блокируя доступность указанного участка 5'ss и тем самым предотвращая включение альтернативного экзона в мРНК, что позволяет экспрессироваться белку целевого гена. Создана платформа для экспрессии генов, в которой экспрессию белка целевого гена можно модулировать путем изменения доступности участка 5'ss экзогенного альтернативного экзона посредством вторичной структуры РНК.
Конструкцию DHFR_wtmtSRp40 (SEQ ID NO: 58) (далее обозначаемую как mtDHFR) применяли для дальнейшего исследования рибосвитча.
Пример 4. Применение теофиллинового аптамера для регулирования экспрессии целевого гена посредством альтернативного сплайсинга.
Экспериментальные методики.
DHFR-акцепторный вектор сконструировали для облегчения клонирования последовательности аптамеров, прикрепленной к стеблям шпильки разной длины. Последовательность применяемого теофиллинового аптамера была следующей: ggcgatacCAGCCGAAAGGCCCTTGgcagcgtc (SEQ ID NO: 9).
Олигонуклеотиды теофиллинового аптамера (олиго) с 4 нуклеотидным выступом на 5'-конце синтезировали (IDT), отжигали и лигировали с BsaI-расщепленным DHFR-акцепторным вектором. Клетки HEK 293 трансфицировали с репортерными конструкциями люциферазы с помощью регуляторной кассеты, содержащей теофиллиновый аптамер, как описано в примере 1. Через 4 ч после трансфицирования среду отсасывали и добавляли новую среду с 3 мМ теофиллина или без него, при этом люциферазу анализировали через 20-24 ч после воздействия теофиллином. Кратность индукции выражали как показатель активности люциферазы, полученный при наличии соединения аптамер/лиганд, деленный на значение, полученное в отсутствие соединения аптамер/лиганд. Уровень активности люциферазы выражали в процентах от уровня активности люциферазы (называемой максимальной экспрессией), продуцируемого конструкцией Con1, которая не содержит интрона IVS2Δ в CDS гена люциферазы.
Результаты.
С целью регулирования доступности 5'-участка сплайсинга альтернативного экзона, содержащего стоп-кодон, и тем самым осуществления регулирования экспрессии белков целевого гена, последова
- 18 037120 тельности аптамеров прикрепляли к стеблю шпилькообразной структуры, которая встраивает интронную часть участка 5'ss DHFR и его комплементарную последовательность. В этой конфигурации введение аптамерных последовательностей нарушает образование стебля шпильки, оставляя доступным участок 5'ss DHFR, что приводит к включению альтернативного экзона DHFR и предотвращению экспрессии белка целевого гена (фиг. 4а). Когда происходит связывание аптамер/лиганд, как показано на фиг. 4b, конформационное изменение в аптамере, вызванное связыванием лиганда, объединяет 5'ss DHFR и его комплементарную последовательность для стабильного образования стебля, таким образом скрывая 5'ss DHFR и приводя к исключению экзона DHFR и экспрессии белка целевого гена.
Теофиллиновый аптамер анализировали путем связывания нижнего стебля теофиллинового аптамера непосредственно со стеблем шпильки (фиг. 4с, DHFR_Theo1). Если стебель слишком длинный, он может образовывать стабильную структуру в отсутствие связывания аптамер/лиганд, а если стебель слишком короткий, он никогда не сможет образовать стабильный стебель, даже при наличии лиганда. Следовательно, длина стебля должна быть оптимизирована таким образом, чтобы стабильная вторичная структура формировалась только при связывании аптамер/лиганд. С целью определения оптимальной длины стебля, которая даст возможность образовать стебель при наличии, но не отсутствие лиганда, осуществили ряд конструкций, в которых клонированный теофиллиновый аптамер клонировали в mtDHFR (описанный в примере 2, табл. 2) и провели последовательные усечения стебля. Фиг. 4с иллюстрирует четыре конструкции с последовательным усечением стебля.
Фиг. 4d иллюстрирует экспрессию люциферазы в конструкциях с последовательным усечением стебля при наличии и в отсутствие теофиллина. В конструкциях от Theo 1 до Theo 12 с длиной стебля от 20 до 9 п.о. стебель шпильки имел достаточную длину, чтобы сформировать устойчивую вторичную структуру даже в отсутствие связывания аптамер/лиганд. Таким образом, экспрессия люциферазы наблюдается на уровнях, подобных Con 1, как в отсутствие, так и при наличии тиофиллина.
В конструкции DHFR_Theo13 в отсутствие теофиллина экспрессия люциферазы подавляется. Это свидетельствует о доступности участка 5'ss экзона mtDHFR, что приводит к включению альтернативного экзона DHFR и подавлению экспрессии генов. Однако при наличии теофиллина экспрессия люциферазы включалась, что приводило к 43-кратной индукции по сравнению с уровнем экспрессии без теофиллина, и при этом уровень экспрессии составлял 56% от уровня экспрессии люциферазы, наблюдаемого при применении контрольного вектора Con1. Таким образом, сконструирован рибосвитч для включения у млекопитающих, который включает экспрессию белка целевого гена при наличии соединения аптамер/лиганд, в данном случае с применением теофиллинового аптамера.
Пример 5. Применение xpt-гуанинового аптамера для регулирования экспрессии целевого гена посредством альтернативного сплайсинга.
Экспериментальные методики.
Xpt-гуаниновый аптамер со следующей последовательностью: cactcatataatCGCGTGGATATGGCACGCAAGTTTCTACCGGGCACCGTAAATGTCcgactatgggtg (SEQ ID NO: 10) применяли для создания рибосвитча. Олигонуклеотиды, содержащие последовательность гуанинового аптамера и стебля шпильки с 4 нуклеотидным выступом на 5'-конце, синтезировали (IDT), отжигали и лигировали с BsaI-расщепленным DHFR-акцепторным вектором. Клетки HEK 293 трансфицировали, как описано в примере 1. Через 4 ч после трансфицирования среду отсасывали и добавляли новую среду с 500 мкМ гуанина или без него. Экспрессию люциферазы анализировали через 20-24 ч после обработки гуанином, как описано в Примерах 1 и 4. HepG2, AML12, RD и С2С12 (АТСС) культивировали согласно протоколу, рекомендованному АТСС. Кассету интрон-экзон-интрон, содержащую рибосвитч xpt-G17 (SEQ ID NO: 15), вводили в лидерные пептидные последовательности гена антитела анти-KDR и в участок StuI в ген эритропоэтина мыши согласно стратегии клонирования Gibson (NEB). Конструкции, содержащие эритропоэтин (Еро) мыши или антитело анти-KDR, трансфицировали в клетки HEK 293. Через 4 ч после трансфицирования среду отсасывали и добавляли новую среду с 500 мкМ гуанина или без него. Супернатанты подвергали анализу ELISA для продуцирования либо антитела анти-KDR, либо продуцирования Еро мыши (R&D Systems).
Результаты.
Применение дополнительных аптамеров/лигандов для контроля экспрессии целевого гена с помощью аптамер-опосредованного модулирования альтернативного сплайсинга изучали путем присоединения xpt-гуанинового аптамера, полученного из Bacillus subtilis, через стебель Р1 к стеблю шпильки (фиг. 5а, DHFR_G1). Подобно примеру 4, сконструировали 18 конструкций путем последовательного усечения соединительного стебля (фиг. 5а и 5b, от G1 до G18 DHFR, также обозначаемого как от xpt-G1 до G18, содержащего регуляторные кассеты) для получения оптимальной длины стебля шпильки вместе с гуаниновым аптамером, что дает возможность для осуществления взаимодействия соединения аптамер/лиганд с доступным участком 5'ss и процессом сплайсинга экзонов. Как проиллюстрировано на фиг. 5b, в конструкциях от DHFR-G1 до G13 с длиной стебля от 24 до 12 п.о. экспрессия люциферазы не зависит от вставки альтернативного экзона DHFR и xpt-гуанинового аптамера при наличии или отсутствии соединения аптамер/лиганд, в данном случае с применением гуанинового аптамера. Из этого можно сделать вывод, что длина стебля является достаточной для образования стабильной структуры как в
- 19 037120 отсутствие, так и при наличии лиганда, что предотвращает включение альтернативного экзона в мРНК.
Однако в конструкциях от DHFR_G14 до DHFR_G18 экспрессия люциферазы подавлялась в отсутствие добавленного гуанина. При добавлении 1 мкМ гуанина экспрессия люциферазы в этих конструкциях индуцировалась (фиг. 5b).
Дополнительная строгая валидация конструкций от G11 до G18 снова продемонстрировала четкую регуляцию экспрессии люциферазы при воздействии гуанином (фиг. 5 с). Конструкция DHFR_G17, содержащая xpt-G17 (SEQ ID NO: 15) (фиг. 5а) демонстрировала 2000-кратную индукцию экспрессии, составляющую около 65% от уровня экспрессии люциферазы в конструкции Con1 (называемого уровнем максимальной экспрессии). Такой высокий динамический диапазон индукции является результатом активации экспрессии с очень низкого неиндуцированного исходного уровня в отсутствие лиганда. Конструкция DHFR_G16 (фиг. 5 а) демонстрировала приблизительно 800-кратную индукцию по сравнению с исходным уровнем неиндуцированной экспрессии с достижением уровня, составляющего 83% максимальной экспрессии (фиг. 5с и 5d). Кроме того, конструкции DHFR_G14 и G15 демонстрировали практически 100% уровень максимальной экспрессии с более низким показателем кратности индукции из-за более высокого исходного уровня неиндуцированной экспрессии люциферазы.
С целью оценки общей функциональности и применимости синтетического рибосвитча в кассете интрон-экзон-интрон трансфицировали конструкцию, содержащую xpt-G17 (DHFR_G17), во множество клеточных линий человека и мыши. В этих различных клеточных линиях обработка гуанином обусловливала значительную индукцию экспрессии генов, более чем 500-кратную индукцию в клетках HepG2 с более низким показателем кратности индукции в других клеточных линиях (фиг. 5е). Разные показатели кратности индукции в различных клеточных линиях могут отражать различия в эффективности трансфицирования, а также в профиле экспрессии специфического к определенному типу клеток регулятора сплайсинга. Кроме того, ген люциферазы с регуляторной кассетой, содержащей рибосвитч xpt-G17 (DHFR_G17), демонстрировал аналогичный уровень индукции при трансфицировании на основу AAV (фиг. 5f), что свидетельствует о том, что регуляторный эффект гена не зависит от основы вектора.
В дополнение к регулированию гена, люциферазы регуляторную кассету, содержащую xpt-G17, также оценивали при регулировании секретируемых белков, антитела анти-KDR и эритропоэтина (Еро). Регуляторную кассету, содержащую xpt-G17, вставляли в кодирующую последовательность антитела анти-KDR и эритропоэтина. Как проиллюстрировано на фиг. 5g и 5h, обработка гуанином обусловливала 80-кратную индукцию при продуцировании антител анти-KDR и 140-кратную индукцию при продуцировании Еро по сравнению с продуцированием каждой молекулы из клеток в отсутствие лиганда.
Эти результаты демонстрируют общую функциональность и применимость для регулирования экспрессии белка потенциального терапевтического целевого гена, а также применение указанной кассеты для регулирования гена при AAV-опосредованной доставке гена. Таким образом, авторы изобретения сконструировали синтетический рибосвитч включения у млекопитающих, который способен включать экспрессию белка целевого гена в ответ на наличие специфичного для аптамера лиганда в клетках млекопитающих.
Пример 6. С целью регулирования экспрессии целевого гена посредством альтернативного сплайсинга можно применять различные пуриновые аптамеры.
Экспериментальные методики.
В конструкциях рибосвитчей применяли следующие последовательности аптамеров, перечисленные в табл. 3.
Таблица 3
Ydhl-G SEQ ID NO.:11 ttgtataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccaggaaccgtaaaatcctgactacaa
Ydhl-A SEQ ID NO.:12 ttgtataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccaggaaccgtaaaatcctgattacaa
addA-G SEQ ID NO.:13 tcatataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaagagccttaaactcttgactatga
addA-A SEQ ID NO.:14 tcatataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaagagccttaaactcttgattatga
Результаты.
С целью анализа дополнительных аптамеров в нашей системе для регулирования генов, авторы изобретения применяли ту же стратегию и способ, которые описаны в предыдущих примерах, и создава- 20 037120 ли множество реагирующих на гуанин и аденин рибосвитчей, путем связывания различных гуаниновых и адениновых аптамеров с кассетой интрон-mtDHFR-интрон (фиг. 6a). Гуаниновые рибосвитчи, которые были проанализированы, эффективно регулировали экспрессию гена люциферазы в ответ на гуанин (фиг. 6b). Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что эти гуаниновые рибосвитчи регулировали экспрессию целевого гена в ответ не только на гуанин (фиг. 6b), но и на гуанозин (фиг. 6c) и 2' деоксигуанозин (2'dG) (фиг. 6d).
Авторы изобретения сконструировали ряд адениновых рибосвитчей (фиг. 6a), а также продемонстрировали функциональность регулирования гена (фиг. 6e).
Различия в регуляции экспрессии генов различными анализируемыми конструкциями, содержащими аптамер, могут отражать различия в аффинности связывания аптамер/лиганд, а также различия во вторичной структуре аптамера, которые могут влиять на доступность участка 5'ss, включение альтернативного экзона и, следовательно, экспрессию целевого гена. Кассету интрон-экзон-интрон для регулирования гена можно оптимизировать путем изменения последовательности аптамеров для достижения желаемого уровня регулирования гена.
Пример 7. Состояние включения/выключения экспрессии целевого гена, регулируемое гуаниновым рибосвитчем у млекопитающего.
Экспериментальные методики.
Кассету инmрон-mtDHFR-аптамер-интрон амплифицировали методом ПЦР и клонировали с применением стратегии клонирования Golden Gate (NEB) в вектор pEGFP-C1. С целью получения клеточной линии, стабильно экспрессирующей EGFP с помощью рибосвитча, клетки HEK-293 электропорировали с применением 20 нг плазмидной ДНК. Спустя 48 ч после электропорации культуру клеток отбирали с помощью 800 мкг/мл G418 в течение 2 недель с целью получения клеток, которые стабильно экспрессируют кассету. Клетки трипсинизировали, а суспензию клеток подвергали проточному цитометрическому анализу интенсивности флуоресценции GFP с помощью устройства Guava EasyCyte 8HT. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения GuavaSoft 2.2.2.
Результаты.
Чтобы еще раз продемонстрировать, что экспрессия целевого гена, содержащего разработанную регуляторную кассету интрон-экзон-интрон, может регулироваться посредством воздействия лиганда, специфичного к аптамеру, содержащемуся внутри рибосвитча, кассету инmрон-mtDHFR-интрон, содержащую рибосвитч xpt-G17 (SEQ ID NO: 15) вводили в ген EGFP и стабильно трансфицировали клетки HEK 293. При наличии гуанина экспрессия EGFP включалась (фиг. 7а). Флуоресценция определялась уже через 6 ч после обработки гуанином и увеличивалась в течение 3 дней обработки гуанином, достигая 300-кратной индукции по сравнению с необработанными клетками (фиг. 7b), что свидетельствует о включенном состоянии экспрессии целевого гена при наличии соединения аптамер/лиганд. Когда гуанин извлекали из среды для культивирования клеток, уровень экспрессии EGFP снижался, указывая на выключенное состояние экспрессии целевого гена в отсутствие лиганда, специфического для аптамера (фиг. 7b). Таким образом, авторы изобретения создали платформу для регулирования генов, состоящую из кассеты интрон-экзон-интрон, содержащей синтетический рибосвитч, с помощью которого регулируется экспрессия в целевых генах клеток млекопитающих, посредством наличия или отсутствия лиганда, специфического для аптамера.
Пример 8. Влияние множества регуляторных кассет на регулирование экспрессии целевого гена.
Экспериментальные методики.
Конструкции были созданы с применением стратегии клонирования Golden Gate (NEB). Клетки HEK 293 трансфицировали указанными конструкциями, обрабатывали 500 мкМ гуанина или 1 мМ гуанозина (Sigma) через 4 ч после трансфицирования. Активность люциферазы анализировали, как описано в примере 5.
Результаты.
Конструкция с xpt-G15 (SEQ ID NO: 46), содержащая регуляторную кассету (DHFR G15, Пример 5), продемонстрировала 60-кратную индукцию экспрессии люциферазы в ответ на обработку гуанином по сравнению с исходным уровнем неиндуцированной экспрессии и достигла почти 100% уровня экспрессии люциферазы, наблюдаемого при применении конструкции Con 1 (фиг. 8а). Это полезная функция при регулировании терапевтического белка, который необходим в высоких уровнях.
В отличие от этого, конструкция с регуляторной кассетой, содержащей xpt-G17 (DHFR G17), характеризовалась значительно более высоким показателем кратности индукции, составляющим 2181 раз, обусловленным более низким исходным уровнем неиндуцированной экспрессии, но имела значительно меньший максимальный уровень экспрессии при индукции по сравнению с конструкцией Con1 (фиг. 8а).
Для того чтобы проанализировать, смогут ли две копии регуляторной кассеты, содержащей xpt-G15 (двойной xpt-G15; SEQ ID NO: 64) снизить исходные уровни экспрессии без ущерба для максимального уровня экспрессии люциферазы при индукции, две копии регуляторной кассеты, содержащей xpt-G15, встраивали в ген люциферазы, при этом каждую копию встраивали в другом месте последовательности гена. При наличии двух копий регуляторной кассеты, содержащей xpt-G15, исходный уровень неиндуцированной экспрессии снижался, что приводило к значительно более высокому показателю кратности ин- 21 037120 дукции (от 60 до 1008 раз) без ущерба для максимального уровня экспрессии (фиг. 8а).
Значение ЕС50 гуанина для кассеты с двойным xpt-G15 (двойной xpt-G15; SEQ ID NO: 64) регистрировалось в 5 раз ниже значения ЕС50 гуанина для конструкции, содержащей одну копию более точной кассеты, содержащей xpt-G17 (43 мкМ против 206 мкМ), что повышает чувствительность реакции лиганда (фиг. 8а).
Принцип двух копий менее точной регуляторной кассеты для повышения кратности индукции и экспрессии максимально индуцированного гена также применяли к гену EGFP. Как проиллюстрировано на фиг. 8b и 8с, согласно результатам регуляции люциферазы (фиг. 8а), одна копия регуляторной кассеты xpt-G15 в гене EGFP (EGFP-xpt-G15) генерировала более высокий исходный уровень неиндуцированной экспрессии EGFP по сравнению с конструкцией, содержащей регуляторную кассету xpt-G17 (EGFP-xpt-G17). Однако, когда две копии регуляторной кассеты xpt-G15 вставляли в ген EGFP в разных местах (двойной EGFP-xpt-G15), исходный уровень неиндуцированной экспрессии снижался до уровня EGFP-xpt-G17 с индуцированным уровнем EGFP даже в большей степени, чем при применении контрольной конструкции Con1-EGFP (фиг. 8с).
Кроме того, в ген люциферазы встраивали одну копию регуляторной кассеты, содержащей xpt-G17, и одну копию регуляторной кассеты, содержащей адениновый рибосвитч Ydhl-A5. Экспрессию люциферазы индуцировали либо добавлением аденина (в 25 раз), либо добавлением гуанина (в 120 раз), однако значительно более высокий уровень индукции (до 2966 раз) получали при совместном применении аденина и гуанина в максимальной концентрации каждого (фиг. 8d). Эти результаты демонстрируют модульный принцип функционирования рибосвитчей на основе альтернативного сплайсинга при регулировании экспрессии целевого гена.
С целью снижения рекомбинации и упрощения изготовления вирусных векторов, содержащих две или более регуляторные кассеты, в одном целевом гене могут применяться регуляторные кассеты с различными интронными и экзоновыми последовательностями, которые могут содержать либо одинаковые, либо различные аптамеры, реагирующие на лиганд.
Пример 9. Влияние размера и последовательности интрона на регулирование экспрессии целевого гена посредством аптамер-опосредованного альтернативного сплайсинга.
Экспериментальные методики.
Конструкцию Con1 применяли в качестве матрицы для ПЦР-амплификации интронных фрагментов, которые имеют делеции интронов, расположенных либо перед, либо после участка инициации транскрипции. Для создания конструкций, которые имеют одиночные делеции интрона, продукты ПЦР клонировали в конструкции, содержащие рибосвитч xpt-G17, применяя стратегию клонирования Golden Gate (NEB). Для создания конструкций, которые имеют делеции интронов, расположенных и перед и после участка инициации транскрипции, фрагменты, высвобожденные с помощью EcoRI и BamHI из конструкций с одиночными делециями в последовательности интрона, расположенного после участка инициации транскрипции, клонировали в конструкции, расщепленные посредством EcoRI и BamHI, с одиночными делециями в последовательности интрона, расположенного перед участком инициации транскрипции.
Результаты.
Интроны содержат элементы, которые могут либо стимулировать (интронный энхансер сплайсинга, ISE), либо подавлять (интронный супрессор сплайсинга, ISS) сплайсинг экзонов. Из всех сконструированных рибосвитчей, xpt-G17 продемонстрировал лучшую регулирующую способность как по показателю кратности индукции, так и по уровню индуцированной экспрессии генов. С целью дальнейшей оптимизации системы авторы изобретения осуществили серию модификаций в последовательностях и длине интронов, а также на участках сплайсинга, используя рибосвитч xpt-G17 в кассете интрон-экзонинтрон.
Сначала влияние модификации интрона анализировали путем введения одиночных делеции в последовательности интрона, размещенного либо перед, либо после экзона mtDHFR (фиг. 9а, 9b). Создали 16 конструкций (от xpt-G17-IR-1 до xpt-G17-IR-16) с рибосвитчем, содержащим xpt-G17 (последовательности из 13 этих конструкций приведены в табл. 5, SEQ ID NO: 16-28). Затем делеции интонов, расположенных перед и после участка инициации транскрипции, объединяли для получения более крупных делеции интронов, как показано на фиг. 9с. Как проиллюстрировано на фиг. 9d и 9е, из 16 конструкций, выполненных с двумя делециями интрона (2IR), конструкции от 2IR-1 до 2IR-10 (SEQ ID NO: 29-38) продемонстрировали значительно более высокие показатели кратности индукции без ущерба для уровня индуцированной экспрессии люциферазы, при этом конструкция 2IR-3 характеризовалась наибольшим улучшением показателя кратности индукции (4744 раза). Кроме того, авторы изобретения также создали конструкции с мутантными участками 3'ss, расположенными перед экзоном mtDHFR, а также уменьшили размер интрона, расположенного после экзона mtDHFR. Как проиллюстрировано на фиг. 9d и 9е (конструкции от DHFR_3ssC_1 до DHFR_3ssC_5), эти модификации дополнительно улучшали показатель относительной кратности индукции, однако в этом случае наблюдалось снижение уровня индуцированной экспрессии (от 64 до 32% для 3ssC_3).
- 22 037120
Эти результаты свидетельствуют о том, что характеристики регуляторной способности кассеты интрон-экзон-аптамер-интрон можно оптимизировать путем модификации интронных последовательностей, граничащих с альтернативным экзоном, с целью достижения желаемого уровня регуляции генов.
Пример 10. Применение множества природных, а также синтетических экзонов в кассете для регулирования генов.
Экспериментальные методики.
Последовательности экзона 5 из мутантной человеческой опухоли Вильмса 1 (mutWT1-e5, SEQ ID NO: 61), экзона 6 SIRT1 (SIRT1-e6, SEQ ID NO: 62), экзона 16 или 17 кальций/калмодулинзависимой протеинкиназы II мыши (Camk2d-e16 or e17, SEQ ID NO: 59, 60) и синтетического экзона ENEEE (SEQ ID NO: 63) синтезировали (IDT) и клонировали в вектор DHFR-G17 вместо экзона DHFR с применением набора для клонирования Gibson (NEB). Плазмидную ДНК трансфицировали в клетки HEK 293, обрабатывали 500 мкМ гуанина и проводили анализ люциферазы, как описано в примере 1. Последовательности каждого экзона с 5'- и 3'-участками сплайсинга указаны с экзонными последовательностями с помощью прописных букв (табл. 5, SEQ ID NO: 59-63).
Результаты.
Для определения того, что регуляторная функция разработанной кассеты интрон-экзон-аптамеринтрон не ограничивается конкретной экзонной последовательностью, авторы изобретения заменили экзон mtDHFR в конструкции, содержащей рибосвитч с гуанином xpt-G17 (DHFR-xpt-G17), на множество различных природных и мутантных экзонов, а также синтетических экзонов, которые содержат известные последовательности экзонных энхансеров сплайсинга (ESE). Как проиллюстрировано на фиг. 10, регуляторная кассета с экзоном CamkIId-e16 генерирует практически эквивалентный показатель кратности индукцию по сравнению с DHFR-xpt-G17, но с более низким уровнем как исходной, так и индуцированной экспрессии люциферазы. Кассеты, содержащие другие экзоны, также продемонстрировали различные уровни как исходной, так и индуцированной экспрессии люциферазы. Таким образом, касссета для регулирования генов на основе аптамер-опосредованного альтернативного сплайсинга не является экзоноспецифической, и не ограничивается экзоном mDHFR-e2.
Экзоны, которые могут генерировать эффективные процессы альтернативного сплайсинга, являются пригодными для кассеты с аптамер-опосредованной регуляцией генов. Эти результаты дополнительно свидетельствуют о том, что характеристики регуляторной способности кассеты интрон-экзон-аптамеринтрон можно оптимизировать путем модификации последовательностей в альтернативном экзоне, а также в окружающих интронных последовательностях, например получая в результате этого изменения силы сплайсинга последовательностей участков 5'ss и 3'ss альтернативных экзонов, а также последовательностей ESE и ESS в альтернативном экзоне, как описано в данном документе.
Пример 11. Регулирование экспрессии целевого гена посредством аптамер-опосредованного альтернативного сплайсинга in vivo у мышей.
Экспериментальные методики.
Введение гидродинамической ДНК и воздействие препаратом: 5 или 10 мкг плазмидной ДНК без эндотоксина, содержащей ген люциферазы с двумя копиями регуляторной кассеты с xpt-G15 (двойной xpt-G15; SEQ ID NO: 64; пример 8, фиг. 8а), разведенной в солевом растворе (набор Qiagen Endofree), вводили в хвостовую вену самкам мышей CD-1 в возрасте 6-7 недель в объеме 10% веса тела в течение от 5 до 10 с. Гуанозин (Sigma) суспендировали в 0,5% метилцеллюлозе/0,25% Твин 80 (Sigma) и вместе со свежей водой вводили перорально через 2 и 12 ч после инъекции ДНК или путем внутрибрюшинной инъекции (в/б) через 5, 12, 16 и 24 ч после введения ДНК.
Неинвазивная прижизненная биолюминесцентная визуализация у животных: перед получением изображений мышей анестезировали 2% изофлураном и вводили люциферин 150 г/кг веса, после этого делали снимки в течение 2-5 мин после инъекции люциферина с применением системы Bruker Xtreme в указанный момент времени после инъекции ДНК. Активность люциферазы выражали как среднее значение фотон/с ± с. о. Показатель кратности индукции рассчитывали путем деления значения фотон/с, полученного у мышей, получавших гуанозин, на значение фотон/с, полученное у мышей, не получавших гуанозин.
Результаты.
Авторы изобретения оценивали функциональные характеристики кассеты интрон-экзон-интрон относительно регулирования генов у мышей in vivo. He содержащую эндотоксина плазмидную ДНК в составе конструкции, включающей две копии рибосвитча xpt-G15 в гене люциферазы (двойной xpt-G15), вводили в печень мышей посредством гидродинамической инъекции с параллельным внутрибрюшинным введением гуанозина. Авторы изобретения проанализировали два пути введения гуанозина. В одном эксперименте (фиг. 11а и 11b) мышам перорально вводили различные дозы гуанозина через 2 и 12 ч после введения ДНК, а затем осуществляли визуализацию. Как проиллюстрировано на фиг. 11а, у мышей, получавших гуанозин, регистрировали более высокие уровни экспрессии люциферазы через 9 ч после введения ДНК. Экспрессия люциферазы у мышей, получавших гуанозин, повышалась в динамике, достигая наивысшего уровня через 48 ч после инъекции ДНК, после чего уровень экспрессии снижался.
- 23 037120
В отдельном эксперименте (фиг. 11с и 11d) гуанозин вводили внутрибрюшинно. Через 4 ч после инъекции ДНК (п/и) и до введения гуанозина у мышей в каждой группе регистрировали одинаковый уровень исходной активности люциферазы (фиг. 11). Затем мышам вводили либо несущую среду в качестве контроля, либо гуанозин. Через 11 ч после инъекции ДНК активность люциферазы повышалась у всех мышей, что согласуется с данными о том, что экспрессия гена люциферазы достигает пика через 12 ч после введения гидродинамической ДНК в печень. Однако у мышей, получавших гуанозин, уровень экспрессии люциферазы регистрировался значительно выше, чем у мышей, не получавших гуанозин; при этом показатели кратности индукции составляли 4,7 и 16,2 раз по сравнению с неиндуцированной исходной экспрессией при введении 100 и 300 мг/кг гуанозина соответственно.
Таким образом, продемонстрировано, что кассета для регулирования генов посредством сплайсинга регулирует экспрессию гена in vivo у животных в дозозависимый способ и в ответ на введение лиганда, специфичного для аптамера, содержащегося в регуляторнои кассете.
Пример 12. Доставка конструкций рибосвитча в сетчатку мыши посредством векторов аденоассоциированного вируса (AAV).
Экспериментальные методики.
Конструкции плазмид AAV: Две конструкции с экспрессией рибосвитча (описанные в табл. 4) адаптировали с помощью молекулярного клонирования в формат, который можно было упаковать в виде генома AAV.
Таблица 4
Название Индуцируемый элемент рибосвитча Промотор Трансгенный репортер
GTX5 Нет (контроль) CMV Усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP)
GTX7 G15 CMV Усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP)
Экспрессирующие конструкции на основе трансгена EGFP (GTX 5-7) расщепляли рестрикционными ферментами MfeI и NheI, высвобождая фрагмент ДНК размером ~1400 н. о., содержащий индуцируемый элемент рибосвитча и трансген EGFP. Геномную плазмиду pD10 AAV также расщепляли ферментами MfeI и NheI, высвобождая фрагмент 4475 н. о., содержащий AAV ITR, промотор CMV и сигнал полиаденилирования SV40. Эти два фрагмента лигировали с применением Т4 DNA-лигазы, в результате чего получали плазмиды, содержащие последовательность со следующей структурой, которые можно было упаковать в виде генома AAV2:
[ITR] _ [CMV] _ [5' EGFP] _ [Элемент рибосвитча] _ [3' EGFP] _ [SV40] _ [ITR]
Все полученные конструкции плазмид верифицировали секвенированием ДНК и называли согласно следующему условному обозначению: pD10-GTX#.
Продукция и титрование вектора AAV: Аденоассоциированный вирус (AAV) получали in vitro путем временного трансфицирования клеток НЕК-293Т тремя плазмидами.
(i) Плазмида вирусного генома на основе остова pD10.
(ii) Упаковывание плазмиды AAV, содержащей ген AAV2 Rep78 и вирусный капсидный ген. Путем изменения последовательности капсидного гена можно получить множество различных серотипов AAV, но в этом случае использовали капсид AAV8.
(iii) Вспомогательная плазмида (pHGTI-Adeno1). Эта плазмида обеспечивает почти минимальный набор генов аденовируса, которые необходимы AAV для упаковки и сборки.
Эти плазмиды трансфицировали в клетки НЕК-293Т в соотношении 1:1:3; в общей сложности 50 мкг плазмидной ДНК трансфицировали на 80-90% конфлюентного планшета с площадью 150 см2. Типичный цикл продукции состоял из 20 таких планшетов. В качестве реагента для трансфицирования применяли полиэтилененимин (PEI) при соотношении PEI к ДНК 2,25:1 (вес/вес). Через 72 ч после трансфицирования клетки физически отделяли от планшетов и осаждали путем центрифугирования; полученный осадок клеток ресуспендировали в 20 мл плотномерного буфера TRIS. Затем осадок лизировали с помощью повторных циклов замораживания/оттаивания/перемешивания вихревым способом, и любую не упакованную ДНК, оставшуюся в лизате, разрушали путем расщепления бензоназой. Затем лизат осветляли с помощью тупикового фильтрования и центрифугирования перед разбавлением до общего объема 50 мл.
Затем осветленный лизат очищали с помощью жидкостной хроматографии быстрого разрешения (FPLC) на основе аффинности, с применением колонки AVB на устройстве AKTA Pure (оба - от компании GE Healthcare), выполняемой согласно предварительно запрограммированным протоколам. Конечный, содержащий AAV элюат из колонки FPLC концентрировали до объема ~200 мкл путем центрифугирования при 5000xg в центробежном концентраторе Vivaspin 4 с порогом отсечения 10000 МВт (GE
- 24 037120
Healthcare), добавляли 2 мл PBS-MK (чтобы разбавить элюирующий буфер с высоким содержанием соли) и снова концентрировали элюат до ~200 мкл с применением того же концентратора. Этот материал представлял собой очищенный вирус AAV; материал аликвотировали по мере необходимости и хранили при -80°C.
Титр вектора устанавливали с применением ПЦР (колич/) (нацеленной на сигнал полиаденилирования SV40) непосредственно в образце очищенного вектора. Полученное пороговое значение цикла сравнивали с известной стандартной кривой и подсчитывали количество векторных геномов на 1 мл.
Векторы рибосвитча AAV называли согласно следующему условному обозначению: AAV2/[капсидный серотип #]-GTX#/
Субретинальные инъекции для мышей: Инъекции вектора в субретинальное пространство выполняли мышам под общей анестезией с помощью управляемой вручную иглы 10 мм, 34 калибра, надетой на шприц Гамильтона объемом 5 мкл. Кончик иглы направляли в положение впрыска, наблюдая за сетчаткой через операционный микроскоп. С целью введения вектора в каждый глаз выполняли инъекции 2x2 мкл, причем одну инъекцию выполняли в верхнее полушарие глаза, а другую - в нижнее полушарие. После инъекции регистрировали характеристики возникшей отслойки сетчатки и любого возвратного оттока вводимого материала.
Флуоресцентное фотографирование глазного дна: После субретинальной инъекции периодически оценивали экспрессию трансгена EGFP посредством фотографирования глазного дна с применением щелевой лампы (SC-16, Keeler) с прикрепленной цифровой камерой Leica DC500. Животные получали общую анестезию, при этом их зрачки расширяли с помощью местного применения 1% тропикамида. Преломляющую способность роговицы нейтрализовали, поместив покровное стекло на роговицу, покрытую раствором связующей среды (Viscotears). Под ярким белым светом инструмент регулировали, а животное располагали так, чтобы сетчатка находилась в четком фокусе, а оптический диск центрировали в поле зрения, затем делали изображение яркого поля с временем экспозиции 200 мс. Флуоресценцию трансгена (EGFP) оценивали путем фильтрования источника света (475±25 нм) и получения двух дополнительных изображений с экспозицией 10 и 30 с.
Результаты.
Конструкции рибосвитча (табл. 4) были успешно клонированы в формат, который может быть упакован в виде генома AAV, что подтверждалось ДНК-секвенированием продуктов лигирования. Из полученных конструкций pd10-GTX7 и pd10-GTX5 в дальнейшем получали вирусные векторы AAV2/8. С помощью ПЦР (колич.) показано, что полученные векторы имеют следующие титры:
AAV2/8-GTX7:1, 17х1013 векторных геномов/мл
AAV2/8-GTX5:1,73х1013 векторных геномов/мл
Эти два вектора затем вводили субретинентально и оставляли на 8 дней для развития экспрессии трансгена EGFP перед оценкой уровня экспрессии с помощью флуоресцентной фотографии глазного дна. Фиг. 12 иллюстрирует, что EGFP экспрессируется в сетчатке, в которую вводили AAV2/8-GTX7. Уровень трансгенной экспрессии является низким, но значительную экспрессию от AAV2/8-GTX7 можно было ожидать только после индукции посредством аптамер-опосредованного альтернативного сплайсинга в ответ на лиганд (который не был добавлен).
Пример 13. Регулирование экспрессии целевого гена посредством альтернативного сплайсинга, опосредованного кассетой in vivo, в сетчатке мышей после введения AAV.
Процедуры.
Количественная оценка флуоресцентной фотографии глазного дна (сигнал EGFP): Все манипуляции и анализ изображений выполняли с применением программы GNU Image Manipulation Program (GIMP, доступный ресурс). Как описано выше, три фотографии каждой сетчатки были сделаны в каждой точке изображения: белый свет (200 мс), 475±25 нм (10 с) и 475±25 нм (30 с). Сначала эти три изображения накладывали в виде слоев и, используя изображение белого света в качестве ориентира, определяли область интереса (ОИ) с целью охвата всей сетчатки, видимой через зрачок. Для двух изображений 475±25 нм (флуоресценция EGFP) пороговый инструмент применяли для подсвечивания только тех пикселей, величина интенсивности которых была выше определенного порога. Пороговое значение выбирали на основе определения четкого отделения сигнала EGFP от фона и предоставления соответствующего динамического диапазона для анализа. Количество пикселей выше порога в пределах ОИ регистрировали для каждого изображения. Для поправки на переменную дилатацию зрачка, приводящую к изменению в области сетчатки, видимой между глазами, количество пикселей выше порога разделяли на общее количество пикселей в пределах ОИ.
Индукция: Опосредованную рибосвитчем индукцию экспрессии целевого гена осуществляли с помощью двух путей введения, как описано ниже:
Внутрибрюшинная инъекция (в/б): Объем 100 мкл [75 мг/мл гуанозина + 0,5% вес./об. метилцеллюлозы + 0,25% об./об. Твин 80 в воде] вводили во внутрибрюшинную полость с помощью иглы 13 мм, 30 калибра. Это эквивалентно дозе гуанозина 300 мг/кг для взрослой мыши весом 25 г.
- 25 037120
Интравитреальная инъекция (и/витр.): Объем 2 мкл [1 мМ гуанозина + 2,5% ДМСО в PBS-MK] вводили интравитреально с помощью управляемой вручную иглы 10 мм, 34 калибра. Положение иглы при инъекции было ниже линзы непосредственно над оптическим диском; иглу направляли в это положение, наблюдая за сетчаткой через операционный микроскоп.
Результаты.
В общей сложности в 9 глаз субретинально вводили препарат, как описано в примере 12 и согласно описанию ниже в день 00:
в 6 глаз вводили AAV2/8-GTX7 (экспрессия трансгена EGFP от промотора CMV, регулируемая элементом рибосвитча G15);
в 3 глаза вводили AAV2/8-GTX5 (конструкция в качестве положительного контроля; нерегулируемая экспрессия трансгена EGFP от промотора CMV).
Флуоресцентное фотографирование глазного дна, как описано в примере 12, выполняли в дни 02, 08, 09, 10 и 12.
Для всех глаз проводили индукцию посредством внутрибрюшинной инъекции после флуоресцентного фотографирования в дни 08, 09 и 10. Для всех глаз проводили индукцию посредством внутрибрюшинной инъекции после флуоресцентного фотографирования в дни 11. Флуоресцентный сигнал определяли количественно, как описано выше; типовые изображения приведены на фиг. 13а.
Индукцию не проводили в течение первых 8 дней после инъекции вектора, поскольку, как известно, период, необходимый для достижения максимального уровня экспрессии гена из AAV2/8, занимает до 7 дней. Таким образом, уровень экспрессии на день 8 принимали за исходный уровень доиндукционной экспрессии. На день 10 после инъекции вектора после двух циклов в/б индукции, экспрессия трансгена увеличилась в ~ 3,5х по сравнению с этим исходным уровнем (Р<0,05, однофакторный анализ ANOVA, критерий Дуннетта), как проиллюстрировано на фиг. 13с и 13а (L по сравнению с N).
На день 12 после инъекции вектора, через 24 ч после интравитреальной индукции и через 48 ч после последней в/б индукции, экспрессия трансгена увеличилась в ~9х по сравнению с исходным уровнем (Р<0,001, однофакторный анализ ANOVA, критерий Дуннетта), как проиллюстрировано на фиг. 13с и 13а (L по сравнению с О). Этот полученный существенно больший показатель после интравитреальной индукции дает основания предположить (но не доказывает окончательно), что этот путь индукции может быть более эффективным, чем внутрибрюшинная инъекция.
Изображения с более высоким разрешением, демонстрирующие отличия в экспрессии трансгена EGFP до и после индукции, приведены на фиг. 13b.
В течение того же периода времени и при одном и том же индукционном режиме уровни экспрессии EGFP, опосредуемые нерегулируемым контрольным вектором AAV2/8-GTX5, достоверно не изменялись (однофакторный анализ ANOVA с поправкой Бонферрони), оставаясь приближенно постоянными, как проиллюстрировано на фиг. 13d. Учитывая существенные отличия в уровне экспрессии, опосредуемой GTX7 по сравнению с GTX5, для каждого набора изображений необходимо разное время экспозиции (30 и 10 с соответственно) и порог экспозиции (50 и 190 соответственно).
Полученные данные четко демонстрируют, что трансгенная экспрессия из конструкции GTX7 на основе G15 в сетчатке мыши регулировалась посредством аптамер-опосредованного альтернативного сплайсинга. Максимальный уровень трансгенной экспрессии, индуцированной GTX7, регистрировался ниже, чем при применении неиндуцируемой конструкции GTX5 в качестве положительного контроля.
- 26 037120
Таблица 5 Описание и ассоциированные последовательности.
Последовательность экзона представлена заглавными буквами, а последовательность интрона представлена строчными буквами, если не указано иное
SEQ ID NO. Описание Последовательность
SEQ ID NO. : 1 Luci-IVSA-Luci в конструкции Coni Интрон 2 бета-глобина человека, содержащий делецию (IVS2A), представлен строчными буквами, а фланкирующая последовательность люциферазы представлена заглавными буквами. GAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGgtgagtctatgggaccc ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatg tcataggaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaa atcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttct tcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatacttt ccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatc atgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttc tgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttct gcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaa tagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatgg ttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggccctt ttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagCAA GGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCT
SEQ ID NO. : 2 Luci-IVSA-Luci в конструкции Соп2 GATTACACCCGAGGGGGATGATAAAGtaagcctatgggaccc ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatg tcataggaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaa atcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttct tcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatacttt
- 27 037120
ccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatc atgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttc tgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttct gcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaa tagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatgg ttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggccctt ttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagCCG GGCGCGGTCGGTAAAGT
SEQ ID NO. : 3 Luci-IVSA-Luci в конструкции СопЗ TTCTTCGCCAAAAGCAgtaagtctatgggacccttgatgttt tctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaa ggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggta attttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaat atacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatct ctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctt tgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaag gcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaa ttgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagcta caatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataa ggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatc atgttcatacctcttatcttcctcccacagCTCTGATTGACA AATACG
SEQ ID NO. : 4 Luci-IVSA-Luci в конструкции Con4 AAGAGCTGTTTCTGAGGAGgtgtggctatgggacccttgatg ttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcatag gaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagg gtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttctttt aatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaa tctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcct ctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggtt aaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatat aaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcag ctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttggga taaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgcta atcatgttcatacctcttatcttcctcccacagCCTTCAGGA TTACAAGATTCAA
SEQ ID NO. : 5 Luci-IVSA-Luci в конструкции Соп5 CATCTGCCAGGTATCAGGgtgagtctatgggacccttgatgt tttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcatagg aaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcaggg taattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttctttta atatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaat
- 28 037120
ctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctc tttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggtta aggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatata aattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagc tacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggat aaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaa tcatgttcataccctttacttctatgactgtagCAAGGATAT GGGCTCACTGAGACT
SEQ ID NO. : 6 Luci-IVSA-Luci в конструкции Сопб TCCATCTGCCAGGTATCAGGgtgagtctatgggacccttgat gttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcata ggaaggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcag ggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttt taatatacttttttgtttatcttatttctaatactttcccta atctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcc tctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggt taaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcata taaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagca gctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttggg ataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgct aatcatgttcataccgtgactgtgtgtatgcacagCAAGGAT ATGGGCTCACTGAGACT
SEQ ID NO. : 7 Luci-IVSA-Luci в конструкции Con7 ATCTGCCAGGTATCAGGgtgagtctatgggacccttgatgtt ttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcatagga aggggagaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggt aattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaa tatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatc tctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctct ttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaa ggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataa attgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagct acaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggata aggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaat catgttcataccattgtgatcgcagccaatagCAAGGATATG GGCTCACTGAGACT
SEQ ID NO. : 8 Экзон 2 DHFR с фланкирующей интронной последовательностью gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA TTTСCAGAGAATGACСACAACСTСTTCAGTAGAAGgtaatgt g
SEQ ID Теофиллиновый аптамер ggcgataccagccgaaaggcccttggcagcgtc
- 29 037120
NO. : 9
SEQ ID NO.:10 Xpt-гуаниновый аптамер cactcatataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccg ggcaccgtaaatgtccgactatgggtg
SEQ ID NO.:11 Ydhl-гуаниновый аптамер ttgtataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccagga accgtaaaatcctgactacaa
SEQ ID NO.:12 Ydhl-адениновый аптамер ttgtataacctcaataatatggtttgagggtgtctaccagga accgtaaaatcctgattacaa
SEQ ID NO.:13 addA-гуаниновый аптамер tcatataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaaga gccttaaactcttgactatga
SEQ ID NO.:14 addA-адениновый аптамер tcatataatcctaatgatatggtttgggagtttctaccaaga gccttaaactcttgattatga
SEQ ID NO.:15 Рибосвитч xpt-G17 Аптамер выделен подчеркиванием, а стебель выделен двойным подчеркиванием. Модифицированный экзон 2 DHFR обозначен заглавными буквами. gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 g t a g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AAT С T T CAGTAGAAGataatgtataatcqcqtqqatatqqca cgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattac
gcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaagg caatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaat tgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctac aatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataag gctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatca tgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:16 xpt-G17-IR-l gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcaaa tcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttctt cttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttc cctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatca tgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCA GATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG g t a atgtataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggc accgtaaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaata acagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgc atataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagagg tttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctg
- 30 037120
cttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtc caagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatct tcctcccacag
SEQ ID NO.:17 xpt-G17-IR-2 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcttt cagggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgt ttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAAT GAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgg atatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgac tacattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctg ggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgc atataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaata gcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggtt gggataaggctggattattctgagtccaagctaggccctttt gctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:18 xpt-G17-IR-3 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctcaaatcagggtaattttgcat ttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttt tgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttc agggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtt tctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATG AAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgga tatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgact acattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgg gttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgca tataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatag cagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttg ggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttg ctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:19 xpt-G17-IR-4 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctctttcagggcaataatgatac aatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGA AT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAG TAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggcacgcaagttt ctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattacgcaccattc taaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaa tatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactga tgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagct accattctgcttttattttatggttgggataaggctggatta ttctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatac
- 31 037120
ctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:20 xpt-G17-IR-5 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtactgctcaaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaa aaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatt tctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatga tacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaacttgta g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggcacgcaag tttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattacgcacca ttctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatag caatatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaac tgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatcca gctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctgga ttattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttca tacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:21 xpt-G17-IR-6 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtactgctctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcc gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA T T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG g t a a t g t ataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggcaccg taaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaataacag tgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatat aaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttc atattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttt tattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaag ctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcct cccacag
SEQ ID NO.:22 xpt-G17-IR-7 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaagtgctcaaatcagggt aattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaa tatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatc tctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgccgag taacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTT С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG gtaatgtata atcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaa atgtccgactacattacgcaccattctaaagaataacagtga taatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaa
- 32 037120
tatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcata ttgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttat tttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagcta ggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctccc acag
SEQ ID NO.:23 xpt-G17-IR-8 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaagtgctctttcagggca ataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctcta acttgtag GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAA AAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggc acgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacatta cgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaag gcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaa ttgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagcta caatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataa ggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatc atgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:24 xpt-G17-IR-9 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 g t a g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggca cgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattac gcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaagg caatagctgctgctggattattctgagtccaagctaggccct tttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:25 xpt-G17-IR-10 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 g t a g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggca cgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattac gcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaagg caatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaat
- 33 037120
tgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctac aatccagctgctgctggattattctgagtccaagctaggccc ttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:26 xpt-G17-IR-ll gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 g t a g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggca cgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattac gcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaagg caatagctgctgaggtttcatattgctaatagcagctacaat ccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggct ggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgt tcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:27 xpt-G17-IR-13 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 g t a g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggca cgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattac gcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaagg caatagctgctctaccattctgcttttattttatggttggga taaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgcta atcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:28 xpt-G17-IR-15 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 g t a g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggca cgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattac gcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaagg
- 34 037120
caatagctgctgcagctacaatccagctaccattctgctttt attttatggttgggataaggctggattattctgagtccaagc taggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctc ccacag
SEQ ID NO.:29 xpt-G17-2IR-l gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcaaa tcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttctt cttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttc cctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatca tgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCA GATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG g t a atgtataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggc accgtaaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaata acagtgataatttctgggttaaggcaatagctgctgctggat tattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcat acctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:30 xpt-G17-2IR-2 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcaaa tcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttctt cttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttc cctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatca tgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCA GATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG g t a atgtataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggc accgtaaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaata acagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgc atataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagagg tttcatattgctaatagcagctacaatccagctgctgctgga ttattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttca tacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:31 xpt-G17-2IR-3 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcaaa tcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttctt cttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttc cctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatca tgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCA GATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG g t a atgtataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggc accgtaaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaata acagtgataatttctgggttaaggcaatagctgctgaggttt catattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgctt ttattttatggttgggataaggctggattattctgagtccaa gctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcc
- 35 037120
tcccacag
SEQ ID NO.:32 xpt-G17-2IR-4 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcaaa tcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttctt cttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttc cctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatca tgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGAA.TGAA.TTCA GATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG g t a atgtataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggc accgtaaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaata acagtgataatttctgggttaaggcaatagctgctctaccat tctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctg agtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctctt atcttcctcccacag
SEQ ID NO.:33 xpt-G17-2IR-5 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcaaa tcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttctt cttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttc cctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatca tgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCA GATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT CTT CAGTAGAAG g t a atgtataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggc accgtaaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaata acagtgataatttctgggttaaggcaatagctgctgcagcta caatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataa ggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatc atgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:34 xpt-G17-2IR-6 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctcaaatcagggtaattttgcat ttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttt tgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttc agggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtt tctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATG AAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgga tatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgact acattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgg gttaaggcaatagctgctgctggattattctgagtccaagct aggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcc cacag
SEQ ID NO.:35 xpt-G17-2IR-7 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctcaaatcagggtaattttgcat ttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttt
- 36 037120
tgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttc agggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtt tctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATG AAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgga tatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgact acattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgg gttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgca tataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatag cagctacaatccagctgctgctggattattctgagtccaagc taggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctc ccacag
SEQ ID NO.:36 xpt-G17-2IR-8 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctcaaatcagggtaattttgcat ttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttt tgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttc agggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtt tctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATG AAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgga tatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgact acattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgg gttaaggcaatagctgctgaggtttcatattgctaatagcag ctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttggga taaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgcta atcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:37 xpt-G17-2IR-9 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctcaaatcagggtaattttgcat ttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttt tgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttc agggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtt tctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATG AAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgga tatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgact acattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgg gttaaggcaatagctgctctaccattctgcttttattttatg gttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggccct tttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:38 xpt-G17-2IR-10 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctcaaatcagggtaattttgcat ttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttt tgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttc
- 37 037120
agggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtt tctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAATG AAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgga tatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgact acattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgg gttaaggcaatagctgctgcagctacaatccagctaccattc tgcttttattttatggttgggataaggctggattattctgag tccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttat cttcctcccacag
SEQ ID NO.:39 xpt-G17-2IR-ll gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcttt cagggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgt ttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAAT GAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgg atatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgac tacattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctg ggttaaggcaatagctgctgctggattattctgagtccaagc taggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctc ccacag
SEQ ID NO.:40 xpt-G17-2IR-12 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccctgctcttt cagggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgt ttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAGAAT GAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtgg atatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgac tacattacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctg ggttaaggcaatagctgctctaccattctgcttttattttat ggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggccc ttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:41 xpt-G17-2IR-13 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctctttcagggcaataatgatac aatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGA AT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAG TAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggcacgcaagttt ctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattacgcaccattc taaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagctg ctgctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaat catgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:42 xpt-G17-2IR-14 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtgctctttcagggcaataatgatac aatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGA AT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAG
- 38 037120
TAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggcacgcaagttt ctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattacgcaccattc taaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagctg ctctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctgg attattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttc atacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:43 xpt-G17-2IR-15 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtactgctctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcc gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA T T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT С T T CAGTAGAAG g t a a t g t ataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggcaccg taaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaataacag tgataatttctgggttaaggcaatagctgctgctggattatt ctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacct cttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:44 xpt-G17-2IR-16 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtactgctctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcc gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA T T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT СT T CAGTAGAAGg t a a t g t ataatcgcgtggatatggcacgcaagtttctaccgggcaccg taaatgtccgactacattacgcaccattctaaagaataacag tgataatttctgggttaaggcaatagctgctctaccattctg cttttattttatggttgggataaggctggattattctgagtc caagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatct tcctcccacag
SEQ ID NO.:45 xpt-G17-3ssC-l gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 с с c c GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AATCTTCAGTAGAAGgtaatgtataatcgcgtggatatggca cgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacattac gcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaagg caatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaat tgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctac aatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataag
- 39 037120
gctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatca tgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:46 Рибосвитч xpt-G15 gtgagtctatgggacccttgatgttttctttccccttctttt ctatggttaagttcatgtcataggaaggggagaagtaacagg gtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaat tttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttat cttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaa taatgatacaatgtatcatgccgagtaacgctgtttctctaa c 11 g t a g GAAT GAAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAA AATCTTCAGTAGAAGgtaatgtgtataatcgcgtggatatgg cacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgtccgactacaca ttacgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggtt aaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatat aaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcag ctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttggga taaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgcta atcatgttcatacctcttatcttcctcccacag
SEQ ID NO.:47 5' одноцепочечная DHFR дикого типа gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA TTTСCAGAGAATGACCACAACСTСTTCAGTAGAAGgtaatgt g
SEQ ID NO.:48 DHFR 5' одноцепочечная С gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA TTTСCAGAGAATGACCACAACСTСTTCAGTAGAAGсссctgt g
SEQ ID NO.:49 DHFR-Conl 5' одноцепочечная gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA TTTСCAGAGAATGACCACAACСTСTTCAGTAGAGGgtgagtt g
SEQ ID NO.:50 DHFR-Con4 5' одноцепочечная gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA TTTСCAGAGAATGACCACAACСTСTTCAGTAGGAGgtgtggt g
SEQ ID NO.:51 DHFR дикого типа mt S Rp 4 0 gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA T T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT СT T CAGTAGAAGg t a a t g t g
SEQ ID NO.:52 DHFR дикого типа сильнаяЗС35 gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGGCCCCTGATA TTTСCAGAGAATGACCACAACСTСTTCAGTAGAAGgtaatgt g
SEQ ID NO.:53 DHFR дикого типа SC35hnRNPAl gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGTAGGGAGATA TTTСCAGAGAATGACCACAACСTСTTCAGTAGAAGgtaatgt g
SEQ ID DHFR-Conl 5' gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA TTTСCAGAGAATGACCACAACСTСTTCAGTAGAGGgtgagtt
- 40 037120
NO.:54 одноцепочечная HP15 ggcgaaagccaactcaccctct
SEQ ID NO.:55 DHFR-Conl 5' одноцепочечная HP15x gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA TTTСCAGAGAATGACСACAACСTСTTCAGTAGAGGgtgagtt ggcgaaaaacagcataaagtat
SEQ ID NO.:56 DHFR дикого типа mtSRp40 HP15 gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA T T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT СT T CAGTAGAAGg t a a t g t ggcgaaagccacattaccttct
SEQ ID NO.:57 DHFR дикого типа mtSRp40 HP15X gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA T T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT СT T CAGTAGAAGg t a a t g t ggcgaaaaacagaactgagtat
SEQ ID NO.:58 Мутантная DHFR-e2 (mtDHFR) gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATA T T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT СT T CAGTAGAAGg t a a t g t
SEQ ID NO.:59 Camk2d-el6 gagtaacgctgtttctctaacttgtagTGAGCCCCAAACTAC TGTAATССACAACССTGACGGAAACAAGgtaatgt
SEQ ID NO.:60 Camk2d-el7 gagtaacgctgtttctctaacttgtagGAGTCAACTGAGAGC T CAAACAC CAC CAT T GAG GAT GAAGAC GT GAAAG g t a a t g t
SEQ ID NO.:61 mutWTl-e5 gagtaacgctgtttctctaacttgtagAGTTGCTGCTGAGAG CTCCAGCTCAGTGAAATGGACAGAAGGGCAGAGCAAgtaatg t
SEQ ID NO.:62 SIRTl-e6 tgtggtgtgttcaagaaacagaaatacttctttaataaagca tatatatgttgtttgtttttagGTTCCTTTGCAACAGCATCT TGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGA GGAGATATTTTTAATCAGgtaatgt
SEQ ID NO.:63 Синтетический экзон gagtaacgctgtttctctaacttgtagACAATCCTCGAACCA AACAAC CAAACAAC CAAACAAT С С T C GAAC CAAACAAT С С T C GAACCAAACAATССTCGAACCAAgtaatgt
SEQ ID NO.:64 Двойной xpt-G15 GCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGgtgagtctatgg gacccttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagt tcatgtcataggaaggggagaagtaacagggtacacatattg accaaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgc tttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaat actttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaat gtatcatgccgagtaacgctgtttctctaacttgtagGAATG AAT T CAGATAT T T С CAGAGAAT GAAAAAAAAAT CTTCAGTAG AAGgtaatgtgtataatcgcgtggatatggcacgcaagtttc taccgggcaccgtaaatgtccgactacacattacgcaccatt ctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagca atatttctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactg
- 41 037120
atgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagc taccattctgcttttattttatggttgggataaggctggatt attctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcata cctcttatcttcctcccacagCAAGGATATGGGCTCACTGAG ACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAA CCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAG GTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAA AGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGT TAT GTAAACAAT С C G GAAG C GAC CAAC G С С T T GAT T GACAAG GATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAA GACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATT AAGTACAAAGGgtgagtctatgggacccttgatgttttcttt ccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaagggga gaagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggtaatttt gcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatact tttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttc tttcagggcaataatgatacaatgtatcatgccgagtaacgc tgtttctctaacttgtagGAATGAATTCAGATATTTCCAGAG AATGAAAAAAAAATCTTCAGTAGAAGgtaatgtgtataatcg cgtggatatggcacgcaagtttctaccgggcaccgtaaatgt ccgactacacattacgcaccattctaaagaataacagtgata atttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaata tttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatatt gctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattt tatggttgggataaggctggattattctgagtccaagctagg cccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccac agCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTC C
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (28)

1. Полинуклеотидная кассета для регулирования экспрессии целевого гена, содержащая:
(а) рибосвитч;
(b) альтернативно сплайсированный экзон, граничащий с 5'-интроном и 3'-интроном, при этом рибосвитч содержит (i) эффекторную область, содержащую стебель, который включает 5'-участок сплайсинга 3'-интрона, и (ii) аптамер, при этом альтернативно сплайсированный экзон содержит стоп-кодон, который находится внутри рамки (считывания) с целевым геном, когда альтернативно сплайсированный экзон сплайсирован в мРНК целевого гена.
2. Полинуклеотидная кассета по п.1, отличающаяся тем, что аптамер специфически связывается с низкомолекулярным лигандом.
3. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1, 2, отличающаяся тем, что 5'- и 3'-интроны:
(a) получают из эндогенного интрона из целевого гена;
(b) являются экзогенными для целевого гена или (c) получают из интрона 2 гена β-глобина человека.
4. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что 5'-интрон содержит стоп-кодон в рамке с целевым геном.
5. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 50 до около 300 нуклеотидов в длину, предпочтительно 5'-и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 125 до около 240 нуклеотидов в длину.
6. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что стебель эффекторной области имеет от около 7 до около 20 пар оснований в длину, предпочтительно стебель эффекторной области имеет от 8 до 11 пар оснований в длину.
7. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что альтернативно сплайсированный экзон:
(a) получают из экзона 2 гена дигидрофолатредуктазы человека, экзона 5 мутантной опухоли Вильмса 1 человека, экзона 16 кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы II дельта мыши или экзона 6 SIRT1;
(b) модифицирован посредством одного или более процессов, выбранных из группы, состоящей из
- 42 037120 изменения последовательности экзонного энхансера сплайсинга, изменения последовательности экзонного сайленсера сплайсинга, добавления экзонного энхансера сплайсинга и добавления экзонного сайленсера сплайсинга;
(c) представляет собой модифицированный экзон 2 DHFR человека из SEQ ID NO: 15 или (d) является синтетическим.
8. Способ модулирования экспрессии целевого гена, включающий:
(a) вставку полинуклеотидной кассеты по любому из пп.1-6 в целевой ген;
(b) введение целевого гена, содержащего полинуклеотидную кассету, в клетку; а также (c) воздействие на клетку низкомолекулярным лигандом, который специфически связывается с аптамером в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии целевого гена.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что полинуклеотидную кассету вставляют в область целевого гена, кодирующую белок.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что уровень экспрессии целевого гена при наличии низкомолекулярного лиганда выше примерно в 5 раз или выше примерно в 10 раз по сравнению с уровнями экспрессии при отсутствии низкомолекулярного лиганда.
11. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что в целевой ген вставляют две или более полинуклеотидные кассеты.
12. Способ по любому из пп.8-11, отличающийся тем, что указанные две или более полинуклеотидные кассеты содержат различные аптамеры, которые специфически связываются с различными низкомолекулярными лигандами, или отличающийся тем, что указанные две или более полинуклеотидные кассеты содержат одинаковый аптамер.
13. Способ по любому из пп.8-12, отличающийся тем, что целевой ген, содержащий полинуклеотидную кассету, вводят в вектор для экспрессии целевого гена.
14. Способ модулирования экспрессии целевого гена в глазу млекопитающего, включающий:
(a) введение в глаз вектора, содержащего целевой ген, который содержит полинуклеотидную кассету, содержащую (i) рибосвитч и (ii) альтернативно сплайсированный экзон, граничащий с 5'-интроном и 3'-интроном, при этом рибосвитч содержит эффекторную область, содержащую стебель, который содержит 5'-участок сплайсинга 3'-интрона, и аптамер, который связывается с низкомолекулярным лигандом, при этом альтернативно сплайсированный экзон содержит стоп-кодон, который находится внутри рамки с целевым геном;
(b) воздействие на млекопитающего низкомолекулярным лигандом в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии целевого гена.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что вектор вводят в глаз с помощью внутриглазной инъекции.
16. Способ по п.14 или 15, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, вектора аденоассоциированного вируса и лентивирусного вектора.
18. Способ по любому из пп.8-17, отличающийся тем, что полинуклеотидную кассету помещают в кодирующую белок последовательность целевого гена.
19. Способ по любому из пп.8-18, отличающийся тем, что 5'-и 3'-интроны:
(a) получают из эндогенного интрона из целевого гена;
(b) являются экзогенными для целевого гена или (c) получают из интрона 2 гена β-глобина человека.
20. Способ по любому из пп.8-19, отличающийся тем, что 5'-интрон содержит стоп-кодон в рамке с целевым геном.
21. Способ по любому из пп.8-20, отличающийся тем, что 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 50 до около 300 нуклеотидов в длину, предпочтительно 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 125 до около 240 нуклеотидов в длину.
22. Способ по любому из пп.8-21, отличающийся тем, что стебель эффекторной области имеет от около 7 до около 20 пар оснований в длину, предпочтительно стебель эффекторной области имеет от 8 до 11 пар оснований в длину.
23. Способ по любому из пп.8-22, отличающийся тем, что альтернативно сплайсированный экзон:
(a) получают из экзона 2 гена дигидрофолатредуктазы человека, экзона 5 мутантной опухоли Вильмса 1 человека, экзона 16 кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы II дельта мыши или экзона 6 SIRT1;
(b) модифицирован посредством одного или более процессов, выбранных из группы, состоящей из изменения последовательности экзонного энхансера сплайсинга, изменения последовательности экзонного сайленсера сплайсинга, добавления экзонного энхансера сплайсинга и добавления экзонного сайленсера сплайсинга;
(c) представляет собой модифицированный экзон 2 DHFR человека из SEQ ID NO: 15 или (d) является синтетическим.
- 43 037120
24. Рекомбинантный полинуклеотид, содержащий целевой ген с полинуклеотидной кассетой по любому из пп.1-7.
25. Рекомбинантный полинуклеотид по п.24, отличающийся тем, что полинуклеотидную кассету помещают в кодирующую белок последовательность целевого гена.
26. Вектор, содержащий целевой ген, который содержит полинуклеотидную кассету по любому из пп.1-7.
27. Вектор по п.26, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
28. Вектор по п.27, отличающийся тем, что указанный вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, вектора аденоассоциированного вируса и лентивирусного вектора.
EA201791751A 2015-02-02 2016-02-02 Регулирование экспрессии генов посредством аптамер-опосредованного модулирования альтернативного сплайсинга EA037120B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562110919P 2015-02-02 2015-02-02
PCT/US2016/016234 WO2016126747A1 (en) 2015-02-02 2016-02-02 Regulation of gene expression by aptamer-mediated modulation of alternative splicing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791751A1 EA201791751A1 (ru) 2018-02-28
EA037120B1 true EA037120B1 (ru) 2021-02-09

Family

ID=56564618

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202092665A EA202092665A3 (ru) 2015-02-02 2016-02-02 Регулирование экспрессии генов посредством аптамеропосредованного модулирования альтернативного сплайсинга
EA201791751A EA037120B1 (ru) 2015-02-02 2016-02-02 Регулирование экспрессии генов посредством аптамер-опосредованного модулирования альтернативного сплайсинга

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202092665A EA202092665A3 (ru) 2015-02-02 2016-02-02 Регулирование экспрессии генов посредством аптамеропосредованного модулирования альтернативного сплайсинга

Country Status (27)

Country Link
US (3) US10494646B2 (ru)
EP (2) EP3265563B1 (ru)
JP (3) JP6871174B2 (ru)
KR (1) KR20170121745A (ru)
CN (2) CN107849563B (ru)
AU (2) AU2016215454B2 (ru)
BR (1) BR112017016639A2 (ru)
CA (1) CA2975735A1 (ru)
CY (1) CY1124189T1 (ru)
DK (1) DK3265563T3 (ru)
EA (2) EA202092665A3 (ru)
ES (1) ES2873400T3 (ru)
HK (1) HK1248760A1 (ru)
HR (1) HRP20210854T1 (ru)
HU (1) HUE054624T2 (ru)
IL (2) IL253786B (ru)
LT (1) LT3265563T (ru)
MX (2) MX2017009953A (ru)
MY (1) MY186203A (ru)
NZ (1) NZ735054A (ru)
PH (1) PH12017501389A1 (ru)
PL (1) PL3265563T3 (ru)
PT (1) PT3265563T (ru)
RS (1) RS61924B1 (ru)
SG (1) SG11201706297RA (ru)
SI (1) SI3265563T1 (ru)
WO (1) WO2016126747A1 (ru)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
IL294014B1 (en) 2015-10-23 2024-03-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
JP7184649B2 (ja) * 2016-02-02 2022-12-06 メイラジーティーエックス・ユーケー・ザ・セカンド・リミテッド アプタマーによるポリアデニル化の調節を通じての遺伝子発現制御
EP3494229B1 (en) * 2016-08-03 2023-10-25 Meiragtx UK II Limited High throughput cell-based screening for aptamers
AU2017306676B2 (en) 2016-08-03 2024-02-22 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
BR112019017444A2 (pt) * 2017-02-21 2020-04-14 Meiragtx Uk Ii Ltd regulação da expressão gênica por acessibilidade mediada por aptâmero de sinais de poliadenilação
CA3055100A1 (en) * 2017-03-02 2018-09-07 MEIRAGTX, UK II Limited Regulation of gene expression by aptamer-modulated rnase p cleavage
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
KR20190130613A (ko) 2017-03-23 2019-11-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
SG11202007652UA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Bristol Myers Squibb Co Camk2d antisense oligonucleotides and uses thereof
US20220127642A1 (en) * 2019-01-30 2022-04-28 Applied Stemcell, Inc. Controllable genome editing system
EP3942040A1 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP3963070A4 (en) * 2019-04-30 2023-02-22 Encodia, Inc. METHODS OF PREPARATION OF ANALYTES AND RELATED KITS
EP4051324A4 (en) * 2019-10-28 2023-11-29 University Of Florida Research Foundation, Incorporated GENE THERAPY VECTORS
AU2021243743A1 (en) 2020-03-24 2022-11-24 Meiragtx Uk Ii Limited Aptamers that bind thiamine analogs and derivatives
MX2022014008A (es) 2020-05-08 2023-02-09 Broad Inst Inc Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo.
CA3239128A1 (en) 2021-12-15 2023-07-13 Xuecui GUO Polycistronic expression of gut peptides
WO2023111686A2 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 Meiragtx Uk Ii Limited Aptamers and small molecule ligands
WO2023212293A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof
WO2023212298A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease
WO2024044689A2 (en) * 2022-08-24 2024-02-29 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Small molecule-inducible gene expression switches

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100223694A1 (en) * 2004-12-21 2010-09-02 Linda Lutfiyya Recombinant DNA Constructs and Methods for Controlling Gene Expression
US20100221821A1 (en) * 2007-05-29 2010-09-02 Yale University Methods and compositions related to riboswitches that control alternative splicing and rna processing
US20110111411A1 (en) * 2009-11-10 2011-05-12 Smolke Christina D Protein-Responsive RNA Control Devices and Uses Thereof
US20130291226A1 (en) * 2012-01-23 2013-10-31 The Regents Of The University Of California P5sm suicide exon for regulating gene expression

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
KR970002255B1 (ko) 1990-06-11 1997-02-26 넥스스타 파아마슈티컬드, 인크. 핵산 리간드
US8008071B2 (en) 1999-11-08 2011-08-30 University Of South Florida Compositions and methods for detecting intracellular glucose and analogs thereof
AU2001240375A1 (en) 2000-03-17 2001-10-03 Benitec Australia Limited Genetic silencing
US20040126882A1 (en) 2000-06-15 2004-07-01 Ellington Andrew D Regulatable, catalytically active nucleic acids
JP5101288B2 (ja) 2004-10-05 2012-12-19 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー アプタマー調節される核酸及びその利用
US7563601B1 (en) * 2005-06-01 2009-07-21 City Of Hope Artificial riboswitch for controlling pre-mRNA splicing
US20080124760A1 (en) * 2006-07-26 2008-05-29 Barbara Enenkel Regulatory Nucleic Acid Elements
CN101801185A (zh) * 2007-03-22 2010-08-11 耶鲁大学 与控制可变剪接的核糖开关有关的方法和组合物
US8367815B2 (en) 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
PT2800811T (pt) * 2012-05-25 2017-08-17 Univ California Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição
EP2855659A1 (en) 2012-05-31 2015-04-08 Novozymes A/S Improved selection in fungi
GB201506440D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Riboswitch-controlled screening and selection of desired biocatalysts

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100223694A1 (en) * 2004-12-21 2010-09-02 Linda Lutfiyya Recombinant DNA Constructs and Methods for Controlling Gene Expression
US20100221821A1 (en) * 2007-05-29 2010-09-02 Yale University Methods and compositions related to riboswitches that control alternative splicing and rna processing
US20110111411A1 (en) * 2009-11-10 2011-05-12 Smolke Christina D Protein-Responsive RNA Control Devices and Uses Thereof
US20130291226A1 (en) * 2012-01-23 2013-10-31 The Regents Of The University Of California P5sm suicide exon for regulating gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
SI3265563T1 (sl) 2021-08-31
CN114990143A (zh) 2022-09-02
CN107849563A (zh) 2018-03-27
AU2016215454B2 (en) 2022-05-19
MX2017009953A (es) 2018-04-26
IL284796A (en) 2021-08-31
HRP20210854T1 (hr) 2021-07-09
JP2023099821A (ja) 2023-07-13
EP3265563A4 (en) 2018-07-11
EA202092665A3 (ru) 2021-06-30
AU2022215190A1 (en) 2022-09-01
IL253786A0 (en) 2017-09-28
EP3892726A1 (en) 2021-10-13
IL284796B (en) 2022-10-01
US20220282278A1 (en) 2022-09-08
PL3265563T3 (pl) 2021-09-13
MY186203A (en) 2021-06-30
KR20170121745A (ko) 2017-11-02
CA2975735A1 (en) 2016-08-11
CY1124189T1 (el) 2022-05-27
EA202092665A2 (ru) 2021-03-31
EP3265563B1 (en) 2021-04-14
JP2018504929A (ja) 2018-02-22
IL253786B (en) 2021-07-29
LT3265563T (lt) 2021-06-25
DK3265563T3 (da) 2021-05-31
ES2873400T3 (es) 2021-11-03
RS61924B1 (sr) 2021-06-30
US11248239B2 (en) 2022-02-15
US20200087683A1 (en) 2020-03-19
MX2022002634A (es) 2022-03-25
US10494646B2 (en) 2019-12-03
EP3265563A1 (en) 2018-01-10
PH12017501389A1 (en) 2018-01-15
HUE054624T2 (hu) 2021-09-28
HK1248760A1 (zh) 2018-10-19
BR112017016639A2 (pt) 2018-06-19
SG11201706297RA (en) 2017-09-28
IL284796B2 (en) 2023-02-01
JP6871174B2 (ja) 2021-05-12
CN107849563B (zh) 2021-10-19
WO2016126747A1 (en) 2016-08-11
PT3265563T (pt) 2021-06-03
JP7288478B2 (ja) 2023-06-07
JP2021112198A (ja) 2021-08-05
AU2016215454A1 (en) 2017-09-21
NZ735054A (en) 2022-09-30
US20180010146A1 (en) 2018-01-11
EA201791751A1 (ru) 2018-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7288478B2 (ja) 選択的スプライシングのアプタマー媒介性調節による遺伝子発現の調節
US20230220382A1 (en) Regulation of gene expression via aptamer-mediated control of self-cleaving ribozymes
JP7184649B2 (ja) アプタマーによるポリアデニル化の調節を通じての遺伝子発現制御
US20240093209A1 (en) Regulation of Gene Expression by Aptamer-Mediated Accessibility of Polyadenylation Signals