CN110184326B - 一种tpp核糖开关序列引物和肠道菌群分类方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TPP核糖开关序列引物和肠道菌群分类方法，该分类应用TPP核糖开关作为一种新的细菌分类分子标准在人类肠道菌中进行物种鉴定，可以区分16SrRNA分不开的物种，弥补16S rRNA基因序列在细菌分类上的不足，能够实现有效区分近缘菌株之间的细小差别。
Description
技术领域
本发明涉及一种TPP核糖开关序列引物和肠道菌群分类方法。
背景技术
目前16S rRNA基因序列广泛应用在细菌分类的研究，但是16S rRNA基因序列具有相对的稳定性，使得16S rRNA基因序列进化速率相对较低，无法分辨近缘菌株之间的进化关系，一般只能分析到属的水平，以及16S rRNA基因序列在物种内存在种内异质性，这也是细菌分类中的一个重要的误差来源。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种TPP核糖开关序列引物和肠道菌群分类方法，解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种TPP核糖开关序列引物，所述引物为3’端带有接头序列的保守序列，所述保守序列为
SEQ ID No:01：NNGCTGAGA，和
SEQ ID No:02：TYCCTNCGC；
本发明还提供了一种肠道菌群分类方法，设计TPP核糖开关序列引物，以KlenowFragment酶构建TPP核糖开关基因序列文库，采用特异性扩增制备人类肠道菌的总TPP核糖开关序列，建立一种新的肠道菌群分类标准；所述TPP核糖开关序列引物包含上述保守序列SEQ ID No:01和SEQ ID No:02。
具体包括如下步骤：
一)构建TPP核糖开关基因序列文库，设计带有接头序列的TPP核糖开关保守序列引物，并以人类肠道菌群DNA样本为模板，加入Klenow Fragment酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和超纯水构建混合体系，经孵育程序依次合成TPP核糖开关基因DNA序列的第一条链和第二条链，得到总TPP核糖开关DNA序列；
其中，孵育程序为：
步骤一)具体步骤如下：
1)TPP核糖开关序列引物设计；所述TPP核糖开关序列引物为带有接头序列的TPP核糖开关保守序列，上游引物和下游引物序列分别为
SEQ ID No:03：TTAACCCCACAAACACGGGAGCNNGCTGAGA，和
SEQ ID No:04：ATGCTTGATTCTCCTCGCTACGTYCCTNCGC；
2)TPP核糖开关基因DNA序列第一条链的合成；
①取人类肠道菌群DNA样本1000ng，加入10μM SEQ ID No:03 5μL，补充超纯水使总体系达到20μL，得到20μL混合体系；
②将20μL混合体系在95℃孵育5min；
③将孵育后的20μL混合体系置于冰上，并加入以下组分，得到40μL混合体系：
④将40μL混合体系立即放入PCR中，以孵育程序进行孵育，得到第一条链。
3)TPP核糖开关基因DNA序列第二条链的合成；
①在上述孵育后的40μL混合体系置于冰上依次加入如下组分，得到50μL混合体系：
②将50μL混合体系立即放入PCR中，进行如下孵育程序，得到第二条链，得到总TPP核糖开关基因DNA样本。
二)将步骤一)产物总TPP核糖开关DNA序列进行PCR扩增；其中，步骤二)的上游引物、下游引物序列为
SEQ ID No:05：TTAACCCCACAAACACGGGAGC，和
SEQ ID No:06：ATGCTTGATTCTCCTCGCTACG
取上步总TPP核糖开关基因DNA样本中10μL，PCR体系以40μL计组分为下表，
进行PCR反应，循环30轮并于4℃下保存产物。
三)构建总TPP核糖开关DNA序列PCR扩增文库；
1)设计总TPP核糖开关DNA序列PCR建库引物，其中建库的上游引物、下游引物序列为
SEQ ID No:07：
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTAACCCCACAAACACGGGAGC，和
SEQ ID No:08：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCATATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCATGCTTGATTCTCCTCGCTACG，
建库的下游引物包括索引序列SEQ ID No:09：GCATAT；
2)将步骤二)TPP核糖开关基因的2个样本PCR产物，依次取3μL作为建库模板，组分为下表，
随后进行PCR反应，循环30轮并于4℃下保存产物。
四)Illumina二代测序服务。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本方案建立了一种特异性扩增具有短保守DNA片段的新方法，并应用该方法特异性扩增出人类肠道菌中总TPP核糖开关序列，可以区分16SrRNA分不开的物种；
2.核糖开关是调控基因表达的非编码RNA，作为细胞核酸组分水平中的分子标准用来区分细菌物种，具有序列较短便于分析的优点，同时核糖开关广泛分布在细菌中，其序列的变异更加丰富，便于和肠道菌功能相结合，能够实现有效区分近缘菌株之间的细小差别。
附图说明
图1为本发明分类方法流程示意图；
图2为16S rRNA基因V4片段；
图3为TPP核糖开关文库。
具体实施方式
请查阅图1～3，本实施例的一种肠道菌群分类方法，包括如下步骤：
一)TPP核糖开关基因序列文库的构建：
1)TPP核糖开关基因序列引物设计；
所述TPP核糖开关基因序列的保守序列(下划线)5’端接有adapter序列，在本实施例中，adapter序列采用与后续高通量测序机器适配接头序列，具体如下：
2)TPP核糖开关基因DNA序列第一条链的合成；
①取肠道菌样品DNA 1000ng，加入上述TPP核糖开关10μM Reverse primer 5μL，补充超纯水使总体系达到20μL，得到20μL混合体系；
②将20μL混合体系在95℃孵育5min；
③将孵育后的20μL混合体系置于冰上，并加入以下组分，得到40μL混合体系：
④将40μL混合体系立即放入PCR中，进行如下孵育程序，得到第一条链：
3)TPP核糖开关基因DNA序列第二条链的合成；
①在上述孵育后的40μL混合体系置于冰上依次加入如下组分，得到50μL混合体系：
②将50μL混合体系立即放入PCR中，进行如下孵育程序，得到第二条链，得到总TPP核糖开关基因DNA样本：
二)总TPP核糖开关基因DNA样本PCR扩增：
1)PCR扩增引物设计；
本实施例采用总TPP核糖开关基因DNA样本adapter序列作为引物，
2)取10μL总TPP核糖开关基因DNA样本作为PCR模板，依次加入如下组分：
3)将PCR反应管放入普通PCR仪中，PCR反应程序如下设置：
三)总TPP核糖开关DNA序列PCR扩增文库制备：
1)总TPP核糖开关DNA序列PCR建库引物P5和97的设计(下划波浪线标记为index序列)；
2)将步骤二)得到的TPP核糖开关基因2个样本PCR产物，依次取3μL作为建库模板；
四)测序，具体为Illumina二代测序服务。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种TPP核糖开关序列引物和肠道菌群分类新方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
nngctgaga 9
<210> 2
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tycctncgc 9
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaaccccac aaacacggga gcnngctgag a 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcttgatt ctcctcgcta cgtycctncg c 31
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttaaccccac aaacacggga gc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcttgatt ctcctcgcta cg 22
<210> 7
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgatacggc gaccaccgag atctacactc tttccctaca cgacgctctt ccgatcttta 60
accccacaaa cacgggagc 79
<210> 8
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agatgcatat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcatgcttg attctcctcg ctacg 85
<210> 9
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcatat 6
Claims (7)
1.一种肠道菌群分类方法，其特征在于：设计TPP核糖开关序列引物，以KlenowFragment酶构建TPP核糖开关基因序列文库，采用特异性扩增制备人类肠道菌的总TPP核糖开关序列，进行肠道菌群分类；所述TPP核糖开关序列引物的保守序列为SEQ ID No:01和SEQ ID No:02。
2.根据权利要求1所述的一种肠道菌群分类方法，其特征在于，包括如下步骤：
一）构建TPP核糖开关基因序列文库，设计带有接头序列的TPP核糖开关保守序列引物，并以人类肠道菌群DNA样本为模板，加入Klenow Fragment酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和超纯水构建混合体系，经孵育程序依次合成TPP核糖开关基因DNA序列的第一条链和第二条链，得到总TPP核糖开关DNA序列；
二）将步骤一）产物总TPP核糖开关DNA序列进行PCR扩增；
三）构建总TPP核糖开关DNA序列PCR扩增文库；
四）测序。
3.根据权利要求2所述的一种肠道菌群分类方法，其特征在于：将所述混合体系置于冰上5分钟，随后依次置于25℃ 25分钟、50℃ 5分钟、75℃ 10分钟、95℃ 5分钟进行孵育。
4.根据权利要求2所述的一种肠道菌群分类方法，其特征在于所述步骤一）包括如下步骤：
1）TPP核糖开关序列引物设计；所述TPP核糖开关序列引物为带有接头序列的TPP核糖开关保守序列，上游引物和下游引物序列分别为SEQ ID No:03和SEQ ID No:04；
2）TPP核糖开关基因DNA序列第一条链的合成；
①取人类肠道菌群DNA样本1000 ng，加入10 µM SEQ ID No:03 5 µL，补充超纯水使总体系达到 20 µL，得到20 µL混合体系；
②将20 µL混合体系在95°C孵育5min；
③将孵育后的20 µL混合体系置于冰上，并加入以下组分，得到40 µL混合体系，所述混合体系的组分为：10X 缓冲液4µL、2.5mM dNTPs 4.5µL、Klenow Fragment 4µL和超纯水7.5µL；
④将40 µL混合体系立即放入PCR中，以孵育程序进行孵育，得到第一条链；
3）TPP核糖开关基因DNA序列第二条链的合成；
①在上述孵育后的40 µL混合体系置于冰上依次加入10 µM SEQ ID No:04 5µL和Klenow Fragment 5µL，得到50 µL混合体系：
②将50 µL混合体系立即放入PCR中，进行如下孵育程序，得到第二条链，得到总TPP核糖开关基因DNA样本。
5.根据权利要求2所述的一种肠道菌群分类方法，其特征在于：所述步骤二）的PCR扩增中，上游引物、下游引物序列为SEQ ID No:05和SEQ ID No:06；
取总TPP核糖开关基因DNA的样本10 µL，PCR体系以40 µL计组分为；10X Pfu HF 缓冲液 10µL、10 μM SEQ ID No:05 2.5µL、10 μM SEQ ID No:06 2.5µL、2.5mM 的 dNTPs 10µL、Pfu高保真酶 2µL和超纯水 13µL；
进行PCR反应，循环30轮并于4°C下保存产物。
6.根据权利要求2所述的一种肠道菌群分类方法，其特征在于所述步骤三）包括如下步骤：
1）设计总TPP核糖开关DNA序列PCR建库引物，其中建库的上游引物、下游引物序列为SEQ ID No:07和SEQ ID No:08，建库的下游引物包括索引序列SEQ ID No:09；
2）将步骤二）TPP核糖开关基因的2个样本PCR产物，依次取3 µL作为建库模板，组分为：10X Pfu HF 缓冲液 10µL、10 μM SEQ ID No:07 2.5µL、10 μM SEQ ID No:08 2.5µL、2.5mM 的dNTPs 4µL、Pfu高保真酶 2µL和超纯水 26µL；
随后进行PCR反应，循环30轮并于4°C下保存产物。
7.根据权利要求2所述的一种肠道菌群分类方法，其特征在于：所述步骤四）采用Illumina二代测序。
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