CN114032293A - 一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法及应用 - Google Patents

一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于污水检测技术领域，涉及一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法及应用。包括以下步骤：i)构建硝化杆菌属细菌DNA片段的质粒；ii)将质粒导入感受态细胞中，扩繁、质粒提取、梯度稀释，获得不同浓度的质粒；iii)从污泥中提取DNA；iv)得到不同浓度的质粒达到一定荧光强度分别对应的循环数和DNA对应的循环数；v)绘制标准曲线；vi)计算污泥中硝化杆菌属细菌的浓度。本发明提供的检测硝化杆菌属细菌的方法具有重复性好、特异性强、灵敏度高、操作过程简便等优点，大幅度提高了检测效率。

Description

一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法及应用
技术领域
本发明属于污泥检测技术领域，更具体地，涉及一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法及应用。
背景技术
亚硝酸盐氧化细菌(NOB)是城市污水处理厂生物脱氮过程中起作用的主要细菌之一，主要将NO2 -氧化为NO3 -，属于专性自养好氧细菌，以无机碳或者无机碳化合物作为碳源合成自身营养物质，利用氨氧化过程中释放的能量作为自身新陈代谢的能源，对光照较为敏感。硝化杆菌属细菌(Nitrospira)是污水处理厂中常见的亚硝酸盐氧化细菌(NOB)菌属。
因此，准确检测硝化杆菌属细菌的浓度，对于污水处理工艺优化控制和稳定运行具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量方法，可准确检测污泥中硝化杆菌属细菌的含量。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，该污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法包括：
Ⅰ)对目的基因片段进行扩增、验证；
Ⅱ)对目的基因片段进行分离、纯化；
Ⅲ)构建含有硝化杆菌属细菌的DNA片段的质粒；
Ⅳ)将所述质粒导入感受态细胞中，并对所述感受态细胞进行扩繁，提取扩繁后的感受态细胞中的质粒，对该质粒进行梯度稀释，获得不同浓度的质粒；
Ⅴ)从污泥中提取DNA；
Ⅵ)对步骤Ⅳ)获得的不同浓度的质粒和步骤Ⅴ)获得的样品DNA进行荧光定量PCR，得到步骤Ⅳ)获得的不同浓度的质粒达到一定荧光强度分别对应的循环数和步骤Ⅴ)获得的DNA对应的循环数；
Ⅶ)根据步骤Ⅳ)得到的不同浓度的质粒以及每个浓度的质粒对应的循环数，绘制标准曲线；
Ⅷ)根据所述标准曲线和样品DNA对应的循环数，计算所述污泥中硝化杆菌属细菌的浓度。
作为优选方案，步骤Ⅰ)-Ⅲ)包括以下步骤：
a)提取含有硝化杆菌属细菌样品的DNA，之后进行PCR，获得大量硝化杆菌属细菌的DNA片段，即PCR产物；
b)对PCR产物进行凝胶电泳验证；
c)将电泳后凝胶进行切胶回收；
d)将回收后的DNA片段导入载体中，构建含有硝化杆菌属细菌的DNA片段的质粒。
本领域技术人员可根据现有的提取DNA的方法改进后用于提取所述硝化杆菌属细菌的DNA。根据硝化杆菌属细菌的DNA设计步骤a)中的PCR的上游引物和下游引物，优选地，所述PCR采用如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。SEQ IDNO:1的核苷酸序列为5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′；SEQ ID NO:2的核苷酸序列为5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′。
根据本发明，在一个具体的实施方式中，PCR的反应条件可以为：94℃变性3min；94℃变性60s、55℃复性60s、72℃延伸120s；30个循环；72℃延伸10min；4℃保持。PCR的反应体系可以如表1所示。
表1 PCR反应体系
组分 体积
上游引物SEQ ID NO:1(100μM) 0.4μl
下游引物SEQ ID NO:2(100μM) 0.4μl
GoTaq Green Master Mix 10μl
DNA模板 2μl
ddH<sub>2</sub>O补至 20μl
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶回收。
将回收后硝化杆菌属细菌的DNA片段(PCR产物)与载体连接，连接体系如表2所示。
表2连接体系
组分 体积
2×buffer(缓冲液) 2.5μl
载体 0.5μl
Ligase酶 0.5μl
PCR产物 1.5μl
为了获得更加准确的检测结果，获得硝化杆菌属细菌的DNA片段所使用的引物与荧光定量所使用的引物相同。具体为，在步骤Ⅵ)中，荧光定量PCR的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述荧光定量PCR的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQID NO:1的核苷酸序列为5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′；SEQ ID NO:2的核苷酸序列为5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′。
根据本发明，在一个具体的实施方式中，荧光定量PCR的扩增程序可以为：94℃预变性3min，94℃变性60s、56℃复性60s、72℃延伸120s，40个循环；溶解曲线95℃15s，60℃1min，72℃45s。荧光定量PCR的反应体系可以如表3所示。
表3荧光定量PCR的反应体系
组分 体积
上游引物SEQ ID NO:1(100μM) 0.2μl
下游引物SEQ ID NO:2(100μM) 0.2μl
SYBR Green Premix Ex Taq 10μl
ROX Reference Dye 0.4μl
DNA模板 2μl
ddH<sub>2</sub>O补至 20μl
作为优选方案，与硝化杆菌属细菌的DNA片段(PCR产物)连接的载体为PGEM-T-easy载体。PGEM-T-easy载体市售可得。
作为优选方案，质粒转化到大肠杆菌、筛选方法以及扩大培养的方法如下：将PCR产物通过切胶回收后，将硝化杆菌属细菌的DNA片段与载体连接，构成质粒，质粒转化进大肠杆菌，通过蓝白斑筛选，筛选出连接、转化成功的质粒，挑出白斑于液体培养基中扩大培养。
作为优选方案，所述感受态细胞为大肠杆菌，进一步优选为大肠杆菌JM109。
作为优选方案，所述标准曲线的检出限为108～1013拷贝数/μl。
作为优选方案，在检测污泥中的硝化杆菌属细菌时，在步骤Ⅴ)中，从污泥中提取DNA包括以下步骤：提取污泥样品中DNA，同时测定样品的含水率。
本发明的第二方面提供上述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法在污泥检测技术领域中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的检测硝化杆菌属细菌的方法可以对污泥中的硝化杆菌属细菌进行检测。
本发明提供的检测硝化杆菌属细菌的方法通过硝化杆菌属细菌DNA质粒和荧光定量PCR技术，可准确检测污泥中硝化杆菌属细菌的浓度。
本发明提供的检测硝化杆菌属细菌的方法具有重复性好、特异性强、灵敏度高、操作过程简便等优点，大幅度提高了检测效率。
本发明的其他特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其他目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了实施例1中的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳照片。
图2示出了不同浓度的质粒的荧光定量PCR结果的曲线图。
图3示出了质粒的溶解曲线图。
图4示出了根据不同质粒的浓度以及每个浓度的质粒对应的循环数绘制的标准曲线。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
实施例1
本实施例提供一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法。
a)从污水处理过程活性污泥中获取DNA。
b)采用MOBIO土壤DNA提取试剂盒(DNeasy PowerSoil Kit)提取污泥样品中的DNA，之后通过PCR方法获得目的基因(DNA片段)。PCR采用如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物，SEQ ID NO:1的核苷酸序列为5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′；SEQ ID NO:2的核苷酸序列为5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′。
配制PCR体系：上游引物(100μM)，0.4μl；下游引物(100μM)，0.4μl；GoTaq GreenMaster Mix，10μl；DNA模板，2μl；ddH2O补至20μl。PCR的反应条件为：94℃变性3min；94℃变性60s、55℃复性60s、72℃延伸120s；30个循环；72℃延伸10min；4℃保持。将扩增后的PCR产物(DNA片段)通过新鲜的TAE缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳，做三个平行样，同时通过DL2000marker进行比较，确定扩增片段大小是否正确，结果如图1所示，每个样品均扩增得到397bp左右的条带。
c)切出目的条带，然后将其移至管中；加约5倍体积的TE缓冲液，55℃水浴3-5min至琼脂糖全溶；加等体积氯仿，混匀，室温，12000rpm离心5min；取上清，加1/10体积的3mol/L的NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的冰冷无水乙醇；-20℃放置30min以上；4℃，12000rpm离心5min；弃上清，加1ml冰冷的70％乙醇，4℃，12000rpm离心5min；弃上清，室温干燥，30μl TE液溶解沉淀。
d)将该回收产物与PGEM-T-easy载体连接，形成质粒。连接体系如表4所示。
表4连接体系
组分 体积
2×buffer(缓冲液) 2.5μl
vector(载体) 0.5μl
ligase(酶) 0.5μl
PCR产物 1.5μl
e)将质粒转化至大肠杆菌JM109、涂板、筛选、扩大培养，质粒提取及纯化。
转化步骤包括：(1)取感受态细胞(大肠杆菌JM109细胞)冰浴化开；(2)取50μl感受态细胞于回收产物与载体结合后的体系中，放入冰里20min；(3)42℃水浴45s；(4)至冰上2min，快速降温至37℃；(5)加入950μl SOC培养基，37℃、150rpm水浴振荡2h。
涂板步骤包括：(1)在培养基中加入感受态细胞，均匀涂抹于平板培养基上；(2)平板培养基培养20h。
筛选步骤包括：将平板培养基从烘箱中取出，放于4℃冰箱半小时，白色菌落即为连接成功菌落。
扩大培养步骤包括：在50ml离心管中加入20ml液体培养基，将白色菌落挑出放入液体培养基。37℃、150rpm水浴振荡16-24h。
质粒提取及纯化采用
Figure BDA0003425962480000072
Plus SV Minipreps DNA PurificationSystems试剂盒进行操作。
f)将纯化后的质粒作为标准样品，逐级按10倍梯度浓度稀释，分别为108～1013拷贝数/μl。配制实时荧光定量PCR体系，如表5所示，扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性60s、56℃复性60s、72℃延伸120s，40个循环。不同浓度的质粒的扩增曲线(Amplificationplot，Cycle：周期)如图2所示。质粒的溶解曲线分析条件为95℃15s，60℃1min，72℃45s。质粒的溶解曲线(Melt curve plot，Temperabure：温度；Derivative Reporter：单位时间内荧光信号的变化量)结果请参见图3。如图3所示，溶解曲线无杂峰，说明PCR产物为特异性扩增，无杂质。
表5荧光定量PCR的反应体系
Figure BDA0003425962480000071
Figure BDA0003425962480000081
其中，荧光定量PCR的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；荧光定量PCR的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；SEQ ID NO:1的核苷酸序列为5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′；SEQ ID NO:2的核苷酸序列为5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′。
g)根据不同质粒的浓度以及每个浓度的质粒对应的荧光强度，绘制标准曲线，请参见图4，经线性拟合得到标准曲线y＝-3.7067x+43.355，R2＝0.9958，式中，y代表循环数，x代表拷贝数对数。
h)采用MOBIO土壤DNA提取试剂盒(DNeasy PowerSoil Kit)提取污泥样品中的DNA。
i)与梯度稀释后质粒同时进行实时荧光定量PCR反应，得出循环数为21.210，带入标准曲线公式可得拷贝数对数为5.974，故样品中硝化杆菌属细菌浓度为105.974拷贝数/μl。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其特征在于，该污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法包括：
Ⅰ)对目的基因片段进行扩增、验证；
Ⅱ)对目的基因片段进行分离、纯化；
Ⅲ)构建含有硝化杆菌属细菌的DNA片段的质粒；
Ⅳ)将所述质粒导入感受态细胞中，并对所述感受态细胞进行扩繁，提取扩繁后的感受态细胞中的质粒，对该质粒进行梯度稀释，获得不同浓度的质粒；
Ⅴ)从污泥中提取DNA；
Ⅵ)对步骤Ⅳ)获得的不同浓度的质粒和步骤Ⅴ)获得的样品DNA进行荧光定量PCR，得到步骤Ⅳ)获得的不同浓度的质粒达到一定荧光强度分别对应的循环数和步骤Ⅴ)获得的DNA对应的循环数；
Ⅶ)根据步骤Ⅳ)得到的不同浓度的质粒以及每个浓度的质粒对应的循环数，绘制标准曲线；
Ⅷ)根据所述标准曲线和样品DNA对应的循环数，计算所述污泥中硝化杆菌属细菌的浓度。
2.根据权利要求1所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，步骤Ⅰ)-Ⅲ)包括以下步骤：
a)提取含有硝化杆菌属细菌样品的DNA，之后进行PCR，获得大量硝化杆菌属细菌的DNA片段，即PCR产物；
b)对PCR产物进行凝胶电泳验证；
c)将电泳后凝胶进行切胶回收；
d)将回收后的DNA片段导入载体中，构建含有硝化杆菌属细菌的DNA片段的质粒。
3.根据权利要求2所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，步骤a)中，所述PCR采用如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物；
SEQ ID NO:1的核苷酸序列为5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′；
SEQ ID NO:2的核苷酸序列为5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′。
4.根据权利要求1所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，在步骤Ⅵ)中，所述荧光定量PCR的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述荧光定量PCR的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
SEQ ID NO:1的核苷酸序列为5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′；
SEQ ID NO:2的核苷酸序列为5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′。
5.根据权利要求2所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，与硝化杆菌属细菌的DNA片段连接的载体为PGEM-T-easy载体。
6.根据权利要求1所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，所述感受态细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，所述感受态细胞为大肠杆菌JM109。
8.根据权利要求1所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，所述标准曲线的检出限为108～1013拷贝数/μl。
9.根据权利要求1所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法，其中，在检测污泥中的硝化杆菌属细菌时，在步骤Ⅴ)中，所述从污泥中提取DNA包括以下步骤：
提取污泥样品中DNA，同时测定样品的含水率。
10.权利要求1-9中任意一项所述的污泥中硝化杆菌属细菌的定量检测方法在污泥检测技术领域中的应用。
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