CN116179722B - 一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法，检测引物对包含上游引物Hade467F和下游引物Hade865R，上游引物Hade467F的序列号如SEQ ID NO：1所示，下游引物Hade865R的序列号如SEQ ID NO：2所示，试剂盒包括检测引物对、荧光试剂和阳性对照，方法包括提取待测样品的基因组DNA，利用试剂盒中的引物对进行PCR扩增；本发明通过设计的引物，可实现对古菌Hadesarchaea的定量检测，同时具有灵敏度高、重复性好、准确度高的特点，定量检测线性范围广，可以快速鉴定检测各种环境样品中古菌Hadesarchaea的存在。

Description

一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法。
背景技术
碳循环是指CO2、CH4等从大气进入生物圈、岩石圈、水圈，再回到大气的循环过程，包括碳固定、甲烷氧化、产甲烷、有机质降解等生物地球化学过程。CO2是碳循环的重要组成部分，同时也是最主要的温室效应气体之一，CO2介导的碳循环过程直接影响到全球变暖问题，也是是实现我国碳达峰和碳中和目标的直接切入点。微生物直接驱动了环境中的碳循环过程，因此直接影响到大气中CO2这一温室气体的含量及分布。
古菌Hadesarchaea是广古菌门新发现的类群，也有研究认为其应该列为古菌的一个新门类，目前尚无定论。尽管如此，已有研究发现Hadesarchaea古菌在陆地和海底环境中广泛存在，在一些特殊的环境如矿区中也有分布，其在古菌群落结构中占有较高的相对丰度。另外，基因组预测分析显示，Hadesarchaea古菌可能通过一氧化碳脱氢酶途径(C1途径)被产甲烷菌和许多其他厌氧菌用于CO2固定或生产。基于以上研究，Hadesarchaea古菌可能在全球CO2循环中发挥着重要的作用，因此，检测Hadesarchaea古菌在不同环境中的分布状况对于深入探讨其在CO2介导的全球变暖中的贡献具有重要的意义；
目前关于Hadesarchaea古菌的检测手段大都是采用古菌的通用引物进行高通量测序来开展，研究的层面主要停留在Hadesarchaea古菌的相对丰度上，而对其绝对定量的研究匮乏，因此，本发明提出一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法，以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法，该用于检测古菌Hadesarchaea的引物对、试剂盒及方法通过设计的引物，可实现对古菌Hadesarchaea的定量检测，同时具有灵敏度高、重复性好、准确度高的特点，定量检测线性范围广，可以快速鉴定检测各种环境样品中古菌Hadesarchaea的存在。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对，包括检测引物对，所述检测引物对包含上游引物Hade467F和下游引物Hade865R，所述上游引物Hade467F的序列号如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物Hade865R的序列号如SEQ ID NO：2所示。
一种用于检测古菌Hadesarchaea的试剂盒，包括所述的检测引物对。
进一步改进在于：试剂盒还包括SYBR Green Mix荧光试剂和阳性对照。
进一步改进在于：所述阳性对照为一种或多种，所述阳性对照为多种时包括古菌Hadesarchaea在不同浓度梯度下测得的扩增循环数Ct值，进而实现对古菌Hadesarchaea含量的定量检测。
一种检测古菌Hadesarchaea的方法，提取待测样品的基因组DNA，利用所述的试剂盒中的检测引物对进行PCR扩增。
进一步改进在于：包括以下步骤，提取待测样品的基因组DNA作为模板，加入检测引物对，进行PCR反应，反应结束后判断待测样品中是否含有古菌Hadesarchaea。
进一步改进在于：所述步骤具体包括先提取待测样品的基因组DNA作为模板，再加入检测引物对，与荧光试剂混合成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后当扩增曲线有典型荧光扩增曲线，且Ct值小于33，则待测样品中含有古菌Hadesarchaea，并对古菌Hadesarchaea进行荧光定量PCR检测；当扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待测样品中不含有古菌Hadesarchaea。
进一步改进在于：所述反应体系中每10μl扩增体系包括荧光试剂5μl、检测引物对5-10μmol/L、所述样品的基因组DNA模板0.01-0.2μg和余量超纯水。
进一步改进在于：所述反应体系反应过程包括95℃预变性4min，95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，共进行35个循环，最后延伸7min并在4℃下保存。
本发明的有益效果为：本发明通过设计的引物，可实现对古菌Hadesarchaea的定量检测，同时具有灵敏度高、重复性好、准确度高的特点，定量检测线性范围广，可以快速鉴定检测各种环境样品中古菌Hadesarchaea的存在。
附图说明
图1为本发明实施例2标准样品的扩增动力学曲线图。
图2为本发明实施例2溶解曲线图。
图3为本发明实施例2标准样品qPCR的标准曲线图。
图4为本发明实施例2沉积物样品的扩增曲线图。
图5为本发明实施例2标准样品qPCR产物和样品阴性电泳图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对，包括检测引物对，所述检测引物对包含上游引物Hade467F和下游引物Hade865R，所述上游引物Hade467F的序列号如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物Hade865R的序列号如SEQ ID NO：2所示。
一种用于检测古菌Hadesarchaea的试剂盒，包括所述的检测引物对，还包括SYBRGreen Mix荧光试剂和阳性对照，所述阳性对照为一种或多种，所述阳性对照为多种时包括古菌Hadesarchaea在不同浓度梯度下测得的扩增循环数Ct值，进而实现对古菌Hadesarchaea含量的定量检测。
一种检测古菌Hadesarchaea的方法，提取待测样品的基因组DNA，利用所述的试剂盒中的检测引物对进行PCR扩增，包括以下步骤，提取待测样品的基因组DNA作为模板，加入检测引物对，进行PCR反应，反应结束后判断待测样品中是否含有古菌Hadesarchaea。
所述步骤具体包括先提取待测样品的基因组DNA作为模板，再加入检测引物对，与荧光试剂混合成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后当扩增曲线有典型荧光扩增曲线，且Ct值小于33，则待测样品中含有古菌Hadesarchaea，并对古菌Hadesarchaea进行定量；当扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待测样品中不含有古菌Hadesarchaea；
其中，反应体系中每10μl扩增体系包括荧光试剂5μl、检测引物对5-10μmol/L、样品的基因组DNA模板0.01-0.2μg和余量超纯水；
其中，反应体系反应过程包括95℃预变性5min，95℃变性15-30s、57℃退火15-30s、72℃延伸15-30s，共进行35个循环，最后延伸7min并在4℃下保存。
一种定量古菌Hadesarchaea的方法，包括以下步骤：
1、将由上述检测引物经过PCR扩增后得到的序列连接到质粒上，通过构建得到重组阳性质粒，将阳性质粒进行梯度稀释用作不同质粒浓度梯度的DNA模板，后根据上述方法将不同质粒浓度梯度的DNA模板进行荧光定量PCR反应，反应结束可得到不同质粒浓度对应的Ct值，根据不同质粒浓度的常用对数和对应的Ct值拟合线性关系得到古菌Hadesarchaea的qPCR标准曲线；
2、提取待测样品的的基因组作为DNA模板，根据上述方法进行荧光定量PCR反应，反应结束后得到待测样品的Ct值，将其代入古菌Hadesarchaea的qPCR标准曲线，通过计算可得到待测样品中古菌Hadesarchaea的丰度。
实施例2
根据图1-图5所示，本实施例提供了一种针对古菌Hadesarchaea的检测引物对。
一、具体设计方法如下：
在NCBI网站搜索并下载了12条Hadesarchaea古菌的代表性序列，通过Clustal W软件对代表性序列进行多序列比对，选取保守性较强的区段作为兼并引物设计的靶点；通过primer软件对预设的1对兼并引物对进行碱基数、Tm及GC％的评估，引物长度不少于18bp，预设的PCR产物在150～1200bp之间，设计的兼并引物的具体信息如下表所示
两组引物序列中Y＝C/T，R＝A/G，预计所扩增片段的长度为399bp。
二、样品DNA的提取及PCR扩增
1、DNA提取使用DNA Isolation Kit提取试剂盒从沉积物样品中提取总DNA，提取过程严格按照其说明书进行，并通过NanoVueTM Plus微量分析仪(GE,UK)测定其DNA浓度；
2、PCR扩增体系(10μl)：包括5μL 2×Taq PCR StarMix，0.5μL模板DNA，上、下游引物各0.25μL(上述设计引物)，最后使用超纯水补充至终体积5μL；
3、PCR扩增反应：95℃预变性5min，95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸30s，扩增35个循环，72℃延伸7min，保持4℃直至取出样品。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带进行切割，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收DNA。
三、阳性质粒标准样品的制备
1、将上述回收纯化后的DNA利用l8-T Vector连接试剂盒将目的片段连接到载体上，采用热激法将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞，再涂布至含有氨苄青霉素(AMP)的固体培养基，37℃恒温培养12-16h；
2、挑选上述生长状况良好的菌落转移至含有氨苄青霉素(AMP)的液体培养基，37℃恒温震荡培养12-16h。培养完成后将部分菌液进行菌液PCR，选取扩增结果良好的样品使用质粒提取试剂盒提取质粒，后将提取后的Hade-1、Hade-2、Hade-3、Hade-4、Hade-5和Hade-6六组质粒送至实验室进行DNA测序，人工比对核苷酸序列无误后得到质粒标准样品，其中Hade-1、Hade-2、Hade-3、Hade-4、Hade-5和Hade-6六组序列的序列号分别如SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
3、将提取后的质粒溶液用NanoVueTM Plus微量分析仪(GE,UK)测定其浓度，根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出质粒的基因拷贝数。
基因拷贝数拷贝数(拷贝数/μl)＝6.02*1023*质粒浓度(ng/μl)/质粒相对分子质量/109/660
其中，质粒相对分子质量为质粒本身长度与插入目的片段长度之和。
四、荧光定量PCR反应标准曲线的建立
将上述标准样品质粒稀释为101-108拷贝/mL的浓度梯度后进行荧光定量PCR检测：总反应体系为10μL，包括SYBR Permix ExTaqM II(2×)5μL，上、下游引物各0.2μL(10μmol/L)，0.5μL标准样品质粒溶液，用双蒸馏水(ddH2O)补至10μL。在荧光定量PCR仪上进行扩增并检测，扩增反应程序为95℃预变性5min，95℃变性15s、57℃退火15s、72℃延伸15s，收集荧光信号强度，共重复35个循环。
说明书附图1为标准样品扩增曲线图，其中1为108拷贝/μL，2为107拷贝/μL，3为106拷贝/μL，4为105拷贝/μL，5为104拷贝/μL，6为103拷贝/μL，7为102拷贝/μL，8为101拷贝/μL。荧光定量PCR后分析熔解曲线和动力学曲线，熔解曲线见说明书附图3，动力学曲线见说明书附图1，反应结束后得到各起始质粒浓度模板对应的扩增循环数Ct值，即可制作古菌Hadesarchaea的qPCR标准曲线，结果见说明书附图2，荧光定量PCR标准曲线方程：y＝-3.4303x+33.804、E＝95.67％、R2＝0.9979，其中x为起始质粒浓度，y为Ct值。
根据标准曲线的标准方程，不同质粒浓度梯度和Ct值呈线性相关，R2为0.9979，相关性良好，引物的扩增效率高达95.67％。
由说明书附图2可知，各个质粒浓度梯度的溶解曲线(除8主峰前有额外的小单峰外)呈现同一峰值，根据图四左侧8的qPCR产物电泳结果，下方引物二聚体较多，主峰前出现额外的小单峰为正常现象，故上述引物的特异性强；由说明书附图1可知，指数增长期曲线平行，表示荧光定量PCR的扩增效率相近，且不同稀释度之间的Ct值相差均匀，Ct值与质粒浓度的常用对数呈现良好的线性关系。
五、样品的荧光定量PCR反应的检测
1、用天平称取一定质量的样品，采用土壤基因组提取试剂盒提取各样品。将提取的样品作为模板，并将步骤中制备的质粒作为标准品，根据上述提供的实时荧光定量反应体系及反应程序进行定量实验，每个模板均设置3个平行，同时用超纯水代替模板，增加3个空白对照，得到样品的基因拷贝数，实现对不同类型样品中Hadesarchaea古菌基因的定量；
2、不同类型样品的定量PCR的扩增曲线图见说明书附图4，其中，样品一为红树林沉积柱泥样，样品二为海水养殖区沉积物泥样，两份样品扩增曲线与基线交点对应的x值即为对应样品的Ct值，将Ct值作为x值代入标准曲线方程中即可得到对应样品的基因拷贝数。说明书附图5左侧为标准样品qPCR产物的电泳图，右侧为样品阴性电泳图，其中M为Marker，N为阴性对照，其中亮带大小与上述引物设计大小一致，进一步证明了该引物的特异性好，并且对不同类型的样品均表现出很好的特异性。该引物对于快速高效地实现不同环境样品中Hadesarchaea古菌基因的定量具有重要意义。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种用于检测古菌Hadesarchaea的引物对，其特征在于：包括检测引物对，所述检测引物对包含上游引物Hade467F和下游引物Hade865R，所述上游引物Hade467F的序列号如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物Hade865R的序列号如SEQ ID NO：2所示。
2.一种用于检测古菌Hadesarchaea的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的检测引物对，还包括荧光试剂和阳性对照，所述阳性对照包括古菌Hadesarchaea在不同浓度梯度下测得的扩增循环数Ct值。
3.一种检测古菌Hadesarchaea的方法，其特征在于：提取待测样品的基因组DNA，利用权利要求2所述的试剂盒中的检测引物对进行PCR扩增。
4.根据权利要求3所述的一种检测古菌Hadesarchaea的方法，其特征在于：包括以下步骤，提取待测样品的基因组DNA作为模板，加入检测引物对，进行PCR反应，反应结束后判断待测样品中是否含有古菌Hadesarchaea。
5.根据权利要求4所述的一种检测古菌Hadesarchaea的方法，其特征在于：所述步骤具体包括先提取待测样品的基因组DNA作为模板，再加入检测引物对，与荧光试剂混合成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后当扩增曲线有典型荧光扩增曲线，且Ct值小于33，则待测样品中含有古菌Hadesarchaea，并对古菌Hadesarchaea进行定量；当扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待测样品中不含有古菌Hadesarchaea。
6.根据权利要求5所述的一种检测古菌Hadesarchaea的方法，其特征在于：所述反应体系中每10μl扩增体系包括荧光试剂5μl、检测引物对5-10μmol/L、所述样品的基因组DNA模板0.01-0.2μg和余量超纯水。
7.根据权利要求6所述的一种检测古菌Hadesarchaea的方法，其特征在于：所述反应体系反应过程包括95℃预变性5min，95℃变性15-30s、57℃退火15-30s、72℃延伸15-30s，共进行35个循环，最后延伸7min并在4℃下保存。
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