CN115521937A - 一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，所述质粒标准品包括如SEQ ID NO.1所示的外源基因，将外源基因通过TA克隆方法构建得到质粒，所述质粒能够作为标准品定量检测环境样本中硝化杆菌的含量。

Description

一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方 法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用。

背景技术

环境样品中微生物数量众多且成分复杂。污水处理过程中，硝化细菌是生物脱氮过程的主要功能菌群，可将亚硝态氮转化为硝态氮。亚硝酸盐氧化菌(Nitrite-oxidizingbacteria，NOB)可大致可分为5个类群，硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化刺菌属(Nitrospina)、硝化螺菌属(Nitrospira)、硝化球菌属(Nitrococcus)及最近发现的“Candidatus Nitrotoga”，NOB是利用亚硝氮为氮源，CO₂作为主要碳源的革兰氏阴性菌。硝化杆菌属Nitrobacter可将亚硝酸盐氧化为硝酸盐，在自然界中，Nitrobacter属分布广，主要分布在水产养殖、沉积物、海洋及土壤中，其中最常见的是在污水处理厂中，可用Nitrobacter的16SrRNA进行表征。

PCR技术诞生后，分子生物学和基因工程领域的研究得到巨大进步。PCR技术发展的同时，将PCR产物克隆到载体(通常为质粒)里的技术也获得了新的发展。目前已有多种构建克隆的方法，如限制性内切酶消化连接、不需要连接的克隆、体内连接和位点特异性重组系统等。但这些方法需要用到限制性酶处理PCR产物和载体，或者需要特殊的菌株或某些特殊的酶，因操作复杂且繁琐，难以进行高通量操作。

除上述构建克隆的方法之外，还有两种常用且相对简单的克隆方法：TA克隆和平末端连接。TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3’加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3’端自动添加一个3’-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接。而高保真DNA聚合酶通常含有3’-5’核酸外切酶活性，它们扩增出的PCR产物为平末端。将这些片段与切成平末端的载体在T4连接酶的作用下连接就是平末端连接。这两种方法的共同特点是不需要事先用特殊的酶对PCR产物进行处理，而是直接连入载体。

实时定量PCR的分析方法主要分为相对定量和绝对定量。相对定量无恒定的管家基因，难以对目标基因进行标准化。绝对定量较为准确，也是目前环境微生物基因水平定量研究的首选。标准曲线的制备是绝对定量PCR实验的关键步骤，为了研究标准品梯度稀释后进行实时荧光定量PCR的Ct值与模板的拷贝数之间的线性关系是否符合绝对定量的要求。然而，目前缺少定量检测污泥群落中功能菌及其表达基因的标准品，导致检测的效果不准确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，将亚硝酸氧化细菌的外源基因通过TA克隆的方法插入pGM-T中得到质粒，所述质粒能够作为标准品定量检测环境样本中硝化杆菌Nitrobacter的含量。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，所述质粒标准品包括如SEQ ID NO.1所示的外源基因。

优选的，所述功能菌为硝化杆菌Nitrobacter。

本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，所述大肠杆菌基因工程菌株含有上述的质粒标准品。

优选的，所述构建方法包括如下步骤：

利用引物扩增得到外源基因后将其插入pGM-T载体即得所述质粒标准品。

优选的，所述质粒标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述外源基因通过在pGM-T载体的酶切位点两侧的3’端添加T进行插入。

优选的，所述酶切位点为EcoRV酶切位点。

本发明还提供了上述的质粒标准品或上述构建方法得到的质粒标准品在检测硝化杆菌中的应用。

优选的，所述应用为定量检测硝化杆菌的16s基因的表达量。

优选的，所述检测方法为实时荧光定量PCR法。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，所述质粒是将硝化杆菌的16s基因通过TA克隆方法构建得到，通过实验证实可知，利用本发明所述质粒作为标准品能够通过实时荧光定量PCR准确判断基因表达量，构建的含有硝化杆菌16s基因的质粒，能够用于检测环境中硝化杆菌的数量或者硝化杆菌16s基因的表达量，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为硝化杆菌Nitrobacter克隆菌落PCR鉴定条带，其中，最左侧为marker，泳道1、2、3、4均为所得质粒电泳图。

图2为本发明质粒标准品的标准曲线。

图3为本发明质粒标准品及样本的扩增曲线。

图4为本发明质粒标准品及样本的熔解曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，所述质粒标准品包括如SEQ ID NO.1所示的外源基因。

本发明中，所述功能菌优选为硝化杆菌Nitrobacter。本发明中，所述如SEQ IDNO.1所示的外源基因来源于硝化杆菌的16s基因。本发明通过对硝化杆菌的16s基因进行序列测定，从而推断细菌某个种群的数量。

本发明提供了上述质粒标准品的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

利用引物扩增得到外源基因后将其插入pGM-T载体即得所述质粒标准品。

本发明中，所述质粒标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物的核苷酸序列如下所示：

Nitro1198F：ACCCCTAGCAAATCTCAAAAAACCG(SEQ ID NO.3)；

Nitro1432R：CTTCACCCCAGTCGCTGACC(SEQ ID NO.4)。

本发明中，通过TA克隆，构建上述含有外源目的基因的质粒标准品。所述质粒构建所用克隆载体优选为pGM-T，通过将pGM-T载体在EcoRV酶切位点处切开，在两侧的3’端添加T而成，其是由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3’端添加一个A，可与pGM-T 3’端的T互补连接，可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。本发明所述质粒标准品更加稳定，对于硝化杆菌具有更强的特异性和灵敏性。

本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，所述大肠杆菌基因工程菌株含有上述的质粒标准品。本发明中，所述大肠杆菌基因工程菌株的宿主菌优选为大肠杆菌TOP10。在本发明的实施例中，所述大肠杆菌TOP10优选为TOP10菌株感受态，所述TOP10菌株感受态优选的是采用大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。本发明实施例使用的TOP10菌株感受态使用pUC19质粒检测，转化效率可达10⁸个转化子/μg质粒DNA。

本发明提供了上述的质粒标准品或上述的构建方法得到的质粒标准品在检测硝化杆菌中的应用。本发明中，所述检测方法优选为实时荧光定量PCR法。在本发明的具体实施例中，所述实时荧光定量PCR法优选为SYBRGreen I法。

本发明中，活性污泥取自废水生物处理中固定床反应器。

在提取样品DNA时使用：基因组DNA提取试剂盒(DP4621,BioTeke)；

在克隆时使用：2×PCR Master Mix(碧云天，D7228)；pGM-T克隆试剂盒(TIANGEN,VT-302-01)；X-gal(TIANGEN,20mg/mL)；IPTG(TIANGEN,50mg/mL)；TakaraPCR仪。

在荧光定量PCR时使用：Takara TB Green Premix Ex Taq(RR820A)；RocheLightCycler96仪器。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、样品DNA的提取

取固定床生物反应器(此前已长期稳定运行60天)中的活性污泥，将其用匀浆器研磨至看不见大的生物组织，将研磨后的活性污泥12000rpm，离心1min，倒掉上清液，得到污泥样品，按照说明书使用基因组DNA提取试剂盒(DP4621,BioTeke)提取样品DNA。

二、PCR的扩增

利用引物Nitro1198F和Nitro1432R扩增硝化杆菌Nitrobacter的16s基因。PCR反应体系和扩增条件如下表1。

表1反应体系和扩增条件

三、插入片段准备

将上述步骤扩增得到的产物插入到pGM-T载体中，具体的操作步骤根据pGM-T克隆试剂盒(TIANGEN,VT-302-01)的说明书进行。

反应体系如下表2所示。

表2反应体系

10×T4 DNA Ligation Buffer	1μL
		T4 DNA Ligase(3U/μL)	1μL
pGM-T载体(50ng/μL)	1μL
		目的PCR片段/对照/Control Insert DNA	3μL
ddH<sub>2</sub>O	补足至10μL

其中，Control Insert DNA为连接实验的对照组，确保可以与载体连接的DNA，主要为了过程中排除错误。

四、转化及培养

1、准备好LB固体琼脂培养基(添加Amp抗生素，使其终浓度为100ng/mL)，倒平板冷却后，加入40μL的X-gal(TIANGEN,20mg/mL)和16μL(TIANGEN,50mg/mL)的IPTG化学药剂用无菌涂布器均匀涂开，将平板避光置于37℃放置1-3h；

2、取100μL TOP10感受态细胞置于冰浴上；

3、向装有感受态细胞的离心管中加入10μL步骤三中得到的重组反应产物，混匀后在冰浴中静置30min；

4、将冰浴30min的感受态细胞置于42℃水浴中60s，然后迅速转到冰浴中，使细胞冷却2-3min；

5、向离心管中加入的300μL提前37℃预热的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床180rpm震荡培养60min；

6、将150μL的感受态细胞加到相应抗生素的LB固体琼脂培养基上(含抗生素)，用无菌的涂布棒将感受态细胞涂布均匀；将涂布有感受态细胞的LB固体琼脂培养基倒置于37℃培养箱中培养12-16个小时，获得平板；

7、带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，选择外源目的基因插入成功的菌落。

五、克隆鉴定及送测

将步骤四中构建的平板挑取数个白色菌落，分别将其放入5μL无菌水中，抽打混匀后取样进行菌落PCR鉴定，其余样品分别置于300μL的含有Amp抗性的LB培养基中，37℃过夜培养。其中PCR鉴定的反应体系如下表3，反应条件如下表4。

表3克隆鉴定反应体系

ddH<sub>2</sub>O	至20μL
		Forward primer(10μmol)	0.8μL
Reverse primer(10μmol)	0.8μL
		模板菌液	1μL
2×PCR Master Mix	10μL
		总体积	20μL

表4反应条件

PCR完成后，PCR产物进行电泳分析，每个PCR产物取2μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。根据该结果可知，外源基因成功克隆到pGM-T载体中，得到了克隆有外源基因的质粒，目的基因长度为229bp。

将上述通过PCR检测过的菌液进行质粒小提后送入生物公司(华大基因)测序，测序所用引物为sp6和T7，引物序列如下：

T7：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.5)；

SP6：ATTTAGGTGACACTATAG(SEQ ID NO.6)。

将测序结果与理论序列比对，发现呈现克隆测序完全正确。

比对成功的样品，将其保存于-20℃保存备用。可作为下一阶段荧光定量PCR实验检测该种菌落数量或基因表达量的标准品。

实施例2

1、荧光定量PCR实验过程

以实施例1针对硝化杆菌Nitrobacter的16s基因的表达量制备的质粒作为标准品进行荧光定量PCR实验。具体的方法步骤如下所示：

1)将实施例1得到的标准品按照10倍梯度进行稀释。具体梯度稀释情况如下：

1μL标准品原液(标准品I浓度为36.58ng/μL)+9μL稀释缓冲液，得标准品II；

1μL标准品II+μL稀释缓冲液，得标准品III；

1μL标准品III+9μL稀释缓冲液，得标准品IV；

1μL标准品IV+9μL稀释缓冲液，得标准品V；

1μL标准品V+9μL稀释缓冲液，得标准品VI。

2)将上述五个十倍稀释梯度的标准品II～标准品VI按照表1的体系配置，并设置空白组和实验组，空白组添加的为无酶水，实验组添加有样本DNA，样本DNA为取自某固定床生物处理反应器污泥，按照实施例1中样本DNA提取步骤提取得到的DNA。

3)将上述各组样品上Roche LightCycler96荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR，其中，反应体系和扩增条件均为表1所示。

2、实验结果

上述荧光定量PCR反应经过Roche LightCycler96软件拟合，得到图2-3，图2为根据标准品对应的Ct值形成的硝化杆菌Nitrobacter质粒的标准曲线，具体参数如表5所示。图3为扩增曲线。其中，标准曲线取五个点，一个点重复三次。

表5标准曲线的斜率和计算公式

项目	数值
		Slope	-3.1337
Efficiency	2.09
		Error	0.33
R<sup>2</sup>	1.00
		Y-Intercept	8.75

由图2-3可以看出，样品在荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增，荧光定量动力学曲线基线平整，指数区较明显，斜率大且固定，平台期较稳定，为理想的扩增曲线，空白对照一直是水平线不产生引物二聚体，空白对照无扩增曲线。表明利用本发明所述的质粒标准品可以进行绝对定量，能够计算待测样本的拷贝数，且熔解曲线单一峰，无特异性荧光，每组熔解曲线的退火温度都在85-90℃，定量准确具有特异性。

同时，利用质粒标准品拷贝数计算公式：(6.02×10²³)×(标准品浓度ng/μL×10^-9)/(质粒DNA length×660)copies/μL，其中质粒标准品浓度为36.58ng/μL，质粒DNA长度为3244bp，计算得到本发明质粒标准品浓度范围为10.29×10⁸～10.29×10⁴copies/μL。表明本发明用所建立的方法对浓度为10.29×10⁸～10.29×10⁴copies/μL的质粒标准品进行检测，三次重复实验的CV均未超过2.47％，检测的稳定性良好。

另外，用统一处理同一浓度的上述取自某固定床生物处理反应器污泥样本为模板，用上述方法检测三次，得到图3和图4和表6所示CT值。

表6样本DNA荧光定量PCR的CT值

SampleName	CT	CTMean	CTError	Slope	EPF
						样本1	21.47	21.42	0.06	1.2	4.18
样本2	21.36	21.42	0.06	1.14	4.05
						样本3	21.42	21.42	0.06	1.07	3..87

根据表6可以计算得到，样本CT值的平均值为21.42(±0.05)，变异系数为2.6％，曲线的重复效果、稳定性很好。在荧光临界值附近，曲线基本是重叠的。表明利用本发明质粒标准品可以用于样本定量，产物特异性好。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 大连鑫玉龙海洋生物种业科技股份有限公司

<120> 一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacccctagc aaatctcaaa aaaccgtctc agttcggatt gggctctgca actcgagccc 60

atgaagttgg aatcgctagt aatcgtggat cagcatgcca cggtgaatac gttcccgggc 120

cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gttggtttta cctgaagacg gtgcgctaac 180

ccgcaaggga ggcagccggc cacggtaggg tcagcgactg gggtgaaga 229

<210> 2

<211> 3244

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60

tacccctagc aaatctcaaa aaaccgtctc agttcggatt gggctctgca actcgagccc 120

atgaagttgg aatcgctagt aatcgtggat cagcatgcca cggtgaatac gttcccgggc 180

cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gttggtttta cctgaagacg gtgcgctaac 240

ccgcaaggga ggcagccggc cacggtaggg tcagcgactg gggtgaagaa tcactagtga 300

attcgcggcc gcctgcaggt cgaccatatg ggagagctcc caacgcgttg gatgcatagc 360

ttgagtattc tatagtgtca cctaaatagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 420

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 480

aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 540

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 600

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 660

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 720

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 780

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 840

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 900

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 960

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1020

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1080

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1140

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1200

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 1260

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1320

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1380

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1440

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1500

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1560

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1620

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1680

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1740

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1800

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1860

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1920

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 1980

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2040

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2100

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2160

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2220

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2280

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2340

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2400

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2460

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2520

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgatg cggtgtgaaa taccgcacag 2580

atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 2640

gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2700

ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 2760

agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 2820

gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 2880

gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 2940

aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 3000

gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 3060

gcgtccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 3120

cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 3180

cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac 3240

tata 3244

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acccctagca aatctcaaaa aaccg 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcacccca gtcgctgacc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atttaggtga cactatag 18

Claims (10)

1.一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，其特征在于，所述质粒标准品包括如SEQ ID NO.1所示的外源基因。

2.根据权利要求1所述的质粒标准品，其特征在于，所述功能菌为硝化杆菌Nitrobacter。

3.一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌株含有权利要求1所述的质粒标准品。

4.权利要求1所述质粒标准品的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

利用引物扩增得到外源基因后将其插入pGM-T载体即得所述质粒标准品。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述质粒标准品的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述外源基因通过在pGM-T载体的酶切位点两侧的3’端添加T进行插入。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述酶切位点为EcoRV酶切位点。

8.权利要求1-3任意一项所述的质粒标准品或权利要求4-7任意一项所述构建方法得到的质粒标准品在检测硝化杆菌中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为定量检测硝化杆菌的16s基因的表达量。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述检测方法为实时荧光定量PCR法。

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