CN111996245B - 一种基于全长小亚基核糖体rna的反转录来分析微生物群落结构的方法 - Google Patents
一种基于全长小亚基核糖体rna的反转录来分析微生物群落结构的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，包括以下步骤：(1)快速提取样品中的总RNA；(2)在RNA的5’端加第一接头序列；(3)在能够覆盖真核和原核生物的通用反向引物的5’端加第二接头序列，用于反转录小亚基核糖体RNA；(4)在反转录产物中筛选核糖体SSU cDNA；(5)进行PCR扩增，获得双链全长核糖体SSU cDNA，对扩增产物进行测序，并提取出全长SSU rRNA序列；(6)根据所得全长SSU rRNA序列确定准确的分类信息，获得精细的微生物群落结构。与现有技术相比，本发明不使用“通用”正向引物，减少PCR过程产生的偏差，能够得到常规“通用”引物PCR扩增遗漏的微生物，并同时分析细菌、古生菌和真核微生物的整体群落结构等。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，涉及一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法。
背景技术
分离培养是研究环境微生物种类和其组成的传统技术，但是大部分微生物在实验室条件无法被分离，环境微生物研究遇到了瓶颈。随着测序技术的发展，尤其是下一代测序技术的普及，使得科学家们可通过不依赖培养的技术研究环境微生物的分类和组成。常用的技术是通过“通用”引物扩增SSU rRNA基因，高通量测序，通过后续的序列处理和分析，揭开环境微生物的群落结构。但是，此方法使用的“通用”引物具有偏向性和覆盖度问题，导致扩增时偏好于某些类别的微生物或会遗漏一些微生物。例如，地球微生物组计划中经过改进的515F/806R是我们最常用的分析环境微生物多样性的引物，但是其在对宏基因组数据的引物评估中仍然有9.6％的错配率(loe-Fadrosh,E.,Ivanova,N.,Woyke,T.et al.(2016).Metagenomics uncovers gaps in amplicon-based detection of microbialdiversity.Nat Microbiol 1,15032.)；此外，随着高通量测序技术的发展，对这些扩增产物的现在常用的是第二代高通量测序平台，其读长不超过600bp，所得SSU rRNA基因序列的分类不够准确；并且，常规微生物群落结构分析一般是针对样本中提取的DNA进行PCR扩增，不能够区分环境中真正活着的微生物和死去的微生物。
在以往的研究中，李晓然等(Li,X.R.,Lv,Y.,Meng,H.,Gu,J.D.,and Quan,Z.X.(2014).Analysis of microbial diversity by pyrosequencing the small-subunitribosomal RNA without PCR amplification.Appl Microbiol Biotechnol 98(9),3777-3789.)通过SROP(Small-subunit Ribosomal RNA withOut specific PCRamplification)的群落结构的分析方法，避开了“通用”引物的影响，鉴定群落中的活性微生物，提高了群落结构分析的准确度(相关专利号：ZL201010132091.6)，但极高的起始微生物RNA量，序列起始位点不固定和分类序列长度制约了其广泛的应用；阎勇伟等(Yan,Y.W.,Zou,B.,Zhu,T.,Hozzein,W.N.,and Quan,Z.X.(2017).Modified RNA-seq method formicrobial community and diversity analysis using rRNA in different types ofenvironmental samples.PLoS One 12(10),e0186161.)通过在RNA的5’端加接头后用加另一接头随机引物反转录SSU rRNA，并用基于两端的接头序列设计引物来进行PCR扩增的方法，进一步解决了转录组分析群落结构需要高起始RNA，序列起始位点不固定的问题，但是可用分类序列长度仍然不超过600bp。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，不使用特异性PCR正向引物，减少PCR过程产生的偏差，能够得到常规“通用”引物PCR扩增遗漏的微生物，同时分析细菌、古生菌、真核微生物的群落结构，从而更全面地反映环境样品中微生物群落结构的特征。
反转录引物的选择上，我们通过对SILVA数据库的引物评价，证实了1492R了作为反转录全长SSU rRNA反向引物的可行性，其对各类覆盖度为：细菌95.5％，古生菌93.9％，真菌83.2％，整体覆盖度达95.1％；对比
M Karst等人(Karst SM,Dueholm MS,McIlroy SJ,Kirkegaard RH,Nielsen PH,Albertsen M.(2018).Retrieval of a millionhigh-quality,full-length microbial 16S and 18S rRNA gene sequences withoutprimer bias.Nat Biotechnol 36(2):190-5.)在研究中发现的常用来扩增接近全长细菌的SSU rRNA基因序列的引物对27F/1391R或1492R，不覆盖的细菌高达14.7％，常用来扩增古生菌的SSU rRNA基因序列的引物对20F/Uni1392R，不覆盖的古生菌高达13.3％，单端引物1492R的覆盖提升明显，覆盖细菌且长度更长，分类分辨率更高。而且，因多循环扩增中所用的是基于接头序列设计的引物，所以可降低多循环PCR扩增中不同类型微生物之间的偏向性。
本发明为了进一步解决分类序列长度不够的问题，在RNA的5’端加接头，并用覆盖真核，细菌和古生菌的“通用”引物1492R(但不限于此通用引物，也可以为1390R等其它通用引物)作为了反转录引物，转录全长的SSU rRNA序列，借助基于两端接头序列设计的引物扩增之后，借助PacBio第三代测序技术，通过Circular Consensus Sequence(CCS)策略，一条序列循环测序多次的方式，降低测序的错误率，获得准确度在Q30以上，即准确度99.9％以上的序列，在全长的水平和数据库比对，获得准确的分类信息。
本发明设计了一种基于总RNA的，构建全长SSU rRNA文库，并结合PacBio三代测序技术；以解决1)常规微生物群落结构分析中“通用”引物偏向性和覆盖度问题；2)部分微生物信息被遗漏问题；3)分类准确度不够的问题；4)活性微生物和死亡微生物难辨的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，包括以下步骤：
(1)快速提取待分析样品中的总RNA；
(2)在RNA的5’端加接头序列(即第一接头序列)；
(3)在能够覆盖真核和原核生物的1492R引物5’端加一段另一种接头序列(即第二接头序列)，使得1492R引物与该接头序列(即第二接头序列)组成反转录引物，并用于反转录小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)；
(4)在反转录产物中筛选核糖体SSU cDNA；
(5)以前端接头序列(即第一接头序列)一部分为正向引物序列、另一接头序列(即第二接头序列)为反向引物序列进行PCR扩增，获得双链全长核糖体SSU cDNA，对扩增产物进行测序，并提取出全长SSU rRNA序列；
(6)根据所得全长SSU rRNA序列确定分类信息，获得准确的微生物群落结构，同时，还可以得到分类信息未知的序列。
进一步的，步骤(2)中，加接头序列(第一接头序列)所用的接头为Illumina测序通用接头，优选为Gnomegen公司RNA建库试剂盒提供的58nt的Illumina测序通用接头，接头上一段序列作为正向引物序列。
进一步的，步骤(3)中，设计反转录引物时，在通用引物1492R序列的5’端添加一段另一种接头序列(即第二接头序列)，中间添加NNN三个碱基，以避免反转录时引物与SSUrRNA模板结合的偏向性。第二接头序列所用接头也可以为Illumina测序通用接头等。
进一步的，步骤(4)中，采用磁珠筛选核糖体SSU cDNA。更具体的，磁珠是Gnomegen公司提供的磁珠。
进一步的，步骤(5)中，前端接头序列一部分作为正向引物，后端接头序列为反向引物来进行PCR扩增；一起分析多个样品时，可在引物5’加条码(barcode)序列来区分样品。
进一步的，步骤(5)中，扩增产物的测序方式为：采用PacBio第三代高通量测序。具体的，是以第一接头序列一部分为正向引物序列、第二接头序列为反向引物序列扩增cDNA，提高测序核酸浓度；因结合PacBio三代测序技术，无需拼接，直接测得全长的SSU rRNA序列。
进一步的，步骤(5)中，从测序结果中提取出全长SSU rRNA序列具体为：结合所测序列与SSU rRNA基因序列数据库(如：Silva数据库(https://www.arb-silva.de/)，NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的rRNA/ITS databases)进行比对，根据相似度(如：>70％)来确定所测序列是否属于SSU rRNA序列。即若相似度大于70％，则判定所测序列属于SSU rRNA序列，反之，则不是。
进一步的，步骤(6)中，根据全长SSU rRNA序列确定分类信息具体为：利用Usearch(https://www.drive5.com/usearch/)工具，以Silva数据库为参考数据库来确认SSU rRNA序列的分类信息。
进一步的，适用分析的微生物群落为活性细菌、古生菌和/或真核生物。
更进一步的，此方法通过包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黄杆菌等细菌，嗜盐杆菌等古生菌以及毕赤酵母等真核微生物的模拟微生物群落，确认了其可信度。
本发明可以同时对一个环境中的细菌、古生菌、真核生物进行分析，它能够弥补现有“通用”引物的偏向性和不能同时分析原核微生物和真核微生物的问题，并扩大可分析微生物种类的覆盖度，有助于寻找新类型微生物。由于本发明获得的是全长SSU rRNA，采用PacBio三代高通量测序的测序方式，在后期数据分析过程中无需拼接，直接获得全长SSUrRNA的序列信息。本发明使用的是总RNA建库，获得的是活性微生物的组成和分类。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明利用总RNA直接反转，无需割胶回收SSU rRNA，减少实验步骤，降低实验成本，对于生物量较少的样品，也能够很好的实验效果。
(2)本发明分析的是微生物的SSU rRNA，能够检测的是样品中具有活性的微生物。
(3)本发明不通过“通用”引物进行扩增，而是用基于两端接头序列设计的引物进行扩增，改善了“通用”引物的偏向性和覆盖度问题。
(4)本发明是结合三代测序，通过一次反应获得全长的SSU rRNA序列，后续数据分析无需拼接，提高数据分析准确度，并节省数据分析的时间。
附图说明
图1为全长SSU rRNA转录组建库原理图；
图2为文库电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施方式或实施例中，接头是Gnomegen公司RNA建库试剂盒提供的58nt的Illumina测序通用接头；磁珠是Gnomegen公司提供的磁珠。
其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
实施例1：
本实施例提供了一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，对环境样品提取总RNA后，对总RNA的5’端加第一接头，再利用覆盖原核和真核生物SSU rRNA的反向“通用”引物1492R(5’端加第二接头)反转SSU rRNA，再利用基于两端接头序列设计的引物进行PCR扩增获得核糖体SSU cDNA，最后结合三代测序，测得全长的SSUrRNA序列信息，获得准确的微生物群落结构。
本实施例的具体操作过程如下，如图1所示：
1.设计反转录引物，在“通用”引物1492R序列(5‘-TACCTTGTTAYGACTT-3’)的5’端添加一段接头序列5‘-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’，中间添加NNN三个碱基以避免反转录时引物与SSU rRNA模板结合的偏向性，引物的纯化方式采用HPLC纯化。
反转录引物
PB-3N-1492R：
5‘-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGNNNTACCTTGTTAYGACTT-3’
2.设计扩增引物，并在扩增引物的5’端添加条码(Barcode)序列，引物纯化方式采用HAP纯化。
正向引物：
BcN1-FPS 5‘-BarcodeSequence-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3’
反向引物：
BcN2-RPS 5‘-BarcodeSequence-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’
3.反转录实验步骤
3.1初始的总RNA量在10ng-100ng为宜，总RNA于PCR仪上65℃孵育5min，冰上静置5min，随后进行下一步。
3.2接头连接，按照表格中试剂顺序依次添加到200μl的PCR管中，制备连接体系。
表1连接体系成分表
| 成分 | 体积 |
| 总RNA | 20μl |
| 10×连接缓冲液* | 3.6μl |
| 10mM ATP* | 4μl |
| 连接酶混合液* | 1μl |
| 连接酶补充液* | 1μl |
| RNA酶抑制剂* | 1μl |
| 连接增强混合液* | 8μl |
| RNA Seq 5’接头* | 2μl |
| 连接混合体系 | 40.6μl |
*标注试剂由Gnomegen公司提供
体系放置在37℃中孵育30min后，取出放置于冰上。
3.3磁珠纯化，提取连接产物，磁珠由Gnomegen公司提供，清洗的过程按照该公司推荐的操作说明进行。
3.4反转录
变性体系：
表2变性体系成分表
| 成分 | 体积 |
| 步骤3.3产物 | 10μl |
| PB-3N-1492R | 1μl |
| 10mM dNTP* | 1μl |
| 变性体系 | 12μl |
*标注试剂由Gnomegen公司提供
将体系在65℃下孵育5min后，立即放置在冰上。
反转录体系：
表3反转录体系成分表
| 成分 | 体积 |
| 变性体系 | 12μl |
| 5×反转录缓冲液* | 4μl |
| 100mM DTT* | 2μl |
| RNA酶抑制剂** | 1μl |
| 反转录酶* | 1μl |
| 反转录混合体系 | 19μl |
*标注试剂由Gnomegen公司提供
**标注试剂由TaKaRa公司提供
在25℃下孵育10min，40℃下孵育40min，70℃条件下15min终止反应，4℃恒温。
3.5全长核糖体SSU cDNA的筛选
a.将反应体系顺离，补充6μl的超纯水到反应体系中，转出25μl的反转录产物到干净的1.5mL EP管中，加入45μl的磁珠，用移液器吸打混匀5次，室温静置5min，随后放于磁力架上静置3min，待体系澄清，转移上清到干净的1.5mL EP管中。加20μl的磁珠到上清中，室温静置5min，随后放于磁力架上静置3min，待体系澄清，弃上清。在每次使用磁珠时，都需要颠倒混匀3次。
b.保持1.5mL EP管在磁力架的条件下使用200μl 70％的无水乙醇清洗磁珠，借助移液器吹洗3次，不要吹起磁珠。吸去70％无水乙醇，并在室温下干燥5min。不要过度干燥。
c.使用20μl的超纯水洗脱磁珠，用移液器吸打10次，室温静置2min，置于磁力架上3min，待体系澄清，吸取上清并转移到PCR管中，即筛选出核糖体SSU cDNA。
3.6全长核糖体SSU cDNA的扩增
扩增体系
表4扩增体系成分表
| 成分 | 体积 |
| cDNA | 20μl |
| BcN1-FPS | 1.25μl |
| BcN2-RPS | 1.25μl |
| 高保真热启动酶* | 25μl |
| 超纯水 | 2.5μl |
| 扩增反应混合体系 | 50μl |
*标注试剂由Roche公司提供
扩增程序
表5PCR扩增程序
3.7筛选目标长度条带
a.将50μl的扩增体系转移到1.5mL EP管中，加入45μl的磁珠，用移液器吸打混匀5次，室温静置5min，随后放于磁力架上静置3min，待体系澄清，转移上清到干净的1.5mL EP管中，不要吸到磁珠。加20μl的磁珠到上清中，室温静置5min，随后放于磁力架上静置3min，待体系澄清，弃上清。在每次使用磁珠时，都需要颠倒混匀3次。
b.保持1.5mL EP管在磁力架的条件下使用200μl 70％的无水乙醇清洗磁珠，借助移液器吹洗三次，不要吹起磁珠。吸去70％无水乙醇，并在室温下干燥5min。不要过度干燥。
c.使用20μl的超纯水洗脱磁珠，用移液器吸打10次，室温静置2min，置于磁力架上3min，待体系澄清，吸取上清并转移到干净1.5mL EP管中，即为全长的SSU rRNA文库，文库电泳图如图2所示。
4.全长反转录效果验证
4.1模拟微生物群落验证全长SSU rRNA转录组分析群落结构的可行性
为了能够准确反映模拟微生物群落的组成，将液体摇培的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，黄杆菌(Chryseobacteriumcanie)，噬盐杆菌(Halobacteria halobium)，毕赤酵母(Pichia pastoris)提取总的RNA，并割胶回收SSU rRNA目标条带。按照表格中的比列混合五种微生物的SSU rRNA，并按照上述步骤构建文库，通过PacBio测序获得最终的各个微生物的SSU rRNA比列。
表6模拟微生物群落全长SSU rRNA转录组实验效果
*以E.coli作为基准来进行了比例分析。
如上表6，通过模拟微生物群落发现该方法能够获得全长的SSU rRNA的序列信息，可以看出虽然具体结果与实际混样比例有一定差距，但不存在明显的系统偏差，并大致反映实际的微生物群落分布。
4.2全长SSU rRNA转录组方法的在多种环境中的广泛适用性
将该方法应用于自来水，活性污泥，肠道，河水，皮肤等不同的生态环境样本中，均能够获得其中的主要的微生物的SSU rRNA信息，而且很多能确定到种，并发现一些在域水平未分类的SSU rRNA序列，说明此方法可发现一些以前被遗漏的微生物，如下表7。
表7基于全长SSU rRNA转录组方法分析的不同环境样品中活性微生物群落结构
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）快速提取待分析样品中的总RNA；
（2）在RNA的5’端加第一接头序列；
（3）在能够覆盖真核和原核生物的通用反向引物的5’端加第二接头序列，使得通用反向引物与第二接头序列组成反转录引物，并用于反转录小亚基核糖体RNA；
（4）在反转录产物中筛选核糖体SSU cDNA；
（5）以第一接头序列一部分为正向引物序列、第二接头序列为反向引物序列进行PCR扩增，获得双链全长核糖体SSU cDNA，对扩增产物进行测序，并提取出全长SSU rRNA序列；
（6）根据所得全长SSU rRNA序列确定准确的分类信息，获得精细的微生物群落结构；
步骤（2）中，第一接头序列中的一段作为正向引物匹配序列；
步骤（3）中，设计反转录引物时，在通用反向引物序列的5’端添加一段第二接头序列，并在通用反向引物序列与第二接头序列的中间添加三个碱基，所用通用反向引物为1492R引物；
步骤（5）中，第一接头序列一部分作为正向引物，第二接头序列为反向引物来进行PCR扩增；
一起分析多个样品时，在正向引物和反向引物的5’端加条码序列来区分样品。
2.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，步骤（4）中，采用磁珠根据长度筛选全长核糖体SSU cDNA。
3.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，步骤（5）中，扩增产物的测序方式为：采用PacBio第三代高通量测序。
4.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，步骤（5）中，从测序结果中提取出全长SSU rRNA序列具体为：结合所测序列与SSU rRNA基因序列数据库和公共核苷酸序列数据库的相似度比对结果来确定所测序列是否属于SSU rRNA序列。
5.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，步骤（6）中，根据全长SSU rRNA序列确定分类信息具体为：以SSUrRNA序列与参考数据库进行比对来确定分类信息。
6.根据权利要求1所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，适用分析的微生物群落为活性细菌、古生菌和/或真核生物。
7.根据权利要求6所述的一种基于全长小亚基核糖体RNA的反转录来分析微生物群落结构的方法，其特征在于，此方法通过包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黄杆菌在内的细菌，嗜盐杆菌在内的古生菌以及毕赤酵母在内的真核微生物来模拟微生物群落，确认其可信度。
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| Modified RNA-seq method for microbial community and diversity analysis using rRNA in different types of environmental samples;Yong-Wei Yan等;《PLoS ONE》;20171010;第12卷(第10期);第3页第5-6段至第5页第2段 * |
| Retrieval of a million high-quality, full-length microbial 16S and 18S rRNA gene sequences without primer bias;Søren M Karst等;《nature biotechnology》;20180101;第36卷(第2期);第190-202页 * |
| 同时提取土壤微生物DNA和RNA方法的研究;洪桂云等;《环境科学与技术》;20110610(第06期);第3页第5-6段至第5页第2段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111996245A (zh) | 2020-11-27 |
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