CN115896319A - 检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒及检测方法和应用 Download PDF

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CN115896319A CN202211725182.XA CN202211725182A CN115896319A CN 115896319 A CN115896319 A CN 115896319A CN 202211725182 A CN202211725182 A CN 202211725182A CN 115896319 A CN115896319 A CN 115896319A
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黄新祥
翁亚丽
周冰钏
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Abstract

本发明提供了一种检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒及检测方法和应用，所述的引物包括扩增引物对组和测序引物对组，本发明首先使用扩增引物对组采用巢式PCR方式对待测样本的DNA进行扩增；然后使用测序引物对组进行测序反应，将测序结果与标准序列进行比对，判断是否发生耐药突变；本发明的方法克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；操作快速，简便，价格低廉。本发明的引物专一性强、灵敏度高，本发明能在1次实验中检测4大类抗生素的二十余个耐药突变位点，包含的位点全面。

Description

检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒及检测方法和应用
技术领域
本发明涉及检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒及检测方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染在世界范围广泛存在，与各种消化系统疾病如慢性炎症、消化性溃疡甚至胃癌的发病机制有关。根除这种微生物的治疗包括联合使用抗菌药物，如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星，以及质子泵抑制剂。虽然目前的治疗是有效的，但观察到治疗失败率很高，主要是因为获得了点突变，这是幽门螺杆菌产生耐药的主要机制之一。这种现象与频繁和/或不当使用抗生素有关，对于已有耐药迹象的患者在治疗前，应在进一步治疗之前进行抗微生物敏感性测试。虽然表型药敏试验是药物敏感性检测的金标准，但幽门螺杆菌是一种苛养菌，很难通过表型方法进行检测。主要的药物包括四环素类耐药(例如四环素、多西环素)、大环内酯类耐药(例如克拉霉素、阿奇霉素)、喹诺酮类耐药(例如左氧氟沙星、司帕沙星)、β-内酰胺类耐药(例如头孢、阿莫西林)。
幽门螺杆菌的主要耐药机制是获得点突变，克拉霉素(大环内酯类)的耐药突变主要发生在23S rRNA区域，而阿莫西林(β-内酰胺类)耐药性的获得与青霉素结合蛋白(PBPs)的突变有关，甲硝唑和左氧氟沙星分别与rdxA和gyrA基因的突变有关。
目前常用的检测方法有琼脂稀释法、肉汤稀释法、纸片扩散法(K-B法)、E试验(E-Test)，琼脂稀释法，定量检测可微量确定被检菌株对某抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)，结果准确、可靠，被誉为Hp体外药敏试验的金标准；但是成本过高，步骤繁琐，实际很少用于临床检测，目前主要用于Hp的耐药性研究工作。肉汤稀释法，操作简单、快速，价格便宜；但是存在Hp在肉汤培养基中难以生长、如果在肉汤中有杂菌污染，很难发现、敏感性低等缺点。纸片扩散法(K-B法)，操作简单，成本低，不需要任何的特殊工具及材料，药敏结果解释直观(敏感或耐药)；但是该方法没有权威定量标准，仅是一种定性试验；纸片扩散法适合于快速生长的细菌，但Hp生长慢，敏感性低；不同实验室之间的结果无法直接比较。E试验(E-Test)，操作简单，结果准确，重复性好；但是抗生素试剂条价格昂贵，有些药物的试条至今还未上市，从而限制了应用。现有的其他检测方法，如PCR-荧光探针法，由于受到荧光报告基团及仪器检测通道的限制，检测的耐药突变往往不够全面，对于每种抗生素仅能检测1～2个较高频的耐药突变，且大多仅检测克拉霉素耐药，使得临床应用受限。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中存在的一些技术问题，包括克服现有的检测方法成本较高、步骤繁琐，且活菌不易取得、运输、保存；检测的耐药突变往往不够全面，对于每种抗生素仅能检测1～2个较高频的耐药突变的技术问题。
因此，本发明提供一种检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒及检测方法和应用。
为达到上述技术目的，本发明首先提供检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物，所述引物包括扩增引物对组和相对应的测序引物对组，所述扩增引物对组包括第一扩增引物对组、第二扩增引物对组、第三扩增引物对组、或/和第四扩增引物对组；所述测序引物对组包括第一测序引物对组、第二测序引物对组、第三测序引物对组、或/和第四测序引物对组。
其中，所述第一扩增引物对组包括SEQ ID NO.1-4所示的引物；
所述第二扩增引物对组包括SEQ ID NO.5-8所示的引物；
所述第三扩增引物对组包括SEQ ID NO.9-12所示的引物；
所述第四扩增引物对组包括SEQ ID NO.13-16所示的引物；
所述第一测序引物对组包括SEQ ID NO.17-18所示的引物；
所述第二测序引物对组包括SEQ ID NO.19-20所示的引物；
所述第三测序引物对组包括SEQ ID NO.21-22所示的引物；
所述第四测序引物对组包括SEQ ID NO.23-24所示的引物。
所述第一扩增引物对组和第一测序引物对组用于检测四环素类(例如四环素、多西环素)耐药性；所述第二扩增引物对组和第二测序引物对组用于检测大环内酯类(例如克拉霉素、阿奇霉素)耐药性；第三扩增引物对组和第三测序引物对组用于检测喹诺酮类(例如左氧氟沙星、司帕沙星)耐药性；第四扩增引物对组和第四测序引物对组用于检测β-内酰胺类(例如头孢、阿莫西林)耐药性。
各引物对组序列如下：
第一扩增引物对组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.1)：5’-GCGAAGGCGACCTGCTGGAACATTACTG
下游外侧引物(SEQ ID NO.2)：5’-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCT
上游内侧引物(SEQ ID NO.3)：5’-ACGATGGATGCTAGTTGTTGGA
下游内侧引物(SEQ ID NO.4)：5’-ACGACACGAGCTGACGACA
第二扩增引物对组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.5)：5’-TACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGAT
下游外侧引物(SEQ ID NO.6)：5’-CGATTTCCAACCGCAATGAGCCAACCTTTG
上游内侧引物(SEQ ID NO.7)：5’-GCTGTCTCAACCAGAGATT
下游内侧引物(SEQ ID NO.8)：5’-CCACCAAGCATTGTCCTG
第三扩增引物对组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.9)：5’-TTTACCGGACGCTAGAGATGGCTTAAAGC
下游外侧引物(SEQ ID NO.10)：5’-TTCACTCGCCTTGGTCATTCTGGCTTCAGT
上游内侧引物(SEQ ID NO.11)：5’-GCGATGCATGAATTAGGC
下游内侧引物(SEQ ID NO.12)：5’-GCGTTATCGCCATCAATAG
第四扩增引物对组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.13)：5’-ACGCCAGCATGATAGTTACAGACACRAGCA
下游外侧引物(SEQ ID NO.14)：5’-ATCCACGATTTCTTTACGCAAGCCYTTRGG
上游内侧引物(SEQ ID NO.15)：5’-AAACGGCARTTTGGGAG
下游内侧引物(SEQ ID NO.16)：5’-CGCATGAAATACGAATACAC
第一测序引物对组：
A-F(SEQ ID NO.17)：5’-ACGATGGATGCTAGTTGTTGGA
A-R(SEQ ID NO.18)：5’-ACGACACGAGCTGACGACA
第二测序引物对组：
B-F(SEQ ID NO.19)：5’-GCTGTCTCAACCAGAGATT
B-R(SEQ ID NO.20)：5’-CCACCAAGCATTGTCCTG
第三测序引物对组：
C-F(SEQ ID NO.21)：5’-GCGATGCATGAATTAGGC
C-R(SEQ ID NO.22)：5’-GCGTTATCGCCATCAATAG
第四测序引物对组：
D-F(SEQ ID NO.23)：5’-AAACGGCARTTTGGGAG
D-R(SEQ ID NO.24)：5’-CGCATGAAATACGAATACAC
其中，序列中的R代表A或G，Y代表C或T。
本发明还提供所述引物的用途，其用于制备检测幽门螺旋杆菌的产品或用于检测幽门螺旋杆菌。
本发明还提供检测幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，试剂盒Ⅰ包含所述的扩增引物对组，还包括Taq酶、dNTPs(0.2mM)、Buffer；试剂盒Ⅱ包括所述测序引物对组，还包括Exonuclease I(核酸外切酶I)、AP(碱性磷酸酶)、BigDyeTMTerminator v3.1 Ready Reaction Mix、5×Sequencing Buffer、Hi-DiTMFormamide(高度去离子甲酰胺)。
所述的扩增引物对组中外侧引物浓度均为0.5μM，内侧引物浓度均为0.04μM；所述测序引物浓度为3.2μM。
本发明还提供一种检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取待测样本，提取DNA。
其中，待测样本取样位置非常重要，优选胃窦和病灶周边部位胃镜活检样本各取1块，每块米粒大小。
所述DNA稀释至10ng/μL。
(2)使用巢式PCR方式对待测样本的DNA进行扩增：分别使用第一扩增引物对组、第二扩增引物对组、第三扩增引物对组、或/和第四扩增引物对组进行巢式PCR扩增。
(3)对PCR产物纯化后测序反应：分别使用第一测序引物对组、第二测序引物对组、第三测序引物对组、或/和第四测序引物对组进行测序反应。
(4)结果判定：
测序反应产物纯化后，将测序结果与幽门螺旋杆菌标准序列进行比对，判断是否发生耐药突变。
所述耐药突变表现为：
若检测目标发生如下突变，则为发生耐药：
若检测目标中16S rRNA区域的A926T、A926G、AGA926-928GTA、A928AT、A928C单个或2个碱基置换与低水平耐药有关，AGA926-928TTC与高水平耐药有关。
若检测目标中23S rRNA区域的A2143G、A2142G、A2142C、T2182C任一位点或任意几个位点突变，则判断为样本中幽门螺杆菌对大环内脂类耐药。
若检测目标中检测结果为gyrA基因中Asn87Lys、Asn87Tyr、Ala88Val、Asp91Gly、Asp91Asn、Asp91Tyr任一位点或任意几个位点突变，则判断为样本中幽门螺杆菌对喹诺酮类耐药。
若检测目标中检测结果为PBP1基因中Ser414Arg、Thr556Ser、Asn562Tyr、Thr593Ala，发生其中任一位点或任意几个位点突变，即可判断为耐药；其余突变Ala369Thr、Val374Leu、Ser402Gly、Glu406Ala、Ser417Thr、Leu423Phe、Thr438Met、Ser543Arg、Thr555Ser、Asn561Tyr、Ile563Val、插入突变464+Glu突变对耐药具有强化作用或可能引起较低水平的耐药。
本发明还提供所述引物、试剂盒或所述方法的用途，其用于检测幽门螺旋杆菌耐药性。
本发明的有益效果：
本发明采用了巢式PCR(nested PCR)，将两套PCR引物进行两轮PCR扩增，利用第一对引物(称为外引物)对靶DNA进行15-20个循环的标准扩增；第一轮扩增结束后再利用第二对引物(称为内引物或巢式引物，结合在第一轮PCR产物的内部)进行25-30个循环的扩增，第二轮PCR的扩增片段短于第一轮。与常规PCR技术相比，本发明中的两套引物的使用提高了扩增的特异性，因为和两套引物都互补的靶序列很少。如果第一次扩增产生了错误片段，内引物与错误片段配对扩增的概率极低，因此提高了PCR扩增反应的特异性与灵敏度。巢式PCR克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性；由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；内侧引物扩增的模板是外侧扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因此可以保证整个反应的准确性及可行性。
本发明采用巢式PCR克服了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性；由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；内测引物扩增的模板是外侧扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因此可以保证整个反应的准确性及可行性。
另外，本发明的检测方法胃镜活检时从病灶和胃窦各取米粒大小的组织1块，置于10％中性福尔马林保存管中，常温保存运输即可，因此样本易于取得、保存、运输。实验操作快速，可在1天半内完成，相对简便，价格低廉。本发明的引物专一性强、灵敏度高，可以检测菌含量相对较低的样品且不受样品中包含的大量人类基因组干扰。本发明能在1次实验中检测4大类抗生素的二十余个耐药突变位点，包含的位点较为全面。
附图说明
图1为本发明巢式PCR流程图。
图2为实施例2中的对引物验证的电泳检测结果，其中M为Marker；泳道从左至右分别为：16S rRNA区域扩增产物、23S rRNA区域扩增产物、gyrA基因扩增产物、PBP1基因扩增产物。
图3为实施例2中测序分析四环素类耐药位点。
图4为实施例2中测序分析大环内酯类耐药位点。
图5位实施例2中测序分析喹诺酮类耐药位点。
图6为实施例2中测序分析阿莫西林类耐药位点。
图7为实施例2中耐药性检测测序反应结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规分子生物学实验方法完成，实施例中所涉及PCR、酶切、连接、密码子优化等过程都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
所涉及部分材料来源及型号如下，其他如无特殊说明，均为常规市售。
高保真DNA聚合酶扩增试剂盒：诺唯赞P505
Exonuclease I(核酸外切酶I)：生工生物C610019
AP(不耐热型碱性磷酸酶)：生工生物B600651
BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒：ABI 4458689
Hi-DiTMFormamide(高度去离子甲酰胺)：ABI 4311320
实施例1：检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒
本发明为克服现有技术中存在的一些技术问题，提供了检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物、试剂盒。
根据幽门螺旋杆菌耐药位点，根据幽门螺旋杆菌16S rRNA区域(四环素类耐药位点，如四环素、多西环素)、23S rRNA区域(大环内酯类耐药位点，如克拉霉素、阿奇霉素)、gyrA基因(喹诺酮类耐药位点，如左氧氟沙星、司帕沙星)、PBP1基因(β-内酰胺类耐药位点，如头孢、阿莫西林)，设计特异性位点扩增引物和测序引物，所述引物包括扩增引物对组和相对应的测序引物对组，所述扩增引物对组包括第一扩增引物对组、第二扩增引物对组、第三扩增引物对组、或/和第四扩增引物对组；所述测序引物对组包括第一测序引物对组、第二测序引物对组、第三测序引物对组、或/和第四测序引物对组。
其中，所述第一扩增引物对组包括SEQ ID NO.1-4所示的引物；
所述第二扩增引物对组包括SEQ ID NO.5-8所示的引物；
所述第三扩增引物对组包括SEQ ID NO.9-12所示的引物；
所述第四扩增引物对组包括SEQ ID NO.13-16所示的引物；
所述第一测序引物对组包括SEQ ID NO.17-18所示的引物；
所述第二测序引物对组包括SEQ ID NO.19-20所示的引物；
所述第三测序引物对组包括SEQ ID NO.21-22所示的引物；
所述第四测序引物对组包括SEQ ID NO.23-24所示的引物。
所述第一扩增引物对组和第一测序引物对组用于检测四环素类(例如四环素、多西环素)耐药性；所述第二扩增引物对组和第二测序引物对组用于检测大环内酯类(例如克拉霉素、阿奇霉素)耐药性；第三扩增引物对组和第三测序引物对组用于检测喹诺酮类(例如左氧氟沙星、司帕沙星)耐药性；第四扩增引物对组和第四测序引物对组用于检测β-内酰胺类(例如头孢、阿莫西林)耐药性。
各引物组序列如下：
第一扩增引物组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.1)：5’-GCGAAGGCGACCTGCTGGAACATTACTG
下游外侧引物(SEQ ID NO.2)：5’-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCT
上游内侧引物(SEQ ID NO.3)：5’-ACGATGGATGCTAGTTGTTGGA
下游内侧引物(SEQ ID NO.4)：5’-ACGACACGAGCTGACGACA
第二扩增引物组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.5)：5’-TACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGAT
下游外侧引物(SEQ ID NO.6)：5’-CGATTTCCAACCGCAATGAGCCAACCTTTG
上游内侧引物(SEQ ID NO.7)：5’-GCTGTCTCAACCAGAGATT
下游内侧引物(SEQ ID NO.8)：5’-CCACCAAGCATTGTCCTG
第三扩增引物组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.9)：5’-TTTACCGGACGCTAGAGATGGCTTAAAGC
下游外侧引物(SEQ ID NO.10)：5’-TTCACTCGCCTTGGTCATTCTGGCTTCAGT
上游内侧引物(SEQ ID NO.11)：5’-GCGATGCATGAATTAGGC
下游内侧引物(SEQ ID NO.12)：5’-GCGTTATCGCCATCAATAG
第四扩增引物组：
上游外侧引物(SEQ ID NO.13)：5’-ACGCCAGCATGATAGTTACAGACACRAGCA
下游外侧引物(SEQ ID NO.14)：5’-ATCCACGATTTCTTTACGCAAGCCYTTRGG
上游内侧引物(SEQ ID NO.15)：5’-AAACGGCARTTTGGGAG
下游内侧引物(SEQ ID NO.16)：5’-CGCATGAAATACGAATACAC
第一测序引物组：
A-F(SEQ ID NO.17)：5’-ACGATGGATGCTAGTTGTTGGA
A-R(SEQ ID NO.18)：5’-ACGACACGAGCTGACGACA
第二测序引物组：
B-F(SEQ ID NO.19)：5’-GCTGTCTCAACCAGAGATT
B-R(SEQ ID NO.20)：5’-CCACCAAGCATTGTCCTG
第三测序引物组：
C-F(SEQ ID NO.21)：5’-GCGATGCATGAATTAGGC
C-R(SEQ ID NO.22)：5’-GCGTTATCGCCATCAATAG
第四测序引物组：
D-F(SEQ ID NO.23)：5’-AAACGGCARTTTGGGAG
D-R(SEQ ID NO.24)：5’-CGCATGAAATACGAATACAC
其中，序列中的R代表A或G，Y代表C或T。
本发明还提供了检测幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒，所述的试剂盒包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，试剂盒Ⅰ包含针对4大类抗生素的耐药热点区域设计4管PCR扩增体系，每个体系包含1对外引物和1对巢式引物；试剂盒Ⅱ提供测序引物、测序反应及纯化试剂。所涉及到的核酸提取试剂，可使用任意可靠的商业化核酸提取试剂盒。
进一步的，试剂盒Ⅰ包含所述的扩增引物对组，还包括Taq酶、dNTPs(0.2mM)、Buffer；试剂盒Ⅱ包括所述测序引物对组，还包括Exonuclease I(核酸外切酶I)、AP(碱性磷酸酶)、BigDyeTMTerminator v3.1 Ready Reaction Mix、5×Sequencing Buffer、Hi-DiTMFormamide(高度去离子甲酰胺)。
实施例2：幽门螺旋杆菌耐药性的检测方法
(1)配制扩增反应液：
分别配制针对4大类抗生素的检测反应液：
A管：dNTPs(0.2mM)、Buffer、第一扩增引物对组；用于检测四环素类耐药(例如四环素、多西环素)。
B管：dNTPs(0.2mM)、Buffer、第二扩增引物对组；用于检测大环内酯类耐药(例如克拉霉素、阿奇霉素)。
C管：dNTPs(0.2mM)、Buffer、第三扩增引物对组；用于检测喹诺酮类耐药(例如左氧氟沙星、司帕沙星)。
D管：dNTPs(0.2mM)、Buffer、第四扩增引物对组；用于检测β-内酰胺类耐药(例如头孢、阿莫西林)。
其中的扩增引物对组中外侧引物浓度均为0.5μM，内侧引物浓度均为0.04μM。
(2)待测样品准备：
胃窦和病灶周边部位胃镜活检样本各取1块，每块米粒大小，约0.5-1.0cm3，注意取样位置非常重要；使用商业化试剂盒提取DNA，本实施例中使用的核酸提取试剂为康为世纪CWY039S固定组织提取试剂盒。
(3)使用巢式PCR方式对待测样本的DNA进行扩增：分别使用第一扩增引物对组、第二扩增引物对组、第三扩增引物对组、第四扩增引物对组进行巢式PCR扩增。
首先取4支PCR管，做好标记，分别加入20μL反应液A、B、C、D(反应液含有dNTPs(0.2mM)、Buffer和扩增引物对组，扩增引物对组中外侧引物浓度均为0.5μM，内侧引物浓度均为0.04μM)。
将模板DNA稀释为10ng/μL，20μL模板DNA与2μL Taq酶预混，得到预混液；各PCR管分别加入5μL模板DNA与Taq酶的预混液。
然后按照如下PCR程序进行扩增：
表1.PCR反应程序
Figure BDA0004029467280000091
将扩增得到的产物取2μL，通过琼脂糖凝胶电泳验证引物的专一性或有效性。
检验标准：条带与Marker对比(本实施例中使用的是100bp ladder，康为世纪CW0636S)，得到的条带单一、清晰且大小符合预期，条带大小符合预期，如图2：产物A:291bp(16S rRNA区域)；产物B:250bp(23S rRNA区域)；产物C:201bp(gyrA基因)；产物D:728bp(PBP1基因)，说明本发明的引物和扩增体系高效且特异，不会因样本中存在大量宿主DNA而产生非特异扩增。
(4)对PCR产物纯化后测序反应：分别使用第一测序引物对组、第二测序引物对组、第三测序引物对组、第四测序引物对组进行测序反应。
PCR产物纯化：取5μL上一步PCR扩增的产物，加入1μL AP(碱性磷酸酶)和0.5μLExonuclease I(核酸外切酶I)，放在PCR仪上，37℃15min孵育，80℃15min热灭活。反应后若不立刻进行后续步骤，可在2～8℃冰箱保存一周左右。
将纯化后的PCR产物进行测序反应：
首先，按照如下组分配制测序反应Mix：
表2.测序反应Mix组分及用量
组分名称 体积
<![CDATA[BigDye<sup>TM</sup>Terminator v3.1Ready Reaction Mix]]> 2μL
5×Sequencing Buffer 1μL
RNase/DNase free water 3μL
测序引物(3.2μM) 1μL
PCR纯化产物 3μL
总体积 10μL
然后按照如下程序进行测序反应：
表3.测序反应程序
Figure BDA0004029467280000101
测序反应产物纯化：取测序反应的产物10μL，加入2.5μL 125mM EDTA溶液，充分混匀；再加入30μL无水乙醇。室温放置15分钟，再1,870×g(4℃)离心45分钟。倒置反应板，185×g离心1分钟。每孔加入30μL 70％乙醇，1,870×g(4℃)离心15分钟。倒置反应板，185×g离心1分钟。室温避光静置5-10分钟，充分挥发板内乙醇。每孔加入10μL高度去离子甲酰胺重悬样品，放在PCR仪上，95℃2分钟。
(5)结果判定：
测序反应产物纯化后，使用ABI3500测序仪进行检测，将测序结果与幽门螺旋杆菌标准序列(参照：Helicobacter pylori-NCBI-NLM(nih.gov)，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/taxonomy/210/)进行比对，判断是否发生耐药突变。
本实施例中使用ABI3500测序仪对测序反应产物进行检测，测序结果使用Chromas软件进行读取，结果序列和NCBI数据库中的参考序列(数据库中搜索Helicobacter pylori的相应基因即可得到)比对，判断是否发生耐药突变。
根据目标片段的参考序列，若相应耐药位点发生核苷酸或氨基酸的单个或多个位点改变，则判定为耐药。部分见图3-图6，标红色位置为耐药位点，若该位置发生核苷酸或氨基酸改变，则判定为耐药；图3为四环素类耐药位点，图4为大环内酯类耐药位点，图5为喹诺酮类耐药位点，图6为阿莫西林类耐药位点。
判断标准为：
若A管中检测结果为16S rRNA区域的A926T、A926G、AGA926-928GTA、A928AT、A928C单个或2个碱基置换与低水平耐药有关，AGA926-928TTC与高水平耐药有关。
若B管中检测结果为23S rRNA区域的A2143G、A2142G、A2142C、T2182C任一位点或任意几个位点突变，则判断为样本中幽门螺杆菌对大环内脂类耐药。
若C管中检测结果为gyrA基因中Asn87Lys、Asn87Tyr、Ala88Val、Asp91Gly、Asp91Asn、Asp91Tyr任一位点或任意几个位点突变，则判断为样本中幽门螺杆菌对喹诺酮类耐药。
若D管中检测结果为PBP1基因中Ser414Arg、Thr556Ser、Asn562Tyr、Thr593Ala，发生其中任一位点或任意几个位点突变，即可判断为耐药；其余突变Ala369Thr、Val374Leu、Ser402Gly、Glu406Ala、Ser417Thr、Leu423Phe、Thr438Met、Ser543Arg、Thr555Ser、Asn561Tyr、Ile563Val、插入突变464+Glu突变对耐药具有强化作用或可能引起较低水平的耐药。
本发明实施例的检测结果如图7(其中β-内酰胺类由于相关位点较多，未一一体现在图中)和下表5所示：
表4.耐药位点对应表
Figure BDA0004029467280000111
表5.测序反应结果
反应组 耐药突变结果 结论
A(四环素类) 无突变 未见耐药突变
B(大环内酯类) c.2143A>G突变 耐药突变
C(喹诺酮类) p.Asn87Lys突变 耐药突变
D(β-内酰胺类) p.Thr556Ser突变 耐药突变
由测序结果可见，该实施例的样本中的幽门螺杆菌对于大环内酯类、喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素耐药，四环素类则未检测到耐药突变。
从上表可以看出，采用本发明的引物、试剂盒或方法对幽门螺旋杆菌耐药基因进行检测和判定，可以有针对性的鉴定出耐药基因位点突变的具体情况，有助与解读出该型菌株的耐药性，对指导幽门螺旋杆菌感染患者个性化治疗有非常重大的意义。

Claims (10)

1.检测幽门螺旋杆菌耐药性的引物，所述引物包括扩增引物对组和相对应的测序引物对组，所述扩增引物对组包括第一扩增引物对组、第二扩增引物对组、第三扩增引物对组、或/和第四扩增引物对组；所述测序引物对组包括第一测序引物对组、第二测序引物对组、第三测序引物对组、或/和第四测序引物对组；
其中，所述第一扩增引物对组包括SEQ ID NO.1-4所示的引物；
所述第二扩增引物对组包括SEQ ID NO.5-8所示的引物；
所述第三扩增引物对组包括SEQ ID NO.9-12所示的引物；
所述第四扩增引物对组包括SEQ ID NO.13-16所示的引物；
所述第一测序引物对组包括SEQ ID NO.17-18所示的引物；
所述第二测序引物对组包括SEQ ID NO.19-20所示的引物；
所述第三测序引物对组包括SEQ ID NO.21-22所示的引物；
所述第四测序引物对组包括SEQ ID NO.23-24所示的引物。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述第一扩增引物对组和第一测序引物对组用于检测四环素类耐药性；所述第二扩增引物对组和第二测序引物对组用于检测大环内酯类耐药性；第三扩增引物对组和第三测序引物对组用于检测喹诺酮类耐药性；第四扩增引物对组和第四测序引物对组用于检测β-内酰胺类耐药性。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述四环素类包括但不限于四环素、多西环素；所述大环内酯类包括但不限于克拉霉素、阿奇霉素；喹诺酮类包括但不限于左氧氟沙星、司帕沙星；β-内酰胺类包括但不限于头孢、阿莫西林。
4.权利要求1-3任一项所述引物的用途，其用于制备检测幽门螺旋杆菌的产品或用于检测幽门螺旋杆菌。
5.检测幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，试剂盒Ⅰ包括权利要求1所述的扩增引物对组，所述试剂盒Ⅱ包括测序引物对组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒Ⅰ还包括Taq酶、dNTPs(0.2mM)、Buffer；所述试剂盒Ⅱ还包括Exonuclease I(核酸外切酶I)、AP(碱性磷酸酶)、BigDyeTMTerminator v3.1 Ready Reaction Mix、5×Sequencing Buffer、Hi-DiTMFormamide(高度去离子甲酰胺)。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增引物对组中外侧引物浓度均为0.5μM，内侧引物浓度均为0.04μM；所述测序引物浓度为3.2μM。
8.一种检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取待测样本，提取DNA；
(2)使用巢式PCR方式对待测样本的DNA进行扩增：使用权利要求1所述的第一扩增引物对组、第二扩增引物对组、第三扩增引物对组、或/和第四扩增引物对组进行巢式PCR扩增；
(3)对PCR产物纯化后测序反应：分别使用权利要求1所述的第一测序引物对组、第二测序引物对组、第三测序引物对组、或/和第四测序引物对组进行测序反应；
(4)结果判定：
将测序结果与幽门螺旋杆菌标准序列进行比对，判断是否发生耐药突变。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结果判定方法为：
若检测目标中16S rRNA区域的A926T、A926G、AGA926-928GTA、A928AT、A928C单个或2个碱基置换，则与低水平耐药有关，AGA926-928TTC与高水平耐药有关；
若检测目标中23S rRNA区域的A2143G、A2142G、A2142C、T2182C任一位点或任意几个位点突变，则判断为样本中幽门螺杆菌对大环内脂类耐药；
若检测目标中检测结果为gyrA基因中Asn87Lys、Asn87Tyr、Ala88Val、Asp91Gly、Asp91Asn、Asp91Tyr任一位点或任意几个位点突变，则判断为样本中幽门螺杆菌对喹诺酮类耐药；
若检测目标中检测结果为PBP1基因中Ser414Arg、Thr556Ser、Asn562Tyr、Thr593Ala，发生其中任一位点或任意几个位点突变，即可判断为耐药；其余突变Ala369Thr、Val374Leu、Ser402Gly、Glu406Ala、Ser417Thr、Leu423Phe、Thr438Met、Ser543Arg、Thr555Ser、Asn561Tyr、Ile563Val、插入突变464+Glu突变对耐药具有强化作用或可能引起较低水平的耐药。
10.权利要求5-7任一项所述的试剂盒或权利要求8-9任一项所述方法的用途，其用于检测幽门螺旋杆菌耐药性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117286265A (zh) * 2023-09-26 2023-12-26 江苏默乐生物科技股份有限公司 一种检测幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的引物探针组合物、试剂盒以及方法

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