CN105950765B

CN105950765B - 一种用于支原体检测试剂盒质控质粒的构建及应用

Info

Publication number: CN105950765B
Application number: CN201610506674.8A
Authority: CN
Inventors: 董永聘
Original assignee: Shanghai Chem Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Chem Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: CN105950765A

Abstract

本发明提供了一种用于支原体检测试剂盒质控质粒的构建及应用。本发明提供的所述质粒包括第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列；所述第一多核苷酸序列为衍生自真核生物18S核糖体RNA基因的多核苷酸片段，所述第二多核苷酸序列为衍生自支原体16S核糖体RNA基因的多核苷酸片段。检测表明，本发明的质粒稳定性好、灵敏度高可以用作支原体检测的质控质粒，可以将该质粒和特定的引物序列配合作为检测支原体的试剂盒。

Description

一种用于支原体检测试剂盒质控质粒的构建及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于支原体检测试剂盒质控质粒的构建及应用。

背景技术

细胞培养是生命学研究过程中常用的实验手段。尽管细胞培养都在洁净的细胞房中进行，但是细胞培养是一个动态的连续过程，在细胞换液及冻存复苏过程中都与外界环境直接接触。支原体无处不在，如果培养细胞受到支原体污染，细胞形态较无明显变化，极易被忽视，往往直到污染非常严重时才能发现。受污染的细胞膜上可能有几百个支原体，这些支原体竞争营养并释放有毒的代谢产物，严重影响实验结果。统计表明，至少二十多种支原体能污染细胞，其中最常见的有：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)、唾液支原体(M.salivarium)、肺支原体(M.pulmonis)和梨支原体(M.pirum)等。培养细胞的支原体污染率在4％-92％不等，其污染来源包括工作环境、操作者本身(一些支原体是人体的正常菌群)、培养基、血清、细胞交叉污染、实验器材和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

鉴于细胞培养的实验周期长，在试验前期及中期对培养细胞进行支原体污染检测相当必要。支原体检测的方法有很多种，如直接培养、DNA荧光染色、ELISA和PCR法等。其中，PCR法具有操作简单、成本低廉、检测灵敏度高等优点。但PCR法也会由于反应试剂失效、操作失误等原因导致的假阴性结果出现，被污染的细胞未被发现。因此，检测过程中的质控及阳性对照显的十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于支原体检测试剂盒质控质粒的构建及应用。

本发明的第一方面，提供了一种用于支原体检测的质控质粒，所述质粒包括第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列；

所述第一多核苷酸序列为衍生自真核生物18S核糖体RNA基因的多核苷酸片段，所述第二多核苷酸序列为衍生自支原体16S核糖体RNA基因的多核苷酸片段。

在另一优选例中，所述质粒还包括第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列连接所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述第一多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一优选例中，所述第二多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在另一优选例中，所述第三多核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在另一优选例中，所述质控质粒以pUC-T载体为骨架。

本发明的第二方面，提供了一种制备用于支原体检测的质控质粒的方法，包括步骤：

(1)提供第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列为衍生自真核生物18S核糖体RNA基因的多核苷酸片段；提供第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列为衍生自支原体16S核糖体RNA基因的多核苷酸片段；

(2)使用第三多核苷酸序列连接步骤(1)中的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列，获得连接产物；

(3)将步骤(2)获得的连接产物构建至质粒载体中，从而获得用于支原体检测的质控质粒。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，包括步骤：

(a)使用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对PCR扩增获得第一多核苷酸序列；

(b)使用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对PCR扩增获得第二多核苷酸序列；

(c)混合步骤(a)、(b)中获得的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列作为模板，使用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示的引物对PCR扩增获得连接产物。

在另一优选例中，所述步骤(c)中，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的混合比例(质量比或摩尔比)为约1：0.5～1.5；优选为1：1。

本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的用于支原体检测的质控质粒。

优选地，所述试剂盒还包括引物对，其中所述引物对选自下组：

(1)SEQ ID NO.4所示的正向引物和SEQ ID NO.8所示的反向引物；和

(2)SEQ ID NO.9所示的正向引物和SEQ ID NO.7所示的反向引物。

本发明中构建的用于支原体检测的质控质粒能够稳定表达，且具有极高的转化效率。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了18S核糖体RNA的多核苷酸片段和支原体16S核糖体RNA基因片段的电泳结果。

图2显示了连接产物的电泳结果。

图3显示了阳性克隆平板。

图4显示了质粒验证的电泳图。

具体实施方式

本发明明人经过深入的研究和大量的筛选，发现了一种稳定性好、灵敏度高的用于支原体检测的质控质粒，可以将该质粒和特定的引物序列配合作为检测支原体的试剂盒。

在一个优选地实施方式中，本发明提供了一种用于支原体检测的质控质粒，所述质粒包括第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列；第一多核苷酸序列为衍生自真核生物18S核糖体RNA基因的多核苷酸片段，所述第二多核苷酸序列为衍生自支原体16S核糖体RNA基因的多核苷酸片段。

在一个优选地实施方式中，所述质粒还包括第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列连接所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列。

在一个优选地实施方式中，所述第一多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

CTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCCCGACCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAATACAGGACTCTTTCGAGGCCCTGTAATTGGAATGAGTCCACTTTAAATCCTTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTTGGGAGCG(SEQ ID NO.1)。

在一个优选地实施方式中，所述第二多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

GAACACCTGGTTGAGGAAATGCTTCCAGGCTGACGGTACCCTGTCAGAAAGCGATGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCTGTTTATTAAGTCTGGAGTCAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGCTCGCTTTGGATACTGGTAAACTAGAGTTAGATAGAGGTAAGCGGAATTCCATGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAAAGGCGAAGGCAGCTTACTGGGTCTATACTGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGAT(SEQ ID NO.2)。

在一个优选地实施方式中，所述第三多核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

TCTGTGTCAGCACATCGTAC(SEQ ID NO.3)。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1一种用于支原体检测试剂盒质控质粒的构建

1.针对SEQ ID NO.1所示的真核生物18S核糖体RNA的多核苷酸片段，设计扩增正反向引物，并在反向引物的5’端加入20bp的连接序列。扩增片段长度为255bp。

发明人在研究中发现，连接序列对于后续质粒检测的灵敏性影响较大，经过一系列的筛选最终使用的连接序列如SEQ ID NO.3所示。

经过筛选获得较佳地引物对序列如下，其中下划线部分为优选的连接序列：

18S RNA-F:5'CTGAGAAACGGCTACCACATC 3' (SEQ ID NO.4)

18S RNA-RL:5'GTACGATGTGCTGACACAGACGCTCCCAAGATCCAACTACG 3' (SEQ IDNO.5)

针对SEQ ID NO.2所示的支原体16S核糖体RNA基因片段，设计正反向引物，并在正向引物的5’端加入与18S RNA反向引物20bp连接序列反向互补的序列。扩增片段长度为370bp。

Myco-2FL:5'TCTGTGTCAGCACATCGTACGAACACCTGGTTGAGGAAATG 3' (SEQ ID NO.6)

Myco-2R:5'ATCGTTTACGGCGTGGACTA 3' (SEQ ID NO.7)

2.应用上述两对引物及对应的模板(模板分别为人工合成的真核生物18S核糖体RNA的多核苷酸片段和支原体16S核糖体RNA基因片段)，扩增相应的片段，实验步骤如下：

引物：1)Myco-2FL+Myco-2R

2)18S RNA-F+18S RNA-R

对1)、2)引物分别进行PCR，反应体系及反应条件如下：

反应体系

试剂	体积(μl)
		PCR Mix(2×)	10
cDNA	2
		上游引物	0.5
下游引物	0.5
		ddH<sub>2</sub>O	7

反应条件

电泳检测结果见图1。

3.将步骤2扩增所得18S RNA基因片段与16S核糖体RNA基因片段等量混合，取混合后的DNA作为PCR扩增模板，利用18S RNA-F、Myco 2R引物，进行连接PCR扩增。扩增片段大小为645bp。实验步骤如下：

引物：3)18S RNA-F+Myco-2R

反应体系及反应条件如下：

反应体系

试剂	体积(μl)
		PCR Mx(2×)	10
DNA	2
		上游引物	0.5
下游引物	0.5
		ddH<sub>2</sub>O	7

反应条件

电泳检测结果见图2。

测定步骤3中PCR产物的浓度，按照pUC-T TA快速连接试剂盒(康为世纪公司，目录号：CW2591，含pUC-T载体)说明书操作，将连接PCR扩增片段插入T载体，产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞。具体操作如下：

1)按照以下体系配制反应液

注：Vector DNA和Insert DNA的摩尔比为1:8

2)轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。

3)将连接产物加入100μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。

4)42℃热击60秒钟，迅速将离心管转移至冰浴中，冰上静置2-3分钟。

5)加入800μl无菌LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150rpm振荡培养60分钟，使菌体复苏。

6)取100μl已转化的感受态细胞，加到含有Amp的LB固体培养基上，用无菌涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，带液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。实验结果见图3。

4.挑选阳性克隆接种至3ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时，按照康为世纪无内毒素质粒小提试剂盒抽提质粒。

5.设计扩增18S RNA(人、大鼠、小鼠、家兔高度同源)的正反向引物，扩增片段长度为255bp。

18s RNA-F:5'CTGAGAAACGGCTACCACATC 3' (SEQ ID NO.4)

18s RNA-R:5'CGCTCCCAAGATCCAACTACG 3' (SEQ ID NO.8)

设计支原体16S核糖体RNA基因片段的正反向引物。扩增片段长度为370bp。

Myco 2F:5'GAACACCTGGTTGAGGAAATG 3' (SEQ ID NO.9)

Myco 2R:5'ATCGTTTACGGCGTGGACTA 3' (SEQ ID NO.7)

6.将质粒稀释至5ng/ul为模板，利用18S RNA-F、18S RNA-R正反向引物，Myco 2F、Myco 2R正反向引物扩增，具体操作如下：

反应体系

反应程序

7.PCR产物利用1％琼脂糖进行电泳。结果见图4，图4中泳道A为只使用18s正反向引物扩增的实验结果、泳道B为只使用16s正反向引物扩增的实验结果、泳道C为18s和16s正反向引物同时使用时获得的扩增结果、泳道D为使用18s正向引物和16s的反向引物获得的扩增结果，从图4中可以看出两对引物同时使用可以同时检测出18s和16s两个序列，该质粒完全可以用做两对引物同时使用的阳性质控。

实施例3试剂盒效果测试

本实例中对数十对引物进行了测试，实验结果表明有2对引物能够针对真核生物18S核糖体RNA基因的多核苷酸片段进行有效扩增，有3对引物能够针对支原体16S核糖体RNA基因的多核苷酸片段进行有效扩增。最终获得的能够成功扩增目标序列的引物详见表1。

表1实验中采用的引物序列

针对18S核糖体RNA的基因序列，引物对1的检测效果最好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测1.5copies/μL的目标序列；引物对2的灵敏度较低，能够检测到2.5×10²copies/μL的目标序列；其它测试的引物对仅能够检测到≥10³copies/μL的目标序列，而且特异性较差，有非特异性条带出现。

针对16S核糖体RNA的基因序列，引物对3的检测效果最好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测1.3copies/μL的目标序列；引物对4和引物对5的灵敏度较低，能够检测到3.5×10²copies/μL的目标序列；其它测试的引物对仅能够检测到≥10³copies/μL的目标序列，而且特异性较差，有非特异性条带出现。

使用引物对1，分别以不同浓度的阳性质控质粒作为标准品建立PCR检测的标准曲线。相关系数达到0.996，线性良好。同样地，使用引物对3建立的PCR检测标准曲线，相关系数达到0.997，线性良好。表明本发明构建的质控质粒非常适合应用于支原体的PCR检测。

对比例1

依照同实施例1中的方法，构建对照质粒，不同在于，使用的18S核糖体基因序列如下：

AACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCCCGACCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAATACAGGACTCTTTCGAGGCCCTGTAATTGGAATGAGTCCACTTTAAATCCTTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTA(SEQ ID NO.16)；

使用的16S核糖体基因序列如下：

CTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCTGTTTATTAAGTCTGGAGTCAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGCTCGCTTTGGATACTGGTAAACTAGAGTTAGATAGAGGTAAGCGGAATTCCATGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAAAGGCGAAGGCAGCTTACTGGGTCTATACTGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC(SEQ ID NO.17)。

检测结果表明，对比例中构建的质粒，在PCR检测的标准曲线中，相关系数仅为0.765，线性交差，无法满足定量检测的要求。而且，灵敏度较低，PCR扩增产物中的杂带较多。

讨论

重组质粒具有无生物活性、无传染性、容易定量、扩增方便等特点，广泛应用于PCR检测质控及荧光定量PCR定量试验中。本发明所构建的质控质粒可用于检测培养细胞的支原体污染PCR检测过程中的质控及阳性对照，也能用于支原体定量过程中的标准曲线构建。

本发明构建的质粒可以用于PCR扩增法检测细胞培养支原体污染时的质控及阳性对照。其基本原理是将人、大鼠、小鼠、家兔高度同源的18S RNA片段及支原体高度保守的16S核糖体RNA基因片段同时连入pUC-T载体，构成既有18SRNA片段又有16S核糖体RNA基因片段的质粒。用于检测培养细胞支原体16S核糖体RNA基因片段的引物及扩增人、大鼠、小鼠、家兔高度同源的18S RNA片段的质控引物将能分别扩增出两条大小不同的DNA片段。通过凝胶电泳检测DNA片段，即能显示支原体检测试剂成份及扩增过程是否成功，起到质控的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。