CN110512009A - 细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒及引物 - Google Patents

细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒及引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒及引物，该试剂盒包括：(1)多重PCR反应液：含有DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液；(2)引物混合液：将如下的扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物用双蒸水溶解后分组混合；(3)阳性对照液：含有磺胺耐药基因sul1和sul2、以及整合酶基因intI1、intI2和intI3的质粒水溶液的混合物。本发明所述试剂盒具有操作简便、结果易判、成本低廉、高效灵敏等优点，可用于各种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的全面筛查检测。

Description

细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒及引物
技术领域
本发明属于生命科学与生物技术领域，具体涉及细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒及引物。
背景技术
磺胺类药物是一类广谱抑菌剂，对许多革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌、衣原体和部分原虫都有抑制效果，而且价格低廉，因此在临床上使用非常广泛。目前，细菌对磺胺类药物的耐药性已较为普遍，其中，质粒介导的磺胺耐药基因的迁移极大地推进了磺胺耐药性在细菌间的传播。目前已发现的可在细菌间迁移的磺胺耐药基因有3个，包括sul1、sul2和sul3，除sul3较为罕见外，sul1和sul2在多种细菌中都被发现。因此，对这三个基因的检测能反映细菌对磺胺类药物的耐药情况。整合子在细菌中广泛存在，其具有捕获并表达外来耐药基因盒(一个或多个耐药基因)的能力，因此，通过检测整合酶基因(intI)来确定整合子的类型是研究整合子介导的细菌耐药的传播及机理性的基础。本团队前期研究表明，同时携带磺胺耐药基因和整合酶基因的菌株更易发生磺胺耐药基因的迁移，将磺胺耐药基因扩散出去。因此，同时筛查磺胺耐药基因和整合酶基因有助于提高对细菌的磺胺耐药性迁移风险评估研究的效率。
利用普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、多重PCR技术和基因芯片技术等，可实现耐药基因的初步排查。普通的单重PCR筛查效率低，每个反应体系只能完成一株细菌中一个耐药基因的定性分析，无法满足在大量细菌样本中进行多个基因的筛查的需求；基因芯片技术能实现耐药基因的高通量筛查，但依赖昂贵的硬件设备，试剂和耗材的成本也较高，在大多数普通实验室中无法推广应用。相较于上述两种技术，多重PCR技术是大量细菌样本中快速筛查耐药基因的理想选择。周万蓉开发了同时检测sul1、sul2和sul3基因的多重PCR试剂盒，但sul1基因的上游引物在该基因的起始密码子之前，因此无法用于检测菌株cDNA中表达的sul1基因。李心晖开发了三类整合酶基因的简并引物PCR检测法，但PCR反应后还需进行酶切鉴定以进一步区分整合酶基因的类型，因此操作步骤比较繁琐。综上，开发能同时检测常见磺胺耐药基因(sul1和sul2)和整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的多重PCR试剂盒，对于细菌中磺胺耐药基因的迁移风险评估研究十分重要。
综上，针对细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的检测，现有的技术的缺点主要包括：
(1)开发的多重PCR体系仅针对磺胺耐药基因或整合酶基因，至少需要两个PCR体系才能完成磺胺基因和整合酶基因的检测；
(2)已开发的磺胺耐药基因的多重PCR检测体系中，因部分引物位于磺胺耐药基因起始密码子的上游，导致体系不适合对细菌样本cDNA文库中能表达成蛋白的磺胺耐药基因的检测。
发明内容
本发明的目的是通过设计高特异性、目的序列位于起始密码子之后的引物序列对，提供一种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，在一个五重PCR体系中，实现对细菌中2个磺胺耐药基因(sul1和sul2)和3个整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的同时快速检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，包括：
(1)多重PCR反应液：含有DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液；
(2)引物混合液：将如下的扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物用双蒸水溶解后分组混合；
扩增sul1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’-ATGGTGACGGTGTTCGG-3’
SEQ ID NO.2：5’-GCAAGGCTCGCTGGAC-3’
扩增sul2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’-CATTTTCGGCATCGTCA-3’
SEQ ID NO.4：5’-CAAGGCGGTTGCGTTT-3’
扩增intI1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’-GGACCAGTTGCGTGAGC-3’
SEQ ID NO.6：5’-TGCCCGTTCCATACAGA-3’
扩增intI2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’-TACGCTGCTGTATGGTGC-3’
SEQ ID NO.8：5’-TTTATTGCTGGGATTAGGC-3’
扩增intI3的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’-ACCTGCCGATACAAGAACA-3’
SEQ ID NO.10：5’-AACCTGACTGCGTCCCTC-3’；
(3)阳性对照液：含有磺胺耐药基因sul1和sul2、以及整合酶基因intI1、intI2和intI3的质粒水溶液的混合物。
优选的，所述多重PCR反应液的组成为：每1000μL多重PCR反应液包括：DNA聚合酶8-30μL；dNTP 32-140μL；PCR反应缓冲液100-120μL；用双蒸水补足至1000μL。
优选的，所述dNTP中，包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP各7-35μL。
优选的，所述PCR反应缓冲液为10×Ex Taq Buffer。
优选的，所述引物混合液中，每条引物在引物混合液中的浓度分别为50-200μmol/L。
优选的，所述阳性对照液中各质粒的浓度分别为0.1-10pg/μL。
本发明还提供了一种检测细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的引物，技术方案如下：
一种检测细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的引物，包括扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物，其核苷酸序列如下所示：
扩增sul1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’-ATGGTGACGGTGTTCGG-3’
SEQ ID NO.2：5’-GCAAGGCTCGCTGGAC-3’
扩增sul2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’-CATTTTCGGCATCGTCA-3’
SEQ ID NO.4：5’-CAAGGCGGTTGCGTTT-3’
扩增intI1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’-GGACCAGTTGCGTGAGC-3’
SEQ ID NO.6：5’-TGCCCGTTCCATACAGA-3’
扩增intI2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’-TACGCTGCTGTATGGTGC-3’
SEQ ID NO.8：5’-TTTATTGCTGGGATTAGGC-3’
扩增intI3的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’-ACCTGCCGATACAAGAACA-3’
SEQ ID NO.10：5’-AACCTGACTGCGTCCCTC-3’。
有益效果：本发明通过在起始密码子之后设计2个磺胺耐药基因(sul1和sul2)和3个整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的特异性引物，并将对应的PCR产物长度差异合适的引物对进行组合，从而实现基于多重PCR技术的细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速检测，对于每一个细菌样品，只需进行一组五重PCR反应，即可完成上述5个基因的筛查。与现有的磺胺耐药基因多重PCR检测和整合酶基因多重PCR检测技术相比，一是检测效率提高约2倍，达到了多重PCR反应引物重数的上限，即五重；二是所有引物序列均在起始密码子之后，使得该检测体系既可用于细菌基因组中上述五个基因的检测，也可用于细菌cDNA中上述五个基因的检测。
综上，本发明所述试剂盒具有操作简便、结果易判、成本低廉、高效灵敏等优点，可用于各种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的全面筛查检测。
附图说明
图1为混合菌液基因组样品中2种磺胺耐药基因和3种整合酶基因的检测结果；
图2为混合菌液cDNA样品中2种磺胺耐药基因和3种整合酶基因的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步的解释。
下列实施例涉及到的材料和试剂，实验条件和方法如下：
一、材料、试剂和仪器
材料：具有磺胺耐药表型的细菌菌株、不具有磺胺耐药表型的细菌菌株、携带或不携带整合酶基因的细菌菌株均由本实验室分离自肉用动物养殖场，并通过16S rDNA测序鉴定菌种。
试剂：DNA聚合酶(5U/μL，配套10×Ex Taq Buffer(含Mg2+))和dNTP混合液(包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，各2.5mM)购于宝日医生物技术(北京)有限公司)；2对磺胺耐药基因和3对整合酶基因的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；琼脂糖凝胶电泳试剂购于北京全式金生物技术有限公司；脑心浸液肉汤培养基(Brain heart infusionbroth,BHI)和琼脂粉购于英国Oxoid公司，磺胺甲恶唑购于美国Sigma公司。
仪器：Bio-Rad T100型PCR仪，Bio-Rad Powerpac Universal型电泳仪，Bio-RadGelDoc XR+Imager型凝胶成像分析系统，北京六一生物科技有限公司DYCP-31E型电泳槽，Eppendorf Centrifuge 5424R型高速冷冻台式离心机，Eppendorf Research Plus型微量移液枪，德国Eppendorf公司。
二、检测方法步骤
1.质粒介导的磺胺耐药基因和整合酶基因检测试剂盒的装配
(1)多重PCR反应液的装配
经参数条件优化，确定多重PCR反应液的组成为：每1000μL多重PCR反应液包括：DNA聚合酶8-30μL；dNTP 32-140μL；PCR反应缓冲液(10×Ex Taq Buffer)100-120μL；用双蒸水补足至1000μL；
其中，32-140μL的dNTP中，包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP各7-35μL。
(2)引物混合液
将扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物的干粉用双蒸水溶解后混合成引物混合液，每条引物的浓度为50-200μmol/L。
扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物的核苷酸序列如表1所示：
表1本发明包括的磺胺耐药基因和整合酶基因检测引物对
基因 引物(正向)5’-3’ 引物(正向)5’-3’ 产物长度bp
sul1 ATGGTGACGGTGTTCGG GCAAGGCTCGCTGGAC 695
sul2 CATTTTCGGCATCGTCA CAAGGCGGTTGCGTTT 497
intI1 GGACCAGTTGCGTGAGC TGCCCGTTCCATACAGA 383
intI2 TACGCTGCTGTATGGTGC TTTATTGCTGGGATTAGGC 156
intI3 ACCTGCCGATACAAGAACA AACCTGACTGCGTCCCTC 280
(3)阳性对照液
将分别含有磺胺耐药基因sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的质粒混合，得到阳性对照液，其中各质粒的含量为0.1-10pg/μL。
2.用本试剂盒检测实际菌株混合样品中的磺胺耐药基因和整合酶基因
在含有磺胺甲恶唑的BHI培养基上分离具有磺胺耐药表型的细菌，对单个菌株用单重PCR鉴定3个磺胺耐药基因(sul1、sul2和sul3)和3个整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的存在情况，并将PCR产物测序，确认是否为目的基因；用16S rDNA测序法鉴定菌种。菌株种属及相关基因的携带情况如表2所示。
表2用于PCR实验的菌株及磺胺耐药基因/整合酶基因的携带情况
菌株编号 菌株种属 携带的磺胺耐药基因/整合酶基因
A Staphylococcus spp. sul1和intI1
B Enterobacterspp. sul2
C E.coli intI2
D E.coli intI3
E Aeromonas spp. /
F Pseudomonas spp. /
G Mycobacterium spp. /
H Acinetobacter spp. /
将所有菌株液混合后，直接提取总DNA，或提取RNA后反转录成cDNA，作为PCR的模板，分别用本发明所涉试剂盒进行磺胺耐药基因和整合酶基因的检测，同时以阳性对照液或蒸馏水为模板进行PCR扩增，作为检测试剂盒的阳性和阴性对照，仅当阳性对照管扩增出目的条带且阴性对照管未扩增出任何条带时，检测管的结果才可用。PCR反应体系和反应程序如表3所示。两次检测的结果分别对应图1-2。
表3用本发明试剂盒检测2个细菌核酸模拟液的测试条件
3.用现有技术的方法检测菌株混合样品中的磺胺耐药基因和整合酶基因
根据现有技术中的磺胺耐药基因多重PCR检测方法对上述2个样品进行检测，引物信息如表4所示。根据现有技术将反应体系定为：10×PCR Buffer 5μL，dNTP(各2.5mmol/L)4μL，sul1的正反向引物各1.4μL，sul2的正反向引物各0.4μL，DNA模板5μL，Taq酶0.35μL，MgCl2(25mmol/L)5μL，用水补足至50μL。根据现有技术将反应程序定为：预变性94℃5min，32个循环(每循环均为94℃变性50s，55℃退火45s，72℃延伸50s)，最后72℃延伸6min。
表4现有技术中用于磺胺耐药基因多重PCR检测的引物对
耐药基因 引物(正向)5’-3’ 引物(正向)5’-3’ 产物长度bp
sul1 CATTGCCTGGTTGCTTCAT ATCCGACTCGCAGCATTT 238
sul2 CATCATTTTCGGCATCGTC TCTTGCGGTTTCTTTCAGC 793
4.结果分析
用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种磺胺耐药基因或整合酶基因。
三、检测结果
1.混合菌液基因组中2种磺胺耐药基因和3种整合酶基因的检测结果
分别用本发明试剂盒和现有技术的多重PCR反应体系检测含有2个磺胺耐药基因和3个整合酶基因的菌株混合液基因组，实际检测结果如图1所示，图1中，M：2K Maker；1：本发明试剂盒的PCR扩增产物；2：本发明试剂盒的阳性对照；3：本发明试剂盒的阴性对照；:4：现有技术多重PCR反应体系的扩增产物；5：现有技术的多重PCR反应体系的阴性对照。
本发明试剂盒能有效检测出5个目的基因，且无非特异性扩增，结果易于分辨。现有技术的磺胺耐药基因PCR体系能按预期检测到2个磺胺耐药基因，但无法同时检测出整合酶基因。
2.混合菌液cDNA组中2种磺胺耐药基因和3种整合酶基因的检测结果
分别用本发明试剂盒和现有技术的多重PCR反应体系检测含有2个磺胺耐药基因和3个整合酶基因的菌株混合液cDNA，实际检测结果如图2所示，图2中，M：2K Maker；1：本发明试剂盒的PCR扩增产物；2：本发明试剂盒的阳性对照；3：本发明试剂盒的阴性对照；4：现有技术多重PCR反应体系的扩增产物；5：现有技术多重PCR反应体系的阴性对照。
本发明试剂盒能有效检测出5个目的基因的表达，且无非特异性扩增，结果易于分辨。现有技术的磺胺耐药基因PCR体系中的sul1基因的上游引物在起始密码子之前，因此无法检出混合菌液cDNA中表达的sul1基因，仅能检测到sul2基因，且无法同时检测出整合酶基因。因此本发明试剂盒的检测效果优于现有技术的磺胺耐药基因多重PCR反应体系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，其特征在于：包括：
(1)多重PCR反应液：含有DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液；
(2)引物混合液：将如下的扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物用双蒸水溶解后分组混合；
扩增sul1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’-ATGGTGACGGTGTTCGG-3’
SEQ ID NO.2：5’-GCAAGGCTCGCTGGAC-3’
扩增sul2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’-CATTTTCGGCATCGTCA-3’
SEQ ID NO.4：5’-CAAGGCGGTTGCGTTT-3’
扩增intI1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’-GGACCAGTTGCGTGAGC-3’
SEQ ID NO.6：5’-TGCCCGTTCCATACAGA-3’
扩增intI2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’-TACGCTGCTGTATGGTGC-3’
SEQ ID NO.8：5’-TTTATTGCTGGGATTAGGC-3’
扩增intI3的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’-ACCTGCCGATACAAGAACA-3’
SEQ ID NO.10：5’-AACCTGACTGCGTCCCTC-3’；
(3)阳性对照液：含有磺胺耐药基因sul1和sul2、以及整合酶基因intI1、intI2和intI3的质粒水溶液的混合物。
2.根据权利要求1所述的细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，其特征在于：所述多重PCR反应液的组成为：每1000μL多重PCR反应液包括：DNA聚合酶8-30μL；dNTP32-140μL；PCR反应缓冲液100-120μL；用双蒸水补足至1000μL。
3.根据权利要求2所述的细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，其特征在于：所述dNTP中，包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP各7-35μL。
4.根据权利要求1或2所述的细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，其特征在于：所述PCR反应缓冲液为10×Ex Taq Buffer。
5.根据权利要求1所述的细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，其特征在于：所述引物混合液中，每条引物在引物混合液中的浓度分别为50-200μmol/L。
6.根据权利要求1所述的细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的快速筛查试剂盒，其特征在于：所述阳性对照液中各质粒的浓度分别为0.1-10pg/μL。
7.一种检测细菌中磺胺耐药基因和整合酶基因的引物，其特征在于：包括扩增sul1、sul2、intI1、intI2和intI3的5对引物，其核苷酸序列如下所示：
扩增sul1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’-ATGGTGACGGTGTTCGG-3’
SEQ ID NO.2：5’-GCAAGGCTCGCTGGAC-3’
扩增sul2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’-CATTTTCGGCATCGTCA-3’
SEQ ID NO.4：5’-CAAGGCGGTTGCGTTT-3’
扩增intI1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’-GGACCAGTTGCGTGAGC-3’
SEQ ID NO.6：5’-TGCCCGTTCCATACAGA-3’
扩增intI2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’-TACGCTGCTGTATGGTGC-3’
SEQ ID NO.8：5’-TTTATTGCTGGGATTAGGC-3’
扩增intI3的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’-ACCTGCCGATACAAGAACA-3’
SEQ ID NO.10：5’-AACCTGACTGCGTCCCTC-3’。
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