CN112143710A - 一种重组k1f噬菌体及其构建方法、应用 - Google Patents

一种重组k1f噬菌体及其构建方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组K1F噬菌体及其构建方法、应用，该重组K1F噬菌体能够快速且准确地检测大肠杆菌。一种重组K1F噬菌体，其包括K1F噬菌体，所述K1F噬菌体中插入有如SEQ ID No.1所示的荧光蛋白基因。一种重组K1F噬菌体的构建方法，其包括如下步骤：A、将荧光蛋白表达框片段插入质粒载体中，得到供体质粒；B、将所述供体质粒转化为大肠杆菌细胞，加入K1F噬菌体，使所述供体质粒与所述噬菌体重组。

Description

一种重组K1F噬菌体及其构建方法、应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种重组K1F噬菌体及其构建方法、应用，具体是在大肠杆菌检测中的应用。
背景技术
当前比较常用的细菌检测方法包括单克隆计数、生化免疫反应(ELISA)及核酸检测(PCR)等。传统的检测方法，例如单克隆培养等，需要对样品中的细菌进行培养和分离，然后进行相关的生化分析，耗时可长达72小时，并不适用于某些需要快速得到结果的医疗和食品检测。一些新的技术，例如基于核酸检测的技术(DNA探针，PCR等)、酶联免疫相关的技术(ELISA等)和质谱相关的技术等，也存在诸如需要特定器械，价格昂贵，假阳性等问题。而新出现的噬菌体检测技术，能够克服上述技术中存在的缺陷，具有特异性高，操作简单，快速便宜等优点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组K1F噬菌体，其能够快速且准确地检测大肠杆菌。本发明的另一个目的是提供一种重组K1F噬菌体的制备方法。本发明的又一个目的是提供一种重组K1F噬菌体在大肠杆菌检测中的应用。
本发明的第一个方面提供一种重组K1F噬菌体，其包括K1F噬菌体，所述K1F噬菌体中插入有如SEQ ID No.1所示的荧光蛋白基因。
上述荧光蛋白基因的序列较短、便于进行基因操作，而且荧光信号较强，方便检测荧光信号。SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具体如下：
taatacgactcactatagTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCTCGAGgaaagaggagaaaGGTCTCActaaacattaatcatttaaaataaggaggtaaagcatgaaatatcttctgcctacggctgccacgggtttgttactgcttgcagctcagccagcggtcgccatgcatcaccatcatcaccatcaccattcagtattcacactggaggattttgtcggtgactggcgccagactgctggatataatcttgatcaagtgctggagcaaggaggcgtctcaagccttttccagaatttaggtgttagcgtcacaccgattcaacgtatcgtgctgagtggggagaacggcttaaaaatcgacatccacgtcatcattccatatgaagggttgtcaggggatcagatgggtcagattgaaaagatttttaaggttgtctacccagtagacgaccatcacttcaaggttattttacactacggtacattagtaattgacggcgtgactcctaacatgattgactattttggacgcccgtatgaggggattgcagtgttcgacggcaagaagatcacagttacggggactctgtggaatgggaataaaattatcgacgagcgtctgattaaccccgatggctctctgttgttccgtgtcactattaacggtgtcacgggctggcgcctttgtgaacgcattttagcataagcttgcggccgcactcgagtaactagttaaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactat
本发明的第二个方面提供一种重组K1F噬菌体的构建方法，其包括如下步骤：
A、将如SEQ ID No.1所示的荧光蛋白表达框片段插入质粒载体中，得到供体质粒；
B、将所述供体质粒转入大肠杆菌细胞，加入K1F噬菌体，使所述供体质粒与所述噬菌体重组。
优选地，所述步骤A具体包括：
A1、以大肠杆菌基因为模板，分别使用第一对引物和第二对引物进行扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；以含有得到荧光蛋白表达框的质粒为模板，使用第三对引物进行扩增，得到第三扩增产物；
A2、将所述第一扩增产物、第二扩层产物及第三扩增产物用于内切酶处理后混合，加入连接酶处理；
A3、将步骤A2处理后的扩增产物转入细胞；
A4、对所述细胞进行培养，提取供体质粒。
其中，第一对引物和第二对引物分别扩增得到荧光蛋白两端的同源臂序列片段，同源臂会与K1F噬菌体基因组发生同源重组，进而将荧光蛋白整合到基因组中
更优选地，所述细胞为感受态细胞，例如DH5α细胞。
进一步地，所述步骤A1中，以EV36细菌的基因组为模板；所述第一对引物的序列为：aattcgcggccgcaTtcgagaccgtgactaccttaagcaa和CTGTCAActatagtgagtcgtattactatagtgatagtttagtccttgatgtgg；和/或，所述第二对引物的序列为：ttgctgaaaggaggaactattctccgcttaaatcacaaaggag和gctttttttgaattcctgcatgtaacgttgtagcctttctcgaag；和/或，所述第三对引物的序列为：taatacgactcactatagTTGACAGCTAGC和atagttcctcctttcagcaaaaaacccc。这些引物为经过筛选的能够高效且特异扩增目的条带。
进一步地，所述步骤A1中，以EV36细菌的基因组为模板；所述第一对引物的序列为：aattcgcggccgcaTggttttcagcccagcggag和gCCaCCgCCaCCAGAACCgCCACCgCCgttgttggactcagccagtttatcg；和/或，所述第二对引物的序列为：gtgaacgcattttagcataattgaaaccccttgggtgcc和tgctttttttgaattcctgcaggactgctggttcaccgatag；和/或，所述第三对引物的序列为：TCTGGtGGcGGtGGcTCTGGcGGTGGcGGTTCTatggtattcacactggaggattttg和ttatgctaaaatgcgttcacaaaggc。
更进一步地，所述步骤A4中，对DH5α细胞培养后，挑单克隆进行PCR鉴定，将其中的阳性单克隆摇菌培养并提取所述供体质粒。
更优选地，所述步骤B中，将供体质粒转换大肠杆菌细胞，加入K1F噬菌体，菌液中的K1F噬菌体的体积百分比为0.5～5％，培养至裂解发生。
进一步地，所述步骤B还包括如下步骤：
使用第四对引物对噬菌体裂解液进行PCR鉴定，确认噬菌体与供体质粒发生重组，所述第四对引物的序列为：tccagacgggaagtacacca和ttcttcagaggcataataaagaggttg，或ggtaagaaagccgacctcgacacc和ccacaagctctaccgtgatagggtc。
进一步地，所述步骤B还包括如下步骤：
在LB培养基中加入噬菌体裂解液及大肠杆菌菌液，培养，至噬菌斑产生；
挑取噬菌斑进行PCR鉴定，鉴定为阳性的噬菌斑即为插入有荧光基因的重组噬菌体。
更进一步地，对噬菌斑进行的所述PCR鉴定采用的引物对的序列为：tccagacgggaagtacacca和ttcttcagaggcataataaagaggttg，或ggtaagaaagccgacctcgacacc和ccacaagctctaccgtgatagggtc。
本发明的第三个方面提供一种如上述所述的重组K1F噬菌体或如上所述的构建方法得到的重组K1F噬菌体在检测大肠杆菌中的应用。
优选地，包括如下步骤：在待测样品中加入插入有荧光基因的重组噬菌体，加入荧光反应底物后，检测荧光信号。
优选地，所述大肠杆菌为EV36细菌。
本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
本发明的检测方法中，采用插入了如SEQ ID No.1所示的荧光基因的重组噬菌体对大肠杆菌进行检测，在噬菌体侵染大肠杆菌的过程中，荧光蛋白得以表达，通过对荧光蛋白的荧光强度进行检测即可实现对大肠杆菌的检测，能够快速且准确地检测大肠杆菌，极大缩短了检测时间，特异性高，检测快速，操作方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例的一种检测方法的流程图；
图2是实施例3的荧光信号标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。
实施例1：插入荧光基因完整表达框的重组噬菌体株构建
1.1供体质粒构建
供体质粒构建过程为将3个核酸片段(2个同源臂片段和1个荧光蛋白表达框片段)同时插入到PUC19骨架质粒中。具体步骤如下：
(1)以EV36细菌基因组为模板，使用引物1-F(序列为aattcgcggccgcaTtcgagaccgtgactaccttaagcaa，SEQ ID No.2)和引物1-R(序列为CTGTCAActatagtgagtcgtattactatagtgatagtttagtccttgatgtgg，SEQ ID No.3)进行PCR扩增，得到扩增产物K1；
以EV36细菌基因组为模板，使用引物2-F(序列为ttgctgaaaggaggaactattctccgcttaaatcacaaaggagg，SEQ ID No.4)和引物2-R(序列为gctttttttgaattcctgcatgtaacgttgtagcctttctcgaag，SEQ ID No.5)进行PCR扩增，得到扩增产物K2；
以含有荧光蛋白表达框(序列为SEQ ID No.1)的质粒为模板，使用引物3-F(序列为taatacgactcactatagTTGACAGCTAGC，SEQ ID No.6)和引物3-R(序列为atagttcctcctttcagcaaaaaacccc，SEQ ID No.7)进行PCR扩增，得到扩增产物K3。
其中，上述各PCR扩增的反应体系如表1所示。
表1
Figure BDA0002677199810000051
反应程序如表2所示。
表2
Figure BDA0002677199810000052
表1中，扩增酶为购自诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase；正向引物和反向引物分别为引物1-F和1-R，或为引物2-F和2-R，或为引物3-F和3-R。该反应体系在95℃下反应5分钟，再按照表2所示的程序循环30次，再在72℃下反应10分钟。
(2)将扩增产物K1、K2和K3分别用DpnI内切酶37℃处理30分钟后等摩尔比例混合，加入连接酶(购自诺唯赞公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit)处理15分钟。
(3)将处理后的扩增产物转化DH5α细胞，具体转化步骤如下：
加入5μL扩增产物到100μL DH5α感受态细胞中，冰上孵育30分钟，42℃热激45秒，冰上放置2分钟，加入500μL LB培养基，37℃培养2小时后涂平板。
(4)平板37℃培养过夜，挑单克隆进行PCR鉴定，将阳性克隆摇菌培养并提取质粒。
1.2噬菌体侵染及阳性筛选
(1)将供体质粒转入EV36细胞，PCR鉴定后培养至OD 0.5左右。在500μL菌液中加入5μL K1F噬菌体，37℃培养2小时左右至裂解发生。
(2)使用引物4-F(序列为tccagacgggaagtacacca，SEQ ID No.8)和引物4-R(序列为ttcttcagaggcataataaagaggttg，SEQ ID No.9)对噬菌体裂解液进行PCR鉴定，确认噬菌体与供体质粒发生重组。
(3)将噬菌体裂解液10倍浓度梯度稀释后，在3mL 50％固体LB培养基(加入相应抗生素)中加入100μL噬菌体稀释液及300μL含有CRISPR质粒(购买自淼灵质粒平台的pCas9质粒)的EV36菌液(英国华威大学赠送)(OD 0.5)。将上述混合液平铺倒入LB平板(含有相应抗生素)后37℃倒置培养8小时左右，至噬菌斑产生。
(4)挑取噬菌斑至40μL 0.5×TBE缓冲液中，37℃培养2小时后，使用引物4-F和引物4-R进行PCR鉴定。鉴定为阳性的噬菌斑即为插入荧光基因的重组噬菌体。
实施例2：荧光蛋白与外壳蛋白融合的重组噬菌体株构建
2.1供体质粒构建
供体质粒构建过程为将3个核酸片段(2个同源臂片段和1个荧光蛋白表达框片段)同时插入到PUC19骨架质粒中。具体步骤如下：
(1)以EV36细菌基因组为模板，使用引物5-F(序列为aattcgcggccgcaTggttttcagcccagcggag，SEQ ID No.10)和引物5-R(序列为gCCaCCgCCaCCAGAACCgCCACCgCCgttgttggactcagccagtttatcg，SEQ ID No.11)进行PCR扩增，得到扩增产物K4；
以EV36细菌基因组为模板，使用引物6-F(序列为gtgaacgcattttagcataattgaaaccccttgggtgcc，SEQ ID No.12)和引物6-R(序列为tgctttttttgaattcctgcaggactgctggttcaccgatag，SEQ ID No.13)进行PCR扩增，得到扩增产物K5；
以含有荧光蛋白表达框的质粒为模板，使用引物7-F(序列为TCTGGtGGcGGtGGcTCTGGcGGTGGcGGTTCTatggtattcacactggaggattttg，SEQ ID No.14)和引物7-R(序列为ttatgctaaaatgcgttcacaaaggc，SEQ ID No.15)进行PCR扩增，得到扩增产物K6。
其中，上述各PCR扩增的反应体系如表3所示。
表3
Figure BDA0002677199810000071
反应程序如表4所示。
表4
Figure BDA0002677199810000072
表3中，扩增酶为购自诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase；正向引物和反向引物分别为引物5-F和5-R，或为引物6-F和6-R，或为引物7-F和7-R。该反应体系在95℃下反应5分钟，再按照表4所示的程序循环30次，再在72℃下反应10分钟。
(2)将扩增产物K4、K5和K6分别用DpnI内切酶37℃处理30分钟后等摩尔比例混合，加入连接酶(购自诺唯赞公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit)处理15分钟。
(3)将处理后的扩增产物转入DH5α细胞，具体转化步骤如下：
加入5μL扩增产物到100μL DH5α感受态细胞中，冰上孵育30分钟，42℃热激45秒，冰上放置2分钟，加入500μL LB培养基，37℃培养2小时后涂平板。
(4)平板37℃培养过夜，挑单克隆进行PCR鉴定，将阳性克隆摇菌培养并提取质粒。
2.2噬菌体侵染及阳性筛选
(1)将供体质粒转化EV36细胞，PCR鉴定后培养至OD 0.5左右。在500μL菌液中加入5μL K1F噬菌体，37℃培养2小时左右至裂解发生。
(2)使用引物8-F(序列为ggtaagaaagccgacctcgacacc，SEQ ID No.16)和引物8-R(序列为ccacaagctctaccgtgatagggtc，，SEQ ID No.17)对噬菌体裂解液进行PCR鉴定，确认噬菌体与供体质粒发生重组。
(3)将噬菌体裂解液10倍浓度梯度稀释后，在3mL 50％固体LB培养基(加入相应抗生素)中加入100μL噬菌体稀释液及300μL含有CRISPR质粒(购买自淼灵质粒平台的pCas9质粒)的EV36菌液(英国华威大学赠送)(OD 0.5)。将上述混合液平铺倒入LB平板(含有相应抗生素)后37℃倒置培养8小时左右，至噬菌斑产生。
(4)挑取噬菌斑至40μL 0.5×TBE缓冲液中，37℃培养2小时后，使用8-F和引物8-R进行PCR鉴定。鉴定为阳性的噬菌斑即为插入荧光基因的重组噬菌体。
实施例3：荧光噬菌体对EV36菌液进行检测的荧光信号标准曲线
用实施例1构建的重组荧光噬菌体对不同浓度的EV36菌液进行检测，建立荧光信号标准曲线。检测流程如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)将EV36细菌在37℃培养，并稀释至不同浓度梯度；
(2)在不同细菌浓度梯度下分别加入荧光噬菌体，并培养20min；
(3)分别加入等体积荧光反应底物，混合均匀；
(4)将上述各反应液加入酶标板，用酶标仪检测荧光信号；
(5)针对菌液浓度梯度，制作荧光信号标准曲线。
如图2所示，经过检测，重组荧光噬菌体对EV36菌液的检测灵敏度在104CFU左右。
实施例4：荧光噬菌体对EV36菌液进行检测
在500μL未知细菌浓度的EV36菌液下加入5μL实施例1构建的荧光噬菌体，并培养20min；加入等体积
Figure BDA0002677199810000081
萤光素酶检测底物，混合均匀；将上述反应液加入酶标板，用酶标仪检测荧光信号；根据实施例3得到的荧光信号标准曲线，换算出EV36的总数，结果如表5所示。
对比例1
采用经典的平板计数方法对实施例4所用的未知细菌浓度的EV36菌液进行检测，结果如表5所示。
对比例2
采用核酸检测方法对实施例4所用的未知细菌浓度的EV36菌液进行检测，结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002677199810000091
由表5可知，实施例4检出的细菌总数高于对比例1，与对比例2持平，且实施例4的检测时间显著小于平板计数法和核酸检测法，且操作更为简便。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏汇先医药技术有限公司
<120> 一种重组K1F噬菌体及其构建方法、应用
<130> 2020
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 809
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
taatacgact cactatagtt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agcctcgagg 60
aaagaggaga aaggtctcac taaacattaa tcatttaaaa taaggaggta aagcatgaaa 120
tatcttctgc ctacggctgc cacgggtttg ttactgcttg cagctcagcc agcggtcgcc 180
atgcatcacc atcatcacca tcaccattca gtattcacac tggaggattt tgtcggtgac 240
tggcgccaga ctgctggata taatcttgat caagtgctgg agcaaggagg cgtctcaagc 300
cttttccaga atttaggtgt tagcgtcaca ccgattcaac gtatcgtgct gagtggggag 360
aacggcttaa aaatcgacat ccacgtcatc attccatatg aagggttgtc aggggatcag 420
atgggtcaga ttgaaaagat ttttaaggtt gtctacccag tagacgacca tcacttcaag 480
gttattttac actacggtac attagtaatt gacggcgtga ctcctaacat gattgactat 540
tttggacgcc cgtatgaggg gattgcagtg ttcgacggca agaagatcac agttacgggg 600
actctgtgga atgggaataa aattatcgac gagcgtctga ttaaccccga tggctctctg 660
ttgttccgtg tcactattaa cggtgtcacg ggctggcgcc tttgtgaacg cattttagca 720
taagcttgcg gccgcactcg agtaactagt taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 780
aggggttttt tgctgaaagg aggaactat 809
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<400> 2
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
gctttttttg aattcctgca tgtaacgttg tagcctttct cgaag 45
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
taatacgact cactatagtt gacagctagc 30
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
atagttcctc ctttcagcaa aaaacccc 28
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
tccagacggg aagtacacca 20
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
ttcttcagag gcataataaa gaggttg 27
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
aattcgcggc cgcatggttt tcagcccagc ggag 34
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
gccaccgcca ccagaaccgc caccgccgtt gttggactca gccagtttat cg 52
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
gtgaacgcat tttagcataa ttgaaacccc ttgggtgcc 39
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
tgcttttttt gaattcctgc aggactgctg gttcaccgat ag 42
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
tctggtggcg gtggctctgg cggtggcggt tctatggtat tcacactgga ggattttg 58
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
ttatgctaaa atgcgttcac aaaggc 26
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
ggtaagaaag ccgacctcga cacc 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
ccacaagctc taccgtgata gggtc 25

Claims (12)

1.一种重组K1F噬菌体，其特征在于：包括K1F噬菌体，所述K1F噬菌体中插入有如SEQID No.1所示的荧光蛋白基因。
2.一种重组K1F噬菌体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将如SEQ ID No.1所示的荧光蛋白表达框片段插入质粒载体中，得到供体质粒；
将所述供体质粒转入大肠杆菌细胞，加入K1F噬菌体，使所述供体质粒与所述K1F噬菌体重组。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：
A1、以大肠杆菌基因为模板，分别使用第一对引物和第二对引物进行扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；以含有所述荧光蛋白表达框的质粒为模板，使用第三对引物进行，得到第三扩增产物；
A2、将所述第一扩增产物、第二扩层产物及第三扩增产物用内切酶处理后混合，加入连接酶处理；
A3、将步骤A2处理后的扩增产物转入细胞；
A4、对所述细胞进行培养，提取所述供体质粒。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1中，以EV36细菌的基因组为模板；所述第一对引物的序列为：aattcgcggccgcaTtcgagaccgtgactaccttaagcaa和CTGTCAActatagtgagtcgtattactatagtgatagtttagtccttgatgtgg；和/或，所述第二对引物的序列为：ttgctgaaaggaggaactattctccgcttaaatcacaaaggag和gctttttttgaattcctgcatgtaacgttgtagcctttctcgaag；和/或，所述第三对引物的序列为：taatacgactcactatagTTGACAGCTAGC和atagttcctcctttcagcaaaaaacccc。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1中，以EV36细菌的基因组为模板；所述第一对引物的序列为：aattcgcggccgcaTggttttcagcccagcggag和gCCaCCgCCaCCAGAACCgCCACCgCCgttgttggactcagccagtttatcg；和/或，所述第二对引物的序列为：gtgaacgcattttagcataattgaaaccccttgggtgcc和tgctttttttgaattcctgcaggactgctggttcaccgatag；和/或，所述第三对引物的序列为：TCTGGtGGcGGtGGcTCTGGcGGTGGcGGTTCTatggtattcacactggaggattttg和ttatgctaaaatgcgttcacaaaggc。
6.根据权利要求3至5任一项所述的构建方法，其特征在于：所述步骤A4中，对DH5α细胞培养后，挑单克隆进行PCR鉴定，将其中的阳性单克隆摇菌培养并提取所述供体质粒。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤B中，将供体质粒转换大肠杆菌细胞，加入K1F噬菌体，菌液中的K1F噬菌体的体积百分比为0.5~5%，培养至裂解发生，使用第四对引物对噬菌体裂解液进行PCR鉴定，确认噬菌体与供体质粒发生重组，所述第四对引物的序列为：tccagacgggaagtacacca和ttcttcagaggcataataaagaggttg，或ggtaagaaagccgacctcgacacc和ccacaagctctaccgtgatagggtc。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤B还包括如下步骤：
在LB培养基中加入噬菌体裂解液及含有CRISPR质粒的大肠杆菌菌液，培养，至噬菌斑产生；
挑取噬菌斑进行PCR鉴定，鉴定为阳性的噬菌斑即为插入有荧光基因的重组噬菌体。
9.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，对噬菌斑进行的所述PCR鉴定采用的引物对的序列为：tccagacgggaagtacacca和ttcttcagaggcataataaagaggttg，或ggtaagaaagccgacctcgacacc和ccacaagctctaccgtgatagggtc。
10.一种如权利要求1所述的重组K1F噬菌体或如权利要求2-9任一项所述的构建方法得到的重组K1F噬菌体在检测大肠杆菌中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：在待测样品中加入插入有荧光基因的重组噬菌体，加入荧光反应底物后，检测荧光信号。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为EV36细菌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116168767A (zh) * 2023-04-25 2023-05-26 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种噬菌体的生长环境监测与评估方法及系统

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105392892A (zh) * 2013-03-27 2016-03-09 六品科技公司 重组噬菌体和细菌检测方法
CN105531382A (zh) * 2013-06-19 2016-04-27 六品科技公司 基于噬菌体的细菌检测法
US20180223291A1 (en) * 2017-02-09 2018-08-09 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Bacteriophage recombination followed by blockage of non-recombinant bacteriophage replication
US10174294B1 (en) * 2018-02-28 2019-01-08 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Recombinant K2 bacteriophages and uses thereof
US20190324033A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Tokitae Llc Phage constructs for detecting bacteria in a fluid, microfluidic devices for use with constructs, and related methods
CN111569959A (zh) * 2020-04-30 2020-08-25 上海邦先医疗科技有限公司 一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片及使用方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105392892A (zh) * 2013-03-27 2016-03-09 六品科技公司 重组噬菌体和细菌检测方法
CN105531382A (zh) * 2013-06-19 2016-04-27 六品科技公司 基于噬菌体的细菌检测法
US20180223291A1 (en) * 2017-02-09 2018-08-09 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Bacteriophage recombination followed by blockage of non-recombinant bacteriophage replication
US10174294B1 (en) * 2018-02-28 2019-01-08 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Recombinant K2 bacteriophages and uses thereof
US20190324033A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Tokitae Llc Phage constructs for detecting bacteria in a fluid, microfluidic devices for use with constructs, and related methods
CN111569959A (zh) * 2020-04-30 2020-08-25 上海邦先医疗科技有限公司 一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片及使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T. C. HINKLEY等: "Reporter bacteriophage T7NLC utilizes a novel NanoLuc::CBM fusion for the ultrasensitive detection of Escherichia coli in water", 《ANALYST》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116168767A (zh) * 2023-04-25 2023-05-26 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种噬菌体的生长环境监测与评估方法及系统
CN116168767B (zh) * 2023-04-25 2023-09-19 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种噬菌体的生长环境监测与评估方法及系统

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