CN105392892A - 重组噬菌体和细菌检测方法 - Google Patents

重组噬菌体和细菌检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105392892A
CN105392892A CN201480030457.5A CN201480030457A CN105392892A CN 105392892 A CN105392892 A CN 105392892A CN 201480030457 A CN201480030457 A CN 201480030457A CN 105392892 A CN105392892 A CN 105392892A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dup
phage
listeria
acid
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480030457.5A
Other languages
English (en)
Inventor
迈克尔·桑德尔·克里斯
罗伯特·帕特里克·希弗斯
丹尼尔·罗伯特·布劳内尔
詹森·怀亚特·霍尔德
杰森·林·鲍尔斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SAMPLE6 TECHNOLOGIES Inc
Sample Tech Inc
Original Assignee
SAMPLE6 TECHNOLOGIES Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SAMPLE6 TECHNOLOGIES Inc filed Critical SAMPLE6 TECHNOLOGIES Inc
Publication of CN105392892A publication Critical patent/CN105392892A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了检测目标细菌的方法。在一些实施方式中，本方法包括将样品暴露于能够感染一组目标细菌并包括编码标记的异源核酸序列的噬菌体。在一些实施方式中，目标细菌包括李斯特菌。在一些实施方式中，目标细菌全部为李斯特菌。本发明也提供了包括编码标记的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体作为该噬菌体的有用重组以及包括该噬菌体的制品等。

Description

重组噬菌体和细菌检测方法
关联申请
本申请要求2013年3月27日提交的美国临时申请61/805,917的优先权和权益，其所有的内容以其全部合并到本申请中。
背景技术
细菌污染和感染是公共健康以及许多其他领域的重要问题。因此，在医学、兽医、农业、食品加工、工业和其他背景中检测细菌的方法和试剂是有益的。的确，在体外诊断市场中，每年世界各地的细菌超过100亿美元。
细菌性食源性疾病对人类健康构成重大威胁，据估计在美国每年可导致多达7600万例疾病，325,000例住院治疗，以及5000例死亡。
例如，在1996年，被大肠杆菌污染(Escherichiacoli)的果汁由果汁制造商被释放到公众中，从而导致一人死亡和66人得病。该公司付出了150万美元的罚款，并且仅召回就花费了该公司650万美元。在2006年，产自加利福尼亚的被污染的菠菜中爆发了E.coliO157:H7，导致205人得病和3人死亡。2011年，在7月、8月和9月，爆发了来自科罗拉多州的香瓜的李斯特菌病，导致30人死亡。那是自1970s疾病预防控制中心开始跟踪爆发之后，在死亡人数方面，美国纪录的第二最致命的爆发。2012年，科罗拉多州的另一起召回暗示食物供给仍然没有安全，这也突出了用于检测食物供给和污染鉴定的补充方法和试剂的一般和普遍需要。
另一个示例是牛乳房炎，由细菌细胞引起的感染导致了牛的乳房炎症，减少了牛奶产量也降低了牛奶质量。这种情况由细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和无乳链球菌(Staphylococcusagalactiae)引起。单在西方世界，这种牛奶产量和质量的降低暗示导致每年财务损失37亿美元。
另一个示例是牛结核病，一种导致全世界财务损失的细菌。例如，在2005年，在密歇根小农场中检测到55头牛的牛群中的12头牛检测出牛结核病阳性。该农场被迫销毁了整群牛，以及整群猪。检测牛中的结核病需要保留动物2天，检测有5％的假阳性次数。通常整个牛群不得不被检疫或销毁。估计每年全世界财务损失在30亿美元。
结核病是全世界死亡的领先原因。三分之一的世界人口被引起结核病的细菌，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染。每天25,000人被感染并有5,000人死于该疾病。而且，主要原因是由于诊断不良、结核分枝杆菌的多重抗药性菌株的出现，因此结核病作为全球流行病的再度出现已成为真正的威胁。全世界每年结核病诊断市场估计有18亿美元。
MRSA是普通金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)细菌的抗药版本，并且在美国有250万人携带。携带者可以是健康的个体，但由于MRSA细菌的特性，仍有高度的传染性。该细菌通过接触具有高度的传染性和传播性。总感染大约86％发生在医院内，并且这些感染者具有20％的死亡率。在美国每年该细菌花费平均21,000美元来治疗，超过了平均的花费，同时也会杀死约19,000人。
单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是细胞内病原体，其能引起人类和动物的侵袭性疾病。约99％的人类李斯特菌病感染出现在食物传染中。虽然单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)已从各种各样的原料和即食的食物中被分离出来，然而大部分人类李斯特菌病感染出现是因为消费即食的食物(RTE食物)，所述RTE食物能使污染后的病原体生长。在美国每年估计李斯特菌病引起约500例死亡，每年死亡的28％是由已知的食传病原体引起的，仅次于沙门氏菌(Salmonella)感染引起的死亡。
存在检测微生物污染的方法和体系。这些方法和体系有很多缺点，包括在大多数情况下需要在采集其的环境中除去潜在的污染样品，并转移其到实验室环境中，在所述实验室环境中所述样品被放置在用来富集的培养环境中并培养范围在从多个小时到许多天的很长一段时间。此外，由于这些实验室经常是现场外的，因此运送样品到实验室常有一个后滞。一旦被富集，一般用昂贵的设备、传统的培养方法、PCR和其他方法来分析样品。因此，现有的方法经常包括样品和结果间的很大的后滞，例如，在该时间里，采样条件可能已经改变，因此分析的结果不能用于诊断患者的感染或不能对大量生产食品中的污染起作用。据此，新的测试方法和试剂是有用的。
噬菌体是自然界中已进化的使用细菌和古菌作为复制它们手段的病毒。噬菌体通过附着其自身到宿主微生物并注射它的遗传物质到宿主中来完成于此，包括其复制所述噬菌体从几十到上千次。一些噬菌体，称为裂解性噬菌体，破坏宿主微生物由此将子代噬菌体释放到环境中寻求其他微生物。根据噬菌体、微生物和环境条件，由亲代噬菌体、噬菌体在微生物中增殖(扩增)以产生子代噬菌体以及在裂解后释放子代噬菌体感染微生物的总的噬菌体复制时间，能够在短至几分钟的时间里发生。
使用噬菌体指示噬菌体感染的细菌的存在的方法已有描述。在这些方法中，含有细菌的样品被该细菌特异的噬菌体孵育。在细菌中，所述噬菌体侵染并复制，结果产生一个可测量的信号。一些方法使用从感染的细菌中释放的子代噬菌体的检测作为检测和鉴定的方法。在这些方法中，如果亲代噬菌体不能成功地侵染细菌，那么不会产生子代噬菌体。还有其他方法依赖于噬菌体基因产品的检测而不是整个子代噬菌体。例如，成功侵染宿主的产生荧光素酶的荧光素酶报告噬菌体已有描述。然后，荧光素酶产生光，如果能被检测到，表明样品中存在宿主细菌。其他方法依赖于被特异的细菌噬菌体成功的裂解性感染宿主细菌释放的细菌碎片的检测。尽管有将检测由工程噬菌体编码的异源基因产品的方法能被用于细菌诊断的建议，然而这一技术还没有被应用于非实验室环境中检测细菌的污染。
在许多其他环境中，鉴定和追踪细菌污染的种和亚种的能力作为追踪爆发的菌株和收集食品加工厂和制成品中污染的流行病学数据的手段变得日益重要。在种的水平上鉴定细菌菌株主要基于生物化学证据。定义亚种鉴定更糟糕，没有鉴定存在的统一方法。然而有很多鉴定亚种的方法，常用的有四种方法：血清分型、噬菌体分型、脉冲凝胶电泳和核糖分型。这四种方法都受到很多限制，虽然每个系统都能将特定的菌株归类到一个亚群，但是这种分类不一定保证组成成员中的亚群的所有成员具有共同的特性。
基于噬菌体方法的细菌检测的特异性和灵敏性部分由工程细菌噬菌体的宿主范围来决定。基于噬菌体的细菌检测系统的有效性依赖于几个因素，包括用于该方法的噬菌体定义的宿主范围的存在。本公开通过提供定义了多组靶标微生物的定义的宿主范围的工程噬菌体来满足这些和其他需要。本公开还提供一起定义靶标微生物的宿主范围的多组工程噬菌体。所述工程噬菌体和以及多组噬菌体是有用的，例如，在检测靶标微生物的方法中。提供了本公开的这些和其他方面。
发明内容
在第一个方面，本公开提供了检测靶标微生物的方法。所述微生物可以是古菌或细菌。
在某些实施方式中，所述方法包括提供的样品、将所述样品暴露于能侵染第一套靶标细菌并且包括编码第一标记的异源核酸序列的第一类噬菌体；将所述样品暴露于能侵染第二套靶标细菌并且包括编码第二标记的异源核酸序列的第二类噬菌体；检测被暴露的样品中第一标记和第二标记的存在。在一些实施方式中，在所述样品中检测到第一标记标记表明在所述样品中第一套靶标细菌的细菌存在。在一些实施方式中，在所述样品中检测到第二标记表明在所述样品中第二套靶标细菌的细菌存在。在一些实施方式中，第一标记和第二标记相同，并且在所述样品中检测到所述标记表明在所述样品中第一套靶标细菌和第二套靶标细菌中的至少一套细菌存在。
在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌独立地包括单个属细菌的至少两个种。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌独立地包括单个属细菌的至少三个种。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌独立地包括单个属细菌的至少四个种。在一些实施方式中，单个属的细菌是李斯特菌(Listeria)。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌通常包括细菌的至少一个种。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌通常包括细菌的至少两个种。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌通常包括细菌的至少三个种。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌通常包括细菌的至少四个种。在一些实施方式中，李斯特菌属(Listeria)的种选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)。在一些实施方式中，李斯特菌属(Listeria)的种选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自11、22、37和56的无害李斯特菌(Listeriainnocua)中的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，靶标细菌包括无害李斯特菌(Listeriainnocua)中的至少4种等位型。在一些实施方式中，无害李斯特菌(Listeriainnocua)中的至少4种等位型是11、22、37和56。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)中的至少一种核糖核酸型。在一些实施方式中，靶标细菌包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)中的至少19种核糖核酸型。在一些实施方式中，单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的至少19种核糖核酸型是DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)中的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，靶标细菌包括西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的至少4种等位型。在一些实施方式中，西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)中的至少4种等位型是3、20、24和35。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自15、27、32和89的威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)中的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，靶标细菌包括威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)中的至少四种等位型。在一些实施方式中，威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)中的至少4种等位型是15、27、32和89。
在一些实施方式中，第一组的靶标细菌是相同属的所有成员。在一些实施方式中，第二组的靶标细菌是相同属的所有成员。在一些实施方式中，靶标细菌包括不止一个属的成员。在一些实施方式中，所有的靶标细菌都是李斯特菌(Listeria)。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、芽孢杆菌科细菌(Bacillaceaebacterium)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、芽孢杆菌科细菌(Bacillaceaebacterium)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的至少一种。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第三套靶标细菌并且包括编码第三标记的异源核酸序列的第三类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第四套靶标细菌并且包括编码第四标记的异源核酸序列的第四类的噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第五套靶标细菌并且包括编码第五标记的异源核酸序列的第五类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第六套靶标细菌并且包括编码第六标记的异源核酸序列的第六类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第七套靶标细菌并且包括编码第七标记的异源核酸序列的第七类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第八套靶标细菌并且包括编码第八标记的异源核酸序列的第八类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第九套靶标细菌并且包括编码第九标记的异源核酸序列的第九类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于能侵染第十或更多套靶标细菌并且包括编码第十或更多标记的异源核酸序列的第十或更多类噬菌体。在一些实施方式中，使用三类或多类噬菌体，所有的三种或多种标记是不同的。在一些实施方式中，使用三类或多类噬菌体，所有的三种或多种标记是相同的。在一些实施方式中，使用三类或多类噬菌体，2、3、4、5、6、7、8或9种标记是相同的。
在一些实施方式中，在所述方法中使用的噬菌体的至少一类选自A511、P100、LP40、LP44、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125和LP143及其衍生物。在一些实施方式中，在所述方法中使用的噬菌体的每类选自A511、P100、LP40、LP44、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125和LP143及其衍生物。
在一些实施方式中，第一标记为可筛选的标记。在一些实施方式中，第一标记为荧光素酶。在一些实施方式中，所述荧光素酶为与SEQIDNO:2至少70％是一致性的。在一些实施方式中，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致性的。
在一些实施方式中，第一类噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc及其那些噬菌体的衍生物。在一些实施方式中，第一类噬菌体选自LP40:nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
在一些实施方式中，第二标记为可筛选的标记。在一些实施方式中，第二标记为荧光素酶。在一些实施方式中，所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致性的。在一些实施方式中，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致性的。
在一些实施方式中，第二类噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。在一些实施方式中，第二类噬菌体选自LP40:nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
在一些实施方式中，所述方法包括将所述样品与A511::nluc、P100::nluc和LP124::nluc接触。在一些实施方式中，所述方法包括将所述样品与A511::nluc和LP124::nluc接触。在一些实施方式中，所述方法包括将所述样品与A511::nluc、LP40::nluc和LP124::nluc接触。
在一些实施方式中，所述方法包括将所述样品同时暴露于第一类噬菌体和第二类噬菌体。
在一些实施方式中，所述样品为环境样品。
在一些实施方式中，检测到所述样品中的第一标记，表明在所述样品中存在第一套靶标细菌中的细菌。在一些实施方式中，检测到所述样品中的第二标记，表明在所述样品中存在第二套靶标细菌中的细菌。在一些实施方式中，第一标记和第二标记相同，并且检测到所述样品中的标记，表明在所述样品中存在第一套靶标细菌以及第二套靶标细菌中的至少一种细菌。
在一些实施方式中，对环境样品分析的假阳性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。在一些实施方式中，对环境样品分析的假阴性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。
在一些实施方式中，在将所述样品暴露于噬菌体之前，所述样品被暴露于代谢刺激条件下。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括在将所述样品暴露于能侵染靶标细菌的噬菌体之前，将所述样品在代谢刺激条件下孵育一段时间。
在某些实施方式中，所述方法包括提供一种样品，将所述样品暴露于包含编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，并分析被暴露的样品的标记的存在。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于包含编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511和重组子P100。在一些实施方式中，在所述样品中检测到标记表明在所述样品中存在李斯特菌(Listeria)。
在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少一个种。在一些实施方式中，在所述样品中检测到所述标记表明在所述样品中存在选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少一个种。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少一个种。在一些实施方式中，在所述样品中检测到标记表明在所述样品中存在选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少一个种。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自11、22、37和56的无害李斯特菌(Listeriainnocua)的至少一种sigB等位型，并且在所述样品中检测到所述标记表明存在选自11、22、37和56的无害李斯特菌(Listeriainnocua)的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，所述至少一种李斯特菌噬菌体能侵染无害李斯特菌(Listeriainnocua)的sigB等位型11、22、37和56。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的至少一种核糖核酸型，并且在所述样品中检测到所述标记表明存在选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的至少一种核糖核酸型。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的核糖核酸型DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)至少一种sigB等位型，并且在所述样品中检测到所述标记表明存在选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的sigB等位型3、20、24和35。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自15、27、32和89的威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的至少一种sigB等位型，并且在所述样品中检测到标记表明存在选自15、27、32和89的威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的sigB等位型15、27、32和89。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少两个种。在一些实施方式中，靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少三个种。在一些实施方式中，靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少四个种。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、芽孢杆菌科细菌(Bacillaceaebacterium)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、芽孢杆菌科细菌(Bacillaceaebacterium)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的至少一种。在一些实施方式中，靶标细菌全部为李斯特菌(Listeria)。
在一些实施方式中，所述标记为可筛选的标记。在一些实施方式中，所述标记为荧光素酶。在一些实施方式中，所述荧光素酶为与SEQIDNO:2至少70％是一致性的。在一些实施方式中，所述荧光素酶与SEQIDNO:4有至少70％的一致性。在一些实施方式中，所述噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。在一些实施方式中，所述噬菌体选自LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
在一些实施方式中，所述样品为环境样品。
在一些实施方式中，在所述样品中检测到所述标记，表明在所述样品中存在第一套靶标细菌的存在。
在一些实施方式中，对环境样品分析的假阳性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少。在一些实施方式中，对环境样品分析的假阴性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少。在一些实施方式中，在所述样品被暴露于所述噬菌体之前，所述样品被暴露于代谢刺激条件。
在另一方面，本公开提供了含有编码标记的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体。在一些实施方式中，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少一个种。在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少一个种。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自11、22、37和56的无害李斯特菌(Listeriainnocua)的至少一种sigB等位型和产生的标记。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括无害李斯特菌(Listeriainnocua)的sigB等位型11、22、37和56。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的至少一种核糖核酸型。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的核糖核酸型DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的sigB等位型3、20、24和35。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自15、27、32和89的威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的sigB等位型15、27、32和89。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少两种。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)中的至少三种。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、BaciUaceaebacterium、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的至少一种。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、BaciUaceaebacterium、Serratiaproteamaculans、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌全部为李斯特菌(Listeria)。
在一些实施方式中，所述标记为可筛选的标记。在一些实施方式中，所述标记为荧光素酶。在一些实施方式中，所述荧光素酶为与SEQIDNO:2至少70％是一致性的。在一些实施方式中，所述荧光素酶为与SEQIDNO:4至少70％是一致性的。
在一些实施方式中，所述噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc和LP143::ffluc。在一些实施方式中，所述噬菌体选自LP124::nlucandLP125::nluc。
在一些实施方式中所述重组李斯特菌噬菌体包括与SEQIDNO:2的一致性至少70％的编码荧光素酶的异源核酸序列，并且重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。
在一些实施方式中重组李斯特菌噬菌体包括与SEQIDNO:4的一致性至少70％的编码荧光素酶的异源核酸序列，并且所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体选自LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体检测环境样品中的靶标细菌有5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的假阳性率。在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体检测环境样品中的靶标细菌有5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的假阴性率。
在另一方面，本公开提供了包含重组李斯特菌噬菌体的组合物。在一些实施方式中所述组合物包括：包含编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，以及至少一种非噬菌体组分，所述非噬菌体组分选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种。在一些实施方式中，所述组合物包括1,2-丙二醇、2-氨基乙醇、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖(LactulosemSucrose)、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。在一些实施方式中所述组合物包括A511::nluc、P100::nluc和LP124::nluc。在一些实施方式中所述组合物包括A511::nluc和LP124::nluc。在一些实施方式中所述组合物包括A511::nluc、LP40::nluc和LP124::nluc。
在一些实施方式中所述组合物包括：含有编码标记的异源核酸序列的至少两种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。在一些实施方式中所述组合物进一步包括至少一种非噬菌体组分，所述非噬菌体组分选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种。在一些实施方式中所述组合包括1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖(LactulosemSucrose)、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。
在另一方面，本公开提供了加工制品。在一些实施方式中所述加工制品包括含有编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LPl0l及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，以及一种含有至少一种非噬菌体组分的溶液，所述非噬菌体组分选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种。在一些实施方式中，所述加工制品包括含有溶液的容器，所述溶液包括1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖(LactulosemSucrose)、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。在一些实施方式中所述加工制品包括A511::nluc、P100::nluc和LP124::nluc。在一些实施方式中所述加工制品包括A511::nluc和LP124::nluc。在一些实施方式中所述加工制品包括A511::nluc、LP40::nluc和LP124::nluc。
在一些实施方式中所述加工制品包括含有编码标记的异源核酸序列的至少两种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，以及含有至少一种非噬菌体组分的溶液，所述非噬菌体组分选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种。在一些实施方式中所述加工制品包括含有溶液的容器，所述溶液包括1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖(LactulosemSucrose)、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。
在另一个方面，本公开提供了鉴定噬菌体靶标微生物的方法，所述靶标微生物可以是细菌或古菌。在一些实施方式中，所述方法包括将多个不同类型的细菌的液体培养样品暴露于噬菌体，并且检测所述噬菌体是否侵染所述多个不同类型的细菌。在一些实施方式中，检测噬菌体是否侵染多个不同细菌的类型包括测量所述样品中的细胞澄清。在一些实施方式中，所述样品中的细胞澄清表明所述样品中细菌的类型是噬菌体的靶标细菌。
在一些实施方式中，所述噬菌体包括编码第一标记的异源核酸序列。在一些实施方式中，检测噬菌体是否侵染多个不同类型的细菌是通过分析所述多个样品中的标记的存在进行的。在一些实施方式中，在所述样品中检测到标记表明所述样品中细菌的类型是噬菌体的靶标细菌。
附图说明
图1为cps基因序列的比对。
图2为由图1的cps基因序列编码的蛋白质序列的比对。
图3为插入的萤火虫荧光素酶的编码序列的比对。
图4为插入的nanoluc荧光素酶的编码序列的比对。
具体实施方式
除非在本发明中另有说明，使用的与本公开有关的科技术语具有本领域的普通的技术人员通常理解的意思。进一步地，除非由上下文需要，单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。一般地，使用的与在本发明中描述的生物化学、酶化学、分子与细胞生物学、微生物学、遗传与蛋白质以及核酸化学与杂交的技术有关的术语是本领域经常熟知和常用的术语。在本发明引用的某些参考资料和其他文件明通过引用被明确地纳入到本发明中。此外，在本发明引用的所有的基因银行(Genbank)或其他序列数据库记录通过引用被明确地纳入到本发明中。在冲突的情况下，由本发明的说明书，包括定义，来限制。材料、方法和实施例仅具有说明性并不意指具有限制性。
本公开的方法和技术一般根据本领域熟知的常规方法进行并且如被本说明书引用并讨论的各种一般以及更具体的参考资料所描述的，另有说明者除外。参见例如，Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001),Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992andSupplementsto2002),TaylorandDrickamer,IntroductiontoGlycobiology,OxfordUniv.Press(2003),WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,N.J.，HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolI,CRCPress(1976),HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolII,CRCPress(1976),EssentialsofGlycobiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。很多分子生物学和噬菌体遗传应用技术在Clokieetal.,Bacteriophages:MethodsandProtocols,Vols.1and2(MethodsinMolecularBiology,Vols.501and502),HumanaPress,NewYork,N.Y.(2009)中有描述，其通过引用被纳入到本发明中。
本公开意指在互联网上发表的某些氨基酸和核酸序列以及互联网上的其他信息的序列数据登记(例如UniProt/SwissProt或基因银行纪录)。熟练的技术人员理解互联网上的信息，包括序列数据登记，是实时更新的，并且，例如，用来引用特定序列的引用次数可以改变。由互联网上的序列信息或其他信息的公共数据构成参考资料，容易理解这样的变化能够发生，互联网上的特定实施方式的信息可来可去。因为熟练的技术人员能够在互联网上找到等同的信息，有互联网网页地址或序列数据登记的参考资料显示被谈及的问题的信息传播的有效性和公开性。
在本发明的噬菌体、组合物、方法以及其他实施方式被公开和描述之前，可以理解本发明使用的术语仅是为了描述特定的实施方式的目的，并不是意指具有限制性。必须注意，如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的“一种”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。
本发明中使用的术语“包括”与“包含”或“含有”同义，并且是包罗广泛的或开放式的，以及不排除额外的、没有引用的成员、元素或方法步骤。
如本发明中使用的术语“在体外”意指事件发生在人工环境中，例如在试管或反应器中，在细胞培养中、在陪替氏培养皿中等等，而不是在生物体(例如动物、植物或微生物)中。
如本发明中使用的术语“在体内”意指事件发生在生物体(例如动物、植物或微生物)内。如果部分分析发生在培养的微生物的外面，至少部分地发生在微生物体内的分析也可以发生在体外。
如本发明中使用的术语“分离的”意指一种物质或实体已经(1)在最初制备时(不论是在自然界中还是在实验环境中)，从与其相关的至少部分组分中分离出来，和/或(2)被人工生产、制备和/或制造出来。分离的物质和/或实体可以从与其最初有关的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其他组份中分离出来。在一些实施方式中，分离的试剂不只是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者不只是约99％的纯度。如在本发明中使用的，如果物质基本上不含其他组分的，那么该物质是“纯的”。
如本发明中使用的术语“肽”意指短肽，例如其一般含有少于约50个氨基酸并且一般更少于约30个氨基酸。如本发明使用的术语包括模仿其结构从而具有其生物功能的同型物和类似物。
如本发明中使用的术语“多肽”包括天然存在的和非天然存在的蛋白质和其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体或多聚体。进一步地，多肽可以包括有一个或多个不同活性的多个不同的域。为了避免怀疑，“多肽”可以是大于两个氨基酸的任何长度。
术语“分离蛋白质”或“分离多肽”是一种蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽凭借其派生起源或来源(1)与伴随其在原生状态下的天然的相关组分不相关；(2)以在自然界中不能找到的纯的形式存在，其中纯度可以以相对于其他细胞物质的存在进行判定(例如，与来自一物种的其他蛋白质是分开的)；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)不存在于自然界中(例如，其是在自然界中存在的多肽片段或其包括在自然界中不能找到或非标准肽键键合的氨基酸类似物或衍生物或)。因此，多肽是以化学的方式合成或从其自然来源的细胞中在细胞系统中被合成，其将从其自然相关的组分中被“分离”出来。通过使用本领域已知的纯化技术分离的多肽或蛋白质也可以呈现出与自然相关的组分基本分开。如这样定义的，“分离”不需要如此描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽从合成其的细胞中被物理地删除。
本发明使用的术语“多肽片段”意指有删除的多肽，例如与全长多肽(如自然存在的蛋白质)相比，氨基末端和/或羧基末端删除。在一个实施方式中，多肽片段是一段连续序列，在所述连续序列中，片段的氨基酸序列与自然存在的序列中的相关位置一致。片段一般至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长，或至少12、14、16或18个氨基酸长，或至少20个氨基酸长，或至少25、30、40或45个氨基酸，或至少50或60个氨基酸长，或至少70个氨基酸长。
术语“融合蛋白”意指包含带有异源氨基酸序列的多肽或片段的一种多肽。融合蛋白是有用的，因为它们能被构建成含有两种或多种期望功能的原件，所述原件可以来自两种或多种不同的蛋白质。融合蛋白包括来自令人感谢趣的多肽的至少10个连续的氨基酸，或至少20或30个氨基酸，或至少40、50或60个氨基酸，或至少70、100或125个氨基酸。包含在融合蛋白质中的异源多肽通常在长度上有至少6个氨基酸，或在长度上有至少8个氨基酸，或在长度上有至少15、20或25个氨基酸。包含较长的多肽(例如IgGFc区，甚至是整个蛋白质，例如绿色荧光蛋白(“GFP”)含有发色基团的蛋白)的融合蛋白有特殊的用途。融合蛋白可以通过构建编码多肽的核酸序列，或阅读框内的编码不同蛋白质或肽的核酸序列的核酸序列片段，并表达所述融合蛋白而产生。或者，融合蛋白可以通过交联多肽或其片段到另一种蛋白质上以化学的方法制备。
如本发明使用的，如果编码一种蛋白质的核酸序列与编码第二种蛋白质的核酸序列有相似的序列，那么这种蛋白质与第二种蛋白质具有“同源性”或是“同源的”。或者，如果两种蛋白质有相似的氨基酸序列，那么一种蛋白质与第二种蛋白质具有同源性。(因此，定义的术语“同源蛋白质”的意思是两种蛋白质有相似的氨基酸序列。)如本发明使用的，氨基酸序列的两个区的同源性(特别是关于预测结构的相似性)被解释为在功能上暗含有相似性。
当在参考资料中将“同源的”用于蛋白质或肽时，公认的是不同的残基位置往往因保守氨基酸的替换而不同。“保守氨基酸的替换”是氨基酸残基在该处被有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的含有侧链(R基团)的另一个氨基酸残基替换。总的来说，保守氨基酸替换基本上不会改变蛋白质的功能特性。一旦两种或多种氨基酸序列由于保守替换而相互不同，那么该序列的一致性或同源程度可以被调整到正确的替换保守性。做出这一调整的手段对本领域的技术人员来讲是熟知的。见例如Pearson,1994,MethodsMol.Biol.24:307-31and25:365-89。
下面六个基团分别含有相互保守替换的氨基酸：1)丝氨酸、苏氨酸，2)天冬氨酸、谷氨酸，3)天冬酰胺酸、谷氨酰胺，4)精氨酸、赖氨酸，5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸和6)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
多肽序列的同源性还意指具有一定百分比的序列一致性，其一般用序列分析软件来测定。见例如遗传计算机组(GCG)序列分析软件包，威斯康星大学生物技术中心，威斯康星州，麦迪逊，大学大道910号，53705。蛋白质分析软件利用同源性测量匹配相似序列归于各种替换、删除和其他修饰，包括保守氨基酸替换。例如，GCG包括例如“Gap”和“Bestfit”程序，所述程序能在缺省参数下用来确定接近的相关多肽之间的序列的同源性或序列的一致性，例如来源于生物不同种的同源的多肽或野生型蛋白质和其突变蛋白。见例如GCGVersion6.1。
当将特定的多肽序列与含有来源于不同生物的大量序列进行比较时，示范性算法为BLAST计算机程序(Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；GishandStates、NatureGenet.3:266-272(1993)；Maddenetal.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)；ZhangandMadden,GenomeRes.7:649-656(1997))，特别是blastp或tblastn(Altschuletal.、NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997))。
BLASTp的示范性参数为：期望值：10(缺省)，过滤器：seg(缺省)，打开一个空位的成本：11(缺省)，延伸一个空位成本：1(缺省)，最大比对：100(缺省)，字长：11(缺省)，描述的个数：100(缺省)，罚分矩阵：BLOWSUM62。用于同源性比较的多肽序列的长度一般至少约16个氨基酸残基，或至少约20个残基，或至少约24个残基，或至少约28个残基，或多于约35个残基。当检索含有大量不同生物的序列的数据库时，比较氨基酸序列可能是有用的。用氨基酸序列检索可以通过算法而不是本领域已知的blastp来测量。例如，多肽序列可以用FASTA(GCG版本6.1中的一个程序)来比较。FASTA提供了怀疑和检索序列之间的比对以及最佳重叠区域的序列一致性的百分比。Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990)。例如氨基酸序列的序列一致性百分比可使用GCGV版本6.1中提供的带有缺省参数的FASTA来确定(2个字长和PAM250得分矩阵)，并通过引用被纳入到本发明中。
在一些实施方式中，如果聚合物分子的序列有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的一致性，那么它们(例如多肽序列或核酸序列)被认为是彼此“同源的”。在一些实施方式中，如果聚合物分子的序列有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的相似性，那么它们被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列之间的比较(核苷酸序列或氨基酸序列)。在一些实施方式中，如果两个核苷酸序列编码的多肽中的至少一段至少约20个氨基酸具有至少约50％的一致性、至少约60％的一致性、70％的一致性、至少约80％的一致性或至少约90％的一致性，那么它们被认为是同源的。在一些实施方式中，同源核苷酸序列有编码一段至少4-5个唯一特定的氨基酸的能力的特性。相对于彼此，这些氨基酸的一致性和大致的间距必然被认为核苷酸序列的同源性。在一些实施方式中的长度小于60个核苷酸的序列，同源性由编码一段至少4-5个唯一特定的氨基酸的能力来确定。在一些实施方式中，如果两个蛋白质序列中的至少一段至少约20个氨基酸具有至少约50％一致性、至少约60％一致性、至少约70％一致性、至少约80％或至少约90％的一致性，那么它们被认为是同源的。
如在本发明中使用的，“修饰衍生物”是指多肽或其片段与参照多肽序列在一级结构上实质上是同源的，但是修饰衍生物包括例如在体内或体外的化学或生物化学的修饰，或其引入了在参考多肽中不能找到的氨基酸。这种修饰包括例如，乙酰化、羧基化、磷酸化、糖基化、泛素化、例如利用放射性核素标记，以及各种酶修饰，并很容易被本领域的技术人员接受。用于该目的的标记多肽的各种方法和各种有用的替换或标记是本领域的技术人员熟知的，并且包括放射性同位素(例如1251、32P、35S和3H)、结合到标记的抗配体(例如抗体)的配体、荧光、化学发光剂、酶和能特异结合标记配体的成对成员的抗配体。标记的选择依赖于需要与引物结合容易度的灵敏性、稳定性需要以及可用仪器。标记多肽的方法是本领域技术人员熟知的。见例如Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992andSupplementsto2002)。
如在本发明中使用的，“多肽突变体”或“突变蛋白”是指与参照蛋白质或多肽(例如天然或野生型蛋白质)相比，序列含有一个或多个氨基酸的插入、重复、缺失、重排或替换的多肽。突变蛋白可以有一个或多个氨基酸的点替换、一个或多个插入和/或缺失，和/或在氨基或羧基末端的任何一端或两端的氨基酸序列的截短，在所述点替换中，在一个位置的单一氨基酸已被改变为另一个氨基酸，在所述插入和/或缺失中，一个或多个氨基酸在参照蛋白质序列中分别被插入或缺失。与参照蛋白质相比，突变蛋白具有相同或不同的生物活性。
在一些实施方式中，突变蛋白与其相对参照多肽或蛋白质有例如至少70％的全序列的同源性。在一些实施方式中，突变蛋白与野生型蛋白质或多肽有至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的全序列同源性。在其他实施方式中，突变蛋白呈现出至少95％的序列一致性，或98％、或99％、或99.5％或99.9％的全序列的一致性。
如在本发明中使用的，“重组子”是指生物分子，例如基因或蛋白质(1)已从其自然存在的环境中删除；(2)与在自然界中的能找到基因中的所有或部分多核苷酸不相关；(3)能有效连接到在自然界中不能被连接的多核苷酸；(4)不存在于自然界中。术语“重组子”可用于关于克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸的类似物、由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由该核酸编码的蛋白质和/或mRNA。因此，例如，如果其由存在于细胞中的重组基因合成的mRNA合成，那么例如，由微生物合成的蛋白质是重组蛋白。如果噬菌体包括重组生物分子，其是“重组子”。因此，例如但并不构成限制，如果噬菌体的基因组包括重组核酸序列，那么噬菌体是重组子。
术语“多核苷酸”、“核酸分子”、“核酸”或“核酸序列”是指长度至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。术语包括DNA分子(例如cDNA或基因组的或合成的DNA)和RNA分子(例如mRNA或合成的RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物、非原生的核苷间键或两者的DNA或RNA的类似物。核酸可以是任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四链的、部分双链的、支链的、发卡式的、环状的或挂锁构象的形式。核酸(也指多核苷酸)可以包括RNA、cDNA、基因组DNA和合成形式以及上述混合的聚合物的正义链和反义链。它们可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，并且很容易被本领域的技术人员接受。这些修饰包括例如，标记、甲基化、用类似物、核苷酸间修饰(例如非电荷键，如甲基膦酸、磷酸二酯、磷酰胺、氨基甲酸盐等；电荷键，如磷硫酰和phosphorodithioates等；悬而未决的部分，如多肽；插入剂，如吖啶和补骨脂素等；螯合剂；烷化剂以及修饰键，如α-异头核酸等)替换一个或多个天然存在的核苷酸。也包括以其通过氢键和其他化学作用结合指定序列的能力模仿多核苷酸的合成分子。这些分子在本领域中是已知的，并且包括例如，其中的肽键代替分子骨架中的磷酸键。其它修饰可以包括，例如类似物，在所述类似物中核糖环包括桥接部分或例如“锁定”核酸中发现的修饰的其他结构。
“合成的”RNA或混合聚合物是在细胞外面产生的RNA，例如化学合成的RNA。
如本发明中使用的术语“核酸片段”是指具有缺失的核酸序列，例如与全长参照的核苷酸序列相比，5'-末端或3'-末端的缺失。在一个实施方式中，核酸片段为连续的序列，在所述序列中片段的核苷酸序列与天然存在的序列中的相关位置是一致的。在一些实施方式中，片段为至少10、15、20或25核苷酸长，或至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150核苷酸长。在一些实施方式中，核酸序列的片段是开放阅读框序列的片段。在一些实施方式中，所述片段编码蛋白质的多肽片段(如在本发明中定义的)，所述蛋白质的多肽片段有开放阅读框核苷酸序列编码。
如本发明中使用的，如果异源序列被放置到邻近内生核酸序列，以至于该内源核酸序列的表达发生了改变，那么生物(包括噬菌体)基因组中的内生核酸序列(或该序列的编码的蛋白质产品)在本发明中被认为是“重组子”。在其上下文中，无论异源序列是其自身内源的(来源于相同的宿主细胞或其子代)还是外源的(来源于不同的宿主细胞或其子代)，异源序列都是不与内生核酸序列天然相邻的序列。通过举例的方式，一个启动子序列可以替换宿主细胞的基因组中的一个基因的内源启动子(例如通过同源重组)，以至于该基因改变了表达模式。现在该基因变成了“重组子”，因为其与天然位于其侧翼的至少一些序列隔开了。
如果核酸含有不是天然存在于基因组中的相关核酸的任何修饰，那么其也被认为是“重组子”。例如，如果内源编码序列含有插入、缺失或人工引入的点突变(例如通过人为干涉)，那么其被认为是“重组子”。“重组核酸”也包括在同源位点整合到宿主细胞染色体中的核酸和作为游离体的本发明构建的核酸。以噬菌体为参照，“重组噬菌体基因组”是含有插入、缺失或人工引入的点突变(例如通过人为干涉)的噬菌体基因组。
如本发明中使用的，短语参照核酸序列的“简并变异”包括能根据标准遗传密码子翻译来提供与参照核酸序列翻译的序列一致的氨基酸序列的核酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”用于表示能与靶标核酸序列杂交的寡核苷酸，所述靶标核酸序列在序列上不必须一致，但在一个或多个特定的部分彼此是同源的。
在上下文的核酸序列中的术语“序列一致性百分比”或“一致的”是指当最大对应性比对时，两个序列中的残基相同。序列一致性比较的长度可以超过一段至少约9个核苷酸，通常至少约20个核苷酸、更通常的是至少约24个核苷酸、特别是至少约28个核苷酸、更特别的是约32个以及甚至更特别的是至少约36个或更多的核苷酸。在本领域中已知有许多不同的算法能被用于测量核苷酸序列的一致性。例如，多核苷酸序列可用FASTA、Gap或Bestfit来比较，所述FASTA、Gap或Bestfit是威斯康星州，麦迪逊，威斯康星包裹版本10.0，遗传计算机组(GCG)的程序。FASTA提供怀疑和检索序列之间的比对和最佳重叠区域的序列一致性百分比。Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990)。例如，核酸序列间的序列一致性百分比能用提供的GCG版本6.1的带有缺省参数(字长为6和NOP因子得分矩阵)的FASTA或带有缺省参数的Gap来确定，其被通过引用纳入本发明中。或者，序列能用计算机程序BLAST(Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；GishandStates,NatureGenet.3:266-272(1993)；Maddenetal.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)；ZhangandMadden,GenomeRes.7:649-656(1997))，特别是blastp或blastn(Altschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997))比较。
术语“实质上同源性”或“实质上相似性”，当指核酸或其片段时，如用任何熟知的序列一致性算法(例如上述的FASTA、BLAST或Gap)测量，表明当适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)进行最佳比对时，有至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基的核苷酸序列一致性。
或者，当核酸或其片段能与另一核酸、另一核酸的一条链或其互补链在严谨杂交条件下杂交时，存在实质上同源性或相似性。在上下文的核酸杂交实验中的“严谨杂交条件”和“严谨洗涤条件”依赖于多种不同的物理参数。核酸杂交被如盐浓度、温度、溶剂、杂交种的碱基组成、互补区域的长度以及杂交核酸之间的错配核苷酸碱基的数量的条件所影响，并很容易被本领域的技术人员接受。本领域的普通技术人员能够知道如何改变这些参数来实现特别严谨的杂交。
一般而言，在一套特定的条件下的特定DNA杂交的“严谨杂交”在低于热熔点(Tm)约25℃的温度下进行。在一套特定的条件下的特定DNA杂交的“严谨洗涤”在低于Tm约5℃的温度下进行。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。见Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989),page9.51。为了本发明的目的，关于作为水相杂交的溶液相杂交(即如无甲酰胺)，“严谨条件”被定义为用于溶液相杂交的液相杂交，在65℃下在6×SSC(其中20xSSC含有3.0MNaCl和0.3M柠檬酸钠)，1％SDS中8-12个小时，然后在65℃下0.2×SSC、0.1％SDS中进行2次的20分钟洗涤。
如在本发明中使用的，“表达控制序列”是指可操纵地连接表达的编码序列并影响编码序列表达的多核苷酸序列。表达控制序列为控制转录、转录后事件和核酸序列翻译的序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列，高效的RNA处理信号例如剪切和多腺苷酸化信号，稳定细胞质中的mRNA的序列，提高转录效率的序列(例如核糖体结合位点)，增强蛋白质稳定性的序列，以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的特性根据宿主生物有所不同，在原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”至少旨在包括表达必须存在的任何组件，并且还能包括额外的有益的存在组件，例如前导序列和融合伴侣序列。
如在本发明中使用的，“可操纵地连接”或“可操作地连接”表达控制序列是指一个连锁，在该连锁处，表达控制序列与感兴趣的基因是连续的从而控制感兴趣的基因以及控制序列的表达，所述控制序列的表达以反式或在远处起作用以控制感兴趣的基因。
如在本发明中使用的，“载体”意指能运载已与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，所述质粒一般是指额外的DNA片段可被连接到其中的环状双链DNA环，但也包括线状双链分子，例如由聚合酶链式反应(PCR)扩增或用限制性酶处理环状质粒得到的那些线状双链分子。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一类载体为病毒载体，其中额外的DNA片段可以被连接到病毒基因组中(下面进行更详细的讨论)。某些载体有在将其导入到的宿主细胞中自主复制的能力(例如具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体通过导入到宿主细胞中能被整合到宿主细胞的基因组中并由此随同宿主基因组一起复制。而且，某些载体有直接表达可操纵地连接到其上的基因的能力。这些载体在本发明中被称为“重组表达载体”(或简单地称为“表达载体”)。
如在本发明中使用的，术语“重组宿主细胞”(或简单地称为“重组细胞”或“宿主细胞”)意指重组核酸例如重组载体已被导入其中的细胞。在某些情况下，单词“细胞”被指定一种类型的细胞名称代替。例如，“重组微生物”是微生物宿主细胞的一种重组细胞。如在本发明中使用的，应当理解这些术语不仅意指特定的主体细胞，而且意指该细胞的子代。因为由于突变或者环境影响，某些修饰可以存在于成功的后代中，这种子代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍然被包括在术语“重组宿主细胞”、“重组细胞”和“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是生长在培养物中的分离细胞或细胞系，或者可以是在活体组织或生物体中的细胞。
如在本发明中使用的，“细菌噬菌体”是指感染细菌的病毒。相似地，“古菌噬菌体(archaeophage)”是指感染古菌的病毒。术语“噬菌体”不但用于指两类病毒而且在某些情况下，如由上下文显示的那样，也可特别地被用作细菌噬菌体或古菌噬菌体的简写。细菌噬菌体和古菌噬菌体是专性细胞内的寄生物，所述寄生物通过利用一些或所有的宿主的生物合成机器在细菌/古菌内繁殖(即感染细菌的病毒)。虽然不同的细菌噬菌体和古菌噬菌体可能包括不同的物质，但是它们都包括核酸和蛋白质，并且在某种条件下，其能被封装在脂质膜中。取决于噬菌体，核酸可以为DNA或RNA，但是其不能同时为DNA和RNA，并且其能以各种形式存在。
如在本发明中使用的，“异源核酸序列”为位于其通常不会存在的基因组中的位置的任何序列。异源核酸序列可以包括非自然地存在于特定的细菌/古菌和/或噬菌体中的序列，或其可仅包括在细菌/古菌和/或噬菌体中自然找到，但放置在基因组中的非正常存在的位置中的序列。在一些实施方式中的所述异源核酸序列不是天然的噬菌体序列；在一些实施方式中即使来源于不同的噬菌体，其仍然是天然噬菌体序列；然而在其他实施方式中，其是仍然自然地存在于初始噬菌体的基因组中，但然后被转移到其非自然存在的另一位点的序列，致使其为那个新位点的异源序列。
“起始噬菌体”或“起始噬菌体基因组”是从自然或人为环境中分离的噬菌体，所述噬菌体没有被遗传工程或该噬菌体的基因组修饰过。
“重组噬菌体”或“重组噬菌体基因组”是包括通过插入异源核酸序列到噬菌体或噬菌体的基因组中的被遗传修饰的基因组。在一些实施方式中，起始噬菌体的基因组被重组DNA技术修饰导入异源核酸序列到被定义位点的基因组中。在一些实施方式中，异源序列在没有内源噬菌体基因组核苷酸相应缺失的情况下被导入。换句话说，如果碱基N1和N2在起始噬菌体基因组中相邻，异源序列被插入到N1和N2之间。因此，在由此产生的重组基因组中，异源序列的两侧是核苷酸N1和N2。在某些情况下，插入异源序列并且移除或由外源序列代替内源核苷酸。例如，在一些实施方式中，外源序列被插入代替一些或全部的被移除的内源序列。在一些实施方式中，内源序列从远离外源序列插入位点的噬菌体基因组中的一个位置移除。
“噬菌体宿主细胞”是一种能被噬菌体侵染以产生子代噬菌体颗粒的细胞。
“可操作地连接”或“可操作地连接”表达控制序列是指一个连锁，在所述连锁处，表达控制序列与感兴趣的编码序列是邻接的，从而控制感兴趣的编码序列表达，同时表达控制序列以反式或在远处起作用以控制编码序列的表达。
“编码序列”或“开放阅读框”是编码多肽或蛋白质的核苷酸序列。编码序列的末端为起始密码子和终止密码子。
如在本发明中使用的，术语“表达控制序列”是指其与可操纵地连接到表达的编码序列并影响编码序列表达的多核苷酸序列。表达控制序列为控制转录、转录后事件和核酸序列翻译的序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效RNA处理信号例如剪切和多腺苷酸化信号，稳定细胞质的mRNA的序列，提高转录效率的序列(例如核糖体结合位点)，增强蛋白质稳定性的序列，以及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的特性根据宿主生物有所不同，在原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”至少旨在包括表达必须存在的所有组件，同时还可以包括其他组件，所述其他组件的存在是有益处的，例如前导序列和融合伴侣序列。
如在本发明中使用的，“噬菌体基因组”包括天然存在的噬菌体基因组和其衍生物。通常(虽然不是必须的)，所述衍生物具有如亲本在相同的宿主中繁殖的能力。在一些实施方式中，天然存在的噬菌体基因组和衍生的噬菌体基因组之间的唯一区别为，如果基因组是线性，从噬菌体基因组的至少一个末端缺失或添加核苷酸中的至少一种；或如果基因组是环状的，在基因组的至少一个位点缺失或添加核苷酸中的至少一种。
如在本发明中使用的，“靶标细菌”为能被噬菌体侵染并产生可检测输出的细菌。例如，可检测输出包括细胞裂解。因此，由噬菌体造成的细菌细胞的裂解表明细菌细胞是那种噬菌体的“靶标细菌”。另一个可检测输出的例子为由噬菌体侵染细菌细胞后标记的表达。合适的标记包括RNA和多肽。
如在本发明中使用的，“标记”包括选择和/或可筛选的标记。如在本发明中使用的，“选择标记”为在一种试剂的存在或缺乏的情况下，赋予细胞具有生长标记的能力，所述试剂分别抑制或刺激不表达该标记的相似的细胞生长。所述细胞也可以说由于它们的选择标记的表达，因而具有“选择表型”。例如，在氨苄青霉素存在于具有并表达氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的细胞的情况下，所述基因赋予了生长的能力。(见Sutcliffe,J.G.,ProcNatlAcadSciUSA.1978August；75(8):3737-3741.)。其他非限制性的示例包括赋予了对氯霉素、卡那霉素和四环素抗性的基因。其他标记包括URA3、TRP和LEU，在分别缺乏所述尿嘧啶、色氨酸和亮氨酸的情况下，其能生长。
如在本发明中使用的，“可筛选的标记”为一种可检测的标签，所述标签能被用作鉴定表达该标记的细胞的基准。所述细胞也可以说由于它们的可筛选的标记的表达，因而具有“可筛选的表型”。(总的来说，在选择标记的基因产物可用作鉴定独立表达该标记(基因产物的功能赋予了表达其的细胞可选择性)的细胞的基准的范围内，选择标记也可以起到可筛选的标记的作用)。能被差异检测和被重组噬菌体编码的任何分子能充当可筛选的标记。可筛选的标记可以是核酸分子或其一部分，例如单链或双链的RNA或DNA分子。或者，可筛选的标记可以是蛋白质或其一部分。合适的蛋白质标记包括促进形成可检测反应产物的酶。一个示例为化学发光蛋白质例如荧光素酶或其变异体，例如luxAB和β-牛乳糖。另一个示例为辣根过氧化物酶。用于产生发光信号的蛋白质分为两大类：直接产生光的那些(荧光素酶和相关蛋白)和作为化学级联一部分的间接产生光的那些(辣根过氧化物酶)。用于生物研究的最常见的生物发光蛋白质水母素和荧光素酶。第一种蛋白质来源于水母维多利亚水母(Aequoreavictoria)并能被用于测定溶液中的钙浓度。荧光素酶家族蛋白质已适应了广泛的实验目的。来源于萤火虫和花虫的荧光素酶是生物研究中最常用的。这些蛋白质从遗传学的角度也被分为两个不同的功能域，当所述蛋白质紧密合作时，所述功能域仅产生光。这两种蛋白的各种发射光谱位移的突变衍生物在过去的十年里已经产生。这些已经用于活细胞的多色成像和定位。用于产生化学发光信号的另一组蛋白质为过氧化物酶和磷酸酶。过氧化物酶在产生光的体系中产生氧化鲁米诺的过氧化氢。这些中使用最广泛为辣根过氧化物酶(HRP)，其已被广泛用于Western印迹和酶联免疫吸附实验(ELISA)中的检测。以相似的方式被使用的第二组蛋白质为碱性磷酸酶，其脱掉底物分子中的磷酸基团，破坏了其稳定性并起始了能产生发射光的级联。
其他合适的可筛选的标记包括荧光蛋白。荧光蛋白包括但不限于蓝色/UV荧光蛋白(例如，TagBFP、Azurite、EBFP2、mKalamal、Sirius、Sapphire和T-Sapphire)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、monomericMidoriishi-Cyan、TagCFP和mTFPl)、绿色荧光蛋白(例如，EGFP、Emerald、SuperfolderGFP、MonomericAzamiGreen、TagGFP2、mUKG和mWasabi)、黄色荧光蛋白(例如，EYFP、Citrine、Venus、SYFP2和TagYFP)、橙色荧光蛋白(例如，MonomericKusabira-Orange、mΚΟκ、mKO2、mOrange和mOrange2)、红色荧光蛋白(例如，mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple和mRuby)、远红外荧光蛋白(例如，mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、niNeptune和NirFP)、近红外荧光蛋白(例如，TagRFP657、IFP1.4和iRFP)、长斯托克斯转移蛋白(例如，mKeimaRed、LSS-mKatel和LSS-mKate2)、光激活荧光蛋白(例如，PA-GFP、PAmCherryl和PATagRFP)、光转变荧光蛋白(例如，Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGRl(绿色)、KikGRl(红色)、PS-CFP2、PS-CFP2、mEos2(绿色)、mEos2(红色)、PSmOrange和PSmOrange)和可开关型荧光蛋白(photoswitchablefluorescentproteins)(例如，Dronpa)。以列举的例子的多种变体和可供选择体对本领域的技术人员来说也是熟知的，并可以在适当的应用中被替换。
其他合适的标记包括表位。例如，包括用抗体或其他结合分子能检测到的表位的蛋白质是可筛选的标记的一个示例。例如，识别表位的抗体能直接连接到信号产生的部分(例如通过化学发光或荧光蛋白的共价连接)或其能用直接连接到信号产生部分的至少一种其他结合试剂(例如第二抗体)检测到。在一些实施方式中，表位不存在于噬菌体蛋白质或靶标微生物中，因此在样品中检测到表位表明包括表位的蛋白质由被重组噬菌体侵染后的微生物产生，所述重组噬菌体包括编码包括表位的蛋白质的基因。在其他实施方式中，标记可以为上下文的蛋白质中纯化的标签，所述蛋白质天然存在于靶标微生物或噬菌体中。例如，标签(如6-His标签)能被用于从其他细菌或噬菌体蛋白质中纯化异源蛋白质，并且纯化的蛋白质能随后被检测到，例如用抗体。
如在本发明中使用的，“环境样品”为从任何环境而不是实验室细胞培养环境中获得的样品。通常，虽然不是必须的，环境样品从包括a)不能支持细菌细胞最快生长和/或代谢的温度，b)不能支持细菌细胞最快生长和/或代谢的营养谱和c)不是分析中的噬菌体的靶标细菌的细菌细胞中的至少一种的环境中获得。在一些实施方式中，存在于环境样品中的一些或全部细菌不处于代谢活跃状态。不构成对本发明的现在，环境样品可以是从工厂、食品加工厂、兽源、食物、牲畜、药品环境和表面、学校、辅助生活中心、其他受限的区域以及家庭中获得。
A.重组噬菌体
本公开提供了评价噬菌体宿主范围的新方法。所述方法用于定义实施例中描述的一套噬菌体的靶标细菌。根据该分析的结果，噬菌体LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、LP143、A511和P100被选用于重组。示例描述了制备包括编码标记的异源核酸序列的噬菌体LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125、LP143、A511和P100的重组版本。例如，如在实施例中显示的，那些噬菌体对检测靶标细菌是有用的，因此进一步公开了整个申请。
据此，本公开提供了包括编码标记的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体。在一些实施方式中，所述重组噬菌体包括含有至少1kb的区域的基因组，所述至少1kb的区域包括与至少一种噬菌体的基因组的至少1kb的区域实质上同源，所述至少一种噬菌体选自LP40、LP48、LP99、LPlOl、LP124、LP125、LP143、A511和P100。在一些实施方式中，同源区域包括至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb或更多。在一些实施方式中，同源区域为重组李斯特菌噬菌体的整个基因组。在一些实施方式中，实质上同源为跨过同源区域，核苷酸序列的一致性至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％or99％。
本公开提供了噬菌体LP40(SEQIDNO:6)、LP48(SEQIDNO:8)、LP99(SEQIDNO:10)、LPl0l(SEQIDNO:12)、LP124(SEQIDNO:14)、LP125(SEQIDNO:16)、LP143(SEQIDNO:18)、A511(SEQIDNO:20)和P100(SEQIDNO:22的cps基因的氨基酸序列。据此，在一些实施方式中，本公开提供了编码标记的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体，其中所述重组李斯特菌噬菌体包括编码选自SEQIDNOS:6、8、10、12、14、16、18、20和22及其突变蛋白的蛋白质的核酸序列。
本公开还提供了噬菌体LP40(SEQIDNO:5)、LP48(SEQIDNO:7)、LP99(SEQIDNO:9)、LPlOl(SEQIDNO:11)、LP124(SEQIDNO:13)、LP125(SEQIDNO:15)、LP143(SEQIDNO:17)、A511(SEQIDNO:19)和P100(SEQIDNO:21)的cps基因的开放阅读框的核苷酸序列。据此，在一些实施方式中，本公开提供了编码标记的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体，其中所述重组李斯特菌噬菌体包括编码选自SEQIDNOS:5、7、9、11、13、15、17、19和21以及包括与其实质上同源的核酸序列的核酸序列。
在一些实施方式中，包括编码标记的异源核酸序列的所述重组李斯特菌噬菌体包括可筛选的标记。在一些实施方式中，所述标记为荧光素酶。在一些实施方式中，所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致性的。在一些实施方式中，所述荧光素酶由包括SEQIDNO:1的核酸序列或包括与SEQIDNO:1实质上同源的核酸序列编码。在一些实施方式中，所述重组李斯特菌噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。在一些实施方式中，所述重组李斯特菌噬菌体选自包括基因组的噬菌体，所述基因组包括与选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc中的至少一种噬菌体实质上同源。
在一些实施方式中，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致性的。在一些实施方式中，所述荧光素酶由包括SEQIDNO:3的核酸序列或包括与SEQIDNO:3实质上同源的核酸序列编码。在一些实施方式中，所述重组李斯特菌噬菌体选自LP::040::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。在一些实施方式中，所述重组李斯特菌噬菌体选自包括基因组的噬菌体，所述基因组包括与选自LP::040::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc中的至少一种噬菌体实质上同源。
在一些实施方式中，编码标记的所述异源核酸序列可操纵地连接重组噬菌体基因组中的至少一个调节元件，所述调节元件也与噬菌体基因组异源。在一些实施方式中，在靶标细菌中的编码标记的异源核酸序列的表达被与噬菌体基因组异源的调节元件广泛地控制。
在一些实施方式中，编码标记的所述异源核酸序列可操纵地连接重组噬菌体基因组中的至少一个调节元件，所述调节元件与噬菌体基因组是同源的。换句话说，编码标记的所述异源核酸序列凭借编码标记的异源核酸序列在起始噬菌体基因组中的位置可操纵地连接内源调节元件。在一些实施方式中，靶标细菌中的编码标记的异源核酸序列的表达被调节元件广泛地控制，所述调节元件与噬菌体基因组是同源的。在一些实施方式中，靶标细菌中的编码标记的异源核酸序列的表达被与噬菌体基因组是同源的调节元件部分地控制同时也被与噬菌体基因组是异源的调节元件部分地控制。
在一些实施方式中，包括编码标记的异源核酸序列所述重组李斯特菌噬菌体包括不止一种编码标记的异源核酸序列。在一些实施方式中，所述重组噬菌体包括多个拷贝的编码标记的相同的核酸序列(即拷贝编码相同的标记)。在一些实施方式中，所述重组噬菌体包括不止一类编码标记的核酸序列(即至少两个拷贝编码不同的标记)的拷贝。在一些实施方式中，不止一个拷贝位于重组噬菌体基因组相邻的位置。在其他实施方式中，不止一个拷贝的至少一个(直到全部)位于重组噬菌体基因组不相邻的位置。
在一些实施方式中，异源核酸序列的长度为至少100个碱基、至少200个碱基、至少300个碱基、至少400个碱基、至少500个碱基、至少600个碱基、至少700个碱基、至少800个碱基、至少900个碱基、至少1.0千个碱基(kb)、至少1.1kb、至少1.2kb、至少1.3kb、至少1.4kb、至少1.5kb、至少1.6kb、至少1.7kb、至少1.8kb、至少1.9kb、至少2.0kb、至少2.1kb、至少2.2kb、至少2.3kb、至少2.4kb、至少2.5kb、至少2.6kb、至少2.7kb、至少2.8kb、至少2.9kb、至少3.0kb、至少3.1kb、至少3.2kb、至少3.3kb、至少3.4kb、至少3.5kb、至少3.6kb、至少3.7kb、至少3.8kb、至少3.9kb、至少4.0kb、至少4.5kb、至少5.0kb、至少5.5kb、至少5.5kb、至少6.0kb、至少6.5kb、至少7.0kb、至少7.5kb、至少8.0kb、至少8.5kb、至少9.0kb、至少9.5kb、至少10kb或更多。在一些实施方式中，异源核酸序列的长度为500个碱基或更少、1,0kb或更少、1.5kb或更少、2.0kb或更少、2.5kb或更少、3.0kb或更少、3.5kb或更少、4.0kb或更少、4.5kb或更少、5.0kb或更少、5.5kb或更少、6.0kb或更少、6.5kb或更少、7.0kb或更少、7.5kb或更少、8.0kb或更少、8.5kb或更少、9.0kb或更少、9.5kb或更少或10.0kb或更少。在一些这样的实施方式中，所述异源核酸序列包括长度小于能包装进噬菌体颗粒的异源核酸序列的最大长度，所述噬菌体颗粒由噬菌体基因组编码并且包括噬菌体基因组。
在一些实施方式中，异源核酸序列的长度为100至500个碱基、200至1,000个碱基、500至1,000个碱基、500至1,500个碱基、1kb至2kb、1.5kb至2.5kb、2.0kb至3.0kb、2.5kb至3.5kb、3.0kb至4.0kb、3.5kb至4.5kb、4.0kb至5.0kb、4.5kb至5.5kb、5.0kb至6.0kb、5.5kb至6.5kb、6.0kb至7.0kb、6.5kb至7.5kb、7.0kb至8.0kb、7.5kb至8.5kb、8.0kb至9.0kb、8.5kb至9.5kb、或从9.0kb至10.0kb。
在一些实施方式中，异源核酸序列的长度与重组噬菌体基因组的总长度的比例为至少0.05、至少0.10、至少0.15、至少0.20，或至少0.25。在一些实施方式中，重组噬菌体基因组的长度与相应的起始噬菌体的基因组的长度的比例为至少1.05、至少1.10、至少1.15、至少1.20，或至少1.25。
在一些实施方式中，异源核酸序列在内源起始噬菌体基因组序列没有丢失的情况下被插入到起始噬菌体基因组中。在一些实施方式中，插入的异源核酸序列代替内源起始噬菌体基因组序列。在一些这样的实施方式中，异源核酸序列代替小于异源核酸序列长度的内源基因序列的量。因此，在这样的实施方式中，重组噬菌体的长度长于起始噬菌体基因组的长度。在一些这样的实施方式中，异源核酸序列代替大于异源核酸序列长度的内源基因序列的量。因此，在这样的实施方式中，重组噬菌体的长度短于起始噬菌体基因组的长度。在一些这样的实施方式中，异源核酸序列代替等于异源核酸序列长度的内源基因序列的量。
在一些实施方式中，修饰了由异源阅读框编码的蛋白质或多肽以减少噬菌体宿主细胞中存在的蛋白酶的切割。例如，可以用计算机算法识别已知的蛋白酶的切割位点，并且开放阅读框的序列可以用保守替换来去除这些位点进行修饰。或者，用定向诱变来设计开放阅读框序列以编码具有增加至少一种蛋白酶抗性的产物，所述蛋白酶存在于噬菌体宿主细胞或噬菌体宿主细胞的培养物中。
本公开还提供了从本公开的重组噬菌体中可获得的分离的核酸。在一些实施方式中，所述分离的核酸为本公开的重组噬菌体的分离的基因组。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括小于本公开的重组噬菌体总基因组的片段，所述片段包括至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或至少99％的重组噬菌体的基因组。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括小于本公开的重组噬菌体总基因组的片段，所述片段包括至少20bp、至少50bp、至少l00bp、至少500bp、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb，或至少5kb的噬菌体基因组。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括与在本段中公开的片段同源的片段。
B.制备重组噬菌体的方法
本领域已知的任何方法能被用于以起始噬菌体制备遗传修饰的噬菌体，例如，美国专利申请号5,824,468公开了制备遗传修饰噬菌体的方法。在2012年9月26日提交的同时待审的申请号13/627,060中公开了可选的方法，在此通过引用被纳入到本发明中。
实施例5描述了一种制备重组噬菌体的新方法。作为噬菌体侵染工程(PIE)，该方法有时在此处引用。该方法允许异源核酸序列插入到噬菌体基因组的任何期望的位置。PIE方法利用转化到噬菌体宿主细胞中的噬菌体靶标载体(PTV)。PTV包括用于插入到噬菌体基因组的异源核酸序列(例如编码标记的开放阅读框)。所述异源核酸序列的两侧是上游和下游同源区域，其位于期望的插入位点相邻处。在一些实施方式中，在起始噬菌体基因组中载体中的同源区域直接相邻。这样的实施方式允许在不丢失内源噬菌体序列的情况下，异源核酸序列插入到噬菌体基因组中。在一些实施方式中，载体中的同源区域侧翼有不包括在载体中的起始噬菌体基因组的区域。这些实施方式允许异源核酸序列插入到噬菌体基因组中，然而会缺失起始噬菌体基因组的入位点插区域。例如，这些实施例允许用替换序列替换内源噬菌体序列。在一些实施方式中，缺失的起始序列和替换序列显示出序列同源性，例如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
上游同源区域、下游同源区域和异源核酸序列在载体中结合制备PTV。合适的载体的一个示例为pMK4，但是，熟练的技术人员知道许多可用于该目的的合适的载体。质粒可以从任何合适的宿主中分离，例如大肠杆菌(E.coli)。经验证，质粒之后被转化到噬菌体的宿主细胞中。对许多李斯特菌噬菌体有用的这样的细胞的一个示例为单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)菌株EGD-e。
一旦PTV被成功地转化到噬菌体宿主中，就通过用初始噬菌体孵育转化的噬菌体的宿主细胞进行初始重组。
为了评价是否已经发生了重组，使用鉴定包括异源核酸序列的重组噬菌体的任何合适的的方法来分析感染。PCR是一种可以使用的方法。或者，如果异源核酸序列包括一个开放阅读框，可以从用所得的噬菌体感染的培养细胞中筛选由该开放阅读框编码的转录本的存在、编码基因产物的存在或编码基因产物的功能读出来鉴定噬菌体。
C.噬菌体靶标细菌
本公开的重组噬菌体可以用来检测细菌的存在。靶标细菌的检测基于重组噬菌体结合靶标细菌，噬菌体向靶标细菌的转导和由细菌表达编码标记的异源核酸序列的能力。因此，用包括编码标记的异源核酸序列的重组噬菌体检测靶标细菌的方法的特异性基于暴露于噬菌体后支持标记表达的细菌类型的范围。有时暴露于噬菌体后支持标记表达的细菌类型的范围在本发明中被称为噬菌体的“宿主范围”。组成噬菌体宿主范围的一套细菌类型有时被称为噬菌体的“靶标细菌”。
本公开提供了评价噬菌体宿主范围的新方法并因此提供了定义噬菌体靶标细菌的新方法。在某些实施方式中所述方法包括在液体培养物中将候选类型的细菌暴露于噬菌体。噬菌体引起培养物澄清的能力反应了噬菌体引起了培养物中的细菌的感染和裂解，表明培养物中的细菌为噬菌体的靶标细菌。如在实施例中显示的，令人惊讶的是，本方法评价噬菌体的真正的噬菌体宿主范围比现有技术的基于平板空斑检测更准确。在本发明中的一些实施方式中，噬菌体的“宿主范围”或噬菌体的“靶标细菌”基于噬菌体能在基于液体培养物的检测中澄清的一套细菌来定义。
然而液体培养物方法是一种基于现有技术的改进方法并且对很多用途是非常有用的，其的确表现出了用重组噬菌体检测靶标细菌的方法的各个方面。这些方法依赖于重组噬菌体结合靶标细菌、噬菌体基因组转导到靶标细菌和由细菌表达编码标记的异源核酸序列的能力。因此，即使噬菌体不能裂解特定细菌细胞类型的液体培养物，但是噬菌体可能能与所述类型的细菌结合、转导噬菌体基因组到靶标细菌中并因此导致细菌表达编码标记的异源核酸序列。的确，如在实施例中显示的，在一些实施方式中，将重组噬菌体暴露在一种类型的细菌中后，检测标记存在的试验比基于液体的宿主范围试验更灵敏。因此，在本发明中的在一些实施方式中，噬菌体的“宿主范围”或噬菌体的“靶标细菌”由一种方法定义，所述方法包括1)提供包括编码标记的异源核酸序列的重组噬菌体，2)将样品暴露于噬菌体，以及3)分析被暴露的样品中标记的存在。有时这类检测在本发明中通常被称为“标记宿主范围检测”。在一些实施方式中，通过包括mRNA检测的方法来分析被暴露的样品中标记的存在。在一些实施方式中，通过包括标记蛋白的直接检测的方法来分析被暴露的样品中的标记存在，例如用抗体。在一些实施方式中，通过包括标记蛋白的功能检测的方法来分析被暴露的样品中的标记存在。例如，如果所述标记为荧光素酶，那么所述被暴露的样品可以被暴露于虫荧光素中并且产生的光可以被分析。该方法可以调整为本发明中公开的任何类型的标记，并且熟练的技术人员知道可以使用多种所述标记检测方法的变化。
在某些的条件下，某些变化可以改变噬菌体的宿主范围。维持细菌持续生长的条件以及因此最大的细菌噬菌体的侵染性很少在有利于检测细菌的方法的环境中找到。营养不足的环境和微生物间的竞争迫使细菌能够迅速的适应恶劣和变化的情形。一种包括生长和饥饿连续循的特定的生活方式通常被称为盛宴与饥荒。为了在营养耗尽和恶劣的环境中生存，细菌已经发展了很多不同的机制(从产生更多的抗性营养细胞到复杂的发育进程的变化)。由于长期饥饿，某些物种的细菌进入存在生长和死亡持续循环的动态非增殖状态，直到“好时机”到来，也称作，恢复良好的生长条件和具有它们的良好的侵染状况。
细菌噬菌体的侵染不仅由其编码的尾丝识别蛋白的特异性部分地决定，而且由存在的环境条件部分地决定。其包括但不限于细菌噬菌体能识别的细菌代谢状态。进一步，其包括当噬菌体接触细菌时，细菌噬菌体和细菌感受到的环境的化学和物理组分。例如但不限于pH、渗透压、温度、流变性能和所有其他的溶液环境因子都可能影响细菌噬菌体侵染细菌的能力。
为了解释这些可变因素，在液体澄清的宿主范围检测和标记宿主范围检测中，将细菌样品暴露到噬菌体中的步骤可在给定的条件下进行。给定的条件可以包括至少一种：给定持续时间、给定温度以及存在a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸和相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂质的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种。
在一些实施方式中，碳水化合物及相关化合物选自例如葡萄糖、甘露糖和麦芽糖的糖。在一些实施方式中，碳水化合物及相关化合物选自由戊糖磷酸通路降解的羧基糖，其消耗每摩尔可能但不必须产生比葡萄糖更多摩尔的还原型辅酶II(NADPH)。在一些实施方式中，碳水化合物及相关化合物选自参与中心代谢的化合物，例如但不限于α-酮戊二酸盐、D-苹果酸或丙酮酸。在一些实施方式中，碳水化合物及相关化合物选自丙三醇和其他碳水化合物(或其它)抗应激剂，其可能但不必须提供渗透来支持存在于在环境中潜在削弱或破坏状态的细胞。在一些实施方式中，丙三醇具有体积排除器的功能，其增加噬菌体侵染的效率。在一些实施方式中，碳水化合物及相关化合物选自糖醇，例如氨基乙醇。
在一些实施方式中，含氮化合物选自铵、其他氨基酸构造单元(buildingblocks)和游离氨基酸。游离氨基酸可以为编码标准氨基酸或非标准氨基酸的任何基因组。在一些实施方式中，氨基酸选自谷氨酸和谷氨酰胺。在一些实施方式中，氨基酸选自支链氨基酸。在一些实施方式中，含氮化合物选自支链氨基酸例如丙酸的降解产物。
在一些实施方式中，核酸和相关化合物选自核苷酸、核苷、脱氧核苷酸和脱氧核苷。在一些实施方式中，核酸和相关化合物选自核苷酸生成途径的代谢产物，例如肌苷。
在一些实施方式中，脂类化合物选自脂肪酸和相关化合物。吐温20、40和80通过酯的水解转换为脂肪酸，那么也能被使用。在一些实施方式中，脂类化合物选自卵磷脂和相关化合物。
在一些实施方式中，无机化合物选自盐、例如硫代硫酸盐。
在一些实施方式中，有机化合物选自脂肪族化合物、芳香族的、杂环族化合物和非生物源聚合物。
在一些实施方式中，至少一种化合物选自：
改变在宿主范围检测中检测的宿主范围的另一种方法为在将细菌样品暴露于噬菌体之前预处理细菌。这允许从源自用于自身侵染条件改变细菌细胞状态设计的解耦步骤(以及其可能噬菌体侵染的易感性)。例如，被噬菌体侵染细菌细胞之后，在预孵育步骤期间可能会增加代谢率，相应地，这可能会增加影响澄清或标记产生的复制、转录和翻译功能中的至少一种。而且，不论噬菌体是否可以高效地侵染细菌，该孵育时间也可能改变了表面受体的表达或改变了细菌细胞壁的组成。
因此，在一些实施方式中，在暴露于用于噬菌体宿主范围检测的噬菌体之前，细菌样品在代谢刺激条件下孵育。在一些实施方式中，将细胞暴露于代谢刺激条件下刺激了细胞中的细胞分裂。在一些实施方式中，将细胞暴露于代谢刺激条件下没有刺激细胞中的细胞分裂。在一些实施方式中，由噬菌体侵染细菌细胞之后，将细胞暴露于代谢刺激条件下刺激了影响澄清或标记产生的复制、转录和翻译功能中的一种。
如在本发明使用的，“代谢刺激条件”为促进微生物代谢状态发展的条件，在所述微生物代谢状态下，微生物允许感染并且维持噬菌体生命周期和/或侵染，之后由在噬菌体基因组中的异源核酸序列编码的标记基因产物表达后。在一些实施方式中，暴露到代谢刺激条件下之前的微生物不允许感染和维持噬菌体生命周期。在其他实施方式中，与可比较的在对数期条件下的微生物生长相比，暴露到代谢刺激条件下之前的微生物处于降低其侵染易感性和维持噬菌体生命周期的代谢状态。在这些实施方式中，暴露于代谢刺激条件下的微生物增加了侵染微生物的易感性以及噬菌体生命周期的维持。在一些实施方式中，代谢刺激条件包括许可的温度、pH、Po2和营养结合中的至少一种。在一些实施方式中，靶标微生物在代谢刺激条件下经历了至少一次细胞分裂。在一些实施方式中，靶标微生物在代谢刺激条件下没有经历至少一次的细胞分裂。
在一些实施方式中，在样品与噬菌体接触之前，将样品暴露于代谢刺激条件下。在一些这样的实施方式中，在于噬菌体接触之前，然后将样品从代谢刺激条件中去除，而在其他实施方式中，当由噬菌体接触时，样品维持在代谢刺激条件下。在一些实施方式中，在第一段时间下，样品被暴露于第一套代谢刺激条件下，然后转移到第二套代谢刺激条件下。在一些实施方式中，重组噬菌体被暴露于样品下，而样品维持在第二套代谢刺激条件下。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下5分钟至24小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下5分钟至6小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下10分钟至6小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下20分钟至6小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下30分钟至6小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下1小时至6小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下2小时至6小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下2小时至12小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下3小时至12小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下6小时至12小时。在一些实施方式中，在样品被噬菌体接触之前，样品被暴露于代谢刺激条件下12小时至24小时。一些实施方式中，样品被暴露于代谢刺激条件下至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少1小时、至少1.5小时，或至少2小时。
在本部分描述的至少一个实施方式条件下，通过进行宿主范围分析定义为检测靶标细菌方法提供的有用的灵敏性和/或选择性水平是可能的。在一些实施方式中，在其他情况下(即当在测试环境样品时)，当噬菌体用于检测靶标细菌时，用于宿主范围分析的条件也用于用噬菌体检测靶标细菌的方法。
D.检测靶标细菌的方法
本公开的重组噬菌体对检测靶标微生物是有用的。本公开进一步提供了示例性的重组噬菌体以及制备重组噬菌体的方法。本公开还定义了某些公开的重组噬菌体的靶标细菌并提供了鉴定包括任何重组噬菌体的任何噬菌体的靶标细菌的方法。因此，本公开提供了用重组噬菌体检测靶标微生物的方法。另外提供了本公开的重组噬菌体的靶标细菌的详细特征，在一些其他实施方式中，提供了现有技术不能获得的有用的方法。
所述方法适用广泛，并且基于本公开的教导，熟练的技术人员将理解如何应用检测无论哪种类型的古菌和/或细菌的方法。在一些实施方式中，古菌为广古菌门(Euryarcheota)。在一些实施方式中，古菌为泉古菌门(Crenarcheota)。在一些实施方式中，细菌为选自放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、装甲菌门(Armatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门(Chlamydiae)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝菌门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、Synergistets、软壁菌门(Tenericutes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)的门中的一员。在一些实施方式中，细菌为选自芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的厚壁菌门(Firmicutes)中的至少一种。在一些实施方式中，细菌为选自Acidobacillus、气单胞菌属(Aeromonas)、伯克氏菌属(Burkholderia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、希瓦氏菌属(Shewanella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、摩根氏菌属(Morganella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、考克斯氏体属(Coxiella)、立克次氏体(Rickettsia)、军团菌属(Legionella)、禽杆菌属(Avibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、莫拉氏菌属(Moraxella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)的变形菌门(Proteobacteria)中的至少一种。在一些实施方式中，细菌为选自支原体(Mycoplasma)、螺原体(Spiroplasma)和脲原体(Ureaplasma)的软壁菌门(Tenericutes)中的至少一种。
常见的细菌污染的食物用本发明公开的噬菌体和方法检测，包括但不限于，沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)(包括但不限于引起疾病的大肠杆菌E.coliO157:H7,产志贺毒素大肠杆菌E.coliO26,OE.coli111,E.coliO103,E.coliO121,E.coliO45和E.coliO145)、大肠型细菌(其包括但不限于柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌(Serratia))、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)(包括肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens))、弧菌属(Vibrio)(包括霍乱弧菌(Vibriocholera)和创伤弧菌(Vibriovulnificus))、肠杆菌科(Enterobacteriacae)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis))、芽孢杆菌(Bacillus)(包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus))、弯曲菌属(Campylobacter)(包括空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni))、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、弯曲菌属(Campylobacter)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。
在某些实施方式中，所述方法包括提供了一种样品、将所述样品暴露于能侵染第一套靶标细菌并且包括编码第一标记的异源核酸序列的第一类噬菌体，将所述样品暴露于能侵染第二套靶标细菌并且包括编码第二标记的异源核酸序列的第二类噬菌体，并分析暴露的样品中的第一标记和第二标记的存在。在一些实施方式中，检测到样品中的第一标记表明第一套靶标细菌的细菌存在样品中。在一些实施方式中，检测到样品中的第二标记表明第二套靶标细菌的细菌存在样品中。在一些实施方式中，第一标记和第二标记相同，检测到样品中的标记表明第一套靶标细菌和第二套靶标细菌中的至少一种的细菌存在样品中。
在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌各自独立地包括细菌的单个属的至少两个种。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌各自独立地包括细菌的单个属的至少三个种。在一些实施方式中，第一套靶标细菌和第二套靶标细菌各自独立地包括细菌的单个属的至少四个种。在一些实施方式中，细菌的单个属为李斯特菌属(Listeria)。在一些实施方式中，通常第一套靶标细菌和第二套靶标细菌包括细菌的至少一个种。在一些实施方式中，通常第一套靶标细菌和第二套靶标细菌包括细菌的至少两个种。在一些实施方式中，通常第一套靶标细菌和第二套靶标细菌包括细菌的至少三个种。在一些实施方式中，通常第一套靶标细菌和第二套靶标细菌包括细菌的至少四个种。在一些实施方式中，李斯特菌属(Listeria)的物种选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)。在一些实施方式中，李斯特菌属(Listeria)的种选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)。
在一些实施方式中，靶标细菌包括至少一种选自11、22、37和56的无害李斯特菌(Listeriainnocua)的sigB等位型。在一些实施方式中，靶标细菌包括无害李斯特菌(Listeriainnocua)的至少四种等位型。在一些实施方式中，无害李斯特菌(Listeriainnocua)的至少四种等位型为11、22、37和56。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的至少一种核糖核酸型。在一些实施方式中，靶标细菌包括至少19种单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的核糖核酸型。在一些实施方式中，至少19种单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的核糖核酸型为DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，靶标细菌包括至少四种西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的等位型。在一项实施方式中，至少四种西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的等位型为3、20、24和35。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自15、27、32和89的威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的至少一种sigB等位型。在一些实施方式中，靶标细菌包括至少四种威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的等位型。在一些实施方式中，至少四种威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的等位型为15、27、32和89。
在一些实施方式中，第一套靶标细菌为相同属的所有成员。在一些实施方式中，第二套靶标细菌为相同属的所有成员。在一些实施方式中，所有的靶标细菌为李斯特菌属(Listeria)。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、BaciUaceaebacterium、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.),变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的至少一种。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、BaciUaceaebacterium、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第三套靶标细菌并包括编码第三标记的异源核酸序列的第三类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第四套靶标细菌并包括编码第四标记的异源核酸序列的第四类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第五套靶标细菌并包括编码第五标记的异源核酸序列的第五类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第六套靶标细菌并包括编码第六标记的异源核酸序列的第六类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第七套靶标细菌并包括编码第七标记的异源核酸序列的第七类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第八套靶标细菌并包括编码第八标记的异源核酸序列的第八类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第九套靶标细菌并包括编码第九标记的异源核酸序列的第九类噬菌体。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将样品暴露于能侵染第十套或更多的靶标细菌并包括编码第十或更多的标记的异源核酸序列的第十种或更多类噬菌体。在一些实施方式中，利用的三类或更多类噬菌体，所有的三种或更多的标记是不同的。在一些实施方式中，利用的三类或更多类噬菌体，所有的三种或更多的标记是相同的。在一些实施方式中，利用的三类或更多类噬菌体。两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种标记是相同的。
在一些实施方式中，在所述方法中使用的至少一类噬菌体选自A511、P100、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125和LP143及其衍生物。在一些实施方式中，在所述方法中的每类噬菌体选自A511、P100、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125和LP143及其衍生物。
在一些实施方式中，第一标记为可筛选的标记。在一些实施方式中，第一标记为荧光素酶。在一些实施方式中，荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的。在一些实施方式中，荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的。
在一些实施方式中，第一类噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc及这些噬菌体的衍生物。在一些实施方式中，第一类噬菌体选自LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
在一些实施方式中，第二标记为可筛选的标记。在一些实施方式中，第二标记为荧光素酶。在一些实施方式中，荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的。在一些实施方式中，荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的。
在一些实施方式中，第二类噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。在一些实施方式中，第二类噬菌体型选自LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
在一些实施方式中，所述方法包括将样品同时暴露于第一类噬菌体和第二类噬菌体。
在一些实施方式中，所述样品为环境样品。
在一些实施方式中，检测到样品中的第一标记，表明第一套靶标细菌的细菌存在于样品中。在一些实施方式中，检测到样品中的第二标记，表明第二套靶标细菌的细菌存在于样品中。在一些实施方式中，第一标记和第二标记是相同的，并且检测到样品中的标记，表明第一套靶标细菌和第二套靶标细菌的细菌存在于样品中。
在一些实施方式中，对环境样品分析的假阳性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。在一些实施方式中，对环境样品分析的假阴性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。
在一些实施方式中，在样品被暴露于噬菌体之前，样品被暴露于代谢刺激条件下。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括在将样品暴露于能侵染靶标细菌的噬菌体之前，将样品在代谢刺激条件下孵育一段时间。
在某些实施方式中，所述方法包括提供了一种样品，将所述样品暴露于包括编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP14及其衍生物，并分析标记在被暴露的样品中的存在。在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述样品暴露于包括编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体下，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511和重组子P100。在一些实施方式中，在样品中检测到标记表明李斯特菌属(Listeria)存在于样品中。
在一些实施方式中，重组李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少一个种。在一些实施方式中，在样品中检测到标记表明选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少一个种存在于样品中。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少一个种。在一些实施方式中，在样品中检测到标记表明选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少一个种存在于样品中。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自11、22、37和56的无害李斯特菌(Listeriainnocua)的至少一种sigB等位型，并且在样品中检测到标记表明选自11、22、37和56的无害李斯特菌(Listeriainnocua)的至少一种sigB等位型存在于样品中。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的至少一种核糖核酸型，并且在样品中检测到标记表明选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的至少一种核糖核酸型的存在。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的核糖核酸型DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的至少一种sigB等位型，并且在样品中检测到标记表明选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的至少一种sigB等位型的存在。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)的sigB等位型。
在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自15、27、32和89的威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的至少一种sigB等位型，并且在样品中检测到标记表明选自15、27、32和89的威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的至少一种sigB等位型的存在。在一些实施方式中，李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的sigB等位型15、27、32和89。
在一些实施方式中，靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少两个种。在一些实施方式中，靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少三个种。在一些实施方式中，靶标细菌包括选自无害李斯特菌(Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、马氏李斯特菌(Listeriamarthii)、罗氏李斯特菌(Listeriarocourti)和威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)的李斯特菌属(Listeria)的至少四个种。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、芽孢杆菌科细菌(Bacillaceaebacterium)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的至少一种。在一些实施方式中，靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、坚忍肠球菌(Enterococcusdurans)、屎肠球菌(Enterococcusfaceium)、海氏肠球菌(Enterococcushirae)、变异库克菌(Kocuriavarians)、吉氏库特氏菌(Kurthiagibsonii)、佐氏库特氏菌(Kurthiazopfii)、马红球菌(Rhodococcusequi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、马链球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、藤黄微球菌(Micrococcuslutues)、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、气单胞菌(Aeromonassp)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)、芽孢杆菌科细菌(Bacillaceaebacterium)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、草假单胞菌(Pseudomonaspoae)、假单胞菌(Pseudomonassp)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、沙雷氏菌(Serratiasp)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、哈夫尼菌(Hafniasp.)、变形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasflorescens)、金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。
在一些实施方式中，标记选自可筛选的标记。在一些实施方式中，标记为荧光素酶。在一些实施方式中，荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的。在一些实施方式中，荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的。在一些实施方式中，噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。在一些实施方式中，噬菌体选自LP::40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
在一些实施方式中，样品为环境中的样品。
在一些实施方式中，在样品中检测到标记，表明第一套靶标细菌的细菌存在于样品中。
在一些实施方式中，对环境样品分析的假阳性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。在一些实施方式中，对环境样品分析的假阴性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。在一些实施方式中，在将样品暴露于噬菌体之前，所述样品被暴露于代谢刺激条件下。
在一些实施方式中，在分析被暴露的样品中标记存在进行之前，样品被暴露于噬菌体一段时间。在一些实施方式中，一段时间为从1分钟至24小时、从5分钟至12小时、从5分钟至6小时、从5分钟至3小时、从5分钟至2小时、从5分钟至1小时、从5分钟至50分钟、从5分钟至40分钟、从5分钟至30分钟、从5分钟至20分钟，或从5分钟至10分钟。在一些实施方式中，一段时间为从1至2小时、从1至4小时、或从2至4小时。在一些实施方式中一段时间为至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟，或至少1小时。
在一些实施方式中，在对被暴露的样品中的标记的存在进行分析之前，充分除去在被暴露的样品中的任何噬菌体和/或噬菌体的部分。
在本公开方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括阳性对照和阴性对照中的至少一种的测试样品中的标记的检测水平。阳性和/或阴性对照可以被用于校准，包括为了定义阳性结果和/或阴性结果目的的试验。
E.组合物
在某些实施方式中，在本发明中提供的分析噬菌体宿主范围的方法允许有噬菌体的宿主范围的特征——并因此以现有技术不能提供的分辨率定义噬菌体的靶标细菌。所述方法和由所述方法表征的噬菌体的一个应用是为了有利于鉴定成为一个检测靶标细菌的系统的可一起使用的组合噬菌体。在一些实施方式中，该系统单独地提供了噬菌体，然后噬菌体在试验之前或期间被混合。或者，该系统包括有用的噬菌体混合物，例如被提供的用于试验中的在缓冲液中的噬菌体。多种实施方式中的试验期间，也必然产生包括有用的噬菌体组合的组合物。因此，本公开也提供了包括噬菌体的组合物。
在一些实施方式中，组合物包括：包括编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，以及选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种非噬菌体组分。在一些实施方式中，所述组合物包括1,2-丙二醇、2-氨基乙醇、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖(LactulosemSucrose)、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2'-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。
在一些实施方式中，所述组合物包括：包括编码标记的异源核酸序列的至少两种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP44及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。在一些实施方式中，所述组合物进一步包括a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种非噬菌体组分中的至少一种。在一些实施方式中，所述组合物包括1,2-丙二醇、2-氨基乙醇、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-海藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖(LactulosemSucrose)、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2'-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。
在一些实施方式中，所述系统或组合物包括选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物的至少两种重组李斯特菌噬菌体。在一些实施方式中所述系统或组合物包括选自重组子LP040及其衍生物、重组子LP048及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物的至少三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种的重组李斯特菌噬菌体。
F.加工制品
在一些实施方式中，以加工制品的形式提供了包括携带编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体的系统和/或组合物。这种加工产品是有用的，例如，作为一种方法来提供包括编码标记的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体与其他组分结合能被一起使用来进行检测靶标细菌的试验。在一些实施方式中所述加工制品包括含有携带编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体的至少一个容器。
在一些实施方式中所述加工制品包括含有选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LPlOl及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物的至少两种重组李斯特菌噬菌体的至少一个容器。在一些实施方式中，所述系统或组合物包括选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LPl0l及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物的至少三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种的重组李斯特菌噬菌体。在所述加工制品包括不止一种噬菌体的一些实施方式中，提供了在单独容器中的所有噬菌体。在其他实施方式中，提供了在单独容器中组合的两种或更多中噬菌体。
在一些实施方式中，加工制品进一步包括包含至少一种非噬菌体组分的溶液，所述非噬菌体组分选自a)至少一种选自碳水化合物及相关化合物的化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸和相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种。在一些实施方式中，所述加工制品包括含有包含1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-丙三醇、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖(LactulosemSucrose)、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80的至少一种溶液的容器。在一些实施方式中，存在于加工产品中的至少一种重组李斯特菌噬菌体存在于包括至少一种非噬菌体组分的溶液中。在其他实施方式中，噬菌体和溶液被单独提供，并且例如可被使用者组合。
实施例
下面的实施例可以充分地描述使用在此公开的本发明的某些实施方式中的方法。给出实施例是为了说明的目的，并不应该作为限制在此公开的本发明的真正的范围。
实施例1：李斯特菌测试板
选择包括李斯特菌属(Listeria)物种和亚种多元组合的细菌菌株测试板是为了表征李斯特菌噬菌体。测试板包括从不同地理环境生态位中已被分离的菌株，所述不同地理环境生态位包括食品加工厂和食品零售地点。为了在细菌菌株测试板中最大限度的自然变异，特别考虑从充分地理分离的食品加工环境中获得的细菌菌株。
最初包含272种李斯特菌属(Listeria)的组装测试板分离并表现出四种主要的李斯特菌属(Listeria)的种(单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)、无害李斯特菌(L.innocua)、威氏李斯特菌(L.welshimeri)和西尔李斯特菌(L.seeligeri))(表1)。在每个种中，测试板包括各亚种的代表分离株以保证充分的覆盖深度，从而允许有意义地推断一般亚种的数据。用于细菌测试板的菌株的选择基于食品环境中的特定菌株的患病率，并且与人类疾病有关。在鉴定物种种群中通常高度代表用于扫描鉴定最常见的确定李斯特菌亚种以及确定其特定等位型的零售食品店的环境筛选。(Williams,S.K.etal.,JFoodProt74,63-77(2011)；Sauders,B.D.etal.,ApplEnvironMicrobiol78,4420-4433(2012))。选择并收集来自每种最常见的核糖核酸型的十(10)株单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)菌株，所述最常见的核糖核酸型代表了来自食物和人类疾病的分离株。这些种群在很大程度上是重叠的并在患病率方面有很强的相关性，因此，代表了用于鉴定食品加工厂中最有用的菌株。当评判基于分离于人类疾病和食品加工厂中的核糖核酸型的单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)菌株的覆盖范围时，如构建的所述测试板分别代表86％和91％的覆盖率。选择10株不同的单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)核糖核酸型的目的是允许在群内有自然变异的鉴别以保证单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)物种的合理的竞争覆盖率。
为了扩大到单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)之外并覆盖该属的其它种和亚种内的其它物种，变种被认为是为检测板选择的进一步的菌株。再次，重点放在食品加工厂通常能识别的种和亚种上。选择代表威氏李斯特菌(L.welshimeri)、无害李斯特菌(L.innocua)和西尔李斯特菌(L.seeligeri)中的每种的十(10)株分离株。构建的检测板覆盖被Saunders等鉴定的96％的无害李斯特菌(L.innocua)、98％的西尔李斯特菌(L.seeligeri)和100％的威氏李斯特菌(L.welshimeri)的核糖核酸型，并提供了李斯特菌属(Listeria)的准确表示。因此，组装的李斯特菌属(Listeria)的宿主检测板起到用于对李斯特菌属(Listeria)的任何的细菌噬菌体的宿主范围分析的作用。因此，该检测板能被用于定义任何给定噬菌体的靶标细菌。
表1提供了检测板的成员中的属、种和亚种。
表1
实施例2：基于平板的噬菌体宿主范围的检测
为了量化宿主范围，特定的细菌噬菌体在特定分离株中的细菌噬菌体的空斑形成效率被标准化为该细菌噬菌体的参考菌株，通常为用于细菌噬菌体产生的菌株。为了测定空斑形成效率，进行噬菌体的系列稀释并进行每种宿主的滴度测定。在此工作报告之前，这是噬菌体宿主范围分析的标准方法。见例如，Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)。
李斯特菌属(Listeria)细菌菌株的测试板被用于测定特定细菌噬菌体的宿主范围。为了做这，被测的每种李斯特菌属(Listeria)的菌株培养物在5ml的LBL1中起始，并在轨道震动器中在30C下培养过夜，并让其培养16个小时。对于每株细菌宿主菌株，30μl的16小时的培养物与270μl的新鲜的LBL1培养基混合。对每一次细胞稀释，加入4ml的LBL1的软琼脂并覆盖到100mm培养皿中的LBL1琼脂上。让软琼脂覆盖层在室温下冷却并固化。此外，以处理参考菌株(FSLF6-367forA511andP100)相似的方式于宿主范围的分离株。细菌噬菌体在LBL1培养基中的10倍系列稀释从10-1到10-8中制备。细菌噬菌体的每次稀释的5μ1被点到软琼脂覆盖层上，液体被吸收后平板在30C下孵育16小时。孵育之后，对在每个稀释系列下出现的空斑进行计数，并与为每种宿主范围分离株提供空斑形成效率的参考菌株比较。宿主范围被表示为在实验宿主上观察到的与参考菌株相比的滴度百分率。显示的空斑形成效率大于参考菌株的10％(表2，深灰色阴影)的细菌菌株被认为在宿主范围内。显示的空斑形成效率小于参考菌株的10％，但大于参考菌株的.01％(表2，浅灰色阴影)的细菌菌株被认为对噬菌体是弱敏感的。显示的空斑形成效率小于参考菌株的.01％(表2，无阴影)的细菌菌株被认为在噬菌体的宿主范围之外。对许多测试的细菌菌株来说，会看到一种现象，所述现象在文献或现有技术中被描述为“超细胞杀伤力”(ECK)(表2，黑色)，见例如Shawetal.(JImmunolMethods.1983；56(l):75-83)。当在高的噬菌体浓度，完全使菌苔澄清了，但接下来的稀释不能澄清，那么这株菌被称为对特定的噬菌体显示有ECK。
基于平板的宿主范围测定允许对李斯特菌属(Listeria)分离文库的A511和P100的大致近似的宿主范围。在细菌菌株文库中测试的272株中，67和120株分别由A511和P100支持空斑形成(表2)。本方法最大的限制为对于给定的细菌噬菌体来说，建立整个文库需要的时长，以及由于ECK现象，不能测定整个宿主范围。对细菌噬菌体A511和P100来说，在宿主范围测试板中测试的272株细菌菌株，117和42分别显示出了ECK，因此没有提供关于这些菌株的宿主范围的信息。此外，由于ECK现象以及由于细菌在平板上的生长和细菌在液体培养物中的生长一般不同，因此，假设基于平板方法测定宿主范围可能不能代表基于液体应用的宿主范围。
实施例3：液体培养噬菌体宿主范围的检测
由A511和P100以基于平板宿主范围方法显示的超细胞杀伤力(ECK)现象的普遍性显示基于的平板并不如其能测定任何一种噬菌体的宿主范围的那样有用。为了克服这些缺陷，发展出了一种新的基于液体的宿主范围检测。基于液体的宿主范围检测是一种端点检测，侵染特定细菌分离株的噬菌体的能力由含有或不含细菌噬菌体的培养物的可比较的光密度来测定。
李斯特菌属(Listeria)宿主测试板菌株的采集(表1)振出脑心浸液肉汤(BHI)琼脂平板上，并且在用无菌的透气的无菌膜覆盖的2-ml96-深孔板中的1ml的BHI液体中，在30C下孵育单菌落16小时。来自96-孔板的每个16-小时的培养物在300μl的平底的透明的96-孔板中以1:10,000在198μl的LBLl中进行稀释，然后将1X105pfu的细菌噬菌体或等体积的LBLl加入到96-孔板的每个孔中。细菌噬菌体的这个浓度和细菌细胞的稀释度约为每孔1个感染复数(MOI)。在添加噬菌体或对照之后，在26C下以50rpm震荡孵育平板16-小时。平板被放置在96-孔板读数仪(BiotekEonMicroplateReader)中并用涡旋震动仪震动3秒钟以悬浮沉淀出培养基的细胞。震动之后，在600nm(OD600)下测量每个孔的光密度。在细菌噬菌体未侵染细菌分离培养物的存在下细菌分离株的OD600的比例被用作度量来测定细菌菌株的感染效率。比例小于或等于0.4(表2，暗灰色阴影)的细菌菌株被认为被细菌噬菌体感染是敏感的。
在细菌菌株测试板中的272株中(表2)，基于液体的宿主范围检测鉴定出192和153株细菌菌株分别对A511和P100敏感。该数据显示A511能感染约70％，P100能感染约58％的宿主范围的测试板。与基于液体的宿主范围相比，基于平板的宿主范围的方法分别鉴定出显示A511和P100的空斑效率的62和120株细菌菌株。基于平板的宿主范围的方法中鉴定的菌株中，仅8株A511-敏感的细菌菌株和3株P100-敏感的细菌菌株没有显示出基于液体澄清检测的澄清。由于基于液体检测是一种终点检测并代表了细菌噬菌体侵染和细菌细胞生长之间的动力学相互作用，具有增加细胞增长率的某些细菌菌株可能使培养基饱和，即使所述菌株对感染是敏感的，这可解释为什么在基于空斑检测中被鉴定出的少数菌株在液体检测中不能被鉴定出的原因。
由基于液体的宿主检测鉴定的其他菌株应归于采集显示出基于平板的宿主范围检测的ECK表型的菌株的数据的能力。显示出这种表型的大量的菌株创建了关于A511和P100的宿主范围的大量未知信息。基于液体的检测消除了基于平板的宿主范围方法的一个很大的缺点的ECK现象。两个因素促成了ECK的缺点。首先，基于液体检测中使用的噬菌体浓度为低于基于平板的宿主范围检测中显示出ECK的噬菌体浓度。第二，液体侵染中的细菌噬菌体的离域浓度和低的MOI减少了细菌细胞和细菌噬菌体之间的相互作用的数量。有限的相互作用减少了非生产性接触的可能性和较低的超感染，或被细胞的多种噬菌体的感染。通过消除ECK，测量特定细菌细胞对细菌噬菌体的易感性的灵敏度大幅增加了并提供了一种跨过李斯特菌属(Listeria)物种的细菌噬菌体的宿主范围的更准确的表示。
基于液体的宿主范围检测显示出比使用基于平板的系统测定细菌噬菌体宿主范围的现有方法有了实质的进展。以前的文献没有报道过以不同于基于平板的方法的形式生长这些细菌噬菌体的能力。液体形式也很有用，因为进行基于液体的宿主范围检测的速度比测试板测定细菌噬菌体宿主范围的速度增加了7-10天，因为其组合了双手劳动的数个小时。此外，宿主易感性评分的高通量特性允许同时测定多种细菌噬菌体的宿主范围，此前不存在这种可能性。同时处理多种细菌噬菌体的能力允许细菌培养的生理机能和培养基份额之间的最小变化的更多的细菌噬菌体的直接比较。同时增加速度和直接细菌噬菌体的特征允多种噬菌体的快速处理以及优化本发明中描述的工程细菌噬菌体。而且，基于液体的宿主范围检测允许在预测产品时，相比于基于平板的宿主范围检测，潜在细菌噬菌体的功能测定的一种更准确的表示。在大多数情况下，以一种对终产品更直接的方法增加速度、更直接比较的能力以及评价细菌噬菌体的功能性的能力使基于液体的宿主范围检测比基于平板的宿主范围的方法更有用。
P100和A511细菌噬菌体鸡尾酒的功效可通过侵染特定菌株的每个细菌噬菌体的能力测定。用P100和A511鸡尾酒侵染宿主测试板显示出期望推测的单种宿主范围之外的宿主范围。在侵染过程期间，基于关于适合荧光素酶产生需要的细菌噬菌体浓度的观察，不论是单独的细菌噬菌体还是多种噬菌体鸡尾酒用于侵染，加入的细菌噬菌体的浓度被维持在1X107的恒定的总噬菌体浓度。P100和A511鸡尾酒显示出构建的测试板的74％的范围，虽然单种细菌噬菌体分别显示出70％和55％的范围。(表2)这种增加的测试板的范围产生于虽然噬菌体有很大的重叠范围，但对P100侵染易感性的菌株的子集没不完全包括在A511菌株中。单独基于液体宿主范围推断细菌噬菌体鸡尾酒的功能的能力提供了鉴定和优先处理新构建更完整的鸡尾酒工程细菌噬菌体的强大的工具。
从环境样品中采集的P100和A511的细菌噬菌体鸡尾酒的功能不能从组装的宿主测试板中被严格地推断出来。测试环境的采样点代表了细菌种群的多样性以并在单一场所中常有不止一个种或亚种的李斯特菌(Listeria)的存在。在地理和来源多样性的食品加工厂环境取样鉴定出在第三方实验室使用基于培养基的检测方法已经确认为李斯特菌(Listeria)阳性的31个样品。在这31个样品样品中，10个样品包含多个李斯特菌属(Listeria)的种或亚种。A511和P100鸡尾酒能检测到31的阳性样品中的24个(77％)。为了获得李斯特菌属(Listeria)的更完全的覆盖，基于液体宿主范围的结果和采集环境样品之间的相关性允许进一步制备的细菌噬菌体鸡尾酒迭代次数并确认基于液体宿主范围方法的益处。
实施例4：额外的李斯特菌噬菌体的宿主范围特征
构建李斯特菌噬菌体属宿主菌株测试板并发展快速的基于液体的宿主范围检测能让鉴定将增加李斯特菌属(Listeria)的覆盖宽度的那些细菌噬菌体的额外的细菌噬菌体的快速筛选。基于液体的宿主范围检测筛选到25株额外的细菌噬菌体对抗宿主测试板，并基于与未侵染的对照相比的澄清，被分析为具有宿主易感性。数据显示在表3。如果菌株显示出0.4或更少(暗灰色阴影)的比例，其被认为在宿主范围内。培养物的OD600的测定过程中，生长培养基或培养平板的吸光度没有相关性，因此，0.09的比例构成被侵染完全澄清的培养物。由于变化，由不同的李斯特菌(Listeria)菌株获得的最大的OD600中。0.4的保守比例被选为代表对特定细菌噬菌体敏感的李斯特菌(Listeria)菌株。OD600比例大于0.4的菌株被认为是在宿主范围之外(表3，无阴影)。从这25株细菌噬菌体分析中看，七(7)株细菌噬菌体被选为进行基于标准化的重组，它们提供了有用的宿主测试板覆盖、有发展靶标载体的基因组序列的益处，并且能侵染转化最容易控制的李斯特菌属(Listeria)的菌株单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)菌株EGD-e。
除A511和P100之外，选择的7株细菌噬菌体为LP44、LP40、LP48、LP99、LP101、LP124、LP125和LP143。没有单一分析的噬菌体覆盖超过78％的李斯特菌属(Listeria)宿主菌株测试板。通过组合，细菌噬菌体覆盖了由基于液体的宿主范围检测(表3)分析的宿主菌株测试板的约92％。这种组合方式允许构建的细菌噬菌体鸡尾酒，其提供李斯特菌属(Listeria)物种的必要范围以提供一种环境样品采集中存在李斯特菌属(Listeria)的可靠的测定。
在用两个不同的遗传负荷，萤火虫荧光素酶和荧光素酶Nanoluciferase，重组噬菌体基因组后，这些噬菌体宿主范围被再次测试以确保基因组修饰没有影响噬菌体的正常性或包括它们侵染靶标细菌的能力。为了检测侵染中组合细菌噬菌体的结果，基于液体的宿主范围检测被用于测试噬菌体侵染的组合效应。为了这些侵染，噬菌体的终浓度维持恒定在1X105pfu，在鸡尾酒中含有每种噬菌体等量(即——两种噬菌体鸡尾酒将包括两种组分噬菌体中的每一种为5X104pfu)。
实施例5：工程李斯特菌噬菌体
发展了构建重组噬菌体的一种新的噬菌体工程方法。该方法在本发明中有时被称为噬菌体侵染工程株(PIE)。该方法允许异源核酸序列的插入到噬菌体基因组的任何期望的位置。选择插入的起点为Loessner等(Appl.EnvironMicrobiol.,62:1133-1140)中的使用的主要衣壳蛋白基因cps的下游。萤火虫荧光素酶(SEQIDNO:1)或nanoluc荧光素酶(SEQIDNO:3)的编码序列被插入到该位置。
PIE方法使用噬菌体靶标载体PTV，其包括位于恰好在希望插入位点上游和下游约1KB的噬菌体序列(被称为上游同源区域(UHR)和下游同源区域(DHR))侧翼的荧光素酶基因序列。这些插入的每一个都是用PCR引物构建，所述PCR引物将扩增期望的扩增子，同时增加有同源性的20bp以便于组装。3个插入(UHR、luc、DHR)被组装到革兰氏阳性/革兰氏阴性穿梭载体pMK4中，穿梭载体pMK4用SmaI和PstI(NEB)进行限制性消化。
A511噬菌体基因组序列可在基因银行(NC_009811)中获得。A511噬菌体可从ATCC中获得ATCC(PTA-4608TM)。
PIE方法用于在A511的cps基因的终止子(基因组序列的碱基46,695和46,696之间)之后直接插入萤火虫荧光素酶基因(SEQIDNO:1)。没有序列从噬菌体基因组中缺失。含有核糖体结合位点(GAGGAGGTAAATATAT)的16bp序列被放置在萤火虫荧光素酶基因的起始(ATG)之前。
为了重组噬菌体A511，cps基因的1276个碱基用寡核苷酸“pMAKupf”和“pMAKupr”扩增，从而形成“A511UHR”的片段。荧光素酶基因用引物“pMAKlucf”和“pMAKlucr”扩增，构建“A511luc”片段。在荧光素酶基因的上游，引物“pMAKlucf”也加入核糖体结合位点(Shine-Dalgarno)。在紧随cps终止子后，用“pMAKdnf”和“pMAKdnr”扩增1140bp，被成为“A511DHR”。
这3个扩增子被重组到pMK4，根据产品说明书，pMK4用GeneArtSeamlessAssemblyKit的SmaI/PstI进行限制性消化。一旦从E.coli中分离，对质粒进行测序以核实扩增和组装的正确性。经验证，质粒被转化到单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)菌株EGD-e中，并在BHI-氯霉素(10μg/ml)琼脂平板上筛选。
一旦PTV被成功地转化到EGD-e中，就完成了最初的重组：过夜培养的含有A511::FFPTV的EGD-e以1:100稀释，并让其生长到OD6000.1。然后该培养物被稀释回OD6000.02，并与le5pfu/ml的野生型A511噬菌体在2ml的体积中混合。该侵染在30℃下以50rpm震荡过夜培养。
为了评价是否发生了重组，在第二天进行感染分析。首先，裂解产物与氯仿混合以杀死任何残留的细胞，并破坏由PTV产生的底色荧光素酶。噬菌体为细菌噬菌体中常见特性的氯霉素抗性。4％v/vCHC13被加入到裂解产物中、涡旋、旋转衰减并回收上清液。完成测试感染，加入1:10的EGD-e过夜培养物稀释，与重组裂解产物(90μ1细胞稀释，10μl的噬菌体裂解产物)混合。设置以没有细胞的对照感染。在30℃静止孵育3hr，然后在Glomax20/20上进行发光分析。20μ1的感染物与100μl的PromegaLucifaseAssayReagen(20μ1的裂解产物和20μ1的用于NanoLuc噬菌体的NanoGlo)混合，然后用10秒混合(为NanoGlo)读数。重组裂解产物产光，表明在裂解产物中有重组噬菌体。
为了富集并分离重组噬菌体，需要从存在重组裂解产物的野生型噬菌体中被分离出来。进行连续多轮的稀释和分离。用10倍稀释液输入噬菌体制备裂解产物并用荧光素酶活性分析的裂解产物筛选重组噬菌体的存在。
重组效率被估计为l:le5至l:le6。为了分离纯的重组裂解产物，下面修改了在(Appl.EnvironMicrobiol.62:1133-1140)中描述的方法。对初始重组裂解产物进行滴度测定。用le6、le5和le4pfu/ml的重组裂解产物设置201-ml的裂解产物：1mlEGD-eOD0.02、leX噬菌体，O/N，30C，50rpm。在接下来的一天，如上面所述，对每个裂解产物进行CHC13处理。如上用裂解产物设置侵染。每个裂解产物在Glomax20/20上进行分析(20μ1侵染，用于FF的100μlReagent，20μ1侵染，用于nluc的20μ1NanoGlo)。目的是定位通过感染显示出发光的最少量的噬菌体制备的裂解产物。一旦该裂解产物被鉴定出，就进行滴度测定，并用le3、le2和leipfu/ml用来建立裂解产物。一旦分离到用le2噬菌体制备的发光的裂解产物，为了得到单一的空斑，对该裂解产物进行平板涂布。挑取空斑放入SM缓冲液中。这些“soakates”在dH2O中以1:10进行稀释，并用“DBONO360”和“DBON0361”PCR进行分析以在荧光素酶基因和噬菌体序列之间寻找重组结合的存在。
P100噬菌体基因组序列可在基因银行(DQ004855)中获得(DQ004855)。P100可从ATCC(PTA-4383TM)中获得。
P100的荧光素酶插入位点也在相同的cps基因的下游。在P100中，萤火虫荧光素酶插入的位置在P100基因组序列的碱基13,196和13,197之间。
以A511相同的方式对P100进行重组，有如下例外：“P100DHR”片段用引物“pMAKdnf”和“pMAKdnrP100”进行扩增。通过挑取空斑放入100μlSM缓冲液中进行单一的重组空斑进行鉴定。10μl的该soakate与50μ1的虫荧光素混合，并在光度计上看光。鉴定阳性的这种方法在随后的重组噬菌体分离中使用。
接下来的噬菌体用萤火虫荧光素酶基因和用于A511::ffluc中描述的方法进行重组：LP48、LP124、LP125、LP99、LP101、LP143。
接下来的噬菌体用NanoLuc基因进行重组：A511、P100、LP40、LP124和LP125。
用于A511::nluc的PTV通过扩增下面的PCR片段构建：用A511裂解产物作为模板，用寡核苷酸pMAKupf和DBON0356产生UHR片段，DHR片段用寡核苷酸DBON0359和pMAKdnr扩增。使用Promega质粒pNLl.1作为模板，NanoLuc片段用寡核苷酸DBON0357和DBON0358扩增。组装和随后的PIE方法与上述描述的相似。
PTV和P100::nluc的重组以如A511::nluc相同的方式进行，除了DHR使用寡核苷酸pMAKdnrP100而不是pMAKdnr进行扩增。
用于LP124、LP125和LP40的PTV以如A511::nluc相同的方式进行，并有以下变化。用寡核苷酸DBON0359和DBON0382扩增的DHR片段被截短了以能够更有效的组装质粒。而且，插入位点用恰好在这些噬菌体的cps基因的下游的外加的两个终止子(TAATAA)进行修饰。通过构建额外的引物DBON0379和DBONO380加入这6个碱基。用于这些噬菌体的UHR片段用寡核苷酸pMAKupf和DBONO380扩增。NanoLuc片段用寡核苷酸DBON0379和DBON0358扩增。
下面的寡核苷酸在PIE的方法中使用：
pMAKupf：
TTACGCCAAGCTTGGCTGCAACGTGAGTTCCTAGACGACC
pMAKupr：
ATGTTTTTGGCGTCTTCCATATATATTTACCTCCTCTTAGTTGCTATGAACGTTTT
pMAKlucf：
AAAACGTTCATAGCAACTAAGAGGAGGTAAATATATATGGAAGACGCCAAAAACAT
MAKlucr：
ATTCAATTATCCTATAATTATTACAATTTGGACTTTCCGC
pMAKdnf：
GCGGAAAGTCCAAATTGTAATAATTATAGGATAATTGAAT
pMAKdnr：
ACGACGGCCAGTGAATTCCCAGTTACTAACTGCTCTAATG
pMAKdnrP100：
ACGACGGCCAGTGAATTCCCAGTTACTAACTGTTCTAATG
DBONO360：CCTCTAGCTCAAATTAACGCATCTGT
DBON0361：TGGCTCTACATGCTTAGGGTTCC
DBON0356：
TCTTCGAGTGTGAAGACCATATATATTTACCTCCTCTTAGTTGC
DBON0357：
CTAAGAGGAGGTAAATATATATGGTCTTCACACTCGAAGATTT
DBON0358：
ATTCAATTATCCTATAATTATTACGCCAGAATGCGTTCGC
DBON0359：
GCGAACGCATTCTGGCGTAATAATTATAGGATAATTGAATAAA
DBON0379：
AAAACGTTCATAGCAACTAATAATAAGAGGAGGTAAATATATATGGTCTTCACACTCGAAGATTT
DBONO380：
ATATTTACCTCCTCTTATTATTAGTTGCTATGAACGTTTTTTACAGG
DBON0382：
ACGACGGCCAGTGAATTCCCTCGTGGTGTTCTGACTCCCG。
在随后的实验中，对方法进行了一些修改。在PTV构建期间中，发现DHR片段经常从组装的质粒中丢失。这通过使用寡核苷酸DBON0382截短使用的片段的长度来克服。
在修改的方法中，在确定重组裂解产物滴度之后，有时进行如下浓缩处理并被用于制备nanoluc噬菌体。
96-孔微量滴定板被用于在200μ1的体积下生长PIE裂解产物。对于FF裂解产物，初始步骤在le6pfu/裂解产物(5e6pfu/ml)下制备96种裂解产物，在le5下制备96种，在le4下制备96种。对于nanoluc噬菌体，发现重组裂解产物的重组效率显著地较高，并且能够使用低至le0pfu/裂解产物的稀释度。在30℃下以50rpm震动过夜孵育制备这些裂解产物。使用适当的荧光素酶检测系统(ff或nanoglo)分析裂解产物。不使用裂解产物侵染新鲜的细胞，发现裂解产物自身的背景信号是重组噬菌体存在的一个迹象。
当由最少量的噬菌体制备的裂解产物的鉴定时，用少量的噬菌体，用裂解产物建立新的96孔裂解产物。如上所述，一旦达到1:10-1:100的合适的重组效率，噬菌体被涂布到琼脂平板上以分离单一空斑。
这些方法用于制备包括编码ff荧光素酶的异源开放阅读框或者编码nanoluc荧光素酶的开发阅读框的重组噬菌体。为了确定工程噬菌体中插入负载和周围序列的完整性，通过PCR扩增一个片段并测序。这个片段从cps基因开始，跨过萤火虫或nanoluc基因并跨进下游序列，跨越了插入序列。全长cps基因使用寡核苷酸DBON0398和pMAKupr也进行PCR扩增。
DBON0398：TGCTATATTATAGGAACATGGGAA。
使用寡核苷酸DBON0273、DBON0398和pMAKupr对基因进行测序。
扩增PCR片段使用引物：
DBON0273：TGCTTACATGCCAGTAGGGGT，以及
DBON0382：
ACGACGGCCAGTGAATTCCCTCGTGGTGTTCTGACTCCCG
对nanoluc菌体进行测序使用寡核苷酸：
DBON0273，
DBON0382，
DBON0361：TGGCTCTACATGCTTAGGGTTCC，
DBONO360：CCTCTAGCTCAAATTAACGCATCTGT，
DBON0362：GTATGAAGGTCTGAGCGGCG以及
DBON0363：GATCTGGCCCATTTGGTCGC。
对萤火虫噬菌体进行测序使用寡核苷酸：
DBON0273，
DBON0382，
DBONO360，
DBON0361，
DBON0274：CGCATAGAACTGCCTGCGTC，
DBON0151：CACCCCAACATCTTCGACGC，以及
DBON0152：GCGCAACTGCAACTCCGATA。
由Genewiz、Inc.使用Geneious软件包进行测序，进行比对，从而产生每种噬菌体的一致序列。
如上所述已构建出下面的工程噬菌体，并且插入位点区域已经测序：
含有插入萤火虫荧光素酶的噬菌体：
LP48::ffluc(SEQIDNO:23)，
LP99::ffluc(SEQIDNO:24)，
LP101::ffluc(SEQIDNO:25)，
LP124::ffluc(SEQIDNO:26)，
LP125::ffluc(SEQIDNO:27)，
LP143::ffluc(SEQIDNO:28)，
A511::ffluc(SEQIDNO:29)，以及
P100::ffluc(SEQIDNO:30)。
含有插入nanoluc荧光素酶的噬菌体：
LP124::nluc(SEQIDNO:31)，
LP125::nluc(SEQIDNO:32)，
A511::nluc(SEQIDNO:33)，
P100::nluc(SEQIDNO:34)。
图3为包括插入萤火虫荧光素酶编码序列的噬菌体的插入位点区域的比对。每个序列包括如下部分。
图4为包括插入nanoluc荧光素酶编码序列的噬菌体的插入位点区域的比对。每个序列包括如下部分。
每种噬菌体的cps开放阅读框和编码蛋白为：
噬菌体 Cps基因序列 Cps蛋白质序列
LP40 5 6
LP48 7 8
LP99 9 10
LP101 11 12
LP124 13 14
LP125 15 16
LP143 17 18
A511 19 20
P100 21 22
图1为cps基因序列的比对，图2为其蛋白质序列。工程噬菌体的cps基因显示出相对高的同源度。
使用上述的方法进行重组上面所有的噬菌体。部分基因组序列显示用于A511的引物能被用于构建LP48、LP124和LP125的PTV。此时，不能获得LP99、LP101或LP143的基因组序列。使用A511PTV引物，以A511相同的方式，可能扩增出用于构建PTV的适当的片段。这反应了那些噬菌体的cps基因区域相同。荧光素酶基因插入位点在如A511::ffluc中相同的位置(在cps基因终止子TAA之后)。
实施例6：重组李斯特菌噬菌体的宿主范围特征
用两种不同的基因负载(萤火虫荧光素酶和Nanoluc荧光素酶)重组噬菌体的基因组之后，重新测定了这些噬菌体的宿主范围以保证基因组修饰没有影响噬菌体的拟合度或损害它们提供覆盖李斯特菌属(Listeria)菌株宿主测试板的能力。在基于液体的宿主范围检测中测试工程噬菌体，并与非修饰噬菌体进行比较。与非修饰的野生型版本相比，工程噬菌体没有显示出它们宿主范围上的改变(表4)。
当它们单独的宿主范围分布被组合时，提供李斯特菌属(Listeria)必要覆盖的细菌噬菌体的鉴定提出了当用于组合侵染时，噬菌体将提供期望之外的覆盖或在侵染中额外的细菌噬菌体存在，是否将减弱单独细菌噬菌体侵染易感菌株的能力的问题。为了进行此测试，测试了细菌噬菌体组合(鸡尾酒)对细菌噬菌体鸡尾酒的能力以提供基于液体的宿主范围检测中的澄清。对于这些侵染，噬菌体的终浓度维持恒定在1X105pfu，在鸡尾酒中含有每种噬菌体等量(即——两种噬菌体鸡尾酒将包括两种组分噬菌体中的一种为5X104pfu)。在鸡尾酒中细菌噬菌体的组合(二、三或四种细菌噬菌体鸡尾酒)没有引起宿主范围的丢失，并提供了单独细菌噬菌体宿主范围的期望的额外影响(表4)。细菌噬菌体的额外影响独立于基因组的修饰，因为与非重组细菌噬菌体相比，细菌噬菌体表达的重组萤火虫荧光素酶和Nanoluc荧光素酶都没有改变基于液体的宿主范围。
实施例7：基于液体的宿主范围与基于标记的宿主的比较
范围
细菌噬菌体使活跃生长的培养物澄清的能力由许多因素决定，包括特定菌株的生长速率和细菌噬菌体复制的速率，以及细菌噬菌体侵染特定菌株的能力。因此，使用液体培养物方法的培养物澄清测量的输出揭示了与由暴露细菌菌株于包括编码标记的异源核酸序列的重组噬菌体以及分析标记产品能够测定的宿主范围相比，在此存在潜在的更多的限制。该标记的一个示例为荧光素酶。因此，噬菌体LP124:nluc的宿主范围由基于液体的宿主范围检测和基于荧光素酶检测分析的侵染测定。为了进行基于侵染的检测，李斯特菌属(Listeria)宿主测试板菌株的收集振出(struckout)在脑心浸液(BHI)琼脂平板上，然后在1ml的BHI液体的覆盖有无菌透气的无菌膜的2-ml96-深孔板中孵育，在30C下生长16小时。从96-孔板的每个16-小时的培养物在198μl的BHI中以1:10,000稀释。为了侵染，12.5μl的培养稀释物与浓度为1X107pfu/ml的12.5μl的LP124:nluc在不透明发光读板中混合，并在30C下孵育3小时。三小时后，用PromegaGlomax96-wellplatereader，用PromegaNanoGloreaction根据产品说明书检测发光水平。
表5显示的是由两种方法测定的宿主范围。对于澄清检测来说，如果侵染培养的OD600与未侵染培养物的OD600的比例小于0.4，那么该菌株被认为是在宿主范围之内。对于基于荧光素酶的宿主范围检测来说，菌株被分为三类，高的RLU菌株(表5，深灰色阴影)、中的RLU菌株(表5，浅灰色阴影)和低的RLU菌株(表5，无阴影)。根据检测的性能，如果RLU的量度超过10,000随机光单位(RLU)(表5，浅灰色阴影)，那么菌株被认为在细菌噬菌体的宿主范围内。使用该荧光素酶活性的界限是因为它能表征细菌检测中的有用的敏感程度。基于这些标准，基于液体的宿主范围的澄清，LP124以50.5％(276中的140)的测试的李斯特菌属(Listeria)的菌株显示出宽的宿主范围。通过荧光素酶检测分析，78.2％(276中的216)的测试的李斯特菌属(Listeria)的菌株显示出高的RLU水平。
LP124::nluc使李斯特菌属(Listeria)宿主测试板的培养物澄清与RLU输出之间的能力的比较显示使用标记表达测量的宿主范围大于使用基于液体宿主范围定义的宿主范围。这可能是因为几方面的原因。第一，由侵染不能澄清但是产光的细菌菌株可能有超过细菌噬菌体侵染和复制的能力的生长速率。既然如此，所述菌株将永远不能完全由细菌噬菌体引起死亡，因为在培养基中未侵染细胞的数量将超过细菌噬菌体。第二，细菌噬菌体可能只能进行侵染的最初步骤(即接触、DNA注射以及病毒蛋白的复制)，但是不能完成侵染过程(即病毒粒子的组装及从细胞中释放)。因为细菌噬菌体的生活周期可被分为不连续的阶段，细菌噬菌体能产生噬菌体编码蛋白，在这里为荧光素酶，而没有使培养物澄清或产生额外的细菌噬菌体。而对于一种细菌噬菌体，产生荧光素酶但没有产生细菌噬菌体的其它菌株将不会落入传统定义的宿主范围之中，但该菌株确实包括在用于本公开目的的宿主范围定义中，因为在用包括编码标记的异源核酸序列的噬菌体检测靶标细菌的方法中有很大影响的宿主范围是支持标记产生的细菌的类型。当使用重组细菌噬菌体是重组过程中一个有利的副产品，并不能被现有技术测定李斯特菌属(Listeria)宿主范围的测试板时，这增加了观察的宿主范围。
细菌噬菌体在不能从基于液体的培养物中澄清的细菌菌株中产光的能力增加了一个可能的顾虑，即在工程噬菌体存在时，其它非靶标细菌的属可能也产品荧光素酶，这些细菌的种将不被认为是在这些噬菌体的宿主范围之内的，因为其对细菌噬菌体侵染的反应是不能产生细菌噬菌体。然而，例如，对于使用工程噬菌体检测早期阶段的侵染，灵敏度的增加至少在理论上能引起未被如使用液体培养方法的宿主定义的细菌菌株中产生标记。为了解决这个问题，组装了与李斯特菌属(Listeria)密切相关的细菌种的测试板(表6)。该测试板包括与李斯特菌属(Listeria)系统发育相似的其它革兰氏阳性生物。为了测定这些菌株中在工程细菌噬菌体的存在下是否能产生光，每个种在适当的生长条件下生长16小时(表6)。所述菌株被稀释到105cfu/ml的浓度，然后90μl的细胞与1X107pfu/ml的10μl细菌噬菌体鸡尾酒混合，并在30C下孵育3小时。然后用标准程序测量荧光素酶存在的反应。测试的细菌种类不是严格的非靶标影响，这降低基于细菌噬菌体检测准确性，所述测试的细菌种类都没有可观察到的RLU水平(表6)，这显示出它们不能澄清菌株中显示RLU的细菌噬菌体的能力。
第二个问题是李斯特菌属(Listeria)和非李斯特菌属细菌的种类同时存在于检测时，这些与李斯特菌属(Listeria)系统发育相似的细菌种类是否将降低检测李斯特菌属(Listeria)的工程细菌噬菌体的敏感性。为了调查这种可能性，相关细菌种类如上面进行培养并稀释到105cfu/ml的浓度。李斯特菌属(Listeria)菌株振出在脑心浸液(BHI)琼脂平板上，单菌落在5mlBHI液体中孵育，在30C下培养16小时。过夜培养物在新鲜的0.5XBHI培养基中以1:5稀释，并在30C下在定轨摇床中以200rpm震荡生长2小时。2小时后，进行培养物的10倍系列稀释。为了完成测试，应该代表总量的约10cfu的10μl李斯特菌属(Listeria)的系列稀释液与20μl的潜在抑制细菌种类混合，10μl的细菌噬菌体鸡尾酒(A511::nluc/LP124::nluc/P100::nluc)和所述混合物在30C下孵育3小时。孵育之后，用建议的PromegaGlomax20/20luminometer和PromegaNanoGloreaction分析荧光素酶存在的反应。这些检测显示在高于104数量的竞争细菌存在的情况下，没有降低检测李斯特菌属(Listeria)的能力(表6)，这显示检测的敏感性没有被样品种的非靶标细菌的存在影响。
细菌的这种选择性是一个有限集合，并不代表在环境采样期间存在的所有的细菌。为了获得可能降低灵敏度以及细菌噬菌体鸡尾酒准确性的细菌种类更详尽的样品，从食品加工厂采集环境样品，并依据检测性能从测定这些种类效果的环境拭子中分离细菌的种类。为了分离存在的细菌种类，环境样品被涂布到脑心浸液琼脂或R2A琼脂平板上，并在30C下培养。存在于平板上的细菌基于菌落形态进行检测，并渗到BHI琼脂平板纯化。细菌种类的纯培养物在BHI培养基中在30C下培养16小时。培养物被稀释到105cfu/ml的浓度，并对在细菌噬菌体鸡尾酒存在下的荧光素酶产物和由细菌噬菌体鸡尾酒侵染的李斯特菌属(Listeria)的抑制进行如上检测。包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细菌种类都没有显示出在细菌噬菌体存在下的任何荧光素酶产物(表7)。此外，在采集样品存在下，李斯特菌属(Listeria)的孵育没有显示荧光素酶产物的任何的减少，显示从环境中采集的细菌没有降低检测灵敏度或准确性。
实施例8：噬菌体组合物的设计
与基于液体的宿主范围检测相比，由基于RLU的荧光素酶检测分析观察到的增加的宿主范围确定了一种用于区分细菌噬菌体宿主范围之间的差异的新方法。此外，基于RLU的荧光素酶检测分析作为一种评价噬菌体宿主范围的手段，在与检测靶标细菌方法相似的那些条件下，允许由工程细菌噬菌体鉴定的靶标细菌的高低准确的评价。可用于该信息的一种方法是用来确定噬菌体有用的组合，所述噬菌体能组合制备含有有用的积累宿主范围的噬菌体的组合。
为了测定细菌噬菌体鸡尾酒中包括LP124::nluc的额外的影响，基于RLU荧光素酶的检测分析比较用于部分李斯特菌属(Listeria)宿主范围测试板的A511::nluc和LP124::nluc。与A51l:nluc(96株菌株中检测到37株，38.5％)相比，LP124::nluc有基于RLU的宿主范围的较大值(96株菌株中检测到77株，80.2％)(表8)。而且与A511:nluc(76％)相比，LP124:nluc产生大于100-倍高的RLU值。LP124:nluc侵染的增加的RLU输出预测含有A511和LP124:nluc的细菌噬菌体鸡尾酒将有更高的灵敏度，并且准确性超过了单独的A511:nluc。
为了测定LP124::nluc是否会增加存在A511和P100产生的RLU的水平，比较用二-噬菌体鸡尾酒(A511::nluc/P100::nluc)和三-噬菌体鸡尾酒(A511::nluc/P100::nluc/LP124::nluc)侵染的样品之间的RLU值。为了测试这些，生长在UVM培养基中的1ml的复杂环境样品通过离心沉淀。去除上清，然后细胞被悬浮在100μl的总细菌噬菌体浓度为1X107的二-噬菌体或三-噬菌体鸡尾酒，并在30C下孵育。RLU水平用PromegaNanoGloreagent和thePromega20/20luminometer测量。至于李斯特菌属(Listeria)宿主测试板，环境样品显示出在三-噬菌体鸡尾酒的存在下的RLU水平高于二-噬菌体鸡尾酒(表9)。这增加了侵染的RLU输出，显示从有LP124::nluc存在超过P100::nluc和A511::nluc单独的明显的优势。
与二-噬菌体鸡尾酒相比，三-噬菌体的宿主范围和RLU增加了，这表明A511::nluc和LP124::nluc鸡尾酒将提供对环境样品有用的覆盖范围。为了测定鸡尾酒鉴定与美国食品加工厂有关的李斯特菌属(Listeria)的能力，在美国的不同的食品加工厂进行环境采样。这些食品加工厂代表海产食品、乳制品、肉和在地理上不同位置的产品加工厂。在进行环境采集之后，存在于环境样品中的李斯特菌属(Listeria)用经过修改的USDA分离方法被分离。The李斯特菌属(Listeria)振出在BHI琼脂平板上，并且单菌落用于在2ml深的孔板中的1ml0.5XBHI培养基孵育，并用无菌透气膜覆盖，在30C下孵育16小时。96-孔板中的每个16-小时培养物在198μl的BHI中以1:10,000稀释。为了侵染，12.5μl的培养物的稀释液加入12.5μl的含有在不透明发光检测仪下总细菌噬菌体浓度为1X107pfu/ml的A511::nluc和LP124::nluc细菌噬菌体鸡尾酒混合，并在30C下孵育3小时。3个小时后，使用PromegaGlomax96-wellplatereader根据产品说明书用PromegaNanoGloreaction检测发光水平。同时，进行基于液体的宿主范围检测以与培养物澄清的RLU输出比较。
基于基于液体的宿主范围检测，细菌噬菌体鸡尾酒能使100株菌株中的25株(25％)的细菌培养物澄清。这降低了澄清的水平，是因为与在李斯特菌属(Listeria)宿主范围测试板中测试的普通实验室分离株相比，环境分离菌株的生长速率较快。基于RLU的宿主范围检测鉴定出100株菌株中的75株(75％)(表10)。这些环境样品代表复杂的微生物群落，并在每个环境样品中有多种李斯特菌属(Listeria)分离株。在这些微生物群落之中存在多株李斯特菌属(Listeria)提高了检测的灵敏度。在该实施例中，去掉一部分后，使用海绵采集环境样品并且海绵用培养基孵育直到24h，并分析需要测定的细菌种群的存在或不存在，基于从相同的环境样品中鉴定单独李斯特菌属(Listeria)菌株的细菌噬菌体鸡尾酒的能力，可以预测A511和LP124:nluc的细菌噬菌体鸡尾酒将能检测出57个中的48个(84.2％)李斯特菌属(Listeria)阳性海绵。当环境海绵在生长培养基中孵育，并且富集样品的样品用含有A511和LP124:nluc的细菌噬菌体鸡尾酒测试，能检测出57个中的49个(85.9％)李斯特菌属(Listeria)-阳性海绵。增加的灵敏度显示多株李斯特菌属(Listeria)的菌株的存在，包括用细菌噬菌体鸡尾酒不能检测出宿主范围的那些，没有减弱检测对细菌噬菌体鸡尾酒敏感的李斯特菌属(Listeria)的菌株的检测的灵敏度。
表2
表3A
表3B
表3C
表3D
表4A
表4B
表5(见下页)
表6
表7
表8(见下页)
表9
样品# A511/P100鸡尾酒RLU A511/P100/LP124鸡尾酒RLU 3-噬菌体/2-噬菌体的信号比值
398 1164 2212 1.9
399 11459 27183 2.4
401 2100 3058 1.5
402 113103 217389 1.9
403 46219 58768 1.3
405 9988 24151 2.4
407 2732 5329 2.0
426 64717 444121 6.9
427 75896 613358 8.1
表10
非正式序列表
虽然本发明已经参照其具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物、方法、方法步骤或步骤。所有的这些改变意在涵盖在本文附权利要求的范围内。

Claims (131)

1.一种检测靶标细菌的方法，包括：
提供一种样品；
将所述样品暴露于能侵染第一套靶标细菌并且包括编码第一标记的异源核酸序列的第一类噬菌体；
将所述样品暴露于能侵染第二套靶标细菌并且包括编码第二标记的异源核酸序列的第二类噬菌体；以及
在被暴露的样品中测验所述第一标记和所述第二标记的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述样品中检测到所述第一标记表明在所述样品中存在所述第一套靶标细菌的细菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述样品中检测到所述第二标记表明在所述样品中存在所述第二套靶标细菌的细菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标记和所述第二标记相同，并且其中，在所述样品中检测到所述标记表明在所述样品中存在所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌中的至少一种的细菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌独立地包括细菌的单个属的至少两种物种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌独立地包括细菌的单个属的至少三种物种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌独立地包括细菌的单个属的至少四种物种。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细菌的单个属为李斯特菌属。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括细菌的至少一个种。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括细菌的至少两种。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括细菌的至少三个种。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括细菌的至少四个种。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述种选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌和威氏李斯特菌。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括选自11、22、37和56的无害李斯特菌的至少一种sigB等位型。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括无害李斯特菌的至少四种等位型。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述无害李斯特菌的至少四种等位型为11、22、37和56。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌的至少一种核糖核酸型。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括单核细胞增多性李斯特菌的至少十九种核糖核酸型。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述单核细胞增多性李斯特菌的至少十九种核糖核酸型为DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌的至少一种sigB等位型。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括西尔李斯特菌的至少四种等位型。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述西尔李斯特菌的至少四种等位型为3、20、24和35。
24.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括选自15、27、32和89的威氏李斯特菌的的至少一种sigB等位型。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括威氏李斯特菌的的至少四种等位型。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述威氏李斯特菌的至少四种等位型为15、27、32和89。
27.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括至少一个种。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括至少两个种。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括至少三个种。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌通常包括至少四个种。
31.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一套靶标细菌全部为相同属的成员。
32.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二套靶标细菌全部为相同属的成员。
33.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌全部为李斯特菌属。
34.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、坚忍肠球菌、屎肠球菌、海氏肠球菌、变异库克菌、吉氏库特氏菌、佐氏库特氏菌、马红球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马链球菌、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌、布氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、藤黄微球菌、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌、气单胞菌、液化沙雷菌、变形斑沙雷菌、液化沙雷菌、芽孢杆菌科细菌、变形斑沙雷菌、荧光假单胞菌、草假单胞菌、假单胞菌、莓实假单胞菌、产碱普罗威登斯菌、沙雷氏菌、格氏沙雷菌、哈夫尼菌、变形斑沙雷菌、荧光假单胞菌、金黄杆菌、莓实假单胞菌和肠杆菌科。
35.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述样品暴露于能侵染第三套靶标细菌并且包括编码第三标记的异源核酸序列的第三类噬菌体。
36.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法中使用的至少一类噬菌体选自A511、P100、LP40、LP48、LP99、LPl0l、LP124、LP125和LP143及其衍生物。
37.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在测验中使用的每类噬菌体选自A511、P100、LP40、LP48、LP99、LPl0l、LP124、LP125和LP143及其衍生物。
38.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标记为可筛选的标记。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一标记为荧光素酶。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第一类噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。
42.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第一类噬菌体选自LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
44.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二标记为可筛选的标记。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述第二标记为荧光素酶。
46.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述第二类噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。
48.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的。
49.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述第二类噬菌体选自LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
50.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述样品同时暴露于第一类噬菌体和第二类噬菌体。
51.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为环境样品。
52.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标记在所述样品中被检测到，表明在所述样品中存在第一套靶标细菌的细菌。
53.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二标记在所述样品中被检测到，表明在所述样品中存在第二套靶标细菌的细菌。
54.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标记和所述第二标记相同，其中所述标记在样品中被检测到，表明在所述样品中存在所述第一套靶标细菌和所述第二套靶标细菌中的至少一种的细菌。
55.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对环境样品测验的假阳性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。
56.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对环境样品测验的假阴性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。
57.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述样品被暴露于噬菌体之前，其被暴露于代谢刺激条件下。
58.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括在将所述样品暴露于能侵染靶标细菌的噬菌体之前，将所述样品在代谢刺激条件孵育一段时间。
59.一种检测靶标细菌的方法，包括：
提供一种样品；
将所述样品暴露于包括编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物；以及
在被暴露的样品中测验标记的存在。
60.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述样品暴露于包括编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511和重组子P100。
61.根据权利要求60所述的方法，其特征在于，在所述样品中检测到所述标记表明在所述样品中存在李斯特菌。
62.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少一个种。
63.根据权利要求62所述的方法，其特征在于，在所述样品中检测到所述标记表明在所述样品中存在选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少一个种。
64.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少一个种。
65.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，在所述样品中检测到所述标记表明在所述样品中存在选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少一个种。
66.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自11、22、37和56的无害李斯特菌的至少一种sigB等位型，并且其中在所述样品中检测到所述标记表明存在选自11、22、37和56的无害李斯特菌的至少一种sigB等位型。
67.根据权利要求66所述的方法，其特征在于，所述至少一种李斯特菌噬菌体能侵染无害李斯特菌的sigB等位型11、22、37和56。
68.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌的至少一种核糖核酸型；并且其中，在所述样品中检测到所述标记表明存在选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌的至少一种核糖核酸型。
69.根据权利要求68所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括单核细胞增多性李斯特菌核糖核酸型DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
70.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌的至少一种sigB等位型，并且其中，在所述样品中检测到所述标记表明选自存在选自3、20、24和35的西尔李斯特菌的至少一种sigB等位型。
71.根据权利要求70所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括西尔李斯特菌的sigB等位型3、20、24和35。
72.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自3、20、24和35的威氏李斯特菌的至少一种sigB等位型，并且其中，在所述样品中检测到所述标记表明存在选自15、27、32和89的威氏李斯特菌的至少一种sigB等位型。
73.根据权利要求72所述的方法，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括威氏李斯特菌的sigB等位型15、27、32和89。
74.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少两个种。
75.根据权利要求74所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少三个种。
76.根据权利要求75所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少四个种。
77.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、坚忍肠球菌、屎肠球菌、海氏肠球菌、变异库克菌、吉氏库特氏菌、佐氏库特氏菌、马红球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马链球菌、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌、布氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、藤黄微球菌、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌、气单胞菌、液化沙雷菌、变形斑沙雷菌、液化沙雷菌、芽孢杆菌科细菌、变形斑沙雷菌、荧光假单胞菌、草假单胞菌、假单胞菌、莓实假单胞菌、产碱普罗威登斯菌、沙雷氏菌、格氏沙雷菌、哈夫尼菌、变形斑沙雷菌、荧光假单胞菌、金黄杆菌、莓实假单胞菌和肠杆菌科。
78.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述靶标细菌全部为李斯特菌。
79.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述标记为可筛选的标记。
80.根据权利要求79所述的方法，其特征在于，所述标记为荧光素酶。
81.根据权利要求80所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的。
82.根据权利要求81所述的方法，其特征在于，所述噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。
83.根据权利要求80所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的。
84.根据权利要求83所述的方法，其特征在于，所述噬菌体选自LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
85.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述样品为环境样品。
86.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述标记在所述样品中被检测到，表明在所述样品中存在所述第一套靶标细菌的细菌。
87.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，对环境样品的测验的假阳性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。
88.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，对环境样品的测验的假阴性率为5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少，或1％或更少。
89.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，在所述样品被暴露于所述噬菌体之前，将其暴露于代谢刺激条件下。
90.一种包括编码标记的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物，和重组子LP143及其衍生物。
91.根据权利要求90所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少一个种。
92.根据权利要求91所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少一个种。
93.根据权利要求91所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自11、22、37和56的无害李斯特菌的至少一种sigB等位型并产生所述标记。
94.根据权利要求93所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括无害李斯特菌的sigB等位型11、22、37和56。
95.根据权利要求91所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D的单核细胞增多性李斯特菌的至少一种核糖核酸型；以及。
96.根据权利要求89所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括单核细胞增多性李斯特菌的核糖核酸型DUP-10142、DUP-1030A、DUP-1030B、DUP-1038B、DUP-1039A、DUP-1039B、DUP-1039C、DUP-1042A、DUP-1042B、DUP-1042C、DUP-1043A、DUP-1044A、DUP-1044B、DUP-1044E、DUP-1045B、DUP-1052A、DUP-1053A、DUP-1062A和DUP-1062D。
97.根据权利要求91所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自3、20、24和35的西尔李斯特菌的至少一种sigB等位型。
98.根据权利要求91所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括西尔李斯特菌的sigB等位型3、20、24和35。
99.根据权利要求91所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自15、27、32和89的威氏李斯特菌的至少一种sigB等位型。
100.根据权利要求99所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括威氏李斯特菌的sigB等位型15、27、32和89。
101.根据权利要求90所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌属的至少两个种。.
102.根据权利要求95所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括选自无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌的李斯特菌的至少三个种。
103.根据权利要求96所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌包括无害李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、西尔李斯特菌、伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、马氏李斯特菌、罗氏李斯特菌和威氏李斯特菌。
104.根据权利要求90所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌不包括蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、坚忍肠球菌、屎肠球菌、海氏肠球菌、变异库克菌、吉氏库特氏菌、佐氏库特氏菌、马红球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马链球菌、Streptococcusgalloyticus、干酪乳杆菌、布氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、藤黄微球菌、Pseudomonasprotogens、荧光假单胞菌、气单胞菌、液化沙雷菌、变形斑沙雷菌、液化沙雷菌、芽孢杆菌科细菌、变形斑沙雷菌、荧光假单胞菌、草假单胞菌、假单胞菌、莓实假单胞菌、产碱普罗威登斯菌、沙雷氏菌、格氏沙雷菌、哈夫尼菌、变形斑沙雷菌、荧光假单胞菌、金黄杆菌、莓实假单胞菌和肠杆菌科。
105.根据权利要求90所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，全部的所述李斯特菌噬菌体的靶标细菌为李斯特菌。
106.根据权利要求90所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述标记为可筛选的标记。
107.根据权利要求106所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述标记为荧光素酶。
108.根据权利要求107的所述重组李斯特菌噬菌体，所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的。
109.根据权利要求108所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc和LP143::ffluc。
110.根据权利要求107的所述重组李斯特菌噬菌体，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的。
111.根据权利要求110所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体选自LP40::nluc、LP124::nluc和LP125::nluc。
112.一种包括编码荧光素酶的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体，所述荧光素酶与SEQIDNO:2至少70％是一致的，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。
113.根据权利要求112所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体选自LP48::ffluc、LP99::ffluc、LP101::ffluc、LP124::ffluc、LP125::ffluc、LP143::ffluc、A511::ffluc和P100::ffluc。
114.一种包括编码荧光素酶的异源核酸序列的重组李斯特菌噬菌体，所述荧光素酶与SEQIDNO:4至少70％是一致的，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。
115.根据权利要求114所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体选自LP40::nluc、LP124::nluc、LP125::nluc、A511::nluc和P100::nluc。
116.根据权利要求90所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，在环境样品中所述重组噬菌体以5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少或1％或更少的假阳性率检测靶标细菌。
117.根据权利要求90所述的重组李斯特菌噬菌体，其特征在于，在环境样品中所述重组噬菌体以5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少或1％或更少的假阴性率检测靶标细菌。
118.一种组合物包括：
包括编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，以及
选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中至少一种的至少一种非噬菌体组分。
119.根据权利要求118所述的组合物，包括1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、乙酸、吐温80中的至少一种。
120.一种包括携带编码标记的异源核酸序列的至少两种重组噬菌体的组合物，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物。
121.根据权利要求120所述的组合物，包括a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中至少一种的至少一种非噬菌体组分。
122.根据权利要求121所述的组合物，包括1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖、尿苷、D-葡萄糖-l-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80中的至少一种。
123.一种加工制品包括：
包括编码标记的异源核酸序列的至少一种重组李斯特菌噬菌体，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，以及
包括选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种的至少一种非噬菌体组分的溶液。
124.根据权利要求123所述的加工制品，包括含有溶液的容器，所述溶液包括1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80.
125.一种包括携带编码标记的异源核酸序列的至少两种重组李斯特菌噬菌体的加工制品，所述重组李斯特菌噬菌体选自重组子A511及其衍生物、重组子P100及其衍生物、重组子LP40及其衍生物、重组子LP48及其衍生物、重组子LP99及其衍生物、重组子LP101及其衍生物、重组子LP124及其衍生物、重组子LP125及其衍生物和重组子LP143及其衍生物，以及
包括选自a)选自碳水化合物及相关化合物的至少一种化合物，b)选自含氮化合物的至少一种化合物，c)选自核酸及相关化合物的至少一种化合物，d)选自脂类的至少一种化合物，e)至少一种无机化合物和f)至少一种有机化合物中的至少一种的至少一种非噬菌体组分的溶液。
126.根据权利要求125所述的组合物，包括含有溶液的容器，所述溶液包括1,2-丙二醇、乙醇胺、葡糖醛酰胺、酪胺、b-苯乙胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺酸、D-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸-天冬氨酸、D-苏氨酸、甘氨酸-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-脯氨酸、L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、己六醇、D-山梨糖醇、丙三醇、L-岩藻糖、D,L-a-甘油、磷酸盐、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-密二糖、胸苷、a-甲基-D-半乳糖苷、a-D-乳糖、半乳糖苷果糖蔗糖、尿苷、D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-果糖-6-磷酸盐、b-甲基-D-糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2′-脱氧腺苷、腺苷、m-肌醇、D-纤维二糖、肌苷、N-乙酰-D-甘露糖胺、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖酸、D,L-乳酸、蚁酸、D-半乳糖醛酸-g-内酯、D,L-苹果酸、乙酸、D-葡萄胺酸、a-酮戊二酸、a-酮丁酸、m-酒石酸、a-羟基戊二酸-g-内酯、a-羟基丁酸、柠檬酸、富马酸、溴代琥珀酸、丙酸、粘酸、乙醇酸、水合乙醛酸、丙三羧酸、乙酰乙酸、琥珀酸单甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、p-羟基苯基乙酸、m-羟基苯基乙酸、丙酮酸、L-半乳糖醛酸-g-内酯、D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐温20、吐温40、吐温80的溶液的容器。
127.一种鉴定噬菌体的靶标细菌的方法，包括：
将多种不同细菌类型的液体培养样品暴露于所述噬菌体中，并检测噬菌体是否侵染所述多种不同的细菌类型。
128.根据权利要求127所述的方法，其特征在于，检测所述噬菌体是否侵染所述多种不同的细菌类型包括测量所述样品中的细胞澄清。
129.根据权利要求128所述的方法，其特征在于，样品中细胞澄清表明所述样品中的细菌类型为所述噬菌体的靶标细菌。
130.根据权利要求127所述的方法，其特征在于，所述噬菌体包括编码第一标记的异源核酸序列的噬菌体，其中通过检测测定所述噬菌体是否侵染所述多种不同的细菌类型是为了确定所述多种样品中所述标记的存在。
131.根据权利要求130所述的方法，其特征在于，在样品中检测到所述标记表明所述样品中的细菌类型为所述噬菌体的靶标细菌。
CN201480030457.5A 2013-03-27 2014-03-27 重组噬菌体和细菌检测方法 Pending CN105392892A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361805917P 2013-03-27 2013-03-27
US61/805,917 2013-03-27
PCT/US2014/031931 WO2014160818A2 (en) 2013-03-27 2014-03-27 Recombinant phage and bacterial detection methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105392892A true CN105392892A (zh) 2016-03-09

Family

ID=51625672

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480030457.5A Pending CN105392892A (zh) 2013-03-27 2014-03-27 重组噬菌体和细菌检测方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9340817B2 (zh)
EP (1) EP2978857A2 (zh)
JP (1) JP2016517687A (zh)
CN (1) CN105392892A (zh)
AU (1) AU2014241191A1 (zh)
CA (1) CA2908266A1 (zh)
WO (1) WO2014160818A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154747A (zh) * 2020-01-19 2020-05-15 天津科技大学 一种混菌发酵提高几丁质脱乙酰基酶产量的方法
CN112143710A (zh) * 2020-09-11 2020-12-29 江苏汇先医药技术有限公司 一种重组k1f噬菌体及其构建方法、应用
CN113528459A (zh) * 2021-06-03 2021-10-22 暨南大学 一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2978857A2 (en) 2013-03-27 2016-02-03 Sample Technologies, Inc. Recombinant phage and bacterial detection methods
US9828625B2 (en) * 2013-06-19 2017-11-28 Phage Diagnostics, Inc. Phage-based bacterial detection assay
US10039795B2 (en) 2014-05-09 2018-08-07 Institute For Environmental Health, Inc. Codon optimized recombinant phage and methods of using same
EP3320108A1 (en) * 2015-07-10 2018-05-16 Sample6 Technologies Inc. Recombinant phage and methods of detecting listeria
US10174295B1 (en) * 2017-08-01 2019-01-08 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Composition of matter: engineering of Escherichia coli phage K1E
MX2023009196A (es) * 2021-02-04 2023-09-13 Laboratory Corp America Holdings Métodos y sistemas para la detección rápida de listeria a través del uso de agentes infecciosos.
CN113444694B (zh) * 2021-06-22 2022-09-30 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 马链球菌马亚种噬菌体sp2019-lx株及其在制备腺疫治疗性药物中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN85109047A (zh) * 1985-11-13 1987-06-03 科技研究公司 应用生物发光或引入其它外源性遗传标记检测或鉴定测试样品中的微生物
US20050175594A1 (en) * 2002-07-08 2005-08-11 Exponential Biotherapies, Inc. Virulent phages to control listeria monocytogenes in foodstuffs and in food processing plants
CN101375163A (zh) * 2003-04-10 2009-02-25 科罗拉多矿业学院 用噬菌体检测微观活生物体的装置与方法
CN101680041A (zh) * 2007-04-18 2010-03-24 康奈尔大学 微生物检测方法和仪器
US20120009574A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-12 Life Technologies Corporation Detection of listeria species in food and environmental samples, methods and compositions thereof
WO2012061529A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Promega Corporation Novel coelenterazine substrates and methods of use

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861709A (en) 1985-05-31 1989-08-29 Technicon Research A.G. Detection and/or identification of microorganisms in a test sample using bioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
CA1308372C (en) 1986-08-11 1992-10-06 Geneva Ruth Davis Nucleic acid probe sandwich assay methods and compositions
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5639604A (en) 1987-09-21 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Homogeneous protection assay
US5283174A (en) 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5118801A (en) 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
KR100242252B1 (ko) 1989-07-11 2000-03-02 다니엘 엘. 캐시앙 핵산서열의 증폭방법
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
GB9017443D0 (en) 1990-08-09 1990-09-26 Amersham Int Plc Reporter bacteria for rapid microbial detection
KR100249110B1 (ko) 1992-05-06 2000-04-01 다니엘 엘. 캐시앙 핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트
US6033898A (en) 1992-12-30 2000-03-07 Abbott Laboratories Enhanced yeast expression using regulatory control sequences from yeast sorbitol dehydrogenase gene
WO1995003430A1 (en) 1993-07-23 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Methods for enhancing nucleic acid amplification
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
WO1995032304A1 (en) 1994-05-23 1995-11-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the rapid separation and identification of microbial contaminants from a complex matrix
DE19517940A1 (de) * 1995-05-18 1996-11-21 Merck Patent Gmbh Nachweis von Listerien mittels rekombinanter Bakteriophagen
ATE440963T1 (de) 1998-07-02 2009-09-15 Gen Probe Inc Molekulare fackeln
US6395504B1 (en) 2000-09-01 2002-05-28 New Horizons Diagnostics Corp. Use of phage associated lytic enzymes for the rapid detection of bacterial contaminants
AU2003299451A1 (en) 2002-01-23 2004-06-07 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health Andhuman Services Method for determining sensitivity to a bacteriophage
FR2845097B1 (fr) 2002-10-01 2006-06-16 Metis Biotechnologies Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon
JP2006510002A (ja) * 2002-10-15 2006-03-23 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 細菌又はウイルス病原体及び汚染物質を検出又は定量化するための検定
US20040197833A1 (en) 2003-04-03 2004-10-07 Danisco A/S Method for the enrichment of target cells by use of CBDs
WO2005017159A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Dsm Ip Assets B.V. Microbial production of l-ascorbic acid
CA2898814C (en) 2004-08-27 2015-12-29 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
US20070072174A1 (en) 2005-09-28 2007-03-29 Sayler Gary S Bioreporter for detection of microbes
WO2007064462A1 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Phage particle diagnostic reagents
CA2665238C (en) 2006-03-23 2013-06-04 Canbiocin Inc. Enhanced preservation of processed food
US8178087B2 (en) 2006-04-04 2012-05-15 Centre National de la Recherche Scientifique —CNRS Process of production of bacteriophage compositions and methods in phage therapy field
EP2087130A2 (en) 2006-10-31 2009-08-12 Microphage, Incorporated Method and apparatus for enhanced bacteriophage-based diagnostic assays by selective inhibition of potential cross-reactive organisms
US7854888B2 (en) 2006-12-04 2010-12-21 Fuller Brush Company, Inc. Methods for determining effectiveness of waste water tank deodorizers and synthetic waste compositions for use in said methods
CN101675157B (zh) 2007-03-01 2013-07-17 日本迈科洛生物制药有限公司 来自多药运出蛋白缺损株的转化株以及使用该转化株的微生物转化方法
WO2009005869A2 (en) 2007-04-04 2009-01-08 Guild Associates, Inc. Biological detection system and method
US20090105195A1 (en) 2007-10-17 2009-04-23 O'brien Chris Composition comprising microbicidal active ingredients
WO2009076668A2 (en) 2007-12-13 2009-06-18 Alpharma, Inc. Bacteriophage preparations and method of use thereof
WO2009140375A2 (en) 2008-05-14 2009-11-19 Guild Associates, Inc. Phage-mediated bioluminescent detection of yersinia pestis
DE102008002972A1 (de) * 2008-07-25 2010-01-28 Profos Ag Neues Endolysin PlyP40
CN105274004B (zh) 2009-03-06 2019-08-09 合成基因组股份有限公司 用于克隆和操作基因组的方法
PL2990478T3 (pl) 2009-05-01 2017-08-31 Promega Corporation Syntetyczna lucyferaza z oplophorus o wzmocnionej emisji światła
CN101955916B (zh) 2010-07-06 2012-02-22 江苏省农业科学院 一种宽宿主谱李斯特菌噬菌体及其制备方法和应用
US20120052492A1 (en) 2010-08-30 2012-03-01 Samsung Techwin Co., Ltd. Oligonucleotides for detecting listeria spp. and use thereof
WO2013049121A2 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Sample6 Technologies, Inc. Recombinant phage and methods
WO2014153194A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Seres Health, Inc. Methods for pathogen detection and enrichment from materials and compositions
EP2978857A2 (en) 2013-03-27 2016-02-03 Sample Technologies, Inc. Recombinant phage and bacterial detection methods

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN85109047A (zh) * 1985-11-13 1987-06-03 科技研究公司 应用生物发光或引入其它外源性遗传标记检测或鉴定测试样品中的微生物
US20050175594A1 (en) * 2002-07-08 2005-08-11 Exponential Biotherapies, Inc. Virulent phages to control listeria monocytogenes in foodstuffs and in food processing plants
CN101375163A (zh) * 2003-04-10 2009-02-25 科罗拉多矿业学院 用噬菌体检测微观活生物体的装置与方法
CN101680041A (zh) * 2007-04-18 2010-03-24 康奈尔大学 微生物检测方法和仪器
US20120009574A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-12 Life Technologies Corporation Detection of listeria species in food and environmental samples, methods and compositions thereof
WO2012061529A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Promega Corporation Novel coelenterazine substrates and methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. J. HO, V. R. LAPPI ET AL: "Longitudinal Monitoring of Listeria monocytogenes Contamination Patterns in a Farmstead Dairy Processing Facility", 《J. DAIRY SCI.》 *
KENDRA NIGHTINGALE: "Combined sigB allelic typing and multiplex PCR provide improved discriminatory power and reliability for Listeria monocytogenes molecular serotyping", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154747A (zh) * 2020-01-19 2020-05-15 天津科技大学 一种混菌发酵提高几丁质脱乙酰基酶产量的方法
CN111154747B (zh) * 2020-01-19 2022-04-08 天津科技大学 一种混菌发酵提高几丁质脱乙酰基酶产量的方法
CN112143710A (zh) * 2020-09-11 2020-12-29 江苏汇先医药技术有限公司 一种重组k1f噬菌体及其构建方法、应用
CN113528459A (zh) * 2021-06-03 2021-10-22 暨南大学 一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用
CN113528459B (zh) * 2021-06-03 2022-02-11 暨南大学 一株蜡样芽胞杆菌噬菌体DLn1及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20140302487A1 (en) 2014-10-09
US10273460B2 (en) 2019-04-30
EP2978857A2 (en) 2016-02-03
US20170044502A1 (en) 2017-02-16
AU2014241191A1 (en) 2015-10-22
CA2908266A1 (en) 2014-10-02
US9340817B2 (en) 2016-05-17
JP2016517687A (ja) 2016-06-20
WO2014160818A2 (en) 2014-10-02
WO2014160818A3 (en) 2014-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105392892A (zh) 重组噬菌体和细菌检测方法
Rokop et al. Interactions between cooccurring lactic acid bacteria in honey bee hives
CN105531382A (zh) 基于噬菌体的细菌检测法
Albert et al. The comparative genomics of Bifidobacterium callitrichos reflects dietary carbohydrate utilization within the common marmoset gut
Fontana et al. Genetic signatures of dairy Lactobacillus casei group
Li et al. Phylogenetic analysis of family Neisseriaceae based on genome sequences and description of Populibacter corticis gen. nov., sp. nov., a member of the family Neisseriaceae, isolated from symptomatic bark of Populus× euramericana canker
Begrem et al. New insight into antimicrobial compounds from food and marine-sourced Carnobacterium species through phenotype and genome analyses
Le Gratiet et al. Development of an innovative and quick method for the isolation of Clostridium botulinum strains involved in avian botulism outbreaks
Modesto et al. Characterization of Bifidobacterium species in feaces of the Egyptian fruit bat: Description of B. vespertilionis sp. nov. and B. rousetti sp. nov.
Guzman et al. Entomobacter blattae gen. nov., sp. nov., a new member of the Acetobacteraceae isolated from the gut of the cockroach Gromphadorhina portentosa
Zdolec et al. Prevalence and persistence of multidrug-resistant Yersinia enterocolitica 4/O: 3 in tonsils of slaughter pigs from different housing systems in Croatia
US20180274004A1 (en) Recombinant phage and methods of detecting listeria
US10039795B2 (en) Codon optimized recombinant phage and methods of using same
Bhatta et al. Exploring the cause of diarrhoea and poor growth in 8–11-week-old pigs from an Australian pig herd using metagenomic sequencing
GB2596822A (en) Methods
Zinno et al. Foodborne microbial communities as potential reservoirs of antimicrobial resistance genes for pathogens: a critical review of the recent literature
Simpson et al. Comparative genomic analysis of Cohnella hashimotonis sp. nov. isolated from the International Space Station
Singh et al. Metagenomics in animal gastrointestinal ecosystem: a microbiological and biotechnological perspective
Lung et al. Comparative Genomics Analysis between frog Virus 3-like Ranavirus from the First Canadian Reptile Mortality Event and Similar Viruses from Amphibians
Li An integrated study on microbial community in anaerobic digestion systems
Tay et al. Whole genome sequencing of Priestia megaterium isolated from the gut of sea cucumber (Holothuria leucospilota)
Monzón-Atienza et al. An In-Depth Study on the Inhibition of Quorum Sensing by Bacillus velezensis D-18: Its Significant Impact on Vibrio Biofilm Formation in Aquaculture
Montes-Grajales et al. Nitrogen-fixing Klebsiella variicola in feces from herbivorous tortoises
Janiszewska et al. Implications of sample preparation methods on the MALDI-TOF MS identification of spore-forming bacillus species from food samples: a closer look at Bacillus licheniformis, Peribacillus simplex, Lysinibacillus fusiformis, Bacillus flexus, and Bacillus marisflavi
Wang et al. Pontibacter kalidii sp. nov., isolated from rhizosphere soil of Kalidium foliatum

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20190416