DE102008002972A1

DE102008002972A1 - Neues Endolysin PlyP40

Info

Publication number: DE102008002972A1
Application number: DE102008002972A
Authority: DE
Inventors: Martin Loessner; Mathias Schmelcher
Original assignee: Profos AG
Current assignee: Hyglos Invest GmbH; Biomerieux SA
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2010-01-28
Also published as: JP2011528898A; AU2009273145A1; CN102076848A; US20140079727A1; BRPI0914245A2; EP2321409B1; EP2321409A1; CA2731630A1; WO2010010192A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Nukleinsäuremoleküle, umfassend eine das Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz, Vektoren, umfssend die Nukleinsäuremoleküle und Wirtszellen zur Expression der Polypeptide. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Polypeptide als Human-, tiermedizinische oder diagnostische Substanz, als antimikrobielle Substanz in Lebensmitteln, in Kosmetika als Desinfektionsmittel oder im Umweltbereich.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Nukleinsäuremoleküle umfassend eine das Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz, Vektoren, umfassend die Nukleinsäuremoleküle und Wirtszellen zur Expression der Polypeptide. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polypeptids als Human-, tiermedizinische oder diagnostische Substanz, als antimikrobielle Substanz in Lebensmitteln, in Kosmetika als Desinfektionsmittel oder im Umweltbereich.
Listerien sind weit verbreitete human- und tierpathogene Bakterien aus dem Lebensmittelbereich, die als Krankheitsbild die Listeriose auslösen. Häufig sind Nahrungsmittel wie Fisch, Fleisch und Milchprodukte mit Listerien belastet. Die Gattung Listeria umfasst 6 verschiedene Species mit 16 unterschiedlichen Serotypen. Im Einzelnen sind dies L. monocytogenes mit den Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7; L. innocua mit den Serotypen 3, 6a, 6b, 4ab, U/S; L. ivanovii mit dem Serotyp 5; L. seeligeri mit den Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c, 4b, 4c, 4d, 6b; L. welshimeri mit den Serotypen 1/2a, 4c, 6a, 6b, U/S und L. grayi mit dem Serotyp Grayi. Die beiden Species L. monocytogenes und L. ivanovii gelten als pathogen. Eine dritte Species, L. seeligeri, wird als apathogen betrachtet, jedoch ist ein Fall bekannt, bei dem L. seeligeri bei einem Menschen Meningitis verursachte. Die übrigen Species gelten als apathogen. Ca. 90% der Listeriosen werden auf L. monocytogenes Serovar 1/2a, 1/2b und 4b zurückgeführt (Wing EJ & Gregory SH, 2002, Listeria monocytogenes: Clinical and Experimental Update, J Infect Diseases 185 (Suppl 1): S18–S24).
Listeriose ist zwar eine seltene Krankheit, wegen der Schwere der Krankheit und der hohen Mortalitätsrate jedoch sehr ernst zu nehmen. Obwohl nur ein geringer Anteil der nahrungsmittelbedingten Erkrankungen von Listerien ausgelöst werden (ca. 1% in den USA), werden nahezu 30% der jährlich tödlich verlaufenden Erkrankungen, die durch Nahrungsmittelpathogene verursacht werden, diesem Keim zugeschrieben. Betroffen sind vor allem immunsupprimierte Personen, z. B. ältere Menschen, Diabetiker, an Krebs und/oder AIDS erkrankte Personen. Schwangere und das noch ungeborene Kind stellen ca. 25% aller Fälle an Listeriosepatienten dar. Aufgrund ihrer Fähigkeit die Blut-Hirnschranke oder die Placentaschranke zu überwinden, können Listerien Meningitis, Encephalitis, Abgänge und Todgeburten verursachen (Wing EJ & Gregory SH, 2002, Listeria monocytogenes: Clinical and Experimental Update, J Infect Deseases 185 (Suppl 1): S18–S24; Doyle ME, 2001, Virulence Characteristics of Listeria monocytogenes, Food Research Institute, October 2001).
Listerien sind sehr gut angepasst an das Überleben in der Umgebung bei der Lebensmittelproduktion. Sie sind tolerant gegenüber leichten Säuren und sind in der Lage, sich bei relativ hohen Salzkonzentrationen und bei Temperaturen von 1°C bis 45°C zu vermehren. Die hauptsächliche Infektionsquelle sind Nahrungsmittel, insbesondere diejenigen, die vor dem Verzehr nicht hitzebehandelt werden, wie z. B. viele Milchprodukte, Räucherfisch, Pökelfisch, gefrorene Meeresfrüchte, Fleischwaren, Salate und in zunehmenden Maße auch Fertigprodukte („ready-to-eat”-Produkte, vor allem Fleischprodukte). Die Kontamination mit Listerien findet häufig bei der Lebensmittelweiterverarbeitung (Entnahme aus den Kochcontainern, Aufschneiden, Garnieren, Verpacken usw.) statt. Bei Lebensmitteln, die mit Hilfe von Starterkulturen erzeugt und nicht hitzebehandelt werden (z. B. Rohmilchkäse, Salami), kann eine Kontamination auch durch die Starterkulturen oder die Rohstoffe selbst oder auch während der Reifung und Lagerung erfolgen. Während in den USA eine Nulltoleranz für L. monocytogenes in genussfertigen Lebensmitteln gilt, ist in vielen europäische Länder oder auch Kanada für bestimmte Nahrungsmittel eine Kontamination mit Listerien bis zu 100 KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/g Nahrungsmttel zulässig. In jedem Fall müssen jedoch die Nahrungsmittel auf Listerienkontamination hin untersucht werden. Viele dieser Nahrungsmittel, z. B. Meeresfrüchte, Räucherlachs, Milchprodukte oder auch Rohkostfertigprodukte haben nur eine geringe Haltbarkeit. So kommt es häufig zu kostenintensiven Rückrufaktionen, wenn bei diesen Produkten nach Auslieferung eine Listerienkontamination bzw. eine Kontamination über dem erlaubten Grenzwert festgestellt wurde.
Aus diesem Grund besteht großes Interesse, sowohl Verfahren für den Nachweis als auch zur Dekontamination von Listerien bereitzustellen. Weiterhin sind Anwendungen von antimikrobiellen Substanzen wichtig, um einerseits das Wachstum von Listerien zu verhindern als auch schon vorhandene Listerien abzutöten.
EP0781349 beschreibt unter anderem das Listeria-Phagenlysin aus dem Phagen A511, Ply511, das für die oben genannten Anwendungen verwendet werden kann. Ply511 ist aufgrund seines breiten Wirtsspektrums gegen eine Vielzahl von Listeria Serovaren sehr gut geeignet, besitzt jedoch eine relativ geringe Stabilität, die gerade auch einem Einsatz in Lebensmitteln entgegensteht. So weisen Turner et al. (2007, Syst. And Appl. Microbiol., 30, 58–67) auf Proteolyseprobleme bei der Expression von Ply511 in Milchsäurebakterien zum potentiellen Einsatz in Lebensmitteln hin.
EP 1 531 692 B1 beschreibt den Listeria-Phagen P100 und das von diesem codierte Listeria-Phagenlysin PlyP100.
Sowohl Ply511 als auch PlyP100 besitzen ein Aktivitätsoptimum im leicht alkalischen pH, während in vielen Anwendungen ein Aktivitätsoptimum im neutralen, bzw. leicht sauren pH-Bereich wichtig wäre.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, Endolysine gegen Listerien zur Verfügung zu stellen, die sowohl eine höhere Stabilität als auch eine höhere Aktivität im leicht sauren Bereich aufweisen.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die nachfolgenden Abbildungen dienen der Erläuterung der Erfindung.
1 zeigt die Aminosäuresequenz des Endolysins PlyP40 (SEQ ID NO: 1) gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 2), die das Endolysin PlyP40 gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert.
3 zeigt in einer graphischen Darstellung die Konzentrationsabhängigkeit der Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 gemäß der vorliegenden Erfindung gegen L. innocua S1147 (SV 6b). Die Änderung der Absorption pro Minute (A) wurde in Abhängikeit von der PlyP40-Konzentration (B) in μg/ml ermittelt.
4 zeigt in einer graphischen Darstellung die pH-Abhängigkeit der Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 gemäß der vorliegenden Erfindung gegen L. innocua S1147 (SV 6b). Die Änderung der Absorption pro Minute (A) wurde in Abhängikeit vom pH-Wert (B) für 12,8 μg des Endolysins PlyP40 in 1 × PBST im pH-Bereich von 5 bis 9
und für 12,8 μg des Endolysins PlyP40 in 50 mM Citrat, 50 mM NaH₂PO₄, 50 mM Borat im pH-Bereich von 4,5 bis 9,5 (☐) ermittelt.
5 zeigt in einer graphischen Darstellung die Aktivität des Endolysins PlyP40 der vorliegenden Erfindung gegen verschiedene Listeria-Stämme. Substratzellen der Listeria-Stämme L. monocytogenes 1442 SV1/2a (∎), L. monocytogenes 1042 SV 4b (☐), L. monocytogenes 1019 SV 4c
L. monocytogenes 1001 SV 1/2 c
L. innocua 2011 SV 6a (+) und L. welshimeri 50146 SV 6a (x) wurden auf eine anfängliche OD₆₀₀ von 1,0 normalisiert. Die normalisierte OD₆₀₀ (A) wurde bei einer Temperatur von 30°C in 1 × PBS, pH 8,0 bei einer anfänglichen PlyP40-Konzentration von 200 pmol/ml in Abhängikeit von der Zeit (B) in Sekunden verfolgt.
6 zeigt in einer graphischen Darstellung die Auswertung eines Thermostabilitätstest der Endolysine PlyP40 und Ply511. Endolysinlösungen von PlyP40 (∎) und Ply511
wurden im Photometer aufgeheizt. Dabei wurde die Zunahme der Proteinaggregation, die einer Zunahme der Absorption (A) bei einer Wellenlänge von 360 nm entspricht, in Abhängigkeit von der Temperatur (B) in Grad Celsius verfolgt.
Der Begriff ”Listerien” wie hier verwendet bezeichnet alle Bakterien, die der Gattung Listeria zugeordnet werden. Insbesondere schließt der Begriff Listerien die Species L. monocytogenes mit den Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7; L. innocua mit den Serotypen 3, 6a, 6b, 4ab, U/S; L. ivanovii mit dem Serotyp 5; L. seeligeri mit den Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c, 4b, 4c, 4d, 6b; L. welshimeri mit den Serotypen 1/2a, 4c, 6a, 6b, U/S und L. grayi mit dem Serotyp Grayi.
Der Begriff „Endolysin” wie hier verwendet bezeichnet Enzyme, die natürlicherweise von Bakteriophagen kodiert werden und die diese am Ende ihres Wirtszyklus herstellen, um die Wirtszelle zu lysieren und damit die Nachkommen freizusetzen. Endolysine sind aus mindestens einer enzymatisch aktiven Domäne (EAD) und einer nicht enzymatisch aktiven zellbindenden Domäne (CBD) aufgebaut. Die EADs können verschiedene Enzymaktivitäten aufweisen wie z. B. N-Acetyl-Muramoyl-L-Alanin-Amidase (Amidase, z. B. Ami_2, Ami_5), (Endo)-Peptidase (z. B. CHAP), Transglykosylase, Glykosylhydrolase, (N-Acetyl)-Muramidase (Lysozyme), N-Acetyl-Glukosaminidase.
Der Begriff bakterielle „Zellwand” wie hier verwendet bezeichnet alle Komponenten, die die äußere Zellhülle der Bakterien aufbauen und so deren Unversehrtheit garantieren. Insbesondere sind darunter das Peptidoglykan, die äußere Membran der gram-negativen Bakterien mit dem Lipopolysaccharid, die Bakterienzellmembran, aber auch zusätzliche auf das Peptidoglykan aufgelagerte Schichten wie Kapseln, Schleime oder äußere Proteinschichten zu verstehen.
Der Begriff „Domäne” oder „Proteindomäne” wie hier verwendet bezeichnet einen Teilbereich einer Aminosäuresequenz, der entweder eine bestimmte funktionelle und/oder strukturelle Eigenschaft aufweist. Domänen können aufgrund von Aminosäuresequenz-Homologien häufig mittels entsprechender Computerprogramme vorhergesagt werden, die Aminosäuresequenzen in frei verfügbaren Datenbanken mit bekannten Domänen vergleichen; z. B. Conserved Domain Database (CDD) an der NCBI (Marchler-Bauer et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192–6), Pfam (Finn et al., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247–D251) oder SMART (Schultz et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864, Letunic et al., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257–D260).
Der Begriff „Domänenlinker” wie hier verwendet bezeichnet eine Aminosäuresequenz, die die Funktion hat, einzelne Proteindomänen miteinander zu verbinden. Domänenlinker bilden in der Regel keine oder wenig reguläre Sekundärstrukturelemente wie α-Helix oder β-Faltblatt aus und können im jeweiligen strukturellen Kontext unterschiedliche Konformationen einnehmen. Im Stand der Technik sind sowohl Eigenschaften von Linkersequenzen beschrieben als auch Methoden, diese aufzufinden (George & Heringa, 2003, Protein Engineering, 15, 871–879, Bae et al., 2005, Bioinformatics, 21, 2264–2270).
Der Begriff „Wildtyp” oder „Wt” wie hier verwendet bezeichnet die Aminosäuresequenz des Endolysins PlyP40 aus dem Phagen P40 wie in SEQ ID NO: 1 aufgeführt. Der Begriff bezeichnet ebenfalls die Nukleinsäuresequenz kodierend für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Die aus dem Phagen P40 isolierte Nukleinsäuresequenz kodierend das Endolysin PlyP40 ist in SEQ ID NO: 2 aufgeführt. Der Begriff schließt ebenfalls die Nukleinsäuresequenz ein, die für einzelne Aminosäuren andere Codons als die in SEQ ID NO: 2 aufgeführten enthält, aber aufgrund des degenerierten Codes die gleiche Aminosäuresequenz codiert.
Der Begriff „Polypeptid” oder „Protein” wie hier verwendet bezeichnet Peptide aus mindestens 8 Aminosäuren. Die Polypeptide können pharmakologisch oder immunologisch aktive Polypeptide, für diagnostische Zwecke verwendete Polypeptide oder als antimikrobielle Substanz verwendete Polypeptide sein.
Der Begriff „Protease” wie hier verwendet bezeichnet ein Enzym, das in der Lage ist, Peptidbindungen von Proteinen und/oder Peptiden hydrolytisch zu spalten. Der Begriff umfasst sowohl Peptidasen, die einzelne Aminosäuren vom Amino- oder vom Carboxyende her abspalten, als auch Proteinasen, die im Inneren eines Proteins oder Polypeptides spalten.
Der Begriff „Varianten” wie hierin verwendet bedeutet, dass ein Polypeptid eine veränderte Aminosäuresequenz im Vergleich zu den Wildtypsequenzen aufweist. Bei den Veränderungen kann es sich um Modifikationen, Substitutionen, Mutationen, Deletionen, Additionen und Insertionen handeln.
Der Begriff „Mutation” wie hier verwendet bedeutet eine Veränderung der Ausgangsaminosäuresequenz. Dabei können einzelne oder mehrere, direkt aufeinander folgende oder durch nicht veränderte Aminosäuren unterbrochene Aminosäuren entfernt (Deletion), hinzugefügt (Insertion oder Addition) oder durch andere ersetzt (Substitution) werden. Der Begriff schließt auch eine Kombination der einzelnen genannten Veränderungen ein. Der Begriff schließt auch die N- oder C-terminale Fusion eines Protein- oder Peptid-Tags ein.
Der Begriff „Modifikation” wie hier verwendet kann synonym für „Mutation” verwendet werden. Der Begriff „Modifikation” wie hierin verwendet umfasst jedoch auch chemische Veränderungen der Aminosäuren wie z. B. Biotinylierung, Acetylierung, chemische Veränderung der Amino-, SH- oder Carboxylgruppen.
Der Begriff „Deletion” wie hier verwendet bedeutet das Entfernen von 1, 2 oder mehr Aminosäuren aus der jeweiligen Ausgangssequenz.
Der Begriff „Insertion” oder „Addition” wie hier verwendet bedeutet das Hinzufügen von 1, 2 oder mehr Aminosäuren zu der jeweiligen Ausgangssequenz.
Der Begriff „Substitution” wie hier verwendet bedeutet den Austausch einer an einer bestimmten Position vorhandenen Aminosäure durch eine andere.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Polypeptide mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Das Endolysin PlyP40 in seiner Wildtyp-Form weist eine Länge von 344 Aminosäuren auf. Es besitzt zwei funktionelle Domänen, die nur geringe Homologien zu anderen bekannten Endolysinen aufweisen. Die N-terminal gelegenen Aminosäuren der Positionen von etwa 1 bis etwa 200 stellen die enzymatisch aktive Domäne (EAD) dar. Die Zellbindedomäne (CBD) des PlyP40 umfasst die C-terminal gelegenen Aminosäuren von etwa 227 bis etwa 344. Die beiden Domänen sind mit einem Domänenlinker verbunden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassend Modifikationen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Nukleotidsequenzen kodierend für die erfindungsgemäßen Polypeptide. Die modifizierten Polypeptide weisen die lytische Aktivität des Wt-PlyP40 Endolysins auf, wobei die Aktivität höher, gleich oder geringer sein kann, aber nicht vollständig verloren ist. Die Aktivität wird mit den dem Fachmann bekannten Assays gemessen, z. B. dem Plattenlysetest oder dem Flüssiglysetest.
Die Modifikationen können Mutationen, insbesondere Deletionen, Insertionen bzw. Additionen, Substitutionen oder Kombinationen davon sein.
Die in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 des natürlicherweise vorkommenden Endolysins PlyP40 eingeführten Deletionen können vorzugsweise die Aminosäuresequenz so verkürzen, dass die Aktivität des Proteins nicht verloren geht. Zum Beispiel können durch die eingeführten Deletionen Proteaseschnittstellen entfernt werden.
Die Deletionen können eine oder mehrere Aminosäuren betreffen. Werden mehrere Aminosäuren deletiert, so können die deletierten Aminosäuren unmittelbar aufeinander folgen. Ferner können einzelne deletierte Aminosäuren oder Bereiche mit mehreren deletierten Aminosäuren durch eine oder mehrere nicht deletierte Aminosäuren voneinander getrennt sein. In der Ausgangssequenz des Endolysins PlyP40 gemäß SEQ ID NO: 1 können daher eine oder mehrere Deletionen eingefügt werden.
Die in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 des natürlicherweise vorkommenden Endolysins PlyP40 eingeführten Substitutionen können vorzugsweise die Aminosäuresequenz so verändern, dass die Aktivität des Proteins nicht verloren geht. Zum Beispiel können durch die eingeführten Substitutionen Proteaseschnittstellen so verändert werden, dass die für die Schnittstelle spezifische Protease das Endolysin nicht mehr spaltet.
Die Substitutionen können eine oder mehrere Aminosäuren betreffen. Werden mehrere Aminosäuren substituiert, so können die substituierten Aminosäuren unmittelbar aufeinander folgen. Ferner können einzelne substituierte Aminosäuren oder Bereiche mit mehreren substituierten Aminosäuren durch eine oder mehrere nicht substituierte Aminosäuren voneinander getrennt sein. In der Ausgangssequenz des Endolysins PlyP40 gemäß SEQ ID NO: 1 können daher eine oder mehrere Substitutionen eingefügt werden.
Modifikationen wie N- oder C-terminale Tags oder chemische Modifikationen einzelner Aminosäuren können hinzukommen, um die Herstellung des Proteins zu erleichtern (z. B. His-Tag oder Strep-Tag zur leichteren Reinigung), seine Anwendung zu verbessern (z. B. Strep-Tag, Avi-Tag, JS-Tag oder chemische Biotinylierung zur Immobilisierung an Oberflächen, die Streptavidin oder Avidin aufweisen) oder die Löslichkeit oder Stabilität zu erhöhen (z. B. PEGylierung). Ferner können die Modifikationen N- oder C-terminale HA-tags, Myc-tags oder GST-tags umfassen.
Die modifizierten erfindungsgemäßen PlyP40 Endolysine weisen alle eine Lyseaktivität auf, die auch das natürlicherweise vorkommende PlyP40 Endolysin aufweist. Darüber hinaus bewirken die vorstehend beschriebenen Modifikationen positive Effekte, die sich vorteilhaft für eine kommerzielle Anwendung der Endolysine auswirken. Bei diesen positiven Effekten kann es sich um eine erhöhte Proteasestabilität, Thermostabilität oder Stabilität gegenüber chemischen Denaturierungsmitteln handeln. Außerdem kann die Stabilisierung zu einer höheren Expressionsrate, Löslichkeit oder längeren Lagerfähigkeit führen. Der positive Effekt kann sich auch in einer erhöhten Aktivität ausdrücken.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung ferner Nukleinsäuremoleküle umfassend Nukleotidsequenzen, die die beschriebenen erfindungsgemäßen modifizierten Polypeptide kodieren. Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, umfassend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung geeignete Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide. Vorzugsweise umfasst eine geeignete Wirtszelle zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor. Vorzugsweise ist eine geeignete Wirtszelle zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül transformiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine als human-, tiermedizinische und diagnostische Substanz, als antimikrobielle Substanz in Lebensmitteln oder Kosmetika oder als Desinfektionsmittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Pharmazeutikum, das ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Vorzugweise kann eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Puffer, ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel oder eine pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanz umfassen. Ferner kann eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung geeignete Stabilisierer, Geschmackstoffe oder andere geeignete Reagenzien enthalten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Verwendung als Human-, tiermedizinische oder diagnostische Substanz zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die durch Listerien hervorgerufen werden oder zur Diagnose von Listerienkontaminationen.
Krankheiten, die durch Listerien hervorgerufen werden, umfassen u. a. Listeriose, Gastroenteritis, Meningitis, Encephalitis, Sepsis, durch Schmierinfektionen verursachte lokale Wundinfektionen und Entzündungen der Binde- und Hornhaut.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Polypeptid in einem Verfahren für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionen verwendet, insbesondere von Infektionen, die durch Listeria verursacht werden. Insbesondere kann es sich bei dieser Listeria-Infektion um eine Infektion durch L. monozytogenes, vorzugsweise durch L. monocytogenes mit den Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7, insbesondere durch L. monocytogenes 1442 SV1/2a, L. monocytogenes 1042 SV 4b, L. monocytogenes 1019 SV 4c und/oder L. monocytogenes 1001 SV 1/2 c handeln. Ferner kann es sich bei dieser Infektion um eine Listeria-Infektion durch L. innocua, vorzugsweise durch L. innocua mit den Serotypen 3, 6a, 6b, 4ab, U/S, insbesondere durch L. innocua 2011 SV 6a handeln. Der Patient kann ein humaner Patient oder ein Tier sein, insbesondere Tiere, die in der Tierhaltung und/oder in den Milchwirtschaft verwendet werden wie Wiederkäuer (z. B. Rinder, Kühe, Schafe und Ziegen) Schweine, Pferde, Geflügel, gefangene Wildvögel, Kaninchen oder Raubtiere. Das Verfahren umfasst die Anwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer angemessenen Menge an der Stelle der Infektion oder an der Stelle, die prophylaktisch gegen eine Infektion behandelt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Gastroenteritis verwendet, insbesondere von Gastroenteritis verursacht durch Listeria.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Listeriose, Meningitis, Encephalitis, Sepsis, sowie durch Schmierinfektionen verursachte lokale Wundinfektionen und Entzündungen der Binde- und Hornhaut verwendet, die insbesondere durch Listeria verursacht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder der Prophylaxe der oben genannten Erkrankungen während der Schwangerschaftsvorsorge verwendet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung für die medizinische Behandlung verwendet, wenn die Infektion, die zu behandeln oder der vorzubeugen ist, durch einen resistenten Listeria-Stamm verursacht wird. Ferner kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch die Verabreichung in Kombination mit konventionellen antibakteriellen Wirkstoffen, wie Antibiotika, anderen Enzymen wie z. B. Endolysinen, etc. in Verfahren zur Behandlung von Infektionen verwendet werden.
Die Dosierung und der Weg der Verabreichung, der in einem Verfahren der Behandlung und/oder Prophylaxe von den oben genannten Krankheiten verwendet wird, hängen von der spezifischen Krankheit sowie des Ortes der Infektion, die behandelt werden soll, ab. Der Weg der Verabreichung kann zum Beispiel in besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein oraler, topikaler, parenteraler, intravenöser, rektaler oder irgendein anderer Verabreichungsweg sein. Für die Anwendung von einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung am Ort der Infektion (oder dem Ort, der gefährdet ist infiziert zu werden) kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer Weise formuliert sein, dass das Polypeptid vor Umwelteinflüssen wie vor Proteasen, vor Oxidation oder vor einer Immunantwort etc. geschützt ist.
Deshalb kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer Kapsel, in einem Dragee, in einer Pille, in einem Zäpfchen, in einer injizierbaren Lösung oder in irgendeiner anderen medizinisch geeigneten galenischen Formulierung vorliegen. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann diese galenische Formulierung zusätzlich geeignete Träger, Stabilisierer, Geschmackstoffe, Puffer oder andere geeignete Reagenzien enthalten.
Zum Beispiel kann für topikale Anwendungen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in Form einer Lotion oder eines Pflasters verabreicht werden.
Zur Behandlung des Darms kann eine Zäpfchenformulierung vorgesehen sein. Alternativ kann eine orale Verabreichung in Betracht gezogen werden. In diesem Fall muss das Polypeptid der vorliegenden Erfindung vor den Einflüssen des Milieus des Verdauungstrakts geschützt werden, bis es die Stelle der Infektion erreicht hat. Dies kann zum Beispiel durch die Verwendung von Bakterien als Träger erreicht werden, die die anfänglichen Schritte der Verdauung im Magen überleben und die später ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung in der Darmumgebung absondern.
Alle medizinischen Anwendungen beruhen auf dem Effekt des Polypeptids der vorliegenden Erfindung spezifisch und umgehend Listeria-Bakterien zu lysieren, wenn sie auf diese treffen. Dieses hat durch die Reduktion von pathogenen Bakterien und bakterieller Ladung und gleichzeitiger Unterstützung des Immunsystems einen sofortigen Einfluss auf den Gesundheitszustand des behandelten Patienten. Zu diesem Zweck können dieselben galenischen Formulierungen verwendet werden, wie sie für konventionelle Medikamente für diese Anwendungen verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung ein Teil einer kosmetischen Zusammensetzung. Eine erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung kann beispielsweise verwendet werden um Reizungen zu verhindern oder vorzubeugen, die durch eine Infektion auf der Haut durch Listeria-Bakterien verursacht werden. Eine erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung enthält vorzugsweise eine ausreichende Menge an erfindungsgemäßen Polypeptiden um bereits existierende und/oder sich frisch ansiedelnde Listeria-Bakterien zu lysieren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder Wirtszellen als antimikrobielle Substanz in Nahrungsmitteln wie z. B. Milchprodukten, Räucherfisch, Pökelfisch, gefrorene Meeresfrüchte, Fleischwaren, Salate und Fertigprodukte („ready-to-eat”-Produkte, vor allem Fleischprodukte und Rohkostfertigprodukte).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide als antimikrobielle Substanz bei Nahrungsmittelverarbeitenden Vorrichtungen, in Nahrungsmittel verarbeitenden Anlagen, auf Oberflächen, die mit Nahrungsmitteln in Kontakt kommen wie Ablagen, an Behältern oder Einrichtungen, die für die Lagerung oder die Verarbeitung von Nahrungsmitteln verwendet werden und in allen anderen Situationen, wo Listeria-Bakterien potenziell Nahrungsmittelmaterial heimsuchen können. Dabei können die erfindungsgemäßen Polypeptide alleine oder in Kombination mit anderen antimikrobiellen Substanzen wie Desinfektionsmitteln, Antibiotika oder Enzymen, wie beispielsweise anderen Endolysinen, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können an oder in Nahrungsmittelprodukten und/oder an verschiedenen technischen Standorten innerhalb Nahrungsmittel-verarbeitender-Anlagen durch eine Vielzahl an Mitteln ein- bzw. aufgebracht werden, wie zum Beispiel durch das Beimischen der erfindungsgemäßen Polypeptide in die Nahrungsmittelprodukte, durch das Aufsprühen der erfindungsgemäßen Polypeptide auf Anlagenvorrichtungen und/oder direktes Aufbringen der erfindungsgemäßen Polypeptide auf Anlagenvorrichtungen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide bei der Diagnose bzw. dem Nachweis von Listerienkontaminationen in der Medizin, Lebensmittelindustrie und -analytik, Tierzucht, Trinkwasser- oder Umweltanalytik.
Listerienkontaminationen können mit Hilfe der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in den verschiedensten Proben nachgewiesen werden, wie beispielsweise in wässrige Lösungen und Gemischen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln, Nahrungsmitteln, Medien, Blut, Blutprodukte, Plasma, Serum, Urin, Stuhlproben, Proteinlösungen, Wasser-Ethanol-Gemische sowie aus Lösungen, in denen nicht wässrige feste zu untersuchende oder zu isolierende Substanzen gelöst sind, wie beispielsweise Protein, DNA, RNA, Zucker, Salze, Nahrungsmittel, Nahrungsmittel-Medien-Homogenisate, Arzneimittel, Impfstoffe, organische und anorganische Chemikalien (z. B. NaCl, MgCl₂, Purine, Pyrimidine, usw.).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen. Sofern nicht anders angegeben, wurden molekularbiologische Standardmethoden verwendet, wie z. B. von Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laborstory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben.
Beispiel 1: Konzentrationsabhängigkeit der Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 gegen L. innocua S1147 (SV 6b).
Um die Konzentrationsabhängigkeit der Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 zu untersuchen wurden L. innocua S1147 (SV 6b)-Zellen als Substrat in einem photometrischen Lysetest eingesetzt. Hierzu wurden L. innocua-Zellen in 1 × PBST–Puffer mit einem pH 8.0 suspendiert und aufgetaut. Unter Zusatz von 1 mM DNAse und verschiedenen Mengen des Endolysins PlyP40 in einem Gesamtvolumen von 1 ml wurde die Änderung der Absorption pro Minute als Indikator für die Lyseaktivität in Abhängigkeit der PlyP40-Konzentration bestimmt. Dabei konnte eine Absorptionsänderung d_abs/min pro μg Protein im linearen Bereich von 0.0294 ermittelt werden, so dass eine deutliche Aktivität des Endolysins PlyP40 nachgewiesen werden konnte.
Beispiel 2: pH-Abhängigkeit der Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 gegen L. innocua S1147 (SV 6b).
Um die pH-Abhängigkeit der Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 zu untersuchen, wurden L. innocua S1147 (SV 6b) Zellen als Substrat in einem photometrischen Lysetest eingesetzt. Hierzu wurden gefrorene L. innocua-Zellen in 1 × PBS Puffern (pH 5–9) oder in 50 mM Citrat, 50 mM NaH₂PO₄, 50 mM Borat Puffern (pH 4,5 bis 9,5) suspendiert und aufgetaut. Anschließend wurden die Substratzellsuspensionen mit jeweils 12,8 μg des Endolysins PlyP40 versetzt. Dabei wurde im Photometer als Indikator für die Lyseaktivität die Änderung der Absorption pro Minute bestimmt. Es stellte sich heraus, dass in beiden Pufferlösungen die maximale Lyseaktivität jeweils bei dem niedrigsten untersuchten pH-Wert auftritt. Bei einem steigenden pH-Wert war eine kontinuierlich abnehmende Lyseaktivität zu beobachten, wobei bei einem pH-Wert von größer als 8 nur noch eine sehr geringe bzw. gar keine Lyseaktivität mehr zu beobachten war. Somit liegt das Lyseoptimum des Endolysins PlyP40 deutlich im sauren Bereich und unterscheidet sich damit von den Lyseoptima der Endolysine Ply511 und PlyP100.
Beispiel 3: Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 gegen verschiedene Listeria-Stämme.
Im photometrischen Lysetest wurde die lytische Aktivität des Endolysins PlyP40 gegen die Listeria-Stämme L. monocytogenes 1442 SV1/2a, L. monocytogenes 1042 SV 4b, L. monocytogenes 1019 SV 4c, L. monocytogenes 1001 SV 1/2 c, L. innocua 2011 SV 6a und L. welshimeri 50146 SV 6a ermittelt. In einem Gesamtvolumen von 1 ml wurden die Substratzellen der einzelnen Listeria-Stämme zu einer anfänglichen OD₆₀₀ zwischen 1,0 und 1,5 (normalisiert auf 1,0) in 1 × PBS bei einem pH-Wert von 8 vorgelegt. Zum Zeitpunkt t = 0 wurde PlyP40 in einer Konzentration von 200 pmol/ml zugegeben und die Änderung der optischen Dichte als Indikator für die Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 über mehrere Minuten verfolgt. Die Tests wurden bei 30°C durchgeführt. Für alle L. monocytogenes Stämme aus unterschiedlichen Serovar-Gruppen sowie L. innocua wurde eine hohe Lyseaktivität des Endolysins PlyP40 festgestellt, während die Lyseaktivität gegen L. welshimeri deutlich geringer ausgeprägt ist.
Beispiel 4: Vergleich der Thermostabilität der beiden Endolysine PlyP40 und Ply511.
Für den Thermostabilitätstest wurden jeweils 100 μg der Endolysine PlyP40 und Ply511 in 25 mM Na-Phosphat, 100 mM NaCl, pH 8,0 in einer rührbaren Quarzküvette (Volumen 1 ml) eingesetzt. Die Zunahme der optischen Dichte, die bei steigenden Temperaturen aufgrund einer veränderten Lichtstreuung, bedingt durch die Aggregation des Proteins, auftritt, wurde während des Aufheizens von 20 bis 90°C verfolgt. Dabei wurde zum Aufheizen eine Heizrate von 1°C/min verwendet und die Messung der optischen Dichte erfolgte im Photometer bei einer Wellenlänge von 360 nm. Mit Hilfe des Thermostabilitätstests wurde für das Endolysin PlyP40 ein Schmelzpunkt von 80°C und für das Endolysin Ply511 ein Schmelzpunkt von 68°C ermittelt.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- EP 0781349 [0006]
- EP 1531692 B1 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Wing EJ & Gregory SH, 2002, Listeria monocytogenes: Clinical and Experimental Update, J Infect Diseases 185 (Suppl 1): S18–S24 [0002]
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- 2007, Syst. And Appl. Microbiol., 30, 58–67 [0006]
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- Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laborstory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York [0065]

Claims

Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder Varianten davon.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Variante eine Deletion, Addition, Insertion und/oder Substitution in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.
Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert.
Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3.
Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3 oder einen Vektor nach Anspruch 4.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung als Human-, tiermedizinische oder diagnostische Substanz, als antimikrobielle Substanz in Lebensmitteln oder in Kosmetika, als Desinfektionsmittel oder im Umweltbereich.
Polypeptid zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Lebensmittel Milchprodukte, Räucherfisch, Pökelfisch, gefrorene Meeresfrüchte, Fleischwaren, Salate oder Fertigprodukte sind.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung als Human-, tiermedizinische oder diagnostische Substanz zur Therapie und/oder Prävention von Erkrankungen, die durch Listerien hervorgerufen werden oder zur Diagnose von Listerienkontaminationen.
Polypeptid zur Verwendung nach Anspruch 8, wobei die durch Listerien hervorgerufenen Erkrankungen Listeriose, Gastroenteritis, Meningitis, Encephalitis, Sepsis, durch Schmierinfektionen verursachte lokale Wundinfektionen und Entzündungen der Binde- und Hornhaut umfassen.
Polypeptid zur Verwendung nach einem der Ansprüche 8 oder 9 während der Schwangerschaftsvorsorge.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zum Nachweis von Listerienkontaminationen in der Medizin, in der Lebensmittelindustrie und -analytik, in der Tierzucht, im Trinkwasser- oder in der Umweltanalytik.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als antimikrobielle Substanz in Lebensmitteln oder in Kosmetika, als Desinfektionsmittel oder im Umweltbereich.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als antimikrobielle Substanz bei Nahrungsmittel-verarbeitenden Vorrichtungen, in Nahrungsmittelverarbeitenden Anlagen, auf Oberflächen, die mit Nahrungsmitteln in Kontakt kommen, und von Einrichtungen, die für die Lagerung oder die Verarbeitung von Nahrungsmitteln verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die antimikrobielle Substanz in Kombination mit anderen Desinfektionsmitteln, Antibiotika und/oder Enzymen verwendet wird.