DE60309882T2

DE60309882T2 - Virulente phagen für die bekämpfung von listeria monocytogenes in nahrungsmitteln und in nahrungsmittelverarbeitenden betrieben

Info

Publication number: DE60309882T2
Application number: DE60309882T
Authority: DE
Inventors: Martin Loessner; M. Richard Port Washington CARLTON
Original assignee: Micreos Food Safety BV
Current assignee: Micreos Food Safety BV
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2023-07-08
Also published as: US20080318867A1; ATE345702T1; JP4471837B2; NZ538098A; JP2006511203A; US20050175594A1; NO20045710L; CA2491872A1; WO2004004495A1; DE60309882D1; EP1531692B1; AU2003247801B2; DK1531692T3; AU2003247801A1; CA2491872C; NO327920B1; US7438901B2; EP1531692A1; ES2276114T3; US8034552B2

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer besonderen Klasse von Bakteriophagen („Phage"), die als virulente Phagen bekannt sind und für die Bakterienart Listeria monocytogenes lytisch sind und welche in der vorliegenden Erfindung eine Reduktion der Anzahl dieser Bakterien zeigen und/oder an erster Stelle ihr Wachstum verhindern und für die Identifikation von Listeria monocytogenes in Nahrungsmitteln (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Molkereiwirtschaft) sowie auf verarbeitenden Anlagen und in anderen Bereichen von Nahrungsmittel-Industrieeinrichtungen und als ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Lebewesen, die mit Listeria monocytogenes infiziert sind, nützlich sind. Ein spezielles Beispiel für einen virulenten Listeria monocytogenes Phagen ist ein als P100 bezeichneter Phage, der kürzlich von einem der anwesenden Erfinder entdeckt wurde. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein von P100 produziertes Endolysin und die Verwendung des Endolysins zur Reduktion der Menge an Listeria monocytogenes in Nahrungsmittelprodukten sowie auf verarbeitenden Anlagen und in anderen Bereichen von Nahrungsmittel-Industrieeinrichtungen und in oder an Lebewesen, die mit Listeria monocytogenes infiziert sind. Die Erfindung betrifft auch Verfahren, die einen zusätzlichen Phagen verwenden, der zu entwickelnde und/oder zu isolierende lytische Eigenschaften aufweist.
Phagen als antibakterielle Mittel haben den Vorteil, sich innerhalb des bakteriellen Targets zu replizieren. So können sie, wenn ihre Nachkommen die Zelle lysieren und in das extrazelluläre Milieu entweichen, Bakterien infizieren und sich in nachfolgenden Bakteriengenerationen vermehren, indem sie Vermehrungsniveaus erzeugen, die weit größer als die des binären Wachstums der Zielbakterien sind, wodurch die Phagenpopulation, gemessen an den Zahlen des Ertrages der bakteriellen Targets, exponentiell ansteigt.
Das Konzept der Verwendung von Phagen, um eine bakterielle Kontamination in Nahrungsmittelprodukten {und -Einrichtungen, -Anlagen} zu identifizieren, ist in der wissenschatlichen Literatur allgemein beschrieben worden (siehe z.B. Greer, J. Food Prot., 49:104-109, 1986). Das Konzept der Verwendung spezieller Listeria Phagen, um insbesondere eine Listeria-Kontamination von Molkereiprodukten und im Speziellen-Einrichtungen/-Anlagen zu identifizieren, wurde bereits 1990 beschrieben (Loessner et al., Applied and Environmental Microbiology, Juni 1990, p.1912-1918).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines kürzlich entdeckten Listeria Phagen mit speziellen essenziellen und zweckdienlichen Eigenschaften, die ihn für die Identifikation und Kontrolle einer Listeria-Kontamination von Molkereiprodukten, Einrichtungen und Anlagen besonders geeignet machen.
Zusätzlich zu der allgemeinen wissenschaftlichen Literatur auf diesem Fachgebiet gibt es auch Patentliteratur, die den allgemeinen Gebrauch von Phagen bei der Kontrolle bakterieller Kontaminationen in Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlagen und in Nahrungsmitteln lehrt. Siehe z.B. U.S. Patent-Nr. 5,006,347, erschienen am 9. April 1991, U.S. Patent-Nr. 4,851,240, erschienen am 25. Juli 1989, GB 2 253 859 A , veröffentlicht am 23. September 1992 und EP 0414304A2 , veröffentlicht am 27. Februar 1991. Jedoch offenbart keines der oben diskutierten Patente einen Listeria-Phagen, der tatsächlich untersucht wurde und eine erfolgreiche Kontrolle einer bakteriellen Kontamination in Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlagen und in Nahrungsmittelprodukten zeigte. Der Grund dafür ist, dass es sich bei allen der aus dem Stand der Technik zum Zeitpunkt der Offenbarung in den vorherigen Patenten bekannten Listeria-Phagen um gemäßigte Phagen handelte, die deshalb für industrielle bakterielle Vernichtungszwecke nicht wirksam bzw. nicht geeignet waren. Der Ausdruck „gemäßigt" bezieht sich auf die Tatsache, dass wenn ein Phagenstamm seine DNA in ein bakterielles Target injiziert, die Phagen-DNA als ein „Prophage" in die DNA der Wirtszelle integriert und darin für beachtliche Zeiträume verbleiben kann. Da der Prophage nur dann exzidiert (und Replikation und Lyse iniziiert), wenn die Wirtszelle gestresst wird, ist die darauf folgende bakterielle Lyse nicht vorhersagbar und nicht leicht kontrollierbar, weshalb sich gemäßigte Phagen nicht gut für industrielle Anwendungen eignen. Gemäßigte Phagen sind zudem aus anderen Gründen, einschließlich der Tatsache, dass sie die Zielbakterien, in die sie ihre DNA integrieren, mit ungewollten und gefährlichen Genen beliefern, für industrielle Dekontaminationszwecke ungeeignet. Im Gegensatz dazu gibt es eine Klasse von Phagen, die bakterielle Targets direkt lysieren, da sie nicht die molekularen Mittel besitzen, die benötigt werden, um sich in die bakteriellen Targets zu integrieren. In Bezug auf die bakteriellen Targets werden solche Phagen als „virulent" oder „lytisch" bezeichnet. Virulente Phagen gegen Listeria monocytogenes wurden kürzlich von einem der anwesenden Erfinder entdeckt.
Der erste dieser virulenten Phagen, der als A511 bezeichnet wurde und bei der ATCC unter der Patent-Hinterlegungsbezeichnung PTA-4608 hinterlegt ist, wurde 1990 in der Literatur beschrieben (siehe Loessner et al., Applied and Environmental Microbiology, Juni 1990, p.1912-1918). Siehe auch DE 43 26617 C; Loessner et al., Applied and Environmental Microbiology, April 1996, vol. 62, No. 4, p.1133-1140; und Gaeng et al., Applied and Environmental Microbiology, Juli 2000, vol. 66, No. 7, p.2951-2958, 1990). Der erfindungsgemäße virulente Phage gehört zu der Myoviridae-Familie und weist Ausläufer auf, die sich in Richtung des Viruskopfes zusammenziehen. Ein besonders bevorzugter Phage, der bei der American Type Culture Collection, 1081 University Blvd., Manassas VA 20110-2209 am 23. Mai 2002, 2002 unter der ATCC Patent-Hinterlegungsbezeichnung PTA-4383 hinterlegt wurde, wird als P100 bezeichnet.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Phagen können auch gegen KbE's (Kolonie-bildende Einheiten) von Listeria monocytogenes Bakterien verwendet werden, die im Gegensatz zu planktonischen KbE's in Biofilmen vorliegen. Die Verwendung gemäßigter Listeria monocytogenes Phagen gegen Listeria-Biofilme ist in der Literatur beschrieben worden (siehe z.B. Roy et al., Appl. Environ. Microbiol., Sept., 59(9):2914-7, 1993). Roy et al. verwendete speziell die gemäßigten Listeria-Bakteriophagen H387, H387-A und 2671 der Siphoviridae-Familie. Während diese Phagen bei der Lichtung eines Listeria-Biofilms einigermaßen wirksam waren, konnten sie selbst bei Verwendung in Kombination bestenfalls eine Verringerung der Anzahl von 3,5-3,7 log erreichen. Roy et al weist darauf hin, dass solche Verringerungen „verbessert werden müssen, um das bei einer 30-s Einwirkung eines chemischen desinfizierenden Mittels empfohlene Reduktionsniveau von 99,999% zu erzielen". Wie oben erwähnt, sind gemäßigte Phagen hinsichtlich der zeitlichen Planung oder der Wirksamkeit, mit der sie die Zielbakterien töten können, nicht vorhersehbar bzw. nicht leicht kontrollierbar.
Zusätzlich zu der Verwendung der oben beschriebenen virulenten Phagen haben die anwesenden Erfinder auch herausgefunden, dass virulente Substämme aus einer Anzahl temperenter Phagenstämme abgeleitet werden können. Diese virulenten Substämme können mittels Techniken, wie der Plaque-Isolation (bei der man die klarsten Bereiche eines Plaques auswählt und die virulentesten Stämme darin durch sich wiederholende Zyklen des Anwachsens zu einem hohen Titer, des Plattierens, um neue Plaques zu erhalten und des Pickens der klarsten Bereiche der späteren Plaque-Generationen anreichert) ausgewählt werden. Beispiele gemäßigter Phagenstämme, aus denen virulente Substämme entwickelt worden sind oder werden, schließen die als A118, A502, A006, A500, PSA, P35 bezeichneten gemäßigten Stämme und verwandte Viren ein.
Der Nachweis von Listeria wird auf bekannte Art und Weise mittels Verfahren, die auf der Kultur der Mikroorganismen basieren, durchgeführt. Das in Int. J. Food Microbiol. 4 (1987), 249-256 beschriebene Verfahren dauert zwei Wochen. Ein etwas schnelleres Verfahren wird von der International Dairy Foundation (IDF) vorgeschlagen, das jedoch mindestens 6-8 Tage dauert. Aufgrund ihrer Dauer sind beide Verfahren für eine schnelle Identifikation ungeeignet. Beide Verfahren sind darüber hinaus Labor-intensiv, da für die Herstellung einzelner Kolonien Nährmedien mehrmals inokuliert werden müssen und weil die Isolate dann mittels biochemischer und serologischer Untersuchungsmethoden charakterisiert werden müssen. Eine Voraussetzung für die Verwendung immunologischer Tests ist, dass das Antigen exprimiert wird, was nicht für alle Proteine zu jeder Zeit der Fall ist. Die Tests dauern anerkanntermaßen nur ein paar Stunden, jedoch wird bei diesen Verfahren eine Zwei-Tage-Voranreicherungskultur benötigt, da die Nachweisgrenze bei 10-1000 × 10³ Zellen liegt. DNA-Sonden haben eine Nachweisgrenze in derselben Größenordnung. Eine vorhergehende Vervielfachung der Bakterien ist daher auch für diese Verfahren notwendig: Nahrungsmittelproben oder Verdünnungen davon werden auf Agarplatten ausgestrichen, die inokulierten Platten werden inkubiert und dann in dem Koloniehybridisierungsverfahren unter Verwendung einer radioaktivmarkierten DNA-Sonde untersucht. Der Nachweis wird mittels Autoradiographie durchgeführt. Diese Methode ist darüber hinaus ebenfalls Labor- und Kostenintensiv.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gestattet die in vitro Replikation der Nukleinsäuren, wobei bei diesem Verfahren eine Vorkultur im Allgemeinen nicht notwendig ist. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,5 × 10³ Zellen. Jedoch kann, da bei diesem Verfahren auch DNA aus toten Zellen oder alternativ isolierte DNA repliziert wird, eine Kontamination mit toten Zellen von einer Kontamination mit lebenden Zellen nicht unterschieden werden.
Die Grenzen dieser Methoden zeigen den Bedarf der Bereitstellung verbesserter Mittel und Methoden für den Nachweis von Bakterien der Gattung Listeria.
EP 0 168 933 (U.S. Pat.-Nr. 4,861,709) offenbart ein auf der Verwendung eines rekombinanten Bakteriophagen basierendes Nachweisverfahren für Bakterien, z.B. Escherichia coli. Dieser Phage enthält das lux-Gen aus Vibrio fischeri, was damit den Nachweis von E. coli durch Biolumineszenz mit einer guten Nachweisgrenze (0,5 × 10³ Zellen) möglich macht. G.J. Sarkis et al. (1995) Molecular Microbiology 15, 1055-1067 beschreiben ein Nachweisverfahren für Mykobakterien unter Verwendung gemäßigter Phagen. Bei diesen Nachweisverfahren werden nur metabolisch aktive bakterielle Zellen nachgewiesen; eine Interferenz aufgrund toter bakterieller Zellen wie bei der PCR-Technik tritt nicht auf.
Scherer, et al., U.S. Patent-Nr. 5,824,468, erschienen am 20. Oktober, 1998, beschreibt eine Nachweisverfahren für Bakterien der Gattung Listeria, bei dem ein DNA-Vektor erzeugt wird, der ein genetisches System enthält, welches DNA umfasst, die für die Expression eines oder mehrerer nachweisbarer Proteine kodiert und wobei ein DNA-Vektor A511 verwendet wird, der spezifisch die Bakterien der Gattung Listeria infiziert und das genetische System in die Bakterien transferiert. Die nachweisbaren Proteine werden in den Bakterien exprimiert, wobei der Nachweis der nachweisbaren Proteine die Anwesenheit von Bakterien der Gattung Listeria anzeigt.
Phagen-kodierte Lysine oder Endolysine sind hoch aktive Enzyme, die bakterielle Zellwände lysieren. Diese Phagen-kodierten lytischen Zellwandenzyme werden während der Virusvermehrung spät synthetisiert und vermitteln die Freisetzung von Nachkommen-Virionen. Endolysine können verwendet werden, um Listeria-Zellen zu lysieren, um Nukleinsäuren oder zelluläre Proteine für einen Nachweis oder eine Differenzierung zu erhalten. Das Endolysin kann auch verwendet werden, um Lebewesen (einschließlich Menschen) zu behandeln, die mit Listeria infiziert sind und um Oberflächen zu behandeln, die mit Listeria kontaminiert sein können. Lysine aus Listeria-Phagen (A118, A500 und A 511) sind kloniert und aufgereinigt worden (Loessner, et al., Applied and Environmental Microbiology, Aug. 1996, p. 3057-3060).
2. Beschreibung des Standes der Technik
Listeria monocytogenes ist ein bakterielles Pathogen, das viele Nahrungsmittelprodukte kontaminiert, deren Liste Weichkäse, Pastete, Eiscreme, geräucherten und gepökelten Fisch, gefrorene Meeresfrüchte, Salate und verarbeitetes Fleisch einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Wenn aufgenommen, können diese Bakterien eine als Listeriose bezeichnete Krankheit hervorrufen, die durch eine Vielzahl von Symptomen und Zuständen, einschließlich Diarrhöe, Fehlgeburt und Encephalitis, charakterisiert ist. Insgesamt treten in den Industrienationen jedes Jahr aufgrund einer Listeria monocytogenes Nahrungsmittel-Kontamination hunderte von Toten auf.
Die Nahrungsmittel-verarbeitende Industrie ist nicht hinreichend erfolgreich bei der Vernichtung von Listeria monocytogenes Bakterien aus der Umgebung der verarbeitenden Anlagen gewesen. Im Ergebnis wurden selbst Nahrungsmittel, die bei Temperaturen pasteurisiert worden sind, die hoch genug waren, um diese Bakterien zu töten, dennoch nach der Pasteurisierung kontaminiert. Die Bakterien erhalten auf einem oder mehreren Wegen, einschließlich (i) durch die Ausgangsmaterialien (z.B. Rohmilch und/oder Milch, die bei niedrigen Temperaturen pasteurisiert worden ist); (ii) durch die verarbeitenden Anlagen (in und an denen die Bakterien als Biofilme wachsen, die schwer zu vernichten sind); und (iii) durch Luft-übertragbare Bakterien, die in der Umgebung der Anlage vorhanden sind und sich auf der Oberfläche der Nahrungsmittel während der Haltbarmachung, Verpackung und so weiter ansiedeln, Zugang zu den Nahrungsmitteln.
Trotz der zahlreichen Methoden, die in der Nahrungsmittel-Industrie verwendet werden, um eine L. monocytogenes Kontamination zu kontrollieren und zu verhindern, erhalten die Bakterien Zugang zur Umgebung Nahrungsmittelverarbeitender Anlagen bzw. verbleiben in dieser. Darüber hinaus überleben sie die sehr hohen Salzkonzentrationen, die bei verschiedenen Nahrungsmittelherstellenden Verfahren gegenwärtig sind. Die resultierende Kontamination der Nahrungsmittel (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Käse, Pasteten, Aufschnitt, Hot Dog und andere verarbeitete Nahrungsmittel) führt in den Industrienationen jedes Jahr zu zahlreichen Toten und weiterhin zu Produkt-Rückrufen, deren Warenwert sich jedes Jahr in der Gesamtsumme auf hunderte von Millionen Dollar beläuft.
Die gegenwärtig verwendeten Methoden, um Listeria in der Nahrungsmittel-Industrie zu kontrollieren, beinhalten: (i) Pasteurisierung der Hauptinhaltsstoffe (z.B. Milch) und Hitzebehandlung der Produkte, was oftmals erfolglos ist, da häufig eine Rekontamination auftritt und viele Produkte einer abschließenden (listeriozidalen) Hitzebehandlung nicht unterzogen werden können; (ii) Anwendung physikochemischer Mittel, wie z.B. Desinfektionsmittel, Enzyme, Antibiotika, etc., wobei die Erfahrung gezeigt hat, dass diese die Bakterienzahl nicht hinreichend reduzieren; und (iii) Versuche, um Biofilme mechanisch aufzubrechen, wobei genügend Bakterienreste zurückbleiben, die die Nahrungsmittel abermals kontaminiert werden.
Daher müssen der Nahrungsmittel-verarbeitenden Industrie zusätzliche Methoden zugänglich gemacht werden, um die Gesundheit der Konsumenten zu schützen und um die Belastung zahlreicher Firmen hinsichtlich hoher Kosten und den Verlust des guten Willens als ein Ergebnis solcher Kontaminationen und Rückrufe zu reduzieren.
Die anwesenden Erfinder haben eine Reihe von Experimenten unter Verwendung eines L. Monocytogenes Stammes durchgeführt, der in der verarbeitenden Anlage eines bestimmten Herstellers von Weich- („Streich-") Käse vorherrscht. Dieser Bakterienstamm erwies sich in vitro als empfindlich gegenüber dem Phagen P100. Wie in dem Beispielabschnitt gezeigt wird, erwies sich der Phage P100 als imstande, die Listeria-Bakterien, die einer käseartigen Matrix zugesetzt wurden, unterhalb messbarer/nachweisbarer Grenzen zu reduzieren.
Überblick über die Erfindung
Der bei der ATCC unter der Patent-Hinterlegungsbezeichnung Nr. 4383 hinterlegte virulente Phage P100 sowie andere virulente Phagen der Myoviridae und Siphoviridae-Familien und virulente Mutanten verschiedener gemäßigter Phagenstämme (wie z.B. – jedoch nicht beschränkt auf – die Phagen B054, A118, A502, A006, A500, PSA, P35 und verwandte Viren) werden in der vorliegenden Erfindung verwendet, um Listeria monocytogenes Bakterien zu kontrollieren, die auf (oder in) Nahrungsmitteln vorkommen sowie Listeria monocytogenes Bakterien, die in den Anlagen oder der allgemeinen Umgebung der Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlagen, in denen die Nahrungsmittel verarbeitet werden, oder an Behältern, die für die Lagerung von Nahrungsmitteln verwendet werden, vorkommen. Dieser Phage kann auch verwendet werden, um mit Listeria monocytogenes infizierte Lebewesen zu behandeln.
Der virulente Phage P100 wird in der vorliegenden Erfindung verwendet, um Listeria monocytogenes Bakterien, die auf Nahrungsmitteln vorkommen, sowie diejenigen Listeria monocytogenes Bakterien zu kontrollieren, die in den Anlagen oder der allgemeinen Umgebung der Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlagen, in denen die Nahrungsmittel verarbeitet werden, oder an Behältern, die für die Lagerung von Nahrungsmitteln verwendet werden sowie in mit Listeria monocytogenes infizierten Lebewesen vorkommen. In der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter DNA-Vektor unter Verwendung eines virulenten Phagen P100 hergestellt, der spezifisch für Listeria monocytogenes ist. Der Vektor enthält ein genetisches System, das eine DNA umfasst, die für die Expression eines oder mehrerer nachweisbarer Proteine kodiert, die kein Genprodukt von Listeria monocytogenes sind. Der DNA-Vektor infiziert die Bakterien der Gattung Listeria und transferiert das genetische System in die Bakterien. Die nachweisbaren Proteine werden von den Bakterien exprimiert, wobei der Nachweis der nachweisbaren Proteine die Anwesenheit von Bakterien der Gattung Listeria und insbesondere Listeria monocytogenes anzeigt.
Ein aus P100 abgeleitetes Endolysin wird in Nahrungsmitteln (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Molkereiwirtschaft) sowie auf verarbeitenden Anlagen und in anderen Bereichen von Nahrungsmittel-Industrieeinrichtungen, wie z.B. Nahrungsmittel-Lagerbehälter, und als ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Lebewesen, die mit Listeria monocytogenes infiziert sind, verwendet, um die Anzahl von Listeria monocytogenes zu verringern und/oder an erster Stelle ihr Wachstum zu verhindern. Endolysine aus Listeria-Phagen weisen eine hohe Substratspezifität auf und lysieren fast ausschließlich Listeria-Zellen.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung des Phagen P100 gerichtet, welcher insbesondere für bakterielle Kontrollmethoden und für den Nachweis von Listeria monocytogenes geeignet ist. Der Phage stammt aus der Myoviridae-Familie und ist gegenüber Listeria monocytogenes Stämmen des Serovars ½ virluent.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt, dass wenn Listeria monocytogenes zu 10³ KbE pro ml Flüssigkultur inokuliert wird und Phagen mit einer Konzentration von 5 × 10⁸ PFU pro ml zugesetzt werden, eine nahezu vollständige Vernichtung der Listeria-Bakterien auftritt.
2 zeigt, dass das Aufbringen des Phagen P100 auf die Oberfläche eines Oberflächen-reifen Käses den Überwuchs von Listeria monocytogenes, womit die Starterkultur versetzt worden war, vollständig verhindert.
3 zeigt Phagentiter auf Käse (PFU/cm²)
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Mit „Vektor" ist ein Nukleinsäuremolekül gemeint, das zur Selbstreplikation imstande ist, wenn es in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Im Allgemeinen handelt es sich bei den Vektoren, die als Ausgangsmaterialien für die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Bakteriophagen, die hinsichtlich der Infektion von Bakterien der Gattung Listeria hoch spezifisch und bevorzugt absolut spezifisch sind und worin die rekombinanten Vektoren diese Spezifität beibehalten. Zum Beispiel ist der Listeria-Bakteriophage P100 ein geeigneter Vektor, der spezifisch Bakterien der Gattung Listeria (zwangsläufig lytisch) lysiert. Er ist ein Myovirus komplexer Bauart. Im Hinblick auf grundlegende Merkmale unterscheidet sich der Listeria-Phage P100 von vielen anderen bekannten Listeria-Phagen, wobei die Unterschiede die Morphologie, den Wirtsbereich und die Proteinprofile (Elektrophorese im SDS-Gel, isoelektrische Fokussierung, Aminosäurezusammensetzung der Hauptstrukturproteine, DNA/RNA-Hybridisierung) betreffen.
Zum Nachweis der Anwesenheit von Bakterien der Gattung Listeria werden Markergene genutzt. Bei diesen handelt es sich um Gene, die nach Infektion einer geeigneten Wirtszelle mit dem Vektor und nachfolgender Kultivierung der Zellen unter Bedingungen, die für die Expression der Markergene geeignet sind, nachgewiesen werden können. Es ist bevorzugt, dass die Markergene solche sind, die nicht in den Bakterien der Gattung Listeria auftreten und die unter Verwendung rekombinanter Techniken in den P100-Phagenvektor eingefügt werden. Solche Gene und ihre Genprodukte sind im Stand der Technik bekannt. Sie umfassen biolumineszierende Proteine, wie z.B. das lux-Gen, welches in Varianten in zahlreichen lumineszierenden Bakterien, z.B. der Gattung Vibrio, auftritt. Das
Einfügen des lux-Gens gestattet den Nachweis mittels Lumineszenzmessung. Ein Beispiel des lux-Gens ist das Gen luxAB aus Vibrio harveyi. Andere geeignete Proteine schließen Luziferase und fluoreszierende Proteine, wie z.B. das grün fluoreszierende Protein ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Nachweisreaktion kann auf einer festen Oberfläche stattfinden, die nicht beschränkend einen Teststreifen einschließt. In dieser Ausführungsform könnte der das Markergen enthaltende Vektor reversibel in einem Probenauftragsbereich oder stromabwärts davon immobilisiert sein. Alternativ könnte der Vektor vor dem Aufbringen auf den Teststreifen mit der Probe inkubiert werden. Anti-Listeria-Antikörper würden stromabwärts des Vektors und des Probenauftragsbereiches irreversibel immobilisiert werden. Wird eine Probe aufgebracht, die Listeria, bevorzugt Listeria monocytogenes enthält, würde der Vektor die Listerien infizieren und die nachweisbaren Proteine würden exprimiert werden. Da sich die Probe an dem Teststreifen nach unten bewegt, würden die Listerien durch die anti-Listeria-Antikörper immobilisiert werden. Die Markerproteine würden dann in den immobilisierten Listerien nachgewiesen werden.
Das Endolysin der vorliegenden Erfindung kann mittels im Stand der Technik bekannter Techniken isoliert werden, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – Lyse, Chromatographie, Filtration und Zentrifugation. Das Endolysin kann aus Listerien isoliert werden, die mit P100 inkubiert worden sind oder das Endolysin kann kloniert und in einem Wirtsbakterium (z.B. E. coli, L. lactis, S. aureus und B. cereus) exprimiert werden. Das Endolysin kann aus den Wirtsbakterien isoliert werden oder die Endolysin-enthaltenden Wirtsbakterien können direkt aufgebracht oder verabreicht werden, ohne das Endolysin zu isolieren. Zum Beispiel könnte ein Wirtsbakterium, dass das Endolysin produziert, einem Lebewesen verabreicht werden oder auf eine Oberfläche aufgebracht werden, wo das Endolysin in das Nahrungsmittel, auf die Oberfläche oder in den Darm eines Lebewesens abgegeben werden würde. Das Endolysin kann dann Listeria-Zellen angreifen, die in dieser Umgebung vorhanden sind. Eine Endolysin-Aktivitätseinheit wird als die Endolysin-Menge definiert, die notwendig ist, um die optische Dichte bei 600 nm um 0,01/min bei einem pH-Wert von 8,0 und bei 25 °C in einem Volumen von 1 ml abzusenken, wenn Hitze-abgetötete, gewaschene Listeria monocytogenes Zellen als Substrat verwendet werden.
Das oben erwähnte Endolysin und die oben erwähnten Endolysin-enthaltenden Wirtsbakterien und/oder Phagen werden an oder in Nahrungsmittelprodukten und/oder an verschiedenen technischen Standorten innerhalb Nahrungsmittelverarbeitender Anlagen durch eine Vielzahl an Mitteln aufgebracht, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – das Beimischen des Endolysins, Endolysinenthaltender Wirtsbakterien und/oder Phagen in die Nahrungsmittelprodukte, Aufsprühen des Endolysins, Endolysin-enthaltender Wirtsbakterien und/oder Phagen auf Nahrungsmittel, Aufsprühen des Endolysins, Endolysin-enthaltender Wirtsbakterien und/oder Phagen auf Anlagenvorrichtungen und/oder direktes Aufbringen des Endolysins, Endolysin-enthaltender Wirtsbakterien und/oder Phagen auf Anlagenvorrichtungen. Diese Anwendungen reduzieren signifikant die Anzahl von Listeria monocytogenes Bakterien, die sonst vorhanden wären.
Der Phage, das Endolysin und/oder das Endolysin-enthaltende Wirtsbakterium der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um Lebewesen, einschließlich Menschen zu behandeln, die mit Listeria monocytogenes infiziert sind. Jeder geeignete Verabreichungsweg, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – eine orale Verabreichung, ein Ärosol oder andere Geräte für die Zufuhr zu den Lungen, ein Nasenspray, eine intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrathecale, vaginale, rektale und topische Verabreichung, eine Lumbalpunktion, eine intrathecale Verabreichung und ein direktes Aufbringen auf das Gehirn und/oder die Hirnhaut kann verwendet werden, um den Phagen zu verabreichen. Hilfsmittel, die als ein Träger für die Phagen-, Endolysin-Zufuhr und/oder die Zufuhr Endolysinenthaltender Wirtsbakterien verwendet werden können, sind für einen Fachmann offensichtlich. Zum Beispiel könnte der freie Phage, das Endolysin und/oder das Endolysin-enthaltende Wirtsbakterium in lyophilisierter Form vorliegen und nur vor der Verabreichung mittels IV-Infektion aufgelöst werden. Für den Phagen wird eine Verabreichungsdosis im Bereich von etwa 10³ bis etwa 10¹³ PFU pro kg pro Tag und bevorzugt 10¹² PFU pro kg pro Tag angestrebt. Für das Endolysin wird eine Verabreichungsdosis im Bereich von etwa 2-2000 ng pro g pro Tag und bevorzugt 20-200 ng pro g pro Tag angestrebt. Der Phage, das Endolysin und/oder das Endolysin-enthaltende Wirtsbakterium wird verabreicht, bis eine erfolgreiche Eliminierung von Listeria monocytogenes erreicht ist oder bis die Menge an Listeria monocytogenes wesentlich reduziert ist.
Die vorliegende Erfindung erfasst auch die Verwendung der Phagen, des Endolysins und/oder der Endolysin-enthaltenden Wirtsbakterien, wenn sie in Kombination mit anderen im Stand der Technik bekannten anti-Listerienmitteln verwendet werden. Beispiele solcher bevorzugt mit Phagen, Endolysin und/oder Endolysin-enthaltenden Wirtsbakterien kombinierten anti-Listerienmittel umfassen – sind jedoch nicht beschränkt auf:
1. Endolysine (Phagenlysine):
Der Phage, das Endolysin und/oder das Wirtsbakterien, welches das Endolysin der vorliegenden Erfindung enthält, können mit Listeriolysinen kombiniert werden, bei denen es sich um Enzyme handelt, von denen gezeigt wurde, dass sie Listerien selektiv in Nahrungsmitteln und in der Umwelt kontrollieren können ( DE4326617C1 und EP 95932002.9 ).
2. Oberflächen-Desinfektionsmittel:
Der Phage, das Endolysin und/oder das Wirtsbakterien, welches das Endolysin der vorliegenden Erfindung enthält, können mit bekannten Oberflächen-Desinfektionsmitteln kombiniert werden, wie z.B. (i) Schutzmittel verschiedener Arten, wie z.B. – jedoch nicht beschränkt auf – Benzoesäure und BHT; und (ii) verschiedene Desinfektionsmittel, mit denen die Phagen kompatibel sind, wie z.B. – jedoch nicht beschränkt auf – quartäre Ammoniumverbindungen.
3. Antibiotika
Der Phage, das Endolysin und/oder das Wirtsbakterien, welches das Endolysin der vorliegenden Erfindung enthält, können in Kombination mit bekannten antimikrobiellen Mitteln (einschließlich Antibiotika und chemotherapeutische Mittel) verwendet werden, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – Vancomycin, Nisin, Danofloxacin und Neomycin.
4. Enzyme
Der Phage, das Endolysin und/oder das Wirtsbakterien, welches das Endolysin der vorliegenden Erfindung enthält, können in Kombination mit Enzymen verwendet werden, um das Aufbrechen von Biofilmen (z.B. Biofilme, die in Nahrungsmittel verarbeitenden Anlagen zu finden sind) zu unterstützen. Solche Enzyme sind im Stand der Technik bekannt und schließen Polysaccharid-Depolymeraseenzyme und Proteasen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
5. Tenside
Der Phage, das Endolysin und/oder das Wirtsbakterien, welches das Endolysin der vorliegenden Erfindung enthält, können mit bekannten Tensiden kombiniert werden, wenn sie verwendet werden, um Nahrungsmittel-verarbeitende Anlagen zu behandeln. Das Tensid hilft, die Oberfläche zu benetzen, so dass die Phagen geeignet über die verschiedenen Oberflächen verteilt werden und um Schmutz zu solubilisieren und zu entfernen, so dass die Listerien für die Phagen zugänglich sind. Geeignete Tenside schließen Tween 80, 20 und 81 sowie Dobanole ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
6. Bakteriophagen, die gegenüber bakteriellen Kontaminanten, die von Listeria monocytogenes verschieden sind, spezifisch sind
Der Phage, das Endolysin und/oder das Wirtsbakterien, welches das Endolysin der vorliegenden Erfindung enthält, können mit Listeria monocytogenes-spezifischen Phagen und/oder Phagen, die gegenüber anderen Bakterien, welche dafür bekannt sind, Nahrungsmittel-verarbeitende Anlagen und Nahrungsmittelprodukte zu kontaminieren, spezifisch sind, kombiniert werden. Solche Bakterien schließen E. coli und Bakterienarten der Gattungen Salmonella, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium und Pseudomonas ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Phagen können auf die Nahrungsmittelprodukte und Nahrungsmittelverarbeitenden Anlagen in einer flüssigen oder einer Puderform aufgebracht werden. Wenn sie in einer flüssigen Form aufgebracht werden, werden die Phagen in einer Konzentration von 10³ bis 10¹⁰ PFU (Plaque bildende Einheiten; "Plaque forming units") pro ml und bevorzugt in einer Konzentration von 10⁶ bis 10⁹ PFU (Plaque bildende Einheiten; "Plaque forming units") pro ml aufgebracht. Wenn sie als ein trockenes Puder aufgebracht werden, werden die Phagen in einer Konzentration von 10³ bis 10¹⁰ PFU (Plaque bildende Einheiten; "Plaque forming units") pro mg und bevorzugt in einer Konzentration von 10⁶ bis 10⁹ PFU (Plaque bildende Einheiten; "Plaque forming units") pro mg aufgebracht. Die Phagen können vor dem Aufbringen oder vor dem Trocknen in einem geeigneten Träger suspendiert werden, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – Lösungen, die BSA, Casein, Molkeprotein, Sojabohnenprotein, etc. enthalten und Zucker-basierte Träger, welche Zucker wie z.B. Mannitol enthalten. Die Phagen können lyophilisiert oder durch Vitrifizierung kryokonserviert werden und entweder vor dem Aufbringen in einer Lösung suspendiert oder direkt als ein trockenes Puder aufgebracht werden.
Geeignete Phagenmengen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – ein Batchverfahren, bei dem eine Wirtsbakterienkultur angezogen und dann mit dem Phagen versetzt wird. Nach einer Zeitdauer, die hinreichend ist, um eine maximale Phagenverbreitung und eine bakterielle Lyse zu gestatten, wird die Kultur weiter durch physikalische oder chemische Mittel lysiert und das Lysat herunter zentrifugiert. Der Phagen-enthaltende Überstand kann so verwendet werden oder unter Verwendung von Techniken, wie z.B. Ultrafiltration, Chromatographie und Zentrifugation weiter aufgereinigt werden.
Das Endolysin kann auf Nahrungsmittelprodukte und Nahrungsmittel-verarbeitende Anlagen in einer flüssigen oder einer Puderform aufgebracht werden. Das Endolysin wird in einer Konzentration zwischen 2 bis 2000 ng Endolysin pro ml oder pro Gramm Träger und bevorzugt zwischen 20 bis 200 ng Endolysin pro ml oder pro Gramm Träger aufgebracht.
Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, ist der Ausdruck "Molkereiprodukt" vorgesehen, jegliches Nahrungsmittelprodukt zu umfassen, das unter Verwendung von Milch oder Milchprodukten, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – Milch, Joghurt, Speiseeis, Käse, Butter und Sahne, hergestellt wird.
Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, ist der Ausdruck "Fleischprodukt" vorgesehen, jegliches Nahrungsmittelprodukt zu umfassen, das tierisches Gewebe, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – Rind, Schwein und Geflügel enthält. Der Term "Fertigfleischprodukt" ist vorgesehen, jegliches Fleischprodukt zu umfassen, das vor dem Verzehr nicht gekocht werden muss, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – Pasteten, Hotdogs, Mortadella, Salami und Aufschnitt.
Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, ist der Ausdruck "Fischprodukt" vorgesehen, jegliches Nahrungsmittelprodukt zu umfassen, das Gewebe aus einem Wasserlebewesen, einschließlich – jedoch nicht beschränkt auf – Hummer, Krabbe, Süß- und Salzwasserfisch und andere Meerestiere enthält.
Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, ist der Ausdruck "unpasteurisiertes Nahrungsmittelprodukt" vorgesehen, jegliches Nahrungsmittelprodukt zu umfassen, das unter Verwendung unpasteurisierter Primärbestandteile hergestellt wird und welches keiner abschließenden (listeriozidalen) Hitzebehandlung unterzogen wird.
Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, ist der Ausdruck "Salat" vorgesehen, jegliches Nahrungsmittelprodukt zu umfassen, das Mischungen von Gemüse oder Früchten und besonders solche Mischungen enthält, wie sie für Konsumenten präsentiert werden, um sie in einer Auslage, die gemeinhin als "Salatbar" bezeichnet wird, auszuwählen.
Beispiel 1
Vernichtung von Listeria monocytogenes in einer Flüssigkultur
Schritt 1. 10³ KbE von Listeria monocytogenes werden in eine Flüssigkultur eingemischt.
Schritt 2. 5 × 10⁸ PFU des Phagen P100 werden zu der Flüssigkultur zugemischt. Schritt 3. Als Kontrolle wurde der Puffer, in dem der Phage P100 suspendiert wurde, zu einem Aliquot der Flüssigkultur zugemischt.
Schritt 4. Die Kolonieanzahl der Bakterien wurde zu verschiedenen Zeitintervallen bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Beispiel 2
Ein Aufgaben-relevantes Experiment wurde an einem Käsemodell im Labormaßstab unter Verwendung eines anti-Listeria monocytogenes Phagen-Stammes, der als P100 bekannt ist, durchgeführt. Dieses Experiment berücksichtigte die technische Flora, um die Oberflächenreife-Qualitäten (Geschmack, Textur, etc.) zu erreichen, die für einen gängigen kommerziellen Käseherstellungsprozess typisch sind. Der als Stamm C bekannte Listeria monocytogenes ("Lm") Stamm, der in diesem Experiment verwendet wurde, ist eine übliche Kontaminante einer bestimmten Käseherstellenden Anlage.
Materialien und Methoden
Aufgaben-relevantes Experiment an Käse

– Das Experiment wurde an Käse durchgeführt, der direkt aus der Lake genommen wurde (nicht eingestellter pH-Wert).
– Lm-Stamm C, die technische Flora und der Phage P100 wurden auf den Käse bei t=0 durch Plattieren von 210 μl oder 1 ml der Inkubationsmischung auf 64 cm² Käseoberfläche aufgebracht. Bei t=0 handelt es sich um denselben Zeitpunkt wie "CMD+1" (Käseherstellungstag + 1; "Cheese Making Day + 1"). Die mit 1 ml Lösung behandelten Käse wurden anschließend in einem Laminarströmungsschrank getrocknet, um die Oberfläche zu trocknen. Die Inkubationsmischung bestand aus:
– 110 g/l NaCl
– Technische Flora:
– Debaromyces hansenii NIZO F937 und NIZO F1200 (Hefen) zu 10⁸ KbE/ml Brevibacterium linens NIZO B1204 (ein für roten Schmierkäse typisches Bakterium) zu 10⁸ KbE/ml
– LmC entsprechend zu einer Konzentration von 7 KbE/cm² (verdünnt in pfz aus einer exponentiell wachsenden Kultur)
– Phage P100 (in MOPS-Puffer) bei einer Konzentration von entsprechend 1 × 10⁷ PFU/cm² oder 5 × 10⁵ PFU/cm² Siehe Tabelle 1 für genaue Behandlungskombinationen
– Die Käse wurden bei 14 °C und 98%-99% relativer Feuchte inkubiert.
– Die Käse wurden täglich mit 210 μl oder 1000 μl Waschlösung behandelt, die an CMD+6, CMD+10 und CMD+13 P100 enthält, wobei 1 ml/70 cm² eingesetzt wurde (Behandlungskombination 4 und 5).
– Die Waschlösung enthielt:
– 110 g/l NaCl
– Brevibacterium linens NIZO B1204 zu 10⁸ KbE/ml
– Phage P100 (in MOPS Puffer) bei einer Konzentration entsprechend 1 × 10⁷ PFU/cm² oder 5 × 10⁵ PFU/cm²
– Die Käse wurden unter Verwendung von Pergamentpapier, einem Material, das zum Verpacken von Munster Käse verwendet wird, an CMD+16 verpackt (CMD+16 ist der Verpackungstag ("packaging day"; PD)).
– Die Käse wurden bei 6 °C bis PD+63 gelagert
– Die LMC-Anzahl wurde zu den in Tabelle 1 angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die Analyse wurde vor der Behandlung mit den Phagen durchgeführt.
– Quantitativ: 70 cm² Proben wurden aus dem Käse ausgeschnitten und auf Selektivmedien analysiert.
– Qualitativ an CMD+1 und CMD+37 mittels Anreicherungsverfahren.
– Die qualitative/quantitative Analyse wird auch von dem Niveau des Listeria-Überwuchses auf den Käsen abhängen. Wenn die Zellanzahl >10² ist, werden keine Anreicherungen durchgeführt. War die Zellanzahl niedriger, wurden vor dem Verpacken Anreicherungen durchgeführt.
– Weiterhin Analyse von pH-Wert und technischer Flora
– Bei einem Käse wurden die Phagentiter vor und nach dem Aufbringen der Phagen an CMD+6 bestimmt.

Ergebnisse
Die Reifung des Käses war gut, da Hefe und Brevibacterium gut auf dem Käse anwuchsen und die Käseoberfläche entsäuert war.
In diesem Modell wuchs Listeria monocytogenes C auf der Käseoberfläche gut an zu Pegeln von 10⁵-10⁷ KbE/cm² in den Negativkontrollen (Negativkontrolle: keine Phagen aufgebracht) (2).
Wie in 2 zu sehen ist, inhibierte der Phage P100 vollständig das Wachstum von LmC. Bei Verwendung des quantitativen Plattenzählverfahrens oder bei der Anreicherung wurde Listeria nicht nachgewiesen. Die Nachweisgrenze bei Verwendung des Anreicherungsverfahrens liegt in der Größenordnung von einem Listerium pro 60 cm². Dies weist darauf hin, dass der Phage P100 nicht nur das Wachstum inhibierte, sondern sogar die Listerientiter reduzierte.
Wie in 2 dargestellt, verhinderte das Aufbringen des Phagen P100 auf die Oberfläche eines Oberflächen-gereiften Käses vollständig das Aufwachsen von Listeria monocytogenes, das der Starterkultur zugesetzt worden war.
Schlüssel: CMD = Käseherstellungstag ("Cheese-making day")
PD = Verpackungstag ("Packaging day")
Um zu bestimmen, ob Phagen auf der Käseoberfläche überleben können, wurden die Phagentiter in einem weiteren Teil des Experiments (in dem eine hohe oder eine niedrige Phagendosis auf die Käseoberfläche aufgebracht wurde) vor sowie nach dem Aufbringen der Phagen an CMD+6 bestimmt. Bei allen Proben wurden die Phagen an CMD+1, CMD+2, CMD+3 und CMD+4 aufgebracht. Daher waren die Phagen in den Proben, die vor dem Aufbringen der Phagen genommen wurden (an CMD+6), für mindestens 48 Stunden auf dem Käse vorhanden. Bei beiden Dosen wurden aktive Phagen von der Käseoberfläche gewonnen (3). Die Phagentiter der Proben, die vor dem Aufbringen der Phagen an CMD+6 genommen wurden, waren geringer als die Proben nach dem Aufbringen der Phagen. Der Anstieg im Phagentiter stimmte mit dem erwarteten Anstieg, der auf der zugesetzten Dosis (d.h. entweder 1 × 10⁷ PFU/cm² oder 5 × 10⁵ PFU/cm²) basierte, gut überein. Die Ergebnisse zeigen, dass der Phage P100 auf der Käseoberfläche für mindestens mehrere Tage aktiv bleibt.
Beispiel 3

Analyse, Überexpression und Aufreinigung von Endolysinen aus E. coli JM109(pHPLxxx)

Plattenanalyse

1. Erzeugen eines Listeria monocytogenes-Analysestammes für den Aktivitätstest: Anzucht einer 1000 ml Übernachtkultur in Tryptose-Nährmedium oder Tryptikase-Soja-Nähmedium, Zentrifugieren, einmaliges Waschen der Zellen mit SM-Puffer, pH 8,0 (siehe Sambrook et al., 1989), (oder PBS) und Resuspendieren in 20 ml SM-Puffer (oder PBS) (etwa 50-fache Konzentration).
2. Lagerung in 1 ml Mengen bei -20 °C oder bei -80 °C.
3. Ausstreichen oder Plattieren von E. coli JM109(pHPLxxx) auf LB-Agar (welcher 100 μg/ml Ampicillin enthält) und Inkubation über Nacht.
4. Erzeugen eines Plattenabdruckes (mit NC-Filtern) auf mit 1 mM IPTG supplementierte LB-Amp Platten, wenn die Kolonien eine hinreichende Größe aufweisen. Inkubation für 5-7 Stunden bis kleine Kolonien sichtbar sind.
5. Exponieren der Plattenoberfläche (obere Seite nach unten) in Gegenwart Chloroform-getränkten Filterpapiers für 5 min.
6. Schnelles Überziehen der Kolonien mit 3-4 ml geschmolzenem Weichagar (0,4% in SM-Puffer, etwa 45 °C), der mit 0,5 ml einer 50-fach konzentrierten L. monocytogenes Kultur versetzt ist (Überzug sollte dünn, eben und völlig trüb sein).
7. Inkubation bei RT für 60 min (bis über Nacht) bis rund um die Kolonien klare Lysezonen sichtbar werden. Dies kann in einem Bereich von 5 Minuten bis 5 Stunden jederzeit erfolgen. (Dies ist eine wichtige Untersuchung; Sie muss funktionieren. Andernfalls kann ein Problem mit dem Stamm oder dem Aktivitätstestverfahren bestehen.)

Herstellung

8. Erzeugen einer JM109(pHPLxxx)-über-Nacht-Kultur in LB-Nährmedium mit 100μg/ml Amp bei einer 30-35°C-Inkubation.
9. Inokulieren von 250 ml vorgewärmtem Nährmedium mit 10 ml ü.N. Kultur am Morgen, Kultivieren bis zu einer OD600 von 0,5-0,6.
10. Induktion mit 1 mM IPTG, Inkubation für weitere 3-4 h bis die Wachstumsrate beginnt aufzuhören.
11. Zellernte mittels Zentrifugation, Resuspendieren des Pellets (der Pellets) in 5 ml PBS (pH 8,0), 0,05% Tween20 oder – wenn eine stromabwärts gerichtete Ni-NTA-Aufreinigung erforderlich ist – Puffer A (siehe unten) pro 250 ml Kultur. Einfrieren der Zellen bei -20°C.
12. Auftauen der Zellen. Erzeugen von Zellextrakten mittels French-Press; Zentrifugation (>30000 × g, 30 min) und Filtration des Überstandes (0,2 μm Filter, bevorzugt aus PES hergestellt). Lagern des Enzym-enthaltenden Extraktes auf Eis (wenige Stunden) oder bei -20 °C (Anmerkung: Ultraschall kann ebenfalls verwendet werden, jedoch sind die mittels French-Press erhaltenen Ausbeuten im Allgemeinen viel besser).

Photometrische Aktivitätsuntersuchung (OD600)

13. Verwendung frisch gewachsener Zellen der mittleren log-Phase bis Ende der log-Phase oder der vorher gefrorenen L. monocytogenes Zellen aus Schritt 1 (oben). Resuspendieren in PBS-Puffer, pH 8,0, 0,05% Triton X100 (Einstellen der OD auf etwa 1,0-1,5). Verwendung von halb-mikro-Kunststoffküvetten (1 ml), Zugabe von 900 μl Zellen, Vorwärmen auf mindestens RT, bevorzugt jedoch auf 30-37 °C und Zugabe von 50-100 ml Enzym. Die Trübung sollte innerhalb von 5 Minuten oder weniger auf 0,5 oder darunter sinken. Dieser Rohextrakt kann für die Lyse von Listeria-Zellen und die Freisetzung chromosomaler DNA, von Plasmiden, Proteinen und Enzymen verwendet werden. Jedoch enthält er große Mengen an E. coli-Proteinen, Nukleinsäure (DNA, RNA)fragmente, ATP und kontaminierenden pHPL-Vektor. Wenn dies nicht gewünscht ist, sind die Enzyme mittels IMAC (siehe unten) aufzureinigen.

Aufreinigung

14. Fraktionieren des Rohextraktes mit einem Ni-NTA-Granulat. Das in den Schritten 8-11 dargelegte Verfahren eignet sich für die Flüssig-Chromatographie (FPLC oder ähnlich, siehe Schritt 15), die sehr empfohlen wird. Jedoch kann es für eine Aufreinigung im Kleinmaßstab auch in einem einfacheren Chargentyp-Verfahren durchgeführt werden: Verwendung von etwa 3 ml Granulat (Ni-NTA-Agarose) pro 250 ml Initialkulturvolumen. Nach der Exposition des Granulates in Gegenwart von Proteinen, werden Waschschritte (in Chargen) mittels Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (weniger als 500 × g) durchgeführt. Sammeln des Granulates nach dem letzten Waschen und Aliquotieren in Portionen von 1-2 ml in kleine Einweg-Kunststoffsäulen (erhältlich von BioRad und anderen); platzieren in 15 ml Röhrchen mit konischen oder runden Böden. Zugabe von Elutionspuffer (etwa 1 ml) (100% B), Stehen lassen für 5 Minuten, Zentrifugieren und Sammeln der Flüssigkeit. Wiederholen der Elution 1-2 mal. Fortfahren mit Schritt 19.
15. FPLC-Reinigung: Herstellen ausreichender Mengen an Puffer A (50 mM Phosphat-Puffer, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol) und Puffer B (wie A, jedoch 250 mM Imidazol). Verwenden eines Imidazol-Gradienten mit den Puffern A und B. Laden des Extraktes (bis zu 40 ml = Extrakt aus 2 Litern Kultur (8 × 250 ml)) auf die Ni-NTA-Säule (25 ml Volumen). Verwenden einer niedrigen Flussrate (0,75 bis 1,0 ml/min). Wenn nötig Regenerieren des Ni-NTA-Granulates (Ni-NTA-Superflow) vor der Aufreinigung eines jeden einzelnen Enzyms durch das im Qiagen-Handbuch dargelegte Verfahren. Eine neue oder regenerierte Säule kann für mindestens 5 Läufe verwendet werden.
16. Waschen mit 5 Säulenvolumen 100 % Puffer A (Flussrate 2 bis 3 ml/min)
17. Waschen mit 3 bis 5 Säulenvolumen 12% Puffer B (Gesamtkonzentration etwa 35 mM Imidazol) bis die abgelesene Basislinie (bei 280 nm) stabil ist. Dieser Schritt wird die meisten kontaminierenden Proteine entfernen (Man sollte sich im Klaren darüber sein, dass Imidazol selbst den Messwert bei 280 nm erhöht!).
18. Eluieren der Enzymfraktion mit 250 mM Imidazol (100% Puffer B). Es ist am besten, die Peaks manuell zu sammeln (bezüglich der rechten Schulter des Peaks ist zeitig zu stoppen – man sollte sich nicht durch die höhere Eigenabsorption des Imidazols beirren lassen). Lagern auf Eis. Die frisch eluierten Fraktionen nicht einfrieren, denn die Enzyme zeigen eine Tendenz in der Kälte in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen und Imidazol zu präzipitieren!
19. Kontrolle aller eluierten Fraktionen mittels photometrischer Aktivitätsuntersuchung (siehe oben).
20. Konzentrations- und Pufferaustausch (Entfernen von Imidazol und Hochsalz) aktiver Fraktionen mit Zentrifugenfiltereinheiten (PES-Membran, Mr-Ausschluss 10 kDa). Vorbehandeln der Membran mit Lysis-Puffer (PBS, pH 8,0, 0,05% Triton X100, 0,05% Tween20). Zweimaliges Waschen mit 5 ml Lysis-Puffer. Transferieren auf neue Filtereinheiten, falls die Membran mit Protein verstopft wird. Sterilisieren des Filters unter Verwendung eines 0,2 μm Spritzenfilters (Verwenden einer PES-Membran-Zellulose wird viele der Enzyme zurückbehalten!). Alternativ kann ein Pufferaustausch mittels Dialyse einer konzentrierten Proteinlösung (PBS oder Tris-Puffer, 0,05% Tween20) durchgeführt werden. Wir fanden heraus, dass HPL118 (jedoch nicht HPL511 oder HPL500) während einer verlängerten Dialyse zu einer Aggregation tendiert.
21. Kontrollieren der Fraktionen mittels SDS-PAGE, Bewerten der Proteinreinheit (Diese sollte eine mehr als 90%ige Reinheit aufweisen.) und der Proteinkonzentration (typischerweise im Bereich von 2-4 mg/ml). Weist die Präparation keine ausreichende Reinheit auf, kann versucht werden, die Säule mit 15% Puffer B zu waschen (Schritt 10) und HPL-Proteine mit 150 mM Imidazol (60% Puffer B) oder 200 mM Imidazol (80% Puffer B) zu eluieren. Man kann ebenso die gesamte Initialproteinpräparation wieder auf die Säule laden (vor dem Wiederbeladen mindestens 10fach verdünnen oder Dialysieren, um Imidazol zu entfernen) und eine 2. Aufreinigung unter Verwendung geänderter Bedingungen, wie z.B. ein pH-Gradient durchführen. Eine Gelfiltration erhöht ebenfalls die Proteinreinheit. Jedoch wird dies sicher nicht für alle Standardanwendungen benötigt.
22. Einstellen der konzentrierten Enzymlösung zu einem Endgehalt von 30-50% Glycerin, Aliquotieren in 50-500 μl Portionen, Lagern bei -25 °C. Unter diesen Bedingungen sind die Enzyme für mehrere Monate stabil. Das Einfrieren bei -80 °C führt mitunter zu einem Aktivitätsverlust.

Diskussion und Fazit
Wenn die Oberfläche eines Oberflächen-gereiften Käses mit Listeria monocytogenes Bakterien zusammen mit einer Starterkultur versetzt wurde, vernichtete das Aufbringen einer hinreichenden Dosis von P100 Phagen auf die Oberfläche vollständig die Bakterien, wie durch Anreicherungsstudien (Nachweisgrenze unter Verwendung der Anreicherung: 1 Listerien-KBE pro 60 cm² der Käseoberfläche) bestätigt wird. In allen mit den Phagen behandelten Käse (hohe oder niedrige Konzentration, einmaliges oder mehrfaches Aufbringen) war der Listerientiter nach der Behandlung mit P100 niedriger als in den Kontrollen. Listerien traten nur auf, wenn die Phagen lediglich einmal (anstatt zu mehreren Zeitpunkten) oder in niedriger Konzentration aufgebracht wurden. Die Phagen können auf dem Käse für mehrere Tage aktiv bleiben.

Claims

Verfahren zur Bekämpfung einer Listeria-Kontamination in einem Nahrungsmittelprodukt, auf einer Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlage oder auf Nahrungsmittel-Lagerbehältern, umfassend die Applikation des lytischen Phagen P100, ATCC Patent-Hinterlegungsbezeichnung Nr. PTA-4383 auf ein Nahrungsmittelprodukt oder eine Nahrungsmittel-verarbeitende Anlage in einer Menge, die ausreichend ist, um die Menge an Listeria zu reduzieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin P100 in Kombination mit dem Phagen A511, ATCC Patent-Hinterlegungsbezeichnung Nr. PTA-4608, appliziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der lytische Phage in Kombination mit mindestens einem Agenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysteriolysin, einem Oberflächendesinfektionsmittel, einem Antibiotikum, einem Tensid, einem Enzym und einem Phagen, der für bakterielle Kontaminationen, anders als Listeria monocytogenes, spezifisch ist, appliziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Nahrungsmittelprodukt ein Molkereiprodukt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Nahrungsmittelprodukt ein unpasteurisiertes Nahrungsmittelprodukt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Nahrungsmittelprodukt ein Fleischprodukt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Fleischprodukt ein Fleischprodukt zum sofortigen Verzehr ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Nahrungsmittelprodukt ein Fischprodukt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Nahrungsmittel-Lagerbehälter eine Salatbar und das Nahrungsmittelprodukt Salat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Nahrungsmittel-verarbeitende Anlage ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Rohr, durch das Milch gepumpt wird, einem Hochsalzgehalt-Tank zur Verarbeitung von Käse, einem Behälter, aus dem Kulturen auf die Oberfläche eines Käses appliziert werden, einer Regalwand, an der ein Produkt getrocknet und geräuchert bzw. gepökelt wird und einem Bodenabfluss.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der lytische Phage durch Mischen mit einem flüssigen oder halbfesten Nahrungsmittelprodukt appliziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der lytische Phage mit einer Flüssigkeit gemischt und auf eine Oberfläche, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nahrungsmittelprodukten, einer Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlage oder Nahrungsmittel-Lagerbehältern, aufgesprüht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin der lytische Phage in Kombination mit einem Agenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysteriolysin, einem Oberflächendesinfektionsmittel, einem Antibiotikum, einem Tensid, einem Enzym und einem Phagen, der für bakterielle Kontaminationen, anders als Listeria monocytogenes, spezifisch ist, auf eine Nahrungsmittel-verarbeitende Anlage appliziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der lytische Phage lyophilisiert oder durch Vitrifizierung kryokonserviert wird und in einer trockenen Form auf das Nahrungsmittelprodukt, die Nahrungsmittel-verarbeitende Anlage und Nahrungsmittel-Behälter appliziert wird.
Zusammensetzung, umfassend den Phagen P100, ATCC Patent-Hinterlegungsbezeichnung Nr. PTA-4383 und einen Träger.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, weiterhin umfassend den Phagen A511, ATCC Patent-Hinterlegungsbezeichnung Nr. PTA-4608.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, weiterhin umfassend ein Agenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysteriolysin, einem Oberflächendesinfektionsmittel, einem Antibiotikum, einem Tensid, einem Enzym und einem Phagen, der für bakterielle Kontaminationen, anders als Listeria monocytogenes spezifisch ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin der Träger ein pharmazeutisch zulässiger Träger ist.
Verwendung der Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 15-18 beansprucht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit Listeria monocytogenes infizierten Lebewesens.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin das Medikament weiterhin den Phagen A511 umfasst.
Phage P100, hinterlegt bei der American Type Culture Collection, ATCC Patent-Hinterlegungsbezeichnung Nr. PTA-4383.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Listeria monocytogenes, umfassend den Erhalt einer Probe, die verdächtigt wird, Listeria monocytogenes zu enthalten, Inkubieren der Probe mit P100 gemäß Anspruch 21 und Detektion einer durch P100 verursachten Veränderung als einen Hinweis auf die Anwesenheit von Listeria monocytogenes.
Verfahren gemäß Anspruch 22, worin die Änderung in der Probe aufgrund einer Lyse durch P100 oder aufgrund einer detektierbaren Markierung oder eines Signals erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 22, weiterhin umfassend das rekombinante Einfügen eines Genkonstruktes in das Genom von P100 vor einer Inkubation mit der Probe, worin die Expression des Genkonstruktes in Anwesenheit von Listeria monocytogenes zu einem nachweisbaren Signal führt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, worin das Genkonstrukt für ein biolumineszierendes Protein kodiert.
Verfahren gemäß Anspruch 25, worin das biolumineszierendes Protein ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Luziferase und einem Fluoreszenzprotein.
Verfahren gemäß Anspruch 26, worin die Luziferase aus Bakterien oder Insekten ist.
Verfahren gemäß Anspruch 26, worin das Fluoreszenzprotein das grün fluoreszierende Protein oder eine Variante davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, weiterhin umfassend das Immobilisieren von Listeria monocytogenes auf einem festen Träger und Detektieren jeder Veränderung auf dem festen Träger.
Verfahren gemäß Anspruch 29, worin Listeria monocytogenes unter Verwendung von anti-Listeria-Antikörpern immobilisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 30, worin der feste Träger ein Teststreifen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, worin die Probe aus einem Patienten erhalten wird, der verdächtigt wird, mit Listeria monocytogenes infiziert zu sein.
Verfahren gemäß Anspruch 22, worin die Probe aus einem Nahrungsmittelprodukt, einer Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlage oder Nahrungsmittel-Lagerbehältern erhalten wird.
Aufgereinigtes Endolysinprotein, erhältlich aus dem Phagen P100.
Verfahren zur Bekämpfung einer Listeria-Kontamination in einem Nahrungsmittelprodukt, auf einer Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlage oder auf Nahrungsmittel-Lagerbehältern, umfassend die Applikation des Endolysinproteins gemäß Anspruch 34 auf ein Nahrungsmittelprodukt, eine Nahrungsmittel-verarbeitende Anlage oder einen Nahrungsmittel-Lagerbehälter in einer Menge, die ausreichend ist, um die Menge an Listeria zu reduzieren.
Verfahren gemäß Anspruch 35, weiterhin umfassend die Applikation mindestens einer Art eines lytischen Phagen aus der Myoviridae Familie auf ein Nahrungsmittelprodukt, eine Nahrungsmittel-verarbeitende Anlage oder einen Nahrungsmittel-Lagerbehälter.
Verfahren gemäß Anspruch 35, worin der lytische Phage ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus P100 und A511.
Verfahren gemäß Anspruch 35, worin das Endolysin rekombinant hergestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 35, weiterhin umfassend die Applikation von Endolysin aus mindestens einem anderen Phagen, der Listeria oder eine andere Bakteriengattung infiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 39, worin der andere Phage A511 ist.
Protein gemäß Anspruch 34, worin das Endolysinprotein rekombinant hergestellt wird.
Zusammensetzung zur Bekämpfung einer Listeria-Kontamination in einem Nahrungsmittelprodukt, auf einer Nahrungsmittel-verarbeitenden Anlage oder auf Nahrungsmittel-Lagerbehältern, umfassend Endolysinprotein, erhältlich aus Phage P100 gemäß Anspruch 34 und einem geeignetem Träger.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 42, weiterhin umfassend mindestens eine Art eines lytischen Phagen aus der Myoviridae Familie.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 43, worin der lytische Phage ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus P100 und A511.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 42, worin das Endolysin in einem Wirtsbakterium rekombinant hergestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 22, worin ein Genkonstrukt rekombinant in P100 eingefügt worden ist, um ein Signal bereitzustellen oder zu emittieren, um die Detektion von Listeria monocytogenes zu bestätigen.
Verfahren gemäß Anspruch 46, worin das Genkonstrukt ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Luziferase- und grün fluoreszierendes Protein-kodierenden Genen.