CN101220350B - 一种分离的李斯特单核增生菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离的李斯特单核增生菌噬菌体及其作为生物杀菌剂在食品和抗感染中的应用。所述的分离出的噬菌体单体(单增李斯特菌噬菌体，拉丁名ListeriaMonocytogenes Bacteriophage)命名为BPH-LM-1对李斯特单核增生菌均有广谱的杀菌能力。噬菌体BPH-LM-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏编号2254。
Description
技术领域
本发明涉及到能够特异性裂解李斯特单核增生菌(Listeria monocytogenes)菌株的噬菌体分离物和其作为生物杀菌剂在食品及在抗感染中的应用。属于生物工程领域。
背景技术
李斯特菌是近十几年来报道较多的病原菌之一，该菌分布十分广泛，且该菌在4℃时仍能够缓慢生长。食品是该菌致病的主要载体，肉类，蛋类，禽类，海产品，乳制品，蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。由该菌引起的人畜共患性疾病已成为全球性疾病。在西方国家，李斯特菌的感染最近呈上升趋势，曾经在美国、加拿大、法国等国家引起严重的食品中毒事件，已成为一个典型的环境卫生问题。
最新资料表明，北京零售鲜肉和蒸煮肉制品上李斯特单核增生菌的污染率分别为8％和4％。李斯特单核增生菌已在许多类型的西式肉制品如法兰克福香肠，咸牛肉和蒸煮火腿中检出。欧洲和加拿大的即食肉制品中其检出率在13％到50％之间在速冻食品中李斯特菌污染率较高达14.3％，随着我国现代化食品加工业的发展，一旦存在此菌的污染源，就可导致大量产品的污染由于李斯特菌其低温增值的特性，容易达到感染的菌量。
目前防治细菌感染的传统方法主要为大量使用抗生素和添加化学杀菌物质。广泛应用抗生素非但成本高而且已经催生很多超级耐药细菌，而应用化学制剂杀菌不但对环境造成污染，且对人类健康造成危害。
噬菌体(bacteriophage，phage)是一种细菌病毒，可以特异性感染并裂解一种或少数几种细菌。一类噬菌体感染细菌后将其遗传物质整合到细菌的DNA里，随着细菌的繁殖而繁殖，一旦外界条件合适就裂解细菌细胞，而引起细菌死亡，这种噬菌体叫做温和噬菌体。另一类噬菌体一旦感染细菌，就利用细菌合成子代噬菌体，然后裂解细菌细胞而释放，这种噬菌体成为烈性噬菌体。噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内，对动植物细胞和其它细菌没有感染性。因而噬菌体是安全的。
发明内容
本发明的一个目的是开发对李斯特单核增生菌具有强烈裂解作用的噬菌体分离物，该分离物可以单独或混合使用可以特异性的部分或完全灭活李斯特单核增生菌，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供噬菌体株来源。
本发明的另一目的是开发一种新型的安全的生物杀菌剂作为食品添加剂防止由李斯特单核增生菌引起的食品污染，避免由于食用该菌污染的食品引起的细菌感染。
本发明的又一目的是提供一种用于食品特别是方便即食产品生产环境的安全的生物净化杀菌剂用以防止食品加工过程中造成的李斯特单核增生菌污染。
本发明的再一目的是为治疗由李斯特单核增生菌引起的感染提供潜在治疗药物。
本发明从自然界中分离得到噬菌体分离物，该噬菌体分离物包括一种或多种对李斯特单核增生菌具有裂解作用的噬菌体，经纯化可得噬菌体单体。证明该噬菌体分离物中的噬菌体单独或混合使用对李斯特单核增生菌具有实质裂解作用。上述分离出的噬菌体单体(单增李斯特菌噬菌体，拉丁名Listeria Monocytogenes Bacteriophage)命名为BPH-LM-1对李斯特单核增生菌均有广谱的杀菌能力。噬菌体BPH-LM-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏编号2254。
本发明中噬菌体BPH-LM-1经小鼠毒理实验，给予1011pfu/kg的噬菌体样品对实验小鼠未见异样，连续给予15天后，将小鼠断颈处死，尸检，违发现其内脏有异样变化。与其他实验结果相同。该噬菌体是安全的。
本发明中噬菌体BPH-LM-1可以单独或混合使用，在液体中的杀菌极限为终浓度7×105pfu/ml，即，在对数生长期内的李斯特单核增生菌中加入该噬菌体单体或混合物，可以在4-6h内完全灭活该菌。本发明中噬菌体可应用于液体食品，包括但不限于乳制品、饮料等防止李斯特单核增生菌的污染。
本发明中噬菌体BPH-LM-1可以单独或混合使用，对被李斯特单核增生菌污染的固体食品表面喷洒106pfu/ml-107pfu/ml数量级的噬菌体，108pfu/ml-1011pfu/ml的效果尤佳，可以在24小时内完全灭活李斯特单核增生菌。且在一个月内李斯特单核增生菌检验呈阴性。提示：本发明中噬菌体可应用于防止固体食品，包括但不限于方便即食产品的李斯特单核增生菌污染。
本发明中的噬菌体BPH-LM-1可以单独或混合使用，可以作为杀菌剂喷洒于食品生产车间，可特异性、持续防止该环境中李斯特单核增生菌的生存和繁殖，防止食品加工过程中的污染。
本发明中的噬菌体BPH-LM-1可以单独或混合使用，可作为一种潜在药物治疗由李斯特单核增生菌引起的细菌感染。
本发明中噬菌体可以和其他噬菌体联合使用，以或得较宽的噬菌范围。
本发明中噬菌体可以和其他抗菌剂混合使用，在获得抗菌广谱性的同时，对李斯特单核增生菌特异性杀灭。能与该发明中噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化学抗菌剂。
本发明中噬菌体可应用于工业生产，可由宿主菌李斯特单核增生菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，作为食品抗菌添加剂防止食品中李斯特单核增生菌污染。
附图说明
本发明采用的噬菌体BPH-LM-1为单增李斯特菌噬菌体，拉丁名ListeriaMonocytogenes Bacteriophage，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏编号2254。
图1为温度对本发明所述的噬菌体BPH-LM-1的影响曲线图
图2为本发明所述的噬菌体生长曲线
图3为本发明所述的噬菌体在固体食品火腿肠中的杀菌能力
图4为本发明所述的噬菌体在液体食品牛奶中的杀菌能力
具体实施方法
实施案1
噬菌体的筛选和纯化
(一)样品的采集及处理
本发明中样品采自珠海本地，包括中山大学第五附属医院未处理污水、珠海市市内下水道污水、排污入海口处海水、珠海市家禽养殖场、珠海市养猪场、珠海市屠宰场。
采集的样品用NaOH调节，使pH约为7.0，经过4000r/min离心15min，用0.45um滤膜过滤得上清液。.取过滤除菌后的样品75ml，加入25ml4倍LB培养基。
(二)样品中针对李斯特单核增生菌的噬菌体特异性扩增
在处理好的样品中加入预先扩增好的李斯特单核增生菌(OD600约为1.0，加入比例为1∶100)，将其置于恒温摇床30℃，250r/min培养6-8h。
(三)斑点实验测定特异性噬菌体
李斯特单核增生菌双层检测平板的制备：
高温灭菌0.75％-2.0％LB固体培养基，室温放置至约40-60℃，取10-15ml倾倒至培养皿内，均匀铺于皿底，室温放置30min，使其凝固。将经过高温灭菌的0.2％-0.9％LB琼脂糖培养基融化，40℃-48℃水浴保温。取李斯特单核增生菌0.2ml-0.8ml，加入步骤2中0.5％LB琼脂糖3.6-5ml，混匀，倒入步骤1制得的培养皿内，室温放置凝固。将李斯特单核增生菌双层检测平板30℃保温培养1h。
取上述经李斯特单核增生菌扩增后的样品1ml，8000r离心15min，上清液经0.22um过滤膜过滤除菌。取5ul点于李斯特单核增生菌双层检测平板上，30℃过夜培养，观察有无噬斑，如果有进行步骤(四)。(以上操作均为无菌条件)
(四)噬菌体样品的分离及噬菌体样品的扩增
将步骤(三)中在李斯特单核增生菌双层检测平板中呈现噬斑的样品，经过适当比例稀释，按如下步骤纯化。将制备好的LB平板，37℃平衡0.5h，使其表面温度达到室温(如果在室温条件下放置可省去这一步)取0.4ml对数生长期(OD6000.4-0.8之间)、0.1ml扩增后的样品和4ml0.5％agarose LB混匀，倒于平板上，轻轻振荡，使其铺平，室温放置约0.5小时，使表面彻底凝固。将双层平板37℃培养4-6h观察。挑选单个噬菌斑。将挑选出来的噬菌体单克隆，加入2ml对数生长期的相应菌种中，30℃培育2h-6h，观察待菌液变澄清，代表杀菌完全。重复3-5次，得到噬菌体单克隆样品。并将其命名为BPH-LM-1。
(五)噬菌体的纯化
应用宿主菌李斯特单核增生菌将噬菌体BPH-LM-1高度扩增，待培养基澄清后，8000g，离心10min，取出杂质，加入固体聚乙二醇(PEG8000)至终浓度为10％w/v，搅拌溶解，4℃过夜，4℃，8000g离心20min，弃沉淀，重悬于缓冲液(100mMNaCl，5mMMgSO4，10mMTris-HClpH7.2)中，于37℃，保温30min，期间振荡数次。加入氯仿，漩涡混合30min，3000g离心5min，小心收集水相，将噬菌体悬液置氯化铯(ρ＝1.4，1.6)密度梯度内10000g，4℃离心2h，置强光下，收集乳状条带。4℃过夜透析除去盐份，重复一次。将得到的噬菌体透析液4℃保存待用。
实施例2
噬菌体计数方法(效价)
将所得噬菌体样品按10倍比例稀释，取其中一定稀释比例的样品100ul，用实施例1的步骤(四)中的方法铺双层平皿，取合适比例的平皿计算噬斑个数，一个噬斑代表一个噬菌体单体。
细菌计数方法(效价)
采用标准平皿法计数
噬菌体稳定性检测
1.温度对噬菌体的影响
在实验前一天，检测噬菌体的效价，将噬菌体样品，分别放于4℃、室温、37℃、50℃、70℃，保温1h后测定效价。由此得到温度对噬菌体的影响。
将噬菌体在4℃、室温和37℃保温，在1d、5d、10d、15d、30d测定效价
结果显示在4℃、室温、37℃保温2h在误差允许的范围呢，噬菌体BPH-LM-1的效价几乎没有变化，说明在此温度下噬菌体稳定性良好。在50℃时，2h后效价降为原来的19％，而在70℃时，2h能将噬菌体完全灭活(如表1)。
表1设定温度下保温2h对噬菌体效价的影响表
| 温度/℃ | 4 | ≈25 | 37 | 50 | 70 |
| 原效价/pfu/ml | 7.3±0.5×10<sup>10</sup> | 7.3±0.5×10<sup>10</sup> | 7.3±0.5×10<sup>10</sup> | 7.3±0.5×10<sup>10</sup> | 7.3±0.5×10<sup>10</sup> |
| 效价/pfu/ml | 7.2±0.7×10<sup>10</sup> | 7.3±0.5×10<sup>10</sup> | 7.0±0.3×10<sup>10</sup> | 1.4±0.8×10<sup>14</sup> | 未检出 |
在4℃放置噬菌体在一月内效价仍能够保持原来的57％；室温和37℃结果相同，效价下降较慢，5d时效价下降不足10％，分别为原来的93％和91％，在一月内效价是原来效价分别为16％和15％，仍维持在较高水平(如图1)。
2.ph对噬菌体杀菌能力的影响
将噬菌体样品分别于pH1-14，室温保存2h，然后检测其效价。
结果，对于噬菌体BPH-LM-1最适pH为6-9，噬菌体的效价几乎没有变化。当pH为10的时候仍保持28％的活性。但是当pH＜5或pH＞11效价下降很快(表2)。
表2pH对噬菌体BPH-LM-1的影响
| PH | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 效价pfu/ml | -- | 3.2×10<sup>6</sup> | 5.7×10<sup>7</sup> | 8.8×10<sup>8</sup> | 9.2×10<sup>8</sup> | 9.1×10<sup>8</sup> | 8.5×10<sup>8</sup> | 2.0×10<sup>8</sup> | 8.5×10<sup>6</sup> | 2.3×10<sup>3</sup> |
3.高浓度盐溶液对噬菌体的影响
加入氯化钠调整噬菌体样品溶液的盐浓度，使盐浓度分别达到0.1M、0.3M、0.5M、1M、3M保存2h，将其稀释，和对照组相比，检测效价的变化。
结果，显示小剂量(0.1-0.3M)的NaCl有助于噬菌体的保存，且高浓度盐对噬菌体没有明显的影响(表3)。
表3盐浓度对噬菌体的影响。
| NaCl/M | 0 | 0.1 | 0.3 | 0.5 | 1 | 3 |
| 效价/pfu/ml | 8.6×10<sup>8</sup> | 9.2×10<sup>8</sup> | 9.0×10<sup>8</sup> | 8.1×10<sup>8</sup> | 8.0×10<sup>8</sup> | 5.6×10<sup>8</sup> |
实施例3
毒理实验
昆明小鼠，清洁级，体重22±3g，2月龄(合格证号：SCXK(京)2004-0001)，由协和医科大学试验动物研究中心提供。试验动物饲养于清洁级饲养室，室温18-22℃，相对湿度40％-70％，12h日照和昏暗循环。实验小鼠20只，雌雄各半，适应性饲养3天后，随机分为两组(噬菌体组、对照组)，每组10只(雌雄各5只)，给予噬菌体组计量为1011pfu/kg的噬菌体BPH-LM-1，对照组给予等量生理盐水，连续给药15d，将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。
观察结果显示，此计量的噬菌体BPH-LM-1对小鼠日常行为没有影响。解剖检查内脏未见异常。
实施例4
检测噬菌体在固体食品中的杀菌效果
此部分选取火腿肠作为试验样品，将火腿肠切为1cm左右方体，用于试验。制备1×103pfu/ml、1×104pfu/ml的李斯特单核增生菌溶液。制备1×108pfu/ml的噬菌体样品。火腿肠样品分别置于上述菌液中，浸泡1h，取出置于无菌广口瓶内，无菌环境下晾干。上述火腿肠样品取出一部分置于噬菌体样品中，置于无菌广口瓶中晾干。将上述制备样品置于室温(约20-25℃)培养。检测样品总李斯特单核增生菌含量。
结果证明，1×108pfu/ml的噬菌体溶液可以在1天内完全杀灭李斯特单核增生菌，且能够对食品提供长久的保护(结果如图3)。
实施例4
检测噬菌体样品在液体中的杀菌效果
1.噬菌体计数方法(效价)
将所得噬菌体样品按10倍比例稀释，取其中一定稀释比例的样品100ul，用步骤(四)中的方法铺双层平皿，取合适比例的平皿计算噬斑个数，一个噬斑代表一个噬菌体单体。
2.细菌计数方法(效价)
采用标准平皿法计数
3.液体中杀菌效果实验
将噬菌体样品按10倍比例稀释，其中一部分按实施例2中方法测定效价，另一部分按如下方法检测杀菌效果，取上述经稀释的噬菌体样品100ul，加入到2ml对数生长期的李斯特单核增生菌(3.4×107pfu/ml)中，30℃，250r/min培养。
按照MOI(噬菌体/细菌)＝0.1，接种噬菌体。30℃保温，然后分别于20min、40min、60min、90min、120min、240min测定噬菌体效价。
结果显示，BPH-LM-1的杀菌极限为105数量级，级当液体中噬菌体的含量达到105pfu/ml时，噬菌体可以给液体中完全杀灭李斯特单核增生菌。噬菌体潜伏期在20-40min内，在20min时，液体中李斯特单核增生菌的个数小于1pfu/ml.而在4h内无细菌增殖(如图4)。
Claims (4)
1.一种噬菌体(Listeria Monocytogenes Bacteriophage)BPH-LM-1，保藏号为CGMCC 2254。
2.权利要求1所述的噬菌体在防止李斯特单核增生菌污染方面的应用。
3.权利要求1所述的噬菌体作为一种食物添加剂用于防止食物李斯特单核增生菌污染方面的应用。
4.权利要求1所述的噬菌体在作为杀菌剂喷洒于食品生产车间，用于防止该环境中李斯特单核增生菌的生存和繁殖，防止食品加工过程中的污染方面的应用。
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