ES2276114T3 - Fagos virulentos para controlar la listeria monocytogenes en productos alimentarios y en plantas de procesamiento de alimentos. - Google Patents
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Abstract
Método para controlar la contaminación por Listeria en un producto de alimentario, en el equipamiento de procesamiento de alimentos, o en los contenedores de almacenamiento de alimentos, que comprende aplicar fago P100 lítico, número de designación de depósito de patentes en la ATCC PTA-4393, a a un producto alimentario o o equipamiento de procesamiento de alimentos en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de Listeria.
Description
Fagos virulentos para controlar la Listeria
monocytogenes en productos alimentarios y en plantas de
procesamiento de alimentos.
La presente invención se refiere al uso de una
clase particular de bacteriófagos ("fago") conocidos como
fagos virulentos que son líticos para las especies bacterianas
Listeria monocytogenes, y demostrando en la presente
invención que reducen el recuento de estas bacterias y/o que evita
su crecimiento en primer lugar, y que es útil para identificar la
Listeria monocytogenes en productos alimentarios (incluyendo
pero sin limitarse a la industria lechera) así como en el
equipamiento de procesamiento y otros lugares de las instalaciones
de la industria alimentaria, y como un agente terapéutico para
tratar animales infectados con Listeria monocytogenes. Un
ejemplo específico de un fago de Listeria monocytogenes
virulento, es un fago designado P100, recientemente descubierto por
uno de los presentes inventores. La presente invención también se
refiere a una endolisina producida por P100 y al uso de la
endolisina para reducir la cantidad de Listeria
monocytogenes en los productos alimentarios así como en el
equipamiento de procesamiento y otros lugares en instalaciones de
la industria alimentaria, y en o para animales infectados con
Listeria monocytogenes y a los métodos que permitirán el
desarrollo y/o aislamiento de un fago adicional con propiedades
líticas.
Los fagos, como agentes antibacterianos, tienen
la ventaja de replicarse dentro de la diana bacteriana. Así, cuando
su progenie lisa la célula y se escapa al medio extracelular,
pueden infectar y multiplicarse en sucesivas generaciones de
bacterias, produciendo niveles de progenie bastante mayores que el
del crecimiento binario de las bacterias diana, de ese modo
aumentando la población del fago en gran cantidad exponencialmente
a costa de las dianas bacterianas.
El concepto del uso fagos para identificar la
contaminación bacteriana en productos alimentarios {e
instalaciones, equipamiento}, en general, ha sido descrito en la
bibliografía científica (ver, p. ej. Greer, J. Food Prot.,
49:104-109, 1986). El concepto del uso de fagos
específicos de Listeria en particular, para identificar la
contaminación de Listeria de productos lácteos e
instalaciones/equipamiento específicamente, fue descrito ya en 1990
(Loessner et. al., Applied and Environmental Microbiology,
Junio 1990, p.1912-1918). La presente invención se
refiere al uso de un fago recientemente descubierto de Listeria con
propiedades específicas, esenciales y pertinentes, que lo convierte
en particularmente adecuado para identificar y controlar la
contaminación de Listeria de productos lácteos, instalaciones y
equipamiento.
Además de la bibliografía científica general
sobre el tema, hay también bibliografía de patentes que enseña la
utilidad de los fagos en general para controlar las contaminaciones
bacterianas en plantas de procesamiento de alimentos y en productos
alimentarios. Ver por ejemplo patente U.S. n°. 5,006,347 expedida
en Abril 9,1991, patente U.S. n°. 4,851,240 expedida en Julio
25,1989, GB 2 253 859 A publicada en Septiembre 23,1992 y EP
0414304A2 publicada el 27 de Febrero de 1991. No obstante, ninguna
de las patentes arriba discutidas revelan un fago de Listeria que
fuese evaluado en realidad y que demostrara que controlara con
éxito la contaminación bacteriana en plantas de procesamiento de
alimentos y en productos alimentarios. La razón de esto es que
todos los fagos de Listeria conocidos en la técnica en el momento
de la revelación en las patentes precedentes fueron fagos atenuados,
y en consecuencia no fueron eficaces ni adecuados para fines de
erradicación bacteriana industrial. El término "atenuado" se
refiere a que cuando una cepa de fago inyecta su ADN en una diana
bacteriana, el ADN del fago se integra en el ADN de la célula
huésped, como un "profago", y puede quedar integrado en su
interior durante períodos de tiempo considerables. Puesto que el
profago corta (e inicia la replicación y lisis) sólo cuando la
célula huésped se vuelve estresada, la tisis bacteriana resultante
es imprevisible y no fácilmente controlada, razón por la cual los
fagos atenuados no se prestan adecuados para aplicaciones
industriales. Los fagos atenuados son inadecuados para fines de
descontaminación industrial para otras cuestiones también,
incluyendo el hecho de que pueden descargar genes indeseados y
peligrosos a las dianas bacterianas en las cuales se integra su
ADN. Por el contrario, hay una clase de fagos que lisan las dianas
bacterianas directamente, suponiendo que éstas no tengan la
maquinaria molecular requerida para integrarse en las dianas
bacterianas. A tales fagos se les conoce como "virulentos" o
"líticos" para las dianas bacterianas. Los fagos virulentos
contra Listeria monocytogenes fueron descubiertos
recientemente, por uno de los presentes inventores.
El primero de estos fagos virulentos de
Listeria, designado A511, depositado en la ATCC bajo el número de
designación de depósito de patente PTA-4608, fue
descrito en la bibliografía en 1990 (Ver Loessner et. al.,
Applied and Environmental Microbiology, Junio 1990,
p.1912-1918, 1990). Ver también DE 43 26617 C;
Loessner et. al., Applied and Environmental Microbiology,
Abril 1996, vol. 62, No. 4, p.1133-1140; y Gaeng
et al., Applied and Environmental Microbiology, Julio 2000,
vol. 66, No. 7, p.2951-2958. El fago virulento según
la presente invención pertenece a la familia Myoviridae y tiene
colas que se contraen hacia la cabeza del virus. Un fago
particularmente preferido es designado P100 y fue depositado en la
American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas
VA 20110-2209 en mayo 23, 2002, 2002, número de
designación de depósito de patente en la ATCC
PTA-4383.
Los fagos virulentos descritos en la presente
invención pueden también ser usados contra CFUs (unidades
formadoras de colonias) de bacterias de Listeria
monocytogenes que están en las biopelículas, en oposición a las
CFUs que son planctónicas. El uso de fagos de Listeria
monocytogenes atenuados contra biopelículas de Listeria ha sido
descrito en la bibliografía (ver p. ej. Roy et. al., Appl.
Environ. Microbiol., Sept., 59(9):2914-7,
1993). Específicamente, Roy et. al. usaron bacteriófagos
atenuados de Listeria H387, H387-A, y 2671 de la
familia Siphoviridae. Mientras que estos fagos atenuados demostraron
cierta eficacia en la limpieza de una biopelicula de Listeria,
incluso al utilizarse en combinación, el mejor resultado que se
podía obtener de éstos era una reducción de 3.5-3.7
log en el recuento. Roy et Al indican que tales reducciones
"tendrían que ser mejoradas para lograr el nivel de reducción
recomendado del 99.999% en una exposición de 30 seg a un agente
químico desinfectante ". Según se ha establecido anteriormente,
los fagos atenuados no son previsibles o fácilmente controlables en
cuanto al ritmo al cual o la eficacia con la cual pueden matar a
las bacterias diana.
Además del uso de los fagos virulentos
anteriormente descritos, los presentes inventores también han
encontrado que las subcepas virulentas pueden estar derivadas de
varias cepas del fago atenuado. Estas subcepas virulentas pueden
ser seleccionadas por técnicas tales como el aislamiento en placas
(donde se seleccionan las áreas más claras de una placa, y se
enriquecen las cepas más virulentas en la misma mediante ciclos
repetidos de crecimiento hasta una graduación más elevada,
colocándose en placas nuevas, y recogiendo las áreas más claras de
las placas de la última generación). Ejemplos de cepas de fago
atenuado, donde las subcepas virulentas han sido o serán
desarrolladas, son las cepas atenuadas designadas A118, A502, A006,
A500, PSA, P35, y los virus relacionados.
La detección de Listeria se realiza de una
manera conocida mediante procedimientos basados en el cultivo de
microorganismos. El procedimiento descrito en Int. J. Food
Microbiol. 4 (1987), 249-256 requiere dos semanas.
Un procedimiento algo más rápido está recomendado por la
International Dairy Foundation (IDF, Fundación internacional
lechera); no obstante ésta requiere al menos 6-8
días. Por su extensión, ambos procedimientos son inadecuados para
una identificación rápida. Ambos procedimientos requieren mucho más
trabajo intensivo, así como para la producción de medios nutrientes
de colonias individuales deben ser inoculados varias veces, y
después los productos aislados deben ser caracterizadas mediante
métodos de investigación bioquímica y serológica.
Un prerrequisito para el uso de pruebas
inmunológicas es que el antígeno se exprese, que no es el caso de
todas las proteínas en cualquier momento. Las pruebas
indudablemente duran sólo unas horas, pero en estos procedimientos
se requiere un cultivo de pre-enriquecimiento de dos
días, cuando el límite de detección es 10-1000 X
10^{3} células. Las sondas de ADN tienen un límite de detección
del mismo orden de magnitud. Una multiplicación previa de las
bacterias es en consecuencia también necesaria para estos
procedimientos: se alinean muestras del producto alimentario o
diluciones de las mismas en placas de agar, y las placas inoculadas
son incubadas y luego investigadas en el procedimiento de
hibridación de colonias usando una sonda
radio-marcada de ADN. La detección se realiza por
autorradiografía. Este método requiere mucho más trabajo y mucho
tiempo.
La reacción en cadena por la polimerasa (PCR)
permite la replicación in vitro de los ácidos nucleicos; un
precultivo no es en general necesario en este procedimiento. El
límite de detección es 0.5 X 10^{3} células. Como, no obstante,
el ADN de células muertas o de forma alternativa el ADN aislado
también se replica en este procedimiento, la contaminación con
células muertas no puede ser diferenciada de la contaminación con
células vivas.
Las limitaciones de estos métodos indican la
necesidad de proporcionar agentes mejorados y métodos para la
detección de bacterias del género Listeria.
EP 0 168 933 (Pat. U.S. N°. 4,861,709) expone un
procedimiento de detección para bacterias, p. ej., Escherichia
coli, basado en el uso de un bacteriófago recombinante. Este
fago contiene el gen lux de Vibrio fischeri y así posibilita la
detección de E. coli por bioluminiscencia con un buen límite
de detección (0.5 X 10^{3} células). Usando fagos atenuados, G.
J. Sarkis et al. (1995) Molecular Microbiology 15,
1055-1067 describe un procedimiento de detección
para micobacterias. En estos procedimientos de detección, sólo se
detectan las células bacterianas metabólicamente activas; la
interferencia se debe a las células bacterianas muertas que en la
técnica de PCR no ocurre.
Scherer, et Al., patente U.S. n°.
5,824,468, expedida el 20 de octubre de 1998 describe un
procedimiento de detección para bacterias del género Listeria, en
el que un vector de ADN es preparado el cual incluye un sistema
genético que comprende ADN que codifica la expresión de una o más
proteínas detectables, y se usa un vector de ADN A511 que infecta
específicamente las bacterias del género Listeria y transfiere el
sistema genético a las bacterias. Las proteínas detectables son
expresadas en las bacterias y la detección de las proteínas
detectables indica la presencia de bacterias del género
Listeria.
Las lisinas codificadas por el fago o
endolisinas son enzimas altamente activas que hidrolizan las
membranas celulares bacterianas. Estas enzimas líticas de pared
celular codificadas por el fago son sintetizadas tarde durante la
multiplicación del virus y median la liberación de viriones de la
progenie. Las endolisinas pueden utilizarse para lisar células de
Listeria para recuperar los ácidos nucleicos o la proteína celular
para la detección o diferenciación. La endolisina puede también ser
usada para tratar animales (incluso de seres humanos) que están
infectados por Listeria y para tratar superficies que pueden ser
contaminadas por Listeria. Las lisinas de fagos de Listeria
(A118;A500 y A511) han sido clonadas y purificadas (Loessner, et
al., Applied and Environmental Microbiology, Agosto 1996, p.
3057-3060).
Listeria monocytogenes es un patógeno
bacteriano que contamina muchos productos alimentarios, cuya lista
incluye pero no está limitada a quesos tiernos, patés, helados,
pescado ahumado y curado, marisco congelado, ensaladas, y carnes
procesadas. Al ingerirse, estas bacterias pueden producir una
enfermedad denominada listeriosis, caracterizada por una variedad
de síntomas y condiciones, que incluyen diarrea, aborto, y
encefalitis. Colectivamente, en los países industrializados,
cientos de muertes ocurren cada año como resultado de la
contaminación de alimentos por la Listeria
monocytogenes.
La industria del procesamiento de alimentos no
ha sido suficientemente exitosa en la erradicación de las bacterias
de Listeria monocytogenes del entorno de las plantas de
procesamiento. Como resultado, incluso los alimentos que han sido
pasteurizados a temperaturas lo suficientemene altas para matar a
estas bacterias sin embargo se vuelven contaminados, después de la
pasteurización. Las bacterias acceden a los productos alimentarios a
través de una o más vías, que incluyen (i) desde las materias
primas (p. ej. leche cruda, y/o leche que ha sido pasteurizada a
temperaturas bajas); (ii) desde la maquinaria de procesamiento (en
y sobre la cual las bacterias pueden crecer como biopelículas que
son difíciles de erradicar); y (iii) a partir de bacterias
aerotransportadas presentes en el entorno de la planta que se
pueden instalar sobre la superficie de los productos alimentarios
durante el curado, embalaje, etcétera.
A pesar de los numerosos métodos usados en la
industria alimentaria para controlar y evitar la contaminación por
L. monocitogenes, las bacterias acceden y persisten en el
entorno de las plantas de procesamiento de alimentos. Además,
sobreviven a las concentraciones altísimas de sal que están
presentes en diferentes procesos de fabricación de alimentos. La
resultante contaminación de los productos alimentarios (que incluyen
pero sin limitarse a quesos, patés, fiambres, perritos calientes y
otros alimentos procesados) conduce a niveles de muertes cada año
en países desarrollados, y también a retiradas del producto cuyo
valor al por menor cada año, en conjunto, está valorado en cientos
de millones de dólares.
Los métodos habitualmente usados para controlar
la Listeria, en la industria alimentaria incluyen: (i)
pasteurización de ingredientes primarios (p. ej. leche) y
tratamiento térmico de los productos, que frecuentemente fracasa
debido a la recontaminación que ocurre frecuentemente y en el que
muchos productos no pueden someterse a un tratamiento térmico final
(listeriocidal); (ii) aplicación de agentes fisicoquímicos tales
como desinfectantes, enzimas, antibióticos, etc., que la
experiencia ha demostrado que no reducen de manera suficiente el
recuento bacteriano; y (iii) intentos de romper las biopeliculas
mecánicamente, lo cual deja residuos suficientes de bacterias tras
lo cual los productos alimentarios siguen contaminándose.
Los métodos adicionales deben en consecuencia
puestos a disposición de la industria de procesamiento de alimentos
para proteger la salud de los consumidores, y para reducir la
exposición de muchas compañías al gran coste y la pérdida de
productos que resulta de tales contaminaciones y retiradas.
Los presentes inventores han realizado una serie
de experimentos usando una cepa de L. monocitogenes que es
predominante en la planta de procesamiento de un fabricante
particular de quesos tiernos ("untables"). Esta cepa
bacteriana demostró ser susceptible al fago P100 in vitro.
Como se demostrará en la sección de los ejemplos, el fago P100
demostró ser capaz de reducir por debajo de los límites
medibles/detectables las bacterias de Listeria adicionadas en una
matriz de tipo queso.
El fago virulento P100 depositado en la ATCC
bajo el número de designación de depósito de patente
PTA-4383, al igual que otros fagos virulentos de
las familias Myoviridae y Siphoviridae, y mutantes virulentos de
varias cepas atenuadas de fagos (tales como pero no limitadas a
fagos B054, A118, A502, A006, A500, PSA, P35 y los virus
relacionados) son usados en la presente invención para controlar
las bacterias Listeria monocytogenes presentes en (o dentro
de) los productos alimentarios, así como las bacterias Listeria
monocytogenes presentes en el equipamiento o en el entorno
general de las plantas de procesamiento de alimentos en las que se
procesan los productos alimentarios o en los recipientes usados
para el almacenamiento de los productos alimentarios. Este fago
puede también ser usado para tratar animales infectados por
Listeria monocytogenes.
El fago virulento P100 se usa en la presente
invención para identificar las bacterias Listeria
monocytogenes presentes en (o dentro de) los productos
alimentarios, así como las bacterias Listeria monocytogenes
presentes en el equipamiento o en el entorno general de las plantas
de procesamiento de alimentos donde los productos alimentarios
están siendo procesados o en los recipientes usados para el
almacenamiento de productos alimentarios y en los animales
infectados por Listeria monocytogenes. En la presente
invención, se prepara un vector de ADN recombinante usando un fago
virulento P100 que es específico para la Listeria
monocytogenes. El vector incluye un sistema genético que
comprende ADN que codifica la expresión de una o más proteínas
detectables que no son un producto genético de la Listeria
monocytogenes. El vector de ADN infecta las bacterias del género
Listeria y transfiere el sistema genético a las bacterias. Las
proteínas detectables son expresadas por las bacterias y la
detección de las proteínas detectables indica la presencia de
bacterias del género Listeria y en particular de Listeria
monocytogenes.
Una endolisina derivada de P100 se utiliza para
reducir el recuento de Listeria monocytogenes y/o para
evitar su crecimiento, en primer lugar en los productos
alimentarios (incluyendo pero sin limitarse a la industria lechera)
al igual que en equipamiento de procesamiento y en otros lugares de
las instalaciones de la industria alimentaria, p. ej. un contenedor
de almacenamiento de alimentos, y también como un agente
terapéutico para tratar animales infectados por Listeria
monocytogenes. Las endolisinas de fagos de Listeria tienen alta
especificidad de sustrato y lisan casi exclusivamente células de
Listeria.
La presente invención se refiere al uso del fago
P100 que es particularmente adecuado para métodos de control
bacteriano y para la detección de Listeria monocytogenes. El
fago es de la familia Myoviridae y es virulento contra cepas de
Listeria monocytogenes de serotipo 1/2.
La Figura 1 muestra que cuando la Listeria
monocytogenes es inoculada a 10^{3} CFU por ml de cultivo
líquido y se añaden los fagos a una concentración de 5 X 10^{8}
Pfu por ml, se produce una erradicación prácticamente completa de
las bacterias Listeria.
La Figura 2 muestra que aplicando el fago P100 a
la superficie de un queso madurado en su superficie se evitó
completamente la excrecencia de la Listeria monocytogenes
que había sido adicionada en el fermento láctico.
La Figura 3 muestra títulos del fago en queso
(PFU/cm^{2}).
Por "vector" se entiende una molécula de
ácido nucleico que es capaz de autorreplicarse al introducirse en
una célula huésped adecuada. En general, los vectores usados como
precursores para los vectores recombinantes de la presente
invención son bacteriófagos que son muy específicos, y
preferiblemente absolutamente específicos, para infectar bacterias
del género Listeria, y donde los vectores recombinantes retienen
esta especificidad. Por ejemplo, un vector adecuado es el
bacteriófago P100 de Listeria, que específicamente lisa las
bacterias del género Listeria (inevitablemente líticas). Es un
miovirus de construcción compleja. Con respecto a las
características esenciales, el fago P100 de Listeria difiere de
muchos fagos conocidos de Listeria; las diferencias se refieren a
la morfología, rango del huésped, perfiles de las proteínas
(electroforesis en gel SDS, isoelectroenfoque, composición del
aminoácido de las proteínas estructurales principales, hibridación
del ADN/ADN).
Para detectar la presencia de bacterias del
género Listeria, se emplean genes marcadores. Estos son genes que
pueden ser detectados tras la infección por el vector de una célula
huésped adecuada y el cultivo posterior de las células bajo
condiciones adecuadas para la expresión de los genes marcadores. Se
prefiere que los genes marcadores sean aquellos que no ocurren en
las bacterias del género Listeria, y que son insertados en el
vector, el fago P100, usando técnicas recombinantes. Tales genes y
sus productos genéticos son conocidos en la técnica; estos incluyen
proteínas bioluminescentes tales como el gen lux que ocurre en
variantes de varias bacterias luminiscentes, por ejemplo del género
Vibrio. La incorporación del gen lux permite la detección por
medición de la luminiscencia. Un ejemplo del gen lux es el gen
luxAB de Vibrio harveyi. Otras proteínas adecuadas incluyen
pero no se limitan a la luciferasa y proteínas fluorescentes tales
como la proteína verde fluorescente.
La reacción de detección puede tener lugar en
una superficie sólida incluyendo pero sin limitarse a una tira
reactiva. En esta forma de realización, el vector que contiene el
gen marcador podría ser reversiblemente inmovilizado en o hacia
abajo de una zona de aplicación de la muestra. De forma
alternativa, el vector podría ser incubado con la muestra antes de
la aplicación en la tira reactiva. Los antianticuerpos de Listeria
serían irreversiblemente inmovilizados hacia abajo del vector y la
zona de aplicación de la muestra. Si se aplica una muestra
conteniendo Listeria, preferiblemente Listeria
monocytogenes, el vector infectaría la Listeria y se expresarían
las proteínas detectables. Cuando la muestra mueve la tira reactiva
hacia abajo, la Listeria sería inmovilizada por los anticuerpos
anti-Listeria. Las proteínas marcadoras son
detectadas después en la Listeria inmovilizada.
La endolisina de la presente invención puede ser
aislada por técnicas conocidas en la técnica incluyendo pero sin
limitarse a lisis, cromatografía, filtración, y centrifugado. La
endolisina puede ser aislada de la Listeria que ha sido incubada
con P100, o bien, la endolisina puede ser clonada y expresada en
una bacteria huésped (p. ej. E. coli, L. lactis, S. aureus, y B.
cereus). La endolisina puede ser aislada de la bacteria
huésped, o bien, la bacteria huésped que contiene la endolisina
puede ser directamente aplicada o administrada sin aislar la
endolisina. Por ejemplo, una bacteria huésped que produce la
endolisina podría ser administrada a un animal o aplicada a una
superficie en la que la endolisina sería segregada en los alimentos,
o sobre la superficie o en el intestino del animal. La endolisina
puede luego atacar las células de Listeria presentes en este
entorno. Una unidad de actividad de endolisina está definida como
la cantidad de endolisina necesaria para reducir la densidad óptica
a 600 nm por 0.01/min, a pH 8.0 y 25°C en un volumen de 1 ml,
cuando las células de Listeria monocytogenes muertas por
calor y lavadas son usadas como sustrato.
La endolisina arriba referenciada, la bacteria
huésped que contiene la endolisina y/o el fago son aplicados sobre
o en productos alimentarios, y/o en varios sitios físicos dentro de
las plantas de procesamiento de alimentos, por varios medios que
incluyen, pero no se limitan a, la adición de la endolisina, de la
bacteria huésped que contiene la endolisina y/o del fago en los
productos alimentarios, la pulverización de la endolisina, de la
bacteria huésped que contiene la endolisina y/o del fago sobre los
productos alimentarios, pulverización de la endolisina, de la
bacteria huésped que contiene la endolisina y/o del fago sobre el
equipamiento de la planta, y/o directamente mediante la aplicación
de la endolisina, de la bacteria huésped que contiene la endolisina
y/o del fago al equipamiento de la planta. Dichas aplicaciones
reducen significativamente los números de bacterias de Listeria
monocytogenes que de lo contrario estarían presentes.
\newpage
El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene la endolisina de la presente invención pueden también
ser usados para tratar animales, incluso seres humanos, infectados
por Listeria monocytogenes. Cualquier forma de
administración adecuada puede ser utilizada para administrar el fago
incluyendo pero sin limitarse a: un dispositivo oral, aerosol u
otro para la descarga en los pulmones, pulverizador nasal,
intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, vaginal,
rectal tópico, punción lumbar, intratecal, y la aplicación directa
en el cerebro y/o meninges. Los excipientes que pueden ser usados
como vehículo para la entrega del fago, la endolisina y/o la
bacteria huésped que contiene la endolisina serán evidentes para
los expertos en la técnica. Por ejemplo, el fago libre, la
endolisina y/o la bacteria huésped que contiene la endolisina
podrían estar en forma liofilizada y ser disueltos justo antes de
la administración por inyección IV. Se considera que la dosificación
de administración para el fago está en la gama de aproximadamente
03 a aproximadamente 10^{13} Pfu/por kg/por día, y
preferiblemente aproximadamente 10^{12} Pfu/por kg/por día. Se
considera que la dosificación de administración para la endolisina
está en la gama de aproximadamente 2-2000 ng/por
g/por día, y preferiblemente aproximadamente 20-200
ng/por g/por día. El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene la endolisina son administrados hasta conseguir la
eliminación exitosa de la Listeria monocytogenes o hasta
reducir sustancialmente la cantidad de Listeria
monocytogenes.
La presente invención también cubre el uso de
los fagos, la endolisina y/o la bacteria huésped que contiene la
endolisina, al utilizarse en combinación con otro agente
antilisterial conocido en la técnica. Ejemplos de estos agentes
antilisteriales, que son preferentemente combinados con los fagos,
la endolisina y/o la bacteria huésped que contiene endolisina,
incluyen pero no se limitan a:
El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene endolisina según la presente invención pueden ser
combinados con listeriolisinas que son enzimas que han demostrado
que controlan selectivamente la Listeria en alimentos y en el
entorno (DE4326617C1 y EP 95932002.9)
El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene endolisina según la presente invención pueden ser
combinados con desinfectantes de superficies conocidos tales como
(i) conservantes de varios tipos, tales como, pero no limitados a,
ácido benzoico y BHT; y (ii) varios desinfectantes con los cuales
los fagos son compatibles, tales como, pero no limitados a,
compuestos de amonio cuaternario.
El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene endolisina según la presente invención pueden ser
usados en combinación con agentes antimicrobianos conocidos
(incluidos agentes antibióticos y quimioterapéuticos) que incluyen,
pero no se limitan a, vancomicina, nisina, danofloxacina y
neomicina.
El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene endolisina según la presente invención pueden ser
usados en combinación con enzimas para ayudar en la rotura de las
biopelículas (p. ej. biopeliculas encontradas en el equipamiento de
procesamiento de alimentos). Tales enzimas son conocidas en la
técnica e incluyen pero no se limitan a las enzimas depolimerasa
polisacárida, y proteasa.
El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene endolisina según la presente invención pueden ser
combinados con agentes tensioactivos conocidos cuando se utilizan
para tratar el equipamiento de procesamiento de alimentos. El
agente tensioactivo ayuda a humedecer la superficie de modo que el
fago se distribuya de forma adecuada sobre las distintas
superficies, y a solubilizar y eliminar la suciedad de modo que la
Listeria no sea accesible para el fago. Agentes tensioactivos
adecuados incluyen pero no se limitan a Tween 80, 20 y 81 y
Dobanols.
El fago, la endolisina y/o la bacteria huésped
que contiene endolisina de la presente invención pueden ser
combinados con fago específico para Listeria monocytogenes y/o fago
específico para otras bacterias conocidas por contaminar el
equipamiento de procesamiento de alimentos y los productos
alimentarios. Tales bacterias incluyen pero no se limitan a E.
coli, y especies bacterianas de los géneros Salmonella,
Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, y
Pseudomonas.
El fago puede ser aplicado en forma líquida o en
polvo en los productos alimentarios y en el equipamiento de
procesamiento de alimentos. Si se aplica como líquido, el fago se
aplica a una concentración de 10^{3} a 10^{10} Pfu (unidades de
formación de placas) por ml y preferiblemente a una concentración de
10^{6} a 10^{9} Pfu (unidades de formación de placas) por ml. Si
se aplica como un polvo seco el fago es aplicado a una
concentración de 10^{3} a 10^{10} Pfu (unidades de formación de
placas) por mg y preferiblemente a una concentración de 10^{6} a
10^{9} Pfu (unidades de formación de placas) por mg. El fago puede
ser suspendido en un portador adecuado antes de la aplicación o del
secado, incluyendo pero sin limitarse a soluciones de proteínas
conteniendo la BSA, caseína, proteína del lactosuero, proteína de
la soja, etc y portadores a base de azúcar conteniendo azúcares
tales como el manitol. El fago puede ser liofilizado o
crioconservado por vitrificación y suspendido en una solución antes
de la aplicación o bien aplicado directamente como un polvo
seco.
Unas cantidades adecuadas de fago para el uso en
la presente invención pueden ser obtenidas por técnicas conocidas
en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, una técnica
discontinua en la que se cultiva un cultivo de bacterias huéspedes
y luego se siembran con el fago. Después de una cantidad de tiempo
adecuada para permitir la propagación máxima del fago y la lisis
bacteriana, el cultivo es posteriormente lisado por medios físicos
o químicos y el lisado es centrifugado. El fago que contiene el
sobrenadante puede ser usado tal cual o puede ser adicionalmene
purificado usando técnicas tales como la ultrafiltración, la
cromatografía y el centrifugado.
La endolisina puede ser aplicada en un líquido o
en una forma en polvo a productos alimentarios y equipamiento de
procesamiento de alimentos. La endolisina es aplicada en una
concentración entre 2 a 2000 ng de endolisina por ml o por gramo de
portador, y preferiblemente entre 20 a 200 ng de endolisina por ml
o por gramo de portador.
Según se usa en la presente aplicación, el
término "producto lácteo" se destina a incluir cualquier
producto alimentario hecho usando leche o productos lácteos,
incluyendo pero sin limitarse a leche, yogur, helado, queso,
mantequilla, y crema.
Como se utiliza en la presente aplicación, el
término "producto de carne" se destina a incluir cualquier
producto alimentario que contiene tejido animal, incluyendo pero
sin limitarse a carne bovina, cerdo, y ave. El término "producto
de carne listo para comer" está destinado a incluir cualquier
producto de carne que no requiere cocción antes del consumo,
incluyendo pero sin limitarse a patés, perritos calientes,
mortadela, salami, y fiambres.
Como se utiliza en la presente aplicación, el
término "producto de pescado" se destina a incluir cualquier
producto alimentario que contiene tejido de animal acuático
incluyendo pero sin limitarse a langosta, cangrejo, pescado de agua
dulce y de agua salada y otros mariscos.
Como se utiliza en la presente aplicación, el
término "producto alimentario no pasteurizado" se destina a
incluir cualquier producto alimentario que se prepara usando
ingredientes no pasteurizados primarios y que no es sometido a un
tratamiento térmico final (listeriocidal).
Como se utiliza en la presente invención, el
término "ensalada" se destina a incluir cualquier producto
alimentario que contiene mezclas de verduras o frutas, y
particularmente tales mezclas tal y como son presentadas a los
consumidores para la elección en un expositor al que normalmente se
hace referencia como "barra de ensaladas".
Fase
1
10^{3} CFUs de Listeria monocytogenes
son mezcladas en un cultivo líquido.
Fase
2
5x10^{8} Pfu de fago P100 son mezcladas en el
cultivo líquido.
Fase
3
Como control, el tampón donde el fago P100 fue
suspendido es mezclado en una alícuota de cultivo líquido.
Fase
4
El recuento de la colonia de bacterias se
realiza a varios intervalos de tiempo. Los resultados están
mostrados en la figura 1.
Un experimento desafiante fue realizado usando
una cepa de fago antilisteria monocytogenes conocido como
P100, en un modelo de queso a escala de laboratorio. Este
experimento incorporaba flora técnica para conseguir las calidades
de maduración de la superficie (sabor, textura, etc.)
características de un proceso de fabricación del queso comercial
establecido. La cepa de Listeria monocytogenes ("Lm")
conocida como cepa C que fue usada en este experimento es un
contaminante común de una planta de fabricación del queso
determinada.
\bullet el experimento se efectuó en queso
tomado directamente de la solución salina (pH sin ajustar).
\bullet cepa C de Lm, flora técnica, y fago
P100 fueron aplicados en el queso a t=0 colocando en placas 210
\mul o 1 ml de mezcla de incubación en una superficie de queso de
64 cm^{2}. t=0 es igual que "CMD+1" (Día + 1 de fabricación
de queso). Los quesos tratados con 1 ml de solución fueron
posteriormente secados en una cabina de flujo laminar para secar la
superficie. La mezcla de incubación consistió en:
\bullet 110 g/l de NaCl
\bullet flora técnica:
\bulletDebaryomyces hansenii NIZO F937
y NIZO F1200 (levaduras) a 10^{8} CFU/mL
\bulletBrevibacterium linens NIZO
B1204 (una bacteria típica para queso de superficie roja) a
10^{8} CFU/mL
\bullet LmC corresponde a una concentración de
7 cfu/cm^{2} (diluida en pfz de un cultivo de crecimiento
exponencial)
\bullet fago P100 (en tampón de MPOS) a una
concentración correspondiente a 1x10^{7} pfu/cm^{2} o
5x10^{5} PFU/cm^{2}
Ver tabla 1 para combinaciones de tratamiento
exactas
\bullet los quesos fueron incubados a 14°C y
98%-99% de humedad relativa
\bullet los quesos fueron tratados a diario
con 210 \mul o 1000 \mul de solución de lavado que contenía
P100, a CMD+6, CMD+10, y CMD+13 y 1 mL/70 cm^{2} (combinación de
tratamiento 4 y 5)
\bullet la solución de lavado contenía:
\bullet 110 g/l NaCl
\bulletBrevibacterium linens NIZO
B1204 a 10^{8} CFU/mL
\bullet Fago P 100 (en tampón MOPS) a una
concentración correspondiente a 1 10^{7} PFU/cm^{2} o 5
10^{5} PFU/cm^{2}
\bullet Los quesos fueron empaquetados usando
papel pergamino, un material que se usa para empaquetar queso
Munster, a CMD+16. (CMD+16 es el día de empaquetado (PD))
\bullet Los quesos fueron almacenados a 6°C
hasta PD + 63
\bullet los recuentos de LmC fueron analizados
en los mismos puntos de tiempo indicados en la Tabla 1. Se realizó
el análisis antes del tratamiento con fago.
\bullet Cuantitativamente: Muestras de 70
cm^{2} fueron recortadas del queso y analizadas en medios
selectivos.
\bullet Cualitativamente a CMD+1 y CMD+37 por
procedimiento de enriquecimiento.
\bullet El análisis cualitativo/cuantitativo
dependerá también del nivel de excrecencia de Listeria en
los quesos. Si los recuentos de células son >10^{2}, no se
produjeron enriquecimientos. Si los recuentos de células fueron
inferiores, se produjeron enriquecimientos también antes del
empaquetado.
\bullet Además análisis de pH y flora
técnica.
\bullet en un queso a CMD+6, los títulos del
fago fueron determinados antes y después de la aplicación del
fago.
La maduración del queso fue buena, puesto que la
levadura y el Brevibacterium se desarrollaron bien en el
queso y la superficie del queso fue desacidificada.
Listeria monocytogenes C creció bien en
la superficie del queso en este modelo, hasta niveles de 10^{5}
-10^{7} CFU/cm^{2} en los controles negativos (control
negativo: sin fago aplicado) (Figura 2).
Como se ve en la Figura 2, el fago P100 inhibió
completamente el crecimiento de LmC. No se detectó Listeria usando
el método de recuento en placas cuantitativas, o en el
enriquecimiento. El límite de detección usando el procedimiento de
enriquecimiento está en el orden de magnitud de una Listeria por 60
cm^{2}. Esto indica que el fago P100 no sólo inhibió el
crecimiento sino que en realidad redujo los títulos de Listeria.
Como se muestra en la Figura 2 aplicando el fago P100 a la
superficie de un queso madurado en la superficie se evitó
completamente la excrecencia de Listeria monocytogenes que
había sido adicionada en el fermento láctico.
Clave: CMD = día de fabricación del queso
Pd = día de empaquetado
Para determinar si los fagos pueden sobrevivir
en la superficie del queso, en otro brazo del experimento (donde
una dosis alta o baja de fago fue aplicada a la superficie del
queso), los títulos del fago fueron determinados a CMD+6, antes y
también después de la aplicación del fago. En todas las muestras,
los fagos han sido aplicados a CMD+1, CMD+2, CMD+3, y CMD+4. En
consecuencia, en las muestras tomadas antes de la aplicación del
fago (a CMD+6), los fagos estuvieron presentes en el queso durante
al menos 48 horas. Los fagos activos fueron recuperados de la
superficie del queso a ambas dosis (Fig. 3). Los títulos del fago
de las muestras tomadas antes de la aplicación del fago a CMD+6
fueron inferiores a las muestras después de la aplicación del fago.
El aumento en el título del fago correspondió bien con el aumento
previsto basado en la dosis añadida (es decir, bien 1x10^{7}
pfu/cm^{2} o 5x10^{5} PFU/cm^{2}). Los resultados muestran
que el fago P100 permanece activo en la superficie del queso
durante al menos varios días.
1. Preparar la cepa del ensayo de Listeria
monocytogenes para evaluar la actividad: dejar crecer 1000 ml
de cultivo durante toda la noche en caldo de triptosa o caldo con
tripticasa de soja, centrifugar, lavar las células una vez con
tampón SM, pH 8.0 (ver Sambrook et Al., 1989), (o PBS), y
volver a suspender en 20 ml de tampón SM (o PBS) (aprox.
concentración 50 veces).
2. Almacenar en 1 ml cantidades a -20°C o a
-80°C.
3. Colocar en líneas o placas
JM109(pHPLxxx) de E. coli en LB-agar
(conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina), e incubar durante toda la
noche.
4. Cuando las colonias son de tamaño suficiente,
preparar la placa de replicación (con filtros NC) en placas de
LB-Amp suplementadas con 1 mM de IPTG. Incubar
durante 5-7 horas hasta que se visualicen colonias
pequeñas.
5. Exponer la superficie de la placa (boca
abajo) a papel de filtro saturado con cloroformo, durante 5 min
6. Rápidamente cubrir las colonias con
3-4 ml de agar fundido blando (0.4%, en tampón SM,
aprox 45°C), suplementado con 0.5 ml de un cultivo de L.
monocytogenes concentrado 50 veces (la capa debería ser fina,
incluso, y bastante turbia).
7. Incubar a RT durante 60 min (durante toda la
noche), hasta que sean visibles zonas claras de la tisis alrededor
de las colonias. Esto puede tardar un tiempo cualquiera, desde 5
minutos hasta 5 horas. (éste es un ensayo importante;
debería funcionar. De lo contrario puede haber un problema
con la cepa, o con el procedimiento de evaluación de la
actividad).
8. Preparar durante toda el noche un cultivo de
JM109(pHPLxxx) en caldo de LB con 100 \mug/ml Amp @
incubación 30-35°C.
9. Por la mañana, inocular 250 ml del caldo
precalentado con 10 ml de cultivo O/N, hecho crecer a OD600 de
0.5-0.6.
10. Inducción con 1 mM de IPTG, incubar durante
3-4 h adicionales hasta que el nivel de crecimiento
empiece a cesar.
11. Cosechar las células por centrifugado,
resuspender el (los) granulado(s) en 5 ml por 250 ml cultivo
de PBS (pH 8.0) 0.05% Tween20 o, si se requiere una purificación
con Ni-NTA de flujo descendente, Tampón A (ver más
abajo). Congelar las células a -20°C.
12. Descongelar las células.
Preparar extractos celulares mediante
French-Press; centrifugado (>30000 X g, 30 min);
y filtración del sobrenadante (0.2 \mum de filtro, preferiblemente
hecho a partir de PES). Almacenar la enzima que contiene el
extracto en hielo (unas horas), o a -20°C (nota: también se puede
usar sonicación, pero los rendimientos obtenidos por
French-Press son generalmente mucho mejores).
13. El uso de células recién desarrolladas, de
fase-de-log-media-a-total,
o las células de L. monocytogenes previamente congeladas de
la Fase 1 (arriba). Volver a suspender en tampón PBS, pH 8.0,0.05%
Triton X100 (ajustar la OD a aprox. 1.0-1.5). Usar
cubetas plásticas de semi-micro (1 ml); añadir 900
\mul de células precalentadas hasta al menos RT pero
preferiblemente 30-37°C, y añadir
50-100 ml de enzima. La turbidez debería caer a 0.5
o por debajo en 5 minutos o menos. Este extracto crudo puede ser
usado para la lisis de células de Listeria y la liberación de ADN
cromosómico, plásmidos, proteínas y enzimas. No obstante, contiene
cantidades altas de proteínas de E. coli, fragmentos de
ácidos nucleicos (ADN, ARN), ATP, y vector pHPL contaminador. Si
esto no es deseable, purificar las enzimas por IMAC (ver
abajo).
\vskip1.000000\baselineskip
14. Fraccionamiento de extractos crudos con
resina Ni-NTA. El procedimiento perfilado en las
fases 8-11 es para cromatografía en fase
líquida (FPLC o similar, ver fase 15), y es altamente
recomendado. No obstante, para la purificación a poca escala,
también se puede realizar en un procedimiento de tipo discontinuo
más simple. Usar aproximadamente 3 ml de resina (Agarosa NiNTA) por
250 ml de volumen de cultivo inicial. Después de la exposición de
la resina a las proteínas, efectuar fases de lavado (en lotes) por
centrifugado a baja velocidad (menos de 500xg). Después del último
lavado, cosechar la resina y la alícuota en partes de
1-2 ml en columnas pequeñas de plástico desechables
(disponibles por BioRad y otros); colocar en tubos de 15 ml cónicos
o de fondo redondo. Añadir tampón de elución (aprox 1 ml) (100% B),
dejar resposar 5 minutos, remover y recoger el líquido. Repetir la
elución 1-2 veces. Continuar con la fase 19.
15. Purificación FPLC: Preparar
cantidades suficientes de tampón A (50 mM tampón de fosfato, pH
8.0,500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol) y tampón B (igual que A, pero
250 mM de imidazol). Usar un gradiente de imidazol con Tampones A y
B. Cargar el extracto (hasta 40 ml = extracto de 2 litros (8 X 250
ml) de cultivo) en la columna de Ni-NTA (25 ml
volumen), usar un nivel de flujo bajo (0.75 a 1.0 ml/min). Si fuera
necesario, regenerar la resina Ni-NTA
(Ni-NTA Superflow) antes de la purificación de cada
enzima individual por el procedimiento perfilado en el manual de
Qiagen. Una columna nueva o regenerada puede ser usada durante al
menos 5 pruebas.
16. Lavar con 5 volúmenes de la columna del 100%
de tampón A (nivel de flujo 2 a 3 ml/min).
17. Lavar con 3-5 volúmenes de
la columna del 12% de tampón B (conc. total aprox. 35 mM de
imidazol), hasta que la lectura de la línea base (@ 280 nm) sea
estable. Esta fase eliminará la mayoría de proteínas contaminantes
(tener en cuenta que el imidazol mismo aumenta la lectura a 280
nm!).
18. Eluir la fracción enzimática con 250 mM de
imidazol (100% de tampón B). Es mejor recoger el valor máximo
manualmente (con respecto al soporte correcto del valor máximo,
parar pronto - no confundirse por la absorción más alta del propio
imidazol). Almacenar en hielo. No congelar las fracciones
recién eluídas, las enzimas tienden a precipitar en frío en
presencia de mucha sal e imidazol!.
19. Controlar todas las fracciones por ensayo de
la actividad fotométrica (ver arriba).
20. Concentración e intercambio de tampón
(eliminación de imidazol y mucha sal) de fracciones activas con
unidades de filtro del centrifugador (membrana PES, corte Mr 10
kDa). Pretratar la membrana con Tampón de tisis (PBS, pH 8.0,0.05%
Triton X100,0.05% Tween20). Lavar dos veces con 5 ml de tampón de
lisis. En el caso de que la membrana sea cubierta con la proteína,
transferir a una unidad de filtro nueva.
Filtro-esterilizar usando un filtro de jeringa de
0.2 \mum (usar membrana PES - la celulosa retendrá la mayoría de
las enzimas!). De forma alternativa, el intercambio del tampón
puede ser realizado por diálisis de la solución de la proteína
concentrada (tampones PBS o Tris, 0.05% Tween20). Encontramos que
HPL118 (pero no HPL511 ni HPL500) tiene una tendencia a agregarse
durante una diálisis prolongada.
21. Comprobar las fracciones por
SDS-PAGE, estimar la pureza de la proteína (debería
tener más del 90% de pureza), y la concentración de proteína
(normalmente en la gama de 2-4 mg/ml). Si la
preparación no es de pureza suficiente, tratar de lavar la columna
(fase 10) con el 15% de tampón B, y eluir las proteínas HPL con 150
mM de imidazol (60% de tampón B), o 200 mM de imidazol (80% de
tampón B). También se puede "recargar" la preparación de la
proteína entera inicial (diluir al menos 10 veces antes de recargar,
o dializar para eliminar el imidazol) de la columna, y realizar una
2ª purificación de la fase usando condiciones alteradas, tales como
un gradiente de pH. La filtración en gel también aumenta la pureza
de la proteína adicionalmente. No obstante, esto ciertamente no es
necesario para todas las aplicaciones estándar.
22. Ajustar la solución enzimática concentrada a
un contenido final del 30-50% glicerol, alícuota en
partes de 50-500 \mul, almacenar a -25°C. Bajo
estas condiciones, las enzimas son estables durante varios meses.
La congelación a - 80°C a veces resultó en una pérdida de
actividad.
\newpage
Cuando las bacterias Listeria
monocytogenes fueron adicionadas sobre la superficie de un
queso madurado en la superficie con el fermento láctico, las
aplicaciones de una dosificación suficiente de fago P100 a la
superficie erradicó completamente las bacterias, según está
confirmado por estudios de enriquecimiento (límite de detección
usando enriquecimiento: una CFU de Listeria por 60 cm^{2} de
superficie de queso). En todos los quesos tratados con fago (una
concentración alta o baja, una aplicación o varias), los títulos de
Listeria después del tratamiento con P100 fueron inferiores que en
los controles. La Listeria surgió sólo cuando se aplicó sólo una
vez (en vez de en varios momentos) o a concentración baja. Los
fagos pueden quedar activos en el queso durante varios días.
Claims (47)
1. Método para controlar la contaminación por
Listeria en un producto de alimentario, en el equipamiento de
procesamiento de alimentos, o en los contenedores de almacenamiento
de alimentos, que comprende aplicar fago P100 lítico, número de
designación de depósito de patentes en la ATCC
PTA-4393, a un producto alimentario o equipamiento
de procesamiento de alimentos en una cantidad suficiente para
reducir la cantidad de Listeria.
2. Método según la reivindicación 2, donde
dicho P100 es aplicado en combinación con el fago A511, número de
designación de depósito de patentes en la ATCC
PTA-4608.
3. Método según la reivindicación 1, donde
dicho fago lítico es aplicado en combinación con al menos un agente
seleccionado del grupo que consiste en listeriolisina, un
desinfectante de superficie, un antibiótico, un agente
tensioactivo, una enzima, y un fago específico para contaminantes
bacterianos distintos de la Listeria monocytogenes.
4. Método según la reivindicación 1, donde
dicho producto alimentario es un producto lácteo.
5. Método según la reivindicación 1, donde
dicho producto alimentario es un producto alimentario no
pasteurizado.
6. Método según la reivindicación 1, donde
dicho producto alimentario es un producto de carne.
7. Método según la reivindicación 6, donde
dicho producto de la carne es un producto de carne listo para
comer.
8. Método según la reivindicación 1, donde
dicho producto alimentario es un producto de pescado.
9. El método según la reivindicación 1, donde
dicho contenedor de almacenamiento de alimentos es una barra de
ensaladas y dicho producto alimentario es ensalada.
10. Método según la reivindicación 1, donde
dicho equipamiento de procesamiento de alimentos está seleccionado
del grupo que se compone de un tubo a través del cual se bombea
leche, un tanque contenedor con alto contenido en sal para procesar
el queso, un contenedor a partir del cual se aplican los cultivos a
la superficie de un queso, un conjunto de estantes sobre los cuales
se seca y madura un producto, y un desagüe del piso.
11. Método según la reivindicación 1, donde
dicho fago lítico es aplicado mediante la mezcla con un líquido o
producto alimentario semisólido.
12. Método según la reivindicación 1, donde
dicho fago lítico es mezclado con un líquido y pulverizado sobre
una superficie seleccionada del grupo que consiste en productos
alimentarios, equipamiento de procesamiento de alimentos y
contenedores de almacenamiento de alimentos.
13. Método según la reivindicación 12 donde
dicho fago lítico es aplicado a dicho equipamiento de procesamiento
de alimentos en combinación con un agente seleccionado del grupo
que consiste en listeriolisina, un desinfectante de superficie, un
antibiótico, un agente tensioactivo, una enzima, y un fago
específico para contaminantes bacterianos distintos de la
Listeria monocytogenes.
14. Método según la reivindicación 1, donde
dicho fago lítico es liofilizado o crioconservado por vitrificación
y es aplicado en forma seca a dicho producto alimentario,
equipamiento de procesamiento de alimentos y contenedores de
alimentos.
15. Composición que comprende fago P100, número
de designación de depósito de patentes en la ATCC
PTA-4383 y un portador.
16. Composición según la reivindicación 15, que
además comprende fago A511, número de designación de depósito de
patente en la ATCC PTA-4608.
17. Composición según la reivindicación 15, que
además comprende un agente seleccionado del grupo que se compone de
listeriolisina, un desinfectante de superficies, un antibiótico, un
agente tensioactivo, una enzima, y un fago específico para
contaminantes bacterianos de Listeria monocytogenes.
18. Composición según la reivindicación 15,
donde dicho portador es un portador farmacéuticamente
aceptable.
19. Uso de una composición según se reivindica
en cualquiera de las reivindicaciones 15-18 para la
producción de un medicamento para tratar un animal infectado por
Listeria monocytogenes.
20. Uso según la reivindicación 19 donde el
medicamento además comprende fago A511.
21. Fago P100 depositado en la American Type
Culture Collection, número de designación de depósito de patente en
la ATCC PTA-4383.
22. Método para detectar la presencia de
Listeria monocytogenes, que comprende obtener una muestra
sospechosa de contener Listeria monocytogenes, incubar dicha
muestra con P100 según la reivindicación 21, y detectar cualquier
cambio en dicha muestra provocada por P100, como indicación de la
presencia de Listeria monocytogenes.
23. Método según la reivindicación 22, donde
dicho cambio en dicha muestra se debe a la Tisis por P100 o una
marca o señal detectable.
24. Método según la reivindicación 22, que
comprende además la inserción de forma recombinante de un
constructo del gen en el genoma de P100 antes de la incubación con
dicha muestra, donde la expresión de dicho constructo del gen
resulta en una señal detectable en presencia de Listeria
monocytogenes.
25. Método según la reivindicación 24, donde
dicho constructo del gen codifica una proteína bioluminescente.
26. Método según la reivindicación 25 donde
dicha proteína bioluminescente está seleccionada del grupo que se
compone de luciferasa y una proteína fluorescente.
27. Método según la reivindicación 26, donde
dicha luciferasa proviene de bacterias o insectos.
28. Método según la reivindicación 26, donde
dicha proteína fluorescente es la proteína verde fluorescente o una
variante de la misma.
29. Método según la reivindicación 22, que
además comprende la inmovilización de dicha Listeria
monocytogenes en un soporte sólido y detección de cualquier
cambio en dicho soporte sólido.
30. Método según la reivindicación 29, donde
dicha Listeria monocytogenes es inmovilizada usando
anticuerpos antilisteria.
31. Método según la reivindicación 30, donde
dicho soporte sólido es una tira reactiva.
32. Método según la reivindicación 22, donde
dicha muestra es obtenida de un paciente sospechoso de estar
infectado por Listeria monocytogenes.
33. Método según la reivindicación 22, donde
dicha muestra es obtenida de un producto alimentario, equipamiento
de procesamiento de alimentos o contenedores de almacenamiento de
alimentos.
34. Proteína endolisina purificada obtenible
del fago P100.
35. Método para controlar la contaminación por
Listeria en un producto alimentario, en el equipamiento de
procesamiento de alimentos o en contenedores de almacenamiento de
alimentos, que comprende la aplicación de la proteína endolisina
según la reivindicación 34, a un producto alimentario, equipamiento
de procesamiento de alimentos o contenedor de almacenamiento de
alimentos en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de
Listeria.
36. Método según la reivindicación 35, que
comprende la aplicación adicional de al menos una variedad de fago
lítico de la familia Myoviridae a dicho producto alimentario,
equipamiento de procesamiento de alimentos o contenedor del
almacenamiento de alimentos.
37. Método según la reivindicación 35, donde
dicho fago lítico está seleccionado del grupo que consiste en P100
y A511.
38. Método según la reivindicación 35, donde
dicha endolisina es producida de forma recombinante.
39. Método según la reivindicación 35, que
además comprende la aplicación de endolisina a partir de al menos
otro fago que infecta la Listeria u otros géneros bacterianos.
40. Método según la reivindicación 39, donde
dicho otro fago es A511.
41. Proteína según la reivindicación 34, donde
dicha proteína endolisina es producida de forma recombinante.
42. Composición para controlar la contaminación
por Listeria en un producto alimentario, en un equipamiento de
procesamiento de alimentos o en contenedores de almacenamiento de
alimentos que comprende la proteína endolisina obtenible a partir
del fago P100 según la reivindicación 34, y un portador
adecuado.
43. Composición según la reivindicación 42, que
comprende además al menos una variedad de fago lítico de la familia
Myoviridae.
44. Composición según la reivindicación 43,
donde dicho fago lítico está seleccionado del grupo que consiste en
P100 y A511.
45. Composición según la reivindicación 42,
donde dicha endolisina es producida de forma recombinante en una
bacteria huésped.
46. Método según la reivindicación 22, donde un
constructo del gen ha sido insertado de forma recombinante en P100
para proporcionar o emitir una señal que confirme la detección de
la Listeria monocytogenes.
47. Método según la reivindicación 46, donde
dicho constructo del gen está seleccionado del grupo que consiste
en los genes que codifican la luciferasa y la proteína verde
fluorescente.
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