NO327920B1 - Virulente fag for kontroll av listeriamonocytogener i matvarer og matprosesseringsanlegg - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår virulent (lytisk) Listeria monocytogenes fag fra Myoviridae-familien, fortrinnsvis P100, alene eller i kombinasjon med andre virulente fag. P100 og endolysinet fra P100 kan bli administrert til matprodukter, til komponentene som skal bli tilsatt til matprodukter og/eller til infrastrukturen i næringsmiddelprosesserende anlegg i hvilke slike matprodukter blir prosessert, eller til beholdere eller innpakning i hvilke slike matvarer blir lagret og/eller sendt ut, for å redusere Listeria monocytogenes kontaminering. P100 kan også bli benyttet i foreliggende oppfinnelse for å identifisere Listeria monocytogenes batterier som er til sted på (eller inni) matvarer, så vel som de Listeria monocytogenes batteriene som er til stede på utstyret eller det generelle miljøet til de næringsmiddelprosesserende anleggene i hvilke matvarene blir prosessert, og i dyr som er infisert med Listeria monocytogenes. Faget og endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli benyttet for å behandle dyr som er infisert med Listeria monocytogenes. P100 vil drepe bakteriene som er innen sitt vertsområde med stor effektivitet og vil formere seg til høye titere der. P100 kan bli kombinert med andre lytiske fag, og/eller med andre antimikrobielle midler for å redusere eller eliminere Listeria.

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

1. Oppfinnelsens felt

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av en bestemt klasse bakteriofager ("fag") som er kjent som virulente fag som er lytiske for bakterielle arter av Listeria monocytogenes, og som er kjent i foreliggende oppfinnelse å redusere tellingene av slike bakterier og/eller først å forhindre deres vekst og å være nyttige for identifiseringen av Listeria monocytogenes, i matprodukter (inkludert, men ikke begrenset til meieriindustri) så vel som på prosesseringsutstyr og andre steder i næringsmiddelindustrianlegg, og som et terapeutisk middel for behandling av dyr som er infisert med Listeria monocytogenes. Et bestemt eksempel på virulente Listria monocytogenes fag, er et fag betegnet P100, som nylig er oppdaget av foreliggende oppfinnere. Foreliggende oppfinnelse angår et endolysin fremstilt av P100 og anvendelse for reduksjon av mengden Listeria monocytogenes i matprodukter så vel som på prosesseringsutstyr og andre steder i næringsmiddelindustrianlegg, og i ett eller flere dyr som er infisert av Listria monocytogenes og fremgangsmåter som vil muliggjøre ytterligere fag som har lytiske egenskaper å bli utviklet og/eller isolert.

Fag, som antibakterielle midler, har fordelen ved replikasjon inni det bakterielle målet. Således, når deres avkom lyserer cellen og utslipper til det ekstracellulære miljø, kan de infisere og multipliseres i etterkommende generasjoner av bakterier, for derved å øke fagpopulasjonen eksponentialt i antall på bekostning av det bakteriell målet.

Konseptet ved anvendelse av fag for og identifiser bakteriell kontaminasjon i matprodukter (og anlegg, utstyr), generelt, har blitt beskrevet i den vitenskaplige litteraturen (se foreksempel Greer, J. Food Prot., 49: 104-109,1986). Konseptet ved bruk av spesielt spesifikke Listeria-fag, for å identifisere Listeria-kontaminasjon av matprodukter og anlegg/utstyr spesielt, ble beskrevet så tidlig som 1990 (Loessner et.al., Applied and Environmental Microbiology, juni 1990, s. 1912-1918).

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av et nylig oppdaget Listeriafag med spesifikke, essensielle og relevante egenskaper, som gjør det spesielt passende for identifisering og kontrahering av Listeria-kontaminasjon av meieriprodukter, anlegg og utstyr.

I tillegg til den generelle vitenskaplige litteraturen på emnet, er der også patentlitteratur som lærer anvendelsen av fag generelt for å kontrollere bakterielle kontaminasjoner i anlegg for prosessering av næringsmidler og i matvarer. Se for eksempel U. S. Patent nr. 5,006, 347 publisert 9. april1991, U. S. Patent nr. 4,851, 240 publisert 25. juli, 1989, og EP 0414304A2 publisert 27. februar1991. Imidlertid beskriver ingen av de ovenfor diskuterte patentene et Listeriafag som faktisk er blitt testet og vist seg å være suksessfylt for kontroll av bakteriell kontaminasjon i prosesseringsanlegg for næringsmidler og i næringsmidler. Grunnen til dette er at alle Listeriafagene som var kjent på tiden for beskrivelsen i de kjente patentene, temperate fag, og var derfor ikke effektive til eller passende for industrielle bakteriefjerningsformål. Uttrykket "temperat" referer til det faktum at når en stamme fag injiserer sitt DNA inn i et bakterielt mål, integreres fagens DNA inn i vertscellens DNA som et "profag", og kan forbli integrert deri i en betydelig tidsperiode. Siden profaget skjæres ut (og initierer replikasjon og lysis) kun når vertscellen blir stresset, er den resulterende bakterielle lysis uforutsigbar og er ikke enkel å kontrollere, noe som er grunnen til at temperate fag ikke er spesielt aktuelle for industrielle anvendelser. Temperate fag passer ikke for industrielle dekontaminasjonsformål også av andre grunner, inkludert det faktum at de kan levere uønskede og farlige gener til bakteriemålet inn i hvilket deres DNA blir integrert. Derimot er der en klasse fag som lyserer sine bakterielle mål direkte, gitt at de ikke har det molekylære apparatet som er nødvendig for integrasjon inn i de bakterielle målene.

Slike fag er referert til som å være "virulente" eller "lytiske" for de bakterielle målene.

Virulente fag mot Listeria monocytogenes ble nylig oppdaget av en av foreliggende oppfinnere.

Det første av disse virulente Listeriafag, betegnet A511, ble beskrevet i litteraturen i 1990 (se Loessner et.al., Applied and Environmental Microbiology, juni 1990, s. 1912-1918,1990). Se også DE 43 26617 C; Loessner et al, Applied and Environemental Microbiology, april 1996, vol. 62, nr. 4, sider 1133-1140; og Gaeng et al., Applied and Environemental Microbiology, juli 2000, vol. 55, nr. 7, s. 2951-2958. Det virulente faget ifølge foreliggende oppfinnelse hører til Myoviridae-familien og har haler som trekker sammen mot virushodet. Et spesielt foretrukket fag er betegnet P100 og ble deponert ved American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110- 2209 23. mai, 2002, 2000 ATCC patentdeponerings designeringsnummer PTA-4383.

Det virulente faget beskrevet I foreliggende oppfinnelse kan også bli benyttet mot CFUs (kolonidannende enheter) av Listeria monocytogenes batterier som er i biofilmer i motsetning til CFUs som er planktoniske. Anvendelse av temperate Listeria monocytoges fag mot Listeriabiofilmer har blitt beskrevet i litteraturen (se for eksempel Roy et. al., Appl. Environ. Microbiol., Sept., 59 (9): 2914-7,1993). Spesifikt benyttet, Roy et. al. temperate Listeria bakteriofag H387, H387-A, og 2671 fra Siphoviridae-familien. Mens disse temperate fag viste noe effektivitet i å fjerne en Listeria-biofilm, kunne de selv når de ble brukt i kombinasjon gi en 3.5 - 3. 7 logaritmisk reduksjon i telling.. Roy et al indikerer at en slik reduksjon "vil måtte forbedres for å imøtekomme det anbefalte reduksjonsnivået på 99,999% ved en 30-s eksponering av et kjemisk sanitærmiddel". Som angitt ovenfor er temperate fag ikke forutsigbare eller lett kontrollerbare i timing av eller effektiviteten med hvilken de kan drepe målbakteriene.

I tillegg til anvendelsen av de virulente fagene som beskrevet ovenfor, har

foreliggende oppfinnere også funnet at virulente substammer kan bli avledet fra et antall temperate fagstammer. Disse virulente substammene kan bli valgt ved teknikker slik som plaque-isolering (i hvilken man velger det klareste området av et plaque, og anriker for de mest virulente stammene deri ved gjentatte sykluser av dyrking til høyere titer, utsåing for nye plaque, og utvelging av de klareste områdene fra plaque i senere generasjoner).

Eksepler på temperate fagstammer fra hvilke virulent substammer har blitt eller vil bli utviklet omfatter de temperate stammene betegnet A118, A502, A006, A500, PSA, P35, og relaterte virus.

Deteksjonen av Listeria blir utført på kjent måte ved hjelp av prosedyrer basert på dyrking av mikroorganismene. Prosedyren beskrevet i Int. J. Food Microbiol. 4 (1987), 249-256 tar to uker. En noe hurtigere prosedyre er anbefalt av International Dairy Foundation (IDF); den tar imidlertid minst 6-8 dager. På grunn av den lange tiden passer ingen av disse prosedyrene for en hurtig identifikasjon. Begge prosedyrene er videre arbeidsintensive, da for produksjonen av individuelle kolonier må næringsmediet bli inokulert flere ganger, og fordi isolatene deretter må blikarakterisert vedhjelp av biokjemiske og serologiske undersøkelsesmetoder.

En forutsetning for anvendelsen av immunologiske tester er at antigenet blir uttrykt, noe som ikke alltid er tilfelle for alle proteinene. Testene varer riktignok kon noen få timer, men i disse prosedyrene er en todagers pre-anrikingskultur nødvendig, da deteksjonsgrensen er 10-1000<*>10<3>celler. DNA prober har en deteksjonsgrense av samme størrelsesorden. En forangående multiplikasjon av bakteriene er derfor også nødvendig for disse prosedyrene: matvareprøver eller fortynninger derav blir strøket ut på agarplater og de inokulerte platene blir inkubert og undersøkt i kolonihybridiseringsprosedyren ved anvendelse av en radioaktivt merket DNA-probe. Deteksjon blir utført ved autoradiografi. Denne fremgangsmåten er også arbeidsintensiv og tar lang tid.

Polymerase kjedereaksjon (PCR) tillater in vitro replikasjon av nukleinsyrer; en forkultur er vanligvis ikke nødvendig for denne prosedyren. Deteksjonsgrensen er 0.5<*>10<3>celler. Imidlertid, da også DNA fra døde celler eller alternativt isolert DNA blir replikert ved denne prosedyren kan forurensing med døde celler ikke bli skilt fra kontaminasjon med levende celler.

Begrensningene ved disse metodene indikerer behovet for å fremskaffe forbedrede midler og metoder for deteksjon av bakterier fra slekten Listeria. EP 0 168 933 (U. S. Pat. nr. 4,861, 709) beskriver en deteksjonsprosedyre for bakterier, f.eks. Escherichia coli, basert på anvendelsen av en rekombinant bakteriofag. Denne fagen inneholder lux-genet fra Vibrio fischeri og gjør det således mulig å detektere E. coli ved bioluminesens med god deteksjonsgrense (0.5<*>10<3>celler).

Ved anvendelse av temperate fag beskriver G. J. Sarkis et al. (1995) Molecular Microbiology 15,1055- 1067 en deteksjonsprosedyre for mycobakterier. I disse deteksjonsprosedyrene blir kun metabolisk aktive bakterieceller detektert; interferens på grunn av døde bakterieceller som i PCR-teknikken skjer ikke.

Scherer, et al., U. S. Patent nr. 5,824,468, meddelt 20. oktober, 1998, beskriver en deteksjonsprosedyre for bakterier av slekten Listeria, hvor det blir preparert en DNA-vektor som omfatter et genetisk system omfattende DNA som koder for ekspresjonen av et eller flere detekterbare proteiner og det blir benyttet en DNA-vektor A511 som spesifikt infiserer bakterier av slekten Listeria og overfører det genetiske systemet til bakterien. De detekterbare proteinene blir uttrykt i bakterien og deteksjonen av detekterbare proteiner indikerer nærværet av bakterier av slekten Listeria.

Fag-kodede lysiner eller endolysiner er sterkt aktive enzymer som hydrolyserer bakterielle cellevegger. Disse fagkodede cellevegg-lytiske enzymene blir syntetisert sent under virusmulitplikasjonen og medierer frigivingen av virusavkommet. Endolysiner kan bli benyttet for å lysere Listeriaceller for å gjenvinne nukleinsyrer eller cellulære proteiner for deteksjon eller differensiering. Endolysinet kan også bli benyttet for å behandle dyr (inkludert mennesket) som er infisert med Listeria og å behandle overflater som kan være kontaminert med Listeria. Lysiner fra Listeria-fag(A118, A500 og A511) har blitt klonet og renset (Loessner, et. al., Applied and Environmental Microbiology, Aug. 1996, s. 3057-3060).

2. Beskrivelse av kjent teknikk

Listeria monocytogenes er et bakterielt patogen som kontaminerer mange næringsmiddelprodukter, listen over hvilke omfatter, men er ikke begrenset til myke oster, posteier, iskrem, røket og salter fisk, frossen sjømat, salater og bearbeidet kjøtt. Når de blir fordøyd kan disse bakteriene produsere en sykdom kalt listerioses, som er kjennetegnet ved en rekke symptomer og tilsander, inkludert diaré, abort og enkefalitt. Følgelig skjer det i industrialiserte land flere hundre dødsfall hvert år som et resultat av Listeria monocytogenes matvarekontaminasjon.

Den matprosesserende industrien har ikke vært tilstrekkelig suksessrik i å utrydde Listeria monocytogenes bakterier fra miljøet i prosesseringsanleggene. Som et resultat, selv når matvarene har blitt pasteurisert ved temperaturer som er høye nok til å drepe disse bakteriene blir de likevel kontaminert etter pasteurisering. Bakteriene får tilgang til matvarene gjennom en eller flere ruter, inkludert (i) fra råvarene (for eksempel fra rå melk, og/eller melk som har blitt pasteurisert ved lav temperatur), (ii) fra prosesseringsmaskineriet (i og på hvilket bakteriene kan vokse som biofilmer som er vanskelige å utrydde); og (iii) fra luftbårne bakterier som er til stede i anleggets miljø som kan sette seg ned på matvarene under konservering, pakking også videre.

Trass de tallrike fremgangmåtene som blir benyttet i industrien for å kontrollere og forhindre kontaminasjon av L. monocytogenes, får bakterien tilgang til og forblir i miljøet i næringsmiddelprosesserende anlegg. Videre overlever de meget høye konsentrasjoner av salt som er til stede i flere fremstillingsprosesser for næringsmidler. Den resulterende kontaminasjonen av matvarene (inkludert, men ikke begrenset til ost, pateer, oppskåret pålegg, varme pølser og andre prosesserte matvarer) føret til tallrike dødsfall hvert år I utviklede land, og resulterer også i tilbaketrekking av matvarer, som summerer seg opp totalt til flere hundre millioner dollar.

Fremgangsmåtene som i dag blir benyttet for å kontrollere Listeria i næringsmiddelindustrien omfatter: (i) pasteurisering av primæringrediensene (f.eks. melk) og varmebehandling av produktet, noe som ofte er lite suksessrikt på grunn av at re-kontaminering ofte opptrer og mange produkter kan ikke gjennomgå en endelig (listeriocidal) varmebehandling; (ii) anvendelse av fysikalsk kjemiske midler slik som desinfiseringsmidler, enzymer, antibiotika, etc., hvor erfaringen har vist at de ikke reduserer bakterielle tellinger tilstrekkelig, og (iii) forsøk på å bryte opp biofilmer mekanisk, noe som etterlater tilstrekkelig av bakterierester til at matvarene blitt kontaminert.

Ytterligere fremgangsmåter må derfor bli gjort tilgjengelige for den næringsmiddelprosesserende industrien for å beskytte konsumentens helse og redusere eksponeringen hos tallrike firma for de store kostnaden og tap av goodwill som er resultatet av slike kontamineringer og tilbakekallinger.

Foreliggende oppfinnere har gjennomført en serie eksperimenter ved bruk av en stamme av L. monocytogenes som er rådende i bearbeidingsanlegget til en bestemt produsent av myke ("smørbare") oster. Den bakteriestammen viste seg å være mottakelig for fag P100 in vitro. Som det vil bli vist i eksempeldelen viste fag P 100 seg I stand til å redusere til under målbare/detekterbare grenser den Listeriabakterien som hadde trengt seg inn i en osteliknende matriks.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Ifølge et første aspekt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for kontroll av Listeriakontaminering av næringsmiddelprodukter, på utstyr for næringsmiddelprosessering, eller i beholdere for lagring av næringsmidler, hvor fremgangsmåten omfatter tilføring av lytisk fag P100, ATCC patent deponeringsnummer PTA 4383, til et næringsmiddelproduktet eller på et utstyr for næringsmiddelprosessering i en mengde som er tilstrekkelig for å redusere mengden av Listeria.

Ifølge et andre aspekt angår foreliggende oppfinnelse En sammensetning som omfatter fag P100, ATCC patent deponeringsnummer PTA-4383 og en bærer, monocytogenes.

Ifølge et tredje aspekt angår foreliggende oppfinnelse en anvendelse av en sammensetning som angitt ovenfor, for fremstilling av et medikament for behandling av et dyr som er infisert med Listeria monocytogenes.

Ifølge et fjerde aspekt angår foreliggende oppfinnelse fag P100 deponert ved the American Type Culture Collection, ATCC patent deponeringsnummer PTA-4383.

Ifølge et femte aspekt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for detektering av nærværet av Listeria monocytogenes, hvor fremgangsmåten omfatter fremskaffelse av en prøve som er mistenkt for å inneholde Listeria monocytogenes, inkubering av nevnte prøve med P100 ifølge krav 21, og detektering av en hvilken som helst endring i nevnte prøve som er forårsaket av P100, som en indikasjon på nærværet av Listeria monocytogenes

Ifølge et sjette aspekt angår foreliggende oppfinnelse et renset endolysinprotein som kan fremskaffes fra fagP100 ifølge krav 21.

Ifølge et syvende aspekt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for kontrahering av Listeria kontaminering i et matprodukt, på et næringsmiddelprosessende utstyr eller på matbeholdere, som omfatter påføring av endolysinproteinet ifølge krav 36 på et næringsmiddelprodukt, på et næringsmiddelprosessende utstyr eller på næringsmiddelbeholdere, i en mengde tilstrekkelig til å redusere mengden av Listeria.

Ifølge et åttende aspekt angår foreliggende oppfinnelse en sammensetning for kontrahering av Listeria-kontaminasjon i et næringsmiddelprodukt, på næringsmiddelprosesserende utstyr eller på beholdere for lagring av næringsmidler, som omfatter endolysinprotein som kan fremskaffes fra fagP100 ifølge krav 36 og en passende bærer.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser at når Listeria monocytogenes blir inokulert ved 10<3>CFU per ml væskekultur og fag blir tilsatt ved en konsentrasjon på 5 x 10<8>PFU per ml, skjer det en praktisk talt fullstendig utrydding av Listeria-bakteriene. Figur 2 viser at påføring av fag P100 på overflaten av en overflatemodnet ost, nesten fullstendig forhindrer vekst av Listeria monocytogenes som hadde blitt tilført startkulturen.

Figur 3 viser fagtitere på ost (PFU/cm<2>).

BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

Ved "vektor" er det ment et nukleinsyremolekyl som er i stand til selv-replikering når den blir introdusert inn i en passende vertscelle. Generelt er vektorene som blir benytter som startmaterialer for de rekombinante vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse, meget spesifikke for infeksjon av bakterier av slektene Listeria og hvor de rekombinante vektorene opprettholder den spesifisiteten. For eksempel er en passende vektor Listeria bakteriofagen P100, som spesifikt lyserer bakterier av slekten Listeria (uunngåelig lytisk). Det er et myovirus med kompleks konstruksjon. Med hensyn på essensielle trekk, skiller Listeria fagen P100 seg fra mange kjente Listeria-fag; forskjellene er relatert til morfologi, vertsområde, proteinprofiler (elektroforese i SDS gel, isoelektrisk fokusering, aminosyresammensetning av de viktigste strukturelle proteinene, DNA/DNA hybridisering).

For deteksjon av nærværet av bakterier av slekten Listeria, blir det benyttet markør-gener. Disse er gener som kan bli detektert etter infeksjon med vektoren av en passende vertscelle og deretter dyrking av cellene under betingelser som passer for ekspresjon av markø-rgenene. Det er foretrukket at markør-gener er de som ikke opptrer i bakteriene av slekten Listeria, og som blir satt inn i vektoren, faget P 100, ved anvendelse av rekombinante teknikker. Slike gener og deres genprodukter er kjent i teknikken, de inkluderer bioluminesensproteiner slik som luxgenet som opptrer i forskjellige varianter av luminiserende bakterier, for eksempel av slekten Vibrio. Inkorporeringen av luxgenet tillater deteksjon ved luminisensmåling. Et eksempel på luxgenet er genet luxAB fra Vibrio harveyi. Andre passende proteiner omfatter, men er ikke begrenset til luciferase og fluoriserende proteiner slik som grønt fluoriserende protein.

Deteksjonsreaksjonen kan skje på en fast overflate som inkluderer, men ikke er begrenset til en teststripe. I denne utførelsesformen kan vektoren inneholdende markørgenet bli reversibelt immobilisert på eller nedstrøms fra en prøvepåsettingssone.

Alternativt kan vektoren bli inkubert med prøven før påsetting på teststripen. Anti-listeria-antistoffer vil bli irreversibelt immobilisert nedstrøms for vektoren og prøvepåsettingssonen. Dersom en prøve som inneholder Listeria blir påsatt vil vektoren infisere Listeria og det detekterbare proteinet vil kunne bli uttrykt. Etter som prøven beveger seg nedover teststripen vil Listeria bli immobilisert av anti-listeria antistoffene. Markørproteinene vil da kunne bli detektert i de immobiliserte Listeria.

Endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli isolert ved teknikker som er kjent innen teknikken, og inkluderer, men er ikke begrenset til lysis, kromatografi, filtrering og sentrifugering. Endolysinet kan bli isolert fra Listeria som har blitt inkubert med PI00 eller endolysinet kan bli klonet og uttrykt I en vertsbakterie (f.eks. E. coli, L. lactis, S. aureus, og B. cereus). Endolysinet kan bli isolert fra vertsbakterien eller vertsbakterien inneholdende endolysinet kan bli satt direkte på eller administrert uten isolering av endolysinet. For eksempel kan en vertsbakterie som produserer endolysinet bli administrert til et dyr eller satt rett på en overflate hvor endolysinet skal bli utskilt I maten, på overflaten eller i dyrets svelg. Endolysinet kan så angripe Listeriaceller som er til stede i dette miljøet. En enhet av endolysinaktivitet er definert som mengden av endolysin som er nødvendig for å redusere den optiske densiteten ved 600 nm med 0,01/min, ved pH 8.0 og 25 °C i et volum på 1 ml, når varmeavlivede, vaskede celler av Listeria monocytogenes blir benyttet som et substrat.

Det ovenfor angitte endolysinet, vertsbakterier inneholdende endolysinet og/eller fag blir påsatt på eller inn i matproduktet, og/eller på forskjellige fysiske steder innen de næringsmiddelproduserende anleggene, ved et antall midler, inkludert, men ikke begrenset til blanding av endolysinet, vertsbakterier inneholdende endolysinet og/eller faget inn i matprodukter, matprodukter, spraying av endolysinet, vertsbakterier inneholdende endolysinet og/eller fag på spraying endolysinet, vertsbakterier inneholdende endolysinet og/eller fag på anleggsutstyret. Nevnte anvendelser reduserer betydelig antallet av Listeria monocytogenes bakterier som ellers ville være til stede.

Faget, endolysinet og/eller vertsbakterien inneholdende endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli benyttet for å behandle dyr, inkludert mennesket, som er infisert med Listeria monocytogenes. En hvilken som helst administrasjonsvei kan bli benyttet for å administrere faget, inkludert, men ikke begrenset til: oral, aerosol eller annen anordning for administrasjon til lungene, nesespray, intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, intratekalt, vaginalt, rektalt, topikalt, lumbal punktur, intratekalt, og direkte tilførsel til hjernen og/eller meninges. Hjelpestoffer som kan bli benyttet som en bærer for leveringen av faget, endolysinet og/eller vertsbakterien som inneholder endolysinet, vil være tydelige for fagmannen innen teknikken. Foreksempel, kan det fri faget, endolysinet og/eller vertsceller inneholdende endolysinet være i lyofilisert form og bli oppløst rett før administrasjon ved IV-injeksjon. Doseringen av administrasjon av faget er antatt å være I området fra omkring 10<3>til omkring 10<13>pfu/per kg/per dag, og foretrukket omkring 10<12>pfu/per k<g>/<p>er dag. Doseringen av administrasjon av endolysinet er antatt å være i området fra 2-2000 ng/per g/per dag, og foretrukket omkring 20-200 ng/per g/per dag. Faget, endolysinet og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet blir administrert inntil det er oppnådd suksessfull eliminering av Listeria monocytogenes eller inntil mengden av Listeria monocytogenes er betydelig redusert.

Foreliggende oppfinnelse dekker også anvendelsen av fagene, endolysinet og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet, når det blir benyttet i kombinasjon med andre anti-Listeriale midler som er kjent i teknikken, Eksempler på slike anti-Listeriale midler, som foretrukket blir kombinert med fag, endolysin og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet, inkluderer, men er ikke begrenset til:

1. Endolysiner (fag-lysiner):

Faget, endolysinet og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli kombinert med listeriolysiner som er enzymer som har blitt vist selektivt å kontrollere Listeria i mat og i miljøet (DE4326617C1 og EP 95932002.9)

2. Overflatedesinfiseringsmidler:

Faget, endolysiner og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli kombinert med kjente overflatedesinfiseringsmidler slik som (i) konserveringsmidler av forskjellig type, slik som, men ikke begrenset til benzosyre og BHT; og (ii) forskjellige desinfiseringsmidler med hvilke fagene er kompatible, slik som, men ikke begrenset til, kvarternære ammoniumforbindelser.

3. Antibiotika

Fagene, endolysinene og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet i kombinasjon med kjente antimikrobielle midler (inkludert antibiotika og kjemoterapeutiske midler) inkludert, men ikke begrenset til vancomycin, nisin, danofloxacin og neomycin.

4. Enzymer

Faget, endolysinet og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet i kombinasjon med enzymer for å hjelpe til å bryte opp biofilmer (f.eks biofilmer funnet på næringsmiddelprosesserende utstyr). Slike enzymer er velkjent I teknikken og inkluderer, men er ikke begrenset til, polysakkarid depolymerase enzymer, og protease.

5. Overflateaktive midler

Faget, endolysiner og/eller vertsbakterier inneholdende endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli kombinert med kjente overflateaktive midler når de blir benyttet for behandling av næringsmiddelprosesserende utstyr. De overflateaktive midlene hjelper til å fukte overflaten slik at fagene blir skikkelig distribuert over de forskjellige overflatene og å oppløse og fjerne skitt slik at Listeria er tilgjengelige for faget. Passende overflateaktive midler omfatter, men er ikke begrenset til, Tween 80,20 og 81 og Dobanols.

6. Bakteriofager som er spesifikke for andre bakterielle kontaminanter enn Listeria monocytogenes

Fagene, endolysinene og/eller vertsbakteriene inneholdende endolysinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli kombinert med fag som er spesifikke for Listeria monocytogenes og/eller fag som er spesifikke for andre bakterier som er kjent for å kontaminere næringsmiddelprosesserende utstyr og matprodukter. Slike bakterier omfatter, men er ikke begrenset til E. coli, og bakterielle arter fra slektene Salmonella, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, og Pseudomonas.

Faget kan bli tilført i en væske- eller en pulverform til matproduktene og det næringsmiddelprosesserende utstyret. Hvis de blir tilført som en væske, blir faget tilført ved en konsentrasjon på 10<3>til 1010 PFU (plaquedannende enheter) per ml og foretrukket ved en konsentrasjon på 10<6>til 109 PFU (plaquedannende enheter) per mL. Hvis de blir tilført som et tørt pulver blir faget tilført ved en konsentrasjon på 10<3>til 1010 PFU (plaquedannende enheter) per mg og fortrinnsvis ved en konsentrasjon på 10<6>til 10<9>PFU (plaquedannende enheter) per mg. Faget kan også bli suspendert I en passende bærer før tilføring eller tørking, inkludert, men ikke begrenset til proteinløsninger inneholdende BSA, casein, myseprotein, soyabønneprotein, etc og sukkerbaserte bærere inneholdende sukker slik som mannitol. Faget kan også bli lyofilisert eller kryopreservert ved forglassing og enten suspendert i en oppløsning før tilførsel eller tilført direkte som et tørt pulver.

Passende mengder av fag for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan bli fremskaffet ved teknikker som er kjent i teknikken, inkludert, men ikke begrenset til en batch-teknikk hvor en kultur av vertsbakterier blir dyrket og så sådd med fag. Etter en passende tid for å tillatte maksimal formering av fag og bakteriell lysis, blir kulturen videre lysert ved fysikalske eller kjemiske midler og lysatet spunnet ned. Supernatenten inneholdende fag kan bli benyttet som sådan eller ytterligere renset ved teknikker som ultrafiltrering, kromatografi og sentrifugering.

Endolysinet kan bli tilført i en væskeform eller i en pulverform til matprodukter og næringsmiddelprosesserende utstyr. Endolysinet blir tilført i en konsentrasjon mellom 2 til 2000 ng endolysin per ml eller per gram bærer, og foretrukket mellom 20 til 200 ng endolysin per ml eller per gram bærer.

Som benyttet i foreliggende søknad, er uttrykket "meieriprodukter" ment å omfatte et hvilket som helst matvareprodukt som blir fremstilt ved bruk av melk eller melkeprodukter, inkludert, men ikke begrenset til melk, yoghurt, iskrem, ost, smør, og fløte.

Som benyttet i foreliggende søknad, er uttrykket "kjøttprodukt" ment å omfatte et hvilket som helst produkt som inneholder dyrevev, inkludert, men ikke begrenset til storfe, svine og fugl. Uttrykket "spiseferdige kjøttprodukter" er ment å omfatte et hvilket som helst kjøttprodukt som ikke krever koking før det spises, inkludert, men ikke begrenset til pateer, varme pølser, bologna, salami, og kjøttpålegg.

Som benyttet i foreliggende søknad, er uttrykket "fiskeprodukt" ment å omfatte et hvilket som helst matprodukt som inneholder vev fra et akvatisk dyr, inkludert, men ikke begrenset til hummer, krabbe, ferskvanns og saltvannsfisk og annen sjømat.

Som benyttet i foreliggende søknad, er uttrykket "ikkepasteurisert matprodukt" ment å omfatte et hvilket som helst matprodukt som blir fremstilt ved bruk av ikkepasteuriserte primæringredienser og som ikke gjennomgår en siste (listeriocidal) varmebehandling.

Som benyttet i foreliggende søknad, er uttrykket "salat" ment å omfatte et hvilket som helst matprodukt som inneholder blandinger av grønnsaker eller frukter, og spesielt slike blandinger som blir presentert for konsumenten for valg fra en utstilling som ofte blir referert til som en "salatbar".

EKSEMPEL 1

Utrydding av Listeria monocytogenes i en væskekultur:

Trinn 1. 10<3>CFU av Listeria monocytogenes ble blandet inn i en væskekultur.

Trinn 2. 5<*>10<8>PFU av fag P100 ble blandet inn i væskekulturen.

Trinn 3. Som en kontroll, ble bufferen i hvilken fag P100 var suspendert, blandet inn i en prøve av væskekulturen.

Trinn 4. Kolonitellinger av bakterien ble utført til forskjellige tider.

Resultatene er vist i figur 1.

EKSEMPEL 2

Et utfordringseksperiment ble utført ved bruk av en stamme av anti-Listeria monocytogenes fag kjent som PI00, i en ostemodell i laboratorieskala. Dette eksperimentet omfatter teknisk flora å oppnå de overflatemodnende kvaliteter (smak, tekstur etc.) som er karakteristiske for en etablert kommersiell ostefremstillingsprosess. Stammen av Listeria monocytogenes ("Lm") kjent som stamme C som ble benyttet I dette eksperimentet er en vanlig kontaminant ved et visst ostefremstillingsanlegg.

Materialer og framgangsmåter

Utfordringseksperiment på ost

• Eksperimentet ble utført på ost som var tatt direkte fra saltvannet (ikkejustert pH). • Lm stamme C, teknisk flora, og fag P100 ble påført på osten ved t=0 ved utsåing av 210fal eller 1 ml av inkubasjonsblandingen på en 64 cm<2>osteoverflate. t=0 er den samme som "CMD+1" (ostefremstillingsdag +1 ("Cheese Making Day +1")). Oster behandlet med 1 ml løsning ble deretter tørket i et laminærstrømningsskap for å tørke overflaten. Inkubasjonsblandingen bestod av:

• 110g/LNaCI

• Teknisk flora:

• Debaryomyces hansenii NIZOF93 7 og NIZOF 1200 (gjær) ved 10<8>CFU/mL • Brevibacterium linens NIZO B 1204 (en bakterie som er typisk for rød smøreost) ved10<8>CFU/mL • LmC tilsvarende til en konsentrasjon på 7cfu/cm2 (fortynnet i pfz fra en eksponentielt voksende kultur) • Fag P100 (i MPOS buffer) ved en konsentrasjon tilsvarende til 1 *107 pfu/cm2 eller 5<*>10<5>PFU/cm2

Se tabell 1 for nøyaktige behandlingskombinasjoner.

• Ostene ble inkubert ved 14 °C og 98% - 99% relativ fuktighet

• Ostene ble behandlet daglig med 210 eller 1000 vaskeoppløsning inneholdende P100, ved CMD+6.CMD+10, og CMD+13 og 1 mL/70 cm2

(behandlingskombinasjon 4 og 5)

• Vaskeoppløsningen inneholdt:

• 110g/LNaCI

• Brevibacterium linens NIZO B 1204 ved 10<8>CFU/mL

• FagP100 (i MOPS buffer) ved en konsentrasjon tilsvarende til 1 *107

PFU/cm<2>eller 5<*>10<5>PFU/cm<2>

• Oster ble pakket ved bruk av pergamentpapir, et materiale som blir benyttet for å pakke Munsterost, ved CMD+16. (CMD+16 er pakkedagen

(PD))

• Oster ble lagret ved 6 °C inntil PD + 63

• LmC-tellinger ble analysert ved tidspunktene indikert I tabell 1. Analysen ble gjort før behandling med fag. • Kvantitativt: prøver på 70 cm2 ble skåret ut av osten og analysert på selektive medier

• Kvalitativt ved CMD+1 og CMD+37 ved anrikingsprosedyre

• Kvalitativ/kvantitativ analyse vil også avhenge av nivået av utvekst av Listeria på ostene. Dersom tellingene er > 102, ble det ikke utført noen anriking. Dersom celletellinger var lavere, ble anrikinger også utført før

pakking.

• Videre ble analyse av pH og teknisk flora utført

• I en ost ved CMD+6, ble fagtitere bestemt før og etter påføring av fag.

Resultater

Modningen av osten var god siden gjæren og Brevibacterium vokste ut vell på osten og ostens overflage var avsuret.

Listeria monocytogenes C vokste godt på ostens overflate i denne modellen, til nivåer på 10<5->10<7>CFU/cm<2>i de negative kontrollene (negativ kontroll: ingen fag tilført) (Figur 2).

Som sett i Figur 2, hemmet fag P100 fullstendig veksten av LmC. Ingen Listeria ble detektert ved bruk av kvantitativ platetellingsmetode, eller ingen anriking. Deteksjonsgrensen ved bruk av anrikingsprosedyren er i størrelsesordenen på en Listeria per 60cm<2>. Dette indikerer at fag P 100 ikke bare hemmer vekst, men også faktisk reduserer Listeria-titere.

Som vist i Figur 2 forhindrer påføring av fagP100 på overflaten til en overflatemodnet ost, fullstendig veksten av Listeria monocytogenes som hadde blitt satt på startkulturen.

Forklaring: CMD = ostefremstillingsdag ("Cheese-making day")

PD = pakkedag ("Packaging day")

For å bestemme om fag kan overleve på ostens overflate, ble i en annen gren av eksperimentet (i hvilken en høy eller en lav dose av faget ble tilført til ostens overflate), fagtitere ble bestemt ved CMD+6, så vel før som etter påføring av fag. I alle prøvene hadde fag blitt tilført ved CMD+1, CMD+2, CMD+3, og CMD+4. Derfor, i de neste prøvene tatt før tilførsel av fag (ved CMD+6), hadde fag vært til stede på osten i minst 48 timer.

Aktive fag ble gjenvunnet fra osteoverflaten ved begge dosene (Fig. 3). Fagtiterne til prøvene tatt før påføring av fag ved CMD+6 var lavere enn prøvene tatt etter tilførsel av fag. Økningen i fagtiter korresponderer bra med den forventede økningen basert på tilsatt dose (dvs. enten 1<*>10<7>pfu/cm<2>eller 5<*>10<5>PFU/cm<2>). Resultatene viser at fag P100 forblir aktiv på osteoverflaten i det minste i flere dager.

EKSEMPEL 3

Analyse, overekspresjon og rensing av endolysiner fra E. coli JM109 (pHPLxxx) plateanalyse 1. Preparer Listeria monocytogenes analysestamme for aktivitetstesting: dyrk 1000 ml overnattkultur i tryptose-medium eller trypticase-soya-medium, sentrifuger, vask celler en gang med SM Buffer, pH 8.0 (se Sambrook et al. , 1989), (eller PBS), og resuspendert i 20 ml SM Buffer (eller PBS) (omkring 50-ganger konsentrering).

2. Lagre i mengder på 1 ml ved -20 °C eller ved -80 °C.

3. Stryk ut eller så ut E. coli JM109 (pHPLxxx) på LB-agar (inneholdende100ug/ml ampicillin), og inkubert over natten. 4. Når koloniene har tilstrekkelig størrelse, preparer replikaplate (med NC-filtere) på LB-Amp plater tilsatt 1 mM IPTG. Inkubert i 5-7 timer inntil små kolonier er synlige. 5. Eksponer overflaten til platen (opp ned) for filterpapir mettet med kloroform i 5 minutter. 6. Legg hurtig over koloniene med 3-4 ml smeltet myk agar (0,4%, i SM Buffer, omkring 45 °C), tilsatt 0,5 ml av en 50-ganger konsentrert L. monocytogenes-kultur (overlaget skal være tynt, jevnt og relativt uklart). 7. Inkuber ved RT i 60 min (opp til over natten), inntil klare lysissoner rundt koloniene er synlige. Dette kan ta alt fra 5 minutter til 5 timer, { dette er en viktig analyse; den må virke. Ellers kan det være et problem med stammen, eller aktivitetstestprosedyren).

Produksjon

8. Preparer ovenrattkultur av JM109 (pHPLxxx) i LB medium med 100tg/ml

Amp@ 30-35 °C inkubering.

9. Om morgenen, inokuler 250 ml forvarmet medium med 10 ml O/N kultur, dyrk til OD600 på 0.5-0,6. 10. Induksjon med 1 mM IPTG, inkuber i ytterligere 3-4 timer inntil vekstraten begynner å avta. 11. Høst celler ved sentrifugering, respuspender pellet 5 ml per 250 ml kultur PBS (pH 8.0) 0,05% Tween20 eller hvis nedstrøms Ni-NTA-rensing er

nødvendig, Buffer A (se nedenfor). Frys celler ved -20 °C.

12. Tin celler. Preparer celleekstrakter ved French-Press; sentrifugering ( > 30000 x g, 30 min); og filtrering av supernatant (0,2 \ im filter, fortrinnsvis fremstilt av PES). Lagre det enzyminneholdende ekstraktet på is (noen få timer), eller ved -20 °C (noter: sonikering kan også bli benyttet, men utbyttet ved French-Press er generelt mye bedre).

Fotometrisk aktivitetsanalalyse (OD 600)

13. Benytt friskt dyrkede midt-til ende-av-log-fase-celler, eller tidligere frosne L. monocytogenes celler fra trinn 1 (over). Resuspender i PBS Buffer, pH 8.0, 0,05% Triton X100 Qustert OD til omkring 1.0-1. 5). Benytt halvmikro plastkuvetter (1 ml); tilsett 900 fal celler, forvarm til mint RT, men fortrinnsvis 30-37 °C, og tilsett 50-100 ml enzym. Turbiditet skal falle til 0,5 eller lavere innen 5 minutter eller mindre. Dette råekstraktet kan bli benyttet for lysis av listeriaceller og frigiving av kromosomalt DNA, plasmider, proteiner og enzymer. Imidlertid, inneholder den store mengder E. coli proteiner, nukleinsyrefragmenter ( DNA, RNA), ATP, og kontaminerende pHPL vektor. Dersom det ikke er ønskelig, rens enzymene ved IMAC ( se nedenfor).

Rensing

14. Fraksjonering av råekstrakter med Ni-NTA-Resin. Prosedyren angitt i trinnene 8-11 er for væskekromatografi (FPLC eller tilsvarende, se trinn 15), og er sterkt anbefalt. Imidlertid, for småskalarensing, kan den også

bil utført ved en enklere batch-type prosedyre: Anvend omkring 3 ml resin(NiNTA Agarose) per 250 ml initielle kulturvolum. Etter eksponering av resinene for proteiner, utfør vasketrinn (i porsjoner) ved lavhastighets sentrifugering (mindre enn 500<*>g). Etter den siste vasken, høst resin og prøver i porsjoner på 1-2 ml I små engangs plastkolonner (tilgjengelige

fra BioRad og andre); plasser i 15 ml konisk- eller rundbunnede rør. Tilsett elueringsbuffer (omkring 1 ml) (100% B), la det stå i 5 minutter, sentrifuger og samle opp væsken. Gjenta eluering 1-2 ganger. Fortsett

med trinn 19.

15. FPLC rensing: Preparer tilstrekkelige mengder av buffer A(50 mM fosfatbuffer, pH 8.0, 500 MmNaCI,5 mM imidazol) og buffer B (samme som A, men 250 mM imidazol). Bruk imidazolgradient med buffere A og B. Last ekstrakt (opp til 40 ml = ekstrakt fra 2 liter (8 x 250 ml) av kultur) på Ni-NTA kolonne (25 ml volum), bruk en lav strømningshastighet (0,75 til 1.0 ml/min). Hvis nødvendig, regenerer Ni-NTA resin(Ni-NTASuperflow) før rensing av hvert individuelle enzym ved prosedyren som angitt i håndboken fra Qiagen. En ny eller regenerert kolonne kan bli

benytter i minst 5 kjøringer.

16. Vask med 5 kolonnevolumer av 100 % Buffer A (strømningshastighet 2 til

3 ml/min)

17. Vask med 3-5 kolonnevolumer av 12 % Buffer B (totalkonsentrasjon omkring 35 mM imidazol), inntil basislinjeavlesningen (@ 280 nm) er stabil. Dette trinnet vil fjerne det mest av de kontaminerende proteinene (vær oppmerksom på at Imidazole i seg selv øker avlesningen ved 280

nm!).

18. Eluer enzymfraksjon med 250 mM imidazol (100 % buffer B). Det er best å samle opp toppen manuelt (vedrørende den høyre skulderen av toppen, stopp tidlig - ikke bli lurt av den høyere absorpsjonen til imidazol selv). Lagre på is. Ikke frys de ferskt eluerte fraksjonen, enzymet har en

tendens til å felle ut I nærvær av mye salt og imidazol!

19. Sjekk alle eluerte fraksjonene ved fotometrisk aktivitetsanalyse (se over). 20. Konsentrasjon og buffer-utbytting (fjerning av imidazol og høysalt) av aktive fraksjoner med sentrifugefilterenheter (PES membran, Mr cut-off 10 kDa). Forbehandle membran med Lysis Buffer (PBS, pH 8.0, 0,05%

Triton X100.0. 05% Tween20). Vask to ganger med 5 ml lysisbuffer. Dersom membranen går tett med protein, overfør til ny filterenhet. Filtersterilisering ved bruk av et 0,2 \ im sprøytefilter (anvend PES membran -cellulose vil holde tilbake mye av enzymene!). Alternativt, kan bufferutbytting bli utført ved dialyse av konsentrert proteinløsning (PBS eller Tris buffere, 0,05% Tween20). Vi fant at HPL118 (men ikke HPL511 eller HPL500) har en tendens til å aggregere under forlenget dialyse. 21. Sjekk fraksjonene ved SDS-PAGE, beregn proteinrenhet (skal være mer enn 90% ren), og proteinkonsentrasjon (typisk i området fra 2-4 mg/ml). Dersom preparatet ikke er tilstrekkelig rent, forsøk å vaske kolonnen (trinn 10) med 15% Buffer B, og eluer HPL proteiner med 150 mM imidazol (60% Buffer B), eller 200 mM imidazol (80% Buffer B). Man kan også "gjenlaste" hele det initiale proteinpreparatet (fortynnet minst 10 ganger før gjenlasting, eller dialysere for å fjerne imidazol) på kolonnen og utføre en andre trinns rensing ved bruk av endrede betingelser, slik som en pH gradient. Gelfiltrering øker også ytterligere proteinets renhet. Dette er imidlertid ikke sikkert er nødvendig for alle anvendelser. 22. Juster konsentrert enzymløsning til et endelig innhold på 30-50% Glycerol, oppdel I 50-500^l-porsjoner, lagre ved -25 °C. Under disse betingelsene er enzymene stabile i flere måneder. Frysing ved -80 °C resulterer i noen tilfeller i tap av aktivitet.

Diskusjon og konklusjon

Når Listeria monocytogenes bakterier ble sådd på overflaten til en overflatemodnet ost sammen med startkulturen, utsletter tilførselen av en tilstrekkelig dosering av Fag P100 på overflaten fullstendig bakterien, som bekreftet ved anrikingsstudiene (deteksjonsgrense ved bruk av anriking: en Listeria CFU per 60cm<2>ostoverflate). I alle ostene behandlet med fag (høye og lave konsentrasjoner, en påføring eller gjentatte), var Listeria-titere etter behandling med P100 lavere enn i kontrollene. Listeria dukket kun opp når fag ble tilført kun en gang (i stedet for flere tidspunkt) eller ved lave konsentrasjoner. Fag kan forbli aktive på osten i flere dager.

Claims (47)

1. Fremgangsmåte for kontroll av Listeriakontaminering av næringsmiddelprodukter, på utstyr for næringsmiddelprosessering, eller i beholdere for lagring av næringsmidler,karakterisert vedat den omfatter tilføring av lytiskfag P100, ATCC patent deponeringsnummer PTA 4383, til et næringsmiddelproduktet eller på et utstyr for næringsmiddelprosessering i en mengde som er tilstrekkelig for å redusere mengden av Listeria.

2. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte P100 blir tilført i kombinasjon med fagA511, ATCC patent deponeringsnummer PTA-4608.

3. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte lytiske fag blir tilført i kombinasjon med minst ett middel valgt blant gruppen bestående av listeriolysin, et overflatedesinfiserende middel, et antibiotika, et overflateaktivt middel, et enzym, og et fag som er spesifikk for bakterielle kontaminanter som er forskjellige fra Listeria monocytogener.

4. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte næringsmiddelprodukt er et meieriprodukt

5. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte matprodukt er et ikkepasteurisert næringsmiddelprodukt.

6.. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte næringsmiddelprodukt er et kjøttprodukt.

7. Fremgangsmåten ifølge krav 6,karakterisert vedat nevnte kjøttprodukt er et kjøttprodukt som er klart til å spise.

8. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte næringsmiddelprodukt er et fiskeprodukt

9. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte lagringsbeholder for næringsmidler er en salatbar og at nevnte næringsmiddelprodukt er salat.

10. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte prosesseringsutstyr for næringsmidler er valgt blant gruppen bestående av et rør gjennom hvilket melk blir pumpet, en tank med høyt saltinnhold for prosessering av ost, en beholder fra hvilken kulturene blir påført å overflaten av en ost, et sett av hyller på hvilke et produkt blir tørket og modnet, og et gulvsluk.

11. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte lytiske fag blir tilført ved blanding med et flytende eller halvfast næringsmiddelprodukt.

12. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte lytiske fag blir blandet med en væske og sprøytet på en overflate valgt blant gruppen bestående av næringsmiddelprodukter, næringsmiddelprosesserende utstyr og næringsmiddellagringsbeholdere.

13. Fremgangsmåten ifølge krav 12,karakterisert vedat nevnte lytiske fag blir tilført til nevnte næringsmiddelprosesserende utstyr i kombinasjon med et middel valgt blant gruppen bestående listeriolysin, et overflatedesinfiserende middel, et antibiotika, et overflateaktivt middel, et enzym, og et fag som er spesifikk for bakterielle kontaminanter forskjellige fra Listeria monocytogenes.

14. Fremgangsmåten ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte lytiske fag blir lyofilisiert eller kryopreservert ved forglassing og tilført i tørr form til nevnte næringsmiddelprodukter, næringsmiddelprosesserende utstyr og næringsmiddel lagringsbeholdere.

15. En sammensetning,karakterisert vedat den omfatter fag P100, ATCC patent deponeringsnummer PTA-4383 og en bærer.

16. Sammensetningen ifølge krav 15,karakterisertv e d at den ytterligere omfatter fagA511, ATCC patent deponeringsnummer PTA-4608.

17. Sammensetningen ifølge krav 15,karakterisertv e d at den ytterligere omfatter et middel valgt blant gruppen omfattende listeriolysin, et overflatedesinfiserende middel, et antibiotika, et overflateaktivt middel, et enzym, og et fag som er spesifikk for bakterielle kontaminanter forskjellige fra Listeria monocytogenes.

18. Sammensetningen ifølge krav 15,karakterisertv e d at nevnte bærer er en farmasøytisk akseptabel bærer.

19. Anvendelse av en sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 15-18 for fremstilling av et medikament for behandling av et dyr som er infisert med Listeria monocytogenes.

20. Anvendelse ifølge krav 19, hvor medikamentet ytterligere omfatter fagA511.

21. FagP100 deponert ved the American Type Culture Collection, ATCC patent deponeringsnummer PTA-4383.

22. Fremgangsmåte for detektering av nærværet av Listeria monocytogenes,karakterisert vedat den omfatter fremskaffelse av en prøve som er mistenkt for å inneholde Listeria monocytogenes, inkubering av nevnte prøve med P100 ifølge krav 21, og detektering av en hvilken som helst endring i nevnte prøve som er forårsaket av P100, som en indikasjon på nærværet av Listeria monocytogenes.

23. Fremgangsmåten ifølge krav 22,karakterisert vedat nevnte endring i nevnte prøve er på grunn av lysis av P100 eller et detekterbart merke eller signal.

24. Fremgangsmåten ifølge krav 22,karakterisert vedat den ytterligere omfatter rekombinant innsetting av et genkonstrukt inn i genomet til P100 før inkubering med nevnte prøve, hvor ekspresjonen av nevnte genkonstrukt resulterer i et detekterbart signal i nærvær av Listeria monocytogenes.

25. Fremgangsmåten ifølge krav 24,karakterisert vedat nevnte genkonstrukt koder for et bio- luminesensprotein.

26. Fremgangsmåten ifølge krav 25,karakterisert vedat nevnte bioluminesensprotein er valgt blant gruppen bestående av luciferase og et fluoresensprotein.

27. Fremgangsmåten ifølge krav 26,karakterisert vedat nevnte luciferase er fra bakterier eller insekter.

28. Fremgangsmåten ifølge krav 26,karakterisert vedat nevnte fluoresensprotein er grønt fluoresensprotein eller en variant derav.

29. Fremgangsmåten ifølge krav 22,karakterisert vedat de ytterligere omfatter immobilisering av nevnte Listeria monocytogenes på en fast støtte og detektering av en hvilken som helst endring på nevnte faste støtte.

30. Fremgangsmåten ifølge krav 29,karakterisert vedat nevnte Listeria monocytogenes blir immobilisert ved bruk av anti-Listeria antistoffer.

31. Fremgangsmåten ifølge krav 30,karakterisert vedat nevnte faste støtte er en teststripe.

32. Fremgangsmåten ifølge krav 22,karakterisert vedat nevnte prøve blir framskaffet fra en pasient som er mistenkt å være infisert med Listeria monocytogenes.

33. Fremgangsmåten ifølge krav 22,karakterisert vedat nevnte prøve blir framskaffet fra et næringsmiddelprodukt, næringsmiddelprosesseringsutstyr eller beholdere for lagring av næringsmidler.

34. Fremgangsmåten ifølge krav 22,karakterisert vedat et genkonstrukt har blitt rekombinant satt inn i P100 for å fremskaffe eller avgi et signal for å bekrefte deteksjonen av Listeria monocytogenes.

35. Fremgangsmåten ifølge krav 34,karakterisert vedat nevnte genkonstrukt er valgt blant gruppen bestående av gener som koder for luciferase og grønt fluoresensprotein.

36. Et renset endolysinprotein,karakterisert vedat kan fremskaffes fra fagP100 ifølge krav 21.

37. Proteinet ifølge krav 36,karakterisert vedat nevnte endolysinprotein er rekombinant fremstilt.

38. Fremgangsmåte for kontrahering av Listeria kontaminering i et matprodukt, på et næringsmiddelprosessende utstyr eller på matbeholdere,karakterisert vedat den omfatter påføring av endolysinproteinet ifølge krav 36 på et næringsmiddelprodukt, på et næringsmiddelprosessende utstyr eller på næringsmiddelbeholdere, i en mengde tilstrekkelig til å redusere mengden av Listeria.

39. Fremgangsmåten ifølge krav 38,karakterisert vedat den ytterligere omfatter påføring av minst en variant av lytisk fag fra Myoviridae-familien på nevnte næringsmiddelprodukt, næringsmiddelprosesserende utstyr eller beholder for lagring av næringsmidler.

40. Fremgangsmåten ifølge krav 38,karakterisert vedat nevnte lytiske fag er valgt blant gruppen omfattende P100 og A511.

41. Fremgangsmåten ifølge krav 38,karakterisert vedat nevnte endolysin er rekombinant fremstilt ved andre bakterielle arter.

42. Fremgangsmåten ifølge krav 38,karakterisert vedat den ytterligere omfatter tilføring av endolysin fra minst et annet fag som infiserer Listeria eller andre bakterielle slekter.

43. Fremgangsmåten ifølge krav 42,karakterisert vedat nevnte andre fag er A511.

44. Sammensetning for kontrahering av Listeria-kontaminasjon i et næringsmiddelprodukt, på næringsmiddelprosesserende utstyr eller på beholdere for lagring av næringsmidler,karakterisert vedat den omfatter endolysinprotein som kan fremskaffes fra fagP100 ifølge krav 36 og en passende bærer.

45. Sammensetningen ifølge krav 44,karakterisertv e d at den ytterligere omfatter minst en variant av lytisk fag fra Myoviridae-familien.

46. Sammensetningen ifølge krav 46,karakterisertved at nevnte lytiske fag er valgt blant gruppen bestående av P100 og A511.

47. Sammensetningen ifølge krav 44,karakterisertv e d at nevnte endolysin er rekombinant fremstilt i vertsbakterier.