CN109868240B - 一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其应用与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种梅毒螺旋体p15‑17‑47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其应用与制备方法，属于分子生物技术与基因工程领域。本申请提供一种梅毒螺旋体p15‑17‑47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其应用与制备方法，通过分析梅毒螺旋体p15‑17‑47融合蛋白中蛋白酶酶切位点，标记可能在发酵表达、纯化过程中容易断裂的位点，并对其关键氨基酸进行定点突变，得到具有高稳定性，以及特异性强和灵敏度高的特点的梅毒螺旋体p15‑17‑47突变体，具备较高的实际应用价值。

Description

一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体、编码基因、重组载体、重组 工程菌及其应用与制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术与基因工程领域，具体而言，涉及一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其应用与制备方法。

背景技术

梅毒是由苍白(梅毒)螺旋体引起的慢性、系统性性传播疾病。主要通过性途径传播，临床上可表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒(胎传梅毒)等。是《中华人民共和国传染病防治法》中，列为乙类防治管理的病种。

梅毒血清学试验梅毒血清学试验方法很多，所用抗原有非螺旋体抗原(心磷脂抗原)和梅毒螺旋体特异性抗原两类。前者有快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)、甲苯胺红不加热血清学试验(TRUST) 等，可做定量试验，用于判断疗效、判断病情活动程度。后者有梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验 (TP-ELISA)等，特异性强，用于TP感染的确证。

80年代初，随着分子生物学技术的发展，特别是基因工程(DNA 重组)技术的出现使梅毒螺旋体的研究进入一个新的阶段。目前，梅毒(TP)的全部基因组DNA序列已经被解析，应用基因工程技术已制备出多种梅毒(TP)重组抗原，这些抗原的制备对梅毒(TP)发病机理的探讨、疫苗的研制、以及血清学诊断试验的建立与应用具有重要意义，为梅毒(TP)的预防和控制提供了更加有效的手段，为梅毒(TP)的研究开辟了一条新的途径。一些抗原已经成功应用于血清学诊断试验的建立与应用，在灵敏性和特异性方面优于传统的梅毒螺旋体抗原血清学实验检测和非梅毒螺旋体抗原血清学实验检测方法，但是仍然不能用于各期梅毒治疗后的疗效判断。

采用基因工程抗原建立的酶联免疫吸附实验(ELISA)以其快速、简便、经济等优点在临床梅毒检测中得到广泛应用。但是，目前的检测方法仍然存在灵敏度差、假阳性率高、稳定性差、早期梅毒感染的检出能力较低等缺点。

发明内容

本申请的目的在于提供了一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其应用与制备方法，本申请提供一种新的梅毒螺旋体p15-17-47突变体作为梅毒抗原，具有高稳定性，以及特异性强和灵敏度高的特点，并提供编码该突变体的编码基因、重组载体、重组工程菌以及制备方法。

第一方面，本申请的实施例提供了一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体，与SEQ IDNO.1所示序列相比，梅毒螺旋体p15-17-47突变体具有对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342 位突变K342G和第363位突变K363G中的至少一种。

在实施例中，梅毒螺旋体p15-17-47融合蛋白是一种基因工程抗原，其氨基酸序列来源于梅毒Nihcols毒株中p15、p17和p47三个蛋白片段的氨基酸序列，并通过大肠杆菌进行表达。但重组表达的野生型梅毒抗原蛋白稳定性较差，容易断裂而暴露出假阳结合位点，进而产生假阳性。本申请通过分析梅毒螺旋体p15-17-47融合蛋白中蛋白酶酶切位点，标记可能在发酵表达、纯化过程中容易断裂的位点，并对其关键氨基酸进行定点突变。

在前述第一方面的一些实施例中，梅毒螺旋体p15-17-47突变体包括对应SEQ IDNO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342 位突变K342G和第363位突变K363G中任意两种；优选地，梅毒螺旋体p15-17-47突变体包括对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342位突变K342G和第363位突变K363G。

在实施例中，通过上述三个位点中的任意两个位点进行突变进一步提高突变体的稳定性；更进一步地，将对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342位突变K342G和第363位突变 K363G三个均进行突变，使得突变体的稳定性达到更高。

第二方面，本申请的实施例一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因，编码基因编码如上述梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

在实施例中，如果是三个位点中的任意一个点突变、任意两个点突变和三个点均突变会产生七种不同的突变方案；产生七种不同突变体；而且由于密码子的简并性，又会产生很多种不同的编码基因。本申请通过分析筛选得到上述三个突变位点。

第三方面，本申请的实施例提供含有上述的梅毒螺旋体 p15-17-47突变体的编码基因的重组载体。

在实施例中，通过重组载体，就能通过原核表达的方式获得梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

第四方面，本申请的实施例提供含有上述的梅毒螺旋体 p15-17-47突变体的编码基因的重组工程菌。

在实施例中，将梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因导入工程菌进行表达，能大量表达得到梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

第五方面，本申请的实施例提供了上述的梅毒螺旋体p15-17-47 突变体的编码基因在制备梅毒螺旋体p15-17-47突变体中的应用。

在实施例中，将上述的梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因应用到制备梅毒螺旋体p15-17-47突变体中，方便通过基因工程的方法大量的制备获得梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

第六方面，本申请的实施例提供一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体的制备方法，包括以下步骤：

以碱基序列如SEQ ID NO.2所示的片段为模板，用碱基序列如 SEQ ID NO.3-4所示第一引物对扩增获得变异片段；

以SEQ ID NO.15所示的p15和p17的总长序列为模板，以碱基序列如SEQ ID NO.5-6所示的第二引物对扩增获得p15-17片段；

以碱基序列如SEQ ID NO.7所示的片段为模板，用碱基序列如 SEQ ID NO.8-9所示的第三引物对扩增获得第一片段；

以碱基序列如SEQ ID NO.10所示的片段为模板，用碱基序列如 SEQ ID NO.11-12所示的第四引物对扩增获得第二片段；

以第一片段、第二片段和变异片段为模板，用碱基序列如SEQ ID NO.8所示的引物为上游引物，以碱基序列如SEQ ID NO.12所示的引物为下游引物，扩增得到p47变异片段；

将含有His-Trx标签的载体骨架、p47变异片段和p15-17片段分别进行双酶切处理，通过凝胶电泳并回收酶切片段；

通过DNA连接酶连接含有His-Trx标签的载体骨架、p47变异片段和p15-17片段的回收片段，得到表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组载体；

将重组载体转化感受态宿主细胞，得到表达梅毒螺旋体 p15-17-47突变体的重组工程菌；

培养并诱导重组工程菌表达得到梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

在实施例中，通过突变梅毒螺旋体p15-17-47的p47片段的位点，得到梅毒螺旋体p15-17-47突变体，使得表达获得的梅毒螺旋体 p15-17-47突变体蛋白具有更高的稳定性，更适合进行试验，提高实验的灵敏度、降低假阳性率。

载体骨架双酶切的时候，载体的5’端和p15-17的5’前端使用相同内切酶进行酶切；载体3’端与p47变异片段的3’末端采用相同的内切酶进行酶切；p15-17的3’端和p47变异片段的5’端酶切后产生相同的黏性末端，可以是相同的酶切也可以是采用同尾酶进行酶切。

在前述第六方面的一些实施例中，扩增的反应程序为94℃，3min； 94℃，30s；55-60℃，30s；65-70℃，30-90s；10个循环；94℃，30s；60-64℃， 30s；65-70℃，30-90s；20个循环；68-72℃，5min。

在实施例中，进行PCR扩增的时候，需要保证基因片段能准确无误的进行复制扩增，因此需要使用高保真的DNA聚合酶进行扩增，保证序列扩增的准确性，保证表达得到的突变体融合蛋白的准确性。

在前述第六方面的一些实施例中，DNA连接酶为Solution I，连接时间为15-18h。

在实施例中，通过DNA连接酶Solution I快速连接经双酶切的 DNA片段，形成重组的表达载体。

当然，连接酶还可以是其他类型的连接酶，本发明中优选为DNA 连接酶SolutionI。

在前述第六方面的一些实施例中，感受态宿主细胞为大肠杆菌感受态。

通过将获得重组表达载体转化到宿主菌感受态细胞内，形成重组工程菌，可以是通过大量培养获得重组工程菌的菌体，从而获得大量的梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

大肠杆菌有很多种类型，都可以作为宿主菌使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本申请提供一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其应用与制备方法，通过分析梅毒螺旋体p15-17-47融合蛋白中蛋白酶酶切位点，标记可能在发酵表达、纯化过程中容易断裂的位点，并对其关键氨基酸进行定点突变，得到具有高稳定性，以及特异性强和灵敏度高的特点的梅毒螺旋体p15-17-47突变体，具备较高的实际应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供梅毒螺旋体p15-17-47突变体表达菌表达的目的蛋白SDS-PAGE检测图；

图2为本发明实验例2提供的纯化后37℃恒温箱中放置6天的目的蛋白SDS-PAGE检测对比图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体，与SEQ ID NO.1所示序列相比，梅毒螺旋体p15-17-47突变体具有对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342位突变K342G和第 363位突变K363G中的至少一种。

优选地，包括对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变 R309G、第342位突变K342G和第363位突变K363G中任意两种；更优选地，包括对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342位突变K342G和第363位突变K363G。

本实施例还提供一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因，该编码基因编码与SEQ ID NO.1所示序列相比，具有对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G或第342位突变K342G或第363位突变K363G。

或者该编码基因编码与SEQ ID NO.1所示序列相比，具有对应 SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G和第342位突变；

或者该编码基因编码与SEQ ID NO.1所示序列相比，具有对应 SEQ ID NO.1所示的序列的第342位突变K342G或第363位突变 K363G；

或者该编码基因编码与SEQ ID NO.1所示序列相比，具有对应 SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G和第363位突变 K363G。

或者该编码基因编码与SEQ ID NO.1所示序列相比，具有对应 SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342位突变 K342G和第363位突变K363G。

实施例2

本实施例提供一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体的制备方法，该制备方法包括扩增目的片段、构建表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组载体以及工程菌。本实施例中以对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342位突变K342G和第363位突变K363G均突变的突变为例进行试验。

1、目的片段的扩增

1.1合成碱基序列如SEQ ID NO.2所示的片段，并以碱基序列如SEQ ID NO.2所示的片段为模板用碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示第一引物对扩增获得变异片段；

1.2以SEQ ID NO.15所示可以表达p15和p17的总长序列为模板，以碱基序列如SEQID NO.5-6所示的第二引物对扩增获得p15-17 片段；

1.3以碱基序列如SEQ ID NO.7所示的片段为模板，用碱基序列如SEQ ID NO.8-9所示的第三引物对扩增获得第一片段；

1.4以碱基序列如SEQ ID NO.10所示的片段为模板，用碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示的第四引物对扩增获得第二片段。

PCR反应引物序列如表1所示。

表1引物序列表

PCR反应体系为上游引物1μL、下游引物1μL、KOD-plus DNA 聚合酶1μL、10×PCR缓冲液2.5μL、MgSO₄2μL、模板3μL和 ddH₂O12μL补足至25μL。

PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，30s；55-60℃，30s；65-70℃， 30-90s；10个循环；94℃，30s；60-64℃，30s；65-70℃，30-90s；20个循环；68-72℃，5min。

扩增获得的第一片段、第二片段和变异片段通过凝胶电泳并回收提纯后，稀释50倍作为模板，并用碱基序列如SEQ ID NO.8所示的引物为上游引物，以碱基序列如SEQ IDNO.12所示的引物为下游引物进行PCR扩增，得到p47变异片段。

2、构建重组载体

以原核表达载体pET30a作为载体骨架，在载体pET30a的N端插入His-Trx蛋白标签，构建pET30a-Trx载体，用NcoI和XhoI双酶切pET30a-Trx载体，用NcoI和NheI双酶切p15-17片段，用SpeI 和XhoI双酶切p47变异片段。酶切体系为酶1和酶2分别1μL，10×缓冲液2μL，底物16μL，共20μL。在30℃酶切反应30min。

载体pET30a-Trx、p15-17片段和p47变异片段的双酶切产物分别通过琼脂糖凝胶电泳和DNA纯化回收。得到载体pET30a-Trx双酶切骨架、p15-17双酶切片段和p47变异双酶切片段。

将载体pET30a-Trx双酶切骨架、p15-17双酶切片段和p47变异双酶切片段通过DNA连接酶为Solution I连接15h-18h，得到表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组载体。连接反应体系为：p15-17双酶切片段4μL、p47变异双酶切片段1μL、载体pET30a双酶切片段1μL、 DNA连接酶Solution 5μL共10μL的反应体系，在16℃温度条件下连接反应15h-18h。

3、获得重组工程菌

将表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组载体转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞。

阳性斑的筛选验证和质粒提取

将梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组工程菌涂于LB平板生长过夜。挑取平板单斑在加有1mL的LB培养基中进行培养3-4h，并用培养的胶凝液进行菌落PCR，引物为SEQ IDNO.13：pET-fw:CACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAAC，SEQ ID NO.14： pET-rv:CTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAG。

菌落PCR的反应体系为模板0.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、 2×Taq Mix 10μL，ddH₂O7.5μL；PCR反应程序为：预变性：94℃5min；循环：94℃30s，60℃30s，72℃150s，共30次循环；延伸：72℃5min。阳性斑菌落PCR产物片段大小理论为2556bp。

筛选得到阳性单斑，将阳性单斑进行扩大培养摇菌过夜，提取质粒用双酶切(NcoI+XhoI)鉴定为阳性并进行测序鉴定，序列与设计序列一致，然后将质粒转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，取鉴定准确的重组载体质粒1μL，加入50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min，加入500μL的LB 培养基(不含抗生素)，37℃，200rpm培养1小时，取60μL培养液涂布平板(含有硫酸卡那霉素50μg/mL)。得到表达梅毒螺旋体 p15-17-47突变体的重组工程菌。

实验例1

本实验例以实施例2的制备表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组工程菌进行梅毒螺旋体p15-17-47突变体的诱导表达和纯化。

1、梅毒螺旋体p15-17-47突变体的诱导表达

将表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组工程菌接种到300mL 培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/mL)，37℃，200rpm摇瓶培养至 OD₆₀₀＝0.8，加入IPTG诱导表达(IPTG终浓度为0.7mM)，继续培养4h。将菌液6500rpm离心10min，弃上清，收集菌泥。

将收集的大肠杆菌菌泥按1g菌泥40mL缓冲液的比例加入 10mM Tris-HCl(pH8.0)，重悬菌体，在超声机上超声破碎，20mL菌液，200w，超声2s停2s超声20min。超声完全的菌液清亮，经11000rpm 离心10min后沉淀极少，取上清30μL作为样品，进行SDS-PAGE检测。

结果如图1所示，经过SDS-PAGE检测出现目的条带。

2、梅毒螺旋体p15-17-47突变体的纯化

按照梅毒螺旋体p15-17-47突变体的诱导表达的步骤诱导表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白后，对大肠杆菌进行超声破碎；离心处理，离心力：22000g，温度：4-8℃，时间：15分钟。保留上清，弃沉淀。上清即为Ni Sepharose Fast Flow柱层析样品。

选择合适的层析柱及填充的Ni Sepharose Fast Flow凝胶量进行装柱。将装填好后的Ni Sepharose Fast Flow层析柱纯化水冲洗4个柱体积。用4倍柱体积的平衡液(10mMTris-HCl+500mM NaCl pH 8.0)平衡纯化柱，平衡完成后上样。上样结束后，以平衡液冲洗管路及层析柱中残余样品。用4倍柱体积的除杂液(10mM Tris-HCl pH 8.0+500mM NaCl+30mM IMZ)洗脱除去杂质。用4倍柱体积的洗脱液(10mM Tris-HCl pH 8.0+500mM NaCl+200mM IMZ)洗脱结合的抗原蛋白即为纯化后的产品。

将纯化的梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白与未突变的蛋白分别进行SDS-PAGE电泳。

结果如图2所示，可以看出，突变后的梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白的杂带更少，而未突变的梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白具有较多的拖尾的断裂片段，说明目的梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白更为稳定。

实验例2

本实验例对获得的梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白的特异性和稳定性进行检测。

1、特异性实验

96孔板、封闭液、酶液、A液、B液、终止液均购自英科新创 (厦门)科技有限公司。

检测板的包被：用包被缓冲液(50mM pH9.6的CB)把纯化好的梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白作为抗原按比例进行稀释混匀，按100μL/孔加入到96孔板中，保鲜膜包裹，37℃恒温箱放置16±2 小时。洗板1次，扣干，按200μL/孔加入封闭液，保鲜膜包裹，37℃恒温箱放置2小时。甩掉板孔中的封闭液，将甩干的酶标板置于干燥间(温度24±4℃、湿度﹤25％)过夜干燥(18h)。

储存：干燥完的酶标板装入铝箔袋封中，加入干燥剂，抽真空包装后放入2-8℃冰箱中储存。

包被板的检测：取所需数量的包被好的微孔条，置于板架上，并做好标识。按顺序分别在相应孔中加入100μL关键质控品及阴、阳性对照。置37℃恒温箱中温育60min，用洗涤液充分洗涤5次，然后扣干(洗涤液浸泡时间30-60秒)。分别在每孔中加入100μL酶标抗体，置于37℃恒温箱中温育30min(如有需要可在板上覆盖封板膜)，用洗涤液充分洗涤5次，然后扣干。每孔加入底物A、B液各50μL，轻拍混匀后，置于37℃恒温箱中温育30min。每孔加入终止液50μL，混匀。用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔的A值 (用单波长测定时，需用空白对照空调零，一般采用双波长测定法)，并记录结果。

Cut off Value(COV)计算：COV＝阴性对照平均OD值×2.0(阴性对照OD值低于0.075作0.075计算，高于0.075按实际OD值计算)，待测样品OD值≥COV为阳性，待测样品OD值＜COV为阴性。

经TPPA法确证的梅毒阳性血清100例，阴性血清1000例按包被板检测方法进行检测，突变前抗原和突变后抗原同时检测。结果如表2所示。

表2特异性检测结果

	阳性样本	真阳样本	假阳样本	阳性符合率	阴性样本	真阴样本	假阴样本	阴性符合率
									突变前	100	100	0	100％	1000	997	3	99.7％
突变后	100	100	0	100％	1000	1000	0	100％

从表2可以看出，本梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白作为抗原具有较高的特异性检测结果。尤其是对阴性样本的检测与设计结果完全符合，避免错误检测。

2、稳定性实验

将纯化好的待检梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白和未突变蛋白均平分成2份，其中的1份置于4℃冰箱中长期存放，另1份置于37℃恒温箱中6天后取出再放入4℃冰箱中平衡过夜，按照时间点分别包被成检测板，与4℃放置的酶标板用阳性关键质控品进行稳定性检测。

结果判定：包被反应板对阳性关键质控品的检测A值与4℃酶标板对阳性关键质控品的检测A值的比值进行判断，比值越高稳定性越好。结果如表3所示。

表3稳定性检测结果

	4℃放置的酶标板	37℃放置6天	37℃活性残存率	4℃放置12月	4℃活性残存率
						突变前	1.286	0.954	74.2％	0.528	41.1％
突变后	1.293	1.269	98.1％	1.146	88.6％

从表3可以看出，本发明提供的梅毒螺旋体p15-17-47突变体蛋白即使在4℃放置12个月后的活性残存率依然高达88.6％，远高于为突变的梅毒螺旋体p15-17-47，说明本发明提供的梅毒螺旋体 p15-17-47突变体蛋白具备较高的稳定性。

综上所述，本发明实施例提供的一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其应用与制备方法，具有高稳定性，以及特异性强和灵敏度高的特点。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京新创生物工程有限公司

<120> 一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体、编码基因、重组载体、重组工程菌及其

应用与制备方法

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 434

<212> PRT

<213> Treponema Pallidum

<400> 1

Met Lys Val Lys Tyr Ala Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Gln Leu Leu

1 5 10 15

Val Val Gly Cys Gly Ser Ser His His Glu Thr His Tyr Gly Tyr Ala

20 25 30

Thr Leu Ser Tyr Ala Asp Tyr Trp Ala Gly Glu Leu Gly Gln Ser Arg

35 40 45

Asp Val Leu Leu Ala Gly Asn Ala Glu Ala Asp Arg Ala Gly Asp Leu

50 55 60

Asp Ala Gly Met Phe Asp Ala Val Ser Arg Ala Thr His Gly His Gly

65 70 75 80

Ala Phe Arg Gln Gln Phe Gln Tyr Ala Val Glu Val Leu Gly Glu Lys

85 90 95

Val Leu Ser Lys Gln Glu Thr Glu Asp Ser Arg Gly Arg Lys Lys Trp

100 105 110

Glu Tyr Glu Thr Asp Pro Ser Val Thr Lys Met Val Arg Ala Ser Ala

115 120 125

Ser Phe Gln Asp Leu Gly Glu Asp Gly Glu Ile Lys Phe Glu Ala Val

130 135 140

Glu Gly Ala Val Ala Leu Ala Asp Arg Ala Ser Ser Phe Met Val Asp

145 150 155 160

Ser Glu Glu Tyr Lys Ile Thr Asn Val Lys Val His Gly Met Lys Phe

165 170 175

Val Pro Val Ala Val Pro His Glu Leu Lys Gly Ile Ala Lys Glu Lys

180 185 190

Phe His Phe Val Glu Asp Ser Arg Val Thr Glu Asn Thr Asn Gly Leu

195 200 205

Lys Thr Met Leu Thr Glu Asp Ser Phe Ser Ala Arg Lys Val Ser Ser

210 215 220

Met Glu Ser Pro His Asp Leu Val Val Asp Thr Val Gly Thr Gly Tyr

225 230 235 240

His Ser Arg Phe Gly Ser Asp Ala Glu Ala Ser Val Met Leu Lys Arg

245 250 255

Ala Asp Gly Ser Glu Leu Ser His Arg Glu Phe Ile Asp Tyr Val Met

260 265 270

Asn Phe Asn Thr Val Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Asp Asp Ala Ser Tyr

275 280 285

Thr Asn Leu Met Ala Ser Tyr Gly Thr Lys His Ser Ala Asp Ser Trp

290 295 300

Trp Lys Thr Gly Arg Val Pro Arg Ile Ser Cys Gly Ile Asn Tyr Gly

305 310 315 320

Phe Asp Arg Phe Lys Gly Ser Gly Pro Gly Tyr Tyr Arg Leu Thr Leu

325 330 335

Ile Ala Asn Gly Tyr Arg Asp Val Val Ala Asp Val Arg Phe Leu Pro

340 345 350

Lys Tyr Glu Gly Asn Ile Asp Ile Gly Leu Lys Gly Lys Val Leu Thr

355 360 365

Ile Gly Gly Ala Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp Ala Ala Val Asp Val

370 375 380

Phe Ala Asp Gly Gln Pro Lys Leu Val Ser Asp Gln Ala Val Ser Leu

385 390 395 400

Gly Gln Asn Val Leu Ser Ala Asp Phe Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Thr

405 410 415

Val Glu Val Arg Phe Lys Glu Phe Gly Ser Val Arg Ala Lys Val Val

420 425 430

Ala Gln

<210> 2

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggaggtgtgc cccgcatttc gtgtggtatc aactatgggt tcgatcggtt taaaggttca 60

gggccgggat actacaggct gactttgatt gcgaacgggt atggggacgt agttgctgat 120

gtgcgcttcc ttcccaagta cgaggggaac atcgatattg ggttgggcgg gaag 174

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgctgactcc tggtggaaga caggaggtgt gccccgca 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccccctatg gtcagcacct tcccgcccaa cccaatat 38

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catgccatgg gtagcttcag ctctattc 28

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggactagtt ttctttgttt ttttgagcac g 31

<210> 7

<211> 858

<212> DNA

<213> Treponema Pallidum

<400> 7

ggcagccatc atgaaaccca ttatggctat gcgaccctga gctatgcgga ttattgggcg 60

ggtgagctgg gccagagccg tgacgtgctt ttggcgggta atgccgaggc ggaccgcgcg 120

ggggatctcg acgcaggcat gttcgatgca gtttctcgcg caacccacgg gcatggcgcg 180

ttccgtcagc aatttcagta cgcggttgag gtattgggcg aaaaggttct ctcgaagcag 240

gagaccgaag acagcagggg aagaaaaaag tgggagtacg agactgaccc aagcgttact 300

aagatggtgc gtgcctctgc gtcatttcag gatttgggag aggacgggga gattaagttt 360

gaagcagtcg agggtgcagt agcgttggcg gatcgcgcga gttccttcat ggttgacagc 420

gaggaataca agattacgaa cgtaaaggtt cacggtatga agtttgtccc agttgcggtt 480

cctcatgaat taaaagggat tgcaaaggag aagtttcact tcgtggaaga ctcccgcgtt 540

acggagaata ccaacggcct taagacaatg ctcactgagg atagtttttc tgcacgtaag 600

gtaagcagca tggagagccc gcacgacctt gtggtagaca cggtgggtac cggttaccac 660

agccgttttg gttcggacgc agaggcttct gtgatgctga aaagggctga tggctctgag 720

ctgtcgcacc gtgagttcat cgactatgtg atgaacttca acacggtccg ctacgactac 780

tacggtgatg acgcgagcta caccaatctg atggcgagtt atggcaccaa gcactctgct 840

gactcctggt ggaagaca 858

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctagctagcg gcagccatca tgaaaccc 28

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcttccacc aggagtcagc a 21

<210> 10

<211> 207

<212> DNA

<213> Treponema Pallidum

<400> 10

gtgctgacca tagggggcgc ggacgcggag actctgatgg atgctgcagt tgacgtgttt 60

gccgatggac agcctaagct tgtcagcgat caagcggtga gcttggggca gaatgtcctc 120

tctgcggatt tcactcccgg cactgagtac acggttgagg ttaggttcaa ggaattcggt 180

tctgtgcgtg cgaaggtagt ggcccag 207

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgctgacca tagggggc 18

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccgctcgagt tactactggg ccactacct 29

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cactataggg gaattgtgag cggataac 28

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctcagcttcc tttcgggctt tgttag 26

<210> 15

<211> 813

<212> DNA

<213> Treponema Pallidum

<400> 15

agcttcagct ctattccgaa tggcacctat cgtgcgacct accaagactt cgatgagaac 60

ggctggaaag actttctgga agttaccttc gatggtggca agatggtgca ggttgtgtac 120

gactatcagc acaaagaagg tcgcttcaag tctcaagacg ctgactatca tcgtgtgatg 180

tatgcaagct ctggtatcgg tccagagaag gcattccgtg agctggctga tgcactgctg 240

gagaagggta atccggagat ggtggatgta gtcactggtg ctactgtgtc tagccagagc 300

ttccgccgtc tgggtgctgc gctgctgcag tctgcgcgtc gcggtgagaa agaggcgatc 360

attagccgtg gcggcggcac tagcggcggt gcgctgggca gcgcgctgtg cgtgagctgc 420

accaccgtgt gcccgcacgc cggcaaggcc aaagcggaaa aggtagagtg cgcgttgaag 480

ggaggtatct ttcggggtac gctacctgcg gccgattgcc cgggaatcga tacgactgtg 540

acgttcaacg cggatggcac tgcgcaaaag gtagagcttg cccttgagaa gaagtcggca 600

ccttctcctc ttacgtatcg cggtacgtgg atggtacgtg aagacggaat tgtcgaactc 660

tcgcttgtgt cctcggagca atcgaaggca ccgcacgaga aagagctgta cgagctgata 720

gacagtaact ccgttcgcta catgggcgct cccggcgcag gaaagccttc aaaggagatg 780

gcgccgtttt acgtgctcaa aaaaacaaag aaa 813

Claims (8)

1.一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体，其特征在于，与SEQ ID NO.1所示序列相比，所述梅毒螺旋体p15-17-47突变体对应SEQ ID NO.1所示的序列的第309位突变R309G、第342位突变R342G和第363位突变K363G。

2.一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1所述的梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

3.含有权利要求2所述的梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因的重组载体。

4.含有权利要求2所述的梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因的重组工程菌。

5.如权利要求2所述的梅毒螺旋体p15-17-47突变体的编码基因在制备梅毒螺旋体p15-17-47突变体中的应用。

6.一种梅毒螺旋体p15-17-47突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以碱基序列如SEQ ID NO.2所示的片段为模板，用碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示第一引物对扩增获得变异片段；

以SEQ ID NO.15所示的p15和p17的总长序列为模板，以碱基序列如SEQ ID NO.5-6所示的第二引物对扩增获得p15-17片段；

以碱基序列如SEQ ID NO.7所示的片段为模板，用碱基序列如SEQ ID NO.8-9所示的第三引物对扩增获得第一片段；

以碱基序列如SEQ ID NO.10所示的片段为模板，用碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示的第四引物对扩增获得第二片段；

以所述第一片段、所述第二片段和所述变异片段为模板，用碱基序列如SEQ ID NO.8所示的引物为上游引物，以碱基序列如SEQ ID NO.12所示的引物为下游引物，扩增得到p47变异片段；

将含有His-Trx标签的载体骨架、所述p47变异片段和所述p15-17片段分别进行双酶切处理，通过凝胶电泳并回收酶切片段；

通过DNA连接酶连接所述含有His-Trx标签的载体骨架、所述p47变异片段和所述p15-17片段的回收片段，得到表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组载体；

将所述重组载体转化感受态宿主细胞，得到表达梅毒螺旋体p15-17-47突变体的重组工程菌；

培养并诱导所述重组工程菌表达得到梅毒螺旋体p15-17-47突变体。

7.根据权利要求6所述的梅毒螺旋体p15-17-47突变体的制备方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为94℃，3min;94℃，30s;55-60℃，30s;65-70℃，30-90s;10个循环；94℃，30s;60-64℃，30s;65-70℃，30-90s;20个循环；68-72℃，5min。

8.根据权利要求6所述的梅毒螺旋体p15-17-47突变体的制备方法，其特征在于，所述感受态宿主细胞为大肠杆菌感受态。

Images