CN115976154A - 一种金属蛋白酶adamts13活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，涉及蛋白多肽检测领域。该方法包括：构建pcDNA3.4‑10His‑vWF73‑SEAP表达载体；采用pcDNA3.4‑10His‑vWF73‑SEAP表达载体对诱导细胞进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His‑vWF73‑SEAP蛋白；10His‑vWF73‑SEAP蛋白和样本中的ADAMTS13金属蛋白酶进行酶切反应，产生第一酶切产物；对第一酶切产物进行检测。采用本发明的方法制备的微孔板进行金属蛋白酶ADAMTS13活性的检测，操作简单，节省时间。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白多肽检测领域，特别涉及一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法。
背景技术
I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白酶(A Disintegrin And Metalloproteasewith ThromboSpondin type I motif,ADAMTS)13，属于含I型血小板反应蛋白的解聚素和金属蛋白酶家族成员，为人血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)裂解蛋白酶。ADAMTS13于2001年首次发现并克隆，为存在血浆中的一种重要金属蛋白酶，在多种疾病中发现其水平异常，如血栓性血小板减少性紫癜，此外目前认为与炎症反应也有关系。随着研究的深入，ADAMTS13与心血管疾病的关系引起普遍关注，其参与多种心血管疾病的发生和发展。而起作为功能性蛋白，其活性高低的检测就极为重要。
目前市面上有2种ADAMTS13酶活性检测试剂盒，一种是基于荧光技术的检测方案，一种是基于酶联免疫ELISA原理的检测方案。由于基于荧光技术的检测方案受到血液样本中的血红蛋白以及血红素的干扰非常明显，因此基于酶联免疫ELISA原理的检测方案在临床上应用更加广泛，该试剂盒来源于奥地利公司Technoclone的产品号Ref:5450701。基于酶联免疫ELISA原理的检测方案主要包括：用GST抗体包被96孔板；加入带有GST标签的ADAMTS13酶切底物短肽vWF73；跟带有ADAMTS13的血液样本孵育一定时间，ADAMTS13可以特异剪切vWF73底物短肽；酶切产物偶联GST标签的一段含有10个氨基酸片段，利用可以特异性结合这段氨基酸片段的抗体进行酶联免疫检测，加入辣根过氧化物酶底物TMB，最终读取450nm波长的分光光度值。此检测方案整个实验流程较长，大约耗时5个小时左右，检测效率较低，且制备出来的试剂盒售价高，每个试剂盒售价高达1500美元左右。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：
本发明提供了一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，包括如下步骤：
构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体；
采用上述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体对诱导细胞进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白；
上述10His-vWF73-SEAP蛋白和样本中的ADAMTS13金属蛋白酶进行酶切反应，产生第一酶切产物；
对上述第一酶切产物进行检测。
在一种实施方式中，上述构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体，具体包括：
采用vWF73-f和vWF73-r作为PCR引物，对pGEX6p-1-vWF73-5K模板DNA序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
对上述PCR扩增产物进行纯化，得到vWF73片段；
采用限制性核酸内切酶Hind III对上述vWF73片段和pcDNA3.4-His-SEAP质粒进行酶切，得到第二酶切产物，其中，上述第二酶切产物中包括酶切后的vWF73目的片段和酶切后的目标质粒；
对上述第二酶切产物进行纯化，得到纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒；
将上述纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒进行混合连接，得到连接产物；
采用上述连接产物对DH5α感受态细胞进行转化，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。该表达载体具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有50％以上同源性的核苷酸序列。
在一种实施方式中，上述采用上述连接产物对DH5α感受态细胞进行转化，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体，具体包括：
将上述连接产物与上述DH5α感受态细胞混合，得到混合物；
向上述混合物中加入上述混合物的10倍体积的LB培养基进行摇菌后，得到菌液；
将上述菌液进行离心，弃上清液，得到重悬菌液；
将上述重悬菌液置于含有氨苄抗生素的LB平板上培养，得到菌落；
从上述菌落中选取克隆菌落进行菌液PCR鉴定，从鉴定为阳性的菌落中提取pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。
在一种实施方式中，上述采用诱导细胞对上述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白，具体包括：
使用Expi293FTM细胞作为诱导细胞，对上述Expi293FTM细胞进行悬浮培养；
当Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，采用上述Expi293FTM细胞转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到转染后的细胞；
向转染后的细胞中加入500mL减血清培养基进行培养，收集培养后的上清液进行离心；
取离心后的上清液，使用层析柱进行纯化，洗脱后得到10His-vWF73-SEAP蛋白。该表达载体具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有50％以上同源性的氨基酸序列。
在一种实施方式中，上述当Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，采用上述Expi293FTM细胞转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到转染后的细胞，具体包括：
将25ml减血清培养基缓慢加入3ml聚醚酰亚胺，混匀后，室温静置5min；
将25ml减血清培养基缓慢加入1mg pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，混匀后，室温静置5min；
将静置好的含有聚醚酰亚胺的减血清培养基加入到静置好的含有pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒的减血清培养基中，边加边搅拌，混匀后，室温静置15min-25min；
将静置好的pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒-聚醚酰亚胺复合物加入到Expi293FTM细胞中，边加边摇晃锥形瓶，得到转染后的细胞。
在一种实施方式中，上述采用诱导细胞对上述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白后，还包括：
采用上述10His-vWF73-SEAP蛋白制备偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板。
在一种实施方式中，上述采用上述10His-vWF73-SEAP蛋白制备偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板，具体包括：
将上述10His-vWF73-SEAP蛋白用酶切反应缓冲液稀释，得到稀释蛋白液；
将上述稀释蛋白液加入微孔板中，4℃下静置24小时后，采用1×PBS后，真空密封，得到偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板。
在一种实施方式中，上述10His-vWF73-SEAP蛋白和样本中的ADAMTS13金属蛋白酶进行酶切反应，产生第一酶切产物，具体包括：
向上述偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板的小孔中加入酶切反应缓冲液，将样本加入上述小孔中，盖上封膜后反应1小时，产生第一酶切产物。
在一种实施方式中，上述对上述第一酶切产物进行检测，具体包括：
采用洗脱缓冲液洗脱上述第一酶切产物中的杂质蛋白；
向洗脱杂质蛋白后的第一酶切产物中加入碱性磷酸酶显色底物，盖上封膜后反应30分钟；
向反应后的溶液中加入碱性磷酸酶显色终止液，得到样本的显色溶液；
在410nm波长下测定上述样本的显色溶液的吸光光度值。
在一种实施方式中，上述对上述第一酶切产物进行检测还包括：
采用标准品建立标准曲线；
基于上述标准曲线和上述显色溶液的吸光光度值，确定上述样本中金属蛋白酶ADAMTS13活性。
在一种实施方式中，上述采用标准品建立标准曲线，具体包括：
将不同浓度的标准品加入上述偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板的小孔中，盖上封膜后反应1小时，产生标准品的酶切产物；
采用洗脱缓冲液洗脱上述标准品的酶切产物中的杂质蛋白；
向洗脱杂质蛋白后的标准品的酶切产物中加入碱性磷酸酶显色底物，盖上封膜后反应30分钟；
向反应后的溶液中加入碱性磷酸酶显色终止液，在410nm波长下测定上述标准品的显色溶液的吸光光度值；
将标准品的浓度值的常用对数作为y轴，将上述标准品的显色溶液在410nm波长下的吸光光度值作为x轴，建立标准曲线。
本发明提供的上述技术方案的有益效果至少包括：
本发明的一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，制备了一种新型的ADAMTS13酶切底物，采用带有碱性磷酸酶标签的底物纯化蛋白，制备检测用微孔板，来定量检测金属蛋白酶ADAMTS13的酶切产物含量，从而根据标准曲线计算血液样本中该酶的活性。依据该酶活性的高低，可用于临床血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的辅助诊断以及监控多种心血管疾病的发生和发展。采用本发明的方法制备好的微孔板进行金属蛋白酶ADAMTS13活性的检测操作步骤简单，时间仅需1.5小时左右，精简了流程，大大提高了检测效率，使整体检测流程更加简便，且采用本发明的偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板制备的试剂盒成本低廉。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍。通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为本发明实施例提供的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法的工作原理图；
图2为本发明实施例提供的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法的方法流程图；
图3为本发明金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法的一个实施例的标准曲线图；
图4为本发明金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法的一个实施例的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本申请，将参考附图对本申请的各个方面做出更详细的说明。应理解，这些详细说明只是对本申请的示例性实施方式的描述，而非以任何方式限制本申请的范围。在说明书全文中，相同的附图标号指代相同的元件。表述“和/或”包括相关联的所列项目中的一个或多个的任何和全部组合。
在附图中，为了便于说明，已稍微调整了元素的大小、尺寸和形状。附图仅为示例而并非严格按比例绘制。如在本文中使用的，用语“大致”、“大约”以及类似的用语用作表近似的用语，而不用作表程度的用语，并且旨在说明将由本领域普通技术人员认识到的、测量值或计算值中的固有偏差。另外，在本申请中，各步骤处理描述的先后顺序并不必然表示这些处理在实际操作中出现的顺序，除非有明确其它限定或者能够从上下文推导出的除外。
还应理解的是，诸如“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”等表述在本说明书中是开放性而非封闭性的表述，其表示存在所陈述的特征，但不排除一个或多个其它特征和/或它们的组合的存在。此外，当诸如“...中的至少一个”的表述出现在所列特征的列表之后时，其修饰整列特征，而非仅仅修饰列表中的单独元件。此外，当描述本申请的实施方式时，使用“可”表示“本申请的一个或多个实施方式”。并且，用语“示例性的”旨在指代示例或举例说明。
除非另外限定，否则本文中使用的所有措辞(包括工程术语和科技术语)均具有与本申请所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。还应理解的是，除非本申请中有明确的说明，否则在常用词典中定义的词语应被解释为具有与它们在相关技术的上下文中的含义一致的含义，而不应以理想化或过于形式化的意义解释。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本申请。
本发明提供了一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，实验原理如图1所示。请参考图2，该方法包括如下步骤：
步骤101，构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。
在一种实施方式中，上述构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体，具体包括：
第一步，如下表1，采用vWF73-f和vWF73-r作为PCR引物，对pGEX6p-1-vWF73-5K模板DNA序列进行扩增，得到PCR扩增产物。
表1PCR引物
| 引物名称 | 5’-3’ |
| vWF73-f | tctAAGCTTGACCGGGAGCAGGCGCCCA |
| vWF73-r | tccAAGCTTCCTCTGCAGCACCAGGTC |
作为示例，在采用PCR进行扩增时，PCR条件如表2所示。作为另一示例，本申请中的即用型快速PCR预混液使用金牌Mix TSINGKE TSE101，任何可以达到本申请效果的即用型快速PCR预混液均可以选择，本申请不对此做出限制。
表2PCR条件
进一步地，对上述PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果显示扩增出了与预期大小相符的条带，则扩增成功。采用DpnI酶37℃处理PCR扩增产物1小时，消化PCR原模板。
第二步，对上述PCR扩增产物进行纯化，得到vWF73片段。具体地，采用DNA胶回收纯化试剂盒对已消化的PCR扩增产物进行纯化，得到vWF73片段。
第三步，采用限制性核酸内切酶Hind III对上述vWF73片段和pcDNA3.4-His-SEAP质粒进行酶切，得到第二酶切产物，其中，上述第二酶切产物中包括酶切后的vWF73目的片段和酶切后的目标质粒。进一步地，采用限制性核酸内切酶Hind III对3μg vWF73片段和5μg pcDNA3.4-His-SEAP质粒进行酶切，37℃水浴酶切两小时，酶切体系如下表3所示，得到第二酶切产物。对第二酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果显示第二酶切产物与预期大小相符，则酶切成功。
表3酶切体系
第四步，对上述第二酶切产物进行纯化，得到纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒。具体地，采用DNA胶回收纯化试剂盒对第二酶切产物进行纯化，并进行DNA浓度测量，得到纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒。
第五步，将上述纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒进行混合连接，得到连接产物。具体地，将上述纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒按照摩尔比3：1进行混合连接，4℃下连接12小时，得到连接产物。
第六步，采用上述连接产物对DH5α感受态细胞进行转化，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。
在一种实施方式中，上述采用上述连接产物对DH5α感受态细胞进行转化，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体，具体包括如下子步骤：
第一子步骤，将上述连接产物与上述DH5α感受态细胞混合，得到混合物。具体地，将2.5μL连接产物与上述DH5α感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，冰浴2-3分钟，得到混合物。
第二子步骤，向上述混合物中加入上述混合物的10倍体积的LB培养基进行摇菌后，得到菌液。具体地，向上述混合物中加入上述混合物的10倍体积的LB培养基，在37℃下220rpm转速摇菌2小时后，得到菌液。
第三子步骤，将上述菌液进行离心，弃去适量上清液，得到重悬菌液。作为示例，离心的转速可以设置为10000rpm。
第四子步骤，将上述重悬菌液置于含有氨苄抗生素的LB平板上培养，得到菌落。具体地，培养的条件为37℃。
第五子步骤，从上述菌落中选取克隆菌落进行菌液PCR鉴定，从鉴定为阳性的菌落中提取pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。具体地，需要对从鉴定成功的阳性克隆摇菌中提取pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒进行测序，当测序结果证实克隆质粒序列完全正确时，表明已经成功的构建了pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP哺乳动物细胞表达载体，即pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。
步骤102，采用上述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体对诱导细胞进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白。
在一种实施方式中，上述采用上述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体对诱导细胞进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白，具体包括：
第一步，使用Expi293FTM细胞作为诱导细胞，对上述Expi293FTM细胞进行悬浮培养。具体地，悬浮培养的过程为在500ml培养基体系中接种Expi293FTM细胞，使得Expi293FTM细胞终浓度达到2million/ml。
第二步，当Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，采用上述Expi293FTM细胞转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到转染后的细胞。具体地，当Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，采用上述Expi293FTM细胞转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，以pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒(mg)：聚醚酰亚胺(ml)为1：3的比例进行转染，得到转染后的细胞。
第三步，向转染后的细胞中加入500mL减血清培养基进行培养，收集培养后的上清液进行离心。具体地，培养时间为5天。进一步地，收集培养后的上清液进行离心具体为，收集培养后的上清液在1000rpm，4℃下离心10min，弃去沉淀后，对初次离心的上清液再次离心，离心条件为1000rpm，4℃下离心30min。
第四步，取离心后的上清液，使用层析柱进行纯化，洗脱后得到10His-vWF73-SEAP蛋白。
在一种实施方式中，上述当Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，采用上述Expi293FTM细胞转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到转染后的细胞，具体包括如下子步骤：
第一子步骤，取25ml减血清培养基(Opti-MEM)于50ml离心管内，缓慢加入3ml聚醚酰亚胺(PEI)，轻轻吹打混匀，室温静置5min。
第二子步骤，取25ml Opti-MEM于50ml离心管内，缓慢加入1mg pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，轻轻吹打混匀，室温静置5min。
第三子步骤，将静置好的含有PEI的Opti-MEM加入到静置好的含有pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒的Opti-MEM中，边加边搅拌，最后用移液枪轻轻吹打混匀，室温静置15min-25min。
第四子步骤，将静置好的pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒-PEI复合物一滴一滴地加入到Expi293FTM细胞中，边加边摇晃锥形瓶，条件为37℃，浓度为8％CO2，锥形瓶旋转速度为110rpm，转染4小时后，得到转染后的细胞。
在一种实施方式中，上述取离心后的上清液，使用层析柱进行纯化，洗脱后得到10His-vWF73-SEAP蛋白，具体包括如下子步骤：
第一子步骤，取离心后的上清液，使用0.45μm的滤膜过滤，再用0.22μm的滤膜过滤，取过滤后的溶液200μL补至最终溶液的浓度为20mM Tris-HCl；500mM NaCl；pH8.0，0.2mM NiCl2，取200μL最终溶液作为层析柱的样品，置于4℃下备用。
第二子步骤，层析柱采用规格为20ml NI填料的NI柱，平衡NI柱。具体地，将Ni-NTAbeads装入层析柱，待酒精流出后，将5倍柱体积去离子水加入层析柱，进一步清洗掉酒精；采用20mM Tris-HCl8.0；500mM NaCl作为洗涤液清洗5倍柱体积平衡柱子。
第三子步骤，将样品加入柱子中，并在层析柱下方放置收集管，调节流出速度为2s/滴，使蛋白挂柱。
第四子步骤，采用洗涤液清洗3倍柱体积，洗脱层析柱内未结合的蛋白，收集流出液，前1-2柱体积(40mL)在管子上标记wash buffer1，第3个柱体积，在管子上标记washbuffer2(共20mL)。
第五子步骤，采用20mM Tris-HCl 8.0；500mM NaCl；5mM咪唑清洗3倍柱体积，洗脱层析柱内未结合的蛋白，收集流出液，前1-2柱体积(40mL)在管子上标记5mM咪唑1，第3个柱体积在管子上标记5mM咪唑2(共20mL)。
第六子步骤，采用20mM Tris-HCl 8.0；500mM NaCl；10mM咪唑清洗3倍柱体积，洗脱层析柱内未结合的蛋白，收集流出液，前1-2柱体积(40mL)在管子上标记10mM咪唑1，第3个柱体积在管子上标记10mM咪唑2(共20mL)。
第七子步骤，采用20mM Tris-HCl 8.0；500mM NaCl；20mM咪唑清洗3倍柱体积，洗脱层析柱内未结合的蛋白，收集流出液，前1-2柱体积(40mL)在管子上标记20mM咪唑1，第3个柱体积在管子上标记20mM咪唑2(共20mL)。
第八子步骤，采用20mM Tris-HCl 8.0；500mM NaCl；300mM咪唑清洗3倍柱体积，洗脱层析柱内的10His-vWF73-SEAP蛋白粗品，收集流出液，10mL/管。并在管子上分别依次标记300mM咪唑1，300mM咪唑2，300mM咪唑3，300mM咪唑4，300mM咪唑5、300mM咪唑6。进一步地，将清洗及洗脱蛋白的每一步收集的流出液进行SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达量和纯化纯度。
第九子步骤，使用PH7.5的20mM Tris-HCL作为透析液，对10His-vWF73-SEAP蛋白粗品进行透析，透析1000倍以上，在AKTApruo层析系统上使用HiTrapTMCaptoTMQ ImpRes色谱柱进行离子交换。
第十子步骤，将透析后的蛋白样品上样到HiTrapTMCaptoTMQ ImpRes柱上进行阴离子交换，采用20mM Tris-HCl PH7.5清洗5个柱体积，设置盐浓度梯度洗脱蛋白，将梯度设置为初始为20mM Tris-HCl PH7.5，30min梯度上升为100％的20mM Tris-HCL，1mM NaCL，PH7.5，结束。
第十一子步骤，将洗脱后收集到的样品浓缩并置换20mM Tris-HCL，150mM NaCL，PH8.0，得到10His-vWF73-SEAP蛋白，测定终浓度，置于-80℃保存。
在一种实施方式中，上述采用诱导细胞对上述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白后，还包括：
采用上述10His-vWF73-SEAP蛋白制备偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板。
在一种实施方式中，上述采用上述10His-vWF73-SEAP蛋白制备偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板，具体包括如下子步骤：
第一子步骤，将上述10His-vWF73-SEAP蛋白用酶切反应缓冲液稀释至0.5ng/μl，得到10ml稀释蛋白液，其中，酶切反应缓冲液为5mM Tris-HCl,5mM NaCl,pH 8.5,1mMBaCl2。
第二子步骤，将上述稀释蛋白液加入微孔板中，4℃下静置24小时后，采用1×PBS清洗后，真空密封，得到偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板。具体地，将100μl上述稀释蛋白液加入微孔板的每个小孔中，盖上封口膜，4℃下静置24小时后，采用1×PBS清洗一次后，轻轻叩干，真空密封，得到偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板，置于4℃保存备用。作为示例，本申请中使用的微孔板为Thermo Scientific Catalog number:15442的透明微孔板，任何可以实现本申请的微孔板均可以使用，本申请对此不做限制。
步骤103，上述10His-vWF73-SEAP蛋白和样本中的ADAMTS13金属蛋白酶进行酶切反应，产生第一酶切产物。
在一种实施方式中，上述10His-vWF73-SEAP蛋白和样本中的ADAMTS13金属蛋白酶进行酶切反应，产生第一酶切产物，具体包括：
向上述偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板的小孔中加入酶切反应缓冲液，将样本加入上述小孔中，盖上封膜后反应1小时，产生第一酶切产物。具体地，向上述偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板的小孔中加入90μL酶切反应缓冲液，将样本加入上述小孔中，盖上平板封膜，置于37度摇床，150转/分钟(rpm)，反应1个小时，产生第一酶切产物。
步骤104，对上述第一酶切产物进行检测。
在一种实施方式中，上述对上述第一酶切产物进行检测，具体包括：
第一步，采用洗脱缓冲液洗脱上述第一酶切产物中的杂质蛋白。具体地，将摇床中的微孔板取出，倒掉反应混合物，用洗脱缓冲液洗4次，最后一次洗完以后，将平板在纸上轻叩，去掉多余的水分。其中，洗脱缓冲液的制备方法如下：将10倍浓缩PBS缓冲液，加入至225mL纯净水中混合均匀，制备成洗脱缓冲液，置于室温中待用。
第二步，向洗脱杂质蛋白后的第一酶切产物中加入50μL碱性磷酸酶显色底物，盖上封膜后反应30分钟。具体地，反应条件为37度摇床中静置反应30分钟。
第三步，向反应后的溶液中加入50μL碱性磷酸酶显色终止液，得到样本的显色溶液。
第四步，在410nm波长下测定上述样本的显色溶液的吸光光度值。
在一种实施方式中，上述对上述第一酶切产物进行检测还包括：
第五步，采用标准品建立标准曲线；
第六步，基于上述标准曲线和上述显色溶液的吸光光度值，确定上述样本中金属蛋白酶ADAMTS13活性。
在一种实施方式中，上述采用标准品建立标准曲线，具体包括如下子步骤：
第一子步骤，将不同浓度的标准品加入上述偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板的小孔中，盖上封膜后反应1小时，产生标准品的酶切产物。具体地，分别将10μL不同浓度的标准品和2个质控样品加入上述偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板的小孔中，盖上平板封膜，置于37度摇床，150转/分钟(rpm)，反应1个小时，产生标准品的酶切产物和质控的酶切产物。作为示例，标准品浓度可以选择100％,50％,20％,10％,5％。
第二子步骤，采用洗脱缓冲液洗脱上述标准品的酶切产物中的杂质蛋白；
第三子步骤，向洗脱杂质蛋白后的标准品的酶切产物中加入碱性磷酸酶显色底物，盖上封膜后反应30分钟；
第四子步骤，向反应后的溶液中加入碱性磷酸酶显色终止液，在410nm波长下测定上述标准品的显色溶液的吸光光度值；
第五子步骤，如图3所示，将标准品的浓度值的常用对数作为y轴，将上述标准品的显色溶液在410nm波长下的吸光光度值作为x轴，建立标准曲线。
进一步地，上述采用标准品建立标准曲线的第一子步骤至第四子步骤应与步骤103、步骤104中样本的酶切反应与检测同步进行。
在体外条件下，金属蛋白酶ADAMTS13可以特异性的剪切含有位点D1596-R1668的人血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)短肽，因此本发明构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP哺乳动物细胞表达载体，利用的酶切底物带有碱性磷酸酶SEAP(Secreted Alkaline Phos-phatase)标签，酶切反应结束以后，通过检测96孔板上剩余的碱性磷酸活性，从而计算出血液样本中ADAMTS13的活性高低。
本发明提供的上述技术方案的有益效果至少包括：
本发明的一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，制备了一种新型的ADAMTS13酶切底物，采用带有碱性磷酸酶标签的底物纯化蛋白，制备检测用微孔板，来定量检测金属蛋白酶ADAMTS13的酶切产物含量，从而根据标准曲线计算血液样本中该酶的活性。依据该酶活性的高低，可用于临床血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的辅助诊断以及监控多种心血管疾病的发生和发展。本发明的方法操作步骤简单，采用制备好的微孔板进行金属蛋白酶ADAMTS13活性的检测时间仅需1.5小时左右，精简了流程，大大提高了检测效率，使整体检测流程更加简便，且采用本发明的偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板制备的试剂盒成本低廉。
实施例1制备偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的96孔板
1.构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体
1.1如表1所示，采用vWF73-f和vWF73-r作为PCR引物；PCR条件如表2所示，进行PCR扩增。
1.2对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果显示扩增出了与预期大小相符的条带。
1.3利用DpnI酶(NEB)37℃处理PCR扩增产物1小时，消化PCR原模板。
1.4利用DNA胶回收纯化试剂盒对已消化的PCR扩增产物进行纯化，得到vWF73片段。
1.5分别利用限制性核酸内切酶Hind III(NEB)酶切3μg vWF73片段/5μgpcDNA3.4-His-SEAP质粒，37℃水浴酶切两小时。酶切体系如表3所示。
1.6对第二酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果显示第二酶切产物与预期大小相符。
1.7利用DNA胶回收纯化试剂盒对第二酶切产物进行纯化，并进行DNA浓度测量。
1.8将纯化好的vWF73目的片段以及纯化后的目标质粒按照摩尔比3：1进行混合连接，4℃连接12小时。
1.9取2.5μL连接产物用于转化DH5α感受态细胞。
1.9.1将连接产物与DH5α感受态细胞混合，冰浴30分钟后，42℃水浴热激90秒，然后冰浴2-3分钟，得到混合物；
1.9.2向上述混合物中加10倍体积LB培养基，在37℃下220rpm转速摇菌2小时，得到菌液；
1.9.3对上述菌液以10000rpm转速离心，弃去适量上清液，得到重悬菌液后；
1.9.4将上述重悬菌液在含有氨苄抗生素的LB平板上进行37℃培养，得到菌落；
1.9.5从上数菌落中选取克隆菌落进行菌液PCR鉴定后，采用质粒提取试剂盒(QIAGEN)从初步鉴定为阳性的菌落中提取质粒，进行测序。鉴定过程如下：即利用vWF73-f和vWF73-r作为PCR引物，用菌落菌液作为PCR模板，同时利用pGEX6p-1-vWF73-5K作为阳性对照，如果菌落菌液可以得到跟阳性对照大小一致约250bp的DNA片段，该菌落即为阳性菌落。经测序证实，所得克隆质粒序列完全正确，表明已成功构建了pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP哺乳动物细胞表达载体。
2.悬浮细胞瞬时表达分泌10His-vWF73-SEAP蛋白及其纯化
2.1悬浮培养Expi293FTM细胞，在500ml培养基体系中接种Expi293FTM细胞，使得细胞终浓度达到2million/ml。待Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒,以pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒(mg):PEI(ml)＝1：3的比例进行转染。
2.1.1取25ml Opti-MEM于50ml离心管内，缓慢加入3ml PEI，轻轻吹打混匀，室温静置5min；
2.1.2取25ml Opti-MEM于50ml离心管内，缓慢加入1mg pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，轻轻吹打混匀，室温静置5min；
2.1.3将静置好的含有PEI的Opti-MEM加入到静置好的含有pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒的Opti-MEM中，边加边搅拌，最后用移液枪轻轻吹打混匀，室温静置15min-25min；
2.1.4将2.1.3中静置好的pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒-PEI复合物一滴一滴地加入到Expi293FTM细胞中，边加边摇晃锥形瓶，条件为37℃，8％CO2，110rpm；
2.1.5转染4小时后再加500ml减血清培养基，培养5天，收取培养后的上清液，4℃下，1000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液继续离心，4℃下，10000rpm离心30min，收集离心后的上清液。
2.2蛋白纯化
2.2.1纯化前样品的准备：离心后的上清液，使用0.45μm的滤膜过滤，再用0.22μm的滤膜过滤，取过滤后的溶液200μl，补至终浓度为20mM Tris-HCl；500mM NaCl；pH8.0，0.2mM NiCl2，然后取200μl作为样品置于4℃，备用。
2.2.2纯化前NI柱的平衡：将Ni-NTA beads(GE)装入层析柱，待酒精流出后，用5倍柱体积去离子水加入层析柱清洗掉酒精；用wash buffer(20mM Tris-HCl；pH8.0；500mMNaCl)清洗5倍柱体积平衡柱子。
2.2.3蛋白挂柱：将样品加入柱子中，并在下方放置收集管，标记为Flow through(2S/滴)。
2.2.4清洗杂蛋白：
wash buffer(20mM Tris-HCl；pH8.0；500mM NaCl)清洗未结合的蛋白，收集流出液，洗3倍柱体积，前1-2柱体积(40mL)在管子上标记wash buffer1，第3个柱体积，在管子上标记wash buffer2(共20mL)。
5mM咪唑清洗杂蛋白(20mM Tris-HCl；pH8.0；500mM NaCl；5mM咪唑)：3个柱体积清洗未结合的蛋白，收集流出液，前1-2柱体积(40mL)在管子上标记5mM咪唑1，第3个柱体积在管子上标记5mM咪唑2(共20mL)。
10mM咪唑清洗杂蛋白(20mM Tris-HCl；pH8.0；500mM NaCl；10mM咪唑)：3个柱体积清洗未结合的蛋白，前1-2柱体积(40mL)在管子上标记10mM咪唑1，第3个柱体积在管子上标记10mM咪唑2(共20mL)。
20mM咪唑清洗杂蛋白(20mM Tris-HCl；pH8.0；500mM NaCl；20mM咪唑)：3个柱体积清洗未结合的蛋白，前1-2个柱体积(40mL)在管子上标记20mM咪唑1，第3柱体积在管子上标记20mM咪唑2(共20mL)。
洗脱目的蛋白：300mM咪唑清洗脱目的蛋白(20mM Tris-HCl；pH8.0；500mM NaCl；300mM咪唑)：3CV洗脱蛋白，收集流出液，10mL/管。并在管子上标记300mM咪唑1，300mM咪唑2，300mM咪唑3，300mM咪唑4，300mM咪唑5、300mM咪唑6。
对样品、Flow through、wash buffer1，wash buffer2、10mM咪唑1，10mM咪唑2、20mM咪唑1、20mM咪唑2、300mM咪唑1、300mM咪唑2、300mM咪唑3、300mM咪唑4、300mM咪唑5、300mM咪唑6及每一步洗脱收集到的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达量和纯化纯度。
2.2.5离子交换前样品的准备：透析过柱后的10His-vWF73-SEAP粗品，透析液为20mM Tris-HCL，PH7.5，透析1000倍以上，在AKTApruo层析系统上使用HiTrapTMCaptoTMQImpRes(GE)色谱柱进行离子交换。
2.2.6上样：将透析后的10His-vWF73-SEAP样品上样到HiTrapTMCaptoTMQ ImpRes(GE)柱上进行阴离子交换，采用bufferA(20mM Tris-HCl PH7.5)清洗5个柱体积，设置盐浓度梯度洗脱蛋白，将梯度条件设置为初始20mM Tris-HCl，pH7.5，30min内上升至100％BufferB(20mM Tris-HCL，1mM NaCL，pH7.5)，开始洗脱，直至梯度上升至100％ BufferB时结束。将洗脱后收集到的样品进行10His-vWF73-SEAP凝胶电泳检测蛋白表达量和纯化纯度。
2.2.7将洗脱后收集到的样品浓缩并置换buffer(20mM Tris-HCL，150mM NaCL，PH8.0)，测定纯化蛋白10His-vWF73-SEAP终浓度，-80℃保存。
3.偶联底物10His-vWF73-SEAP蛋白的96孔板构建
3.1取可以结合His标签的透明96孔板(Thermo Scientific Catalog number:15442)，室温备用；
3.2将纯化得到的10His-vWF73-SEAP蛋白用酶切反应缓冲液(5mM Tris-HCl,5mMNaCl,pH 8.5,1mM BaCl2)稀释至0.5ng/μl，得到10ml稀释蛋白液；
3.3每个小孔加入100μl上述0.5ng/μl的稀释蛋白液，盖上封口膜，4℃冰箱静置24小时；
3.4每个小孔用200μl 1×PBS清洗一次，在卫生纸上轻轻叩干，真空密封，4℃保存备用。
实施例2ADAMTS13金属蛋白酶活性检测。
1.酶切反应
1.1根据需要，取出一定数量的偶联底物His-vWF73-SEAP蛋白的反应结合条孔，置于室温待用；
1.2每个孔加入90μL的酶切反应缓冲液，另外在一个孔中加入100μL反应缓冲液作为标准品的F-0％；
1.3分别取10μL血浆标准品(浓度分别为A-100％,B-50％,C-20％,D-10％,E-5％)，2个质控(HC,LC)，以及待测血浆样本S，加入对应的小孔；
1.4盖上平板封膜，置于37度摇床，150转/分钟(rpm)，反应1个小时；
2.酶切产物检测
2.1将10倍浓缩PBS缓冲液，加到225mL纯净水中混合均匀，制备成工作洗脱缓冲液，置于室温中待用；
2.2将37度摇床中的微孔板取出，倒掉反应混合物，用洗脱缓冲液洗4次，最后一次洗完以后，将微孔板在吸水纸上轻叩，去掉多余的水分；
2.3加入50μL碱性磷酸酶显色底物，盖上平板封膜，置于37度摇床，静置反应30分钟；
2.4加入50μL碱性磷酸酶显色终止液，在410nm波长条件下读取吸光光度值；
2.5建立纵坐标是血浆浓度(％)的常用对数(log10x)，横坐标是OD410的标准曲线。
3.结果分析
所有的检测样本包括标准品A--F，质控HC/LC，以及血浆样本都是两次重复检测，以平均值进行结果分析。首先用F-0％的值减去各个检测点的值作为相应活性的OD410相对值，然后用血浆浓度值的常用对数作为标准曲线的Y轴，用OD410相对值作为X轴，做线性曲线，如图3所示。
本发明金属蛋白酶ADAMTS13活性检测的精确度跟准确度通过不同次实验以及同次实验来体现，经过多次反复实验，得到结果如下表所示：
选择ADAMTS13活性广泛分布的48个样本，采用本发明的方法进行检测，其结果如图4所示，结果显示本发明的方法检测水平较高。
以上说明书中描述的只是本发明的具体实施方式，各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制，所属技术领域的普通技术人员在阅读了说明书后可以对以前所述的具体实施方式做修改或变形，而不背离本发明的实质和范围。
Claims (10)
1.一种金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体；
采用所述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体对诱导细胞进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白；
所述10His-vWF73-SEAP蛋白和样本中的ADAMTS13金属蛋白酶进行酶切反应，产生第一酶切产物；
对所述第一酶切产物进行检测。
2.根据权利要求1所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述构建pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体，具体包括：
采用vWF73-f和vWF73-r作为PCR引物，对pGEX6p-1-vWF73-5K模板DNA序列进行扩增，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物进行纯化，得到vWF73片段；
采用限制性核酸内切酶Hind III对所述vWF73片段和pcDNA3.4-His-SEAP质粒进行酶切，得到第二酶切产物，其中，所述第二酶切产物中包括酶切后的vWF73目的片段和酶切后的目标质粒；
对所述第二酶切产物进行纯化，得到纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒；
将所述纯化后的vWF73目的片段和纯化后的目标质粒进行混合连接，得到连接产物；
采用所述连接产物对DH5α感受态细胞进行转化，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。
3.根据权利要求2所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述采用所述连接产物对DH5α感受态细胞进行转化，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体，具体包括：
将所述连接产物与所述DH5α感受态细胞混合，得到混合物；
向所述混合物中加入所述混合物的10倍体积的LB培养基进行摇菌后，得到菌液；
将所述菌液进行离心，弃上清液，得到重悬菌液；
将所述重悬菌液置于含有氨苄抗生素的LB平板上培养，得到菌落；
从所述菌落中选取克隆菌落进行菌液PCR鉴定，从鉴定为阳性的的菌落中提取pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体。
4.根据权利要求1所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述采用诱导细胞对所述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白，具体包括：
使用Expi293FTM细胞作为诱导细胞，对所述Expi293FTM细胞进行悬浮培养；
当Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，采用所述Expi293FTM细胞转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到转染后的细胞；
向转染后的细胞中加入500mL减血清培养基进行培养，收集培养后的上清液进行离心；
取离心后的上清液，使用层析柱进行纯化，洗脱后得到10His-vWF73-SEAP蛋白。
5.根据权利要求4所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述当Expi293FTM细胞浓度达到3million/ml时，采用所述Expi293FTM细胞转染pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，得到转染后的细胞，具体包括：
将25ml减血清培养基缓慢加入3ml聚醚酰亚胺，混匀后，室温静置5min；
将25ml减血清培养基缓慢加入1mgpcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒，混匀后，室温静置5min；
将静置好的含有聚醚酰亚胺的减血清培养基加入到静置好的含有pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒的减血清培养基中，边加边搅拌，混匀后，室温静置15min-25min；
将静置好的pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP质粒-聚醚酰亚胺复合物加入到Expi293FTM细胞中，边加边摇晃锥形瓶，得到转染后的细胞。
6.根据权利要求4所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述采用诱导细胞对所述pcDNA3.4-10His-vWF73-SEAP表达载体进行转染，转染后的细胞表达分泌蛋白，纯化后得到10His-vWF73-SEAP蛋白后，还包括：
采用所述10His-vWF73-SEAP蛋白制备偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板。
7.根据权利要求6所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述采用所述10His-vWF73-SEAP蛋白制备偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板，具体包括：
将所述10His-vWF73-SEAP蛋白用酶切反应缓冲液稀释，得到稀释蛋白液；
将所述稀释蛋白液加入微孔板中，4℃下静置24小时后，采用1×PBS后，真空密封，得到偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板。
8.根据权利要求7所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述所述10His-vWF73-SEAP蛋白和样本中的ADAMTS13金属蛋白酶进行酶切反应，产生第一酶切产物，具体包括：
向所述偶联10His-vWF73-SEAP蛋白的微孔板的小孔中加入酶切反应缓冲液，将样本加入所述小孔中，盖上封膜后反应1小时，产生第一酶切产物。
9.根据权利要求1所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述对所述第一酶切产物进行检测，具体包括：
采用洗脱缓冲液洗脱所述第一酶切产物中的杂质蛋白；
向洗脱杂质蛋白后的第一酶切产物中加入碱性磷酸酶显色底物，盖上封膜后反应30分钟；
向反应后的溶液中加入碱性磷酸酶显色终止液，得到样本的显色溶液；
在410nm波长下测定所述样本的显色溶液的吸光光度值。
10.根据权利要求9所述的金属蛋白酶ADAMTS13活性检测方法，其特征在于，所述对所述第一酶切产物进行检测还包括：
采用标准品建立标准曲线；
基于所述标准曲线和所述显色溶液的吸光光度值，确定所述样本中金属蛋白酶ADAMTS13活性。
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| CN117554605A (zh) * | 2024-01-12 | 2024-02-13 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 一种检测adamts13的质控品及其制备方法和应用 |
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