CN109182281B - 处理腺相关病毒的方法及试剂盒 - Google Patents

处理腺相关病毒的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109182281B
CN109182281B CN201811013195.8A CN201811013195A CN109182281B CN 109182281 B CN109182281 B CN 109182281B CN 201811013195 A CN201811013195 A CN 201811013195A CN 109182281 B CN109182281 B CN 109182281B
Authority
CN
China
Prior art keywords
adeno
associated virus
protein
receptor
tag
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811013195.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109182281A (zh
Inventor
丁卫
崔梦甜
程杉
卢雅彬
张晨光
牛静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Capital Medical University
Original Assignee
Capital Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Capital Medical University filed Critical Capital Medical University
Priority to CN201811013195.8A priority Critical patent/CN109182281B/zh
Publication of CN109182281A publication Critical patent/CN109182281A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109182281B publication Critical patent/CN109182281B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了处理腺相关病毒的方法及试剂盒。所述方法包括：将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物；以及将所述腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白‑结合蛋白复合物，其中，所述结合蛋白能够与所述标签蛋白特异性结合。由此，利用本发明处理腺相关病毒的方法可以达到腺相关病毒的分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，并且具有操作简便、准确性高、可重复性好、成本低等优点，适于规模化应用。

Description

处理腺相关病毒的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及处理腺相关病毒的方法及试剂盒。
背景技术
病毒载体在基因转移和基因治疗中有广泛的应用。其中腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)因具有无致病性、理化性质稳定、免疫原性弱、可定点整合到真核细胞染色体中从而介导外源基因的长期稳定表达等特点而越来越受到关注，在基因转移和基因治疗领域具有广阔的应用前景。
然而，目前腺相关病毒的纯化、鉴定及滴度测定方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
超速离心法是最为广泛使用的一种分离AAV的方法，根据杂质与AAV载体的形状、大小以及等密度点的不同，在高速离心作用下实现分离。但不足之处在于操作时间较长，完成2～3次超速离心，需要48～72h，AAV载体长期在黏性或者高渗透压(蔗糖或者CsCl)的溶液中及超速离心的强剪切力作用下，可能会导致载体粒子活力降低；要求操作人员的技术水平要高，若操作不当，则损失严重；在AAV的大规模纯化时，通常需要处理10～200L的细胞裂解液，反复的离心处理，操作烦琐，不利于载体的大规模纯化。
色谱柱层析法也是AAV规模化纯化的一种重要方法。当澄清的病毒液流经固定相时，固定相的功能区域与AAV衣壳蛋白或者所含有的基因组相互作用，通过改变流动相的组成或者pH值而实现分离。最常用的方法是肝素亲和层析分离纯化方法，该方法为AAV2最为普遍使用的纯化方法。但是该方法很难用于其他血清型载体。当溶液的pH大于AAV的等电点时，也可以采用阴离子色谱进行分离，如Poros HQ、Poros PI、Source 15Q、Q-Sepharose、HiTrap Q等用于纯化AAV1、2、4、5、6、8。但不足之处在于不同血清型的病毒载体理化性质有所差异，因此需要根据不同血清型载体理化特征建立对应的纯化工艺。由此可见，这两大类常用方法均有着其一定的缺陷，限制了规模化的生产。
rAAV的滴度是影响基因治疗效果的重要因素。斑点杂交法是AAV滴度测定的传统经典方法，但该方法消耗时间长、定量精确性低、过程复杂、成本比较高、测定结果重现性差，差异可达10倍以上。采用PCR技术检测rAAV基因组序列，可以将测定灵敏度提高10倍，定量PCR技术的运用则又可提高10倍以上。相对于斑点杂交法的2天时间，大大增加了效率，且qPCR法精确度高、操作简单、成本低廉。但作为标准检测方法其重现性不甚理想，并且由于细胞裂解液及培养液中未知成分会抑制PCR反应的进行，大量的DNA和RNA严重干扰PCR测定；生产细胞中含有转基因序列的双链DNA含量要高出rAAV内部包装的单链DNA(目的DNA)1个数量级。如何排除以上干扰，是定量PCR技术能否应用于大规模生产过程质控的关键。
有鉴于此，发明人采用一种能够特异性结合腺相关病毒的蛋白—腺相关病毒受体，并在该腺相关病毒受体上连接标签蛋白，通过使标签蛋白与结合蛋白特异性结合，以便可以分离出腺相关病毒，得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白和结合蛋白复合物。对该复合物可以通过洗脱处理以分离腺相关病毒或者腺相关病毒-腺相关病毒受体复合物，达到纯化、鉴定等目的。同时，还可以对腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物进行滴度检测。由此，利用本发明处理腺相关病毒的方法可以达到分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，经纯化的腺相关病毒或者腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物得率及纯度高，可鉴定包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9在内的所有血清型野生及重组AAV，准确性高、操作简单、可重复性好、成本低，适于规模化应用。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种处理腺相关病毒的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；以及将所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物，其中，所述结合蛋白能够与所述标签蛋白特异性结合。
发明人采用一种能够特异性结合腺相关病毒的蛋白—腺相关病毒受体，并在该腺相关病毒受体上连接标签蛋白，通过使标签蛋白与结合蛋白特异性结合，得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白和结合蛋白复合物。由此，可以达到腺相关病毒的分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，并且具有操作简便、准确性高、可重复性好、成本低等优点，适于规模化应用。
根据本发明的实施例，上述处理腺相关病毒的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述标签蛋白选自Nano标签蛋白、SBP标签蛋白和/或Strep标签蛋白，优选SBP标签蛋白。
根据本发明的实施例，所述腺相关病毒受体具有至少3个结构域。
根据本发明的实施例，所述腺相关病毒选自腺相关病毒1、腺相关病毒2、腺相关病毒3、腺相关病毒5、腺相关病毒6、腺相关病毒7、腺相关病毒8和/或腺相关病毒9。
根据本发明的实施例，所述结合蛋白选自亲和素。
根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触，所述固相载体上连接有能够与所述标签蛋白特异性结合的结合蛋白，以便分离出腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，得到固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物；以及利用洗脱液对所述固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物进行洗脱处理，以便得到腺相关病毒或者是腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，所述固相载体选自磁珠或链霉亲合素琼脂糖凝胶。
根据本发明的实施例，所述固相载体选自磁珠，所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在50～70℃下孵育5～10分钟，所述洗脱液中含有0.5质量％的SDS，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒；或者所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在90～100℃下孵育5～10分钟，所述洗脱液中含有1质量％的SDS，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；或者所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在室温下孵育40～70分钟，所述洗脱液中含有8～12mM的生物素，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物。
根据本发明的实施例，基于1mg所述腺相关病毒受体，所述固相载体的添加量为5～20μL。
根据本发明的实施例，所述固相载体选自链霉亲合素琼脂糖凝胶，所述洗脱液中含有15～30mM Tris-HCl和0.5～2mM的NaCl，pH值为7.0～7.8，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒。
根据本发明的实施例，所述方法包括：将含有腺相关病毒的提取液加入预先包被有腺相关病毒受体的容器中，进行孵育处理，洗板；向所述容器中加入连接有标签蛋白的腺相关病毒受体，进行孵育处理，洗板；向所述容器中加入酶标记的结合蛋白，进行孵育处理，洗板；以及向所述容器中加入显色液，所述显色液与所述酶发生显色反应，对所得到的显色反应液进行光学检测。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种实施前面所述处理腺相关病毒的方法的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：连接有标签蛋白的腺相关病毒受体；以及结合蛋白，所述结合蛋白能够特异性结合所述标签蛋白。利用根据本发明实施例的试剂盒能够达到腺相关病毒的分离、纯化、鉴定和滴度检测等目的，且分离、纯化的得率及纯度高，鉴定及滴度检测的准确性高，操作简便、准确性高、可重复性好、成本低，适于规模化应用。
根据本发明的实施例，所述标签蛋白选自标签蛋白选自Nano标签蛋白、SBP标签蛋白和/或Strep标签蛋白，所述结合蛋白选自亲和素。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括下列至少之一：磁珠；链霉亲合素琼脂糖凝胶；第一洗脱液，含有1质量％SDS；第二洗脱液，含有0.5质量％SDS；第三洗脱液，含有8～12mM生物素；酶标记的结合蛋白；以及显色液。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的处理腺相关病毒的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的AAVR-SBP蛋白及AAVR蛋白的原核表达与纯化分析图，其中A：AAVR-SBP蛋白原核表达重组质粒图谱；B：AAVR和AAVR-SBP蛋白小量诱导与纯化电泳图，其中，实心黑色箭头指示AAVR蛋白；空心黑色箭头指示AAVR-SBP蛋白，M：marker，NCTL：未加入IPTG诱导组，LB：全菌液，P：菌液沉淀组分，S：菌液上清组分；C：点杂交的显色图；
图3显示了根据本发明一个实施例的SAV-AAVR-SBP磁珠法从小量病毒粗提物中纯化AAV病毒分析图，其中A：磁珠法获取小量纯化病毒及复合物流程图；B：qPCR测定磁珠法回收各组分的AAV颗粒数分析图；
图4显示了根据本发明一个实施例的AAVR-SAV预装柱层析法纯化AAV病毒分析图，其中A：AAVR-SAV预装柱层析法流程示意图；B：HPLC示意图，Pro(UV)为穿流液A260蛋白质曲线，Conc为穿流液中高盐洗脱液(NaCl 1M)所占的比例，白色箭头：AAVR-SBP蛋白上样于SAV层析柱中，直至紫外吸收曲线降至平稳，黑色箭头：上样病毒粗提物，其中未结合固相AAVR蛋白的杂蛋白被洗脱；
图5显示了根据本发明一个实施例的AAVR蛋白包被的ELISA试剂盒检测病毒滴度分析图，其中A：AAVR蛋白包被的ELISA试剂盒原理示意图；B：AAVR蛋白包被的ELISA检测AAV滴度标准曲线图；
图6显示了根据磁珠法发明的一个实施例的以SAV-AAVR-SBP磁珠法获得AAV-AAVR复合物的原理示意图和纯化电泳图，其中A：原理示意图，B：纯化电泳图，M：marker，白色箭头：VP2，VP3蛋白条带，黑色箭头：AAVR-SBP蛋白条带；以及
图7显示了根据磁珠法发明的一个实施例的miniAAVR蛋白原核表达质粒的图谱。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了处理腺相关病毒的方法及实施该方法的试剂盒，下面将分别对其进行详细描述。
处理腺相关病毒的方法
在本发明的一个方面，本发明提出了一种处理腺相关病毒的方法。根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：
S100腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触
在该步骤中，将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物。腺相关病毒(AAV)能够特异性结合腺相关病毒受体(AAVR)，形成复合物。
对AAVR的基因结构和表达产物的序列分析显示，其编码蛋白属于I型跨膜受体，为单次跨膜的免疫球蛋白样(immunoglobμLin-like，Ig-like)分子。其胞内区较短，N端胞外部分主要由5个PKD(polycystic kidney disease)结构域构成。含有串联PKD结构域的蛋白质家族成员数量庞大，多参与细胞基质成分或细胞间的相互作用，也偶可见于一些病毒的细胞受体或共同受体，如麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒和呼吸道肠道病毒等。体外分子结合实验证实，AAV与AAVR的结合有很强的亲和力；在体感染实验也表明，AAVR的过表达可极大地促进多种血清型rAAV感染。
为探究五个PKD结构域是否在AAV2的感染中发挥类似的促进作用，各个PKD结构域被依次串联或独立表达，以研究它们各自的生物学作用。研究结果发现AAVR胞外区5个串联的PKD结构域中，N末端的前3个结构域与病毒转导活性的关系较为密切，构成介导AAV2感染细胞的关键区域。在最近的报道中，进一步证明其中PKD2的N端肽段序列是对受体的病毒转导功能有决定性作用的必需序列。
根据本发明的实施例，腺相关病毒受体具有至少3个结构域。例如，具有PKD1结构域、PKD2结构域和PKD3结构域。根据本发明的另一实施例，腺相关病毒受体具有5个结构域。例如，具有PKD1结构域、PKD2结构域、PKD3结构域、PKD4结构域、PKD5结构域。由此，AAV与AAVR能够发生特异性结合，且两者之间的亲和力较强，从而使得腺相关病毒的分离、纯化、鉴定和滴度检测的效果较好。
根据本发明的实施例，腺相关病毒选自腺相关病毒1(AAV1)、腺相关病毒2(AAV2)、腺相关病毒3(AAV3)、腺相关病毒5(AAV5)、腺相关病毒6(AAV6)、腺相关病毒7(AAV7)、腺相关病毒8(AAV8)和/或腺相关病毒9(AAV9)。发明人发现，AAVR作为适用于多种血清型的AAV特异性受体，与腺相关病毒在体外的亲和常数可达到150nM，从而可以利用该特性对多种血清型的AAV进行分离、纯化、鉴定和滴度检测等。
S200标签蛋白与结合蛋白接触
在该步骤中，将腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物，其中，结合蛋白能够与标签蛋白特异性结合。
需要说明的是，本发明所采用的标签蛋白主要起到标签作用，便于结合蛋白识别并与其特异性结合，达到分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，对于标签蛋白和结合蛋白的种类不作严格限定，可以根据实际需要灵活选择。根据本发明的实施例，标签蛋白选自Nano标签蛋白、SBP标签蛋白和/或Strep标签蛋白。根据本发明的另一实施例，结合蛋白选自亲和素。
生物素-亲和素(biotin-avidin)系统是蛋白纯化的常用生物学配体。除了传统的生物素结合，一些特殊的结合标签具有其独特的特点。链霉抗生素结合肽(SBP，Streptavidin-binding Peptide)最早报道于2001年，在实际应用中通过突变分子进化进行标签优化所得到的片段由38个氨基酸组成，编码大小为4.3kDa的多肽片段，已经开始被用于重组蛋白质的鉴定和纯化。SBP的主要配体是亲和素，包括传统的II型链霉亲和素，SBP与亲和素的连接紧密(Kd≈2.5-4.9nM)。SBP肽链N端的HVV多肽序列与C端的HPQ序列可直接结合在链霉亲和素的生物素结合口袋上。SBP的中间序列(17-28)组成两个常见的α螺旋结构，将三个亮氨酸位点连接固定两个链霉亲和素单体。
除了SBP标签蛋白之外，还有两种具有相对较高亲和力的链霉亲和素结合标签蛋白。第一个是15个氨基酸的Nano-tag蛋白(Kd，4nM)。针对其与链霉亲和素相互作用的模式，该标签蛋白必须位于重组蛋白质的N端。此外，为了获得高亲和力需要以甲酰化的甲硫氨酸为蛋白序列的N-末端，重组蛋白只能由细菌产生。第二个标签蛋白是strep-tag III蛋白，它的原理同SBP标签相似。它有两个由接头分开的strep-tag II序列，可以与Strep-Tactin结合，这是一种具有较高strep-tag II结合亲和力的工程链霉亲和素。这个系统有一个缺点，即尽管使用脱硫生物素可将含strep标签的蛋白质从基质中洗脱下来，但柱子的结合容量随着使用而降低，这是因为脱硫生物素中存在生物素的污染。此外，为了更好地回收strep标签蛋白，需要使用生物素用于洗脱。由于Strep-Tactin以与野生型链霉亲和素类似的方式与生物素紧密结合，所以柱不能再生。并且，参见表1，SBP蛋白的解离常数适宜，可以通过简单的操作(例如利用洗脱液进行洗脱)即可与亲和素分开。若解离常数过大(如生物素)，其与亲和素之间的结合力较大，不易分开。因此，根据本发明的实施例，标签蛋白选自SBP标签蛋白。
表1亲和素结合蛋白类型
Figure BDA0001785540380000071
根据本发明的实施例，该方法包括：将腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触，固相载体上连接有能够与标签蛋白特异性结合的结合蛋白，以便分离出腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，得到固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物；以及利用洗脱液对固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物进行洗脱处理，以便得到腺相关病毒或者是腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，固相载体选自磁珠或链霉亲合素琼脂糖凝胶。
利用磁珠或链霉亲合素琼脂糖凝胶的固相载体分离出腺相关病毒，并对固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物进行洗脱处理，利用腺相关病毒与腺相关病毒受体之间的结合力和结合蛋白与标签蛋白之间的结合力大小不同的特点，达到分离、纯化腺相关病毒或者腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物的目的。通过分离、纯化出腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，有利于对腺相关病毒及腺相关病毒受体之间的作用关系进行深入研究。
根据本发明的实施例，固相载体选自磁珠，腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在50～70℃下孵育5～10分钟，洗脱液中含有0.5质量％的SDS，经过洗脱处理以便得到腺相关病毒；或者腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在90～100℃下孵育5～10分钟，洗脱液中含有1质量％的SDS，经过洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；或者腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在室温下孵育40～70分钟，洗脱液中含有8～12mM的生物素，洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物。
由于腺相关病毒与腺相关病毒受体之间的结合力和结合蛋白与标签蛋白之间的结合力大小不同，通过改变洗脱液的组成，以便获得不同的分离物。当洗脱液中含有0.5％SDS，腺相关病毒与腺相关病毒受体分离，得到腺相关病毒；当洗脱液中含有1％SDS或者8～12mM的生物素，标签蛋白和结合蛋白分离，得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物。
根据本发明的实施例，基于1mg腺相关病毒受体，固相载体的添加量为5～20μL。由此，以便腺相关病毒受体上的标签蛋白能够充分与固相载体上的结合蛋白结合，以提高分离、纯化效果，目标物得率及纯度较高。
根据本发明的实施例，固相载体选自链霉亲合素(SAV)琼脂糖凝胶，当洗脱液中含有15～30mM Tris-HCl和0.5～2mM的NaCl，pH值为7.0～7.8时，经过洗脱处理以便得到腺相关病毒。采用链霉亲合素琼脂糖凝胶预装柱对腺相关病毒进行分离、纯化，先上样连接有标签蛋白的AAVR，标签蛋白会结合到柱上，再上样含有AAV的溶液，AAV会与柱上的AAVR特异性结合，从而达到分离目的，然后利用上述洗脱液进行洗脱，从而使得AAV和AAVR分离，得到AAV。当洗脱液中含有8～12mM的生物素时，利用生物素与结合蛋白之间的结合力大于标签蛋白与结合蛋白之间的结合力，使得生物素取代标签蛋白，竞争性地结合到结合蛋白上，从而获得腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物。
根据本发明的实施例，该方法包括：将含有腺相关病毒的提取液加入预先包被有腺相关病毒受体的反应孔(酶标板)中，进行孵育处理，洗板；向反应孔中加入连接有标签蛋白的腺相关病毒受体，进行孵育处理，洗板；向反应孔中加入酶标记的结合蛋白，进行孵育处理，洗板；以及向反应孔中加入显色液，所述显色液与酶发生显色反应，对所得到的显色反应液进行光学检测。
AAV先与AAVR受体形成复合物，包被于酶标板上，从而达到由提取液中分离出AAV的目的。向反应孔中加入连接有标签蛋白的AAVR，其可以与AAV-AAVR复合物形成双抗体夹心结构，即AAVR-AAV-AAVR-标签蛋白复合物。再向反应孔中加入酶标记的结合蛋白，该结合蛋白可以与标签蛋白特异性结合，形成AAVR-AAV-AAVR-标签蛋白-结合蛋白-酶标记蛋白复合物。该酶标记蛋白可以与显色液中的显色物发生显色反应，对该反应进行光学检测，从而达到腺相关病毒的滴度定量检测目的。
试剂盒
在本发明的另一方面，本发明提出了一种实施前面所述处理腺相关病毒的方法的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：连接有标签蛋白的腺相关病毒受体；以及结合蛋白，结合蛋白能够特异性结合标签蛋白。腺相关病毒受体能够特异性结合腺相关病毒，在该腺相关病毒受体上连接标签蛋白，通过使标签蛋白与结合蛋白特异性结合，得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物。由此，可以达到腺相关病毒的分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，且操作简便、准确性高、可重复性好、成本低，适于规模化应用。
根据本发明的实施例，标签蛋白选自Nano标签蛋白、SBP标签蛋白和/或Strep标签蛋白，结合蛋白选自亲和素。由此，该标签蛋白能够与亲和素发生特异性结合，从而获得腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物。
根据本发明的实施例，试剂盒进一步包括下列至少之一：磁珠；链霉亲合素琼脂糖凝胶；第一洗脱液，含有1质量％SDS；第二洗脱液，含有0.5质量％SDS；第三洗脱液，含有8～12mM生物素；酶标记的结合蛋白；以及显色液。磁珠或链霉亲合素琼脂糖凝胶作为固相载体，能够达到分离、纯化腺相关病毒的目的。酶标记的结合蛋白和显色液的提供能够达到腺相关病毒的滴度定量检测的目的。利用含有生物素或者1质量％SDS的洗脱液进行洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，利用含有0.5质量％SDS的洗脱液进行洗脱处理以便得到腺相关病毒。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对处理腺相关病毒的方法所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1.通过SAV-AAVR-SBP磁珠法从小量病毒粗提物中获得纯化AAV病毒颗粒
1.1AAVR来源AAVR蛋白的表达及纯化(图2)
本发明首先生产及纯化AAVR蛋白序列中PKD1-5结构域的蛋白(简称AAVR蛋白)，并在AAVR蛋白C端带有His标签及与生物素亲和的SBP标签。
1)以PET-28a为载体构建PET-28a-AAVR及PET-28a-AAVR-SBP融合质粒。
2)以100μL BL21感受态细胞为宿主菌分别转化两种融合质粒，37℃培养14h。
3)挑取单克隆菌落，接种于5ml卡那霉素抗性液体LB，37℃220rpm摇菌8h后，以1：1000比例接种于1L卡那霉素抗性液体LB培养基中，相同条件培养至菌液OD值为0.4。加入终浓度1mM的IPTG诱导10h。
4)菌液4℃4200rpm离心30min，以50ml MCAC0重悬菌体沉淀，冰上超声破菌2h，期间每半小时加入终浓度10μM的PMSF，4℃20000rpm离心30min去除菌体沉淀。
5)镍柱重力柱初步纯化诱导蛋白：4ml镍柱填料装柱，5倍柱体积MCAM0平衡填料。上清菌液过柱并收集穿流液再次过柱。以5倍柱体积MCAC0洗涤未结合蛋白，依次以2倍柱体积MCAC20、MCAC40、MCAC100、MACAC200、MCAC500洗脱液过柱洗脱蛋白并以5ml每管收集过柱后的洗脱液。
6)分子筛柱层析进一步纯化诱导蛋白：步骤5)中的回收蛋白经考染鉴定后，使用10k 40ml超滤管浓缩定容至5ml，分子筛层析柱SP Sepharose XL以平衡缓冲液5倍柱体积平衡，浓缩蛋白流经层析柱，监测紫外吸收值，出峰后开始收集流穿液，再用平衡缓冲液冲洗层析柱直至电导和紫外吸收基线稳定，停止收集样品，最后用20％乙醇溶液处理层析柱。
7)以8％SDS-PAGE胶垂直电泳及考马斯亮蓝染色法鉴定各个回收组分蛋白大小，表明通过原核表达系统可以纯化出AAVR-SBP蛋白及AAVR蛋白。将大小为60kDa左右蛋白对应组分以上述超滤管离心浓缩至3ml，分装储存于-20℃。
1.2病毒粗提物的制备
1)三质粒共转染包装AAV2，收集三质粒共转染72小时后的HEK293T细胞，以16℃10000rpm离心10min收集细胞沉淀去除培养液。
2)细胞沉淀以10mM PH7.9Tris溶液重悬于玻璃试管内并定容至4ml，干冰-乙醇混合物冷冻及37℃水浴间反复循环4次。超声破碎细胞1min，超声2s暂停2s，循环5次。超声后细胞液加入终浓度1％脱氧胆酸钠溶液及DNA酶，37℃水浴消化1h，加入终浓度1％的胰酶-EDTA溶液，37℃水浴消化30min，室温1000rpm离心3min，去除沉淀。将上清经0.45μn滤器过滤，过滤液则为AAV2病毒粗提物混合液。
1.3通过SAV-AAVR-SBP磁珠法从小量病毒粗提物中获得纯化AAV(图3)
1)将SAV标记磁珠震荡重悬，移取100μL磁珠。磁性分离，用移液器吸去上清液，从磁性分离器上取下离心管。
2)按照1：1体积比加入平衡Buffer到离心管中，buffer用量至少1ml。盖上离心管盖，充分振荡重悬磁珠。磁性分离，移去上清液。重复步骤2次，共洗涤3次。
3)加入1mL用平衡buffer稀释的AAVR-SBP蛋白及AAV2病毒粗提物混合液，使磁珠浓度为1mg/mL，充分振荡重悬磁珠。将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合60min，使得蛋白与AAV2结合形成复合物，蛋白的SBP标签同时与SAV磁珠结合。
4)磁性分离，将上清液转移至新的离心管。按上述的方法洗涤磁珠5次。
5)加入平衡Buffer，重悬磁珠。
6)加入含有0.01％SDS的平衡液buffer，58℃金属浴震动孵育5min，以此使AAV2颗粒与AAVR-SBP蛋白分离，而AAVR-SBP不与SAV磁珠分离。
7)磁性分离，将上清液转移至新的离心管。则上清液为与AAVR-SBP分离的游离AAV2病毒颗粒。
利用点杂交验证AAVR-SBP蛋白生物学作用。具体地，将AAV2病毒及PBS点样于NC膜上，以AAVR-SBP纯化蛋白为一抗，Anti-AAVR为二抗，以HRP-IgG抗体为酶联抗体进行显色。结果如图2C所示，可见原核制备AAVR-SBP可特异性结合AAV2病毒颗粒。
1.4纯化多种血清型野生及重组AAV
由于AAVR为适用于多种血清型的AAV特异受体，通过SAV-AAVR-SBP磁珠法可以从多种血清型病毒小量粗提物中获得纯化多种AAV血清型病毒颗粒：AAV1、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
图3B中，穿流液FLOW可见未结合AAV2颗粒，各个洗涤组分Wash1-3无大量洗脱颗粒。60℃金属浴洗脱AAV2病毒颗粒，可见2.1E+08病毒颗粒洗脱。Biotin洗脱AAV2-AAVR蛋白复合物可见4.8E+08的病毒洗脱采用qPCR法测得实施例1获得的AAV2滴度为2.1E+08v.g.。
实施例2
2.通过AAVR-SAV预装柱层析法从大量病毒粗提物中获得纯化AAV病毒颗粒(图4)
图4A给出了反应流程示意图，以SAV为固向载体，负载AAVR-SBP蛋白。固定PKD蛋白后，使含有AAV颗粒的粗提物穿流液流经预装柱，AAV结合于AAVR-SBP蛋白上，经高盐溶液洗脱，得到AAV病毒。
2.1制备AAVR-SAV预装柱
使用5ml链霉亲和素琼脂糖凝胶(SAV)预装柱(美国ThermoFisher公司)，上样缓冲液为20mM Tris-HCl，PH＝7.4，上样流速为1ml/min。上样缓冲液平衡5倍柱体积，1mg/ml的AAVR-SBP蛋白液(实施例1的步骤1.1获得)共5ml上样，收集穿流液2次上样。而后用上样缓冲液平衡至电导和紫外基线回归稳定时完成预装柱制备。
2.2 AAV2病毒纯化
AAV2病毒粗提物(实施例1的步骤1.2获得)用上样缓冲液定容至不小于5ml且不大于25ml。上样并回收穿流液二次上样。以平衡液平衡至电导和紫外基线回归稳定。以洗脱液洗脱，病毒洗脱液为20mM Tris-HCl，1M NaCl，PH＝7.4，洗脱流速为1ml/min。紫外吸收线起峰后开始收集穿流液，直至电导和紫外基线回归稳定时结束收样，得到AAV病毒。
2.3 AAVR-SAV预装柱的储存
待电导和紫外基线回归稳定时以5倍柱体积平衡液洗脱预装柱，而后以5倍柱体积20％乙醇水溶液洗脱预装柱。于4℃储存。
2.4大规模纯化多种血清型野生及重组AAV
由于AAVR为适用于多种血清型的AAV特异受体，通过AAVR-SAV预装柱层析法从大量病毒粗提物中获得纯化多种AAV血清型病毒颗粒：AAV1、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
实施例3
3.通过AAVR蛋白包被的ELISA试剂盒对纯化AAV病毒滴度进行鉴定(图5)
图5A给出了试剂盒原理示意图，以AAVR蛋白包被，作为捕获抗体，加入梯度稀释AAV病毒，以AAVR-SBP蛋白为初级抗体。SAV-HRP为次级抗体，以ABTS为HRP反应底物，酶标仪405nm吸收光测定各样品显色程度。
3.1 AAVR蛋白的包被
将AAVR蛋白用包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠buffer,pH 9.6)稀释至1mg/ml。酶标板各孔加入100μL稀释AAVR蛋白，置于4℃过夜孵育。保证环境湿度，过夜后完成包被，弃去孔中液体。
3.2酶标板封闭
5％小牛血清置37℃封闭40min，封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后吸干孔内反应液，用洗涤液PBST，pH 7.4满孔洗涤，放置2min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤3次。
3.3加入纯化回收的病毒样品
将实施例1的步骤1.2获得的病毒粗提物及其用稀释液(PBS，PH＝7.4)稀释10倍、稀释100倍、稀释1000倍四个浓度的病毒纯化样品加入酶标反应孔中，每样品重复1次。每孔100μL，置于37℃，60min。用洗涤液如步骤2中洗涤3遍，每遍3min。
3.4加入一级抗体
将AAVR-SBP蛋白(实施例1的步骤1.1获得)以稀释液稀释至10μg/ml，每孔加入100μL，37℃孵育60min。如步骤3.2中洗涤3遍，每遍3min。
3.5加入酶标二级抗体。
稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素至10μg/ml，每孔加入100μL，37℃，孵育60min。如步骤3.2中洗涤3遍，每遍3min。
3.6加入底物液。
以ABTs作为显色液。每孔加入100μL，37℃，孵育60min。如步骤3.2中洗涤3遍，每遍3min。加入终止液显色，于20min内测定实验结果。
3.7结果判断
以空白孔调零，以492nm波长检测样品孔读数。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)。
3.8多种血清型野生及重组AAV的滴度鉴定
由于AAVR为适用于多种血清型的AAV特异受体，通过AAVR蛋白包被的ELISA试剂盒对纯化的多种血清型病毒滴度进行鉴定，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
通过AAVR蛋白包被的ELISA检测绘制出了AAV2滴度标准曲线。病毒滴度在1.00E+05以上的可以通过该标准曲线计算出AAV2滴度。
实施例4
4.通过SAV-AAVR-SBP&SAV磁珠法从小量病毒粗提物中获得AAVR-AAV病毒颗粒复合物(图6)
4.1 AAVR-SBP-AAV病毒颗粒复合物的制备。
1)将SAV标记磁珠震荡重悬，移取100μL磁珠。磁性分离，用移液器吸去上清液，从磁性分离器上取下离心管。
2)按照1：1体积比加入平衡Buffer到离心管中，buffer用量至少1ml。盖上离心管盖，充分振荡重悬磁珠。磁性分离，移去上清液。重复步骤2次，共洗涤3次。
3)加入1mL用平衡buffer稀释的AAVR-SBP蛋白及AAV2病毒粗提物混合液，使磁珠浓度为1mg/mL，充分振荡重悬磁珠。将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合60min，使得蛋白与AAV2结合形成复合物，蛋白的SBP标签同时与SAV磁珠结合。
4)磁性分离，将上清液转移至新的离心管。按上述的方法洗涤磁珠5次。
5)加入平衡Buffer，重悬磁珠。
6)加入含有10mM生物素的平衡buffer，重悬磁珠。将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min。
7)磁性分离，将上清液转移至新的离心管。则上清液为SBP-AAVR-AAV病毒颗粒的复合物。
4.2多种血清型野生及重组AAV的AAVR-SBP-AAV病毒颗粒复合物的分离纯化。
由于AAVR为适用于多种血清型的AAV特异受体，通过SAV-AAVR-SBP磁珠法从小量病毒粗提物中获得AAVR-AAV病毒颗粒复合物，如AAVR-AAV1、AAVR-AAV3、AAVR-AAV5、AAVR-AAV6、AAVR-AAV7、AAVR-AAV8和AAVR-AAV9。通过AAVR mutation-SBP蛋白快速验证不同血清型AAV病毒颗粒与AAVR突变体的结合能力。
结果：通过考马斯亮蓝染色表明通过biotin洗脱可获得大量纯化的SBP-AAVR-AAV复合物。
实施例5
5.通过miniAAVR-SBP&SAV磁珠法从小量病毒粗提物中获得纯化AAV病毒颗粒(图7)
5.1生产并纯化AAVR蛋白序列中PKD1-3结构域的蛋白(简称miniAAVR蛋白)
方法及流程同实施例1.1。
5.2通过SAV-miniAAVR-SBP磁珠法从小量病毒粗提物中获得纯化多种血清型病毒颗粒，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
方法及流程同实施例1。
结果：miniAAVR同样具有与AAV结合的能力。
实施例6
6.通过miniAAVR-SAV预装柱层析法从大量病毒粗提物中获得纯化多种血清型病毒颗粒，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9(图7)。
方法及流程同实施例2。
结果：miniAAVR同样具有与AAV结合的能力。
实施例7
7.通过miniAAVR蛋白包被的ELISA试剂盒对纯化的多种血清型病毒滴度进行鉴定，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9(图7)。
方法及流程同实施例3。
结果：miniAAVR同样具有与AAV结合的能力。
实施例8
8.AAVR-SAV(Nano-PKD1-5)预装柱层析法从大量病毒粗提物中获得纯化AAV病毒颗粒并对其滴度进行鉴定
将实施例2纯化及鉴定系统中的SBP标签更换为功能相似的Nano标签，通过的AAVR-SAV(Nano-PKD1-5)预装柱层析法从大量病毒粗提物中获得纯化多种AAV血清型病毒颗粒，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。通过实施例3的AAVR蛋白包被的ELISA试剂盒对纯化的多种血清型病毒滴度进行鉴定(以Nano-AAVR蛋白为一级抗体)，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
实施例9
9.SAV-AAVR-Strep磁珠法从小量病毒粗提物中获得纯化AAV病毒颗粒并对其滴度进行鉴定
将实施例1纯化及鉴定系统中的SBP标签更换为功能相似的Strep标签，通过SAV-AAVR-Strep磁珠法从小量病毒粗提物中获得纯化多种AAV血清型病毒颗粒，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。通过实施例3的AAVR蛋白包被的ELISA试剂盒对纯化的多种血清型病毒滴度进行鉴定(以Strep-AAVR蛋白为一级抗体)，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种处理腺相关病毒的方法，其特征在于，包括：
将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；
将所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触，所述固相载体上连接有能够与所述标签蛋白特异性结合的结合蛋白，以便分离出腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，得到固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物；以及
利用洗脱液对所述固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物进行洗脱处理，以便得到腺相关病毒或者是腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；
所述腺相关病毒受体属于I型跨膜受体，为单次跨膜的免疫球蛋白样分子；
所述标签蛋白选自SBP标签蛋白，所述结合蛋白选自亲和素；
所述固相载体选自磁珠；
所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在50～70℃下孵育5～10分钟，所述洗脱液中含有15～30mM Tris-HCl和0.5～2mM的NaCl，pH值为7.0～7.8；或者所述洗脱液中含有0.5质量％的SDS，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒；或者
所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在90～100℃下孵育5～10分钟，所述洗脱液中含有1质量％的SDS，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；或者
所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在室温下孵育40～70分钟，所述洗脱液中含有8～12mM的生物素，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺相关病毒受体具有至少3个结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺相关病毒选自腺相关病毒1、腺相关病毒2、腺相关病毒3、腺相关病毒5、腺相关病毒6、腺相关病毒7、腺相关病毒8和/或腺相关病毒9。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体选自磁珠或链霉亲合素琼脂糖凝胶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于1mg所述腺相关病毒受体，所述固相载体的添加量为5～20μL；
所述固相载体选自链霉亲合素琼脂糖凝胶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：
将含有腺相关病毒的提取液加入预先包被有腺相关病毒受体的容器中，进行孵育处理，洗板；
向所述容器中加入连接有标签蛋白的腺相关病毒受体，进行孵育处理，洗板；
向所述容器中加入酶标记的结合蛋白，进行孵育处理，洗板；以及
向所述容器中加入显色液，所述显色液与所述酶发生显色反应，对所得到的显色反应液进行光学检测。
7.一种实施权利要求1～6任一项所述处理腺相关病毒的方法的试剂盒，其特征在于，包括：
连接有标签蛋白的腺相关病毒受体，所述腺相关病毒受体属于I型跨膜受体，为单次跨膜的免疫球蛋白样分子；
结合蛋白，所述结合蛋白能够特异性结合所述标签蛋白，所述标签蛋白选自SBP标签蛋白，所述结合蛋白选自亲和素；
所述试剂盒进一步包括下列至少之一：
磁珠；
链霉亲合素琼脂糖凝胶；
第一洗脱液，含有1质量％SDS；
第二洗脱液，含有0.5质量％SDS；
第三洗脱液，含有8～12mM生物素；
酶标记的结合蛋白；以及
显色液。
CN201811013195.8A 2018-08-31 2018-08-31 处理腺相关病毒的方法及试剂盒 Active CN109182281B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811013195.8A CN109182281B (zh) 2018-08-31 2018-08-31 处理腺相关病毒的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811013195.8A CN109182281B (zh) 2018-08-31 2018-08-31 处理腺相关病毒的方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109182281A CN109182281A (zh) 2019-01-11
CN109182281B true CN109182281B (zh) 2022-08-02

Family

ID=64917463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811013195.8A Active CN109182281B (zh) 2018-08-31 2018-08-31 处理腺相关病毒的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109182281B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111273006A (zh) * 2020-03-10 2020-06-12 四川沃文特生物技术有限公司 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 S蛋白检测方法
CN113430232A (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 四川大学 一种腺相关病毒中和抗体含量的检测方法及细胞系的构建方法
CN113552349B (zh) * 2021-07-30 2022-07-19 上海勉亦生物科技有限公司 Aav蛋白外壳的检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6593123B1 (en) * 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
US7238478B2 (en) * 2003-11-13 2007-07-03 Stratagene California Compositions and methods for protein isolation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Generic Method for Fast and Sensitive Detection of Adeno-Associated Viruses Using Modified AAV Receptor Recombinant Proteins;Mengtian Cui等;《Molecules》;20191103;第24卷(第3973期);1-13 *
Prokaryotic expression of AAVR fusion proteins and the application for AAV preparation and characterization;Mengtian CUI 等;《中国生物化学与分子生物学会第十二届全国会员代表大会暨2018年全国学术会议摘要集中国生物化学与分子生物学会会议论文集》;20181025 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109182281A (zh) 2019-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230416695A1 (en) Scalable purification method for aav9
CN109182281B (zh) 处理腺相关病毒的方法及试剂盒
WO2017100676A1 (en) Scalable purification method for aav8
US8021889B2 (en) Chromatographic material for the absorption of proteins at physiological ionic strength
WO2017100674A1 (en) Scalable purification method for aav1
KR890000985B1 (ko) 이뮤노 글로부린 g의 정제
WO2017100704A1 (en) Scalable purification method for aavrh10
CA2455499A1 (en) Method for purification of viral vectors having proteins which bind sialic acid
Wenger et al. An automated microscale chromatographic purification of virus‐like particles as a strategy for process development
CN111808828B (zh) 腺相关病毒的分离纯化方法
CN114196638B (zh) 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法
US20130224730A1 (en) Peptide ligands
AU2010244523B2 (en) Method for purification of target polypeptides
CN113564173B (zh) 一种重组腺相关病毒rAAV核酸适体及其应用
CN115976154A (zh) 一种金属蛋白酶adamts13活性检测方法
Xie et al. Multi-attribute analysis of adeno-associated virus by size exclusion chromatography with fluorescence and triple-wavelength UV detection
Chong et al. A preparative hydrophobic interaction chromatography for purification of recombinant nucleocapsid protein of Nipah virus from clarified Escherichia coli homogenate
JP2022547159A (ja) 生物学的調製物のクロマチン含有量を低減する組成物及び方法
CN117229393B (zh) 特异性结合腺相关病毒5的抗体及其应用
JP2023079850A (ja) アデノ随伴ウイルスの分析方法
WO2023140197A1 (ja) 改変された組換えアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）結合性タンパク質及び感染能に基づくａａｖの分析方法
US20240255475A1 (en) METHOD FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF ADENO-ASSOCIATED VIRUSES (AAVs) USING AN AFFINITY MATRIX
JP2023137162A (ja) アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質の安定化法
CN118339303A (zh) 用于使用亲和基质检测和定量腺相关病毒（aav）的方法
Huang Rapid Isolation and Quantification of Exosome and Lentivirus by Hydrophobic Interaction Chromatography on a Polyester Capillary-Channeled Polymer Fiber Stationary Phase

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant