CN114196638B - 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法 - Google Patents
一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114196638B CN114196638B CN202111621847.8A CN202111621847A CN114196638B CN 114196638 B CN114196638 B CN 114196638B CN 202111621847 A CN202111621847 A CN 202111621847A CN 114196638 B CN114196638 B CN 114196638B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- adeno
- associated virus
- aav
- microbeads
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 239000011325 microbead Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 22
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid group Chemical group C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N Ala-Phe-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 2
- ASQKVGRCKOFKIU-KZVJFYERSA-N Arg-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ASQKVGRCKOFKIU-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- ZQFRDAZBTSFGGW-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZQFRDAZBTSFGGW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N Gln-Pro-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- TTYVAUJGNMVTRN-GJZGRUSLSA-N Gly-Met-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)CN TTYVAUJGNMVTRN-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 2
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UHRNIXJAGGLKHP-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N Thr-Gly-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 2
- OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N Thr-Val-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108010076441 Ala-His-His Proteins 0.000 description 1
- ATAKEVCGTRZKLI-UWJYBYFXSA-N Ala-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 ATAKEVCGTRZKLI-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- QRIYOHQJRDHFKF-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 QRIYOHQJRDHFKF-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- ZCUFMRIQCPNOHZ-NRPADANISA-N Ala-Val-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N ZCUFMRIQCPNOHZ-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N Ala-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- YHQGEARSFILVHL-HJGDQZAQSA-N Arg-Gln-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O YHQGEARSFILVHL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- PRLPSDIHSRITSF-UNQGMJICSA-N Arg-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PRLPSDIHSRITSF-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IZSMEUDYADKZTJ-KJEVXHAQSA-N Arg-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IZSMEUDYADKZTJ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Lys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NCFJQJRLQJEECD-NHCYSSNCSA-N Asn-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NCFJQJRLQJEECD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O NCXTYSVDWLAQGZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- CGYKCTPUGXFPMG-IHPCNDPISA-N Asn-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O CGYKCTPUGXFPMG-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- VEYGCDYMOXHJLS-GVXVVHGQSA-N Gln-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VEYGCDYMOXHJLS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N Glu-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- DXVOKNVIKORTHQ-GUBZILKMSA-N Glu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DXVOKNVIKORTHQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FHQRLHFYVZAQHU-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FHQRLHFYVZAQHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N Gly-Trp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)CN UMRIXLHPZZIOML-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N Gly-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN YGHSQRJSHKYUJY-SCZZXKLOSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- VXZZUXWAOMWWJH-QTKMDUPCSA-N His-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VXZZUXWAOMWWJH-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- BZUOLKFQVVBTJY-SLBDDTMCSA-N Ile-Trp-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N BZUOLKFQVVBTJY-SLBDDTMCSA-N 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RTIRBWJPYJYTLO-MELADBBJSA-N Leu-Lys-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N RTIRBWJPYJYTLO-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- MSFITIBEMPWCBD-ULQDDVLXSA-N Leu-Val-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MSFITIBEMPWCBD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N Lys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- FRWZTWWOORIIBA-FXQIFTODSA-N Met-Asn-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N FRWZTWWOORIIBA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001364096 Pachycephalidae Species 0.000 description 1
- OLZVAVSJEUAOHI-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O OLZVAVSJEUAOHI-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- SKICPQLTOXGWGO-GARJFASQSA-N Pro-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SKICPQLTOXGWGO-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- WVXQQUWOKUZIEG-VEVYYDQMSA-N Pro-Thr-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WVXQQUWOKUZIEG-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ICHZYBVODUVUKN-SRVKXCTJSA-N Ser-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ICHZYBVODUVUKN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BIWBTRRBHIEVAH-IHPCNDPISA-N Ser-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O BIWBTRRBHIEVAH-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- DKDHTRVDOUZZTP-IFFSRLJSSA-N Thr-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DKDHTRVDOUZZTP-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- SLOYNOMYOAOUCX-BVSLBCMMSA-N Trp-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SLOYNOMYOAOUCX-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XFEMMSGONWQACR-KJEVXHAQSA-N Tyr-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O XFEMMSGONWQACR-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- MYLNLEIZWHVENT-VKOGCVSHSA-N Val-Ile-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N MYLNLEIZWHVENT-VKOGCVSHSA-N 0.000 description 1
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N Val-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)C(C)C NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N Val-Pro-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C(C)C)N)O MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N Val-Ser-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N Val-Ser-Pro Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 108010090333 leucyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012418 validation experiment Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种腺相关病毒纯化试剂盒，包括裂解‑平衡缓冲液、第一抗体、锚定微珠以及洗脱液；所述第一抗体为纳米抗体，具有重链可变区和Fc区，所述重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示；所述抗体偶联微珠为偶联了第二抗体的微珠，所述第二抗体是针对所述Fc区的抗体。本发明筛选和制备了针对AAV的高特异性和亲和力的抗体，并且该抗体具有特定的pH活性范围，使其容易用于对AAV的分离。利用该AAV抗体的特点制备的AAV纯化试剂盒可通过离心分离或磁力分离的方式快速纯化腺相关病毒，并提高了分离得到的AAV的感染滴度。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更特别地，涉及一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法。
背景技术
在生物和医学研究和产业化中，转基因技术是重要的研究内容和使用手段，一直处在快速发展中，近年来迅速发展起来的载体病毒技术即是被广泛使用的转基因技术。各种载体病毒的应用已经形成了很大的市场，包括病毒的克隆、包装、制备、纯化等都有市售产品和服务。腺相关病毒（AAV）是常用的载体病毒，已经广泛应用于疫苗、基因治疗以及科研等方面。由于生产和研究的需要，目前，对腺相关病毒的需求量也越来越高。
目前腺相关病毒的制备和纯化技术相对滞后，由于该病毒包装后仍留在包装细胞里，其纯化过程相对复杂。实验室纯化腺相关病毒的方法主要还是采用超速梯度离心技术，此法首先需要一台超速离心机，而且操作过程繁琐、费时费力。我们与旧金山加州大学Jennifer Whistler博士的实验室合作制备腺相关病毒产品，先后使用了Cell Biolabs公司（美国）和Biominga公司（美国）的腺相关病毒纯化试剂盒，但因其回收率太低而失败。Cell Biolabs和Biomiga的产品类似，均采用树脂吸附法。除此之外，VIRAPUR公司（美国）提供基于过滤膜吸附法的腺相关病毒纯化试剂盒，由于过滤膜吸附法对腺相关病毒吸附的特异性不高，吸附容量有限，纯化效果不是特别好，因此这种产品没有得到广泛使用。已有一些研究者开发了特异性抗体搭载在固体基质上，以提高对AAV的吸附特异性。然而，特异性抗体的使用带来了新的问题，例如在洗脱时难以把AAV颗粒洗下来，造成回收率低，在洗脱过程中还有可能造成抗体与AAV颗粒一起洗脱，影响AAV颗粒纯度。
因此，需要一种新的腺相关病毒纯化方法和纯化试剂产品。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种腺相关病毒纯化试剂盒，包括裂解-平衡缓冲液、第一抗体、锚定微珠以及洗脱液；
所述第一抗体为纳米抗体，具有重链可变区和Fc区，所述重链可变区序列如SEQID NO:1所示；
所述抗体偶联微珠为偶联了第二抗体的微珠，所述第二抗体是针对所述Fc区的抗体。
本发明通过研发了针对AAV的第一抗体，以及针对第一抗体的第二抗体，并将第二抗体与微珠偶联，从而使得能够快速锚定和洗脱AAV。本发明的试剂盒通过离心或磁力的方法进行AAV纯化，大大加快了生产和科学实验中的纯化速度，同时，本发明的试剂盒能够提供更高感染滴度的AAV溶液。
在一个具体实施方案中，所述裂解-平衡缓冲液为pH 8-8.5的tris缓冲液，含有浓度为0.05%-0.1%的吐温20以及浓度为0.2%-0.3%的NP40。第一抗体与AAV的特异性亲和力在pH 8-8.5时很高，有利于将AAV锚定在例如微珠等固体基质上。
在一个具体实施方案中，所述洗脱液为pH 4-5的柠檬酸缓冲液，含有500-100 mM的氯化钠。4-5的pH以及50-100 mM的氯化钠浓度下有利于从第一抗体洗脱AAV，同时保持第一抗体仍然锚定在微珠上。
在一个具体实施方案中，所述Fc区是小鼠Fc区。
在一个具体实施方案中，所述第二抗体为纳米抗体，重链可变区序列如SEQ IDNO:5所示。
在一个具体实施方案中，所述抗体偶联微珠为琼脂糖微珠或磁珠。
本发明还公开了一种纯化腺相关病毒的方法，包括使用上述腺相关病毒纯化试剂盒纯化腺相关病毒的步骤。
在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
S1：收集含有腺相关病毒的细胞，使用所述裂解平衡缓冲液破碎所述细胞，离心获得含有腺相关病毒的上清液；
S2：向所述上清液中加入所述第一抗体，混匀，得到第一抗体-上清液；
S3：向所述第一抗体-上清液中加入所述抗体偶联微珠，混匀；
S4：从所述第一抗体-上清液中分离所述抗体偶联微珠；
S5：用所述洗脱液从所述抗体偶联微珠洗脱得到腺相关病毒溶液。
优选地，所述抗体偶联微珠对于所述第一抗体的过量。抗体偶联微珠对第一抗体过量才能将所有与AAV结合的第一抗体固定在微珠上，以防止AAV的损失。
本发明筛选和制备了针对AAV的高特异性和亲和力的抗体，并且该抗体具有特定的pH活性范围，使其容易用于对AAV的分离。利用该AAV抗体的特点制备的AAV纯化试剂盒可通过离心分离（使用琼脂糖微珠）或磁力分离（使用磁珠）的方式快速纯化腺相关病毒，并提高了分离得到的AAV的感染滴度。
附图说明
图1为ELISA法检测纳米抗体AT1-3对AAV1-8的特异结合能力的统计图。
图2为纳米抗体AT2对AAV的结合能力随环境pH值的变化曲线。
图3为第二抗体对小鼠Fc的结合能力随环境pH值的变化曲线。
图4为破碎上清、分离上清和纯化的AAV溶液中的相对蛋白含量的统计图。
图5为本发明试剂盒与市售试剂盒纯化得到的AAV溶液的基因拷贝数滴度的比较。
图6为本发明试剂盒与市售试剂盒纯化得到的AAV溶液的感染滴度的比较。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1. 针对AAV的单克隆抗体的筛选
将AAV1-13的VP1、VP2和VP3的氨基酸序列进行比对，提取保守序列，合成序列克隆到酵母菌中表达得到AAV外壳蛋白免疫原，将免疫原用来免疫羊驼，取羊驼脾脏进行单克隆抗体筛选。最终，我们筛选到3株对血清型AAV1-8都具有良好的特异性和亲和力的单克隆抗体（图1）。我们在研究中意外地发现，使用AT2株单克隆抗体对pH特别敏感，在合适的缓冲液中，当pH为7.5-9时，该单克隆抗体对AAV外壳具有非常高的结合力，但是，当pH降低至6以下时该抗体对AAV外壳几乎没有结合力（图2）。通过测序，获得AT2的重链可变区（VHH）序列如SEQ ID NO:1所示，其中，CDR1-3序列分别如SEQ ID NO:2-4所示。我们将该VHH与小鼠Fc片段融合表达，得到具有小鼠Fc片段和上述AT2 VHH的新抗体，即为第一抗体。检测第一抗体的结合特性，结果显示其与AT2 VHH的特性一致，对AAV1-8均具有非常高的特异结合能力，并且在该特异结合能力在pH 7.5-9的范围内很高，但是当pH降低至6及以下时，抗体对AAV外壳几乎没有结合力。
使用小鼠Fc片段作为免疫原免疫羊驼，制备针对小鼠Fc的单克隆抗体，得到第二抗体AF，VHH序列如SEQ ID NO:5所示，其中，CDR1-3序列分别如SEQ ID NO:6-8所示。检测AF对第一抗体的亲和力，结果如图3所示，当pH为4-9时，第二抗体AF对第一抗体均具有非常好的亲和力。
基于上述两种抗体的特性，我们开发了一种新的AAV纯化试剂盒。
2. AAV纯化试剂盒的组成
本实施例的AAV纯化试剂盒包括以下试剂：裂解-平衡缓冲液、第一抗体、抗体偶联微珠以及洗脱液。
其中，抗体偶联微珠为第二抗体偶联的磁珠或琼脂糖微珠；
裂解-平衡缓冲液为pH 8-8.5的tris缓冲液，其中含有浓度为0.05%-0.1%的吐温20以及浓度为0.2%-0.3%的NP40；
洗脱液为pH 4-5的柠檬酸缓冲液，其中含有50-100 mM的氯化钠。
3. AAV的纯化
1）细胞培养：培养皿中加入10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，接种HEK293细胞，在5% CO2、37℃下进行培养，每3-5日传一代。
2）病毒质粒转染：当细胞密度为85%以上时，将细胞悬浮，将AAV质粒转入细胞中。转入的质粒包括：repcap质粒（AAV-1）、辅助质粒和载体质粒，载体质粒中搭载GFP表达框，用于后续检测纯化的AAV的感染效率。转化子培养3-5天。
3）AAV病毒纯化：
培养后的细胞培养物离心收集细胞，用裂解-平衡缓冲液重悬细胞，涡旋振荡2-5min使细胞破碎，然后离心，取破碎上清用于继续纯化，并保留一部分用于后续的功能验证实验。
向上清液中加入第一抗体，翻转振荡5-10 min使第一抗体与AAV颗粒充分结合；抗体偶联磁珠加入到EP管中，加入裂解-平衡缓冲液涡旋振荡15s，翻转振荡2 min，在磁力架上移除液体；将第一抗体-上清液加入到EP管中，涡旋振荡15s，然后翻转振荡15-20 min，使AAV-第一抗体复合物与磁珠上的第二抗体结合，将AAV锚定在磁珠上。将EP管转移至磁力架上，去除液体（本步骤液体用于后续的功能验证实验，为了简要，在后文中称为分离上清），使用裂解-平衡缓冲液洗两次。然后加入洗脱液，涡旋振荡15s后，翻转振荡2-5 min。然后在磁力架上吸取上清液，即得到纯化的AAV溶液。磁珠和第一抗体的用量应当配合，使所有第一抗体能够全部吸附在磁珠上，以防止未结合AAV的抗体与结合了AAV的抗体之间发生竞争。
4. AAV纯化试剂盒的功能验证
将破碎上清、分离上清和纯化得到的AAV溶液进行蛋白定量检测，用破碎上清的蛋白含量进行归一化，结果如图4所示，本次纯化去除了约85-90%的蛋白。通过SDS-PAGE电泳检测，纯化得到的AAV溶液在电泳中只有3个蛋白条带，分别对应VP1-3。可见，本发明的试剂盒可去除杂质蛋白，获得纯度非常高AAV溶液。
测定纯化得到的AAV溶液的滴度，对AAV溶液进行梯度稀释，通过荧光定量PCR的方法来确定AAV溶液的基因拷贝数滴度。我们购买了两种市售AAV纯化试剂盒（市售纯化-1和市售纯化-2），按说明书纯化后得到的AAV溶液与本发明的试剂盒纯化得到的AAV溶液的基因拷贝数滴度进行比较。结果如图5所示，本发明试剂盒纯化的AAV溶液与市售的AAV纯化试剂盒纯化得到的AAV溶液没有显著差异，分离上清中几乎不含基因拷贝数，可见纯化比较彻底，AAV回收率较高。
将上述试剂盒纯化得到的AAV溶液进行梯度稀释，感染HEK293细胞，由于AAV内包裹的载体质粒中含有GFP表达框，可根据荧光表达情况来标记被感染的细胞，从而计算出感染滴度。结果如图6所示，本发明的试剂盒纯化得到的AAV溶液的感染滴度约为5×107TU/μl，显著高于两个市售试剂盒，分离上清不具有感染活性。
从以上效果验证实验可看出，本发明的纯化试剂盒可或的高纯度的AAV溶液，基因拷贝数滴度与市售试剂盒相差不大。但是，在感染滴度方面，本发明试剂盒纯化得到的AAV溶液具有显著更高的感染滴度。我们推测，很可能是因为本发明的试剂盒通过使用特异性抗体的方式分离AAV从而剔除了一些微量的杂蛋白，使得本发明试剂盒纯化的AAV溶液在基因拷贝数滴度差不多的情况下具有远高于市售试剂盒的感染滴度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉美博尔津生物科技有限公司
皖西学院
<120> 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Ser Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Asp Ser Phe Arg
20 25 30
Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ala Val Ile Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Asp Leu Asp Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile
85 90 95
Cys Ala Ala Val Gly Ala Tyr Ser Ser Asn Tyr Gly Arg Ser His Thr
100 105 110
Val Pro Thr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro
130 135
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Thr Asp Ser Phe Arg Tyr Thr
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly
1 5
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Ala Val Gly Ala Tyr Ser Ser Asn Tyr Gly Arg Ser His Thr Val
1 5 10 15
Pro Thr Asn Tyr
20
<210> 5
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe Ala Ser Ala Phe Tyr Ile
20 25 30
Asp Ser Tyr Ala Pro Gly Trp Phe Arg Gln Val Leu Gly Lys Gln Arg
35 40 45
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Arg Ile Asn Arg Val Thr Glu Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
Leu Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Thr Gly Trp Gly Met Trp Arg Thr Ala Gly Val Ala Gly
100 105 110
Val Pro Leu Thr Val Ala Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Pro Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser
130 135 140
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Ala Ser Ala Phe Tyr Ile Asp Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ile Asn Arg Ile Asn Arg Val Thr
1 5
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Thr Gly Trp Gly Met Trp Arg Thr Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Leu
1 5 10 15
Thr Val Ala Ser Tyr
20
Claims (8)
1.一种腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，包括裂解-平衡缓冲液、第一抗体、锚定微珠以及洗脱液；
所述第一抗体为纳米抗体，具有重链可变区和Fc区，所述重链可变区序列如SEQ IDNO:1所示；
所述抗体偶联微珠为偶联了第二抗体的微珠，所述第二抗体是针对所述Fc区的抗体；
所述裂解-平衡缓冲液为pH 8-8.5的tris缓冲液，含有浓度为0.05%-0.1%的吐温20以及浓度为0.2%-0.3%的NP40。
2.根据权利要求1所述的腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为pH 4-5的柠檬酸缓冲液，含有50-100 mM的氯化钠。
3.根据权利要求1所述的腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，所述Fc区是小鼠Fc区。
4.根据权利要求3所述的腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为纳米抗体，重链可变区序列如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求1所述的腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，所述抗体偶联微珠为琼脂糖微珠或磁珠。
6.一种纯化腺相关病毒的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-5中任一项所述的腺相关病毒纯化试剂盒纯化腺相关病毒的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：收集含有腺相关病毒的细胞，使用所述裂解-平衡缓冲液破碎所述细胞，离心获得含有腺相关病毒的上清液；
S2：向所述上清液中加入所述第一抗体，混匀，得到第一抗体-上清液；
S3：向所述第一抗体-上清液中加入所述抗体偶联微珠，混匀；
S4：从所述第一抗体-上清液中分离所述抗体偶联微珠；
S5：用所述洗脱液从所述抗体偶联微珠洗脱得到腺相关病毒溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗体偶联微珠对于所述第一抗体过量。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111621847.8A CN114196638B (zh) | 2021-12-28 | 2021-12-28 | 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111621847.8A CN114196638B (zh) | 2021-12-28 | 2021-12-28 | 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114196638A CN114196638A (zh) | 2022-03-18 |
| CN114196638B true CN114196638B (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=80656937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111621847.8A Active CN114196638B (zh) | 2021-12-28 | 2021-12-28 | 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114196638B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023282161A1 (ja) * | 2021-07-09 | 2023-01-12 | 株式会社カネカ | 低分子化抗体 |
| WO2024068795A1 (en) * | 2022-09-27 | 2024-04-04 | Pci Biotech As | Method for releasing viral vectors |
| CN116239679B (zh) * | 2022-12-22 | 2023-08-18 | 北京因诺惟康医药科技有限公司 | 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108794580A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-13 | 山东农业大学 | 基于纳米抗体和抗原模拟肽的黄曲霉毒素磁珠-酶联免疫吸附检测方法 |
| CN111100192A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-05-05 | 皖西学院 | 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用 |
| CN111808828A (zh) * | 2020-09-14 | 2020-10-23 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 腺相关病毒的分离纯化方法 |
| CN112159467A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-01 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 能够与aav1-13结合的抗体 |
| CN215757393U (zh) * | 2021-09-09 | 2022-02-08 | 武汉美博尔津生物科技有限公司 | 一种用于分离腺相关病毒颗粒的磁珠分离装置 |
| JP2023078401A (ja) * | 2019-05-24 | 2023-06-06 | アビタイド リミテッド ライアビリティ カンパニー | Ａａｖ９アフィニティ薬剤 |
| CN116396381A (zh) * | 2021-12-28 | 2023-07-07 | 成都思柏沃生物技术有限公司 | 人腺相关病毒(aav)单域抗体制备及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11028372B2 (en) * | 2015-12-11 | 2021-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAVRH10 |
-
2021
- 2021-12-28 CN CN202111621847.8A patent/CN114196638B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108794580A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-13 | 山东农业大学 | 基于纳米抗体和抗原模拟肽的黄曲霉毒素磁珠-酶联免疫吸附检测方法 |
| JP2023078401A (ja) * | 2019-05-24 | 2023-06-06 | アビタイド リミテッド ライアビリティ カンパニー | Ａａｖ９アフィニティ薬剤 |
| CN111100192A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-05-05 | 皖西学院 | 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌毛ApfA抗原及其免疫特性与应用 |
| CN111808828A (zh) * | 2020-09-14 | 2020-10-23 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 腺相关病毒的分离纯化方法 |
| CN112159467A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-01-01 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 能够与aav1-13结合的抗体 |
| CN215757393U (zh) * | 2021-09-09 | 2022-02-08 | 武汉美博尔津生物科技有限公司 | 一种用于分离腺相关病毒颗粒的磁珠分离装置 |
| CN116396381A (zh) * | 2021-12-28 | 2023-07-07 | 成都思柏沃生物技术有限公司 | 人腺相关病毒(aav)单域抗体制备及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Immunoglobulins G from patients with ANCA-associated vasculitis are atypically glycosylated in both the Fc and Fab regions and the relation to disease activity;Olivier M Lardinois等;《PLoS One》;第14卷(第2期);全文 * |
| 抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究;谭淑萍等;《病毒学报》;第25卷(第04期);第267-273页 * |
| 抗心磷脂抗体阳性的系统性红斑狼疮临床特点和预后分析;张莹等;《医学研究生学报》;第32卷(第9期);第958-962页 * |
| 重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达;王槐志等;《免疫学杂志》;第22卷(第05期);第487-490页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114196638A (zh) | 2022-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114196638B (zh) | 一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法 | |
| US11732245B2 (en) | Scalable purification method for AAV9 | |
| US11015173B2 (en) | Scalable purification method for AAV1 | |
| EP3387117B1 (en) | Scalable purification method for aav8 | |
| CA2002839C (en) | Parvovirus capsids | |
| MXPA00010338A (es) | Purificacion eficiente de adenovirus. | |
| JP2003505033A (ja) | 修飾されたクロマトグラフィー特性を有するアデノ随伴ウイルスの構造タンパク質と、その製造及び使用 | |
| CN111808828B (zh) | 腺相关病毒的分离纯化方法 | |
| JP2022539148A (ja) | アデノ随伴ウイルスの精製方法 | |
| CN111154803B (zh) | 一种重组EBV gHgL免疫原的制备方法及其应用 | |
| CN114350855A (zh) | 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒 | |
| JP2007117003A (ja) | ウイルス中空粒子の迅速除去および精製方法 | |
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| CN109182281B (zh) | 处理腺相关病毒的方法及试剂盒 | |
| Kaelber et al. | Structure of the AAVhu. 37 capsid by cryoelectron microscopy | |
| CN111518174B (zh) | 优化的非洲猪瘟CD2v蛋白及其高效表达方法和应用 | |
| CN105859891B (zh) | Gfp-cd19融合蛋白及其在细胞标记方面的应用 | |
| Belova et al. | Approaches to purification and concentration of rAAV vectors for gene therapy | |
| CN109959789B (zh) | 一种狂犬病毒抗体检测试纸及其制备方法与检测方法 | |
| CN113717284B (zh) | 一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体及其应用 | |
| WO2001042299A2 (en) | Hepatitis virus sentinel virus i (svi) | |
| Wadell et al. | Separation of adenovirus type 4 components | |
| CN108794625A (zh) | 一种抗ev-d68病毒的单克隆抗体及其制备和应用 | |
| CN111996212B (zh) | 序列的应用、重组载体及其提高pvx植物表达载体蛋白表达量的方法 | |
| CN117903300A (zh) | 一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy1及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |